MD707Z - Metodă de identificare a secvenţelor polimorfe 4a/4b ale genei sintetazei endoteliale a oxidului nitric - Google Patents
Metodă de identificare a secvenţelor polimorfe 4a/4b ale genei sintetazei endoteliale a oxidului nitric Download PDFInfo
- Publication number
- MD707Z MD707Z MDS20130005A MDS20130005A MD707Z MD 707 Z MD707 Z MD 707Z MD S20130005 A MDS20130005 A MD S20130005A MD S20130005 A MDS20130005 A MD S20130005A MD 707 Z MD707 Z MD 707Z
- Authority
- MD
- Moldova
- Prior art keywords
- temperature
- nos3
- concentration
- dna
- primers
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 29
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract description 16
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 title abstract description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 title abstract description 3
- 101001128156 Homo sapiens Nanos homolog 3 Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 101001124309 Homo sapiens Nitric oxide synthase, endothelial Proteins 0.000 claims abstract description 29
- 102100028452 Nitric oxide synthase, endothelial Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 9
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 claims abstract description 7
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims abstract description 6
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108010075520 Nitric Oxide Synthase Type III Proteins 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 4
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 10
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 9
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 102000008052 Nitric Oxide Synthase Type III Human genes 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 101150031207 NOS3 gene Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 2
- 208000004476 Acute Coronary Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108091092919 Minisatellite Proteins 0.000 description 1
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 1
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000003467 diminishing effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 206010042772 syncope Diseases 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Invenţia se referă la genetica medicală moleculară, şi anume la o metodă de identificare a secvenţelor polimorfe 4a/4b ale genei sintetazei endoteliale a oxidului nitric.Esenţa metodei constă în aceea că se colectează proba integrală de sânge, se extrage ADN cu hidroxid de amoniu 0,7 M, se menţine la temperatura camerei timp de 5 min şi se incubează într-un termostat la temperatura de 100ºC timp de 30 min cu agitare continuă, apoi ADN extras se amplifică cu utilizarea primerilor NOS3 sens: 5´-GCCCTATGGTAGTAGTGCCTTT-3´ şi NOS3 antisens: 5´- CCTCTTAGTGCTGTGGTCA-3´, totodată se efectuează denaturarea iniţială la temperatura de 94°C timp de 3 min, apoi se efectuează 30 de cicluri cu denaturarea la temperatura de 94°C timp de 1 min, la temperatura de 54°C timp de 30 s, la temperatura de 72°C timp de 30 s şi la temperatura de 72°C timp de 5 min, se separă fragmentele amplificate de ADN în gel de agaroză de 1,8%, se colorează cu o soluţie de bromură de etidiu de 0,5 µg/mL şi se identifică secvenţele polimorfe.
Description
Invenţia se referă la genetica medicală moleculară, şi anume la o metodă de identificare a secvenţelor polimorfe 4a/4b ale genei sintetazei endoteliale a oxidului nitric.
În condiţii fiziologice oxidul de azot (NO) acţionează în calitate de mediator al mai multor funcţii biologice, una dintre cele mai importante fiind adaptarea sistemului vascular la necesităţile metabolice intensificate după efortul fizic. Excesul de NO în condiţii patologice induce vasodilatarea periferică şi sincopă, iar insuficienţa oxidului nitric a fost asociată cu astfel de patologii ca hipertensiunea arterială, ateroscleroza şi cardiopatia ischemică. Este demonstrat că concentraţia de NO în sânge depinde de activitatea enzimei genei sintetazei endoteliale a oxidului nitric (eNOS), aceasta din urmă depinde de polimorfismul genetic ce o codează.
Elaborarea procedeelor inofensive, şi totodată eficiente, de diagnosticare şi pronosticare genetică a bolilor coronariene cu identificarea polimorfismului genei sintetazei endoteliale de oxid nitric (eNOS) este una dintre problemele actuale în medicina clinică modernă.
Este cunoscut un procedeu de diagnosticare genetică a polimorfismului în intronul 4 al genei care codează sintetaza endotelială a NO, prin reacţia de polimerizare în lanţ, unde ADN se extrage din sângele periferic al pacienţilor cu boli cardiovasculare. În intronul 4 al genei eNOS există polimorfismul 4a/4b, care conţine 4 sau 5 repetări de 27 pb (perechi de bază). Această substituţie facilitează potenţialul clivajului enzimei în acest site, diminuând funcţionalitatea genei eNOS.
Pentru amplificarea porţiunii de ADN, ce conţine secvenţa nucleotidică polimorfă eNOS-4a/4b au fost utilizaţi primerii sens (s) şi antisens (as) cu următoarele secvenţe:
1) NOS3 (s) 5 ́-AGGCCCTATGGTAGTAGTGCCTTTT -3 ́ ;
2) NOS3 (as) 5 ́-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAT-3 ́.
Amplificarea fragmentului ADN, ce conţine markerul polimorf minisatelit eNOS-4a/4b, s-a efectuat în 50 µL soluţie: Master Mix (echivalent Fermentas) (2×) - 25 µL, primer sens - 1 pM/µL - 5 µL, primer antisens - 1 pM/µL - 5 µL, ADN genomic - 5 ng/µL - 10 µL, H2O ultrapură - 5 µL.
Compoziţia soluţiei Master Mix este următoarea: soluţie pentru executarea PCR (reacţiei de polimerizare în lanţ) care conţine MgCl2 - în concentraţie de 2,0 mM - 4,0 µL; dezoxinucleozidtrifosfat-5 ́-trifosfat (dNTP) în concentraţie de 0,4 mM - 0,4 µL; Taq polimerază în concentraţie de 0,05 unităţi/µL - 2,0 µL, H2O ultrapură - 18,6 µL.
PCR s-a realizat cu ajutorul termociclerului Crocodil-III (Appligene S.A., Franţa) prin programul automat de amplificare cu regimul următor:
primul ciclu - 94°C/3 min, următoarele 35 cicluri - 94°C/1 min, 60°C/1 min, 72°C/1 min, ultimul ciclu - 72°C/6 min. Identificarea alelelor s-a executat după separarea fragmentelor ADN amplificate în gel de agaroză de 2% şi s-au colorat cu soluţie de bromură de etidiu (0,5 µg/mL).
Ampliconul alelei 4a a avut lungimea de 393 perechi de nucleotide (pn), iar cel al alelei 4b - de 420 pn [1].
Dezavantajele procedeului descris constau în faptul că este costisitor, totodată:
1) implică izolarea ADN prin utilizarea unor kituri de reactivi costisitori; 2) primerii recomandaţi formează un număr mare de dimeri în procesul de amplificare; 3) lungimea primerilor NOS3 este mare (25 pb); PCR se efectuează într-un volum de 50 µL de amestec, utilizând astfel o cantitate mare de reagenţi chimici, şi, de asemenea, de ADN izolat din sângele pacienţilor. Acelaşi program al metodei PCR în termociclu necesită o lungă perioadă de timp - 114 min. Pentru vizualizarea produselor PCR se foloseşte gelul de agaroză de 2%, ceea ce, de asemenea, prezintă un consum excesiv de reactivi, care pot fi periculoşi sănătăţii investigatorilor în cazul lipsei echipamentelor şi techicilor speciale de protecţie. Toate acestea necesită cheltuieli considerabile şi contribuie la tergivesarea analizelor şi stabilirea în termen a diagnosticului clinic.
Problema pe care o rezolvă prezenta invenţie constă în majorarea eficienţei metodei de identificare a secvenţelor polimorfe 4a/4b ale genei sintetazei endoteliale a oxidului nitric, precum şi în ieftinirea şi accelerarea ei.
Esenţa metodei constă în aceea că se colectează proba integrală de sânge, se extrage ADN cu hidroxid de amoniu 0,7 M, se menţine la temperatura camerei timp de 5 min şi se incubează într-un termostat la temperatura de 100ºC timp de 30 min cu agitare continuă, apoi ADN extras se amplifică cu utilizarea primerilor NOS3 sens: 5 ́-GCCCTATGGTAGTAGTGCCTTT-3 ́ şi NOS3 antisens: 5 ́- CCTCTTAGTGCTGTGGTCA-3 ́, totodată se efectuează denaturarea iniţială la temperatura de 94°C timp de 3 min, apoi se efectuează 30 de cicluri cu denaturarea la temperatura de 94°C timp de 1 min, la temperatura de 54°C timp de 30 s, la temperatura de 72°C timp de 30 s şi la temperatura de 72°C timp de 5 min, se separă fragmentele amplificate de ADN în gel de agaroză de 1,8%, se colorează cu o soluţie de bromură de etidiu de 0,5 µg/mL şi se identifică secvenţele polimorfe.
Modificarea primerilor a fost concepută în scopul reducerii costului şi creşterii eficienţei amplificării fragmentelor ADN. Modelarea pentru modificarea primerilor a fost efectuată cu ajutorul soft-ului Oligo Analyzer 3.1. La toate etapele de modelare au fost respectate legile clasice cunoscute de proiectare a primerilor.
Modificarea primerului NOS3 (s) a fost realizată într-o etapă prin deleţia nucleotidei AG din capătul 5 ́ şi primei nucleotide T din capătul 3':
NOS3 (s) 5 ́-AGGCCCTATGGTAGTAGTGCCTTTT -3 ́ NOS3_modif_s: 5 ́-GCCCTATGGTAGTAGTGCCTT-3 ́
Modificarea primerului NOS3 (as) a fost realizată în 2 etape. În scopul ameliorării topirii nucleotida T la capătul 5' a fost înlocuită cu nucleotida C. La a doua etapă prima nucleotidă T din capătul 3' a fost eliminată în scopul scurtării lungimii şi reducerii costului primerului.
NOS3 (as) 5 ́-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAT-3 ́ NOS3_modif_as: 5 ́- CCTCTTAGTGCTGTGGTCA-3 ́
Rezultatul invenţiei constă în ieftinirea metodei date prin utilizarea concentraţiilor mai mici ale componentelor reacţiei, precum şi în accelerarea acesteia prin reducerea ciclurilor de reacţie în termociclul pentru PCR, ceea ce o face mai eficientă.
Exemple de realizare a invenţiei
Exemplul 1
Pentru efectuarea metodei propuse s-au utilizat leucocitele din sângele periferic colectat de la 10 pacienţi cu cardiopatie ischemică. În total s-au efectuat câte 10 teste în 3 repetiţii pentru analiza eficienţei metodei propuse în comparaţie cu cea mai apropiată soluţie.
Prelevarea sângelui venos şi separarea leucocitelor din sângele periferic s-a realizat prin metoda standard.
Metoda propusă s-a realizat în felul următor: ADN-ul a fost extras din leucocitele sângelui integral eliberate prin fierbere cu hidroxid de amoniu (MD 3539).
Programul separării ADN: 10 µL de soluţie conţinând aproape 10 000 de leucocite s-au amestecat cu 100 µL de 0,7 М de soluţie de hidroxid de amoniu în eprubete de tip Eppendorf şi s-au menţinut la temperatura camerei timp de 5 min. Apoi eprubetele închise au fost incubate în termostat la temperatura de 100°C agitând continuu timp de 30 min. Concentraţia ADN-ului izolat s-a verificat utilizând spectrofotometrul.
ADN extras s-a amplificat prin metoda PCR cu utilizarea primerilor NOS3 sens (s) : 5 ́-GCCCTATGGTAGTAGTGCCTTT-3 ́ şi NOS3 antisens (as): 5 ́- CCTCTTAGTGCTGTGGTCA-3 ́.
Pentru realizarea reacţiei s-au utilizat reactivi ai companiei Fermentas Inc. S-au efectuat în paralel 2 experimente testate conform metodei propuse şi celei mai apropiate soluţii.
Amplificarea ADN-ului s-a efectuat într-un volum de soluţie de 25 µL.
Amestecul de PCR pentru amplificare contine, µL:
soluţie Master Mix - 12,5,
primer sens cu concentraţia de 0,75 pM/µL - 1,25,
primer antisens cu concentraţia de 0,75 pM/µL - 1,25,
ADN genomic cu concentraţia de 5 ng/µL - 5,
H2O ultrapură - 5 µL;
totodată compoziţia soluţiei Master Mix conţine, µL:
MgCl2 cu concentraţia de 2,0 mM - 2,0,
dNTP cu concentraţia de 0,4 mM- 0,2,
Taq polimerază cu concentraţia de 0,05 Unităţi/µl - 1,0,
H2O ultrapură - 9,3.
Reacţia PCR s-a realizat cu ajutorul termociclerului prin programul automat de amplificare cu regimul următor:
primul ciclu - 94°C/3 min, următoarele 30 cicluri - 94°C/1 min, 54°C/30 s, 72°C/30 s, ultimul ciclu - 72°C/5 min. Identificarea alelelor s-a executat după separarea fragmentelor ADN amplificate în gel de agaroză de 1,8% care se colorează cu o soluţie de bromură de etidiu (0,5 µg/mL).
La toţi 10 pacienţi ampliconul alelei 4a a avut lungimea de 393 pn, iar cel al alelei 4b - de 420 pn.
Paralel, pentru studii de comparaţie au fost efectuate cercetări în conformitate cu cea mai apropiată soluţie.
Eficienţa metodei de identificare a secvenţelor polimorfe 4a/4b ale genei sintetazei endoteliale a oxidului nitric a fost evaluată prin compararea numărului (%) de produse PCR pozitive cu cea mai apropiată soluţie (tab. 1).
Caracteristica comparativă a metodei conform invenţiei
şi metodei conform celei mai apropiate soluţii
Tabelul 1
Metoda, invenţia Metoda, cea mai apropiată soluţie PCR Master mix Volumul final 25 µL Volumul final 50 µL • Master Mix11 - 12,5 µL • primer sens NOS3_modif_s (în concentraţie de 0,75 pM/µL) - 1,25 µL • primer antisens NOS3_modif_as (în concentraţie de 0,75 pM / µL) - 1,25 µL • H2O ultrapură - 5 µL • ADN genomic (în concentraţie de 5 ng/ µL) - 5 µL • Master Mix12 - 25 µL • primer sens NOS3 (s) (în concentraţie de 1,0 pM/µL) - 5,0 µL • primer antisens NOS3 (as) (în concentraţie de 1 pM/µL) - 5,0 µL • H2O ultrapură - 5 µL • ADN genomic (în concentraţie de 5 ng/ µL) - 10 µL Regimul de amplificare • primul ciclu - 94°C/3 min • primul ciclu - 94°C/3 min • următoarele 30 cicluri - 94°C/1 min, 54°C/30 s, 72°C/30 s • următoarele 35 cicluri - 94°C/1 min, 60°C/1 min, 72°C/1 min • ultimul ciclu - 72°C/5 min • ultimul ciclu - 72°C/6 min Vizualizarea produselor PCR în gel de agaroză • identificarea alelelor s-a efectuat după separarea fragmentelor ADN amplificate în gel de agaroză de 1,8%, care s-au colorat cu o soluţie de bromură de etidiu (0,5 µg/mL) • identificarea alelelor s-a efectuat după separarea fragmentelor ADN amplificate în gel de agaroză de 2%, care s-au colorat cu o soluţie de bromură de etidiu (0,5 µg/mL) Ampliconul alelei 4a a avut lungimea de 393 pn, iar cel al alelei 4b - de 420 pn.
La aprecierea rezultatelor reacţiei, amplificarea pozitivă s-a notat cu punctajul 1, iar cea negativă - cu 0. Datele din tab. 2 demonstrează că rezultatele experimentului sunt absolut identice, prin urmare, metoda solicitată nu numai nu cedează metodei-prototip în eficienţă, dar este superioară în ceea ce priveşte economia financiară şi a timpului.
Tabelul 2
Analiza comparativă a rezultatelor amplificării genei de codare a sintetazei endoteliale
a oxidului nitric
Nr. amplifi-cării Rata de succes a reacţiei PCR, efectuată prin metoda propusă Rata de succes a reacţiei PCR, efectuată prin cea mai apropiată metodă Prezenţa produsului PCR Absenţa produsului PCR Prezenţa produsului PCR Absenţa produsului PCR I 1 0 1 0 II 1 0 1 0 III 1 0 1 0 IV 1 0 1 0 V 1 0 1 0 VI 1 0 1 0 VII 0 1 0 1 VIII 1 0 1 0 IX 1 0 1 0 X 1 0 1 0 Total 9 1 9 1
Exemplul 2
Pentru testarea primerilor perfecţionaţi în raport cu primerii cunocuţi conform cele mai apropiate soluţii s-a utilizat soft-ul Oligo Analyzer 3.1 şi baza internaţională de date genetice GenBank.
А. Comparaţia primerilor sens: NOS3 (s) 5 ́-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAT-3 ́şi NOS3_modif_s ́-GCCCTATGGTAGTAGTGCCTTT-3 ́.
Comparaţia parametrilor molecular-biologici ai primerilor s-a realizat utilizând datele genetice din baza internaţională GenBank prin metoda de analiză BLAST.
Rezultatele demonstrează identitatea ambilor primeri de 100% cu ADN genomic uman şi acoperire de 77% (primeri omologi cu secvenţa de ADN depozitat în baza de date sub numărul AL110203). Astfel, ambii primeri pot fi utilizaţi în reacţia PCR ca primeri sens.
Comparaţia parametrilor fizici ai ambilor primeri este prezentată în tab 3.
Tabelul 3
Parametrii/primerii NOS3 (s) NOS3_modif_s Lungimea primerului, bp 25 22 Temperatura de topire 59,6ºC 56,4ºC Mărimea coeficientului termodinamic al structurii stabile secundare -1,37ºC -0,22ºC Cantitatea de dimeri 13 12
Comparaţia parametrilor primerilor relevă lungimea mai scurtă a primerului NOS3_modif_s în raport cu NOS3 (s). Astfel, sinteza primerului perfecţionat cu lungimea mai scurtă cu 3 nucleotide prin metoda propusă permite o economie financiară. Un punct de topire mai jos comparativ cu originalul economiseşte cheltuielile de energie necesară în reacţie. Primerul perfecţionat are un număr mai mic de dimeri, precum şi structuri secundare instabile, reducând numărul de amplificări non-specifice în timpul PCR.
В. Comparaţia primerilor antisens: NOS3 (as) 5 ́-TCTCTTAGTGCTGTGGTCAT-3 ́ şi NOS3_modif_as: 5 ́- CCTCTTAGTGCTGTGGTCA-3 ́
Rezultatele demonstrează identitatea de 100% a ambilor primeri NOS3 (as) şi NOS3_modif_as cu ADN genomic uman, ce codifică intronul 4 al genei NOS3, şi acoperirea de 95...100% (primeri omologi cu secvenţa de ADN depozitată în baza de date sub numărul NOS3). Astfel, ambii primeri pot fi utilizaţi în reacţia PCR ca primeri antisens. În plus, primerul perfecţionat are afinitate cu 5% mai mare pentru intronul 4 al genei NOS3.
Comparaţia parametrilor fizici ai ambilor primeri este prezentată în tab 4.
Tabelul 4
Parametrii/primerii NOS3 (as) NOS3_modif_as Lungimea primerului, bp 20 19 Temperatura de topire 53,1ºC 54,0ºC Mărimea coeficientului termodinamic al structurii stabile secundare +1,44ºC +0,8ºC Cantitatea de dimeri 9 9
Comparaţia parametrilor primerilor relevă dimensiunea mai mare a primerului NOS3_modif_as în raport cu NOS3 (as). Astfel, sinteza primerului perfecţionat cu lungimea mai scurtă cu o nucleotidă permite o economie financiară. Primerul perfecţionat are structuri secundare mai instabile, ce reduce numărul de amplificări non-specifice în PCR.
С. Modelarea PCR cu utilizarea perechilor de primeri modificaţi NOS3_modif_s / NOS3_modif_as şi primerii cunosuţi NOS3 (s) / NOS3 (as).
Conform regulilor cunoscute pentru PCR, diferenţa dintre temperaturile de topire a primerilor sens-antisens trebuie să fie minimă. Astfel, primerii modificaţi satisfac cel mai bine această cerinţă. Perechea de primeri modificaţi necesită o temperatură de topire mai mică, economisind costurile energetice la încălzirea amplificatorului (tab. 5).
Considerând că dimensiunea produselor de amplificare presupuse va fi de 420 pb, în corespundere cu regulile generale de amplificare, timpul topirii şi elongării poate fi scurtat, ceea ce va reduce durata reacţiei.
Tabelul 5
Parametrii/primerii NOS3 (s) / NOS3 (as) NOS3_modif_s / NOS3_modif_as Diferenţa dintre temperaturile de topire a primerilor 6,5ºC (59,6ºC - 53,1ºC) 2,4ºC (56,4ºC - 54,0ºC) Temperatura de topire a primerilor 60°C 54°C Modelarea programului de amplificare PCR primul ciclu - 94°C/3 min, următoarele 35 cicluri - 94°C/1 min, 60°C/1 min, 72°C/1 min, ultimul ciclu - 72°C / 6 min. primul ciclu - 94°C/3 min, următoarele 30 cicluri - 94°C/1 min, 54°C/30 s, 72°C/30 s, ultimul ciclu - 72°C/5 min.
Astfel, metoda de identificare a secvenţelor polimorfe 4a/4b ale genei sintetazei endoteliale a oxidului nitric este mai eficientă, mai ieftină şi de o durată mai scurtă.
1. Caproş N., Istrati V., Popescu V., Butovscaia C., Popovici I. Polimorfismul genei sintetazei endoteliale de oxid nitric la pacienţii cu sindrom coronarian acut. Anale Ştiinţifice ale Universităţii de Stat de Medicină şi Farmacie "N.Testemiţanu". Probleme actuale în medicina internă. Zilele Universităţii 21-23 octombrie, ed. a X-a, Chişinău, 2009, vol. III, p. 57-62
Claims (1)
- Metodă de identificare a secvenţelor polimorfe 4a/4b ale genei sintetazei endoteliale a oxidului nitric, care constă în aceea că se colectează proba integrală de sânge, se extrage ADN cu hidroxid de amoniu 0,7 M, se menţine la temperatura camerei timp de 5 min şi se incubează într-un termostat la temperatura de 100ºC timp de 30 min cu agitare continuă, apoi ADN extras se amplifică cu utilizarea primerilor NOS3 sens: 5 ́-GCCCTATGGTAGTAGTGCCTTT-3 ́ şi NOS3 antisens: 5 ́- CCTCTTAGTGCTGTGGTCA-3 ́ într-un amestec ce conţine, în µL:soluţie Master Mix 12,5 primer sens în concentraţie de 0,75 pM/µL 1,25 primer antisens în concentraţie de 0,75 pM/µL 1,25 ADN genomic în concentraţie de 5 ng/µL 5 H2O ultrapură 5, totodată soluţia Master Mix conţine, în µL:MgCl2 în concentraţie de 2,0 mM 2,0 dNTP în concentraţie de 0,4 mM 0,2 Taq polimerază în concentraţie de 0,05 unităţi/µL 1,0 H2O ultrapură 9,3, totodată se efectuează denaturarea iniţială la temperatura de 94°C timp de 3 min, apoi se efectuează 30 de cicluri cu denaturarea la temperatura de 94°C timp de 1 min, la temperatura de 54°C timp de 30 s, la temperatura de 72°C timp de 30 s şi la temperatura de 72°C timp de 5 min, se separă fragmentele amplificate de ADN în gel de agaroză de 1,8%, se colorează cu o soluţie de bromură de etidiu de 0,5 µg/mL şi se identifică secvenţele polimorfe.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| MDS20130005A MD707Z (ro) | 2013-01-18 | 2013-01-18 | Metodă de identificare a secvenţelor polimorfe 4a/4b ale genei sintetazei endoteliale a oxidului nitric |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| MDS20130005A MD707Z (ro) | 2013-01-18 | 2013-01-18 | Metodă de identificare a secvenţelor polimorfe 4a/4b ale genei sintetazei endoteliale a oxidului nitric |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| MD707Y MD707Y (ro) | 2013-12-31 |
| MD707Z true MD707Z (ro) | 2014-07-31 |
Family
ID=49912590
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| MDS20130005A MD707Z (ro) | 2013-01-18 | 2013-01-18 | Metodă de identificare a secvenţelor polimorfe 4a/4b ale genei sintetazei endoteliale a oxidului nitric |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| MD (1) | MD707Z (ro) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2002110275A (ru) * | 2000-08-22 | 2004-03-27 | Дзе Брихэм Энд Уимен'З Хоспитал, Инк. (Us) | Диагностика и лечение сердечно-сосудистых состояний |
| EA007014B1 (ru) * | 2000-05-05 | 2006-06-30 | Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. | Применение il-18 в качестве диагностического маркера |
| RU2304775C2 (ru) * | 2005-07-27 | 2007-08-20 | Олег Сергеевич Глотов | Способ диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и диагностический набор для его осуществления |
| RU2322193C1 (ru) * | 2006-12-04 | 2008-04-20 | Федеральное государственное учреждение "Учебно-научный медицинский центр" Управления делами Президента Российской Федерации | Способ оценки генетического риска сердечно-сосудистых заболеваний у спортсменов |
| RU2007112316A (ru) * | 2007-04-03 | 2008-10-10 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт медицинской генетики Томского научногоцентра Сибирского отделени Российской академии медицинских наук (RU) | Способ генетической диагностики подверженности к сердечно-сосудистым заболеваниям |
| EA200970781A1 (ru) * | 2007-02-21 | 2010-04-30 | Декоуд Дженетикс Ехф | Варианты генетической предрасположенности, связанные с сердечно-сосудистыми заболеваниями |
| RU2010141594A (ru) * | 2010-10-11 | 2012-04-20 | Российская Федерация в лице Министерства образования и науки Российской Федерации (RU) | Способ генодиагностики сердечно-сосудистых заболеваний |
-
2013
- 2013-01-18 MD MDS20130005A patent/MD707Z/ro not_active IP Right Cessation
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA007014B1 (ru) * | 2000-05-05 | 2006-06-30 | Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. | Применение il-18 в качестве диагностического маркера |
| RU2002110275A (ru) * | 2000-08-22 | 2004-03-27 | Дзе Брихэм Энд Уимен'З Хоспитал, Инк. (Us) | Диагностика и лечение сердечно-сосудистых состояний |
| RU2304775C2 (ru) * | 2005-07-27 | 2007-08-20 | Олег Сергеевич Глотов | Способ диагностики сердечно-сосудистых заболеваний и диагностический набор для его осуществления |
| RU2322193C1 (ru) * | 2006-12-04 | 2008-04-20 | Федеральное государственное учреждение "Учебно-научный медицинский центр" Управления делами Президента Российской Федерации | Способ оценки генетического риска сердечно-сосудистых заболеваний у спортсменов |
| EA200970781A1 (ru) * | 2007-02-21 | 2010-04-30 | Декоуд Дженетикс Ехф | Варианты генетической предрасположенности, связанные с сердечно-сосудистыми заболеваниями |
| RU2007112316A (ru) * | 2007-04-03 | 2008-10-10 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт медицинской генетики Томского научногоцентра Сибирского отделени Российской академии медицинских наук (RU) | Способ генетической диагностики подверженности к сердечно-сосудистым заболеваниям |
| RU2376372C2 (ru) * | 2007-04-03 | 2009-12-20 | Государственное учреждение Научно-исследовательский институт медицинской генетики Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук | Способ генетической диагностики подверженности к сердечно-сосудистым заболеваниям |
| RU2010141594A (ru) * | 2010-10-11 | 2012-04-20 | Российская Федерация в лице Министерства образования и науки Российской Федерации (RU) | Способ генодиагностики сердечно-сосудистых заболеваний |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Caproş N., Istrati V., Popescu V., Butovscaia C., Popovici I. Polimorfismul genei sintetazei endoteliale de oxid nitric la pacienţii cu sindrom coronarian acut. Anale Ştiinţifice ale Universităţii de Stat de Medicină şi Farmacie "N.Testemiţanu". Probleme actuale în medicina internă. Zilele Universităţii 21-23 octombrie, ed. a X-a, Chişinău, 2009, vol. III, p. 57-62 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| MD707Y (ro) | 2013-12-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Old et al. | Fetal DNA analysis | |
| KR101550489B1 (ko) | 기준 차단 서열을 이용한 완전 ｃｏｌｄ－ｐｃｒ 풍부화 | |
| EP2825675B1 (en) | Measurement of nucleic acid variants using highly-multiplexed error-suppressed deep sequencing | |
| EP1468114B1 (en) | Late-pcr | |
| KR102245110B1 (ko) | 박테리아 오염을 검출하기 위한 방법 및 조성물 | |
| JP5637850B2 (ja) | 標的核酸配列の増幅方法、それを用いた変異の検出方法、および、それに用いる試薬 | |
| CA2677517A1 (en) | Nucleic acid-based tests for rhd typing, gender determination and nucleic acid quantification | |
| HK1220737A1 (zh) | 短端粒丰度的量度 | |
| CA2888720A1 (en) | Methods, compositions and devices for amplification of nucleic acids | |
| WO2011066467A2 (en) | Allelic ladder loci | |
| He et al. | Genotyping of human neutrophil antigens by polymerase chain reaction sequence-based typing | |
| KR20160106040A (ko) | ｃＭＥＴ 핵산의 멀티모달 분석을 위한 조성물 및 방법 | |
| WO2016165591A1 (zh) | 基于焦磷酸测序技术的mgmt基因启动子甲基化检测 | |
| JPWO2008066163A1 (ja) | Ｃｙｐ２ｃ９遺伝子増幅用プライマーセット、それを含むｃｙｐ２ｃ９遺伝子増幅用試薬およびその用途 | |
| MD707Z (ro) | Metodă de identificare a secvenţelor polimorfe 4a/4b ale genei sintetazei endoteliale a oxidului nitric | |
| Fakruddin et al. | Competitiveness of polymerase chain reaction to alternate amplification methods | |
| EP1942196B1 (en) | Late-PCR | |
| CN104789673B (zh) | rs1800818在检测新布尼亚病毒引起的发热伴血小板减少综合征中的应用 | |
| CN102605089B (zh) | 一种检测高原红细胞过度增多易感性的试剂盒 | |
| RU2455364C2 (ru) | Способ идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции | |
| JP7335871B2 (ja) | 短い核酸の多重検出 | |
| JP4111481B2 (ja) | 心筋梗塞の遺伝的要因を判定するための方法及びこれに使用されるオリゴヌクレオチド | |
| RU2804111C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров для определения метилирования промотора гена человека CCR5 в образах биологического материала, подвергшегося предварительной бисульфитной конверсии, методом пиросеквенирования | |
| Nischalke et al. | Rapid Determination of the Δ32 Deletion in the Human CC-Chemokine Receptor 5 (CCR5) Gene without DNA Extraction by LightCycler Real-Time Polymerase Chain Reaction | |
| WO2011068610A1 (en) | Methods for detecting risk of myelodysplastic syndrome by genotypic analysis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TK4Y | Erratum in official gazette with regard to short term patent |
Free format text: RECTIFICATION IN INID 72 |
|
| FG9Y | Short term patent issued | ||
| MK4Y | Short term patent expired |