KR20140108567A - 말초 신경병증의 회복을 증진시키기 위한 방법, 시스템, 및 조성물 - Google Patents

Abstract

제한함이 없이, 몇몇 실시예는 티모신 베타 4, LKKTET 또는 LKKTNT의 아미노산 서열 및/또는 이의 임의의 보존적 변이체 또는 임의의 이러한 물질 또는 이의 보존적 변이체의 제조를 자극하는 물질로 이루어진 치료 유효량의 조성물을 말초 신경병증의 회복의 증진의 치료를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체에서 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 치료 방법을 포함한다.

Description

말초 신경병증의 회복을 증진시키기 위한 방법, 시스템, 및 조성물{METHODS, SYSTEMS, AND COMPOSITIONS FOR PROMOTING RECOVERY OF PERIPHERAL NEUROPATHY}

관련 출원에 대한 상호 참조

본원은 2011년 12월 23일자에 출원된 미국 가출원 제 61/579,951호(그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함됨)의 이익을 주장한다

기술 분야

제한 없이, 몇몇 실시예는 말초 신경병증의 회복을 증진시키기 위한 분야에 관한 것이다.

말초 신경병증은 진성 당뇨병의 가장 흔한 장애를 발생시키는 합병증 중 하나이다. 말초 신경병증의 회복을 증진시키기 위한 효과적인 방법, 시스템 및 조성물에 대한 수요가 당해 분야에 여전히 존재한다.

몇몇 실시예의 하기 예는, 본 발명을 본 명세서에 기재된 이 실시예로만 제한하지 않고 임의의 실시예 또는 발명의 대상을 포기하지 않고, 제공된다.

몇몇 실시예는 티모신 베타 4, 이의 보존적 변이체(들)(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 LKKTET 또는 LKKTNT의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 물질, 또는 LKKTET 또는 LKKTNT 펩타이드 또는 이의 보존적 변이체의 제조를 자극하는 자극 물질을 포함하는 치료 유효량의 조성물을 말초 신경병증의 회복의 증진의 치료를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 방법을 포함한다.

몇몇 실시예는 첨부된 도면을 참조하여 다른 실시예의 포기 없이 예의 방식으로만 기재되어 있다.
도 1은 Tβ4가 좌골 신경에서 혈관 기능을 개선한다는 것을 나타내는 데이터를 보여주는 이미지 및 데이터 표식이다.
도 2는 Tβ4가 혈관벽에서 오클루딘 면역반응 부위를 증가시킨다는 것을 나타내는 데이터를 보여주는 이미지 및 데이터 표식이다.
도 3과 도 4는 신경학적 기능에 대한 Tβ4의 효과를 나타내는 데이터를 보여주는 데이터 표식이다.
도 5는 Tβ4가 당뇨병 마우스 모델에서 내피 세포 및 슈반 세포에서 Ang1 발현을 상향조절한다는 것을 나타내는 데이터를 보여주는 이미지 및 데이터 표식이다.
도 6은 Ang/Tie2 신호전달 경로가 내피 기능에 대한 Tβ4의 효과를 중재한다는 것을 나타내는 데이터를 보여주는 이미지 및 데이터 표식이다.
도 7은 Tβ4 치료된 슈반 세포에 의해 분비된 Ang1이 내피 기능을 개선한다는 것을 나타내는 데이터를 보여주는 이미지 및 데이터 표식이다.

본 명세서에 명확히 개시된 이 실시예로만 제한함이 없이 임의의 실시예 또는 발명의 대상을 포기함이 없이 임의의 특정한 이론에 구속됨이 없이, 몇몇 실시예는 말초 신경병증을 앓는 환자, 예컨대 당뇨병 환자, 예를 들면 2형 당뇨병 환자 또는 진성 당뇨병을 앓는 환자에서 말초 신경병증의 회복을 증진시키기 위해 액틴 봉쇄 펩타이드, 예컨대 티모신 베타 4(또한, "Tβ4" 또는 "TB4") 및/또는 LKKTET 또는 LKKTNT의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변이체를 포함하는 액틴 봉쇄 펩타이드 또는 펩타이드 단편을 포함하는 다른 물질을 포함한다.

티모신 베타 4는 초기에 실험실내 내피 세포 이동 및 분화 동안 상향조절된 단백질로서 확인되었다. 티모신 베타 4는 원래 갑상선으로부터 단리되고 다양한 조직에서 확인된 4.9kDa의 편재성 폴리펩타이드인 43개의 아미노산이다. (제한함이 없이, 예를 들면, 서열 번호 1 참조; 정확한 서열에서의 일부 종 변이가 존재하고, 임의의 및 모든 이러한 서열은 몇몇 실시예를 포함할 수 있다. 또한, 몇몇 실시예는 서열(들)(오직 하나의 예로서 제한함이 없이, 하기 기재된 서열 번호 2)의 일 말단 또는 양 말단에서의 특정한 화학기의 첨가를 포함할 수 있다). 내피 세포 분화 및 이동, T 세포 분화, 액틴 봉쇄, 혈관화 및 상처 치유에서의 역할을 비롯한 일부 역할이 이 단백질에 속한다.

몇몇 실시예는 LKKTET 또는 LKKTNT의 아미노산 서열(각각 서열 번호 3 및 서열 번호 4) 또는 이의 보존적 변이체를 포함하는 폴리펩타이드, 바람직하게는 티모신 베타 4 및/또는 KLKKTET(서열 번호 5), LKKTETQ(서열 번호 6), Tβ4의 N 말단 변이체, Tβ4의 C 말단 변이체 및 Tβ4의 길항제(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 Tβ4 동형체, 유사체 또는 유도체일 수 있는, 펩타이드 물질을 포함하는 치료 유효량의 조성물을 말초 신경병증의 회복의 증진의 치료를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체에서 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 방법을 포함한다. 몇몇 실시예는 또한 산화된 Tβ4를 사용할 수 있다. 다른 실시예에 따라, 상기 물질은 티모신 베타 4 또는 산화된 Tβ4 이외의 것이다. 몇몇 실시예에서, 펩타이드 물질은 재조합 또는 합성 펩타이드, 또는 단리된 또는 정제된 펩타이드일 수 있다.

몇몇 실시예에 따라 사용될 수 있는 조성물은 펩타이드 물질, 예컨대 티모신 베타 4(Tβ4) 및/또는 산화된 Tβ4, Tβ4의 N 말단 변이체, Tβ4의 C 말단 변이체 및 Tβ4의 길항제를 포함하는 Tβ4 동형체, 유사체 또는 유도체, LKKTET의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 변이체를 포함하거나 이들로 실질적으로 이루어진 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편을 포함한다. 본 명세서에 참조문헌으로 포함된 국제 출원 PCT/US99/17282는 몇몇 실시예에 따라 유용할 수 있는 Tβ4의 동형체 및 몇몇 실시예에서 사용될 수 있는 LKKTET의 아미노산 서열 및 이의 보존적 변이체를 개시한다. 본 명세서에 참조문헌으로 포함된 국제 출원 PCT/GB99/00833(WO 99/49883)은 몇몇 실시예에 따라 사용될 수 있는 산화된 티모신 β4를 개시한다. 몇몇 실시예가 Tβ4 및 Tβ4 동형체와 관련하여 주로 하기에 기재되어 있지만, 하기 설명은 LKKTET 또는 LKKTNT의 아미노산 서열, LKKTET 또는 LKKTNT, 말초 신경병증 질환 억제 활성을 갖는 이의 보존적 변이체를 포함하거나 이들로 실질적으로 이루어진 펩타이드 및 단편 및/또는 Tβ4의 N 말단 변이체, Tβ4의 C 말단 변이체 및 Tβ4의 길항제를 포함하는 Tβ4 동형체, 유사체 또는 유도체에 동등하게 적용되도록 의도되는 것으로 이해된다. 몇몇 실시예는 또한 산화된 Tβ4를 사용할 수 있다.

몇몇 실시예는 LKKTET 또는 LKKTNT의 아미노산 서열, 이의 보존적 변이체를 포함하는 펩타이드 물질, 또는 LKKTET 또는 LKKTNT 펩타이드 또는 이의 보존적 변이체의 제조를 자극하는 자극 물질을 포함하는 치료 유효량의 조성물을 말초 신경병증의 회복의 증진의 치료를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체에서 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 방법을 포함한다.

몇몇 실시예는 KLKKTET의 아미노산 서열, LKKTETQ의 아미노산 서열, Tβ4의 N 말단 변이체, Tβ4의 C 말단 변이체 및/또는 또는 Tβ4의 동형체로 이루어진 펩타이드 물질을 갖는 치료 유효량의 조성물을 말초 신경병증의 회복의 증진의 치료를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를 포함하는 피험체에서 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 방법을 포함한다.

몇몇 실시예는 이환된 조직을 본 명세서에 기재된 펩타이드 물질을 포함하는 치료 유효량의 조성물과 접촉시켜 피험체에서 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 방법을 포함한다. 직접 투여의 예는 예를 들면 조직을 직접 도포 또는 흡입에 의해 본 명세서에 기재된 펩타이드 물질을 포함하는 액제, 로션, 고약(salve), 겔, 크림, 페이스트, 스프레이, 현탁제, 분산제, 하이드로겔, 연고 또는 오일과 접촉시키는 것을 들 수 있다. 전신 투여는 예를 들면 주사용수와 같은 약제학적으로 허용되는 담체 중에 본 명세서에 기재된 펩타이드 물질을 포함하는 조성물의 정맥내, 복강내, 근육내 주사를 포함한다.

본 명세서에 기재된 몇몇 실시예에서 사용하기 위한 펩타이드 물질을 임의의 유효량으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 본 명세서에 기재된 펩타이드 물질을 약 0.0001 내지 1,000,000 마이크로그램의 범위 내의 용량으로, 더 바람직하게는 약 0.1 내지 5,000 마이크로그램의 범위 내, 가장 바람직하게는 약 1 내지 100 마이크로그램의 범위 내의 양으로 투여할 수 있다.

몇몇 실시예에 따라 조성물을 투여일마다 단일 도포 또는 수회 도포로, 예컨대 투여일마다 2회, 3회, 4회 이상의 도포로 매일, 격일, 격주, 격달 등으로 투여할 수 있다.

많은 Tβ4 동형체가 확인되었고, Tβ4의 공지된 아미노산 서열에 약 70% 또는 약 75% 또는 약 80% 이상의 상동성을 갖는다. 이러한 동형체는 예를 들면 Tβ4^ala, Tβ9, Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 및 Tβ15를 포함한다. Tβ4와 유사하게, Tβ10 및 Tβ15 동형체는 액틴을 봉쇄하는 것으로 나타났다. Tβ4, Tβ10 및 Tβ15, 및 이러한 다른 동형체는 액틴 봉쇄 또는 결합을 중재하는 데 관여하는 것으로 보이는 LKKTET 또는 LKKTNT의 아미노산 서열을 공유한다. 임의의 특정한 이론에 구속되고자 함이 없이, 본 명세서에 기재된 펩타이드 물질의 활성은 적어도 부분적으로 이러한 물질의 항염증성 활성으로 인할 수 있다. Tβ4는 또한 액틴 중합을 중재할 수 있다(예를 들면, β-티모신은 유리 G-액틴을 봉쇄하여 F-액틴을 탈중합하는 것으로 보인다). 액틴 중합을 중재하는 Tβ4의 능력은 LKKTET 또는 LKKTNT 서열을 통해 액틴에 결합하거나 이를 봉쇄하는 이의 능력으로 인할 수 있다. 따라서, Tβ4에서처럼, LKKTET 또는 LKKTNT의 아미노산 서열을 갖는 Tβ4 동형체를 비롯하여, 항염증성이고/이거나 액틴에 결합하거나 이를 봉쇄하거나 액틴 중합을 중재하는 다른 단백질은 본 명세서에 기재된 바대로, 단독으로 또는 Tβ4와 조합되어, 효과적일 것이다.

따라서, Tβ4 동형체, 예컨대 Tβ4^ala, Tβ9, Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 및 Tβ15, 및 아직 확인되지 않은 Tβ4 동형체를 포함하는 본 명세서에 기재된 공지된 LKKTET 또는 LKKTNT 펩타이드는 몇몇 실시예의 방법에서 유용한 것으로 구체적으로 고려된다. Tβ4 동형체를 포함하는 본 명세서에 기재된 이러한 LKKTET 또는 LKKTNT 펩타이드는 피험체에서 실행되는 방법을 포함하여 몇몇 실시예의 방법에서 유용하다. 몇몇 실시예는 Tβ4, 및 Tβ4 동형체 Tβ4^ala, Tβ9, Tβ10, Tβ11, Tβ12, Tβ13, Tβ14 및 Tβ15를 포함하는 본 명세서에 기재된 LKKTET 또는 LKKTNT 펩타이드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.

또한, 적절한 봉쇄, 결합, 동원 또는 중합 검정에서 입증되거나, 예를 들면 LKKTET 또는 LKKTNT와 같은 액틴 결합을 중재하는 아미노산 서열의 존재에 의해 확인된 것처럼, 액틴을 동원하거나 액틴 중합을 중재할 수 있는 항염증성 활성 및/또는 액틴 봉쇄 또는 결합 능력을 갖는 다른 물질 또는 단백질을 몇몇 실시예의 방법에서 유사하게 사용할 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들면 겔솔린, 비타민 D 결합 단백질(DBP), 프로필린, 코필린, 디팩틴, Dnasel, 빌린, 프라그민, 서버린, 캡핑 단백질, 액티닌 및 아쿠멘틴을 포함할 수 있다. 이러한 방법이 피험체에서 실행된 것을 포함하므로, 몇몇 실시예는 본 명세서에 기재된 겔솔린, 비타민 D 결합 단백질(DBP), 프로필린, 코필린, 디팩틴, Dnasel, 빌린, 프라그민, 서버린, 캡핑 단백질, β-액티닌 및 아쿠멘틴을 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다. 몇몇 실시예는 LKKTET 또는 LKKTNT의 아미노산 서열 및 이의 보존적 변이체를 포함하는 폴리펩타이드의 용도를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "보존적 변이체" 또는 이의 문법상 변형어는 다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의한 특정한 아미노산의 대체를 의미한다. 보존적 변이체의 예는 다른 잔기에 의한 소수성 잔기, 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 대체, 다른 잔기에 의한 극성 잔기의 대체, 예컨대 리신에 의한 아르기닌의 치환, 아스파르트산에 의한 글루탐산의 치환 또는 아스파라긴에 의한 글루타민의 치환 등을 포함한다.

Tβ4는 다수의 조직 및 세포 유형에 국재화되고, 따라서 LKKTET 또는 LKKTNT 펩타이드, 예컨대 Tβ4 또는 본 명세서에 기재된 다른 펩타이드 물질의 제조를 자극하는 물질은 조직 및/또는 세포로부터의 펩타이드 물질의 제조를 실행하는 조성물에 첨가되거나 이 조성물을 포함할 수 있다. 이러한 자극 물질은 성장 인자의 패밀리 구성원, 예컨대 인슐린양 성장 인자(IGF-1), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 티모신 α1(Tα1) 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 포함할 수 있다. 더 바람직하게는, 자극 물질은 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β) 또는 TGF-β 슈퍼패밀리의 다른 구성원이다.

몇몇 실시예에 따라, 본 명세서에 정의된 펩타이드 물질의 제조를 자극하는 자극 물질로 피험체를 치료한다.

추가로, 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 것을 돕는 다른 물질을 본 명세서에 기재된 펩타이드 물질과 함께 조성물에 첨가할 수 있다. 예를 들면 제한의 방식이 아니라, 본 명세서에 기재된 펩타이드 물질은 단독으로 또는 조합되어 치료 유효량의 항생제, VEGF, KGF, FGF, PDGF, TGFβ, IGF-1, IGF-2, IL-1, 프로티모신 α 및/또는 티모신 α 중 임의의 하나 이상의 물질과 함께 첨가될 수 있다.

몇몇 실시예는 약제학적으로 허용되는 담체 중에 치료 유효량의 본 명세서에 기재된 펩타이드 물질을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.

치료를 제공하는 실제 용량 또는 시약, 제제 또는 조성물은 피험체의 체격 및 건강을 포함하는 많은 인자에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 당해 분야의 당업자는 상기 PCT/US99/17282 및 이에 인용된 문헌에 개시된 임상 용량을 결정하여 사용 전 적절한 용량을 결정하는 방법 및 기법을 기술하는 교시내용을 이용할 수 있다.

적합한 제제는 약 0.001 중량% 내지 50 중량% 범위 내, 더 바람직하게는 약 0.01 중량% 내지 0.1 중량% 범위 내, 가장 바람직하게는 약 0.05 중량%의 농도로 본 명세서에 기재된 펩타이드 물질을 포함할 수 있다.

몇몇 실시예와 관련하여 본 명세서에 기재된 치료학적 접근법은 피험체에 대한 임의의 종래의 투여 기법(예를 들면, 직접 투여, 국소 주사, 흡입 또는 전신 투여(이들로 제한되지는 않음))을 포함하여 본 명세서에 기재된 펩타이드 물질의 다양한 투여 또는 전달 경로를 포함한다. 본 명세서에 기재된 펩타이드 물질을 사용하거나 포함하는 방법 및 조성물은 약제학적으로 허용되는 비독성 부형제 또는 담체와 혼합되어 약제학적 조성물로 제제화될 수 있다.

예

하기 예는 본 발명을 본 명세서에 기재된 이 실시예로만 제한하지 않고 다른 실시예 또는 발명의 대상을 포기하지 않고 제공된다.

예 1.

배경: 말초 신경병증은 진성 당뇨병의 가장 흔한 장애를 발생시키는 합병증 중 하나이다. 본 발명자들은 티모신 β4("Tβ4")가 좌골 신경에서 당뇨병 유발 신경혈관 기능장애를 완화시키고 당뇨병성 말초 신경병증으로부터의 신경학적 기능의 회복을 증진시키는지를 평가하였다. 본 발명자들의 평가의 결과는 티모신 베타 4가 2형 당뇨병 마우스에서 말초 신경병증의 회복을 증진시킨다는 것을 보여준다.

방법과 결과: 말초 신경병증을 갖는 db/db 마우스의 Tβ4 치료는 좌골 신경에서 기능적 혈관 밀도 및 국부 혈류를 실질적으로 증가시키고 신경 기능을 개선시켰다. Tβ4는 당뇨병성 좌골 신경에서 내피 세포 및 슈반 세포에서 안지오포이에틴-1(Ang1) 발현을 상향조절하지만, Ang2 발현을 억제하였다. 실험실내, 고 포도당 조건 하의 Tβ4와의 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC)의 항온처리는 고 포도당 하향조절된 Ang1 발현 및 고 포도당 감소된 모세혈관 유사 관 형성을 완전히 무효화하였다. 더구나, Tβ4로 치료된 인간 슈반 세포(HSC)로부터 수집된 순화 배지와의 고 포도당 하의 HUVEC의 항온처리는 고 포도당 감소된 모세혈관 유사 관 형성을 유의적으로 역전시켰다. Tie2에 대한 중화 항체는 HUVEC에서 Tβ4 및 순화 배지의 효과를 억제하였다. Tβ4는 HSC에서 Akt를 활성화하고, PI3K 억제제인 LY294003에 의한 PI3K/Akt의 봉쇄는 Akt를 불활성화하고 Ang1 상향조절에 대한 Tβ4의 효과를 억제하였다.

본 발명자들의 결과는 Tβ4가 말초 당뇨병성 신경병증의 마우스 모델에서 좌골 신경에서의 혈관 기능 및 말초 신경 기능을 현저하게 예상치 못하게 개선한다는 것을 나타낸다. 임의의 특정한 이론에 구속됨이 없이, Tβ4는 당뇨병성 신경병증 하에 좌골 신경에서의 혈관 기능을 보존하고/하거나 회복시켜 말초 신경 기능의 개선을 증진시키도록 내피 세포 및 슈반 세포에 작용할 수 있다.

말초 신경병증은 진성 당뇨병의 가장 흔한 장애를 발생시키는 합병증 중 하나이다. 실험 동물 및 인간으로부터의 말초 당뇨병성 신경병증의 연구는 당뇨병성 신경병증의 진행이 현저한 신경혈관 기능장애와 밀접히 관련된다는 것을 나타낸다^1-3. 혈관 기능장애는 신경 손상을 발생시키는 신경 전도율 결핍의 발생으로 진행한다^{3 -5}.

43개의 아미노산의 작은 4.9kDa 폴리펩타이드인 티모신 베타 4(Tβ4)는 주요 세포내 G-액틴 봉쇄 펩타이드이다⁹. 이의 다수의 생물학적 기능 중에서, Tβ4는 발생 동안 심근경색 후 신생혈관형성 및 맥관형성을 촉진한다^{10 ,11}. Tβ4는 현재 급성 심근경색을 앓고 있는 환자의 치료를 위해 2상 임상 시험 중이다¹². Tβ4가 당뇨병성 신경병증에 대해 치료학적 효과를 미치는지는 본 업적 전에 공지되어 있지 않았다.

안지오포이에틴(Ang1 및 Ang2) 및 이의 수용체 Tie-2는 혈관 발생 및 항상성을 조절한다^{17 ,18}. Ang-1은 혈관 안정화 및 성숙을 촉진하는 반면, Ang2는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 생체이용율에 따라 Ang1 신호전달의 부분 효현제 또는 길항제로서 작용한다^{17 ,19,20}. Ang/Tie2 신호전달 경로는 당뇨병 하에 혈관 기능을 중재하는 데 있어서 중요한 역할을 한다^{21 ,22}. 고혈당증은 Ang1을 하향조절하고 Ang2를 상향조절한다^{21 ,23}. Ang1 수치 증가는 당뇨병 유발 미성숙 맥관구조를 정상화한다²⁴. Ang1은 신생혈관형성을 증가시킴으로써 심근경색을 감소시키고, Ang2 수치 증가는 당뇨병 랫트에서 경색을 악화시킨다²¹. 말초 당뇨병성 신경병증을 앓는 환자는 순환 Ang2 수치가 증가된다²⁵. 그러나, 말초 당뇨병성 신경병증에 대한 Ang/Tie2 신호전달 경로의 효과는 광범위하게 연구되지 않았다.

2형 당뇨병의 마우스 모델을 사용하여, 본 발명자들은 Tβ4에 의한 말초 당뇨병성 신경병증의 치료가 신경혈관 기능장애를 완화시키고 말초 신경 기능을 개선하는지를 평가하였다. 또한, 본 발명자들은 말초 당뇨병성 신경병증 하에 Ang/Tie2 신호전달 경로에 대한 Tβ4의 효과를 평가하였다.

방법:

동물 - 헨리 포드 병원(Henry Ford Hospital)의 실험 동물 운영 위원회(institutional Animal Care and Use Committee)이 승인한 실험실 동물의 관리 및 사용(Care and Use of Laboratory Animals)에 대한 NIH 가이드에 따라 모든 실험 절차를 수행하였다. 20주령의 수컷 BKS.Cg-m+/+ Lepr ^db /J(db/db) 마우스(Jackson Laboratories, 미국 메인주 바 하버 소재)를 사용하였다. 비침투성 유전자형(Jackson Laboratories)인 연령 일치 이형접합체 마우스(db/m)를 대조군 동물로서 사용하였다.

Tβ4 치료 - 20주령의 db/db 마우스(n=10/그룹)를 4주 동안 3일마다 6㎎/㎏ 또는 24㎎/㎏(RegeneRx, Inc, 복강내 주사, i.p.)의 용량으로 Tβ4로 치료하였다. 동일한 용적의 식염수로 치료된 동일한 연령의 db/db 마우스(n=10/그룹)를 대조군으로서 사용하였다. Tβ4(6㎎/㎏ i.p. 3일마다, n=10/그룹) 또는 식염수(n=10/그룹)로 치료된 연령 일치 db/m 마우스를 추가의 대조군으로서 사용하였다. 모든 마우스를 초기 치료 8주 후 희생시켰다. 공개된 실험에 기초하여 Tβ4의 용량을 선택하였다¹³.

레이저 도플러 혈류측정기에 의한 국부 좌골 신경 혈류의 측정 -

레이저 도플러 혈류측정기(LDF PeriFlux PF4, Perimed AB, Jarfalla, Sweden)를 사용하여 (초기 치료 8주 후) 실험 종료시 국부 좌골 신경 혈류를 측정하였다²⁶. 간단히 말하면, 마취 하에 마우스를 마취 하 주촉성 프레임에 탑재하였다. 중간 허벅지 부위에서 왼쪽 좌골 신경을 노출시키고 동물 직장 온도를 피드백 제어 수욕을 사용하여 측정 기간 동안 37±1.0℃에서 유지시켰다. 미세조작기를 사용하여, LDF 프로브를 좌골 신경의 표면에 위치시키고, 관류 단위로서 표현되는 상대 흐름 값을 전체 3회 동안 5분마다 기록하였다. db/m 마우스로부터의 국부 좌골 신경 혈류 값을 기준치로서 사용하고, 데이터를 기준치의 백분율로서 나타낸다.

신경생리학 측정 -

상기 기재된 바대로 순방향성 기록 기법으로 좌골 신경 전도율을 평가하였다²⁷. 간단히 말하면, 분리된 펄스 자극기계(모델 2100, A-M Systems, 미국 워싱턴주 에버레트 소재)를 사용하여 트리거 단일 구형파 전류 펄스를 전달하였다. 고유한 발 근육에 위치한 2개의 무균 전극과 함께 글라스 앰플리파이어(Grass Amplifier)(모델 P5, Grass Instruments, 미국 메사추세츠주 퀸시 소재)에 의해 동시 근전도검사를 기록하였다. 측정 동안, 동물 직장 온도를 피드백 제어 수욕을 사용하여 측정 기간 동안 37±1.0℃에서 유지시켰다. 공개된 실험에 따라 운동 신경 전도율(MCV) 및 감각 신경 전도율(SCV)을 계산하였다⁷.

꼬리 회피 및 핫 플레이트 시험 - 열 과민증을 조사하기 위해, 공개된 방법에 따라 꼬리 회피 및 핫 플레이트 시험을 이용하였다^{27 -29}. 간단히 말하면, 꼬리 회피 시험을 위해, 마우스의 꼬리를 원뿔형 폴리프로필렌 관의 구멍을 통해 노출시킨 채 이 관에 구속하였다. 대략 2㎝의 마우스 꼬리를 52℃±0.2 수욕 중에 담그고 이 설치류가 움직이거나 이의 꼬리를 치울 때까지의 시간을 기록하였다²⁸. 핫 플레이트 시험을 위해, 마우스를 투명한 유리 표면에서 플렉시글라스(plexiglass) 챔버 내에 위치시키고, 적어도 20분 동안 적응시켰다. 바닥 온도가 55℃(제조업자의 설정)인 열 자극 미터(IITC Model 39 Hot Plate Analgesia Meter, IITC Life Science, 미국 캘리포니아주 소재)를 사용하였다. 복사열에 반응하여 발을 빼는 반응시간(latency)을 기록하였다²⁹. 각각 꼬리 회피 및 핫 플레이트 시험에 대한 조직 손상을 피하기 위해 10초 및 15초의 컷오프 기간을 이용하였다. 시험 둘 다에서, 15분 간격으로 동물마다 적어도 3회 판독을 취하고 평균을 계산하였다.

면역조직화학 - 공개된 프로토콜에 따라 왼측 및 오른측 좌골 신경을 중간 허벅지 수준에서 분리하고, 4% 파라포름알데하이드 중에 고정하고 파라핀에 포매하였다^{2 7}. 본 발명자들의 공개된 프로토콜에 따라 면역염색하기 위해 각각의 동물에 대해 (60㎛ 간격의) 10개 시리즈 중 1개에서 3개의 횡단 절편(6㎛ 두께) 또는 3개의 종단 절편(6㎛ 두께)을 사용하였다²⁷. 다중클론 래빗 항-Ang1(1:2000; Abeam, 미국 메사추세츠주 캠브리지 소재), 단일클론 마우스 항-CD31 항체(1:500, BD Biosciences, 미국 캘리포니아주 산 호세 소재), 다중클론 래빗 항폰빌레브란트 인자(vWF)(1:300, Dako, 미국 캘리포니아주 카펜테리아 소재), 단일클론 마우스 항오클루딘(1:200, Zymed, 미국 캘리포니아주 샌 프란시스코 소재) 및 다중클론 래빗 항-S100(1:400, Abeam)의 1차 항체를 사용하였다. 음성 대조군으로서 래빗 또는 염소 IgG를 사용하였다. 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(1:5000)로 절편을 대비염색하였다.

이미지 분석 및 정량화 - 좌골 신경에서의 미세혈관 관류를 조사하기 위해, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)-덱스트란(2x10⁶ 분자량, Sigma; 50㎎/㎖의 0.2㎖)을 희생 10분 전에 마우스에 정맥내 투여하였다³⁰. 좌골 신경을 신속히 제거하고 2시간 동안 2% 파라포름알데하이드 중에 위치시켰다. 이후, 신경을 냉동된 횡단 절편에 대해 OCT 화합물 중에 포매하였다. 이미지 분석을 위해 각각의 마우스로부터의 60㎛ 간격의 3의 냉동된 횡단 절편(20㎛/절편, 두께)을 사용하였다. 마이크로 컴퓨터 이미징 디바이스(Micro Computer Imaging Device)(MCID) 시스템(Imaging Research Inc, 캐나다 온타리오주 세인트 카타리네스 소재)을 통해 20배율 현미경 대물렌즈(Zeiss Axiophot) 하에 절편을 디저털화하였다³⁰. FITC-덱스트란 관류된 혈관의 전체 수를 계수하고 전체 조직 부위로 나눠 혈관 밀도를 결정하였다.

vWF 면역반응 혈관 형태 및 밀도의 분석을 위해, 각각의 마우스로부터 60㎛ 간격으로 이격된 3개의 절편을 사용하였다. 절편마다 3의 시야를 20배율 대물렌즈 하에 무작위로 영상화하고, MCID를 사용하여 vWF 면역반응 혈관 주연부 및 vWF 양성 혈관의 전체 수를 측정하였다.

연구되는 샘플의 정체를 모르는 실험자가 모든 분석을 수행하였다.

세포 배양 -

본 발명자들은 5mM 포도당을 포함하는 배지로서 정상 포도당 배지(NG)를 규명하고, 고 포도당 배지(HG)는 30mM 포도당을 포함하는 배지를 의미하고, 이 배지는 비조절 당뇨병 환자에 일반적인 포도당 수치와 일치하도록 선택되었다³¹. 다른 사람이 실험실내 고혈당증 실험을 위해 이 포도당 농도를 사용하였다^{32 ,33}.

1차 배양물 및 인간 제정맥 내피 세포(HUVEC, American Type Culture Collection, ATCC, 미국 버지니아주 마나사스 소재)로부터 유래한 인간 슈반 세포(HSC, ScienCell Research Laboratories, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 제조업자(ScienCell Research Laboratories 및 ATCC)의 지시에 따라 배양하였다. HSC에 대한 Tβ4의 효과를 조사하기 위해, 24시간 또는 72시간 동안 상이한 농도(0, 25, 50 및 100ng/㎖)의 Tβ4의 존재 하에 NG 또는 HG 조건 하에 HSC를 배양하였다. 실시간 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 위해 세포를 수확하였다. HSC로부터 순화 배지를 수집하기 위해, 2.5×10⁶개의 HSC를 1.2ml의 제한 배지 중에 35㎜ 직경 접시로 평판배양하였다. 24시간 동안 Tβ4(100ng/㎖)의 존재 또는 부재 하에 NG 또는 HG 조건 하에 세포를 배양하였다. 이후, HSC를 PBS로 3회 세척하고, 새로운 혈청 비함유 배지를 첨가하여 과도한 Tβ4 오염을 피했다. 추가로 48시간 동안 세포를 배양하고, 상청액(순화 배지)를 수집하고, 1000rpm에서 10분 동안 원심분리하고, -80℃에서 저장하였다.

실험실내 신생혈관형성에 대한 Tβ4의 효과를 평가하기 위해, 모세혈관 유사 관 검정을 수행하였다^{34 -36}. 간단히 말하면, 5시간 동안 Tβ4(0, 25, 50 및 100ng/㎖)의 존재 또는 부재 하에 순화 배지 또는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 중에 마트리겔(BD Biosciences, 미국 메릴랜드주 록빌 소재)에 의해 코팅된 96웰 플레이트에서 HUVEC(2×10⁴개의 세포)를 배양하였다. MCID를 사용하여 각각의 웰로부터 전체 관 길이를 3의 무작위 시야로 측정하였다.³⁷

실시간 RT - PCR -

제조업자의 지시에 따라 Stratagene Absolutely RNA MicroRNA 분리 키트(Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라 소재)를 사용하여 세포로부터 전체 RNA 샘플을 단리하였다. 무작위 헥사머 및 M-MLV 역전사효소(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스바드 소재)를 사용하여 동일한 농도의 전체 RNA 생성물로부터 상보적 DNA(cDNA)를 역전사하였다. SYBR 그린 실시간 PCR 방법을 이용하여³⁸, 50℃에서의 2분, 95℃에서의 10분 및 이후 95℃에서의 15초 및 60℃에서의 1분의 40회 사이클과 같이 제조업자에 의해 제공된 3단계 프로그램 중재변수에 의해 ABI 7000 PCR 기기(Applied Biosystems, 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)에서 정량적 PCR을 수행하였다. 분해 반응 구성의 실험에 의해 생성된 증폭 생성물의 특이성을 확인하였다. 각각의 샘플을 3회 시험하고, 2^{-ΔΔ CT} 방법을 이용하여 상대 유전자 발현의 분석을 위해 3회 독립 실험으로부터 얻은 샘플을 사용하였다³⁹. 실시간 PCR을 위해 프라이머 익스프레스 소프트웨어(Primer Express software)(ABI)를 사용하여 글리세르알데하이드-3-포스페이트 탈수소효소(GAPDH)(FWD, AGA ACA TCA TCC CTG CAT CC(서열 번호 7); REV, CAC ATT GGG GGT AGG AAC AC(서열 번호 8)) 및 Ang1(FWD, GAA GGG AAC CGA GCC TAT TC(서열 번호 9); REV, GCT GAA ATC AGC ACC GTG TA(서열 번호 10)), Ang2(FWD, CAG ATC CGG GCT CTA GAC AG(서열 번호 11); REV, TCC GGA AAT CGT TCT TCA TC(서열 번호 12))의 프라이머를 설계하였다.

웨스턴 블롯 분석 -

공개된 방법에 따라 웨스턴 블롯을 수행하였다³⁸. 간단히 말하면, 동일양의 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로딩하였다. 전기영동 후, 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고, 이후 블롯을 다중클론 래빗 항-Ang1(1:1000; Abeam, 미국 메사추세츠주 캠브리지 소재), 다중클론 래빗 항-Ang2(1:1000; Abeam), 포스포-Akt(1:1000, Cell Signaling Technology, Inc. 미국 메사추세츠주 댄버 소재) 및 Akt(1:1000, Cell Signaling Technology)의 항체로 프로빙하였다. 검출을 위해, 겨자무 과산화효소 접합 2차 항체를 사용한 후(1:2000), 증감 화학발광 전개시켰다(Pierce, 미국 일리노이주 락포드 소재). β-액틴 항체에 의해 평행 웨스턴 블롯을 수행하여 결과의 정규화를 보장하였다. 이미지 처리 및 분석 프로그램(Scion Image, 미국 메사추세츠주 에더릭 소재)을 이용하여 광학 밀도를 정량화하였다.

통계 분석 -

정상상태에 대해 데이터를 평가하였다. 데이터가 정상이 아닌 경우 데이터 변환을 고려하였다. 그 결과, 분석을 위해 랭킹된 데이터를 사용하였다. 측정된 기능 회복에 대한 그룹 차이를 시험하기 위해 일반화 추정 방정식(Generalize Estimating Equation: GEE)을 이용한 전반적인 시험을 실행하였다. 분석은 치료 전체 그룹 효과를 시험하여 시작하고, 이후 전체 그룹 효과가 0.05 수준에서 검출되는 경우 0.05 수준에서 하위그룹을 분석하였다. 다수의 결과에 대한 전반적인 시험은 모든 결과에서 용량 효과가 일치할 때(예를 들면, 양의 상관) 단일 결과보다 더 효과적이다. 0.05에서 각각의 결과에 기능 회복(전반적인 시험에 기초하여 p<0.05)에 대한 유의적인 용량 효과를 추가로 시험하였다. 전체 그룹 효과를 시험하기 위해 1방향 ANOVA를 이용하였다. 데이터는 평균±SE로 제시된다. P<0.05의 값을 유의적으로 취했다.

결과:

본 발명자들의 데이터는 Tβ4가 좌골 신경에서 당뇨병 유발 혈관 기능장애를 개선한다는 것을 나타낸다.

db/db 마우스가 신생혈관 손상을 진행시키는지를 조사하기 위해, 본 발명자들은 28주령의 마우스의 좌골 신경에서 신경 혈관의 미세혈관을 조사하였다. 신경 혈관의 vWF 면역반응 혈관의 분석은 db/db 마우스에서의 혈관 주연부가 연령 일치 db/m 마우스에서와 비교할 때 유의적으로 감소하지만, 이 2개의 그룹 사이에 혈관 밀도가 유의차가 없다는 것을 나타낸다(db/m 마우스에서 73.5±0.5 대 56.9±6.4, p>0.05)(도 1). 도 1은 Tβ4가 좌골 신경에서 혈관 기능을 개선한다는 것을 나타내는 데이터를 포함한다. 패널 A 내지 패널 C는 대표적인 db/m 마우스(A), 식염수로 치료된 db/db 마우스(B) 및 Tβ4로 치료된 db/db 마우스(24㎎/㎏, C)로부터의 좌골 신경의 횡단 절편에서의 vWF 면역반응 혈관을 보여준다. 패널 D 내지 F는 대표적인 db/m 마우스(D), 식염수로 치료된 db/db 마우스(E) 및 Tβ4로 치료된 db/db 마우스(24㎎/㎏, F)로부터의 좌골 신경의 횡단 절편에서의 FITC-덱스트란 관류 혈관을 보여준다. 패널 G 및 패널 I는 vWF 면역반응 혈관 주연부의 정량적 데이터(G, n=6/그룹) 및 FITC-덱스트란 관류된 혈관의 밀도(H, n=4/그룹), 오클루딘 면역반응 혈관(I, n=6/그룹) 및 100%에서의 db/m 마우스에 대한 좌골 신경 혈류의 백분율 변화(J, n=4/그룹)를 나타낸다. dm=db/m 마우스; db=db/db 마우스. 또한, db/db 마우스는 실질적인 오클루딘, 밀착 연접 단백질, 면역반응 혈관의 감소를 나타낸다(도 1). db/db 마우스에서의 주연부 감소가 혈관 기능에 영향을 미치는지를 조사하기 위해, 본 발명자들은 혈장 관류된 미세혈관을 측정하였고, 이는 기능 혈관^{7 ,26} 및 국부 혈류를 나타낸다. 혈장 관류된 혈관을 측정하기 위해, 본 발명자들은 FITC-덱스트란을 마우스에 정맥내 주사한 후 주사 10분 후 이를 희생시켰고, 이 10분은 FITC-덱스트란이 생리학적 조건 하에 전체 혈관계에 걸쳐 순환하기에 충분한 시간을 제공한다. 좌골 신경의 횡단 절편에서의 FITC-덱스트란 관류된 혈관의 정량적 분석은 db/db 마우스가 db/m 마우스와 비교하여 FITC-덱스트란이 관류된 미세혈관 밀도가 유의적으로 감소한다는 것을 나타낸다(도 1). 동시에, LDF에 의해 측정된 좌골 신경 혈류는 db/m 마우스에서와 비교하여 db/db 마우스에서 유의적으로 감소하였다(도 1). 종합하면, 이 데이터는 당뇨병이 좌골 신경에서 혈관 기능장애를 유발한다는 것을 나타내고, 이는 공개된 연구와 일치한다^{6 ,7,40}. 그러나, 20주령의 동물에서 시작하여 4주 동안 6㎎/㎏ 및 24㎎/㎏의 용량으로 Tβ4로 치료된 db/db 마우스는, 식염수로 치료된 db/db 마우스와 비교하여, db/m 마우스에서 측정된 수치와 유사한, 28주령에서 혈관 주연부, 오클루딘 면역반응 혈관, FITC-덱스트란 관류된 혈관의 밀도 및 좌골 신경 혈류의 유의적인 증가를 나타낸다 (도 1). 유사하게, 도 2의 데이터는 Tβ4가 혈관벽에서 오클루딘 면역반응 부위를 증가시킨다는 것을 나타낸다. 패널 A 내지 L은 CD31 면역반응 혈관(녹색)이 대표적인 db/m 마우스(A-D, dm), 식염수로 치료된 db/db 마우스(E-H, db) 및 Tβ4로 치료된 db/db 마우스(24㎎/㎏, l-L)로부터 오클루딘 양성(적색)이라는 것을 나타낸다. 패널 M은 오클루딘 면역반응 부위의 백분율의 정량적 데이터를 나타낸다. 식염수로 치료된 db/db 마우스에 대해 #p<0.05. n=6/그룹. 이 데이터는 Tβ4가 좌골 신경에서의 당뇨병 유발 혈관 기능장애를 완화시킨다는 것을 나타낸다.

본 발명자들의 데이터는 Tβ4가 당뇨병 마우스에서 신경학적 기능을 개선시킨다는 것을 나타낸다.

말초 신경 전도의 손상은 말초 신경병증을 앓는 당뇨병 환자에 대한 중요한 표시자이고^{41 ,42}, 혈관 기능장애는 신경 전도에 영향을 미친다^{4 ,5}. 따라서, 본 발명자들은 Tβ4에 의한 국부 혈류 증대가 좌골 신경에서 운동 전도율(MCV) 및 감각 전도율(SCV)에 영향을 미친다고 평가하였다. 전기생리학적 기록은 MCV 및 SCV가 연령 일치 db/m 마우스와 비교하여 db/db 마우스에서 유의적으로 느려진다(도 3)는 것을 나타내고, 이는 다른 사람이 기록한 값에 필적한다^{7 ,43}. 도 3은 신경학적 기능에 대한 Tβ4의 효과와 관련된 데이터를 나타낸다. Tβ4에 의한 db/db 마우스의 치료는 MCV(A), SCV(B), 꼬리 회피 시험(C) 및 핫 플레이트 시험(D)에 의해 측정된 신경학적 기능을 개선한다. 각각 db/m 마우스 및 식염수로 치료된 db/db 마우스에 대해 ^*P<0.05 및 #P<0.05. n=10/그룹. dm=db/m 마우스; db=db/db 마우스. 4주 동안 6㎎/㎏ 및 24㎎/㎏의 용량에서의 Tβ4에 의한 db/db 마우스의 치료는 식염수 치료된 db/db 마우스와 비교하여 Tβ4 치료 종료시 및 치료 종료 4주 후 MCV 및 SCV 둘 다가 현저히 개선된다는 것을 나타낸다(도 3). 이후, 본 발명자들은 꼬리 회피 및 핫 플레이트 시험에 의해 열 반응시간을 측정하여 감각 기능에 대한 Tβ4 치료의 효과를 조사하였다. Tβ4에 의한 db/db 마우스의 치료는 Tβ4 치료 종료시 시작하는 열 반응시간을 현저히 개선하였고, 이는 치료 종료(실험 기간 종료) 후 적어도 4주 동안 지속되었다(도 4). 비당뇨병 마우스에 대한 Tβ4의 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 6㎎/㎏의 용량으로 Tβ4에 의해 db/m 마우스를 치료하였고, 상기 기재된 방법에 의해 측정할 때 어떠한 기능 변화도 검출하지 못했다. 도 4를 참조한다. 6㎎/㎏에서의 Tβ4에 의한 db/m 마우스의 치료는 MCV(A), SCV(B), 꼬리 회피 시험(C) 및 핫 플레이트 시험(D)에 의해 측정된 신경학적 기능을 변화시키지 않았다. n=10 마우스/그룹. dm=db/m 마우스. 이 데이터는 Tβ4가 당뇨병 마우스에서 말초 신경 기능을 개선한다는 것을 나타낸다.

Tβ4에 의한 db/db 마우스의 치료는 혈중 포도당 수치 및 동물 체중을 유의적으로 변경하지 않았다(표 1 및 표 2).

본 발명자들의 데이터는 Tβ4가 좌골 신경에서 전혈관생성 유전자를 조절한다는 것을 나타낸다.

당뇨병 환자 및 실험적 당뇨병에서 Ang1 및 Ang2 수치 변경이 검출되었다^{21 ,25}. 이 혈관생성 유전자에 대한 Tβ4의 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 Ang1 및 Ang2의 단백질 수치를 측정하였다. 도 5는 Tβ4가 당뇨병 마우스에서 내피 세포 및 슈반 세포에서 Ang1 발현을 상향조절한다는 것을 나타내는 데이터를 보여준다. 내부 대조군으로서 β-액틴 및 좌골 신경 조직에서의 Ang1 및 Ang2 수치의 웨스턴 블롯 분석(A 및 B)을 사용하였다. 이중 면역형광 염색의 대표적인 이미지는 Ang1 면역활성(C, F, G, J, 적색, 화살표)이 CD31 양성 혈관(D, F, 녹색) 및 S100 양성 슈반 세포(H, J, 녹색, 화살표)에 동시 국재화된다는 것을 나타낸다. 각각 db/m 마우스 및 식염수 치료된 db/db 마우스에 대해 ^*P<0.05 및 #P<0.05. n=6/그룹. dm=db/m 마우스; db=db/db 마우스. 좌골 신경의 웨스턴 블롯 분석은 db/db 마우스에서 실질적인 Ang1 수치 감소 및 Ang2 수치 증가를 나타내고(도 5), Tβ4에 의한 db/db 마우스의 치료는 Ang1 발현을 유의적으로 증가시켰지만, Ang2 발현을 감소시켰다(도 5). 이중 면역염색은 Ang1 면역반응 세포가 CD31(내피 세포의 마커) 및 S100(슈반 세포의 마커) 양성이라는 것을 나타낸다(도 5). 종합하면, 이 데이터는 Tβ4가 당뇨병 마우스에서 내피 세포 및 슈반 세포에서 Ang1 발현을 상향조절한다는 것을 나타낸다.

본 발명자들의 데이터는 Ang/Tie2 신호전달 경로가 내피 기능에 대한 Tβ4의 효과를 중재한다는 것을 나타낸다.

상기 기재된 생체내 데이터는 Ang1 및 Ang2 유전자가 당뇨병 마우스에서 Tβ4 개선된 혈관 기능을 중재한다는 것을 제시한다. 고혈당증 상태 하에 내피 세포에 대한 이 유전자의 원인 효과를 조사하기 위해, 본 발명자들은 실험실내 내피 기능을 조사하기 위해 널리 사용되는 모세혈관 유사 관 형성 검정을 이용하여 실험실내 실험을 수행하였다^{34 ,35,37,44}. 도 6은 Ang/Tie2 신호전달 경로가 내피 기능에 대한 Tβ4의 효과를 중재한다는 것을 나타내는 데이터를 보여준다. 대표적인 현미경 이미지(A) 및 정량적 데이터(B)는 정상 포도당(N), 고 포도당(H), 고 포도당과 Tβ4(H+TB4, 100ng/㎖) 및 Tie2에 대한 중화 항체의 존재(+Tie2, 5pg/㎖) 하의 고 포도당과 Tβ4에서 배양된 HUVEC에서의 모세혈관 유사 관 형성을 나타낸다. 실시간 RT-PCR(C) 및 웨스턴 블롯(D) 데이터는 정상 포도당(N), 고 포도당(H), 고 포도당과 Tβ4(+TB4) 및 LY294003의 존재(+LY, 10μM) 하의 고 포도당과 Tβ4에서 배양된 HUVEC에서의 Ang1 및 Ang2의 mRNA 및 단백질 수치를 나타낸다. 패널 E는 상기 기재된 상이한 조건 하에 배양된 HUVEC에서의 pAkt 및 전체 Akt의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 각각 mRNA 및 단백질에 대한 내부 대조군으로서 GAPDH 및 β-액틴을 사용하였다. 각각 정상 포도당(N), 고 포도당(H) 및 고 포도당과 Tβ4(100ng/㎖) 그룹에 대해 ^*P<0.05, #P <0.05 및 $P <0.05. n=6/그룹. 고 포도당 조건 하의 HUVEC의 항온처리는 정상 포도당 조건 하에 배양된 HUVEC와 비교하여 모세혈관 유사 관 형성을 감소시켰다(도 6). 그러나, Tβ4는 모세혈관 유사 관 형성의 감소에 대한 고 포도당의 효과를 억제하였다(도 6). 정량적 RT-PCR 및 웨스턴 블롯 분석은 고 포도당과의 HUVEC의 항온처리가 각각 Ang1 및 Ang2 발현을 실질적으로 감소시키고 증가시키고(도 6), Tβ4가 Ang1 및 Ang2의 고 포도당 유발 발현을 무효화한다는 것을 나타낸다(도 6). Ang1 및 Ang2의 수용체인 Tie2에 대한 중화 항체에 의한 Tie2의 봉쇄는 Tβ4 증가된 모세혈관 유사 관 형성을 억제하였다(도 6). 이 데이터는 Ang/Tie2 신호전달 경로가 고혈당증 하에 Tβ4 개선된 내피 기능을 중재하는 데 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 나타낸다.

본 발명자들의 데이터는 Tβ4 치료된 슈반 세포에 의해 분비된 Ang1이 내피 기능을 개선한다는 것을 나타낸다.

내피 세포 이외에, 본 발명자들의 생체내 이중 면역염색 데이터는 슈반 세포가 Ang1을 발현한다는 것을 나타낸다. 따라서, 본 발명자들은 슈반 세포에서 안지오포이에틴 발현의 발현에 대한 Tβ4의 효과를 조사하였다. 도 7은 Tβ4 치료된 슈반 세포에 의해 분비된 Ang1이 내피 기능을 개선한다는 것을 나타내는 데이터를 보여준다. 실시간 RT-PCR(A) 및 웨스턴 블롯(B) 데이터는 정상 포도당(N), 고 포도당(H), 고 포도당과 Tβ4(+TB4) 및 LY294003의 존재(+LY) 하의 고 포도당과 Tβ4과 배양된 HSC에서의 Ang1 및 Ang2의 mRNA 및 단백질 수치를 나타낸다. 패널 C는 상기 기재된 상이한 조건 하에 배양된 HSC에서의 pAkt 및 전체 Akt의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 각각 mRNA 및 단백질에 대한 내부 대조군으로서 GAPDH 및 β-액틴을 사용하였다. 패널 D는 정상 포도당(N), 고 포도당(H), 고 포도당 및 Tβ4(+TB4, 100ng/㎖) 및 LY294003의 존재(+LY) 하의 고 포도당 및 Tβ4와 배양된 HSC로부터 수확된 상청액에서의 Ang1 수치의 ELISA 데이터를 나타낸다. 대표적인 현미경 이미지(E) 및 정량적 데이터(F)는 정상 포도당(N), 고 포도당(H), 고 포도당 및 Tβ4(+TB4, 100ng/㎖) 및 Tie2에 대한 항체의 존재(+Tie2) 하의 고 포도당 및 Tβ4에서 HSC로부터 수집된 순화 배지와 배양된 HUVEC에서의 모세혈관 유사 관 형성을 나타낸다. 각각 정상 포도당(N), 고 포도당(H) 및 Tβ4(100ng/㎖)를 함유한 고 포도당 그룹에 대한 ^*P<0.05, #P <0.05 및 $P <0.05. n=6/그룹. 고 포도당은 실질적으로 Ang1을 하향조절하고 Ang2를 상향조절하고, 100ng/㎖의 용량에서의 Tβ4는 HSC에서의 안지오포이에틴 발현에 대한 고 포도당 효과를 억제하고(도 7), 이는 Tβ4가 또한 슈반 세포에서 안지오포이에틴 발현을 조절한다는 것을 제시한다. 이후, 본 발명자들은 슈반 세포가 Tβ4 상향조절된 Ang1을 분비하여 결과적으로 고 포도당 조건 하에 혈관 기능을 개선하는지를 조사하였다. 마우스 Ang1을 검출하는 데 특이적인 ELISA를 이용하여, 본 발명자들은 48시간 동안 배양된 HSC로부터 수확된 상청액에서 Ang1 수치를 측정하였다. ELISA는 고 포도당과 배양된 HSC로부터의 성청액이 정상 포도당 조건으로부터 수집된 상청액에서의 수치와 비교하여 Ang1 수치가 유의적으로 감소하고, Tβ4가 Ang1 수치에 대한 고 포도당의 효과를 역전시킨다는 것을 나타낸다(도 7).

다음에, 본 발명자들은 HUVEC를 HSC로부터 수확된 순화 배지와 배양함으로써 모세혈관 유사 관 형성에 대한 상청액의 효과를 조사하였다. 정상 포도당과 배양된 HSC로부터 수집된 순화 배지와 비교하여, 고 포도당 조건 하에 배양된 HSC로부터의 순화 배지는 모세혈관 유사 관 형성을 유의적으로 감소시켰다(도 7). 반대로, 고 포도당 조건 하에 Tβ4로 치료된 HSC로부터 수집된 순화 배지는 모세혈관 관 형성을 유의적으로 증가시켰다. Tie2에 대한 중화 항체의 존재 하에, 모세혈관 유사 관 형성에 대한 Tβ4 순화 배지의 효과는 억제되었다(도 7). 종합하면, 이 데이터는 Tβ4 치료된 슈반 세포에 의해 분비된 가용성 Ang1인 내피 Ang1이 내피 세포 기능을 개선한다는 것을 나타낸다.

본 발명자들의 데이터는 PI3K/Akt 신호전달 경로가 Ang1 발현에 대한 Tβ4의 효과를 중재한다는 것을 나타낸다.

세포내 신호전달 경로가 내피 세포 및 슈반 세포에서 Tβ4 상향조절된 Ang1/Ang2에 관여하는지를 추가로 평가하기 위해, 본 발명자들은 내피 전구 세포 이동에 대한 Tβ4의 효과를 중재하는 것으로 나타난 PI3K/Akt 신호전달 경로를 조사하였다⁴⁵. HUVEC 및 HSC의 웨스턴 블롯 분석은 고 포도당 조건이 정상 포도당과 비교하여 pAkt 수치를 현저히 감소시킨다는 것을 나타낸다(도 6 및 도 7). 고 포도당 조건 하에 Tβ4에 의한 HUVEC 및 HSC의 치료는 PI3K 억제제 LY294002에 의해 완전 차단된 pAkt 수치를 유의적으로 증가시키고(도 6 및 도 7), 이는 Tβ4가 PI3K/Akt 신호전달 경로를 활성화한다는 것을 나타낸다. 더욱이, LY294002는 고 포도당 조건 하에 HUVEC 및 HSC에서의 Ang2 발현이 아니라 Ang1에서의 Tβ4의 효과를 완전히 억제하였다(도 6 및 도 7). 이 데이터는 PI3K/Akt 신호전달 경로가 내피 세포 및 슈반 세포에서 Tβ4 조절된 Ang1 발현에 관여한다는 것을 제시한다.

처음에 본 발명자들의 업적은 Tβ4가 말초 당뇨병성 신경병증의 마우스 모델에서 좌골 신경 혈관 기능 및 말초 신경 기능을 현저히 예상치 못하게 개선한다는 것을 나타낸다. 임의의 특정한 이론에 구속됨이 없이, Ang/Tie2 신호전달 경로는 개선된 혈관 기능에 대한 Tβ4의 효과를 중재할 수 있다. 이전에 말초 당뇨병성 신경병증에 대한 Tβ4의 효과가 조사되지 않았다. 2형 당뇨병의 잘 확립된 마우스 모델을 이용하여, 본 발명자들의 업적은 Tβ4가, 말초 당뇨병성 신경병증에 대한 중요한 중재변수인 좌골 신경 전도율 결핍의 감소 및 열 자극 및 기계적 자극에 대한 반응의 개선에 의해 입증된 것처럼, 말초 당뇨병성 신경병증을 완화시킨다는 것을 나타낸다. 본 발명자들의 데이터는 몇몇 실시예에서, 제한함이 없이, Tβ4가 말초 당뇨병성 신경병증의 치료에 사용될 수 있다는 것을 나타낸다.

실험 동물 및 인간로부터의 말초 당뇨병성 신경병증의 연구는 당뇨병성 신경병증의 진행이 현저한 신경혈관 기능장애와 밀접히 관련된다는 것을 나타낸다^{1 -3}. 혈관 기능장애는 신경 손상을 발생시키는 신경 전도율 결핍 발생으로 진행한다^{3 -5}. 본 발명자들의 데이터는 Tβ4가 당뇨병성 신경병증의 신경학적 기능 개선과 동시에 좌골 신경에서 혈장 관류된 혈관 및 국부 혈류를 실질적으로 증가시킨다는 것을 나타내고, 이는 Tβ4에 의한 혈관 기능의 정상화가 관찰된 신경 전도율 결핍 감소에 기여할 수 있다는 것을 제시한다.

Ang/Tie2 신호전달 경로는 혈관 항상성을 조절한다^{17 ,18}. Ang1은 혈관 성숙을 촉진하고, Ang2는 Tie2 결합에 대해 Ang1의 경쟁적 억제제로서 작용하고 혈관을 탈안정화시킨다^{17 ,19,20}. 고혈당증은 Ang1을 하향조절하고 Ang2를 상향조절한다²¹. Ang1 수치 증가는 당뇨병 유발 미성숙 맥관구조를 정상화한다²⁴. 당뇨병 랫트에서 Ang1은 신생혈관형성을 증가시킴으로써 심근경색을 감소시키고, Ang2 수치 증가는 경색을 악화시킨다²¹. 말초 당뇨병성 신경병증을 앓는 환자는 순환 Ang2 수치가 유의적으로 증가된다²⁵. 본 발명자들의 데이터는 고혈당증이 내피 세포 및 슈반 세포에서 Ang1을 하향조절하고 Ang2를 상향조절하고, Tβ4가 Ang1 및 Ang2의 발현을 역전시킨다는 것을 나타낸다. Tβ4는 강력한 혈관생성 인자이고, 전구 세포 분화를 촉진하고 내피 세포 이동을 지시함으로써 발생 동안 신생혈관형성 및 맥관형성을 조절한다^{10 ,46,47}.

중화 항체에 의한 Tie2의 봉쇄가 실험실내 신생혈관형성에 대한 Tβ4의 효과를 억제한다는 본 발명자들의 데이터는 생체내 관찰된 Tβ4 개선된 혈관 기능을 중재하는 데 있어서의 Ang/Tie2 신호전달 경로를 시사한다. 임의의 특정한 이론에 구속됨이 없이, 본 발명자들의 데이터는 Tβ4가 PI3K/Akt 경로의 활성화를 통해 Ang1을 조절한다는 것을 추가로 제시한다.

슈반 세포는 퇴화 및 재생 말초 신경을 조절하는 다양한 인자를 분비한다^{48 -50}. 본 발명자들의 업적은 슈반 세포에 의해 분비된 Ang1 및 Ang2이 고혈당증 조건 하에 내피 기능에 영향을 미치고, 슈반 세포에서의 Tβ₄ 증가된 Ang1 수치가 실험실내 신생혈관형성을 증대시킨다는 것을 나타낸다. 따라서, 임의의 특정한 이론에 구속됨이 없이, Tβ4는 당뇨병성 신경병증 하에 내피 세포 및 슈반 세포에 작용하여 좌골 신경에서의 혈관 기능을 보존하고/하거나 회복시켜 말초 신경 기능의 개선을 증진시킬 수 있다.

본 명세서에 개시된 이 실시예로만 제한함이 없이 다른 실시예 또는 발명의 대상을 포기함이 없이, 각각의 환자의 임상 상태, 투여 부위 및 방법, 투여 스케쥴링, 환자 연령, 성별, 체중 및 의학 의사에게 공지된 다른 인자를 고려하여 우수 제조 관리 기준(good medical practice)에 따라 몇몇 실시예를 포함하는 조성물을 투여하고 투약한다. 따라서, 당해 분야에 공지된 바대로 이러한 고려에 의해 본 명세서의 목적을 위한 "치료 유효량"을 결정한다. 질환의 표시자 감소, 질환의 빈도 또는 중등도 감소, 또는 증상의 개선 또는 제거 및 당해 분야의 당업자가 적절한 조치로서 선택하는 다른 표시자(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 개선을 성취하기에 이 양은 효과적이어야 한다.

투여는 다양한 방식일 수 있다. 이를 단독으로 또는 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 및 비히클과 조합하여 활성 성분으로서 투여할 수 있다. 투여는 경구, 피하 또는 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내 및 비강내 투여 및 척추강내 및 주사 기법을 비롯한 비경구, 또는 질환 또는 병리학적 병증의 부위로의 국소 투여 또는 직접 접종에 의할 수 있다. 화합물의 이식이 또한 유용하다. 치료되는 환자는 온혈 동물, 특히 인간을 포함하는 포유동물일 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 및 비히클 및 임플란트 담체는 일반적으로 몇몇 실시예의 활성 성분과 반응하지 않는 불활성, 비독성 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다.

치료 기간이 질환 과정의 기간 및 약물 효과에 비례하는 본 명세서에 예시된 실험 동물보다 인간이 일반적으로 오래 치료된다는 것에 유의한다. 용량은 시간에 걸쳐 단일 용량 또는 다회 용량일 수 있다. 치료 기간은 일반적으로 질환 과정의 기간 및 약물 효과 및 치료되는 환자 종에 비례한다.

몇몇 실시예를 비경구로 투여할 때, 이는 일반적으로 단위 용량 주사용 형태(용제, 현탁제, 에멀션)로 제제화된다. 주사에 적합한 약제학적 제제는 무균 수용액 또는 분산액, 및 무균 주사용수 또는 분산액으로 재구성하기 위한 무균 분말을 포함한다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질, 및 식물성 오일일 수 있다.

필요한 경우, 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅의 사용에 의해, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 선택된 실시예에 대해 용매 시스템으로서 비수성 비히클, 예컨대 면실유, 세서미유, 올리브유, 대두유, 옥수수유, 해바라기유 또는 땅콩유 및 에스테르, 예컨대 이소프로필 미리스테이트를 또한 사용할 수 있다. 추가로, 항균 보존제, 항산화제, 킬레이트화제 및 완충제를 포함하는 조성물의 안정성, 무균성 및 등장성을 증대시키는 다양한 첨가제를 첨가할 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 보장될 수 있다. 많은 경우에, 등장성 물질, 예를 들면 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 물질을 사용하여 주사용 약제학적 형태의 흡수가 연장될 수 있다. 사용된 임의의 비히클, 희석제 또는 첨가제는 선택된 실시예와 상용성이어야 한다.

원하는 바대로 필요한 양의 적절한 용매 중에 다양한 다른 성분과 원하는 실시예를 혼입하여 무균 주사용 용액을 제조할 수 있다.

몇몇 실시예를 포함하는 약물학적 제제를 임의의 상용성 담체, 예컨대 다양한 비히클, 부형제, 첨가제 및 희석제를 포함하는 주사용 제제로 환자에게 투여할 수 있거나; 이 실시예를 서방 피하 임플란트 또는 표적화 전달 시스템의 형태로 환자에게 비경구로 투여할 수 있다. 많은 다른 이러한 임플란트, 전달 시스템 및 모듈은 당해 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다.

몇몇 실시예를 포함하는 조성물은 임의의 적합한 형태이고 내부 또는 외부 용도를 위한 것일 수 있다. 내부 용도를 위한 제제는 경구 섭취 또는 주사에 적합한 분말, 정제, 분산성 과립, 캡슐, 용제, 현탁제 및 에멀션을 포함한다.

국소 조성물을 또한 상처 드레싱, 경피 패치 등의 형태로 투여할 수 있다.

몇몇 실시예에서, 본 명세서에 개시된 것에만 제한함이 없이 다른 실시예 또는 발명의 대상을 포기함이 없이, 피험체의 병증, 직면한 징후학, 투여 경로 및/또는 투여 빈도, 및 당업자에게 공지되거나 이용 가능하고 우수 과학 또는 의학 규격 및 실행에 일치하여 적용되는 다른 고려 및 기법에 따라 치료학적 유효 용량을 결정할 수 있다.

제한함이 없이, 몇몇 실시양태는 인간 및 다른 포유동물(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 임의의 유형의 동물과 함께 사용될 수 있다.

모든 별첨, 표 및 인용 문헌은, 본 명세서에 완전히 기재되어 있지만, 그 전문이 참조문헌으로 본 명세서에 포함된다.

본 명세서의 정신 및 범위를 벗어남이 없이 본 명세서에 기재되고 청구된 실시예에 다양한 변화 또는 변형이 이루어질 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명이 특히 상기 바람직한 및 대안적인 실시예를 참조하여 도시되고 기재되어 있지만, 하기 특허청구범위에 정의된 바대로 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어남이 없이 본 발명을 실행하는 데 있어서 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시예에 대한 다양한 대안을 이용할 수 있는 것으로 당업자는 이해해야 한다. 하기 특허청구범위가 본 발명의 범위를 한정하고, 본 특허청구범위 및 이의 균등물의 범위 내의 방법 및 기기가 이에 의해 커버되는 것으로 의도된다. 본 발명의 상세한 설명은 본 명세서에 기재된 부재의 모든 신규하고 비자명한 조합을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, 특허청구범위는 본원 또는 이 부재의 임의의 신규하고 비자명한 조합에 대한 이후의 출원에서 제시될 수 있다.

상기 실시예는 예시적이고 제한적이지 않으며, 단일의 피처 또는 부재가 본원 또는 이후의 출원에 청구될 수 있는 모든 가능한 조합에 필수적이지 않다. 제공된 예 이외의 많은 실시예 및 출원은 상기 상세한 설명을 읽을 때 당업자에게 명확하다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명을 참조하지 않고 결정되어야 하지만, 대신에 특허청구범위와 함께 이러한 특허청구범위가 권한 부여한 균등물의 완전한 범위를 참조하여 결정되어야 한다. 본 명세서에 기재된 분야에서 추가의 개발이 발생하고 개시된 시스템 및 방법이 이러한 추가의 실시예로 통합되는 것으로 기대되고 의도된다. 요약하면, 본 발명은 변화 및 변형이 가능하고 하기 특허청구범위에 의해서만 제한되는 것으로 이해되어야 한다.

특허청구범위에 사용된 모든 용어는 그 반대에 대한 명확한 표시가 본 명세서에 이루어지지 않는 한 당해 분야의 당업자가 이해하는 바대로 이의 광범위한 합당한 구성 및 이의 보통의 의미가 제공되는 것으로 의도된다. 특히, "하나", "이", "상기" 등과 같은 단수 관사의 사용은 청구항이 그 반대로의 명확한 제한을 언급하지 않은 한 하나 이상의 표시된 부재를 언급하는 것으로 이해되어야 한다. 청구항이 이의 균등물의 "하나" 또는 "제 1" 부재를 언급할 때, 이러한 청구항은 2개 이상의 이러한 부재를 필요로 하지도 배제하지도 않고 하나 이상의 이러한 부재의 통합을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

참조문헌

표

[표 1]

값은 평균±SE이다. db+식염수 그룹에 대해 ^*P<0.01. n=10/그룹. W = 주, 0주는 치료 전을 나타내고, 다른 숫자는 치료 후를 나타낸다. dm=db/m 마우스; db=db/db 마우스.

[표 2]

값은 평균±SE이다. db+식염수 그룹에 대해 ^*P<0.01. n=10/그룹. W = 주, 0주는 치료 전을 나타내고, 다른 숫자는 치료 후를 나타낸다. dm=db/m 마우스; db=db/db 마우스.

<110> HENRY FORD HEALTH SYSTEM <120> METHODS, SYSTEMS, AND COMPOSITIONS FOR PROMOTING RECOVERY OF PERIPHERAL NEUROPATHY <130> Rothwell 1.57(P) <150> 61/579,951 <151> 2011-12-23 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys 1 5 10 15 Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu 20 25 30 Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser 35 40 <210> 2 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <223> Ac at terminal end before SDK...sequence <400> 2 Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys 1 5 10 15 Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu 20 25 30 Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln Ala Gly Glu Ser 35 40 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Leu Lys Lys Thr Glu Thr 1 5 <210> 4 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Leu Lys Lys Thr Asn Thr 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr 1 5 <210> 6 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Leu Lys Lys Thr Asn Thr Gln 1 5 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 agaacatcat ccctgcatcc 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 cacattgggg gtaggaacac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gaagggaacc gagcctattc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 gctgaaatca gcaccgtgta 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 cagatccggg ctctagacag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 tccggaaatc gttcttcatc 20

Claims (11)

1. 피험체에서 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 치료 방법으로서,
   서열 번호 1, 서열 번호 3, 및/또는 서열 번호 4, 임의의 이러한 서열의 보존적 변이체, 또는 임의의 이러한 서열 또는 이의 보존적 변이체의 제조를 자극하는 자극 물질을 포함하는 치료 유효량의 조성물을 말초 신경병증의 회복의 증진의 치료를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 단계를
   포함하는, 피험체에서 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 치료 방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 신경병증은 상기 피험체에서 당뇨병과 관련된, 피험체에서 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 치료 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 당뇨병은 진성 당뇨병인, 피험체에서 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 치료 방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 서열 번호 1, 서열 번호 3, 및/또는 서열 번호 4, 상기 자극 물질 및/또는 이의 임의의 보존적 변이체를 포함하는 조성물의 약 1-100마이크로그램의 성분의 범위 내의 용량으로 상기 피험체에게 투여되는, 피험체에서 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 치료 방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 물질은 상기 조직에 대한 직접 투여에 의해 또는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 흡입, 경피 또는 경구 투여에 의해 상기 피험체에게 투여되는, 피험체에서 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 치료 방법.
6. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 전신으로 투여되는, 피험체에서 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 치료 방법.
7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 직접 투여되는, 피험체에서 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 치료 방법.
8. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은, 액제, 겔, 크림, 페이스트, 로션, 스프레이, 현탁제, 분산제, 고약(salve), 하이드로겔 또는 연고 제제의 형태인, 피험체에서 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 치료 방법.
9. 제 1항에 있어서, 임의의 상기 서열은 재조합 또는 합성 펩타이드를 포함하는, 피험체에서 말초 신경병증의 회복을 증진시키는 치료 방법.
10. 피험체에서 말초 신경병증을 치료하기 위한 약제로서,
    서열 번호 1, 서열 번호 3, 및/또는 서열 번호 4, 임의의 이러한 서열의 보존적 변이체, 또는 임의의 이러한 서열 또는 이의 보존적 변이체의 제조를 자극하는 자극 물질을 포함하는 약제.
11. 피험체에서 말초 신경병증을 치료하기 위한, 제 10항의 약제를 사용하는 방법.

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