KR100798545B1 - 죽상경화증의 치료 또는 예방을 위한 ｉｌ-18 저해물질의용도 - Google Patents
죽상경화증의 치료 또는 예방을 위한 ｉｌ-18 저해물질의용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 죽상경화증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
Description
도 1은 각각 산화된 지단백 단독, 또는 산화된 지단백과 IL-18 항체 혹은 IL18BP의 혼합물과 함께 배양된 사람 배꼽 정맥 내피세포의 생존 비율을 보여주는 히스토그램이다.
도 2는 대조군 대동맥과 비교하여, 죽상경화성 대동맥으로부터 유래된 단백질 추출물에 실시한 웨스턴 블랏을 보여준다. 상기 웨스턴 블랏에서, IL-18BP(hIL18BP), IL-18 수용체 α 아단위(hIL18Rα), IL-18(hIL18), 카스파제-1에 대한 항체를 이용하였다.
도 3은 죽상경화성 플라크 세포에서 IL-18과 IL-18BP mRNA에 대한 RT-PCR 분석의 결과를 보여주는 에티듐 브로마이드 염색된 아가로즈 겔을 도시한다.
도 4는 증후성 플라크와 무증후성 플라크에서 hα-액틴(대조군)과 비교하여 죽상경화성 플라크에서 IL-18BP와 IL-18에 대한 RT-PCR 결과를 도시한다.
도 5는 쥐에서 근육내 전기이전(electrotransfer)에 사용되는 발현 벡터의 유전자 지도를 도시한다.
도 6은 죽상경화성 대동맥에서 지질 염색 영역을 보여주는 히스토그램이다. 지질 침착의 정량적인 컴퓨터-보조된 이미지 분석. 데이터는 평균 ±SEM으로 표시 한다(빈 플라스미드, n=19; IL-18BP 플라스미드, n=14). 4중 별표는 P<0.0001을 나타낸다.
도 7은 대조군(빈 플라스미드)과 비교하여 IL-18BP-치료이후의 대동맥동 병변 영역을 보여주는 히스토그램이다. 병변 영역의 정량적인 컴퓨터-보조된 이미지 분석. 데이터는 평균 ±SEM으로 표시한다(빈 플라스미드, n=19; IL-18BP 플라스미드, n=14). 이중 별표는 P<0.01을 나타낸다.
도 8은 병변 염증 세포에 대한 IL-18BP 치료의 효과를 보여준다. 정량적인 컴퓨터-보조된 이미지 분석은 대조군(대식세포 염색, n=12; T 림프구 염색, n=15) 또는 IL-18BP 치료받은 생쥐(대식세포, n=13; T 림프구, n=12)의 대동맥동 병변에서 대식세포-파지티브 영역의 비율(검은색 막대) 및 ㎟당 침윤한 T 림프구 수(회색 막대)를 측정하는데 활용하였다. 데이터는 평균 ±SEM으로 표시한다. 삼중 별표는 P<0.005를 나타내고, 사중 별표는 P<0.0001을 나타낸다.
도 9는 병변 평활근 세포와 콜라겐 함량에 대한 IL-18BP 치료의 효과를 보여준다. 정량적인 컴퓨터-보조된 이미지 분석은 대조군(평활근 세포, n=6; 콜라겐, n=11) 또는 IL-18BP 치료받은 생쥐(평활근 세포, n=6; 콜라겐, n=13)의 대동맥동 병변에서 평활근 세포-파지티브 영역의 비율(검은색 막대) 및 콜라겐 축적(회색 막대)을 측정하는데 활용하였다. 데이터는 평균 ±SEM으로 표시한다. 단일 별표는 P<0.005를 나타내고, 이중 별표는 P<0.01을 나타낸다.
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죽상경화증이 가장 일반적이고 가장 중요한 혈관 질환이긴 하지만, 다수의 다른 혈관 질환이 확인되고 있다. 죽상경화증은 주로 대동맥 또는 중간-크기 동맥에 영향을 주고, 이의 병변은 지방 선조, 포브로리틱(fobrolytic) 플라크, 복합 병변으로 구성된다. 죽상경화증은 콜레스테롤과 같은 지질, 대식세포, T 림프구 또는 평활근 세포와 같은 세포 및 세포외 매트릭스의 점진적인 축적으로 특징지어지는 동맥벽의 만성적 염증 질환이다(1). 좀더 대규모의 축적은 죽종 또는 플라크라고 하는데, 이들은 칼슘을 함유하기도 한다. 지방 조직은 동맥벽을 침식하고 동맥의 탄력성을 감소시키고 혈류를 방해한다. 최종적으로, 플라크 침착물 주변에 응혈이 형성되고 이는 혈류를 추가적으로 방해하는데, 이로 인해 혈관의 완전한 폐색이 초래된다. 일반적으로, 죽상경화증은 HDL-콜레스테롤의 수준 감소를 비롯하여 LDL-콜레스테롤의 수준 증가, Lp(a) 피브리노겐, 인자 VII와 연관한다. 위험 인자에는 연령 증가, 남성, 흡연, 당뇨, 비만, 높은 혈액 콜레스테롤, 지방 함량이 높은 식사, 개인적 또는 가족성의 심장 질환이 포함된다. 이는 심근경색과 같은 장기 허혈의 주원인이다.
죽종은 동맥에서 가장 흔한 병변인데, 이는 혈전-색전증에 의해 더욱 악화될 수 있다. 죽종성 플라크는 동맥 내강을 좁히는데, 이는 저관류된 부위에서 허혈 및 때로는 조직의 위축을 초래한다. 심각한 결과에는 심근경색으로 인한 협심증, 허혈성 또는 비-허혈성 증상에 의한 심부전, 신동맥 협세(narrowing)에 의한 고혈압, 증가된 레닌 분비에 의한 생리적으로 반응하는 신장의 저관류가 포함된다.
가끔 죽상경화증과 동맥경화증은 별개의 병리 질환으로 분류되기도 하는데, 이런 경우에 죽상경화증은 특히 죽종에 의한 동맥의 경화(경화증) 또는 탄력성 상실을 의미하고, 반면 동맥경화증은 임의의 원인으로 인한 동맥의 경화 또는 탄력성 상실을 의미한다.
죽상경화증의 합병증 또는 결과에는 관상동맥 질환(관상동맥의 죽상경화증), 폐색에 의한 혈액 공급의 부족(허혈/협심증), 급성 MI(심근경색, 심장마비), 일시적인 뇌허혈 발작이나 뇌졸중 및 혈관, 근육 또는 장기에 대한 손상이 포함된다.
혈관의 비정상적 확장증인 영속적 동맥류는 죽상경화증의 일반적인 결과다. 죽상경화성의 비정상적 대동맥 동맥류는 주로 노인 환자에서 발생한다. 이는 후복막 공간에 파열을 초래할 수 있다. 죽상경화성 동맥류에서, 대동맥 중막 근육의 허혈 및 탄력성 섬유의 단편화를 초래하는 대식세포 효소의 방출에 주로 기인하는 탄력성 조직의 현저한 감소와 중막의 섬유증이 나타난다.
죽상경화증의 치료 또는 예방에 권고되는 처방에는 혈액 지방/콜레스테롤의 감소가 포함된다. 특히, LDL-콜레스테롤을 낮추는 요법이 광범위하게 활용되고 있다. 현재, HMG CoA 환원효소의 특이적인 저해물질인 스타틴이 가장 광범위하게 이 용되고 있다. 지방을 낮추는 다른 약물에는 콜레스티라민, 콜레스티폴, 니코틴산, 겜피브로질, 프로부콜, 로바스타틴 등이 포함된다.
다른 접근방법은 확립된 죽종성 병변에서 혈전 형성의 위험을 감소시키는 것이다. 응혈 형성의 위험을 감소시키기 위하여, 트롬복산 A2 매개된 혈소판 응집의 특이적인 저해물질 또는 항응혈제인 아스피린을 이용할 수 있다.
경피 "풍선 혈관확장술"은 끝에 풍선이 달린 카테터를 이용하여 플라크를 평평하게 하고 폐색된 부위에서 혈류를 증가시킨다. 이 기술은 심장 동맥을 개방하는데 사용되는 기술과 유사하긴 하지만, 신체내 다른 동맥에도 적용할 수 있다. 관상동맥 협착은 인근 대동맥으로 봉합된 복재 정맥의 단편으로, 또는 흉벽으로부터 내유동맥을 절개하고 심장의 전면에서 이의 원부를 대동맥에 문합시켜 우회한다.
침착물의 외과적 제거(동맥 내막 절제술)는 일부 경우에 바람직할 수 있다(예: 경동맥 내막 절제술).
하지만, 가장 바람직한 방법은 심장과 혈액 순환의 양호함을 향상시키는 주기적인 운동을 비롯하여 위험 인자를 지속적으로 치료 또는 조절하고, 예를 들면 저-지방, 저-콜레스테롤, 저-염 식이요법을 유지하고, 고혈압, 당뇨, 다른 질환의 치료와 조절, 체중 감소, 흡연 중단을 위한 의사의 처방을 따르는 것이다.
*염증 과정은 죽상 경화증의 여러 단계에 관여한다(1). 낮은 전단응력(shear stress), 변형된 지단백, 친-염증성 사이토킨을 비롯한 다양한 인자에 의 한 내피 활성화는 죽상경화증의 제 1 단계로 생각되며 염증 조절하에 위치한다(1). 최근 연구에서 혈관 세포와 염증 세포간 상호작용이 죽종형성에 중요하다는 것이 밝혀졌다. 특히, 정의된 항-염증 경로의 저해는 죽상경화증의 발생을 감소시켰다(1).
염증은 죽상경화성 플라크 파괴와 혈전증에 중요한 역할을 수행하고(2-5), 따라서 급성 허혈성 증상 및 이들과 관련된 사망의 발생 빈도에 영향을 준다(6). 실제로, 죽상경화증의 영향을 받는 심장, 뇌, 다른 장기의 경색을 비롯한 죽상경화증의 중증 임상적 증상은 파괴된 죽상경화성 플라크의 접촉면에 형성된 혈전증에 의한 혈관 내강 폐색에 주로 기인한다(3,4). 병리학적 연구에서, 취약한 또는 불안정한, 다시 말하면 파괴되는 경향이 있는 또는 파괴된 플라크는 파괴되지 않은 안정된 플라크와 비교하여 세포와 매트릭스의 조성이 현저하게 상이한 것으로 확인되었다(7). 취약한 플라크는 염증성 세포(대식세포와 T 림프구)에 풍부하게 존재하고 혈전형성성 지질 코어를 보유하고 세포외 매트릭스에서 가는 섬유 캡으로 특징지어진다(7).
친-염증성 사이토킨 IFN-
에 의해 매개되는 감소된 콜라겐 합성 및 대식세포-유래된 매트릭스 분해 금속성단백질분해효소(metalloproteinase)의 증가된 활성은 섬유 캡 세선화(thinnng)와 연약성을 담당한다. 연약한 섬유 캡의 파괴는 상당한 혈전형성성 지질 코어를 순환하는 혈액에 노출시켜 폐색성 혈전형성을 초래한다(1,7). 따라서, 임의의 죽상경화성 병변에서 염증성 세포의 밀도는 불안정성의 유효한 척도로 간주된다.
죽상경화증 환자의 임상적 예후는 병변의 크기에 부분적으로 의존한다(19,20). 현재는 병변의 크기보다는 특질(플라크 조성)이 허혈성 증상 발생의 좀더 유효한 전조로서 인식되고 있다. 실제로, 죽상경화증의 중증 임상적 증상(심장과 뇌의 경색)은 파괴된 죽상경화성 플라크의 접촉면에 형성된 혈전에 의한 혈관 내강 폐색에 주로 기인한다(19). 병리학적 연구에서, 취약한 또는 불안정한, 다시 말하면 파괴되는 경향이 있는 또는 파괴된 플라크는 염증 세포에 풍부하게 존재하고 평활근과 콜라겐 함량에서 상당한 감소를 보이는 것으로 밝혀졌다(20, 21). 게다가, 이런 플라크는 상당한 혈전형성성 지질 코어의 생성을 초래하는 아폽토시스형 세포 사멸에서 현저한 증가를 보인다(13, 22).
친-염증성 사이토킨은 염증에 참여한다. 사이토킨 인터루킨 18(IL-18)은 초기에는 인터페론(IFN-
) 유도 인자(8)로 알려졌었다. 이는 T-림프구 보조 1형 세포형(Th1) 반응의 발생에서 초기 신호다. IL-18은 IL-12, IL-2, 항원, 유사분열물질, 다른 인자와 함께 IFN-
의 생산을 유도하는 역할을 한다. 또한, IL-18은 GM-CSF와 IL-2의 생산을 향상시키고 항-CD3 유도된 T 세포 증식을 강화시키고 고유 킬러 세포의 Fas-매개된 죽임 능력을 증가시킨다. 성숙 IL-18은 IL-1β전환 효소(ICE, 카스파제-1)에 의해 전구물질로부터 만들어진다. IL-18 수용체는 리간드 결합에 동시-작동하는 적어도 2개의 성분으로 구성된다. IL-18에 대한 고-친화성과 저-친화성 결합위치가 뮤린 IL-12 자극된 T-세포에서 발견되었는데(9), 이는 다중 연쇄 수용체 복합체를 암시한다. 2개의 수용체 아단위가 지금까지 확인되었는 데, 이들 둘 모두 IL-1 수용체 군에 속한다(10). IL-18의 신호 전달에는 NF-κB의 활성화가 관여한다(11).
최근에, IL-18에 대하여 높은 친화성을 보이는 가용성 단백질이 사람 소변으로부터 분리되었고, 사람 유전자 및 사람과 생쥐의 cDNA가 클론되었다(12; WO99/09063). 상기 단백질은 IL-18 결합 단백질(IL-18BP)로 명명되었다.
IL18BP는 공지된 IL18 수용체중 한가지의 세포외 도메인이 아니고 분비되고 자연적으로 순환하는 단백질이다. 이는 새로운 분비 단백질 군에 속하는데, 여기에는 몇몇 폭스바이러스-인코드된 단백질이 포함된다(12). IL18BP는 비장에서 구조적으로 발현된다(12). 재조합 IL18BP와 소변 IL18BP는 높은 친화성으로 IL-18과 특이적으로 결합하고 IL-18의 생물학적 활성을 조절한다.
IL18BP 유전자는 사람 크로모좀 11q13에 위치하고, 막통 도메인을 코딩하는 엑손은 8.3kb 게놈 서열에서 발견되지 않았다. IL18BP의 4가지 접합 변이체 또는 동소체는 사람에서 발견되어 각각 IL18BP a, b, c, d로 명명되었는데, 이들은 동일한 N-말단을 공유하지만 C-말단에서는 상이하다(12).
mRNA 접합에 기인하고 다양한 cDNA 라이브러리에서 발견되는 IL-18BP의 4가지 사람 동소체와 2가지 생쥐 동소체는 발현시키고 정제하고 결합 및 IL-18 생물학적 활성의 중화를 평가하였다(23). 사람 IL-18BP 동소체 a(IL-18BPa)는 빠른 온-레이트, 느린 오프-레이트, 399 pM의 분리 계수(K(d))로 IL-18에 대하여 가장 높은 친화성을 보였다. IL-18BPc는 29개의 C-말단 아미노산을 제외하고 IL-18BPa의 Ig 도메인을 공유한다; IL-18BPc의 K(d)는 10배 낮다(2.94 nM). 그럼에도 불구하고, IL-18BPa와 IL-18BPc는 과몰량에서 IL-18을 >95% 중화시킨다. IL-18BPb와 IL-18BPd 동소체는 완전한 Ig 도메인이 결핍되고, IL-18과 결합하거나 이를 중화시키는 능력이 없다. 동일한 Ig 도메인을 보유하는 뮤린 IL-18BPc와 IL-18BPd 동소체 역시 과몰량에서 뮤린 IL-18을 >95% 중화시킨다. 하지만, 사람 IL-18BPa와 공통된 C-말단 모티프를 공유하는 뮤린 IL-18BPd 역시 사람 IL-18을 중화시킨다. 분자 모델링을 통하여, IL-18BP의 Ig 도메인에서 정전성과 소수성이 혼합된 상당히 큰 결합위치가 확인되었는데, 이런 결합위치는 리간드에 대한 이의 높은 친화성 결합을 설명할 수 있다(23).
본 발명의 요약
본 발명은 IL-18의 저해물질이 죽상경화증의 뮤린 모델에서 플라크 발생, 플라크 진행, 플라크 안정성에 유익한 효과를 보인다는 관찰 결과에 기초한다. IL-18의 저해물질은 흉부 대동맥에서 병변 형성을 예방할 뿐만 아니라, 이미 확립된 죽상경화성 플라크의 안정된 플라크로의 전환을 유도하였다.
따라서, 본 발명은 죽상경화증의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다. 이에 더하여, 본 발명은 죽상경화증을 치료 및/또는 예방하는 유전자 치료방식의 치료방법에 관한다.
본 발명은 급성 관상동맥 증상 환자에서 순환하는 IL-18의 수준 증가 및 뇌졸중의 원인이 되는 불안정한 경동맥 죽상경화증에서 IL-18 생산 증가와 관련된 관 찰 결과에 기초한다. 이에 더하여, IL-18BP를 인코드하는 발현 플라스미드 DNA의 생체내 전기이전이 흉부 대동맥에서 지방 선조(fatty stroke) 발생을 예방하고 확립된 죽상경화증 뮤린 모델의 대동맥동에서 이미 진전된 죽상경화성 플라크의 진행을 지연시키는 것으로 확인되었다. 좀더 중요하게는, IL-18BP 플라스미드를 이용한 트랜스펙션이 안정된 플라크 표현형을 유발하는 플라크 조성의 현저한 변화(대식세포, T 세포, 세포 사멸, 지질 함량의 감소 및 평활근과 콜라겐 함량의 증가)를 결과한다. 이들 결과는 플라크 발생/진행의 감소 및 플라크 안정성의 증진에서 IL-18 저해물질의 중요한 역할을 처음으로 입증한다.
따라서, 본 발명은 죽상경화증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
본 발명에서 "예방"은 특정 효과의 완전한 예방을 의미할 뿐만 아니라, 발병 이전이나 발병 초기에 이런 효과를 부분적으로 또는 실질적으로 예방, 약화, 감소, 소멸시키는 것을 의미한다.
본 발명에서 "치료"는 발병이후 병리학적 발생의 약화, 감소 또는 소멸을 비롯한 질환의 진행에 대한 임의의 유익한 효과를 의미한다.
본 발명에서 "IL-18 저해물질"은 IL18 생산을 약화, 감소, 또는 부분적으로, 실질적으로 혹은 완전히 예방하거나 차단하는 방식으로 IL1-8 생산을 조절하는 임의의 분자를 의미한다.
생산 저해물질은 IL-18의 합성, 처리 또는 성숙에 부정적인 영향을 주는 임의의 분자일 수 있다. 본 발명에 따른 이런 저해물질은 예로써 인터루킨 IL-18의 유전자 발현의 저해물질, IL-18 mRNA의 전사를 감소시키거나 예방하는 또는 상기 mRNA의 분해를 유발하는 안티센스 mRNA, 정확한 접힘을 손상시키는 단백질, IL-18의 성숙이나 분비를 부분적으로 또는 실질적으로 예방하는 단백질, 일단 합성된 IL-18을 분해시키는 프로테아제 등일 수 있다. 생산 저해물질은 예로써 IL-18의 성숙을 예방하는 카스파제-1 저해물질 또는 ICE 저해물질일 수도 있다.
IL-18 작용의 저해물질은 예로써 IL-18 길항제일 수 있다. 길항제는 리간드(예, 수용체)에 대한 IL-18 결합을 담당하는 IL-18이나 IL-18 결합위치를 부분적으로 또는 실질적으로 중화시킬 수 있을 정도로 충분한 친화성과 특이성으로 IL-18 분자 자체와 결합하거나 이를 격리시킬 있다. 길항제는 IL-18/수용체 결합 직후에 세포내에서 활성화되는 IL-18 신호 경로를 저해할 수도 있다.
IL-18 작용의 저해물질은 가용성 IL-18 수용체나 이를 모방하는 분자, IL-18 수용체를 차단하는 약물, 단클론항체와 같은 IL-18 또는 표적에 대한 IL-18의 결합을 예방하는 임의의 약물이나 분자일 수도 있는데, 이들은 IL-18에 의해 매개되는 세포내 또는 세포외 반응을 감소시키거나 또는 이의 유인을 예방한다.
죽상경화증은 동맥경화증 또는 동맥의 경화라고도 한다. 본 발명에서, 죽상경화증에는 죽상경화증으로 분류되는 동맥의 모든 질환 또는 병리 상태가 포함되는데, 여기서 지방질 물질은 혈관 벽에 침착되어 혈전형성으로 인한 파괴 또는 침식 및 혈류의 좁혀짐과 손상을 초래한다.
본 발명에서, 죽상경화증에는 죽종에 기인한 동맥의 경화나 탄력성 상실(죽상경화증) 및 임의의 다른 원인에 기인한 동맥의 경화나 탄력성 상실(동맥경화증) 이 포함된다. "죽상경화증"의 합병증이나 결과 및 죽상경화증의 병리학적 상태는 상기 "배경기술"에서 자세히 설명하였다.
죽상경화증의 진행에는 죽상경화성 플라크의 형성 및 좀더 불안정한 형태로 이들의 발달이 포함된다. 따라서, 본 발명은 죽상경화증의 진행을 감소 또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
죽상경화증 플라크에 형성된 혈전에 의한 혈관 폐색은 죽상경화증의 가장 해로운 결과인 심장과 뇌의 경색에 결정적인 역할을 한다. 따라서, 본 발명은 죽상경화성 플라크의 혈전증을 치료 또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
플라크 안정성은 혈전증을 유발시키는 경향이 있는 유해한 또는 취약한 플라크로 죽상경화성 플라크의 발생에 영향을 준다. 따라서, 본 발명은 죽상경화성 플라크 불안정성의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
불안정한 플라크는 파괴되는 경향이 있고, 플라크의 파괴는 혈전증을 초래할 수 있다. 따라서, 본 발명은 죽상경화성 플라크 침식 또는 파괴의 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
플라크 불안정성과 혈전증은 아폽토시스형 세포 사멸에 기인할 수 있는데, 이는 높은 응혈촉진 활성을 공여하고 색전 증상을 비롯하여 부식된 또는 파괴된 죽상경화성 플라크의 혈전증을 초래하는 결정적인 증상일 수 있다(13, 14). 산화된 지단백(oxLDL)은 배양중인 대식세포와 내피세포의 아폽토시스를 유발하는 것으로 밝혀졌다(15). 하기 실시예에 보인 바와 같이, IL-18 저해물질은 oxLDL에 의해 유도된 세포 사멸을 상당히 감소시킬 수 있다.
본 발명에서는 혈액에서 IL-18 수준이 병원에 재입원하지 않은 환자와 비교하여, 재발성 증상, 예를 들면 죽음, 재발성 허혈, 맥관재생, 죽상경화증의 진행 또는 심장마비로 인한 재-입원으로 고생하는 심장마비 환자에서 현저하게 증가한다는 것을 확인하였다. IL-18 수준에서 이런 증가는 생존한 환자에 비하여 사망한 환자에서 특히 현저하였다. 혈액 순환에서 상승된 IL-18 수준은 비-허혈성 환자와 허혈성 환자 모두에서 관찰되었다.
따라서, 본 발명은 심장마비 재발성 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다. 재발성 증상은 죽음, 재발성 허혈, 맥관재생, 죽상경화증의 진행 또는 심장마비로 인한 재-입원과 같은 심장마비이후 임의의 증상일 수 있다.
본 발명의 적절한 구체예에서, 심장마비는 허혈성, 다시 말하면 심근 허혈에 기인한다.
본 발명의 다른 적절한 구체예에서, 심장마비는 전신 고혈압, 판막성 심질환, 또는 울혈성 심부전으로 이어지는 폐 질환과 같은 비-허혈성이다.
본 발명의 적절한 구체예에서, IL-18 저해물질은 ICE-저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 임의 한가지에 대한 항체, IL-18 수용체 신호 경로의 저해물질, IL-18과 경합하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항제, IL-18 결합단백질, 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능유도체, 활성 단편 또는 동일한 활 성을 보유하는 이들의 순환 치환된 유도체에서 선택된다.
본원에서 "뮤테인"은 IL-18BP의 유사체 혹은 바이러스성 IL-18BP의 유사체를 말하는데, 여기서 고유 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 아미노산 잔기중 적어도 하나는 상이한 아미노산 잔기로 치환되거나 결실되거나 또는 1개이상의 아미노산 잔기가 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 고유 서열에 부가되는데, 이때 야생형 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP과 비교하였을 때 생성된 산물의 능력에 큰 변화가 없다. 이와 같은 뮤테인은 공지된 합성 방법이나 특정부위-돌연변이유발 기술, 또는 임의의 다른 공지된 적절한 기술을 활용하여 만들 수 있다.
임의의 이런 뮤테인은 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열을 가지기 때문에, IL-18BP와 실제 유사한 활성을 가진다. IL-18BP의 한 가지 활성은 IL-18에 결합하는 능력이다. 뮤테인이 IL-18에 대하여 실제적인 결합 활성을 보유하는 경우에, 이는 친화성 크로마토그래피와 같은 수단으로 IL-18의 정제에 사용할 수 있고, IL-18BP와 실제 동일한 활성을 가지는 것으로 간주할 수 있다. 따라서, 통상적인 실험방법으로 임의의 뮤테인이 IL-18BP와 실질적으로 동일한 활성을 가지는 지를 결정할 수 있는데, 상기 실험방법은 적절히 라벨된 IL-18과 뮤테인이 결합하는 지를 측정하는 간단한 샌드위치 경합 분석 단계, 예를 들면 방사능면역검사 또는 ELISA 분석에 이런 뮤테인을 적용하는 단계로 구성된다.
본 발명에 따라 사용할 수 있는 IL-18BP 폴리펩티드 혹은 바이러스성 IL-18BP의 뮤테인 또는 이를 인코드하는 핵산에는 본원에 제시된 내용에 따라 과도한 실험없이 당업자가 용이하게 수득할 수 있는 치환된 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 일단의 실질적으로 상응하는 서열이 포함된다
본 발명에 따른 뮤테인에 대한 적절한 변화는 "보존성" 치환이다. IL-18BP 폴리펩티드 혹은 단백질 또는 바이러스성 IL-18BP의 보존성 아미노산 치환에는 분자의 생물학적 기능을 보존하면서 유사한 물리화학적 성질을 가지는 일군의 동질성 아미노산이 포함된다(16). 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 상기 정의된 서열에서 이루어질 수 있는데, 특히 30개 이하, 적절하게는 10개 이하의 아미노산이 부가 또는 결실되고, 기능적 구조에 중요한 아미노산(시스테인 잔기)이 결실 또는 치환되지 않는 경우에 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 가능하다. 이런 결실/부가에 의해 만들어지는 단백질 및 뮤테인은 본 발명의 목적에 포함된다.
바람직한 동질성 아미노산 군은 표 1에 제시한다. 좀더 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 2에 제시한다; 가장 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 3에 제시한다.
본 발명에 사용할 수 있는 IL-18BP 폴리펩티드이나 단백질의 뮤테인 또는 바이러스성 IL-18BP의 뮤테인을 수득하는데 활용할 수 있는 단백질에서 아미노산의 치환체를 만드는 방법의 예에는 임의의 공지된 방법이 포함되는데, 이들 방법은 가령 미국 특허 RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462(Mark et al); 5,116,943(Koths et al.,) 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,); 리신이 치환된 경우는 미국 특허 4,904,584(Shaw et al.,)에서 제시한다.
"융합단백질"은 체액에서 체류 시간이 연장되는 다른 단백질과 융합된 IL-18BP, 바이러스성 IL-18BP 또는 이들의 뮤테인으로 구성되는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, IL-18BP 또는 바이러스성 IL-18BP는 다른 단백질, 폴리펩티드 등, 예를 들면, 면역글로불린 또는 이의 단편과 융합될 수 있다.
본원에서 "기능성 유도체"에는 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 유도체, 이들의 뮤테인, 융합된 단백질이 포함되고, 이들은 당분야에 공지된 수단으로 잔기 또는 N- 혹은 C-말단기에 측쇄로 생성되는 작용기로부터 만들 수 있는데, 이들이 제약학적으로 수용가능하면, 다시 말하면 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 활성과 실질적으로 유사한 단백질의 활성을 파괴하지 않고 이를 함유하는 조성물에 독성 성질을 공여하지 않는다면 본 발명에 포함된다. 가령, 이들 유도체에는 폴리에틸렌 글리콜 측쇄가 포함되는데, 이는 항원성 부위를 차단하고 체액에서 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 체류를 연장시킬 수 있다. 다른 유도체에는 카르복실기의 지방족 에스테르, 암모니아 또는 일ㆍ이차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아마이드, 아실 성분(가령, 알카노일 또는 카르보사이클릭 아로일 작용기)으로 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노기의 N-아실 유도체 또는 아실 성분으로 형성된 유리 하이드록실기(가령, 세릴 또는 테레오닐 잔기)의 O-아실 유도체등이 포함된다.
본 발명에서 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP, 뮤테인, 융합단백질의 "활성 단편"에는 단독으로 또는 관련된 분자 혹은 이에 결합된 잔기(예, 당이나 인산염 잔기, 또는 단백질 분자나 당 잔기의 자체적인 응집체)와 조합된 단백질 분자의 폴리펩티드 사슬의 임의 단편이나 전구물질이 포함되는데, 단 이런 단편은 IL-18BP와 실질적으로 유사한 활성을 보유해야 한다.
본 발명의 다른 적절한 구체예에서, IL-18 저해물질은 IL-18 항체다. 항-IL-18 항체는 다클론이나 단클론, 키메라, 인화 또는 사람 항체다. 재조합 항체와 이의 단편은 생체내에서 IL-18에 대한 높은 친화성 결합 및 낮은 독성으로 특징지어진다. 본 발명에 사용할 수 있는 항체는 낮은 독성으로 병리 이상이나 이와 관련된 여러 증상을 효과적으로 저하 또는 완화시킬 만큼 충분한 기간동안 환자를 치료할 수 있는 능력으로 특징지어진다.
중화 항체는 IL-18 면역주사로 토끼, 염소 또는 생쥐와 같은 동물에서 생성시킨다. 면역화된 생쥐는 하이브리도마 제조를 위한 B 세포의 공급원을 제공하는데 특히 유용한데, 상기 하이브리도마는 배양하여 다량의 항-IL-18 단클론항체를 생산한다.
키메라 항체는 상이한 동물 종으로부터 유래된 2개이상의 분절 또는 일부분으로 특징지어지는 면역글로불린 분자다. 일반적으로, 키메라 항체의 가변 영역은 비-사람 포유동물 항체, 예를 들면 뮤린 단클론항체로부터 유래되고, 면역글로불린 불변 영역은 사람 면역글로불린 분자로부터 유래된다. 가급적, 양 영역 및 이들의 조합은 일반적으로 낮은 면역원성을 갖는다(24). 인화 항체는 유전공학 기술로 만들어진 면역글로불린 항체로, 여기서 뮤린 불변 영역은 사람 불변 영역으로 대체되고 뮤린 항원 결합 영역은 계속 잔존한다. 생성된 생쥐-사람 키메라 항체는 사람에서 낮은 면역원성 및 향상된 약동학을 보유한다(25).
따라서, 다른 적절한 구체예에서 IL-18 항체는 IL-18 인화 항체다. 바람직한 항-IL-18 인화 항체의 예는 유럽 특허 출원 EP 0 974 600에서 기술한다.
다른 적절한 구체예에서, IL-18 항체는 완전한 사람 항체다. 사람 항체를 생산하는 기술은 WO 00/76310, WO 99/53049, US 6,162,963 또는 AU5336100에서 자세히 기술한다. 바람직한 완전 사람 항체는 기능성 사람 Ig 좌위의 전체 또는 일부분을 포함하는 외래유전자도입 동물, 예를 들면 외래유전자도입 생쥐에서 만들어진 재조합 항체다.
본 발명의 좀더 적절한 구체예에서, IL-18 저해물질은 IL-18BP, 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 단편 또는 이들의 순환 치환된 유도체이다. 이들 동소체, 뮤테인, 융합단백질 또는 기능성 유도체는 IL-18BP의 생물학적 활성, 특히 IL-18에 대한 결합능력을 유지하고, IL-18BP와 적어도 유사한 활성을 보유한다. 이상적으로는, 이런 단백질은 변형되지 않은 IL-18BP와 비교하여 증가된 생물학적 활성을 갖는다. 적절한 활성 단편은 IL-18BP의 활성보다 좀더 높은 활성, 바람직하게는 좀더 높은 안정성 또는 좀더 낮은 독성이나 면역원성을 보유하거나, 대량으로 좀더 용이하게 생산 또는 정제된다.
IL-18BP의 서열 및 이의 접합변이체/동소체는 (23)뿐만 아니라, WO 99/09063 또는 (12)에서 구할 수 있다.
IL-18BP의 기능성 유도체는 중합체에 공액시켜 단백질의 특성, 예를 들면 안정성, 반감기, 생체이용효율, 사람 신체에 의한 내약성 또는 면역원성을 향상시킬 수 있다. 이를 달성하기 위하여, IL-18BP는 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 결합시킬 수 있다. PEG화(PEGlaytion)는 WO 92/13095에서 밝힌 방법으로 실시할 수 있다.
따라서, 본 발명의 적절한 구체예에서 IL-18BP는 PEG화된다.
본 발명의 다른 적절한 구체예에서, IL-18 저해물질은 IL-18 결합단백질의 전체 또는 일부분으로 구성되는 융합단백질로, 이는 면역글로불린의 전체 또는 일부분과 융합된다. 생성된 융합단백질은 IL-18BP의 생물학적 활성, 특히 IL-18에 대한 결합능력을 계속 유지한다. 융합은 직접적으로, 또는 짧게는 1 내지 3개 아미노산 잔기 혹은 이보다 긴, 예를 들면 13개 아미노산 잔기의 링커 펩티드를 통하여 달성할 수 있다. 상기 링커는 삼중항 IL-18BP 서열과 면역글로불린 서열간에 도입된 펩티드 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met) 또는 13개 아미노산 링커 서열 Glu-Phe- Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met이다. 생성된 융합단백질은 체액에서 체류 시간(반감기) 연장, 특이적 활성 증가, 발현 수준 증가 또는 융합단백질의 용이한 정제와 같은 향상된 특성을 보유한다.
적절한 구체예에서, IL-18BP는 Ig 분자의 불변 영역에 융합된다. 바람직하게는, 이는 예로써 사람 IgG1의 CH2와 CH3 도메인과 같은 중쇄 영역에 융합된다. IL-18BP 및 면역글로불린의 일부분으로 구성되는 특이적 융합단백질의 생산은 WP 99/09063(실시예 11)에서 기술한다. Ig 분자의 다른 동소체는 본 발명에 따른 융합단백질, 예를 들면 동소체 IgG2 혹은 IgG4, 또는 다른 Ig(IgM, IgA)의 생산에도 적합하다. 융합 단백질은 단량체 또는 다량체(헤테로- 혹은 동종-)일 수 있다.
인터페론은 바이러스 복제와 세포 증식에 대한 저해 효과로 알려져 있다. 가령, 인터페론-
는 면역과 염증 반응을 촉진하는데 중요한 역할을 한다. 인터페론 β(IFN-β, I형 인터페론)는 항-염증 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
또한, 본 발명은 죽상경화증의 치료를 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질과 인터페론의 병용에 관한다.
인터페론은 중합체에 공액시켜 단백질의 안정성을 향상시킬 수 있다. 인터페론-β와 폴리올 폴리에틸렌글리콜(PEG)간의 공액체는 WO 99/55377에서 기술한다.
본 발명의 다른 적절한 구체예에서, 인터페론은 인터페론-β, 좀더 바람직하게는 IFN-β1a이다.
IL-18 생산 및/또는 작용의 저해물질은 가급적 인터페론과 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용한다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, IL-18 저해물질은 TNF 길항물질과 병용한다. TNF 길항물질은 여러 방식으로 활성을 나타낸다. 먼저, 길항물질은 TNF 수용체 결합을 담당하는 TNF 에피토프를 부분적으로 또는 실질적으로 중화시키는데 충분한 친화성과 특이성으로 TNF 분자 자체와 결합하거나 또는 이를 격리시킬 수 있다(이후, "격리 길항물질"). 격리 길항물질은 예로써 TNF에 대한 항체일 수 있다.
대안으로, TNF 길항물질은 TNF 결합이후에 세포표면 수용체에 의해 활성화되는 TNF 신호 경로를 저해할 수 있다(이후, "신호 길항물질"). 이들 길항물질은 죽상경화증의 치료에서 단독으로 사용하거나 또는 IL-18 저해물질과 병용한다.
TNF 길항물질은 시험관내에서 영향을 쉽게 받는 세포주, 예를 들면 TNF가 증식과 면역글로불린 분비를 유발하는 사람 B 세포에서 고유 TNF의 활성에 대한 효과를 일반적인 후보 스크리닝으로 확인하고 평가한다. 상기 분석에는 다양하게 희석된, 예를 들면 분석에 이용된 TNF 몰농도의 0.1 내지 100배 몰농도의 후보 길항물질의 TNF 제형 및 TNF가 없거나 길항물질만 있는 대조군이 포함된다(26).
격리 길항물질은 본 발명에 사용하는데 적합한 TNF 길항물질이다. 격리 길항물질 중에서, 높은 친화성으로 TNF와 결합하고 낮은 면역원성을 보유하는 폴리펩티드가 바람직하다. 가용성 TNF 수용체 분자 및 TNF에 대한 중화 항체가 특히 바람직하다. 가령, 가용성 TNF-RI과 TNF-RII가 본 발명에 유용하다. 수용체의 세포외 도메인 또는 이들의 기능성 일부분을 포함하는 이들 수용체의 절두형은 본 발명에 특히 바람직한 길항물질이다. 절두된 가용성 TNF I형 수용체와 II형 수용체는 EP914431에 기술한다.
TNF 수용체의 절두형은 가용성이고 소변과 혈청에서 30kDa와 40kDa TNF 저해 결합단백질로 검출되는데, 이들은 각각 TBPI과 TBPII라고 한다(27). 본 발명에서 TNF 길항물질 및/또는 인터페론과 IL-18 저해물질은 동시, 순차적 또는 개별적 사용이 바람직하다.
본 발명에서, TBPI과 TBPII는 IL-18 저해물질과 병용하는데 적합한 TNF 길항물질이다. 수용체 분자의 유도체, 단편, 일부분, 생물학적 활성 단편은 본 발명에 사용할 수 있는 수용체 분자와 기능적으로 유사하다. 수용체 분자의 이런 생물학적 활성 등가물 또는 유도체는 폴리펩티드의 일부분 또는 수용체 분자를 인코드하는 서열의 일부분을 의미하는데, 이는 막-결합된 TNF 수용체를 저해 또는 차단할 정도의 친화력으로 TNF와 결합할 수 있다.
다른 적절한 구체예에서, 사람 가용성 TNF-RI(TBPI)는 본 발명에 따라 사용되는 TNF 길항물질이다. 고유와 재조합 가용성 TNF 수용체 분자 및 이들의 생산 방법은 유럽 특허 EP308 378; EP 398 327; EP 433 900에서 기술한다.
IL-18 저해물질은 TNF 저해물질과 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용할 수 있다. 가급적, IL-18 항체 또는 항혈청 및 TNF 저해활성을 보유하는 가용성 TNF 수용체의 조합을 사용한다.
본 발명의 다른 적절한 구체예에서, 약물은 COX-저해물질, 바람직하게는 COX-2 저해물질을 추가로 함유한다. COX 저해물질은 당분야에 공지되어 있다. 특이적인 COX-2 저해물질은 WO 01/00229에서 제시한다.
현재, 트롬복산, 특히 트롬복산 A2의 저해물질은 죽상경화증의 치료에 광범위하게 사용되고 있다. 따라서, 본 발명의 다른 적절한 구체예에서, 약물은 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용되는 트롬복산 저해물질, 특히 트롬복산 A2의 저해물질을 추가로 함유한다.
죽상경화증의 원인중 한가지는 혈액에서 높은 농도의 지질인 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 다른 적절한 구체예에서, 약물은 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용되는 지질 저하제를 추가로 함유한다. 당분야에 공지된 임의의 지질 저하제, 예를 들면 콜레스티라민, 콜레스티폴, 니코틴산, 겜피브로질, 프로부콜 등을 본 발명에 이용할 수 있다. 특히, HMG CoA 환원효소 저해물질, 바람직하게는 스타틴이 적합하다. 다수의 스타틴, 예를 들면 심바스타틴 또는 로바스타틴은 당분야에 공지되어있다.
죽상경화증을 좀더 효과적으로 예방 및/또는 치료하기 위하여, IL-18 저해물질과 함께 저-지방, 저-콜레스테롤 및/또는 저-염 식이요법을 병행한다.
본 발명의 적절한 구체예에서, IL-18 저해물질은 대략 0.0001 내지 10 ㎎/체중㎏, 바람직하게는 대략 0.01 내지 5 ㎎/체중㎏, 좀더 바람직하게는 대략 0.1 내지 3 ㎎/체중㎏, 가장 바람직하게는 대략 1 내지 2 ㎎/체중㎏ 함량으로 사용한다. 다른 적절한 구체예에서, IL-18 저해물질은 대략 0.1 내지 1000 ㎍/체중㎏, 바람직하게는 대략 1 내지 100 ㎍/체중㎏, 좀더 바람직하게는 대략 10 내지 50 ㎍/체중㎏ 함량으로 사용한다.
또한, 본 발명은 죽상경화증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 코딩 서열로 구성되는 발현 벡터의 용도에 관한다. 따라서, 상기 질환을 치료 및/또는 예방하는데 유전자 치료법을 활용한다. 가급적, IL-18 저해물질은 in situ 발현시켜, 상기 질환의 영향을 받는 조직 또는 세포에서 IL-18을 효과적으로 직접 차단한다.
하기 실시예에서 상세하게 설명한 바와 같이, IL-18BP의 효율적인 발현은 IL-18BP 코딩 서열로 구성되는 발현 벡터의 전기이전(electrotransfer)이후에 뮤린 모델에서 관찰할 수 있었다.
따라서, 적절한 구체예에서 발현 벡터는 근육내 전기이전법으로 투여한다.
정상 상태에서는 IL-18 저해물질의 발현이 중단되는 또는 충분한 함량의 저해물질을 발현하지 못하는 세포에서 IL-18 저해물질의 내생적 생산을 유도 및/또는 강화하기 위한 벡터의 용도 역시 본 발명에 포함된다. 상기 벡터는 IL-18 저해물질을 발현하도록 소요의 세포에서 작동하는 조절 서열을 포함한다. 이런 조절 서열은 프로모터 또는 인헨서일 수 있다. 이후, 조절 서열은 동종 재조합으로 게놈의 정확한 좌위에 도입할 수 있는데, 여기서 이런 조절 서열은 발현을 유도 혹은 강화시켜야 하는 유전자에 동작가능하도록 연결된다. 이런 기술은 "내생적 유전자 활성화(EGA)"라 한다(WO 91/09955).
당업자가 인지하는 바와 같이 동일 기술을 활용하여, 다시 말하면 네거티브 조절 요소(예, 억제 인자)를 IL-18의 유전자 좌위에 도입하여 IL-18 발현을 차단하고, 따라서 IL-18 발현을 하향-조절 또는 예방하는 것이 가능하다. 당업자가 인지하는 바와 같이 IL-18 발현의 이런 하향-조절 또는 억제는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 IL-18 저해물질의 이용과 동일한 효과를 갖는다.
또한, 본 발명은 죽상경화증의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18의 저해물질을 생산하도록 유전자 조작된 세포의 용도에 관한다.
또한, 본 발명은 죽상경화증의 예방 및/또는 치료에 특히 유용한 제약학적 조성물에 관하는데, 이는 치료요법적 효과량의 IL-18 저해물질 및 치료요법적 효과량의 인터페론으로 구성된다. IL-18의 저해물질로서 상기 조성물은 카스파제-1 저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 임의 한가지에 대한 항체, IL-18 신호 경로의 저해물질, IL-18과 경합하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18 길항물질 및 IL-18 결합단백질, 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 단편 또는 동일 활성을 보유하는 이들의 순환 치환된 유도체를 함유할 수 있다.
전술한 IL-18BP, 이의 동소체, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 단편 또는 순환 치환된 유도체는 제약학적 조성물에 적합한 활성 성분이다.
제약학적 조성물에 포함되는 인터페론은 IFN-β이다.
다른 적절한 구체예에서, 제약학적 조성물은 치료요법적 효과량의 IL-18 저해물질, 선택적으로 인터페론, TNF 길항물질로 구성된다. TNF 길항물질은 TNF 활성을 중화시키는 항체 또는 절두된 가용성 TNF 수용체 단편(즉, TBPI과 TPBII)일 수 있다. 본 발명에 따른 제약학적 조성물은 하나 또는 복수의 COX 저해물질, 바람직하게는 COX-2 저해물질을 추가로 함유할 수 있다.
"제약학적으로 수용가능한"은 활성 성분의 생물학적 효능을 방해하지 않고 투여된 숙주에 독성을 보이지 않는 임의의 담체를 의미한다. 가령, 장관외 투여에서 활성 단백질은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민, 링거액과 같은 운반체에 녹인 주사용 단위 약형 형태로 만들 수 있다.
*본 발명에 따른 제약학적 조성물의 활성 성분은 다양한 방법으로 개체에 투여할 수 있다. 투여 경로에는 피내, 경피(예, 서방 제형), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구, 경막외, 표면, 비강내 경로가 포함된다. 치료요법적으로 유효한 임의의 투여 경로, 예를 들면 상피나 내피 조직을 통한 흡수 또는 활성 성분을 인코드하는 DNA 분자를 환자에 투여하고(예, 벡터를 통하여) 상기 DNA 분자가 생체내에서 활성 성분을 발현 및 분비하는 유전자 요법을 활용할 수 있다. 이에 더하여, 본 발명에 따른 단백질은 제약학적으로 수용가능한 계면활성제, 부형제, 담체, 희석제, 운반체와 같은 다른 생물학적 활성 성분과 함께 투여할 수 있다.
장관외(예, 정맥내, 피하, 근육내) 투여에서, 활성 단백질은 제약학적으로 수용가능한 장관외 운반체(예, 물, 식염수, 덱스트로스 용액) 및 등장성(예, 만니톨) 또는 화학적 안정성(예, 방부제와 완충제)을 유지시키는 첨가제와 혼합된 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말 형태로 만들 수 있다. 상기 제형은 통상의 기술로 멸균한다.
본 발명에 따른 활성 단백질의 생체이용효율은 사람 체내에서 분자의 반감기를 증가시키는 공액 과정으로, 예를 들면 상기 분자에 폴리에틸렌글리콜을 부착시켜 개선할 수 있다(PCT 특허 출원 WO 92/13095).
치료요법적 효과량의 활성 단백질은 길항물질의 유형, IL-18에 대한 길항물질의 친화성, 길항물질에 의한 임의 잔기의 세포독성, 투여 경로, 환자의 임상적 상태(내생적 IL-18 활성의 비-독성 수준의 유지 필요성 포함)를 비롯한 다양한 변수의 함수다.
"치료요법적 효과량"은 IL-18의 생물학적 활성을 저해하는 IL-18 저해물질 복용량이다. 개체에 투여된 단일 또는 다중 복용량은 IL-18 저해물질 약동학, 투여 경로, 환자 상태와 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증상의 정도, 병행 치료법, 치료 빈도, 소요 효과를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라지게 된다. 개체에서 IL-18의 저해를 측정하는 시험관내와 생체내 방법을 비롯하여, 기존 용량 범위의 조정은 당업자에게 공지된 것이다.
본 발명에 따라, IL-18 저해물질은 대략 0.0001 내지 10 ㎎/체중㎏, 바람직하게는 대략 0.01 내지 5 ㎎/체중㎏, 좀더 바람직하게는 대략 0.1 내지 3 ㎎/체중㎏, 가장 바람직하게는 대략 1 내지 2 ㎎/체중㎏ 함량으로 사용한다. 좀더 적절한 구체예에서, IL-18 저해물질은 대략 0.1 내지 1000 ㎍/체중㎏, 바람직하게는 대략 1 내지 100 ㎍/체중㎏, 좀더 바람직하게는 대략 10 내지 50 ㎍/체중㎏ 함량으로 사용한다.
본 발명에서 바람직한 투여 경로는 피하 경로를 통한 투여다. 본 발명에서 좀더 바람직한 투여 경로는 근육내 투여다.
다른 적절한 구체예에서, IL-18의 저해물질은 매일 또는 격일로 투여한다.
일일 복용량은 분할 분량으로 또는 소요 결과를 달성하는데 효과적인 지속 방출 형태로 제공한다. 2차 또는 후속 투여는 개체에 투여된 초기분량이나 이전 분량과 동일한, 이보다 적은 또는 이보다 많은 복용량으로 실시할 수 있다.
본 발명에 따른 IL-18 저해물질은 치료요법적 효과량의 다른 섭생이나 약물(예, 다중 약물 요법), 특히 인터페론 및/또는 TNF 길항물질 및/또는 COX 저해물질에 앞서, 동시에 또는 순차적으로 예방이나 치료 목적으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 죽상경화증을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 IL-18 저해물질의 저해 효과량을 죽상경화증 환자에 투여하는 것으로 구성된다.
또한, 본 발명은 죽상경화증을 치료 및/또는 예방하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 IL-18 저해물질의 코딩 서열로 구성되는 발현 벡터를 죽상경화증 환자에 투여하는 것으로 구성된다.
본 발명의 적절한 구체예에서, 발현 벡터는 전신적으로, 바람직하게는 근육내 주사로 투여한다.
또한, 본 발명은 심장마비에서 불량한 임상적 예후에 대한 진단 마커로서 IL-18의 용도에 관한다. 불량한 임상적 예후에는 첫 번째 심근경색이후 환자 상태의 악화, 예를 들면 재발성 증상 또는 죽음이 포함된다.
바람직하게는, IL-18은 첫 번째 심장마비이후 재발성 증상에 대한 진단 마커로 이용한다. 재발성 증상에는 죽음, 재발성 허혈, 맥관재생, 죽상경화증의 진행 또는 심장마비로 인한 재-입원이 포함되지만, 이들에 국한되지 않는다.
본 발명은 다음의 실시예를 참고하면 좀더 용이하게 이해할 수 있지만, 이들 실시예는 단지 설명하는 것으로 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.
실시예
재료와 방법
시료
경동맥 내막 절제술을 받은 36명의 환자로부터 41개의 사람 죽상경화성 플라크를 수집하였다. 대조군으로, 생검에서 또는 관상동맥 우회 수술동안 죽상경화증이 없는 2개의 경동맥과 3개의 내유동맥(2개는 최소 섬유근조직 농후화됨)을 수득하였다. 이들은 액체 질소에 신속하게 담그고 -80℃에 저장한다. 단백질과 RNA 추출에 사용되는 플라크는 신속하게 세척하고 액체 질소에 담그고 -80℃에 저장한다. 면역조직학적 연구를 위하여, 플라크는 2시간동안 새로 만든 4% 파라포름알데하이드에 넣고, 이후 30% 슈크로즈-PBS 용액에 옮기고 최적 절단 온도 조직 처리 배지(O.C.T. Compound, Miles Inc, Diagnostics Division)에서 액체 질소 스냅-동결하고 동결절편 박절(sectioning)을 위하여 -80℃에 저장한다. 조직학적 분석 및 면역조직화학적 연구를 위하여 각 시료에서 수개의 8- 내지 10-㎛ 절편을 수득한다.
환자 분류
IL-18/IL-18BP 발현과 플라크 불안정성의 징후간 잠재적 상호관계를 연구하기 위하여, 2000년 5월부터 8월까지 경동맥 내막 절제술을 받은 23명 환자(총 36명)로부터 전향적 맹검 방식의 임상 데이터를 얻었다. 현미경적 검사에서 플라크내 궤양의 존부는 내막 절제술을 실시한 수술의에 의해 체계적으로 보고되었다. 이는 플라크를 궤양화된 또는 비-궤양화된 플라크로 분류하는 것을 가능하게 하였다. 이에 더하여, 환자는 임상적 증상에 따라 2개의 군으로 분류하였다. 경동맥 협착과 관련된 뇌허혈발작의 임상적 증상을 보이는 환자는 증후성 군으로 분류한다. 내막 절제술은 이들 환자에서 임상적 증상의 발병으로부터 2-66일(17.6 ±5.3일)이후 실시한다. 경동맥 부위에서 뇌허혈 증상을 보이지 않는 환자는 무증후성 군으로 분류한다. 무증후성 경동맥 협착은 관상동맥 또는 말초 질환을 가진 환자의 전신적인 임상 검사에 기초하여 탐지하고, 이의 심각도는 숙련된 유자격의 초음파검사 전문가가 반복 Doppler 초음파검사법을 이용하여 측정한다. 무증후성 환자가 경동맥 협착 부위에서 허혈성 증상을 보이지는 않지만, 경동맥 내막 절제술은 이들 환자에도 유효하였다(Asymptomatic Carotid Atherosclerosis Study(ACAS))(28).
웨스턴
블랏
분석
단백질은 12개의 죽상경화성 플라크와 5개의 대조군 정상 동맥으로부터 추출한다. 동결된 시료는 액체 질소하에 분쇄한다. 분말은 얼음같이 차가운 세포용해 완충액[20mmol/ℓTris-HCl, pH 7.5, 5mmol/ℓEGTA, 150 mmol/ℓNaCl, 20 mmol/ℓ글리세로포스페이트, 10 mmol/ℓNaF, 1 mmol/ℓ소디움 오르토바나데이트, 1% Triton X-100, 0.1% Tween 20, 1 ㎍/㎖ 아프로티닌, 1 mmol/ℓPMSF, 0.5 mmol/ℓN-토실-L-페닐알라닌 클로로메틸 케톤(TPCK), 0.5 mmol/ℓ N(a)-p-토실-L-리신 클로로메틸 케톤(TLCK)]에 0.3 ㎖/10㎎ 습식 중량의 비율로 재부유시킨다. 추출물은 15분동안 얼음에서 배양하고 이후 원심분리(12,000g, 15분, 4℃)한다. 세정제-가용성 상층액 분취물은 존속시키고, 시료에서 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 분석법을 활용하여 균등화시킨다.
IL-18과 IL-18R에 대한 웨스턴 블랏 분석을 실시하기 위하여, 단백질 추출물은 5분동안 끓이고 7.5% 또는 15% SDS-폴리아크릴아마이드 겔에 적하시킨다. IL-18BP를 위해, 대장균(Serono Pharmaceutical Research Institute, Geneva)으로부터 정제된 rhIL-18은 제조업자의 프로토콜에 따라 1 ㎎/㎖ 수지에서 Affligel 15(Biorad)에 결합시킨다. 단백질 추출물(60 ㎍)은 500 ㎕ PBS 0.05% Tween으로 조정되는 20 ㎕ 수지와 함께 롤러에서 4℃로 하룻밤동안 배양한다. 비-특이적 결합을 제거하기 위하여, 수지는 원심분리하고 10 mM Tris pH 8, 140 mM NaCl, 0.5% Triton-X-100(Fluka), 0.5% 데옥시콜레이트; 50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 0.05% TX100(Fluka), 0.05% Nonidet P40(Fluka), 2mM CHAPS(Boehringer, Mannheim); 최종적으로 50 mM Tris pH 8로 세척한다. 이후, 수지는 원심분리하고 환원 조건하에 시료 완충액에 재부유시키고 5분동안 끓이고 최종적으로 10% SDS-폴리아크릴아마이드 NuPAGE 겔(Invitrogen)에 적하시킨다.
시료는 폴리아크릴아마이드 겔로부터 니트로셀룰로오스로 전기영동적으로 옮긴다. 니트로셀룰로오스 막은 5% 무-지방 분유를 함유하는 TBST[50 mmol/ℓ Tris-HCl(pH 7.5), 250 mmol/ℓNaCl, 0.1% Tween 식염수]에서 2시간동안 실온에서 포화시킨다. 이후, 막은 염소 항-사람 IL-18과 IL-18R(α-사슬)다클론 항체(1 ㎍/㎖)(R&D Systems), 생쥐 항-사람 IL-18BP 단클론 항체(Mab 657.27, 5 ㎍/㎖)(Corbz et al., 2000), 토끼 항-사람 카스파제-1 다클론 항체(1 ㎍/㎖)(A-19, Santa Cruz)와 함께 배양한다. Mab 657.27의 특이성은 1시간동안 5 ㎍/㎖로 Mab 657.27과 동시-배양된 200x 몰과량의 rhIL-18BP-6his(중국 햄스터 난세포로부터 정제됨, Serono Pharmaceutical Research Institute)를 이용한 경합으로 불순물이 없는 막에서 분석한다. HRP 공액된 상응하는 항체와 함께 배양한 이후, 화학형광 기질(ECL, Western blotting; Amersham Corp)을 제조업자의 지시에 따라 이용하여 파지티브 밴드를 확인하고, 밴드는 Hyperfilm ECL(Amersham Corp)에 노출시켜 가시화시킨다.
면역조직화학법
6개 죽상경화성 플라크로부터 유래된 동결 절편은 1:10 정상 말 혈청 또는 1:10 정상 염소 혈청과 함께 실온에서 30분동안 배양하고 PBS에서 1회 세척하고 이후 대식세포 확인을 위한 CD68에 대한 일차 생쥐 단클론 항체(DAKO-CD68, KP1) 또는 평활근 세포 확인을 위한 사람 평활근 α-액틴에 대한 일차 생쥐 단클론 항체(1A4, DAKO)와 함께 배양한다. 죽상경화성 플라크내에서 IL-18 또는 IL-18 수용체를 확인하기 위하여, 5 ㎍/㎖로 희석된 특이적인 염소 다클론 항체(R&D Systems)를 사용한다. IL-18 BP는 재조합 사람 IL-18BP 동소체 a에 대한 특이적인 단클론 항체(H20)(Corbaz et al., 2000)를 사용하여 탐지한다. PBS에서 세척한 이후, 슬라이드는 다음과 같은 이차 비오틴처리된 항체와 함께 배양한다: CD68, 평활근 α-액틴, IL-18BP에 대한 항체를 탐지하기 위한 1:200으로 희석된 비오틴처리된 말 항-생쥐 IgG(Vector Laboratories, Inc) 또는 항-IL-18과 항-IL-18 수용체 항체를 탐지하기 위한 1:200으로 희석된 비오틴처리된 말 항-염소 IgG(Vector). 면역염료는 아비딘-비오틴 HRP 가시화 시스템(Vectastain ABC kit PK-6100 Vector)으로 가시화시킨다. 네거티브 대조군을 위해, 인접 절편은 일차 항체 대신에 아이소타입-대합된 무관한 항체로 염색한다.
RNA 준비
전체 RNA는 Chomczynski와 Sacchi의 방법(29)에 따라 산 구아니듐 티오시아네이트 용액에 들어있는 29개의 죽상경화성 플라크로부터 페놀과 클로로포름으로 추출한다. 정제된 RNA는 물에 용해시키고, 농도는 260nm에서 흡수도로 측정한다. RNA 일체성은 1% 아가로즈 겔에서 전기영동으로 평가한다. cDNA는 제조업자의 프로토콜에 따라 Promega 역전사 시스템을 활용하여 1 ㎍ 전체 RNA로부터 합성한다.
사람
죽상경화성
플라크에서 사람 IL-18과 IL-18BP의 반-정량적 실시간
PCR
반-정량적 PCR 반응은 1U AmpliTaq DNA 중합효소(Perkin Elmer, Roche, U.S.A.), 2.5 mM dNTP(Amersham, U.S.A), 50 pmole 선행과 역행 PCR 프라이머의 존재하에 50㎕ 전체 부피로 실시한다. 반응물은 다음과 같은 조건하에 PTC-200 Peltier Effect Thermal Cycler(MJ Research, U.S.A)에 배양한다: 94℃에서 1분동안 변성, 55℃에서 1분동안 어닐링, 72℃에서 1분동안 신장. 선형상의 PCR 반응동안 PCR 산물의 함량을 비교하기 위하여, IL-18BP, IL-18, β-액틴은 각각 25회, 28회, 31회 사이클이후 분석한다. 밴드의 포화에 앞서 IL-18BP, IL-18, β-액틴에 대한 최적 사이클을 결정한다(각각 31, 28, 25회). PCR 프라이머는 다음과 같은 공개된 서열(AF110799, D49950, X00351)에 기초하여 설계하였다: IL-18, 역행 5'-GCGTCACTACACTCAGCTAA-3'; 선행 5'-GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3'; IL-18BP, 선행 5'-ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3'; 역행 5'-GCACGAAGATAGGAAGTCTG-3'; β-액틴, 역행 5'-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3'; 선행 5'-GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3'. 시료를 함유하는 게놈 DNA의 증폭을 배제하기 위하여, PCR 반응은 cDNA 주형의 부재하에 실시한다. PCR 산물(10㎕)은 1x TAE 완충액에서 전기영동된 1% 아가로즈 겔에서 분석한다. PCR 산물의 크기는 겔 염색이후 1Kb 라더(Gibco)로 비교하여 확인한다. 에티듐-브로마이드 염색된 밴드의 상대적 정량은 Kodak Digital Sciences 분석 소프트웨어를 이용하여 UV광하에 실시하고 하우스키핑 유전자(hβ-액틴)에 대한 표적 유전자(hIL-18BP, hIL-18)의 비율로 표시한다.
IL-18, IL-18BP, GADPH(하우스키핑-유전자)에 대한 SYBR Green 실시간 PCR 프라이머는 다음과 같은 공개된 서열(AF110799, D49950, NM002046)에 기초하여 Primer Express 소프트웨어(PE Biosystems)로 설계하였다: IL-18, 역행 5'-CAGCCGCTTTAGCAGCCA-3'; 선행 5'-CAAGGAATTGTCTCCCAGTGC-3'; IL-18BP, 역행 5'-AACCAGGCTTGAGCGTTCC-3'; 선행 5'-TCCCATGTCTCTGCTCATTTAGTC-3'; GADPH, 역행 5'-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3'; 선행 5'-CCACCCATGGCAAATTCC-3'; 인트론-GADPH, 역행 5'-CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3'; 선행 5'-CTGTGCTCCCACTCCTGATTTC-3'. 특이성 및 최적 프라이머 농도를 검사한다. 잠재적인 게놈 DNA 오염은 특정 인트론-GADPH 프라이머로 PCR 반응을 실시하여 배제시킨다. 비-특이적인 증폭의 부재는 3.5% 아가로즈 겔 전기영동으로 PCR 산물을 분석하여 확인한다. SYBR Green 실시간 PCR은 5 ㎕/웰 RT-산물(0.5 ng 전체 RNA), AmpErase Uracil N-Glycosylase(UNG)(0.5 unit/웰)과 25 ㎕/웰 SYBR Green PCR 마스터 혼합물(PE Biosystem, CA, USA), 20 ㎕ 프라이머(300 nM)로 실시한다. PCR은 ABI PRISM 7700 Detection System에서 50℃에서 20분동안(cDNA에 통합된 우라실을 제거하는 AmpErase UNG 배양을 위해), 95℃에서 10분동안(AmpliTaq Gold 활성화를 위해), 이후 95℃에서 15초와 60℃에서 1분동안 40회 사이클로 실시한다. 이렇게 증폭된 역전사된 cDNA 시료는 Ct(사이클 한계치)값을 측정한다. IL-18, IL-18BP, GADPH에 대한 단일 특이적 DNA 밴드는 겔 전기영동 분석법으로 관찰한다.
"SYBR Green PCR 마스터 혼합물"을 이용한 실시간 탐지의 원리는 이중-가닥 DNA에 대한 SYBR Green 염료의 결합에 의해 야기되는 형광 증가를 측정하는 PCR 산물의 직접 탐지에 기초한다.
통계학적 분석
데이터는 평균 ±SEM으로 표시한다. IL-18의 수준은 Mann-Whitney 검증을 이용하여 군간 비교한다. P 0.05는 통계학적으로 유의한 것으로 간주한다.
실시예 1: 산화된 지단백(oxLDL)에 의해 유도된 내피세포 사멸로부터 IL-18 저해물질에 의한 보호
배양된 사람 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC)는 IL-18 결합단백질 또는 항-IL-18 항체의 존부하에 16시간동안 oxLDL에 노출시킨다. 도 1에 도시한 바와 같이, oxLDL에 노출된 이후 83%의 HUVEC가 사멸하였다. IL-18BP 또는 항-IL-18 항체와의 동시-배양은 사멸로부터 거의 모든 세포를 보호하였다. IL-18BP를 이용하면 사멸은 전혀 관찰되지 않았다. 항-IL-18 항체를 이용하면 89%의 세포가 생존하였다.
이런 실험 결과는 죽상경화성 플라크내 아폽토시스에 기인한 세포 사멸에 대한 2가지 상이한 IL-18 저해물질의 보호 효과를 명확하게 보여준다.
실시예 2: 죽상경화성 플라크에서 IL-18 단백질과 이의 내생적 저해물질 IL-18 BP의 발현
웨스턴 블랏 분석은 12개의 경동맥 죽상경화성 동맥과 5개의 정상 대조군으로부터 유래된 단백질 추출물에 실시하였다. 활성 형태를 포함하여 IL-18 단백질은 죽상경화성 플라크에서 고도로 발현되는 반면, 정상 동맥에서는 발현이 거의 관찰되지 않았다(도 2). 레인 1 내지 4는 죽상경화성 플라크로부터 유래된 시료를 포함하고, 레인 5 내지 7은 정상 동맥으로부터 유래된 시료를 포함한다. 흥미롭게도, IL-18 활성 형태의 탐지는 IL-18 가공에 참여하는 카스파제-1의 발현과 상관하는 것으로 보인다(도 2, 4번 열). 또한, 정상 동맥에서 낮은 수준의 발현과 비교하여, IL-18 수용체 단백질(α사슬)의 현저한 발현이 모든 죽상경화성 플라크에서 탐지되었다(도 2, 2번 열). 이에 더하여, 발현의 수준이 상이하긴 하지만 대부분의 죽상경화성 플라크는 IL-18BP를 발현하였다(도 2, 1번 열).
실시예 3: 죽상경화성 플라크에서 IL-18 단백질과 이의 내생적 저해물질 IL-18 BP의 세포내 분포
*IL-18과 IL-18BP의 세포내 분포를 측정하기 위하여, 6개의 경동맥 죽상경화성 플라크에 면역조직화학적 연구를 실시하였다. 도 2에 도시한 바와 같이, IL-18은 대식세포에서 주로 발현되었는데, 이들 대식세포는 플라크에서 IL-18의 주 공급원일 가능성이 높다. 이들 부위에는 또한 CD3-파지티브 림프구가 풍부하게 존재하였다. 하지만, T 림프구는 IL-18 생산에 직접적으로 관여하지 않는 것으로 보였다. IL-18은 일부 혈관내막 평활근 세포 및 때로는 내피세포에서 발현되었다. 대조적으로, 발현이 모든 혈관에서 관찰되는 것은 아니지만 플라크 미세혈관과 내강 표면의 내피세포에서 IL-18BP의 현저한 발현이 탐지되었다. 또한, 일부 대식세포-풍부한 부위에서 상대적으로 낮고 좀더 이질적인 IL-18BP 발현이 주로 세포외에서 관찰되었다.
실시예 4: 죽상경화성 플라크에서 IL-18과 IL-18BP mRNA 전사체의 발현 및 플라크 불안정성에 대한 관계
사람 IL-18과 IL-18BP mRNA가 사람 경동맥 죽상경화성 플라크에서 발현되는 지를 확인하기 위하여, 6개의 죽상경화성 플라크에서 RT-PCR을 실시하였다(도 3). IL-18과 IL-18BP mRNA는 함량 측면에서 상이하긴 하지만, 모든 죽상경화성 플라크에서 탐지되었다. 따라서, IL-18과 IL-18BP mRNA 발현의 수준을 정확하게 정량하기 위하여, SYBR Green 실시간 PCR 방법으로 23개의 죽상경화성 플라크를 추가로 분석하였다(도 4). 상기 플라크는 임상적 병리학적 검사로 현미경적 궤양의 보유 여부에 따라 증후성(불안정한) 또는 무증후성(안정한) 플라크로 분류하였다. 환자의 임상적 특징은 표 4에 요약 제시한다. 경동맥 직경 감소의 비율(60%-95%) 및 연령, 당뇨, 고콜레스테롤혈증, 고혈압, 흡연을 비롯한 위험 인자는 두 군간에 차이가 없었다.
표 4
환자 특성
증후성 무증후성
환자(n=9) 환자1(n=14)
연령 66.9 ±4.0 70.2 ±3.9
성별 남성(8) 남성(9)
고혈압2 8 9
고콜레스테롤혈증3 4 8
당뇨 3 1
흡연(현재) 7 8
관상동맥 질환 5 4
1 내막 절제술로부터 2-66일 전에 일과성 또는 지속성 대뇌 허혈성 발작을 보인 환자.
2 항고혈압제 치료를 받은 임상적 고혈압 환자의 수.
3 지질 저하제 치료를 받은 임상적 고콜레스테롤혈증 환자의 수.
IL-18의 함량은 무증후성 죽상경화성 플라크에 비하여 증후성에서 상향조절되는 것으로 밝혀졌다(각각, 2.03 ±0.5 vs 0.67 ±0.17). 통계학적 분석에서 증후성 플라크에 관찰되는 IL-18 생산의 이런 증가는 고도로 유의하고(P<0.0074), 반면 증후성 플라크 vs 무증후성 플라크에서 관찰되는 증가된 함량의 IL-18BP은 그렇지 않다는 것이 확인되었다(각각, 4.64 ±0.98 vs 2.5 ±0.92)(도 4B). 다시 말하면, 증후성 군과 무증후성 군 모두 IL-18과 IL-18BP mRNA간 파지티브 상관관계를 보이긴 하지만, 두 군간에 기울기는 현저하게 상이하였다(증후성 군: 기울기 1.16[0.19-2.14], r2=0.36 vs 무증후성 군: 기울기 4.79[2.39-7.02], r2=0.76; p<0.05). 따라서, 증후성 군에서 IL-18BP 발현의 상대적 증가는 IL-18 발현의 증가를 보충하기에는 충분하지 않는 것으로 보인다. 게다가, 궤양의 존재가 플라크에서 불안정성의 특징으로 간주되기 때문에 플라크내 궤양 유무하의 플라크에서 추가적인 통계 분석을 실시하였는데, 궤양을 보이는 플라크에서 IL-18의 현저한 상향조절이 확인되었다(p<0.018)(도 4C).
이들 데이터는 죽상경화성 플라크에서 관찰되는 IL-18 발현의 증가가 플라크의 불안정성과 상관한다는 것을 보여준다.
실시예 5: IL-18BP는 생체내 질환 모델에서 죽상경화성 병변 발생과 안정성을 조절한다.
방법
환자 특성
혈장 시료는 발병후 7일이내에 급성 허혈성 관상동맥 증상(불안정한 협심증과 심근경색)을 보이는 환자로부터 얻었다. 불안정한 협심증은 심전도에서 허혈성 변화 또는 관상동맥 질환의 존재 및 전형적인 흉부 통증의 결합으로 정의한다. 심근경색은 순환 혈액에서 심근 효소(크레아틴 포스포키나제와 트로포닌 I)의 현저한 증가와 관련된 심전도의 전형적인 허혈성 변화에 기초하여 진단한다. 비-허혈성 환자를 동일 심장 내과에 등록시켰는데, 이들은 허혈성 징후를 전혀 보이지 않았다. 사람 IL-18의 혈장 수준은 상업적으로 가용한 키트(MBL, Japan)를 이용하여 측정한다.
뮤린
IL-18BP 발현 플라스미드의
생체내
근육내
전기이전
14주된 14마리의 수컷 C57BL/6 apoE KP 생쥐는 3주 간격으로 IL-18BP 발현 플라스미드 pcDNA3-IL18BP를 3회 주사한다. 대조군 생쥐(n=19)는 대조군 빈 플라스미드를 주사한다. 전술한 바와 같이 분리된 뮤린 IL-18BP 동소체 d cDNA(부속 번호 # Q9ZOM9)(23)는 시토메갈로바이러스 프로모터(Invitrogen)의 조절하에 포유동물 세포 발현벡터 pcDNA3의 EcoR1/Not1 위치에 서브클론한다. 334.yh 구조체는 도 5에 도시한다. 대조군 플라스미드는 이와 유사하지만 치료 cDNA가 결여된 구조체이다. IL-18BP 또는 대조군 발현 플라스미드(60 ㎍)는 전술한 바와 같이 마취된 생쥐의 양쪽 뇌 경골근에 주사한다. 간단히 말하면, 경피 전기 펄스(200 V/㎝의 8 스퀘어 파동 전기 펄스, 2Hz에서 20 mesc 지속시간)는 다리 각 측면에 4.2 내지 5.3 ㎜ 떨어져 위치시킨 2개의 스테인레스 철판 전극을 이용한 PS-15 전기펄스기(Genetronics, France)로 전달한다.
Elisa
mIL
-18BP
평판은 r-mIL-18Pd-친화성 정제된 토끼 다클론 항체(5 ㎍/웰)로 하룻밤동안 피복한다. 가용성 mIL-18BP는 대장균 r-mIL-18BP(Peprotec)에 대한 비오틴처리된 토끼 다클론 항체(0.3 ㎍/㎖) 및 이후 엑스트라비딘 페록시다제(1/1000)(Sigma)를 이용하여 탐지한다. 포획된 토끼 다클론 항체는 웨스턴 블랏으로 검사하여 mIL-18BP 특이성을 확인한다. HEK 293 세포에 의해 만들어진 재조합 mIL-18BPd는 기준으로 이용한다. ELISA의 민감도는 5 ng/㎖이었다.
생쥐의 분석
동결 절편(8 ㎛)은 대동맥동으로부터 얻어 Oil 레드를 이용한 지질 침착의 탐지, Sirius 레드를 이용한 콜라겐의 탐지 및 전술한 바와 같은 면역학적 분석에 이용한다(13). 절편은 특이적인 일차 항체: 항-생쥐 대식세포, 클론 MOMA2 (BioSource), 평활근 세포에 대한 포스파타제 알칼린-공액된 항-α액틴, 전술한 T-림프구(Dako)에 대한 항-CD3으로 염색한다(13). 세포 사멸의 탐지는 TUNEL 기술을 활용하여 실시한다(13). CD3 파지티브 세포는 맹검 방식으로 현미경적으로 계산한다. 대동맥동에서 죽상경화성 플라크 및 대식세포, 평활근 세포, 콜라겐 또는 TUNEL에 대하여 파지티브 염색된 부위는 전술한 바와 같은 컴퓨터-보조된 이미지 정량(NS15000, Microvision)으로 측정한다(13). 비-면역성 아이소타입-대합된 면역글로불린 염색으로 면역염색의 특이성을 평가한다. TUNEL의 특이성은 말단 데옥시뉴클레오티드 전달효소의 생략(omission)으로 평가한다. 좌 쇄골밑동맥부터 신동맥에 이르는 흉부 대동맥은 10% 완충된 포르말린으로 고정시키고 지질 침착을 위하여 Oil 레드로 염색시킨다. 이후, 이들은 세로로 개방하고, 지질 침착의 비율은 컴퓨터-보조된 이미지 정량(NS15000, Microvision)으로 계산한다.
결과
본 연구에서는 IL-18/IL-18BP 조절이 죽종형성 및 플라크 안정성에 중요한 역할을 한다는 가설을 검증하였다. 급성 관상동맥 증상 환자(30명의 남성, 18명의 여성, 평균 연령 66.2 ±1.8세, 이중 14명은 불안정한 협심증을 보였고 34명은 심근경색을 보였다) 및 동일 심장 내과에 등록된 비-허혈성 대조군 환자(10명의 남성, 3명의 여성, 평균 연령 60.0 ±5.2세)의 혈장 수준을 측정하였다. IL-18의 혈장 수준은 대조군에 비하여 급성 관상동맥 환자에서 현저하게 상승하고(각각, 146.9 ±17.1 vs 73.0 ±12.2 pg/㎖, p<0.05), 반면 IL-18BP의 순환 수준은 약간 증가하였다(각각, 20.1 ±2.7 vs 7.5 ±2.5 ng/㎖, p=0.06). 이에 더하여, 질환의 심각도와 관련된 IL-18 수준은 중증도의 허혈성 심장 기능장애와 폐부종의 임상적 징후를 보이는 환자에서 최대값이 관찰된다는 점에서, 질환의 심각도와 상관하였다(224.03 ±39.1 pg/㎖, 대조군과 비교하여 P<0.001). 뇌졸중 환자로부터 유래된 죽상경화성 플라크에서 IL-18이 상승한다는 기존의 관찰 결과와 함께 급성 관상동맥 질환 환자로부터 얻은 이들 결과는 죽상경화 과정에서 IL-18/IL-18BP 조절의 잠재적으로 중요한 역할을 암시한다.
따라서, 자발적으로 사람-유사 죽상경화성 병변이 발생하는 apoE 녹아웃(KO) 생쥐를 이용하여 이런 가설을 검증하였다. 14주된 14마리 수컷 생쥐는 뮤린 IL-18BPd를 인코딩하는 발현 플라스미드 DNA의 생체내 근육내 전기이동을 통하여 IL-18BP을 보충하고 반면, 동일 연령의 19마리 대조군은 빈 플라스미드를 투여하였다. 플라스미드 전기이전은 3주 단위로 반복하고, 생쥐는 9주간의 치료이후 23주시점에서 죽였다. 빈 플라스미드를 주사한 apoE KO 생쥐에서 뮤린 IL-18BP의 혈장 수준은 탐지 한계(5 ng/㎖)보다 낮았다. 하지만, IL-18BP 플라스미드의 단일 주사는 혈액에서 높은 수준의 IL-18BP를 결과하는데, 주사 2일후 최대값(323.5 ±100.9 ng/㎖)이 관찰되었고 2주후에는 127.4 ±35.4 ng/㎖이었다. IL-18BP 또는 빈 플라스미드로 9주동안 치료한 이후, 전체 콜레스테롤(각각, 489.4 ±34.6 vs 480.8 ±36.3 ㎎/㎗)과 고-밀도 지단백 혈청 수준(각각, 52.3 ±9.4 vs 48.8 ±5.1 ㎎/㎗)은 두 군간에 차이가 없었다. 동물 체중에서 대조군과 비교하여 작지만 의미있는 증가가 IL-18BP 치료받은 군에서 관찰되었다(각각, 31.8 ±0.9 vs 28.6 ±0.8 g, p<0.05).
죽상경화증에 대한 IL-18BP 보충의 결과는 2가지 상이한 부위: 하행 흉부 대동맥과 대동맥동에서 검사하였다. 흉부 대동맥은 지방 선조 발생(죽종형성)에서 IL-18BP의 역할을 확인하기 위하여 선택하였는데, 그 이유는 흉부 죽상경화성 병변이 IL-18BP 트랜스펙션이 시작되는 14주시점에서 거의 부재하기 때문이다. 14주시점에서 죽상경화성 병변이 이미 존재하는 대동맥동에서는 플라크 안정성의 중요한 결정요인인 진전된 플라크의 진행과 조성을 검사하였다. apoE KO 생쥐의 IL-18BP-치료는 죽상경화성 병변 발생과 진행에 상당한 영향을 주었다. 흉부 대동맥의 검사에서는 빈 플라스미드에 비하여 IL-18BP 플라스미드로 치료한 생쥐에서 현저한 지질 침착 감소가 확인되었다(도 6). 정량적 컴퓨터-보조된 이미지 분석은 죽상경화성 병변의 크기에서 69% 감소(P<0.0001)를 보이는데, 이는 죽종형성에서 IL-18의 결정적인 역할을 시사한다(도 6). 이에 덧붙여, 9주동안 IL-18BP 플라스미드 치료는 빈 플라스미드 치료에 비하여 대동맥동에서 이미 진전된 죽상경화성 플라크의 진행을 현저하게 제한하였다(플라크 크기에서 24% 감소, P=0.01)(도 7).
좀더 중요하게는, 플라크 불안정성의 주요 결정인자인 병변의 조성이 IL-18BP 치료에 상당한 영향을 받았다. IL-18BP 플라스미드로 치료한 생쥐의 죽상경화성 병변은 대식세포 침윤에서 50% 감소를 보이고(P<0.0001)(도 8) 67% 더 적은 T 림프구를 보유하고(P<0.005)(도 8) 평활근 세포 축적에서 2배 증가를 보였다(p<0.05)(도 9). 이에 더하여, 병변 세포내 조성에서 이와 같은 중요한 변화는 Sirius 레드 염색으로 측정하는 경우에 콜라겐 함량에서 85% 증가(P<0.0005) 및 전체 지질 함량에서 감소와 연관하였다.
따라서, IL-18BP 치료는 죽상경화성 병변에서 염증 과정을 상당히 약화시키고 안정된 죽상경화성 플라크로 특징지어지는 치유 과정을 유도하였다. 더 나아가, IL-18BP 치료받은 생쥐에서 병변의 염증 성분의 현저한 감소는 플라크내에서 세포사멸 발생 빈도의 실질적인 감소와 연관하고(IL-18BP 치료받은 생쥐에서 2.9 ±0.9% vs 대조군에서 10.5 ±3.6%, P<0.05), 따라서 비세포성 지질 코어의 확대와 혈전형성성(trombogenicity)을 제한하였다[Mallat, 1999].
결론:
이미-검증된 사람-유사 죽상경화증 생쥐 모델을 이용하여, 전술한 결론은 죽상경화성 플라크 발생, 진행, 안정성에서 IL-18과 IL-18BP 조절의 예상치 못한 결정적인 역할을 확인한다. IL-18BP 보충에 의한 IL-18 활성의 저해 역시 흉부 대동맥에서 초기 병변 형성을 예방하면서 대동맥동에서 이미 진행된 병변 조성에 영향을 주어 안정된 플라크 표현형으로의 전환을 유도하였다.
죽상경화증 환자의 임상적 예후는 병변의 크기에 부분적으로 의존한다. 현재는 병변의 크기보다는 특질(플라크 조성)이 허혈성 증상 발생의 좀더 유효한 전조로서 인식되고 있다. 실제로, 죽상경화증의 중증 임상적 증상(심장과 뇌의 경색)은 파괴된 죽상경화성 플라크의 접촉면에 형성된 혈전에 의한 혈관 내강 폐색에 주로 기인한다(19). 병리학적 연구에서, 취약한 또는 불안정한, 다시 말하면 파괴되는 경향이 있는 또는 파괴된 플라크는 염증 세포에 풍부하게 존재하고, 평활근과 콜라겐 함량에서 상당한 감소를 보이는 것으로 밝혀졌다(20, 21). 게다가, 이런 플라크는 상당한 혈전형성성 지질 코어의 생성을 초래하는 아폽토시스형 세포 사멸에서 현저한 증가를 보인다(13, 22). 이와 같은 증가된 플라크 불안정성의 모든 징후는 IL-18BP 치료받은 생쥐에서 현저하게 약화되었는데, 이는 IL-18 신호가 플라크 불안정성의 주요 결정요인임을 시사한다.
apoE KO 생쥐에서 얻은 결과의 사람 질환에 대한 관련성은 급성 관상동맥 증상 환자에서 순환 IL-18의 수준 증가 및 뇌졸중을 유발하는 불안정한 경동맥 죽상경화성 플라크에서 IL-18 생산 증가와 관련된 본 연자들의 발견 결과에 의해 뒷받침된다. 이들 발견 결과는 죽상경화성 플라크 발생을 예방 및 치료하고 플라크 합병증을 제한할 수 있는 신규한 치료요법적 도구로서 IL-18 활성의 저해물질을 증명한다.
실시예 6: IL-18의 증가된 수준은 심장마비 환자에서 재발성 증상과 연관한다.
IL-18의 수준은 환자의 혈청에서 IL-18 특이 항체를 이용한 ELISA로 측정하였다.
또한, 심장마비가 발생한 또는 발생하지 않은 56명의 허혈성 또는 비-허혈성 환자를 검사하였다.
IL-18의 수준은 사망한 환자에서 216.0 ±41.5 pg/㎖이고, 반면 생존한 환자에서 112.2 ±12.2 pg/㎖이었다(P=0.0018).
죽음, 재발성 허혈, 맥관재생, 죽상경화증의 진행 또는 심장마비로 인한 재-입원과 같은 임의의 재발성 증상이 발생한 환자에서, 다음의 IL-18 수준이 측정되었다: 165.8 ±23.8 vs 107.7 ±14.6(재발성 증상이 발생하지 않은 환자)(P=0.03).
이들 결과는 재발성 증상이나 죽음과 같은 불량한 임상적 예후를 보였던 환자에서 IL-18 수준이 현저하게 상승한다는 것을 확인한다.
심장마비가 발생한 또는 발생하지 않은 16명의 비-허혈성 환자의 혈액 시료에서 IL-18 수준을 측정하였다. IL-18 수준은 사망한 환자에서 199.0 ±34.8 pg/㎖이고, 반면 생존한 환자에서 95.3 ±20.4 pg/㎖이었다(P=0.09).
임의의 재발성 증상 환자: 146.6 ±34.4 pg/㎖ vs 재발성 증상이 발생하지 않은 환자: 95.4 ±23.9 pg/㎖(p=0.03). 환자의 적은 인원수로 인해 IL-18 수준에서 차이가 통계학적으로 유의한 수준에 이르지는 못했지만, IL-18 수준이 증가하는 경향은 분명하게 관찰되었다.
허혈성 환자에서, IL-18 수준은 사망한 환자에서 214.2 ±45.9 pg/㎖이고, 반면 생존한 환자에서 118.4 ±12.8 pg/㎖이었다(P=0.007).
IL-18은 임의의 재발성 증상을 보인 환자에서 162.8 ±24.7 pg/㎖이고, 반면 임의의 재발성 증상을 보이지 않은 환자에서 116.2 ±16.0 pg/㎖이었다.
재발성 증상이나 죽음과 같은 불량한 임상적 예후를 보였던 환자에서 IL-18 수준이 현저하게 상승한다는 것을 확인한다.
Claims (4)
- 심부전의 나쁜 임상적 예후의 진단학적 표식(marker)으로 IL-18을 활성 성분으로 사용하는 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 나쁜 임상적 예후는 재발이 되는 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
- 최초 심부전 발생 이후 재발의 진단학적 표식(marker)으로 IL-18을 활성 성분으로 사용하는 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 재발은 사망, 재발성 허혈, 재관류술, 죽상경화증 진행 또는 심부전후 재입원이 되는 것을 특징으로 하는 진단용 조성물.
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