KR20080085201A

KR20080085201A - 증가된 혈류에 의해 유발된 조직 손상의 치료법 또는예방법

Info

Publication number: KR20080085201A
Application number: KR1020087019166A
Authority: KR
Inventors: 앨런 엘 골드스테인; 제이.제이. 핀켈스테인
Original assignee: 리지너크스 바이오 파마소티컬스, 인코포레이티드
Priority date: 2006-01-17
Filing date: 2007-01-17
Publication date: 2008-09-23
Also published as: IL192600A0; AU2007207609A1; JP2009523804A; US20090169538A1; EP1984017A4; WO2007084544A2; CA2636187A1; ES2600806T3; EP1984017A2; CN101374543A; EP1984017B1; AU2007207609B2; IL192600A; WO2007084544A3

Abstract

티모신 β4(Tβ4), Tβ4의 이소 형태, Tβ4의 N-말단 단편, Tβ4의 C-말단 단편, Tβ4 술폭시드, LKKTET 펩티드, LKKTNT 펩티드, 액틴-격리 펩티드, 액틴 결합 펩티드, 액틴-유동 펩티드, 액틴 중합-조절 펩티드, 또는 조직 손상-감소 활성을 갖는 그의 보존 변종 중의 적어도 하나를 포함하는 조직 손상-감소 또는 -예방 폴리펩티드를 포함하는 효과량의 조성물을 투여함으로써, 조직과 소통하는 혈관을 통해 혈류의 증가에 영향을 미친 후 발생하는 조직 손상의 치료 또는 예방 방법. 이 조성물은 혈류의 증가에 영향을 미치기 전, 그 동안 및/또는 그 후 상기 조직에 투여된다.

Description

증가된 혈류에 의해 유발된 조직 손상의 치료법 또는 예방법{METHODS OF TREATING OR PREVENTING TISSUE DAMAGE CAUSED BY INCREASED BLOOD FLOW}

본 발명은 2006년 1월 17일자로 출원된 미합중국 가특허 출원 제60/759,051호의 우선권을 주장한다.

본 발명은 증가된 혈류에 의해 유발된 조직 손상의 치료 또는 예방 분야에 관한 것이다.

동맥들 또는 기타 혈관들을 통해 혈류를 증가시키거나 또는 장애를 제거하기 위해 이용되는 많은 약물들, 장치들 및 의료 시술들이 존재한다. 그러나, 혈관들의 장애 제거는 때때로 산소, 자유 라디칼들 및 기타 화학 물질들을 함유하는 대량의 혈액이 조직에 대한 손상을 유발할 가능성을 갖는 조직 부위들로 돌진하게 한다.

혈류의 증가에 의해 유발된 조직 손상을 치료 또는 예방하기 위한 방법들 및 조성물들이 당업계에 여전히 필요하다.

본 발명에 따라서, 조직과 소통하는 혈관 내의 혈류의 증가에 영향을 미친 후 발생하는 조직 손상을 치료 또는 예방하는 방법은 티모신 베타 4(Tβ4), Tβ4의 이소 형태, Tβ4의 N-말단 단편, Tβ4의 C-말단 단편, Tβ4 술폭시드, LKKTET 펩티드, LKKTNT 펩티드, 액틴-격리 펩티드, 액틴 결합 펩티드, 액틴-유동 펩티드, 액틴 중합-조절 펩티드, 또는 조직 손상-감소 활성을 갖는 그의 보존 변종 중의 적어도 하나를 포함하는 조직 손상-감소 또는 -예방 폴리펩티드를 포함하는 효과량의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 이 조성물은 혈류의 증가에 영향을 미치기 전, 그 동안 또는 그 후 중의 적어도 하나의 단계 동안 상기 조직에 투여된다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 티모신 β4(Tβ4) 및 기타, 예를 들면 액틴-격리 펩티드들 또는 아미노산 서열 LKKTET 또는 LKKTNT를 함유할 수 있는 펩티드 단편들 또는 그의 보존성 변종들(이하, 때때로 "조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드(들)"이라 언급됨) 등의 펩티드들이 혈류의 증가와 연관된 심장, 신경 또는 기타 조직 손상 및 기타 변화의 치료 또는 예방을 촉진시킨다는 발견에 기초한다. 그러한 조직 손상-예방 펩티드들은 티모신 베타 4(Tβ4), Tβ4의 이소 형태, Tβ4의 N-말단 단편, Tβ4의 C-말단 단편, Tβ4 술폭시드, LKKTET 펩티드, LKKTNT 펩티드, 액틴-격리 펩티드, 액틴 결합 펩티드, 액틴-유동 펩티드, 액틴 중합-조절 펩티드, 또는 그의 보존 변종 중의 적어도 하나를 포함한다. KLKKTET 및 LKKTETQ를 포함할 수 있거나 또는 포함할 수 없는 N- 또는 C-말단 단편들 또는 변종들이 포함된다. Tβ4은 침식성 모델들(rodent models)에서 혈관신생기작(angiogenesis)의 인자로서 제안되어왔다. 그러나, 지금까지 그러한 특성들이 혈류의 증가에 의해 유발된 조직 손상을 치료하는데 이용될 수 있다는 공지된 지시 사항은 없었다. 임의의 특정 이론에 결부됨이 없이, 이들 펩티드들은 1개 이상의 염증 사이토카인들 또는 케모카인들의 레벨들을 감소시키고 조절하기 위해서 및 세포들에 대한 화학 전술적 및/또는 혈관 형성 인자(angiogenic factor)로서 작용하도록 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(비-템플레이트 지향된 DNA 폴리머라제)를 유도하는 능력을 가짐으로써 회복, 치료 및 예방을 고무시키는 능력을 가질 수 있고, 그럼으로써 혈류의 증가에 의해 유발된 조직 손상을 치료 및 예방한다.

본 발명은 특히 동맥들 및 기타 혈관들을 통해 혈류를 증가시키거나 또는 장애를 제거하는데 이용되는 시약들(예, 약물들, 장치들 또는 시술들)의 사용과 관련하여 유용하다. 조직과 소통되는 혈관을 통해 혈류의 증가에 영향을 미친 후에 발생하는 조직 손상을 예방 또는 치료하기 위해, 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드는 혈류의 증가에 영향을 미치기 전, 그 동안 및/또는 그 후에 투여될 수 있다.

혈관을 통해 혈류의 증가에 영향을 미치도록 이용될 수 있는 시약들은 아스피린, tPA, 스트렙토키나제, 플라스미노겐, 응고 방지제(anti-clotting agents), 애니스트렙플라제, 레테플라제, 테넥테플라제 및/또는 헤파린을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드는 혈류가 그와 관련하여 증가되기 전, 그 동안 및/또는 그 후 투여될 수 있다. 혈관을 통해 혈류를 증가시키는데 효과적인 그러한 시약들의 양은 0.001-1,000 mg의 범위에 포함된다. 본 발명은 또한 그러한 혈류-증가제 및 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드를 포함하는 조성물들에 적용될 수도 있다.

혈관을 통해 혈류의 증가에 영향을 미치도록 이용될 수 있는 장치들 및 시술들은 동맥 스텐트, 정맥 스텐트, 심장 카테테르 시술, 경동맥 스텐트, 대동맥 스텐트, 폐 스텐트, 혈관 성형술, 바이패스 수술 및/또는 신경 외과술을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드는 혈류가 그와 관련하여 증가되기 전, 그 동안, 및/또는 그 후에 투여될 수 있다.

본 발명이 적용될 수 있는 증상들은 외상 유도된 빈혈(신경 또는 심장), 질병 유도된 빈혈, 특발성 빈혈 및/또는 발작을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다. 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드는 혈류가 그와 관련하여 증가되기 전, 그 동안 및/또는 그 후에 투여될 수 있다.

본원에 개시된 바의 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드들은 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (P13-K)/Akt (단백질 키나제 β) 경로 등의 대사성 및 신호 효소들을 상향 조절함으로써 빈혈, 감염, 병리학, 독성 또는 외상 손상 후 뇌 및 기타 신경 혈관 세포들 및 조직들의 아폽틱 사멸을 예방 및/또는 제한할 수 있다. 상향 조절되는 P13-K/Akt 및 저류 포스포릴화된 Bad 및 프롤린이 풍부한 Akt 생존 키나제는 저산소성 손상(hypoxic insult) 중에 뉴런 세포들을 보호한다. 또한, 상기한 바의 조직 손상-예방 또는-감소 펩티드들은 IL-18 등의 염증 사이토킨들 및 IL-8 등의 케모카인들 및 캐스페이스 2, 3, 8 및 9 등의 효소들을 하향 조절하는 이들의 능력에 의해 뉴런 세포들을 보호하고, 신경 조직의 치료를 고무시킨다.

상기한 바의 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드들은 본원에 개시된 바의 혈전 용해제의 투여 직전, 그 동안 및/또는 직후에 투여될 때 P13-K/Akt 시그널링 경로들 및 감소된 뉴런 아폽토시스, 및 감소된 염증 케모카인, 사이토킨 및 캐파제 활성의 조절을 특징으로 하는 동면 형태를 겪도록 뉴런 조직을 도입함으로써 저산소성 손상으로 인한 뉴런 손상을 제한할 것이다.

본원에 개시된 바의 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드들은 글루타메이트 유도된 신경 독성을 예방함으로써 허혈성 또는 외상성 부상 이후 뇌 및 척수에서 신경 독성을 예방한다. 손상된 뇌 및 신경 조직들로부터 자극성 신경 전달 물질인 글루타메이트의 미조절된 방출은 미토콘드리아성 기능 이상 및 여러 가지 염증 반응들을 초래하는 세포에서 에너지 메카니즘들, 영양 신호들을 변경시킨 기계적 응력(mechanical stress) 및 영향받은 신경 세포들 및 조직들의 사망의 주요 매개 인자이다.

상기한 바와 같이, 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드는 이 조직과 소통되는 혈관을 통해 혈류의 증가에 영향을 미치기 전, 그 동안 및/또는 그 후에 투여될 수 있다. 전달 경로들은 비경구, 경구, 비강, 폐, 심장내, 정맥내, 경피 및/또는 리포좀을 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는다.

티모신 β4는 시험관 내 내피세포 이동 및 분화 중에 상향 조절되는 단백질로서 초기에 확인되었다. 티모신 β4는 원래 흉선으로부터 단리되었고, 여러 조직들 내에서 식별된 4.9 kDa의 편재하는 폴리펩티드인 43 아미노산이다. 내피 세포 분화 및 이동, T 세포 분화, 액틴 격리, 및 혈관화에서의 역할을 포함하여 이 단백질에 대한 여러 가지 역할들이 개시되어 있다.

일 구체예에 따라, 본 발명은 아미노산 서열 LKKTET 또는 LKKTNT를 포함하는 조직 손상-감소 펩티드 또는 조직 손상-감소 활성을 갖는 그의 보존성 변종, 바람직하게는 티모신 β4, Tβ4 이소 형태, 또는 티모신 β4의 길항질을 포함하는 조성물의 효과량을 그러한 치료를 요하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 혈류의 증가에 의해 유발된 조직 손상과 연관된 치료를 촉진시키고, 손상 및 염증을 예방하기 위한 치료 방법이다. 본 발명은 산화된 Tβ4를 이용할 수도 있다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 조성물들은 티모신 β4(Tβ4), Tβ4 이소 형태들, 산화된 Tβ4, 폴리펩티드들 또는 액틴 결합 영역들을 갖는 임의의 다른 액틴 격리 또는 결합 단백질들, 또는 조직 손상-감소 활성을 갖는 아미노산 서열 LKKTET 또는 LKKTNT를 본질적으로 포함 또는 구성할 수 있거나 그렇지 않은 펩티드 단편들 또는 그의 보존성 변종들을 포함한다. 본원 명세서에 참고 문헌으로서 인용된 국제 특허 출원 제PCT/US99/17282호는 본 발명에 따라 이용될 수 있는 Tβ4의 이소 형태 뿐만 아니라 본 발명에 따라 이용될 수 있는 아미노산 서열 LKKTET 및 그의 보존성 변종들을 개시하고 있다. 본원 명세서에 참고 문헌으로서 인용된 국제 특허 출원 제PCT/GB99/00833호(WO 99/49883호)는 본 발명에 따라 이용될 수 있는 산화된 티모신 β4를 개시하고 있다. 본 발명이 이하 Tβ4 및 Tβ4 이소 형태들에 관하여 주로 개시되더라도, 다음 설명은 아미노산 서열 LKKTET, LKKTNT, 또는 LKKTETQ, 또는 KLKKTET 및 본질적으로 LKKTET 또는 LKKTNT 또는 LKKTETQ 또는 KLKKTET를 포함하거나 또는 이것으로 구성된 펩티드들 및 단편들, 조직 손상-감소 활성을 갖는 그의 보존성 변종들 뿐만 아니라 산화된 티모신 β4, 및 상기한 바의 기타 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드들 등에 동등하게 적용되도록 의도됨을 이해해야 한다.

일 구체예에서, 본 발명은 본원 명세서에 개시된 바의 Tβ4 또는 Tβ4 이소 형태 또는 기타 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드들을 함유하는 조직 손상-감소 조성물의 효과량과 조직 부위를 접촉시킴으로써, 환자에서 염증 및 손상을 치료 및 예방하는 방법을 제공한다. 접촉은 직접적이거나 또는 전신으로 이루어질 수 있다. 손상된 부위와 접촉하는 예는 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드들의 치료되어야 할 영역 내로의 침투, 또는 지연 또는 서행 방출을 증진시키는 적어도 하나의 시약과 병용하거나 또는 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드를 단독으로 포함하는 조성물과 그 부위를 접촉시키는 것을 포함한다. 투여는 직접적으로 또는 전신으로 이루어질 수 있다. 투여의 예로는 예를 들면 본원에 개시된 바의 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드를 포함하는 용액, 로션, 고약, 겔, 크림, 페이스트, 분무제, 현탁액, 분산액, 하이드로겔, 연고, 발포제, 오일 또는 고체로서 직접 도포, 주사 또는 주입을 포함한다. 투여는 예를 들면 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드를 함유하는 조성물의 정맥내, 복강내, 근육내 또는 피하 주사, 또는 흡입, 경피 또는 경구 투여를 포함할 수 있다. 피검자는 포유 동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.

조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드는 임의의 적절한 조직 손상-감소 또는 -예방량으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드는 약 0.0001-1,000,000 마이크로그램의 범위의 복용량으로, 더욱 바람직하게는 약 0.01-5,000 마이크로그램 범위, 더 바람직하게는 약 0.1-50 마이크로그램 범위, 가장 바람직하게는 약 1-30 마이크로그램 범위의 복용량으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 매일, 격일 등으로 투여일 당 단일 도포 또는 다중 도포로, 예를 들면 투여일 당 2, 3, 4회 이상의 도포로 투여될 수 있다.

Tβ4 이소 형태들이 확인되었으며, Tβ4의 공지된 아미노산 서열과 약 70%, 또는 약 75% 또는 약 80% 이상의 상동성을 갖는다. 그러한 이소 형태들은 예를 들면 Tβ4ala, Tβ9, Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 및 Tβ15를 포함한다. Tβ4와 유사하게, Tβ10 및 Tβ15 이소 형태들은 액틴을 격리시키는 것으로 보였다. Tβ4, Tβ10 및 Tβ15 뿐만 아니라 이들 다른 이소 형태들은 액틴 격리를 매개하거나 또는 결합시키는데 연루될 것으로 보이는 아미노산 서열 LKKTET 또는 LKKTNT를 공유한다. 임의의 특정 이론에 결부시키고자 희망하지 않더라도, Tβ4 이소 형태들의 활성은 부분적으로 액틴의 중합을 조절하는 능력에 기인할 수 있다. β-티모신들은 유리 G-액틴을 격리시킴으로써 F-액틴을 탈중합시키는 것으로 보인다. 따라서, 액틴 중합 반응을 조절하는 Tβ4의 능력은 LKKTET 또는 LKKTNT 서열을 통해 액틴에 결합하거나 또는 그를 격리시키는 그의 능력에 전체적으로 또는 부분적으로 기인할 수 있다. 따라서, Tβ4에 의해서와 같이, 아미노산 서열 LKKTET 또는 LKKTNT를 갖는 Tβ4 이소 형태들을 포함하여 액틴을 결합 또는 격리시키거나, 또는 액틴 중합 반응을 조절하는 다른 조직 손상-예방 또는 -감소 단백질들이 본원에 설명된 바와 같이 단독으로 또는 Tβ4와 조합하여 사용되기 쉽다.

따라서, Tβ4 이소 형태들, 예를 들면 Tβ4ala, Tβ9, Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 및 Tβ15 뿐만 아니라 아직 확인되지 않은 Tβ4 이소 형태들이 본 발명의 방법들에 유용할 것임이 특히 예상된다. 그로써, Tβ4 이소 형태들은 환자에게 실시된 방법들을 포함하여, 본 발명의 방법들에 유용하다. 따라서, 본 발명은 Tβ4 뿐만 아니라 Tβ4 이소 형태들인 Tβ4ala, Tβ9, Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 및 Tβ15, 및 제약학상 허용되는 담체를 포함하는 제약학적 조성물들을 추가로 제공한다.

또한, 액틴 격리 또는 결합 능력을 갖거나, 또는 액틴을 이동시킬 수 있거나 또는 액틴 중합 반응을 조절할 수 있는 다른 단백질들은 적절한 격리, 결합, 이동화 또는 중합 분석으로 나타내거나, 또는 예를 들면 LKKTET 또는 LKKTNT와 같은 액틴 결합을 매개하는 아미노산 서열의 존재에 의해 확인되는 바와 같이, 본 발명의 방법들에 유사하게 사용될 수 있다. 그러한 단백질들은 예를 들면 겔졸린, 비타민 D 결합 단백질(DBP), 프로필린, 코필린, 애드세베르틴, 프로포마이오신, 핀실린, 디팩틴, 드나젤, 빌린, 프래그민, 세베린, 캡핑 단백질, β-액틴 및 아쿠멘틴을 포함할 수 있다. 그러한 방법들이 환자에서 실시된 것들을 포함하므로, 본 발명은 본원에 나타낸 바의 겔졸린, 비타민 D 결합 단백질(DBP), 프로필린, 코필린, 디팩틴, 드나젤, 빌린, 프래그민, 세베린, 캡핑 단백질, β-액틴 및 아쿠멘틴을 포함하는 제약 조성물들을 추가로 제공한다. 따라서, 본 발명은 아미노산 서열 LKKTET 또는 LKKTNT(그의 일차 아미노산 서열 내에 존재할 수 있음)를 포함하는 조직 손상-감소 폴리펩티드 및 그의 보존성 변종들의 사용을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "보존성 변종" 또는 그의 문리적 변종들이라는 용어는 아미노산 잔기가 또 다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의해 대체된 것을 나타낸다. 보존성 변종들의 예들은 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌 등의 소수성 잔기가 다른 것들을 대체하고, 극성 잔기가 다른 것을 대체하고, 예를 들면 아르기닌이 리신을, 글루탐산이 아스파르트산을 또는 글루타민이 아스파라긴을 치환하는 등을 포함한다.

Tβ4는 많은 조직 및 세포 유형들로 국지화되고, 따라서 Tβ4 또는 다른 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드의 생산을 자극하는 시약들은 조직 및/또는 세포로부터 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드 생산에 영향에 미치도록 조성물에 부가되거나 또는 그를 포함할 수 있다. 그러한 작용제들은 성장 인자들의 부류의 구성원들, 예를 들면 인슐린형 성장 인자(IGF-1), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 상피 성장 인자(EGF), 변형 성장 인자 베타(TGF-β), 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 티모신 α1(Tα1) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 작용제들은 변형 성장 인자 베타(TGF-β) 또는 TGF-β 수퍼패밀리의 다른 구성원들이다. 본 발명의 조성물들은 세포외 매트릭스 증착, 세포 이동 및 혈관화를 통해 결합 조직의 성장을 달성함으로써 혈류의 증가에 의해 유발된 조직 손상을 감소시킬 수 있다.

일 구체예에 따라, 환자들은 본원에 정의된 바의 조직 손상-예방 또는 감소 펩티드의 환자에서의 생산을 자극하는 작용제에 의해 치료된다.

추가로, 혈류의 증가에 의해 유발된 조직 손상의 치료를 보조하거나 또는 그 치료를 고무시키는 작용제들이 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드와 함께 조성물에 부가될 수 있다. 그러한 작용제들은 혈관 형성제(angiogenic agents), 성장 인자들, 세포들의 분화를 지향시키는 작용제들을 포함한다. 예를 들면, 비제한적인 방식으로, 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드들은 단독으로 또는 조합물로 임의의 다음 작용제들 중의 하나 이상: VEGF, KGF, FGF, PDGF, TGFβ, IGF-1, IGF-2, IL-1, 프로티모신 α 및 티모신 α1과 조합하여 효과량으로 부가될 수 있다.

본 발명은 또한 제약학적으로 허용되는 담체 중의 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드의 치료 유효량을 포함하는 제약학적 조성물을 포함한다. 그러한 담체들은 무엇보다도 본원에 열거된 것들을 포함한다.

혈류의 증가에 의해 유발된 조직 손상과 연관된 염증, 손상 및 변질을 치료하거나 또는 방지하는 실제 복용량, 제형 또는 조성물은 환자의 체격 및 건강 상태를 포함하는 많은 요인들에 좌우될 수 있다. 그러나, 당업계의 통상의 기술을 가진 자들이라면 사용하기 적절한 복용량을 결정하기 위해 위의 PCT/US99/17282 및 그안에 인용된 참조 문헌들에 개시된 바의 임상적 복용량을 결정하는 기술들 및 방법들을 개시하는 가르침을 사용할 수 있다.

적절한 제형들은 약 0.001-50중량% 범위, 더욱 바람직하게는 약 0.01-0.1중량% 범위, 가장 바람직하게는 약 0.05중량%의 농도로 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드를 포함할 수 있다.

본원에 개시된 치료 접근법들은 임의의 종래 투여 기술을 포함하여 본 발명의 조직 손상-예방 또는 -감소 화합물들을 포함하는 시약들 또는 조성물들을 환자에게 투여하거나 또는 전달하는 여러 경로들을 포함한다. 본 발명의 조직 손상-예방 또는 -감소 화합물들을 사용하거나 또는 그를 함유하는 조성물들 및 그 방법들은 제약학상 허용되는 비-독성 부형제들 또는 담체들과의 혼합물로 제약 조성물들 내로 제형될 수 있다.

본 발명은 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드들 또는 그의 기능성 단편들과 상호 작용하는 항체들의 사용을 포함한다. 상이한 에피토픽 특이성을 갖는 울혈된(pooled) 모노클로날 항체들로 본질적으로 구성된 항체들뿐만 아니라 독특한 모노클로날 항체 제법들이 제공된다. 모노클로날 항체들은 위의 PCT/US99/17282호에 개시된 바의 당업계의 숙련자들에게 잘 공지된 방법들에 의해 단백질의 단편들을 함유하는 항원들로부터 제조된다. 본 발명에 사용된 바의 항체라는 용어는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체들을 포함하도록 의도된다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드 유전자 발현을 조절하는 작용제의 효과량을 투여함으로써 환자를 치료하는 방법을 제공한다. "조절한다"라는 용어는 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드가 과다 발현될 때 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드 발현의 억제 또는 저지, 및 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드가 불충분하게 발현되었을 때 발현의 유도를 의미한다. "효과량"이라는 용어는 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드 유전자 발현을 조절하는데 효과적이어서, 효과적인 치료가 되게 하는 조절제의 양을 의미한다. Tβ4 또는 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드 유전자 발현을 조절하는 작용제는 예를 들면 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 안티센스, 트리플렉스제 또는 리보자임일 수 있다. 예를 들면, Tβ4의 구조적 유전자 영역으로 또는 촉진제 영역으로 지향된 안티센스가 이용될 수 있다.

다른 구체예에서, 본 발명은 Tβ4 또는 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드 활성을 조절하는 화합물들을 이용하는 방법을 제공한다. Tβ4 또는 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드 활성에 영향을 미치는 화합물들(예, 길항제 및 작용 물질)은 펩티드류, 펩티도 모방체류, 폴리펩티드류, 화학적 화합물들, 아연과 같은 무기물들 및 생물학적 작용제들을 포함한다.

임의의 특정 이론에 결부되지 않지만, 본 발명은 1개 이상의 염증 사이토킨들, 또는 케모카인들의 레벨을 감소시키고 내피 세포들을 위한 케모택틱 인자로서 작용하도록 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(비-템플릿 지향된 DNA 폴리머라제)를 도입함으로써 혈류의 증가에 의해 유발된 조직 손상과 연관된 염증 또는 손상의 치료 또는 예방을 고무시킬 수 있고, 그로 인해 혈류의 증가 또는 기타 퇴행성 또는 환경적 인자들에 의해 유발되는 조직 손상의 치료 또는 예방을 고무시킨다.

실시예 1

합성 Tβ4 및 Tβ4에 대한 항체는 RegeneRx Biopharmaceuticals, Inc.(3 Bethesda Metro Center, Suite 700, Bethesda, MD 20814)에 의해 제공되었고, 콜라겐 겔 분석으로 시험되어 심장 내피 세포들의 간엽 세포들로의 변형에 대한 이들의 효과들을 측정하였다. 심장 판막들 및 기타 심장 조직의 발생은 상피-간엽 변형에 의해 형성되고, 이러한 공정의 결함들은 발생 및 삶의 전반 동안 심각한 심장 혈관 기형 및 부상을 유발할 수 있다. 생리적 농도에서 Tβ4는 콜라겐 겔 분석에서 심내막 세포들의 간엽 세포들로의 변환을 현저히 증진시킨다. 더욱이, Tβ4에 대한 항체는 이러한 변환을 억제 및 봉쇄한다. 방실계 심내막의 침습적 간엽으로의 변 환은 심장 판막들의 형성 및 정상적인 심장 조직의 형성 및 유지의 일 국면이다.

실시예 2

심장 발달에 연루된 조절 경로들은 심장 회복에 조력하도록 심근 세포들의 재프로그래밍에 이용될 수 있다. 심장 형태 형성 중에 발현된 유전자들의 연구에서, 43개 아미노산 펩티드 티모신 β4는 심장의 발육 중에 발현되었다. 티모신 β4는 세포 운동성, 기관 발생 및 기타 세포 생물학적 사건들에 필수적인 액틴-세포 골격 조직에 대한 G-액틴 단량체들 및 후속 효과들의 가장 영구적인 관련 격리에 의한 수많은 기능들을 갖는다. 최근의 도메인 분석들은 β4-티모신들이 액틴에 대한 이들의 카르복시-말단 친화도에 기초하여 액틴 어셈블리에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다. 세포 운동성 외에, 티모신 β4는 핵의 액틴에 의해 조절된 Rho-의존 유전자 발현 또는 크로마틴 재모델링 사건들에 영향을 미침으로써 전사 사건들에 영향을 미칠 수 있다.

여기서, 티모신 β4는 심근 세포들(cardiomyocytes) 및 내피 세포들의 이동을 자극하고, 심근 세포들의 생존을 촉진시킬 수 있는 것으로 드러났다. LIM 도메인 단백질 PINCH 및 인테그린 링크된 키나제(ILK) 모두는 세포 이동 및 생존을 위해 필요한 것으로, 생존한 키나제 Akt/PKB의 포스포릴화를 초래하는 티모신 β4와의 착물을 형성하였다. Akt 포스포릴화의 억제는 심근 세포들에 대한 티모신 β4의 영향들을 반전시켰다. 관상 결찰 후 티모신 β4에 의한 성체 쥐들의 치료는 심장에서 Akt의 증가된 포스포릴화를 초래하였고, 24시간 내에 초기 근세포 생존을 증진시키고 심근 기능을 개선시켰다. 이들 결과들은 심장 발생 중에 발현된 내인 성 단백질이 급성 관상 사건들의 설정에서 심근(myocardium)을 보호하도록 재배치될 수 있다는 것을 나타낸다.

결과

티모신 β4의 발달 발현

발달하는 뇌에서 티모신 β4의 발현은 상세하지는 않지만 심혈관계에서 발현되는 것으로서 이미 보고되어 있다. 배아일(E) 10.5의 생쥐 배들의 전체 설치된 RNA 자체 혼성화(in situ hybridization)는 좌심실, 우심실의 외부 곡률, 및 심장 분출관에서 티모신 β4 발현을 드러냈다. 방사성 자체 혼성화는 티모신 β4 전사물들이 심내막 쿠션들로서 공지된 심장 판막 전구체들의 영역에서 풍부함을 지시하였다. 이 영역의 세포들은 간엽 변환을 수행하고, 심내막으로부터 벗어나 이동하고, 심근 및 심내막을 분리하는 세포외 매트릭스의 팽윤을 침습하는 내피 세포들로부터 유도된다. 심내막 세포들 외에, 심근 세포들의 서브셋은 쿠션 영역으로 이동하여 차지하고, 이 과정은 심강(cardiac chamber)들의 분리 및 리모델링을 위해 필요하다. 면역 조직 화학을 사용함으로써, 쿠션들 내의 티모신 β4-발현 세포들은 심장 근육 액틴을 발현하였고 티모신 β4는 심내막 쿠션을 침습하는 이동 심근 세포들 내에 존재하는 것으로 밝혀졌다. 마지막으로, 티모신 β4 전사물들 및 단백질은 또한 심실 격막 내 및 치밀한 층으로서 공지된 심근의 덜 분화되고 더 증식된 영역에서 E9.5-E11.5에서 발현되었고, 세포 성숙물로서 섬유주(trabecular) 영역 내로 이동한다. 전방 심장계로부터 이동하는 분출관 심근은 또한 높은 수준의 티모신 β4 단백질을 발현시켰다.

분비된 티모신 β4 자극된 심장 세포 이동 및 생존

티모신 β4는 시토졸 및 핵에서 발견되고 세포내로 기능하지만, myc-태그된 티모신 β4로 형질감염(transfect)된 Cos 1 셀들의 조건 배지는 상처난 체액에서 티모신 β4 분비 및 그 존재에 대한 선행 보고서들과 일치하게 웨스턴 블롯에 의해 검출될 수 있는 티모신 β4를 함유하는 것을 발견하였다. 배아기 심장 외식체(explant)들에 세포외로 부가된 파지 입자들의 표면 상에 티모신 β4의 발현시, 안티-파지 항체가 세포 표면을 코팅하였고, 궁극적으로 대조군 파지는 검출되지 않으면서 시토졸 및 핵 내에서 세포 내로 검출되는 것으로 밝혀졌다. 비오티닐화된 티모신 β4를 사용하여 유사한 관찰들이 이루어졌다. 이들 데이터는 세포 도입 메커니즘이 결정되어야 하는 채로 남겨지더라도 분비된 티모신 β4가 세포들 내로 내재화될 수 있음을 지시한다.

심장 세포 이동에 대한 분비된 티모신 β4의 효과를 시험하기 위해, 3차원 콜라겐 겔에 대한 세포 이동 및 변환 사건들을 분석하도록 고안된 배아기 심장 외식체 시스템이 이용되었다. 이러한 분석에서, 판막 형성 영역들로부터 인접한 배아 심근 및 심내막 외식체들은 콜라겐에 인접한 심내막과 콜라겐 겔 상에 배치되었다. 심근 세포들로부터 신호들은 심내막 세포 이동을 유도하지만, 심근 세포들은 현저한 수의 콜라겐 상으로 보통은 이주하지 않는다. 대조적으로, 일차 외식체들에 티모신 β4의 부가시, 많은 수의 자발적으로 박동하는 심근 액틴-양성 세포들이 외식체로부터 벗어나 이주하는 것이 관찰되었다. TUNEL 분석 또는 포소-히스톤 H3 면역 염색(phosho-histone H3 immunostaining) 각각에 기초한 세포 사멸 또는 증식 률 간의 어떠한 현저한 차이도 대조군 세포들과 비교한 이들 세포들에서 관찰되지 않았다.

출생-후 심근 세포들의 응답을 시험하기 위해, 최초의 생쥐 신생 심근 세포들을 라미닌-코팅된 유리 상에서 배양하고, 세포들을 인산염 완충된 염수(PBS) 또는 티모신 β4로 처리하였다. 배아 심근 세포들과 유사하게, 티모신 β4-처리된 신생 심근 세포들의 이주 거리는 대조군에 비해 현저히 증가된 것으로 밝혀졌다(P<.05). 심근 세포 이주에 대한 티모신 β4의 효과 외에, 배아 심장 외식체 분석에서 내피 이주에 대한 유사한 효과가 관찰되었다. E11.5 외식체들을 티모신 β4에 노출시킴으로써 PBS외 비교하여 증가된 수의 이주하는 내피 세포들을 초래하였다(P<.01).

신생 심근 세포들의 초기 배양물은 전형적으로 약 1 내지 2주 동안 생존하였고, 일부 세포들은 실험실에서 라미닌-코팅된 슬라이드들 상에서 성장하였을 때 2주에 이르기까지 박동하였다. 놀랍게도, 신생 심근 세포들은 28일에 이르기까지 볼 수 있는 리드미컬하게 수축하는 근세포들에 의해 티모신 β4에 노출시 현저히 오래 생존하였다. 또한, 박동수는 티모신 β4-처리된 신생 심근 세포들에서 일관되게 더 빨랐고(분당 95 대 50 비트, P<.02), 세포-세포 소통의 변화 또는 더욱 격렬한 심근 세포들을 나타냈다.

티모신 β4는 ILK 및 Ak /단백질 키나제 B를 활성화시킨다 .

티모신 β4가 세포 이동 및 생존 사건들에 영향을 미칠 수도 있는 잠재적인 메커니즘들을 조사하기 위해, 단백질들과 상호 작용하는 티모신 β4가 탐색되었다. 티모신 β4의 아미노-말단은 이전에 공지되지 않은 상호 작용하는 단백질들의 식별을 허용하지만, 액틴과의 연관성을 억제하는 카르복시-말단의 노출을 초래하는 아피-겔 비드들과 융합되었다. E9.5-12.5 생쥐 심장 T7 파지 cDNA 라이브러리는 파지 디스플레이에 의해 합성되고 선별되었고, 티모신 β4-상호 작용 클론들이 풍부하였고, ELISA에 의해 확인되었다. LIM 도메인 단백질인 PINCH는 이 선별(screen)에서 가장 일관되게 단리되었고, 액틴의 부재 하에 티모신 β4와 상호작용하였다(ELISA). PINCH 및 인테그린 링크된 키나제(ILK)는 서로 직접적으로 상호 작용하고, 병소 접착 착물로서 공지된 세포-세포외 매트릭스 상호 작용들에 연루된 더 큰 착물의 일부로서 액틴 사이토스켈레톤과 간접적으로 상호 작용한다. PINCH 및 ILK는 부분적으로 생존 및 성장 시그널링 경로들에서 중심 키나제인 세린-트레오닌 키나제 Akt/단백질 키나제 B의 포스포릴화를 촉진시킴으로써 세포 이동성 및 세포 생존을 위해 요구된다. 티모신 β4를 인코딩하는 플라스미드들은 배양 세포들 중에서 PINCH 또는 ILK에 의해 또는 이들 없이 형질 감염되었고, 티모신 β4는 PINCH 또는 ILK와 독립적으로 공침전되는 것으로 밝혀졌다. 더욱이, PINCH, ILK, 및 티모신 β4는 ILK와 티모신 β4의 상호 작용이 PINCH에 의한 것보다 약하더라도 공통 착물 내에서 일관되게 면역침전되었다. 티모신 β4와의 PINCH 상호 작용은 PINCH의 제4 및 제5 LIM 도메인들에 대해 매핑되는 한편, ILK의 아미노 말단 앤크린 도메인은 티모신 β4 상호 작용에 충분하였다.

병소 접착 착물에 대한 ILK의 보충은 그의 활성화를 위해 중요하기 때문에 ILK 편재화 및 발현에 대한 티모신 β4의 영향들이 분석되었다. 면역세포화학에 의한 ILK 검출은 배아기 심장 외식체들 또는 C2C12 근아세포들을 합성 티모신 β4 단백질(10ng/100ul) 또는 티모신 β4-발현 플라스미드로 처리한 후 세포 에지들 근처에서 현저히 증진되었다. 웨스턴 분석은 C2C12 세포들에서 ILK 단백질 레벨들의 완만한 증가를 지시하였고, 증진된 면역 형광은 부분적으로 티모신 β4에 의해 변경된 국지화에 기인할 수 있음을 제안한다. C2C12 세포들의 티모신 β4 처리시, ILK는 기능적으로 활성화되고, Akt의 세린 473에 대한 포스포-특이적 항체를 사용하여 그의 공지된 기질 Akt의 증가된 포스포릴화에 의해 입증되는 한편, 전체적인 Akt 단백질은 변화가 없는 것으로 밝혀졌다. 세포외로 투여된 티모신 β4 및 형질 감염된 티모신 β4의 유사한 효과들은 펩티드의 내재화의 이전 관찰들과 일치하였고, 티모신 β4에 대한 시그널링에서 세포외 역할보다 오히려 세포내 역할을 제안한다. 티모신 β4는 G-액틴 단량체들의 푸울을 격리시키기 때문에, ILK 활성화에 대한 영향들은 중합된 F-액틴과 단량체성 G-액틴 간의 균형을 조절하는데 있어서 티모신 β4의 역할에 좌우되었다. F-액틴 중합 반응은 C3 트랜스퍼라제를 사용하여 억제되었고, 또한 F-액틴 형성은 활성화된 Rho에 의해 촉진되었지만, 티모신 β4에 의한 COS1 또는 C2C12 세포들의 처리 후 관찰되는 ILK 활성화에 대해 어떠한 개입도 영향을 미치지 않았다.

티모신 β4의 관찰된 효과들에 대해 ILK의 활성화가 필요한지 여부를 결정하기 위해, 잘-개시된 ILK 억제제인 워트마닌이 사용되었고, 이는 ILK의 상류 키나제인 포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3-키나제)를 억제한다. 티모신 β4 활성을 위한 분석으로서 심근 세포 이동 및 박동 빈도를 사용함으로써, 배아 심장 외식체들 이 워트마닌과 함께 또는 워트마닌 없이 티모신 β4의 존재 하에서 상기한 바와 같이 배양되었다. 티모신 β4의 효과를 매개하는 ILK와 일치하게, 심근 세포 이동 및 박동 빈도의 현저한 감소가 ILK의 억제시 관찰되었다(P<.05). 함께, 이들 결과들은 세포 내의 티모신 β4-PINCH-ILK의 생리학적으로 현저한 상호 작용을 지원하고, 이 착물이 액틴 중합 반응과 상대적으로 독립적으로 티모신 β4의 관찰된 효과들의 일부를 매개할 수 있음을 제안하였다.

티모신 β4는 심근 경색 후 세포 생존을 촉진시키고 , 심장 기능을 개선시킨다

시험관 내에서 배양된 심근 세포들의 생존 및 이동 및 Akt의 포스포릴화에 대한 티모신 β4의 영향 때문에, 티모신 β4가 심근 손상 후 생체 내 심장 회복에 조력할 수 있는지 여부가 시험되었다. 58마리의 성체 생쥐들에서 심근 경색은 관상 동맥 결찰에 의해 생성되었고, 절반은 전신성, 심장내, 또는 결찰 직후 전신 + 심장내 티모신 β4에 의해 처리되었고, 나머지 절반은 PBS로 처리되었다. 심장내 주사는 콜라겐(대조군) 또는 티모신 β4와 혼합된 콜라겐으로 행해졌다. 2주 후 생존한 45마리 생쥐들 모두 심장 수축의 다중 측정에 의해 경색 후 2 내지 4주 후에 랜덤-맹 초음파 그래프로 심장 기능에 대해 심문되었다. 경색 후 4주에, 대조군 생쥐들의 좌심실들은 23.2 +/- 1.2%의 평균 구획 단축률(n=22.95% 신뢰도 구간)을 가졌고; 대조적으로, 티모신 β4로 처리된 생쥐들은 37.2 +/- 1.8%의 평균 구획 단축률(n=23.95% 신뢰도 구간; P<.0001)을 가졌다. 심실 기능의 제2 척도로서, 2차원적인 초음파 심장 검진 측정들은 티모신 β4 처리된 생쥐들의 좌심실로부터 배 출된 혈액의 평균 분율(배출 분율)이 관상 결찰 후 대조군 생쥐들에서 28.2 +/- 2.5% 평균(n=22.95% 신뢰도 구간)에 비교한 바 57.7 +/- 3.2%였다 (n=23.95% 신뢰도 구간; P<.0001). 심장 구획 단축률 또는 배출 분율의 60% 이상 또는 100%의 개선은 각각 심장 기능이 모조 처리된 동물들(~60% 구획 단축률; ~75% 배출 분율)이 비해 여젼히 디프레스되더라도, 티모신 β4에 노출됨에 따라 현저한 개선을 제안한다. 마지막으로, 말기 이완기 치수(end diastolic dimensions; EDD) 및 말기 수축기 치수(end systolic dimensions; ESD)는 대조군에서 현저히 높았고, 이는 티모신 β4 처리가 개선된 기능과 일치하게 경색 후 감소된 심장 이완을 초래하였음을 지시한다. 현저하게도, 티모신 β4가 복강내 주사를 통해 전신으로 또는 심장 경색 부위 내에서만 국소로 투여되었을 때 개선 정도는 통계학적으로 다르지 않았고, 티모신 β4에 대한 유익한 효과들이 심장외 소스를 통해서보다는 오히려 심장 세포들에 대한 직접적인 영향을 통해 마찬가지로 발생하였음을 제안한다. 대조군 심장 주사는 동일한 콜라겐 비히클에 의해 수행되었고, 이는 주사에 대한 내인성 반응이 심장 회복에 기여하는 것을 게 있음직하지 않게 만든다.

티모신 β4가 심장 기능을 개선시키는 방식을 측정하기 위해, 티모신 β4 와 함께 또는 없이 처리된 심장들의 다수의 일련의 조직학적 부분들이 검사되었다. 3개 레벨의 섹션에서 트리크롬 염색은 상처의 크기가 티모신 β4로 처리된 모든 생쥐들에서 감소되었지만 상기 초음파 심장 검사 데이터와 일치하게 티모신 β4의 전신 전달 또는 국소 전달 사이에 차이가 없음을 드러낸다. 생쥐 서브셋의 좌심실을 통해 6개의 분비 레벨을 사용한 상처 체적의 정량화는 티모신 β4로 처리된 생쥐들 에서 상처 체적의 현저한 감소를 나타냈다(P<.05). PBS 또는 티모신 β4 처리된 심장들에서 관상 결찰 후 3, 6, 11 또는 14일에 우리는 현저한 심근 세포 증식 또는 사멸을 검출하지 않았다. 그러나, 결찰 후 24 시간에 우리는 티모신 β4 처리된 심근 세포들에서 TUNEL 분석(녹색)에 의해 세포 사멸의 현저한 감소를 발견하였고, 근육-액틴 항체(적색)에 의한 이중 라벨링으로 확인하였다. 근세포들인 TUNEL 양성 세포들은 티모신 β4 그룹에서 희박하였지만, 대조군 심장에서 풍부하였다. 이러한 관찰과 일치하게, 경색 후 3일에 좌심실 구획 단축율은 대조군들에서 28.8 +/- 2.26%(n=4.95% 신뢰 구간)(P<.02)에 비교한 바 심장내 티모신 β4 처리에 의해 39.2 +/- 2.34%였고(n=4.95% 신뢰도 구간); 배출 분율은 각각 64.2 +/- 6.69% 또는 44.7% +/- 8.4% 였고(P<.02), 이는 티모신 β4에 의한 초기 보호를 제안한다. 마지막으로, 처리된 심장과 미처리된 심장 사이에서 c-kit, Sca-1 또는 Abcg2 양성 심근 세포들의 수에서 어떠한 차이도 검출되지 않았고, 티모신 β4 처리된 동물들에서 심근 세포들의 세포 체적은 성숙한 근세포들에서 유사하였고, 이는 티모신 β4-유도된 개선이 공지된 줄기 세포들의 심장 혈통으로의 보충에 의해 영향을 받기 쉽지 않음을 제안한다. 따라서, 티모신 β4 처리된 생쥐들의 감소된 상처 체적 및 보존된 기능은 심근 세포들의 생존에 대한 티모신 β4의 영향을 통해 경색 후 심근의 초기 보전에 기인하기 쉽다.

티모신 β4는 배양된 세포들 내에서 ILK 활성 및 Akt 포스포릴화를 상향 조절(upregulate)하기 때문에, 생체 내 이들 키나제들에 대한 효과들이 시험되었다. 웨스턴 블랏에 의해, ILK 단백질의 레벨은 PBS 처리된 생쥐들에 비교한 바 관상 결 찰 후 티모신 β4에 의해 처리된 생쥐들에서 심장 용해물 중에서 증가되는 것으로 밝혀졌다. 상응하게는, Akt-5473에 대한 포스포-특이적 항체들은 초기에 개시된 ILK에 대한 티모신 β4의 영향과 일치하게, 티모신 β4에 의해 처리된 생쥐들에서 포스포릴화된 Akt-5473의 양의 증가를 드러냈다. 전체 Akt 단백질은 증가되지 않았다. 생체 내 이들 관찰치들은 시험관 내에서 나타나는 세포 이동 및 생존에 대한 티모신 β4의 영향과 일치하였고, ILK의 활성화 및 Akt의 후속 자극이 부분적으로 티모신 β4에 의해 유도된 증진된 심근 세포 생존을 설명할 수 있음을 나타내지만, 단일 메커니즘이 티모신 β4의 세포 효과들의 완전한 레파토리를 책임지기는 쉽지 않다.

고찰

여기 제공된 증거는 심장 형태 형성 중에 세포 이주 및 생존에 연루된 단백질인 티모신 β4는 심근 경색 후 심근 세포 손실을 최소화하기 위해 재배치될 수 있음을 제안한다. PINCH, ILK 및 Akt의 역할을 제공하는 데이터는 세포 이동, 생존 및 심장 회복에 대한 티모신 β4의 영향에서 중심 역할을 하는 이러한 착물과 일치한다. 관상 결찰 후 24시간 내에 세포 사멸을 방지하는 티모신 β4의 능력은 감소된 상처 체적을 유도하기 쉽고, 개선된 심실 기능이 생쥐들에서 관찰된다. ILK의 티모신 β4 활성화는 많은 세포 효과를 갖기 쉽지만, Akt의 활성화는 티모신 β4가 세포 생존을 촉진시키는 것을 통해 이루어지는 우세한 메커니즘일 수 있다. 이는 비-세포 자율적 형식으로 발생하기 쉽지만, 이는 심장 부상후 투여된 생쥐 골수-유도된 줄기 세포들에서 과다-발현될 때 심장 회복에 대한 Akt의 제안된 효과와 일치한다.

세포 사멸로부터 심장을 보호하는데 있어서 티모신 β4의 초기 효과는 "동면"에 의한 저산소성 상해를 생존시킬 수 있는 근세포를 암시한다. 동면하는 심근 아래 놓인 메커니즘들은 불명확하지만, 대사 및 에너지 사용의 변경은 세포 생존을 촉진시키는 것으로 보인다. 티모신 β4 등의 유도체들은 동면하는 심근과 유사한 방식으로 세포 특성들을 변경시킬 수 있고, 가능하게는 내피 세포 이주 및 신생 혈관 형성을 위한 시간을 허용한다.

여기서, 우리는 G-액틴 격리 펩티드 티모신 β4가 배아기 심장에서 심근 및 내피 세포 이주를 촉진시키고, 출생후 심근 세포에서 이러한 특성을 보존한다. 배양물 중에서 배아기 및 출생후 심근 세포들의 생존은 티모신 β4에 의해서 역시 증진되었다. 티모신 β4는 PINCH 및 인테그린 링크된 키나제(ILK)와 기능성 착물을 형성하고, 심근 세포들에 대한 티모신 β4의 효과에 필수적인 생존한 키나제 Akt/PKB의 활성화를 초래하는 것으로 밝혀졌다. 생쥐들에서 관상 동맥 결찰 후, 티모신 β4 처리는 심장에서 ILK 및 Akt 활성의 상향 조절을 초래하였고, 조기 근세포 생존을 증진시키고, 심장 기능을 개선시켰다. 이들 발견은 티모신 β4가 심근 세포 이주, 생존 및 회복을 촉진시키고, 이는 급성 심근 손상의 세팅에 있어서의 신규한 치료 타겟이다.

방법들

RNA 자체 혼성화 ( RNA in situ hybridization )

E 9.5-12.5 생쥐 배아들의 전체-설치된 또는 섹션 RNA 자체 혼성화는 티모신 β10의 치밀하게 관련된 전사물과 상동성을 공유하지 않는 생쥐 티모신 β4 cDNA의 3'UTR 영역으로부터 합성된 디곡시게닌-라벨되거나 또는 S-라벨된 안티센스 리보프로브들에 의해 수행되었다.

면역 조직 화학

배아기 또는 성체 심장 조직을 파라핀 내에 내포시키고, 그 섹션들을 면역 조직 화학을 위해 사용하였다. 배아기 심장 섹션들은 티모신 β10을 인식하지 않는 안티-티모신 β4와 함께 인큐베이션시켰다. 성체 심장들은 심장의 베이스로부터 정점에 이르는 10개의 등가의 레벨로 분할하였다. 일련의 섹션들은 트리크롬 섹션들 및 근절 a-액틴, c-키트, Sca-1, Abcg2, 및 BrdU 항체들과의 반응 및 TUNEL 분석(인터전 컴퍼니# S7111)을 위해 사용되었다.

콜라겐 겔 이주 분석

분출관은 E11.5 야생형 생쥐 배아들로부터 절개하고, 상기한 바의 콜라겐 매트릭스 상에 놓았다. 부착한지 10시간 후, 외식체들을 PBS 중의 티모신 β4 30ng/300㎕, PBS 단독 또는 티모신 β4 및 100nM 워트마닌 중에서 인큐베이션시켰다. 배양을 37℃, 5% CO₂에서 3-9일 동안 수행하고, 실온에서 10분 동안 PBS 중의 4% 파라포름알데히드 중에 고정시켰다. 세포들을 내피 세포 이주를 위한 각각의 조건 하에 적어도 3개의 별개의 외식체들을 사용하고, 심근 이주를 위해 8개의 별개의 외식체들을 사용하여 이주 및 거리의 정량화에 대해 계수하였다.

콜라겐 겔 외식체들에 대한 면역 세포 화학

파라포름알데히드-고정된 외식체들은 삼투 가능한 용액(10 mM PIPES pH6.8; 50mM NaCl; 0.5% 트리톤 X-100; 300 mM 자당; 3mM MgCl₂)으로 실온에서 10분 동안 삼투시키고, 실온에서 PBS로 2회 5분 동안 헹구어냈다. 일련의 봉쇄 및 헹굼 단계 후, 검출 항체들을 사용하고, 외식체들을 실온에서 10분 동안 평형 완충액(안티-페이드 키트)으로 헹구고 인큐베이션시켰다. 외식체들은 유리 현미경 슬라이드에 옮기고, 커버를 덮고, 형광 현미경으로 조사하였다. TUNEL 분석은 권장되는 바의 아폽태그 플러스 형광 자체 아폽토시스 검출 키트(인터전 컴퍼니 #S7111)를 사용하여 수행하였다.

배아기 T7 파지는 cDNA 라이브러리를 디스플레이한다

등량의 mRNA를 단리시키고, 스트레이트 A mRNA 단리 시스템(노바겐, 위스콘신 매디슨)을 사용함으로써 E9.5-12.5 생쥐 배아기 심장들로부터 정제하였다. cDNA는 T7Select10-3 오리엔트익스프레스 cDNA 랜덤 프라이머 클로닝 시스템(노바겐, 위스콘신주 메디슨)을 사용함으로써 합성하였다. 벡터 T7Select10-3은 5-15 파지 10B 코트 단백질 분자들의 C-말단에서 랜덤 프라임된 cDNA를 디스플레이하기 위해 사용되었다. 제2 코트 단백질 10A의 발현이 유도되었다. EcoRI 및 Hind III 소화 후, 삽입물들은 T7 select10-3 벡터 내로 결찰되었다(T7 셀렉트 시스템 매뉴얼, 노보겐). 이 벡터는 포장되고, 라이브러리의 복잡도는 10⁷이었다. 포장된 파지는 37℃에서 4시간 동안 BLT5615 대장균 균주의 로그 상 0.5L 배양물 중에서 증폭되었다. 세포 파편은 원심분리에 의해 제거되었고, 파지는 8% 폴리에틸렌 글리 콜과 함께 침전되었다. 파지는 1M NaCl/10mM 트리스-HCl pH8.0/1mM EDTA에 의해 펠렛으로부터 추출되었고, CsCI 구배 초원심 분리에 의해 정제되었다. 정제된 파지들은 PBS에 반하여 투석되고 -80℃에서 10% 글리세롤 중에 저장되었다.

T7 파지 바이오패닝 ( T7 phage biopanning )

아피-겔 15(Bio-Rad Laboratories) 300 ul는 아미노 말단 리신 잔기들을 통해 제조 업자들의 매뉴얼에 따라 합성된 티모신 β4 단백질(RegeneRx) 12 ug과 결합되었다. PBS 중에서 1시간 동안 3% BSA로 봉쇄한 후, 겔은 컬럼으로 옮겨지고, PBS 10ml, 1% SDS/PBS 2ml, 및 PBS/0.05% 트윈(Tween)-20(PBST) 1ml로 4회 세척되었다. PBST 500 ul 중의 10⁹ pfu의 T7 파지 배아기 심장 라이브러리(100배 복잡)가 컬럼에 도포되고, 낮은 엄격도의 바이오패닝을 달성하기 위해 5분 동안 인큐베이션되었다. 바운드되지 않은 파지들은 PBS 50ml로 세척하였다. 바운드된 파지들은 1% SDS 2.0ml 중에서 용출시켰다. 용출된 파지들 10 ㎕를 적정하고, 파지들의 나머지를 용해될 때까지 log 파지 BLT5615 대장균 배양액 0.5L 중에서 즉시 증폭시켰다. 세포 파편을 원심분리에 의해 제거하고, 용해물을 적정하고, 10⁹pfu의 파지들을 다음 라운드의 바이오팬닝을 위해 사용하였다. 4라운드의 바이오팬닝이 수행되었고, 30개의 단일 콜로니들이 순차 분석을 위해 증폭 전에 2차, 3차 및 4차 라운드 후 각각 선출되었다. 10개 이상의 아미노산들을 함유하는 단일 콜로니들이 증폭되고, ELISA 확인 분석을 위해 사용되었다.

ELISA 확인 분석

MaxiSorp Nunc-이뮤노 플레이트들(Nalgene Nunc International)이 합성된 티모신 β4 펩티드 1㎍/100㎕로 철야 코팅되었고, 이어서 PBS로 세척되고, 3% BSA로 봉쇄되었다. 10⁹ pfu의 증폭된 단일 파지 콜로니들이 각각의 웰에 별도로 PBST에 부가되었고, 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션되었다. T7 야생형 파지는 네거티브 대조군으로서 사용되었다. 바운드되지 않은 파지들은 PBS로(4회) 세척함으로써 제거하였고, 바운드된 파지들은 실온에서 1시간 동안 웰에 1% SDS/PBS 200㎕를 부가함으로써 용출되었다.

공면역 침전

Cos 및 10T1/2 세포들을 티모신 β4로 형질감염시키고, PINCH 및/또는 ILK 및 용해물들은 상기한 바와 같이 각각에 대한 항체들로 침전시켰다. 웨스턴 블랏들은 PINCH의 태그된 버전에 반하는 안티-ILK 폴리클로날 항체(산타 크루즈), 안티-티모신 β4 폴리클로날 항체 및 안티-myc 또는 안티-FLAG 항체를 사용하여 수행하였다.

동물들 및 수술 절차들

심근 경색은 상기한 바와 같이 좌측 전방 하향 관상 동맥의 결찰에 의해 16주령(25-30g)의 58마리 수컷 C57BL/6J 생쥐들에서 생성되었다. 결찰된 생쥐들 중의 29마리는 결찰 직후 티모신 β4 처리를 수용하였고, 나머지 29마리는 PBS 주사를 수용하였다. 처리는 티모신 β4(10ul 콜라겐 중의 200ng)에 의해서 또는 콜라겐 10ul에 의해서 심장 내로 주어지고; 티모신 β4(300 ㎕ PBS 중의 150㎍)에 의해 서 또는 PBS 3000에 의해서 복막내로 주어지거나; 또는 심장내 및 복막내 주사 모두에 의해 주어진다. 복막내 주사는 생쥐들이 희생될 때까지 3일마다 주어졌다. 복용량은 티모신 β4 생체 분포의 선행 연구들에 기초하였다. 심장이 제거되고, 조직학적 섹션화를 위해 칭량되고 고정되었다. 추가의 생쥐들이 결찰 후 0.5, 1, 3, 6 및 11일에 연구를 위한 유사한 형식으로 오퍼레이팅되었다.

초음파 심장 검진에 의한 심장 기능 분석

수축 기능을 평가하기 위한 초음파 심전도는 이미 기재된 바와 같이 M-모드 및 2-차원 측정을 사용하여 수행되었다. 그 측정들은 스캔 수준의 일치를 위한 기준점으로서 사용된 유두상 근육들에 의해 랜덤-맹 형식으로 수행된 적어도 2개의 별개의 스캔들로부터 6개의 선택된 심장 주기들의 평균을 나타냈다. 말기 이완 (end diastole)은 최대 좌심실(LV) 이완 치수(diastolic dimension)로서 정의되었고, 말기 수축은 후방벽 운동의 피크로서 정의되었다. 각각의 그룹의 단일 이상치(outlier)들은 통계학적 분석을 위해 생략되었다. 수축 기능의 대행으로서 구획 단축률(FS)은 다음과 같이 LV 치수로부터 산출되었다: FS=EDD-ESD/EDDx100%. 배출 분율(EF)은 2차원 영상들로부터 산출되었다. EDD, 말기 이완 치수; ESD, 말기 수축 치수.

상처 체적의 산출

상처 체적은 이전에 기재된 것과 유사하게 Openlab 3.03 소프트웨어 (임프로비전)를 사용하여 각각의 생쥐의 심장을 통해 6개의 섹션들을 사용하여 산출하였다. 콜라겐 증착의 백분율 면적은 맹 형식으로 각각의 섹션 상에서 측정되었고, 각각의 생쥐에 대해 평균되었다.

통계학적 분석들

통계학적 산출은 95% 신뢰 구간을 갖는 변수들의 표준 t-시험을 사용하여 수행되었다.

티모신 β4는 배아기 심장에서 심근 및 내피 세포 이주를 촉진시키고, 출생후 심근 세포에서 이러한 특성을 보존한다. 배양물 중에서 배아기 및 출생후 심근 세포들의 생존은 티모신 β4에 의해서 역시 증진되었다. 티모신 β4는 PINCH 및 인테그린-링크된 키나제(ILK)와 기능성 착물을 형성하고, 생존한 키나제 Akt(단백질 키나제 B로서 또한 공지됨)의 활성화를 초래한다. 생쥐들에서 관상 동맥 결찰 후, 티모신 β4 처리는 심장에서 ILK 및 Akt 활성의 상향 조절을 초래하였고, 조기 근세포 생존을 증진시키고, 심장 기능을 개선시켰다. 이들 발견은 티모신 β4가 심근 세포 이주, 생존 및 회복을 촉진시키는 것을 지시하고, 그것이 조절하는 경로는 급성 심근 손상의 세팅에 있어서의 신규한 치료 타겟이다.

실시예 3

합성 Tβ4 및 Tβ4에 대한 항체는 RegeneRx Biopharmaceuticals, Inc.(3 Bethesda Metro Center, Suite 700, Bethesda, MD 20814)에 의해 제공되었고, 콜라겐 겔 분석으로 시험되어 심장 내피 세포들의 간엽 세포들로의 변형에 대한 이들의 효과들을 측정하였다. 심장 판막들 및 기타 심장 조직의 발생은 상피-간엽 변형에 의해 형성되고, 이러한 과정의 결함들은 발생 및 삶의 전반 동안 심각한 심장 혈관 기형 및 부상을 유발할 수 있음이 잘 확립되었다. 생리적 농도에서 Tβ4는 콜라겐 겔 분석에서 심내막 세포들의 간엽 세포들로의 변환을 현저히 증진시킨다. 더욱이, Tβ4에 대한 항체는 이러한 변환을 억제 및 봉쇄한다. 방실계 심내막의 침습적 간엽으로의 변환은 심장 판막들의 형성 및 정상적인 심장 조직의 형성 및 유지에서 중요하다.

실시예 4

티모신 β4(TB4)의 체중 kg당 0.1ug 내지 1ug은 혈관 형성술 직후 심장 카테테르화에 의해 투여되고, 이어서 환자는 7일에 이르는 기간 동안 하루에 2회 내지 4회로 체중(BW) kg당 600 ug 내지 6 mg TB4를 정맥 내로 섭취한다. 치료 량 및 그 기간은 전기 심전도에 의해 측정된 바의 급성 심근 경색 후 심실의 손상 정도 및 혈관촬영 시점과 환자의 최초 입원 중 핵 영상 촬영에 좌우된다

실시예 5

kg당 0.1 ug 내지 1ug/TB4의 BW는 혈관 형성술 및/또는 스텐팅 직후에 심장 카테테르화(catherization)에 의해 투여된다. 이어서, 환자는 IV 투여에 의해 MI 후에 7일에 이르는 기간 동안 1일당 2 내지 4회 600 ug 내지 6 mg/kg BW를 섭취하였다. 심장 근육의 보전 및 재협착의 감소는 전기 심전도에 의해 측정되고 핵 영상화 또는 기타 진단 방법들에 의해 모니터링된다.

실시예 6

TB4는 플라크 형성으로 인해 관상 봉쇄를 감소시키기 위해 30일에 이르는 동안 1 mg 내지 10mg/kg BW/1일의 복용량으로 IV 투여된다.

실시예 7

본원에 개시된 바의 티모신 베타 4, 및 기타 조직 손상-예방 또는 -감소 펩티드들은 아스피린, tPA, 스트렙토키나제, 플라스미노겐, 응고 방지제, 애니스트렙플라제, 레테플라제, 테넥테플라제, 헤파린, 동맥 스텐트, 정맥 스텐트, 심장 카테테르 시술, 경동맥 스텐트, 대동맥 스텐트, 폐 스텐트, 혈관 형성술, 바이패스 수술 및/또는 신경 외과술을 포함하여, 동맥들 또는 기타 혈관들을 통해 혈류를 증가시키거나 또는 장애를 제거하기 위해 이용되는 약물들, 장치들 및 의료 시술들에 의해 투여된다. 조직 손상-감소 폴리펩티드들은 이 약물들, 장치들 및 시술들에 의해 야기되는 혈류의 증가 전후 및/또는 그 동안에 투여된다. 조직 손상-감소 폴리펩티드들은 혈류의 증가와 연관된 조직 손상을 감소 및/또는 예방한다.

Claims

티모신 β4(Tβ4), Tβ4의 이소 형태, Tβ4의 N-말단 단편, Tβ4의 C-말단 단편, Tβ4 술폭시드, LKKTET 펩티드, LKKTNT 펩티드, 액틴-격리 펩티드, 액틴 결합 펩티드, 액틴-유동 펩티드, 액틴 중합-조절 펩티드, 또는 조직 손상-감소 또는 -예방 활성을 갖는 그의 보존 변종 중의 적어도 하나를 포함하는 조직 손상-감소 또는 -예방 폴리펩티드를 포함하는 효과량의 조성물을 투여하는 단계, 또는 상기 조직 손상-감소 또는 -예방 폴리펩티드의 생산을 자극하는 자극제를 포함하는 효과량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하고, 이 조성물은 혈류의 증가에 영향을 미치기 전후 또는 그 동안 중의 적어도 한 단계 동안 상기 조직에 투여되는 것인, 조직과 소통하는 혈관을 통해 혈류의 증가에 영향을 미친 후 발생하는 조직 손상의 치료 또는 예방 방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 아미노산 서열 KLKKTET 또는 LKKTETQ, 티모신 β4(Tβ4), Tβ4의 N-말단 변종, Tβ4의 C-말단 변종, Tβ4의 이소 형태 또는 산화된 Tβ4를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 전신으로 투여되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 관상 조직에 직접적으로 투여되는 것인 방 법.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 재조합물 또는 합성 물질인 방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 티모신 β4인 방법.
제6항에 있어서, 상기 시약은 티모신 β4의 생산을 자극하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 혈류의 증가는 아스피린, tPA, 스트렙토키나제, 플라스미노겐, 응고 방지제(anti-clotting agents), 애니스트레플라제, 레테플라제, 테넥테플라제 또는 헤파린 중의 적어도 하나의 투여에 의해 영향받는 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 혈류의 증가는 아스피린, tPA, 스트렙토키나제, 플라스미노겐, 응고 방지제, 애니스트레플라제, 레테플라제, 테넥테플라제 또는 헤파린 중의 적어도 하나의 투여에 의해 영향받는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 혈류의 증가는 동맥 스텐트, 정맥 스텐트, 심장 카테테르 시술, 경동맥 스텐트, 대동맥 스텐트, 폐 스텐트, 혈관 형성술, 바이패스 수술 또는 신경 외과술 중의 적어도 하나에 의해 영향받는 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 혈류의 증가는 동맥 스텐트, 정맥 스텐트, 심장 카테테르 시술, 경동맥 스텐트, 대동맥 스텐트, 폐 스텐트, 혈관 형성술, 바이패스 수술 또는 신경 외과술 중의 적어도 하나에 의해 영향받는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 조직 손상-예방 또는 감소 펩티드는 Tβ4, Tβ4ala, Tβ9, Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14, Tβ15, 겔졸린, 비타민 D 결합 단백질(DBP), 프로필린, 코필린, 애드세르베틴, 프로포미오신, 핀실린, 디팩틴, 드나젤, 빌린, 프래그민, 세베린, 캡핑 단백질, β-액틴 및 아쿠멘틴을 포함하는 것인 방법.
조직 손상-감소 또는 예방 활성을 갖는 제1항의 조직 손상-예방 또는 -감소 폴리펩티드 또는 자극제를 포함하고, 상기 폴리펩티드 및 상기 시약이 개별적으로 또는 함께 투여될 수 있는 혈류를 증가시키는-유효량의 혈류 증가제를 추가로 포함하는 약제학적 조합물.
제1항에 있어서, 상기 조직 손상은 신경학적 손상인 방법.
제14항에 있어서, 상기 손상은 외상, 질병, 특발증, 또는 발작에 기인한 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 손상은 허혈(ischemia)에 기인한 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 손상은 발작에 기인한 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 조직 내의 혈류를 증가시키기 위해 혈류-증가제와 관련하여 상기 폴리펩티드를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 혈류-증가제는 아스피린, tPA, 스트렙토키나제, 플라스미노겐, 응고 방지제, 애니스트레플라제, 레테플라제, 테넥테플라제 또는 헤파린을 포함하는 것인 방법.
제19항에 있어서, 상기 혈류-증가제는 tPA 또는 스트렙토키나제를 포함하는 것인 방법.
제18항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 혈류를 증가시키기 위해 상기 혈류-증가제 전후 또는 그 동안에 투여되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 약 0.1-50 마이크로그램 범위의 상기 폴리펩티드 복용량으로 투여되는 것인 방법.
제22항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 약 1-30 마이크로그램 범위의 상기 폴리펩티드 복용량으로 투여되는 것인 방법.
제23항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 티모신 베타4인 방법.