ES2668815T3 - Procedimientos, sistemas y composiciones para estimular la recuperación de la neuropatía periférica - Google Patents

Abstract

Composición que comprende timosina β4 para su utilización en el tratamiento para estimular la recuperación de la neuropatía periférica en un sujeto, comprendiendo dicho tratamiento administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición.

Description

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DESCRIPCION

Procedimientos, sistemas y composiciones para estimular la recuperación de la neuropatía periférica SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se refiere al sector de la estimulación de la recuperación de la neuropatía periférica. ANTECEDENTES

La neuropatía periférica es una de las complicaciones más frecuentes e incapacitantes de la diabetes mellitus. Sigue existiendo una necesidad en la técnica de procedimientos, sistemas y composiciones eficaces para estimular la recuperación de la neuropatía periférica.

CARACTERÍSTICAS

El objeto de la presente invención es una composición que comprende timosina p4 para su utilización en el tratamiento para estimular la recuperación de neuropatía periférica en un sujeto y timosina p4 para su utilización en el tratamiento para estimular la recuperación de neuropatía periférica en un sujeto, como se reivindica en las reivindicaciones independientes. En las respectivas reivindicaciones dependientes se reivindican realizaciones de la invención.

Los siguientes ejemplos de algunas realizaciones se dan a conocer sin limitar la invención a solo aquellas realizaciones descritas en el presente documento y sin negar ninguna realización u objeto.

Los procedimientos para estimular la recuperación de la neuropatía periférica comprenden administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende timosina p4, y opcionalmente también, un agente peptídico que comprende la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT, que incluye, pero no se limita a las mismas, la variante o variantes conservadoras de Tp4, o un agente estimulante que estimula la producción de un péptido LKKTET o LKKTNT, o una variante conservadora del mismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

A continuación se describirán algunas realizaciones, solo a modo de ejemplo y sin limitación de otras realizaciones, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 consiste en imágenes y representaciones de datos que muestran datos que indican que la Tp4 mejora la función vascular en el nervio ciático.

La figura 2 consiste en imágenes y representaciones de datos que muestran datos que indican que la Tp4 aumenta el área inmunorreactiva de la ocludina en las paredes del vaso.

Las figuras 3 y 4 son representaciones de datos que muestran datos que indican el efecto de la Tp4 sobre la función neurológica.

La figura 5 consiste en imágenes y representaciones de datos que muestran datos que indican que la Tp4 regula positivamente la expresión de Ang1 en células endoteliales y células de Schwann en un modelo en ratón diabético.

La figura 6 consiste en imágenes y representación de datos que muestran datos que indican que la vía de señalización de Ang/Tie2 media en el efecto de la Tp4 sobre la función endotelial.

La figura 7 consiste en imágenes y representación de datos que muestra datos que indican que Ang1 secretada por las células de Schwann tratadas con Tp4 mejora la función endotelial.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Sin limitarse a solo las realizaciones expresamente dadas a conocer en el presente documento y sin negar ninguna realización u objeto, y sin estar sujeto a ninguna teoría específica, algunas realizaciones comprenden, además del péptido secuestrador de actina timosina beta 4 (también, "Tp4" o " TB4"), otros agentes que comprenden péptidos secuestradores de actina o fragmentos peptídicos que contienen la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT, o variantes conservadoras de los mismos, para estimular la recuperación de la neuropatía periférica en pacientes que la padecen, tales como pacientes diabéticos, por ejemplo, diabetes de tipo II, o aquellos que padecen diabetes mellitus.

La timosina beta 4 se identificó inicialmente como una proteína que está regulada positivamente durante la migración y diferenciación de las células endoteliales in vitro. La timosina beta 4 se aisló originalmente del timo y es

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un polipéptido ubicuo de 43 aminoácidos y 4,9 kDa identificado en diversos tejidos. (Sin limitación, véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 1; puede existir alguna variación de especies en la secuencia precisa, y cualquiera y todas estas secuencias pueden utilizarse en algunas realizaciones, además de Tp4. Algunas realizaciones pueden comprender la utilización de Tp4, y la adición adicional de ciertos grupos químicos en un extremo o en ambos extremos de la secuencia o secuencias como un ejemplo solo y sin limitación, la SEQ ID NO: 2 enumerada más adelante). Se han atribuido varias funciones a la proteína Tp4, incluyendo un papel en la diferenciación y migración de células endoteliales, diferenciación de células T, secuestro de actina, vascularización y cicatrización de heridas.

En el presente documento se describe un procedimiento para estimular la recuperación de la neuropatía periférica en un sujeto, que comprende administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende timosina p4 y, opcionalmente, un agente peptídico, que puede ser un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT (respectivamente, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4), o una variante conservadora de la misma, y/o isoformas, análogos o derivados de Tp4, que incluyen, pero no se limitan a los mismos, KLKKET (SEQ ID NO: 5), LKKTETQ (SEQ ID NO: 6), variantes en N-terminal de Tp4, variantes en C-terminal de Tp4 y antagonistas de Tp4. También se puede utilizar Tp4 oxidada además de Tp4. En algunas realizaciones, Tp4 se utiliza con un agente peptídico que puede ser un péptido recombinante o sintético, o un péptido aislado o purificado.

Las composiciones que pueden utilizarse de acuerdo con algunas realizaciones incluyen timosina beta 4 (Tp4) y agentes peptídicos, tales como isoformas, análogos o derivados de Tp4, incluyendo Tp4 oxidado, variantes en N-terminal de Tp4, variantes en C-terminal de Tp4 y antagonistas de Tp4, polipéptidos o fragmentos peptídicos que comprenden o consisten esencialmente en la secuencia de aminoácidos LKKTeT o variantes conservadoras de las mismas. La solicitud internacional número de serie PCT/US99/17282 da a conocer isoformas de Tp4 que pueden ser útiles de acuerdo con algunas realizaciones, así como también la secuencia de aminoácidos LKKTET y variantes conservadoras de la misma, que pueden utilizarse con algunas realizaciones, además de Tp4. La solicitud internacional número de serie PCT/GB99/00833 (WO 99/49883) da a conocer timosina p4 oxidada que puede utilizarse de acuerdo con algunas realizaciones, además de Tp4. Aunque algunas realizaciones se describen principalmente en lo sucesivo con respecto a Tp4 y a las isoformas de Tp4, debe entenderse que la siguiente descripción pretende ser igualmente aplicable a la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT, péptidos y fragmentos que comprenden o consisten esencialmente en LKKTET o LKKTNT, variantes conservadoras de las mismas que tienen actividad inhibidora de la enfermedad por neuropatía periférica, y/o isoformas, análogos o derivados de Tp4, que incluyen variantes en N-terminal de Tp4, variantes en C-terminal de de Tp4 y antagonistas de Tp4. Algunas realizaciones también pueden utilizar Tp4 oxidada. Los agentes anteriores, cuando se utilizan, se utilizan además de Tp4 en la composición de la presente invención.

Los procedimientos para estimular la recuperación de la neuropatía periférica en un sujeto comprenden administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende Tp4 y, opcionalmente, un agente peptídico que comprende la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT, una variante conservadora de la misma o un agente estimulante que estimula la producción de un péptido LKKTET o LKKTNT, o una variante conservadora del mismo.

Un procedimiento para estimular la recuperación de la neuropatía periférica, en un sujeto, comprende poner en contacto el tejido afectado con una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que contiene Tp4 y, opcionalmente, un agente peptídico adicional como se describe en el presente documento. Los ejemplos de administración directa incluyen, por ejemplo, poner en contacto el tejido, mediante aplicación directa o inhalación, con una solución, loción, bálsamo, gel, crema, pasta, pulverizador, suspensión, dispersión, hidrogel, pomada o aceite, que comprende Tp4, y opcionalmente un agente peptídico adicional como se describe en el presente documento. La administración sistémica incluye, por ejemplo, inyecciones intravenosas, intraperitoneales e intramusculares de una composición que contiene Tp4, y, opcionalmente, un agente peptídico adicional como se describe en el presente documento, en un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como agua para inyectables.

La Tp4 y otros agentes peptídicos para su utilización en algunas realizaciones, como se describen en el presente documento, se pueden administrar en cualquier cantidad efectiva. Por ejemplo, un agente peptídico como se describe en el presente documento puede administrarse en dosificaciones dentro del intervalo de aproximadamente 0,0001-1.000.000 de microgramos, más preferentemente en cantidades dentro del intervalo de aproximadamente 0,1-5.000 microgramos, de la forma más preferente, dentro del intervalo de aproximadamente 1-100 microgramos.

Una composición de acuerdo con algunas realizaciones puede administrarse diariamente, cada dos días, cada dos semanas, cada dos meses, etc., con una sola aplicación o varias aplicaciones al día de administración, tales como aplicaciones 2, 3, 4 o más veces al día de administración.

Se han identificado muchas isoformas de la Tp4 y tienen aproximadamente un 70%, o aproximadamente un 75%, o aproximadamente un 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos conocida de la Tp4. Dichas isoformas incluyen, por ejemplo, Tp4ala, Tp9, Tp10, Tp11, Tp12, Tp13, Tp14 y Tp15. Similar a la Tp4, se ha demostrado que las isoformas Tp10 y Tp15 secuestran actina. Tp4, Tp 10 y Tp15, así como estas otras isoformas comparten una secuencia de aminoácidos, LKKTET o LKKTNT, que parece estar implicada en la mediación del

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secuestro de la actina o unión a la actina. Aunque sin desear quedar ligado a teoría específica alguna, la actividad de los agentes peptídicos como se describe en el presente documento puede deberse, al menos en parte, a la actividad antiinflamatoria de dichos agentes. La Tp4 también puede modular la polimerización de actina (por ejemplo, las p-timosinas parecen despolimerizar la F-actina secuestrando la G-actina libre). La capacidad de la Tp4 para modular la polimerización de actina puede deberse a su capacidad para unirse o secuestrar actina a través de la secuencia LKKTET o LKKTNT. Por lo tanto, como con la Tp4, otras proteínas que son antiinflamatorias y/o se unen a o secuestran actina, o modulan la polimerización de la actina, incluyendo las isoformas de Tp4 que tienen la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT, es probable que sean eficaces, en una combinación con Tp4, como se establece en el presente documento.

Por lo tanto, se contempla específicamente que los péptidos LKKTET o LKKTNT conocidos tal como se describen en el presente documento, que incluyendo las isoformas Tp4, tales como Tp4ala, Tp9, Tp10, Tp11, Tp12, Tp13, Tp14 y Tp15, así como las isoformas de Tp4 aún no identificadas, serán útiles en los procedimientos descritos en el presente documento en combinación con Tp4. Como tales péptidos LKKTET o LKKTNT como se describen en el presente documento, incluyendo las isoformas de Tp4, son útiles en los procedimientos descritos en el presente documento, incluidos los procedimientos practicados en un sujeto. Algunas realizaciones dan a conocer composiciones farmacéuticas que comprenden Tp4, y que comprenden además péptidos LKKTET o LKKTNT como se describe en el presente documento, así como las isoformas de Tp4, Tp4ala, Tp9, Tp10, Tp 11, Tp12, Tp13, Tp14 y Tp15, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Además, otros agentes o proteínas que tienen actividad antiinflamatoria y/o secuestradora de actina o capacidad de unión, o que pueden movilizar actina o modular la polimerización de actina, como se demuestra en un ensayo de secuestro, unión, movilización o polimerización apropiado, o identificados por la presencia de una secuencia de aminoácidos que media en la unión a actina, tal como LKKTET o LKKTNT, por ejemplo, puede emplearse de forma similar en los procedimientos descritos en el presente documento, en combinación con Tp4. Tales proteínas pueden incluir gelsolina, proteína de unión a vitamina D (DBP), profilina, cofilina, depactina, ADNasaI, vilina, fragmina, severina, proteína de protección, p-actinina y acumentina, por ejemplo. Dado que tales procedimientos incluyen los practicados en un sujeto, algunas realizaciones dan a conocer además composiciones farmacéuticas que comprenden gelsolina, proteína de unión a vitamina D (DBP), profilina, cofilina, depactina, ADNasaI, vilina, fragmina, severina, proteína de protección, p-actinina y acumentina como se expone en el presente documento, en combinación con Tp4. Algunas realizaciones incluyen la utilización de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos LKKTET o LKKTNT y variantes conservadoras de la misma, en combinación con Tp4.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "variante conservadora" o variaciones gramaticales de la misma denota la sustitución de un resto de aminoácido por otro resto biológicamente similar. Ejemplos de variaciones conservadoras incluyen la sustitución de un resto hidrófobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro o la sustitución de un resto polar por otro, tal como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico o glutamina por asparagina, y similares.

La Tp4 se ha localizado en varios tipos de tejidos y células y, por lo tanto, pueden añadirse agentes que estimulan la producción de un péptido LKKTET o LKKTNT, tal como Tp4 u otro agente peptídico como se describe en el presente documento, a una composición que comprende Tp4, para producir un agente peptídico a partir de un tejido y/o una célula. Tales agentes estimulantes pueden incluir miembros de la familia de factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento similar a insulina (IGF-1), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento transformante beta (TGF-p), el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), timosina a1 (Ta1) y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). Más preferentemente, el agente estimulante es el factor transformante beta de crecimiento (TGF-p) u otros miembros de la superfamilia de TGF-p.

De acuerdo con algunas realizaciones, los sujetos se tratan con Tp4 y un agente estimulante que estimula la producción en el sujeto de un agente peptídico, como se define en el presente documento.

Adicionalmente, se pueden añadir otros agentes que ayudan a estimular la recuperación de la neuropatía periférica a una composición, junto con Tp4, y, opcionalmente, un agente peptídico adicional como se describe en el presente documento. Por ejemplo, y no a modo de limitación, se puede añadir un agente peptídico como se describe en el presente documento solo o en combinación con uno o más de los siguientes agentes: antibióticos, VEGF, KGF, FGF, PDGF, TGFp, IGF-1, IGF-2, IL-1, protimosina a y/o timosina a en una cantidad terapéuticamente eficaz.

Algunas realizaciones comprenden una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de Tp4, y, opcionalmente, un agente peptídico adicional como se describe en el presente documento en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La dosis real o reactivo, formulación o composición real que proporciona el tratamiento puede depender de muchos factores, incluido el tamaño y la salud de un sujeto. Sin embargo, los expertos en la materia pueden utilizar enseñanzas que describen los procedimientos y técnicas para determinar las dosis clínicas como se da a conocer en el documento PCT/US99/17282, citado anteriormente, y las referencias citadas en el presente documento, para

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determinar la dosificación apropiada a utilizar.

Las formulaciones adecuadas pueden incluir timosina p4 y, opcionalmente, un agente peptídico adicional como se describe en el presente documento a una concentración dentro del intervalo de aproximadamente el 0,001 - 50% en peso, más preferentemente dentro del intervalo de aproximadamente el 0,01 - 0,1% en peso, de la forma más preferente aproximadamente el 0,05% en peso.

Los enfoques terapéuticos descritos en el presente documento con respecto a algunas realizaciones implican diversas vías de administración o liberación de Tp4, y, opcionalmente, un agente peptídico adicional como se describe en el presente documento, incluyendo cualquier técnica de administración convencional (por ejemplo, pero sin limitaciones a las mismas, administración directa, inyección local, inhalación o administración sistémica) a un sujeto. Los procedimientos y composiciones que utilizan o que contienen Tp4 y, opcionalmente, un agente peptídico adicional como se describe en el presente documento pueden formularse en composiciones farmacéuticas mediante mezcla con excipientes o vehículos no tóxicos farmacéuticamente aceptables.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se dan a conocer, sin limitar la invención a solo aquellas realizaciones descritas en el presente documento y sin negar ninguna otra realización u objeto.

Ejemplo 1

Antecedentes: La neuropatía periférica es una de las complicaciones más frecuentes e incapacitantes de la diabetes mellitus. Los inventores evaluaron si la timosina p4 ("Tp4") mejora la disfunción neurovascular inducida por diabetes en el nervio ciático y estimula la recuperación de la función neurológica de la neuropatía diabética periférica. Los resultados de la evaluación de los autores muestran que la timosina beta 4 estimula la recuperación de la neuropatía periférica en ratones diabéticos de tipo II.

Procedimientos y resultados: El tratamiento con Tp4 de ratones db/db que tenían neuropatía periférica aumentó sustancialmente la densidad vascular funcional y el flujo sanguíneo regional en el nervio ciático, y mejoró la función nerviosa. La Tp4 reguló positivamente la angiopoyetina-1 (Ang1), pero suprimió la expresión de Ang2 en células endoteliales y de Schwann en el nervio ciático diabético. La incubación in vitro de células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) con Tp4 en condiciones de glucosa alta anuló completamente la expresión de Ang1 regulada negativamente por niveles altos de glucosa y la formación de tubos capilares reducida por niveles altos de glucosa. Además, la incubación de HUVEC con niveles altos de glucosa con medio acondicionado recogido de células de Schwann humanas (HSC) tratadas con Tp4 revirtió significativamente la formación de tubo capilar reducida por niveles altos de glucosa. Un anticuerpo neutralizado contra Tie2 suprimió el efecto de Tp4 y el medio acondicionado en HUVEC. La Tp4 activó Akt en hSc, mientras que el bloqueo de PI3K/Akt con un inhibidor de PI3K, LY294003, inactivó Akt y suprimió el efecto de Tp4 sobre la regulación positiva de Ang1.

Los resultados de los inventores demuestran que Tp4 mejoró notable e inesperadamente la función vascular en el nervio ciático y la función del nervio periférico en un modelo en ratón de neuropatía periférica diabética. Sin estar ligado a teoría específica alguna, la Tp4 puede actuar sobre las células endoteliales y las células de Schwann para preservar y/o restaurar la función vascular en el nervio ciático, lo que facilita la mejora de la función del nervio periférico bajo neuropatía diabética.

La neuropatía periférica es una de las complicaciones más frecuentes e incapacitantes de la diabetes mellitus. Los estudios de neuropatía periférica diabética de animales de experimentación y seres humanos indican que el desarrollo de la neuropatía diabética está estrechamente relacionado con una disfunción neurovascular marcada1-3. La disfunción vascular precede a la aparición de déficit de velocidad de la conducción nerviosa, lo que lleva a daño

nervioso3-5.

La timosina beta 4 (Tp4), un pequeño polipéptido de 4,9 kDa de 43 aminoácidos, es un importante péptido secuestrador de la actina G intracelular9. Entre sus múltiples funciones biológicas, la Tp4 estimula la angiogénesis después del infarto de miocardio y la vasculogénesis durante el desarrollo10,11. La Tp4 se encuentra actualmente en un ensayo clínico de fase II para el tratamiento de pacientes con infarto agudo de miocardio12. Antes del trabajo de los inventores no se sabía si la Tp4 tiene un efecto terapéutico sobre la neuropatía diabética o no.

Las angiopoyetinas (Ang1 y Ang2) y su receptor Tie-2 regulan el desarrollo vascular y la homeostasis17,18. La Ang-1 estimula la estabilización vascular y la maduración, mientras que la Ang2 actúa como un agonista parcial o antagonista de la señalización de Ang1, dependiendo de la biodisponibilidad del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)17,19,20. La vía de señalización de Ang/Tie2 desempeña un papel importante en la mediación de la función vascular bajo diabetes21,22. La hiperglucemia regula negativamente la Ang1 y regula positivamente la Ang2 21,23 Los aumentos en los niveles de Ang1 normalizan la vasculatura inmadura inducida por la diabetes24. La Ang1, aumentando la angiogénesis, reduce el infarto de miocardio, mientras que una elevación de los niveles de Ang2 agrava el infarto en ratas diabéticas21. Los pacientes con neuropatía diabética periférica tienen niveles elevados de

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Ang2 circulante25. Sin embargo, el efecto de la vía de señalización Ang/Tie2 sobre la neuropatía diabética periférica no se ha estudiado extensamente.

Utilizando un modelo en ratón de diabetes de tipo II, los inventores evaluaron si el tratamiento de la neuropatía diabética periférica con Tp4 mejora la disfunción neurovascular y mejora la función nerviosa periférica. Además, los inventores evaluaron el efecto de Tp4 sobre la vía de señalización Ang/Tie2 bajo neuropatía diabética periférica.

Procedimiento:

Animales - Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con la guía del NIH, NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, y fueron aprobados por el Comité institucional para el cuidado de animales del Henry Ford Hospital. Se utilizaron ratones macho BKS.Cg-m+/+ Lepdb/J(db/db) (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine) de 20 semanas de edad. Como animales de control se utilizaron ratones heterocigotos de edad compatible (db/m), un genotipo no penetrante (Jackson Laboratories).

Tratamiento con Tp4 - Se trataron ratones db/db a las 20 semanas de edad con Tp4 a una dosis de 6 mg/kg o 24 mg/kg (RegeneRx, Inc, inyección intraperitoneal, i.p.), cada 3 días durante 4 semanas (n = 10/grupo). Como grupo de control se utilizaron ratones db/db (n = 10/grupo) a la misma edad tratados con el mismo volumen de solución salina. Como grupos de control adicionales se utilizaron ratones db/m de edad compatible con Tp4 (6 mg/kg i.p. cada 3 días, n = 10/grupo) o solución salina (n = 10/grupo). Se sacrificó a todos los ratones 8 semanas después del tratamiento inicial. Las dosis de Tp4 se seleccionaron basándose en estudios publicados13.

Medición del flujo sanguíneo del nervio ciático regional mediante flujometría de láser Doppler -

El flujo sanguíneo regional del nervio ciático se midió al final de los experimentos (8 semanas después del tratamiento inicial) utilizando flujometría de láser Doppler (LDF PeriFlux PF4, Perimed AB, Jarfalla, Suecia).26 Brevemente, con anestesia, el ratón se montó en un marco estereotáctico bajo anestesia. El nervio ciático izquierdo se expuso en la región media del muslo y la temperatura rectal de los animales se mantuvo a 37 ± 1,0 °C durante el período de medición utilizando un baño de agua controlado por realimentación. Utilizando un micromanipulador, se colocó una sonda de LDF en la superficie del nervio ciático y se registraron los valores de flujo relativo expresados como unidades de perfusión cada 5 minutos durante un total de 3 veces. Los valores de flujo sanguíneo del nervio ciático regional de ratones db/m se utilizaron como valores iniciales y los datos se presentan como un porcentaje de los valores iniciales.

Mediciones neurofisiológicas -

La velocidad de conducción del nervio ciático se evaluó con técnicas de registro ortodrómico, como se ha descrito anteriormente27. Brevemente, se administraron pulsos de corriente de onda cuadrada simples activados utilizando un estimulador de pulso aislado (Modelo 2100, A-M Systems, Everett, WA). Las electromiografías simultáneas se registraron mediante dos electrodos esterilizados colocados en los músculos intrínsecos del pie con un amplificador Grass (modelo P5, Grass Instruments, Quincy, MA). Durante las mediciones, la temperatura rectal del animal se mantuvo a 37 ± 1,0 °C utilizando un baño de agua controlado por realimentación. La velocidad de conducción nerviosa motora (VCM) y la velocidad de conducción nerviosa sensorial (VCS) se calcularon de acuerdo con un estudio publicado7.

Pruebas de retirada de la cola y de placas calientes - Para examinar la hiperalgesia térmica, se emplearon pruebas de retirada de la cola y de placas caliente según los procedimientos publicados27-29. En pocas palabras, para la prueba de retirada de la cola, un ratón se contuvo en un tubo de polipropileno cónico con una abertura a través del cual se expuso su cola. Aproximadamente 2 cm de la cola del ratón se sumergieron en un baño de agua a 52 °C ± 0,2 y se registró el tiempo hasta que el roedor mueve o retira su cola28. Para la prueba de placa caliente, se colocó un ratón dentro de una cámara de plexiglás sobre una superficie de vidrio transparente y se dejó aclimatar durante al menos 20 minutos. Se utilizó un medidor de estimulación térmica (IITC Model 39 Hot Plate Analgesia Meter, IITC Life Science, CA) con temperatura del suelo a 55 °C (configuración del fabricante). Se registró la latencia de la retirada de la pata en respuesta al calor radiante29. Se emplearon períodos de corte de 10 y 15 segundos para evitar el daño tisular para las pruebas de retirada de la cola y de placas calientes, respectivamente. En ambas pruebas, se tomaron al menos tres lecturas por animal a intervalos de 15 minutos, y se calculó el promedio.

Inmunohistoquímica - Los nervios ciáticos del lado izquierdo y derecho se aislaron a nivel de la mitad del muslo, se fijaron en paraformaldehído al 4% y se incluyeron en parafina según el protocolo publicado27. Se utilizaron tres secciones transversales (6 pm de grosor) o tres secciones longitudinales (6 pm de grosor) en una de cada diez series (separadas por 60 pm) para cada animal para inmunotinción de acuerdo con los protocolos publicados de los inventores27. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo policlonal anti-Ang1 de conejo (1:2.000; Abcam, Cambridge, MA), anticuerpo monoclonal anti-CD31 de ratón (1:500, BD Biosciences, San Jose, CA), anticuerpo policlonal anti-factor de Von Willebrand de conejo (vWF) (1:300, Dako, Carpenteria, CA), anticuerpo monoclonal anti-ocludina de ratón (1:200, Zymed, San Francisco, CA) y anticuerpo monoclonal anti-S100 de conejo (1:400, Abcam). Se utilizó IgG de conejo o cabra como control negativo. Se realizó contratinción de las secciones

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con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (1:5.000).

Análisis y cuantificación de imágenes - Para examinar la perfusión microvascular en el nervio ciático, a los ratones se les administró por vía intravenosa isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano (2x106 de peso molecular, Sigma; 0,2 ml de 50 mg/ml) 10 minutos antes del sacrificio30. Se extirparon rápidamente los nervios ciáticos y se introdujeron en paraformaldehído al 2% durante 2 horas. Y a continuación, los nervios se incluyeron en el compuesto OCT para secciones transversales congeladas. Se utilizaron tres secciones transversales congeladas (20 |jm/sección de grosor) a intervalos de 60 |jm de cada ratón para el análisis de imágenes. Se digitalizaron las secciones bajo un objetivo de microscopio 20x (Zeiss Axiophot) a través de un sistema de Dispositivo de Imágenes de microcomputador (MCID) (Imaging Research Inc, St. Catharines, ON, Canadá)30. Se contó el número total de vasos perfundidos con FITC-dextrano y se dividió por el área total del tejido para determinar la densidad vascular.

Para el análisis de la morfología y densidad vascular inmunorreactiva del vWF, se utilizaron tres secciones espaciadas a intervalos de 60 jm de cada ratón. Aleatoriamente se formaron tres campos de la vista por sección bajo un objetivo 20x y se midieron el perímetro vascular inmunorreactivo del vWF y el número total de vasos positivos para vWF utilizando MCID.

Todos los análisis se realizaron con el examinador desconociendo la identidad de las muestras que se están estudiando.

Cultivo celular-

Los inventores definieron un medio de glucosa normal (GN) como medio que contiene glucosa 5 mM, mientras que un medio con niveles altos de glucosa (GA) se denomina medio que contiene glucosa 30 mM, que se eligió para que coincidiera con los niveles de glucosa prevalentes en pacientes diabéticos no controlados31. Otros investigadores han utilizado estas concentraciones de glucosa para los experimentos de hiperglucemia in vitro32' 33

Se cultivaron células humanas de Schwann (HSC, ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA) derivadas de cultivo primario y células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC, Colección Americana de Cultivos Tipo, ATCC, Manassas, VA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ScienCell Research Laboratories y ATCC). Para examinar el efecto de la Tp4 sobre las HSC, se cultivaron HSC en condiciones de GN o GA en presencia de diferentes concentraciones de Tp4 (0, 25, 50 y 100 ng/ml) durante 24 o 72 horas. Las células se recogieron para la RT-PCR en tiempo real y el análisis de transferencia de tipo Western. Para recolectar el medio acondicionado de las HSC, se sembraron en placas 2,5 * 106 HSC en placas de 35 mm de diámetro en 1,2 ml de medio definido. Las células se cultivaron en condiciones de GN y GA en presencia o ausencia de Tp4 (100 ng/ml) durante 24 horas. Las HSC se lavaron tres veces con PBS y se añadió un medio libre de suero fresco para evitar la contaminación excesiva por Tp4. Las células se cultivaron durante 48 horas adicionales, el sobrenadante (medio acondicionado) se recogió, se centrifugó durante 10 minutos a 1.000 rpm y se almacenó a -80 °C.

Para evaluar el efecto de la Tp4 en la angiogénesis in vitro, se utilizó un ensayo de tubo de tipo capilar34-36. En pocas palabras, se cultivaron las HUVEC (2x10^ células) en placas de 96 pocillos revestidas con Matrigel (BD Biosciences, Rockville, MD) en el medio acondicionado o Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) en presencia o ausencia de Tp4 (0, 25, 50 y 100 ng/ml ) durante 5 horas. La longitud total de los tubos se midió en 3 campos aleatorios de cada pocillo utilizando MCID37.

RT-PCR en tiempo real -

Las muestras de ARN total de las células se aislaron utilizando el kit de aislamiento Stratagene Absolutely RNA MicroRNA (Stratagene, La Jolla, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN complementario (ADNc) se transcribió de forma inversa a partir de las mismas concentraciones de productos de ARN total utilizando hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa M-MLV (Invitrogen, Carlsbad, CA). Utilizando el procedimiento de PCR en tiempo real con verde SYBR38, se realizó la PCR cuantitativa en un instrumento de pCr ABI 7000 (Applied Biosystems, Foster City, CA) mediante parámetros de programa de tres etapas proporcionados por el fabricante, de la siguiente manera; 2 minutos a 50 °C, 10 minutos a 95 °C y, a continuación, 40 ciclos de 15 segundos a 95 °C y 1 minuto a 60 °C. La especificidad del producto de amplificación producido se confirmó mediante el examen de los diagramas de la reacción de disociación. Cada muestra se analizó por triplicado y las muestras obtenidas de tres experimentos independientes se utilizaron para el análisis de la expresión génica relativa utilizando el procedimiento 2-mct 39 Se diseñaron los siguientes cebadores para la PCR en tiempo real utilizando el software Primer Express (ABI): gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (DIR, AGA ACA TCA TCC CTG CAT CC (SEQ ID NO: 7); INV, CAC ATT GGG GGT AGG AAC AC (SEQ ID NO: 8)) y Ang1 (DIR, GAA GGG AAC CGA GCC TAT TC (SEQ ID NO: 9); INV, GCT GAA ATC AGC ACC GTG TA (SEQ ID NO: 10)), Ang2 (DIR, CAG ATC CGG GCT CTA GAC AG (SEQ ID NO: 11); INV, TCC GGA AAT CGT TCT TCA TC (SEQ ID NO: 12)).

Análisis de transferencia de tipo Western-

Se realizó el análisis de transferencia de tipo Western según los procedimientos publicados38. Brevemente, se

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cargaron cantidades iguales de proteínas en gel de SDS-poliacrilamida al 10%. Después de la electroforesis, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa y, a continuación, se aplicaron las sondas a las transferencias con los siguientes anticuerpos: anticuerpo policlonal anti-Ang1 de conejo (1:1.000; Abcam, Cambridge, MA), anticuerpo policlonal anti-Ang2 de conejo (1:1.000; Abcam), fosfo-Akt (1:1.000, Cell Signaling Technology, Inc. Danvers, MA) y Akt (1:1.000, Cell Signaling Technology). Para la detección, se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (1:2.000) seguido de desarrollo de quimioluminiscencia potenciado (Pierce, Rockford, IL). La normalización de los resultados se garantizó mediante la realización en paralelo de transferencia de tipo Western con anticuerpos contra p-actina. La densidad óptica se cuantificó utilizando un programa de procesamiento y análisis de imágenes (Scion Image, Ederick, MA).

Análisis estadístico-

Los datos se evaluaron para determinar normalidad. Se consideró la transformación de datos si los datos no eran normales. Como resultado, se utilizaron para el análisis los datos clasificados. Se implementó la prueba global que utiliza la ecuación de estimación generalizada (GEE) para analizar la diferencia de grupo en la recuperación funcional medida. El análisis comenzó ensayando el efecto de grupo general del tratamiento, seguido de un análisis por subgrupos al nivel de 0,05, si el efecto de grupo general se detectó a nivel de 0,05. La prueba global de resultados múltiples es más eficiente que un solo resultado, cuando los efectos de la dosis son congruentes en todos los resultados (por ejemplo, la correlación positiva). Un efecto de dosis significativo en la recuperación funcional (p <0,05 basado en la prueba global) se analizará adicionalmente en el resultado individual a 0,05. Se utilizó un ANOVA de una vía para analizar el efecto general del grupo. Los datos se presentan en forma de la media ± SE. Se tomó un valor de P <0,05 como significativo.

Resultados:

Los datos de los inventores indicaron que la Tp4 mejora la disfunción vascular inducida por la diabetes en el nervio ciático.

Para examinar si los ratones db/db desarrollan una alteración de la neurovasculatura, los inventores examinaron los microvasos de los vasos de los nervios en el nervio ciático de los ratones a la edad de 28 semanas. El análisis de los vasos inmunorreactivos frente al vWF de los vasos de los nervios reveló que el perímetro de los vasos sanguíneos en los ratones db/db se había reducido significativamente en comparación con los de los ratones db/m de la misma edad, aunque la densidad vascular no era significativamente diferente entre estos dos grupos (73,5 ± 10,5 frente a 56,9 ± 6,4 en ratones db/m, p> 0,05) (figura 1). La figura 1 contiene datos que muestran que la Tp4 mejora la función vascular en el nervio ciático. Los paneles A a C muestran vasos sanguíneos inmunorreactivos frente a vWF en la sección transversal del nervio ciático de un ratón db/m representativo (A), un ratón db/db tratado con solución salina (B) y un ratón db/db tratado con Tp4 (24 mg/kg, C). Los paneles D a F muestran vasos prefundidos con FITC-dextrano en la sección transversal del nervio ciático de un ratón db/m representativo (D), un ratón db/db tratado con solución salina (E) y un ratón db/db tratado con Tp4 (24 mg/kg, F). Los paneles G e I muestran datos cuantitativos de los perímetros vasculares inmunorreactivos frente a vWF (G, n = 6/grupo) y la densidad de los vasos perfundidos con FITC-dextrano (H, n = 4/grupo), los vasos inmunorreactivos frente a ocludina (I, n = 6/grupo) y los cambios en porcentaje del flujo sanguíneo del nervio ciático con una referencia de ratones db/m al 100% (J, n = 4/grupo). dm = ratón db/m; db = ratón db/db. Además, los ratones db/db exhibieron una reducción sustancial de ocludina, una proteína de la unión estrecha, vasos inmunorreactivos (figura 1). Para examinar si el perímetro reducido en los ratones db/db afecta a la función vascular, los inventores midieron los microvasos perfundidos con plasma, que representan vasos funcionales7, 26 y el flujo sanguíneo regional. Para medir los vasos perfundidos con plasma, los inventores inyectaron por vía intravenosa FITC-dextrano en los ratones y, a continuación, sacrificaron a los ratones 10 minutos después de la inyección, lo que proporcionó suficiente tiempo para que el FITC-dextrano circule por todo el sistema vascular en condiciones fisiológicas. El análisis cuantitativo de los vasos perfundidos con FITC-dextrano en las secciones transversales de los nervios ciáticos reveló que los ratones db/db presentaban una reducción significativa en las densidades microvasculares perfundidas por FITC-dextrano en comparación con los ratones db/m (figura 1). En paralelo, el flujo sanguíneo del nervio ciático medido por LDF se redujo significativamente en los ratones db/db en comparación con el de los ratones db/m (figura 1). En conjunto, estos datos indican que la diabetes induce disfunción vascular en el nervio ciático, lo cual es coherente con los estudios publicados6,7,40. Sin embargo, los ratones db/db tratados con Tp4 a dosis de 6 y 24 mg/kg durante 4 semanas a partir de la edad del animal de 20 semanas exhibieron aumentos significativos en el perímetro vascular, vasos inmunorreactivos a ocludina, la densidad de vasos perfundidos con FITC-dextrano y ciático flujo sanguíneo del nervio a la edad de 28 semanas en comparación con los ratones db/db tratados con solución salina, que estaban cerca de los niveles medidos en los ratones db/m (figura 1). De forma similar, los datos de la figura 2 muestran que la Tp4 aumenta el área inmunorreactiva a ocludina en las paredes del vaso. Los paneles A a L muestran que los vasos inmunorreactivos a CD31 (verde) eran positivos para ocludina (color rojo) de un ratón db/m representativo (A-D, dm), una ratón db/db tratado con solución salina (E-H, db) y un ratón db/db tratado con Tp4 (24 mg/kg, I-L). El panel M muestra datos cuantitativos del porcentaje del área inmunorreactiva a ocludina. #p < 0,05 frente a los ratones db/db tratados con solución salina, n = 6/grupo. Estos datos indican que la Tp4 mejora la disfunción vascular inducida por la diabetes en el nervio ciático.

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Los datos de los inventores indicaron que la Tp4 mejora la función neurológica en el ratón diabético.

La alteración de la conducción nerviosa periférica es un indicador clave para pacientes diabéticos con neuropatía periférica 41,42 y la disfunción vascular afecta a la conducción nerviosa 4,5 Por lo tanto, los inventores evaluaron si el aumento del flujo sanguíneo regional por Tp4 afecta a la velocidad de conducción motora y sensorial (VCM y VCS) en el nervio ciático. Los registros electrofisiológicos mostraron que la VCM y la VCS se ralentizaron significativamente en ratones db/db en comparación con las de los ratones db/m de la misma edad (figura 3), que son comparables con los valores notificados por otros 7,43 La figura 3 muestra datos relacionados con el efecto de la Tp4 sobre la función neurológica. El tratamiento de ratones db/db con Tp4 mejora la función neurológica medida mediante la VCM (A), la VCS (B), la prueba de la retirada de la cola (C) y la prueba de la placa caliente (D). *P < 0,05 y #P < 0,05 frente a ratones db/m y ratones db/db tratado con solución salina, respectivamente. n = 10/grupo. dm = ratón db/m; db = ratón db/db. El tratamiento de los ratones db/db con Tp4 a dosis de 6 y 24 mg/kg durante 4 semanas mostró una mejora notable tanto en la VCM como en la VCS al final del tratamiento con Tp4 y a las 4 semanas de la finalización del tratamiento en comparación con los ratones db/db tratados con solución salina (figura 3). A continuación, los inventores examinaron el efecto del tratamiento con Tp4 sobre la función sensorial midiendo la latencia térmica con las pruebas de retirada de la cola y en placa caliente. El tratamiento de los ratones db/db con Tp4 mejoró notablemente la latencia térmica comenzando al final del tratamiento con Tp4, que persistió durante al menos 4 semanas después de la finalización del tratamiento (el final del período experimental) (figura 4). Para examinar el efecto de la Tp4 en ratones no diabéticos, los inventores trataron a los ratones db/m con Tp4 a una dosis de 6 mg/kg y no detectaron ningún cambio funcional medido por los procedimientos enumerados anteriormente. Véase la figura 4. El tratamiento de ratones db/m con Tp4 a 6 mg/kg no modificó la función neurológica medida por la VCM (A), la VCS (B), la prueba de retirada de la cola (C) y la prueba de placas calientes (D). n = 10 ratones/grupo. dm = ratón db/m. Estos datos indican que la Tp4 mejora la función nerviosa periférica en el ratón diabético.

El tratamiento del ratón db/db con Tp4 no alteró significativamente los niveles de glucemia y el peso corporal del animal (Tabla 1 y 2).

Los datos de los inventores indicaron que la Tp4 regula los genes proangiogénicos en el nervio ciático.

Se han detectado alteraciones de los niveles de Ang1 y Ang2 en pacientes diabéticos y diabetes experimental21, 25 Para examinar el efecto de Tp4 en estos genes angiogénicos, los inventores midieron los niveles proteicos de Ang1 y Ang2. La figura 5 muestra datos que indican que la Tp4 regula positivamente la expresión de Ang1 en células endoteliales y células de Schwann en ratones diabéticos. El análisis por transferencia de Western (A y B) de los niveles de Ang1 y Ang2 en el tejido del nervio ciático y p-actina se utilizó como control interno. Imágenes representativas de doble tinción inmunofluorescente muestran que la inmunorreactividad de Ang1 (C, F, G, J, color rojo, flechas) se colocalizó en los vasos positivos para CD31 (D, F, color verde) y células de Schwann positivas para S100 (H, J, color verde, flechas). *P < 0,05 y #P < 0,05 frente a ratones db/m y ratones db/db tratados con solución salina, respectivamente. n = 6/grupo. dm = ratón db/m; db = ratón db/db. El análisis por transferencia de tipo Western del nervio ciático mostró una reducción sustancial de los niveles de Ang1 y un aumento de los niveles de Ang2 en ratones db/db (figura 5), mientras que el tratamiento de los ratones db/db con Tp4 aumentó significativamente la expresión de Ang1, pero disminuyó la expresión de Ang2 (figura 5). La inmunotinción doble reveló que las células inmunorreactivas a Ang1 eran positivas para CD31 (un marcador de células endoteliales) y S100 (un marcador de células de Schwann) (figura 5). En conjunto, estos datos indican que la Tp4 regula la expresión de Ang1 en células endoteliales y células de Schwann en ratones diabéticos.

Los datos de los inventores indicaron que la vía de señalización de Ang/Tie2 media el efecto de la Tp4 sobre la función endotelial.

Los datos in vivo mencionados anteriormente sugieren que los genes Ang1 y Ang2 median la función vascular mejorada con Tp4 en ratones diabéticos. Para examinar una causa-efecto de estos genes sobre las células endoteliales en condiciones de hiperglucemia, los inventores realizaron experimentos in vitro que utilizan un ensayo de formación de tubo de tipo capilar, que se utiliza ampliamente para examinar la función endotelial in vitro34'35'37'44. La figura 6 muestra datos que indican que la vía de señalización de Ang/Tie2 media el efecto de la Tp4 sobre la función endotelial. Imágenes microscópicas representativas (A) y datos cuantitativos (B) muestran la formación de tubo de tipo capilar en HUVEC cultivadas en niveles de glucosa normales (N), niveles de glucosa altos (H), niveles de glucosa altos con Tp4 (A + TB4, 100 ng/ml), y niveles de glucosa altos con Tp4 en presencia de un anticuerpo neutralizante contra Tie2 (+ Tie2, 5 pg/ml). Los datos de RT-PCR en tiempo real (C) y transferencia de tipo Western (D) muestran niveles de ARNm y de proteínas de Ang1 y Ang2 en células HUVEC cultivadas con niveles de glucosa normales (N), niveles de glucosa altos (H), niveles de glucosa altos con Tp4 (+ TB4) y niveles de glucosa altos con Tp4 en presencia de LY294003 (+ LY, 10 pM). El panel E muestra un análisis por transferencia de tipo Western de pAkt y Akt total en células HUVEC cultivadas en diferentes condiciones enumeradas anteriormente. Se utilizaron GAPDh y p-actina como controles internos para ARNm y proteínas, respectivamente. *P < 0,05, #P < 0,05 y $P < 0,05 frente a los grupos de niveles de glucosa normales (N), niveles de glucosa altos (H) y niveles de glucosa altos con Tp4 (100 ng/ml), respectivamente. n = 6/grupo. La incubación de HUVEC en condiciones de niveles de glucosa altos disminuyó la formación de tubos de tipo capilar en comparación con las HUVEC cultivadas en condiciones de

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glucosa normales (figura 6). Sin embargo, Tp4 suprimió el efecto de los niveles de glucosa altos sobre la reducción de la formación de tubo de tipo capilar (figura 6). La RT-PCR cuantitativa y el análisis por transferencia de tipo Western demostraron que la incubación de HUVEC con niveles de glucosa altos disminuyó sustancialmente y aumentó la expresión de Ang1 y Ang2, respectivamente (figura 6), mientras que la Tp4 suprimía la expresión de Ang1 y Ang2 inducida por niveles de glucosa altos (figura 6). El bloqueo de Tie2, un receptor de Ang1 y Ang2, con un anticuerpo de naturalización contra Tie2 inhibió la formación de tubo de tipo capilar aumentado por Tp4 (figura 6). Estos datos indican que la vía de señalización de Ang/Tie2 desempeña un papel importante en la mediación de la función endotelial mejorada por Tp4 en condiciones de hiperglucemia.

Los datos de los inventores indicaron que la Ang1 secretada por células de Schwann tratadas con Tp4 mejoraba la función endotelial.

Además de las células endoteliales, los datos de inmunotinción doble in vivo de los inventores mostraron que las células de Schwann expresaban Ang1. Por lo tanto, los inventores examinaron el efecto de la Tp4 sobre la expresión de angiopoyetina en las células de Schwann. La figura 7 muestra datos que indican que Ang1 secretada por las células de Schwann tratadas con Tp4 mejora la función endotelial. Los datos de RT-PCR en tiempo real (C) y transferencia de tipo Western (B) muestran niveles de ARNm y de proteínas de Ang1 y Ang2 en células HSC cultivadas con niveles de glucosa normales (N), niveles de glucosa altos (H), niveles de glucosa altos con Tp4 (+ TB4). y niveles de glucosa altos con Tp4 en presencia de LY294003 (+ LY). El panel C muestra un análisis por transferencia de tipo Western de pAkt y Akt total en células HSC cultivadas en diferentes condiciones enumeradas anteriormente. Se utilizaron GAPDH y p-actina como controles internos para ARNm y proteínas, respectivamente. El panel D muestra los datos de ELISA de los niveles de Ang1 en sobrenadantes cosechados de HSC cultivadas con niveles de glucosa normales (N), niveles de glucosa altos (H), niveles de glucosa altos y Tp4 (+ TB4, 100 ng/ml) y niveles de glucosa altos y Tp4 en presencia de LY294003 (+ LY). Imágenes microscópicas representativas (E) y datos cuantitativos (F) muestran la formación de tubo de tipo capilar en HUVEC cultivadas con el medio acondicionado recogido de las HSC en condiciones de niveles de glucosa normales (N), niveles de glucosa altos (H), niveles de glucosa altos con Tp4 (+ TB4, 100 ng/ml), y niveles de glucosa altos y Tp4 en presencia del anticuerpo contra Tie2 (+ Tie2). *P < 0,05, #P < 0,05 y $P < 0,05 frente a los grupos de niveles de glucosa normales (N), niveles de glucosa altos (H) y niveles de glucosa altos con Tp4 (100 ng/ml), respectivamente. n = 6/grupo. Los niveles de glucosa altos regularon negativamente sustancialmente la Ang1 y regularon positivamente la Ang2, mientras que la Tp4 a una dosis de 100 ng/ml suprimió el efecto de niveles de glucosa altos sobre la expresión de angiopoyetina en HSC (figura 7, lo que sugiere que la Tp4 también regula la expresión de angiopoyetina en células de Schwann. A continuación, los inventores investigaron si células de Schwann secretaban Ang1 regulada positivamente por Tp4 que mejora, en consecuencia, la función vascular en condiciones de niveles altos de glucosa. Utilizando un ELISA específico para detectar Ang1 de ratón, los inventores midieron los niveles de Ang1 en sobrenadantes cosechados de HSC cultivadas durante 48 horas. El ELISA demostró que los sobrenadantes de HSC cultivados con niveles de glucosa altos presentaban una reducción significativa de los niveles de Ang1 en comparación con los niveles en los sobrenadantes recogidos de la condición de niveles de glucosa normales, mientras que la Tp4 invirtió el efecto de la niveles de glucosa altos en los niveles de Ang1 (figura 7).

A continuación, los inventores examinaron el efecto de los sobrenadantes sobre la formación de tubos de tipo capilar mediante el cultivo de HUVEC con medio acondicionado cosechado de HSC. En comparación con el medio acondicionado recogido de HSC cultivadas con niveles de glucosa normales, el medio acondicionado de HSC cultivadas en condiciones de niveles de glucosa altos dio como resultado una disminución significativa de la formación de tubo de tipo capilar (figura 7). Por el contrario, el medio acondicionado recogido de las HSC tratadas con Tp4 en condiciones de niveles de glucosa altos aumentó significativamente la formación de tubos de tipo capilar. En presencia del anticuerpo neutralizante contra Tie2, se inhibió el efecto del medio acondicionado con Tp4 sobre la formación de tubo de tipo capilar (figura 7). En conjunto, estos datos indican que, además de Ang1 endotelial, la Ang1 soluble secretada por las células de Schwann tratadas con Tp4 mejora la función de las células endoteliales.

Los datos de los inventores indicaron que la vía de señalización de PI3K/Akt media el efecto de la Tp4 sobre la expresión de Ang1.

Para evaluar además si las vías de señalización intracelular están involucradas en Ang1/Ang2 regulada positivamente por Tp4 en células endoteliales y células de Schwann, los inventores examinaron la vía de señalización PI3K/Akt que se ha indicado que participa en el efecto de la Tp4 en la migración de células progenitoras endoteliales45. El análisis por transferencia de tipo Western de HUVEC y HSC mostró que la condición de niveles de glucosa altos disminuyó marcadamente los niveles de pAkt en comparación con los niveles de glucosa normales (figuras 6 y 7). El tratamiento de las células HUVEC y HSC con Tp4 en condiciones de niveles de glucosa altos aumentó significativamente los niveles de pAkt, que se bloquearon completamente con un inhibidor de PI3K, LY294002 (figuras 6 y 7), lo que indica que la Tp4 activa la vía de señalización de PI3K/Akt. Además, LY294002 suprimió por completo el efecto de la Tp4 sobre la expresión de Ang1, pero no de Ang2 en las células HUVEC y HSC en condiciones de niveles de glucosa altos (figuras 6 y 7). Estos datos sugieren que la vía de señalización de PI3K/Akt está implicada en la expresión de Ang1 regulada por Tp4 en las células endoteliales y de Schwann.

El trabajo de los inventores por primera vez demuestra que la Tp4 mejoraba notable e inesperadamente la función

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vascular en el nervio ciático y la función del nervio periférico en un modelo en ratón de neuropatía periférica diabética. Sin desear estar ligados a teoría específica alguna, la vía de señalización de Ang/Tie2 puede participar en el efecto de la Tp4 sobre la función vascular mejorada. El efecto de la Tp4 sobre la neuropatía periférica diabética no se ha investigado previamente. Utilizando un modelo en ratón bien establecido de diabetes de tipo II, el trabajo de los inventores indica que la Tp4 mejora la neuropatía periférica diabética, evidenciada por la reducción de los déficit de la velocidad de conducción del nervio ciático, un parámetro clave para la neuropatía diabética periférica y la mejora de las respuestas a estímulos térmicos y mecánicos. Los datos de los inventores indican que, en algunas realizaciones, sin limitación a las mismas, se puede utilizar Tp4 para el tratamiento de la neuropatía periférica diabética.

Los estudios de neuropatía periférica diabética de animales de experimentación y seres humanos indican que el desarrollo de la neuropatía diabética está estrechamente relacionado con una disfunción neurovascular marcada1-3. La disfunción vascular precede a la aparición de déficit de la velocidad de conducción nerviosa, lo que produce daños nerviosos3-5. Los datos de los inventores demostraron que la Tp4 aumentaba sustancialmente los vasos perfundidos con plasma y el flujo sanguíneo regional en el nervio ciático, junto con la mejora de la función neurológica de la neuropatía diabética, lo que sugiere que la normalización de la función vascular por Tp4 puede contribuir a la reducción observada de los déficit de la velocidad de conducción nerviosa.

La vía de señalización de Ang/Tie2 regula la homeostasis vascular17,18. Ang1 estimula la maduración vascular, mientras que Ang2 actúa como un inhibidor competitivo de Ang1 por la unión de Tie2 y desestabiliza los vasos sanguíneos17,19,20. La hiperglucemia regula negativamente la Ang1 y regula positivamente la Ang221. Los aumentos en los niveles de Ang1 normalizan la vasculatura inmadura inducida por la diabetes24. La Ang1, al aumentar la angiogénesis, reduce el infarto de miocardio, mientras que una elevación de los niveles de Ang2 agrava el infarto en ratas diabéticas21. Los pacientes con neuropatía periférica diabética tienen niveles significativamente elevados de Ang2 circulante25. Los datos de los inventores muestran que la hiperglucemia regulaba negativamente la Ang1 y regulaba positivamente la Ang2 en las células endoteliales y las células de Schwann, mientras que la Tp4 invirtió la expresión de Ang1 y Ang2. La Tp4 es un potente factor angiogénico y regula la angiogénesis y la vasculogénesis durante el desarrollo estimulando la diferenciación de células progenitoras y dirigiendo la migración de células endoteliales 10, 46, 47

Los datos de los inventores muestran que el bloqueo de Tie2 con un anticuerpo neutralizante suprimía el efecto de Tp4 en la angiogénesis in vitro implica la participación de la vía de señalización de Ang/Tie2 en la función vascular mejorada de Tp4 observada in vivo. Sin desear quedar ligado a teoría específica alguna, los datos de los inventores sugieren además que la Tp4 regula la Ang1 a través de la activación de la vía PI3K/Akt.

Las células de Schwann secretan numerosos factores que regulan la degeneración y la regeneración de los nervios periféricos48-50. El trabajo de los inventores demostró que Ang1 y Ang2 secretadas por las células de Schwann afectaban a la función endotelial en condiciones de hiperglucemia, mientras que los niveles de Ang1 elevados por Tp4 en las células de Schwann conducen a la mejora de la angiogénesis in vitro. Por tanto, sin desear quedar ligado a teoría específica alguna, la Tp4 puede actuar sobre las células endoteliales y las células de Schwann para preservar y/o restaurar la función vascular en el nervio ciático, lo que facilita la mejora de la función del nervio periférico en condiciones de neuropatía diabética.

Sin limitación a solo aquellas realizaciones dadas a conocer en el presente documento y sin limitación de otras realizaciones u objeto, las composiciones que comprenden algunas realizaciones se administran y dosifican de acuerdo con las buenas prácticas médicas, teniendo en cuenta el estado clínico del paciente individual, el sitio y el procedimiento de administración, la pauta posológica, la edad del paciente, el sexo, el peso corporal y otros factores conocidos por los médicos. La “cantidad terapéuticamente eficaz" para los fines del presente documento se determina de este modo mediante consideraciones tales como las conocidas en la técnica. La cantidad debe ser eficaz para conseguir una mejora incluyendo, pero sin limitaciones, los indicadores de enfermedad disminuidos, frecuencia o gravedad de la enfermedad disminuida, o la mejora o eliminación de los síntomas y otros indicadores como se seleccionan como medidas apropiadas por los expertos en la materia.

La administración puede realizarse de diversas maneras. Se puede administrar de forma individual como principio activo en combinación con excipientes, diluyentes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables. La administración puede ser oral, subcutánea o parenteral, incluyendo la administración intravenosa, intraarterial, intramuscular, intraperitoneal e intranasal, así como las técnicas de administración intratecal y de infusión, o mediante administración local o inoculación directa al sitio de la enfermedad o afección patológica. Los implantes de los compuestos son también útiles. El paciente que se está tratando puede ser un animal de sangre caliente y, en particular, mamíferos, incluyendo el ser humano. Los excipientes, diluyentes, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables, así como los vehículos de implantes, se refieren, generalmente, a cargas, diluyentes o material de encapsulación sólidos o líquidos inertes y no tóxicos que no reaccionan con los principios activos de algunas realizaciones.

Se observa que los seres humanos se tratan, generalmente, más tiempo que los animales experimentales ilustrados como ejemplos en la presente invención, cuyo tratamiento tiene una duración proporcional a la duración del proceso

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de la enfermedad y la eficacia del fármaco. Las dosis pueden ser dosis únicas o dosis múltiples durante periodos de tiempo. El tratamiento generalmente tiene una longitud proporcional a la longitud del proceso de la enfermedad y la eficacia del fármaco y la especie del paciente que se está tratando.

Cuando se administra en algunas realizaciones por vía parenteral, generalmente se formulará en una forma inyectable de monodosis (solución, suspensión, emulsión). Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para inyección incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para reconstitución en soluciones o dispersiones inyectables estériles. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, un poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales.

Cuando sea necesario, se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, por la utilización de un recubrimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por la utilización de surfactantes. También se pueden utilizar vehículos no acuosos, tales como aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de soja, aceite de maíz, aceite de girasol o aceite de cacahuete, y ésteres, tales como miristato de isopropilo, como sistemas de disolventes para realizaciones seleccionadas. Además, se pueden añadir diversos aditivos que aumenten la estabilidad, la esterilidad y la isotonicidad de las composiciones, incluyendo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y tampones. La prevención de la acción de los microorganismos se puede garantizar mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico y similares. En muchos casos, será deseable incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, cloruro sódico y similares. La absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede efectuar mediante la utilización de agentes retardantes de la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina. Cualquier vehículo, diluyente o aditivo utilizado debería ser compatible con la realización seleccionada.

Se pueden preparar soluciones inyectables estériles mediante la incorporación de la realización deseada en la cantidad requerida del disolvente apropiado con diversos de los otros ingredientes, según se desee.

Una formulación farmacológica que comprende algunas realizaciones puede administrarse al paciente en una formulación inyectable que contiene cualquier excipiente compatible, tal como diversos vehículos, adyuvantes, aditivos y diluyentes; o las realizaciones pueden administrarse por vía parenteral al paciente en forma de implantes subcutáneos de liberación lenta o sistemas de administración dirigida. Los expertos en la materia conocen bien muchos otros implantes, sistemas de liberación y módulos de este tipo.

Las composiciones que comprenden algunas realizaciones pueden estar en cualquier forma adecuada y para utilización interna o externa. Las preparaciones para utilización interna incluyen polvos, comprimidos, cápsulas de gránulos dispersables, soluciones, suspensiones y emulsiones adecuadas para ingestión o inyección oral.

Las composiciones tópicas también se pueden administrar en forma de apósitos para heridas, parches transdérmicos y similares.

En algunas realizaciones, sin limitación a solo las dadas a conocer en el presente documento y sin limitación de otras realizaciones u objeto, la dosificación terapéuticamente eficaz puede determinarse de acuerdo con la afección del sujeto, el nivel de sintomatología observado, la vía y/o frecuencia de administración, y otras consideraciones y técnicas conocidas o disponibles para el experto en la materia y aplicadas de acuerdo con los las buenas normas y prácticas científicas o médicas.

Sin limitación, algunas realizaciones se pueden utilizar junto con cualquier tipo de animal, incluyendo, aunque sin limitaciones a los mismos, seres humanos y otros mamíferos.

Se apreciará que se pueden realizar diversos cambios o modificaciones en las realizaciones, tal como se describen y reivindican en el presente documento sin apartarse del alcance de las mismas. Aunque la presente invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencia a las realizaciones preferentes y alternativas anteriores, los expertos en la materia deben entender que se pueden emplear diversas alternativas a las realizaciones de la invención descritas en el presente documento para poner en práctica la invención sin apartarse del alcance de la invención como se define en las siguientes reivindicaciones. Se pretende que las siguientes reivindicaciones definan el alcance de la invención y que los equivalentes se cubran de ese modo. Debe entenderse que esta descripción de la invención incluye todas las combinaciones novedosas y no obvias de elementos descritos en el presente documento.

Las realizaciones anteriores son ilustrativas y no restrictivas. Muchas realizaciones y aplicaciones además de los ejemplos dados a conocer serán evidentes para los expertos en la materia a la luz de la lectura de la descripción anterior. El alcance de la presente invención deberá determinarse, no con referencia a la descripción anterior, sino, en su lugar, determinarse con referencia a las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance completo de equivalentes a los que tienen derecho dichas reivindicaciones. En resumen, debe entenderse que la invención es susceptible de modificación y variación, y está limitada únicamente por las reivindicaciones siguientes.

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Se pretende que todos los términos utilizados en las reivindicaciones tengan sus construcciones más amplias razonables y sus significados ordinarios, tal como lo entienden los expertos en la materia a menos que se haga una indicación explícita en sentido contrario. En particular, la utilización de los artículos en singular tales como "un/una", "el/la", "dicho/dicha", etc. debe leerse para citar uno o más de los elementos indicados, a menos que una reivindicación cite una limitación explícita en sentido contrario. Cuando las reivindicaciones citen “un” o “un primer” elemento del equivalente del mismo, debe entenderse que dichas reivindicaciones incluyen la incorporación de uno o más de dichos elementos, sin requerir ni excluir dos o más de dichos elementos.

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TABLAS

Tabla 1. Efecto de TB4 sobre el peso corporal

Grupos

0 s Peso, g 2 s 4 s 6 s 8 s

dm-solución salina

30,3 ± 0,8* 30,8 ± 0,7* 30,4 ± 0,9* 30,1 ± 0,7* 30,9 ± 0,8*

db-solución salina

61,0 ± 0,8 61,2 ± 0,7 59,3 ± 1,2 57,6 ± 2,2 57,1 ± 2,8

db-TB4 (6mg/kg)

59,5 ± 0,9 57,1 ± 1,1 56,2 ± 1,2 53,7 ± 1,5 53,0 ± 1,7

db-TB4 (24mg/kg)

58,9 ± 1,1 58,1 ± 1,2 55,7 ± 1,5 56,0 ± 1,4 54,8 ± 1,6

Los valores son la media ± SEM. *P < 0,01 frente al grupo de db+solución salina. n = 10/grupo. S = semana, 0 representa antes del tratamiento, mientras que las otras cifras indican después del tratamiento. dm = ratones db/m; db = ratones db/db.

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Tabla 2. Efecto de TB4 sobre la glucemia

Glucemia (g/dl)

Grupos

0 s 2 s 4 s 6 s 8 s

Dm-solución salina

141,6 ± 14,5* 138,6 ± 6,4* 141,4 ± 7,7* 140,1 ± 8,0* 141,3 ± 4,6*

db-solución salina

513,8 ± 14,0 516,6 ± 18,6 517,6 ± 10,7 516,4 ± 32,3 524,2 ± 23,3

db-TB4 (6mg/kg)

503,4 ± 24,0 513,4 ± 17,5 512,8 ± 24,8 517,6 ± 21,4 503,3 ± 18,0

db-TB4 (24mg/kg)

517,6 ± 15,0 515,9 ± 13,1 504,7 ± 16,5 521,6 ± 16,0 515,8 ± 19,3

Los valores son la media ± SEM. *P < 0,01 frente al grupo de db+solución salina. n = 10/grupo. S = semana, 0 s representa antes del tratamiento, mientras que las otras cifras indican después del tratamiento. dm = ratones db/m; db = ratones db/db.

SECUENCIAS

SEQ ID NO: 1 -

SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES Ser - Asp - Lys - Pro - Asp - Met - Ala - Glu - lie - Glu - Lys - Phe - Asp - Lys - Ser - Lys - Leu - Lys - Lys - Thr - Glu - Thr - Gln - Glu - Lys - Asn - Pro - Leu - Pro - Ser - Lys - Glu - Thr - lie - Glu - Gln - Glu - Lys - Gln - Ala - Gly - Glu - Ser

SEQ ID NO: 2 -

Ac - Ser - Asp - Lys - Pro - Asp - Met - Ala - Glu - lie - Glu - Lys - Phe - Asp - Lys - Ser - Lys - Leu - Lys - Lys - Thr - Glu - Thr - Gln - Glu - Lys - Asn - Pro - Leu - Pro - Ser - Lys - Glu - Thr - lie - Glu - Gln - Glu - Lys - Gln - Ala - Gly - Glu - Ser

SEQ ID NO: 3 -

LKKTET

SEQ ID NO: 4 -

LKKTNT SEQ ID NO: 5 - KLKKTET SEQ ID NO: 6 - LKKTNTQ SEQ ID NO: 7 -

AGA ACA TCA TCC CTG CAT CC SEQ ID NO: 8 -

CAC ATT GGG GGT AGG AAC AC SEQ ID NO: 9 -

GAA GGG AAC CGA GCC TAT TC SEQ ID NO: 10 -

GCT GAA ATC AGC ACC GTG TA

SEQ ID NO: 11 -

CAG ATC CGG GCT CTA GAC AG SEQ ID NO: 12 -

TCC GGA AAT CGT TCT TCA TC.

Claims (12)

1. 5

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   REIVINDICACIONES

   1. Composición que comprende timosina p4 para su utilización en el tratamiento para estimular la recuperación de la neuropatía periférica en un sujeto, comprendiendo dicho tratamiento administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz de dicha composición.
2. 2. Composición, para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicha neuropatía está asociada con la diabetes en dicho sujeto.
3. 3. Composición, para la utilización según la reivindicación 2, en la que dicha diabetes es diabetes mellitus.
4. 4. Composición, para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicha composición se administra a dicho sujeto a una dosificación dentro de un intervalo de aproximadamente 1-100 microgramos de timosina p4.
5. 5. Composición, para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicha composición se administra mediante administración directa a dicho tejido, o mediante administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, por inhalación, transdérmica u oral, a dicho sujeto.
6. 6. Composición, para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicha composición se administra por vía sistémica.
7. 7. Composición, para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicha composición se administra directamente.
8. 8. Composición, para la utilización según la reivindicación 1, en la que dicha composición está en forma de una formulación en solución, gel, crema, pasta, loción, pulverización, suspensión, dispersión, bálsamo, hidrogel o pomada.
9. 9. Composición, para la utilización según la reivindicación 1, en la que la secuencia de la timosina p4 es un péptido recombinante o sintético.
10. 10. Timosina p4, para su utilización en el tratamiento para estimular la recuperación de la neuropatía periférica en un sujeto.
11. 11. Timosina p4, para la utilización según la reivindicación 10, en la que dicha neuropatía está asociada con diabetes.
12. 12. Timosina p4, para la utilización según la reivindicación 11, en la que dicha diabetes es diabetes mellitus.