RU2322193C1

RU2322193C1 - Способ оценки генетического риска сердечно-сосудистых заболеваний у спортсменов

Info

Publication number: RU2322193C1
Application number: RU2006142763/14A
Authority: RU
Inventors: Борис Алексеевич Сидоренко (RU); Борис Алексеевич Сидоренко; Дмитрий Александрович Затейщиков (RU); Дмитрий Александрович Затейщиков; Лариса Олеговна Минушкина (RU); Лариса Олеговна Минушкина; Марина Станиславовна Кочкина (RU); Марина Станиславовна Кочкина; Наталь Дмитриевна Селезнева (RU); Наталья Дмитриевна Селезнева; Ольга Сергеевна Чумакова (RU); Ольга Сергеевна Чумакова; Ольга Сергеевна Королева (RU); Ольга Сергеевна Королева; Ольга Юрьевна Асейчева (RU); Ольга Юрьевна Асейчева; к Виталий Кузьмич Решетн (RU); Виталий Кузьмич Решетняк; Петр Степанович Турзин (RU); Петр Степанович Турзин
Priority date: 2006-12-04
Filing date: 2006-12-04
Publication date: 2008-04-20

Abstract

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии и спортивной медицине. Способ позволяет повысить воспроизводимость, надежность и точность прогноза развития осложнений, обусловленных генетическими факторами. Проводят определение полиморфных маркеров генов-кандидатов, при этом выполняют генетическое исследование крови спортсмена, определяют предрасполагающие и защищающие аллели и генотипы полиморфных маркеров генов-кандидатов: для ишемической болезни сердца маркер Т174М гена AGT предрасполагающая аллель М и защищающая аллель Т, маркер A(-153)G гена AT2R1 предрасполагающие генотипы AG, GG и аллель G и защищающие генотип АА и аллель А, маркер А1298С гена MTHFR предрасполагающие генотип СС и аллель С и защищающая аллель А, маркер С825Т гена GNB3 предрасполагающий генотип СС, маркер Ala(-9) Val гена SOD2 предрасполагающие генотип АА и аллель А и защищающие генотип W и аллель V, маркер Т(-262)С гена CAT предрасполагающий генотип СС, маркер Cys311Ser гена PON2 предрасполагающий генотип Ser/Ser и защищающий генотип Cys/Ser, маркер I/D гена ApoB предрасполагающие генотип I/I и аллель I и защищающие генотипы ID и DD и аллель D; для гипертонической болезни маркер Ser447Ter гена LPL предрасполагающая аллель Ser и защищающая аллель Тег, маркер Рrо12Ala гена PPARG2 предрасполагающая аллель Ala и защищающие генотип Pro/Pro и аллель Pro, маркер А1298С гена MTHFR предрасполагающая аллель С и защищающие генотип АА и аллель А, маркер Т(9282) гена CAT предрасполагающий генотип ТС и защищающий генотип СС, маркер Lys198Asn гена END1 предрасполагающий генотип Lys/Lys; для гипертонического сердца маркер 4а/4b гена NOS3 предрасполагающие генотип 4b/4а и аллель 4а и защищающие генотип 4b/4b и аллель 4b, маркер А(-153)G гена AT2R1 предрасполагающие генотип AG и аллель G и защищающие генотип АА и аллель А, маркер А1298С гена MTHFR предрасполагающие генотип СС и аллель С и защищающая аллель А, маркер G7831A генаАСЕ предрасполагающие генотипы GA и АА и аллель А и защищающие генотип GG и аллель G и делают заключение о предрасположенности при количественном преобладании предрасполагающих генотипов и аллелей, а о генетической защите от развития патологии при равном значении предрасполагающих и защищающих генотипов и аллелей или количественном преобладании защищающих. 11 табл.

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике, и может быть использовано в кардиологии, спортивной медицине.

Медико-техническое решение (сущность) заключается в том, что определяют генотипы полиморфных маркеров генов АСЕ, AGT, AT2R1, АРОВ, LPL, EDN1, PON2, MTHFR, NOS3, SOD2, CAT, PPARG2, GNB3, рассчитывают относительный риск, ассоциированный с конкретным генотипом по табличным данным, выполняют оценку индивидуального риска развития сердечно-сосудистых заболеваний у спортсменов, генотип или аллель считают предрасполагающим при относительном риске больше 1,5 и защитным при относительном риске меньше 0,7.

Известны способы-аналоги предложенного изобретения. Так, для оценки риска инфаркта миокарда у молодых мужчин можно использовать полиморфный маркер I/D гена АСЕ. Показано, что носители аллеля D имеют более высокий риск инфаркта миокарда в молодом возрасте [1]. В опубликованном в 1992 г. исследовании было показано, что с помощью определения генотипа полиморфных маркеров Т174М и М235Т гена AGT можно оценивать риск развития артериальной гипертонии. В качестве одного из основных генов-кандидатов, ассоциированных с развитием спортивного сердца, рассматривается ген ангиотензиногена [2]. С большим индексом массы миокарда у спортсменов ассоциирован аллель 235Т этого гена [3].

Известен способ [4], выбранный в качестве прототипа. С помощью исследования полиморфизма гена АСЕ определяется предрасположенность к длительной физической работе. Этому способу присущи недостатки: использован только один полиморфный маркер одного гена кандидата. Определение полиморфизма гена-кандидата проводят из промывной жидкости ротовой полости. Выполнение данного способа у спортсменов с целью оценки риска сердечно-сосудистых заболеваний не позволяет по одному маркеру сделать заключение о предрасположенности к неблагоприятному воздействию интенсивных аэробных нагрузок на состояние сердечно-сосудистой системы. Кроме того, выделение ДНК из промывной жидкости ротовой полости снижает точность определения аллелей и генотипов полиморфных маркеров.

В предложенном изобретении решена задача повышения надежности, воспроизводимости и точности оценки индивидуального риска поражения сердечно-сосудистой системы.

Указанная задача решена тем, что по результатам наблюдений формируют таблицы генотипов полиморфных маркеров генов-кандидатов и определяют относительный риск развития патологии, выполняют генетическое исследование крови спортсмена, сопоставляют данные генотипов его генов-кандидатов с табличными показателями относительного риска, при относительном риске больше 1,5 делают заключение о предрасположенности, при относительном риске меньше 0,7 - о генетической защите от развития патологии.

Способ выполняют в следующей последовательности:

1. Формируют группу наблюдений

Для этого формируют группы здоровых и больных сердечно-сосудистыми заболеваниями. Группы набирают из спортсменов, закончивших спортивную карьеру. Для определения отношения шансов проводят сравнение частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов-кандидатов в группах здоровых и больных.

2. Формируют таблицу относительного риска

Расчет относительного риска проводят на популяционной выборке, сформированной по типу случай-контроль. В нашем исследовании было обследовано 118 бывших спортсменов, страдающих ИБС, и 229 здоровых лиц, сопоставимых по возрасту и полу и имеющих в анамнезе интенсивные аэробные нагрузки (спорт высоких достижений). По основным клиническим характеристикам группы достоверно не различались (таблица 1).

Таблица 1
Клиническая характеристика больных ИБС и контрольной группы
Клиническая характеристика	Бывшие спортсмены, страдающие ИБС, N=118	Контрольная группа (N=229)
Средний возраст, лет	56,89±11,83	56,85±0,73
Мужчины/женщины	44,4%/55,6%	52%/48%
Средний ИМТ, кг/м²	25,56±3,66	25,3±0,31
ИМТ>25 кг/м²	48,8%	44,4%
Гиперлипидемия (ОХС>5,2 ммоль/л)	51,2%	51,6%
Сахарный диабет, тип 2	6,6%	6,1%
Курение	24,2%	26,8%
Курение в анамнезе	12,9%	16,2%

В группах случай и контроль проводят сравнение частот аллелей и генотипов выбранных полиморфных маркеров генов-кандидатов. Сравнение частот проводят по критерию χ² Pearson, коррекцию Yates применяли для таблиц сопряженности с 1 степенью свободы (2×2). Относительный риск и доверительный интервал связи с заболеванием оценивали с помощью однофакторного регрессионного анализа с помощью статистического пакета программ SPSS 13.0.

Для оценка ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов с артериальной гипертонией было обследовано 211 здоровых лиц, занимавшихся интенсивными физическими нагрузками, и 202 бывших спортсмена, страдающих артериальной гипертонией. По основным клиническим характеристикам группы не различались (таблица 2).

Таблица 2
Клиническая характеристика больных АГ и контрольной группы
Показатель	Здоровые (n=211)	Больные сАГ (n=202)	p
Возраст, годы	59,7±0,78	60,9±0,88	нд
Пол (м/ж)	130/81	103/99	нд
Индекс Кетле, более 25 кг/м²	151 (73,7%)	148 (78,3%)	нд
Курение (n,%)	61 (28,9%)	40 (19,8%)	нд
Креатинин, мкмоль/л	82,4±3,90	83,2±3,49	нд
Уровень ОХ, ммоль/л	5,94±0,096	6,24±0,130	нд
Уровень ХС ЛНП, ммоль/л	4,06±0,111	4,17±0,133	нд
Уровень ХС ЛВП, ммоль/л	1,15±0,027	1,12±0,032	нд
Уровень ТГ, ммоль/л	2,30±0,138	2,55±0,125	нд

Различия частот аллелей и генотипов генов-кандидатов и относительный риск рассчитывают, как указано ранее.

Для оценки ассоциации полиморфных маркеров с гипертрофией миокарда обследуют группы больных с гипертрофией миокарда и без нее. Было обследовано 137 бывших спортсменов без ГЛЖ и 106 - с ГЛЖ. Группы были сопоставимы по основным характеристикам (таблица 3)

Таблица 3
Клиническая характеристика больных с ГЛЖ и контрольной группы
Показатель	Нет ГЛЖ n=137	Есть ГЛЖ n=106	P
Возраст, годы	53,41±0,92	52,77±1,0	нд
Пол (м/ж)	86/51	64/42	нд
Индекс Кетле, кг/м²	27,6±0,44	26,8±0,45	нд
Индекс Кетле, более 25 кг/м²	114(83,2%)	81 (76,4%)	нд
Курение	23(16,8%)	24 (22,6%)	нд
Сахарный диабет	27(19,7%)	11 (10,4%)	нд
Длительность АГ, годы	110,9±0	16,75±1,92	<0,001

Достоверность различий, относительный риск и доверительный интервал рассчитывают, как описано ранее.

Значения относительного риска для всех причинных генотипов приведены в таблицах 4-6.

Таблица 4
Риск ишемической болезни сердца, ассоциированный с генотипами и аллелями основных генов-кандидатов.
Генотип	Относительный риск [95% CI]
1	2
Полиморфный маркер Т174М гена AGT
Генотипы
ТТ
ТМ
ММ
Аллели
Т	0,43 [0,28-0,66]
М	2,32 [1.51-3,55]
Полиморфный маркер A(-153)G гена AT2R1
Генотипы
АА	0,13 [0,07-0,22]
AG	4,76 [2.76-8,13]
GG	2,83 [1,19-6,75]
Аллели
А	0,26 [0,17-0,39]
G	3,78 [2,53-5,67]
Полиморфный маркер А1298С гена MTHFR
Генотипы
АА
АС
СС	3,23 [1,81-5,76]
Аллели
А	0,61 [0,45-0,84]
С	1,62 [1,18-2,21]
Полиморфный маркер С825Т гена GNB3
Генотипы
СС	1,62 [1,07-2,45]
СТ
ТТ
Аллели
С
Т
Полиморфный маркер Ala(-9)Val гена SOD2
Генотипы
VV	0,24 [0,13-0,45]
VA
АА	2,30 [1,27-4,19]
Аллели
V	0,47 [0,33-0,48]
А	2,12 [1,49-3,02]
Полиморфный маркер T(-262)C гена CAT
Генотипы ТТ
TT
TC
СС	1,97 [1,10-3,52]
Аллели
Т
С
Полиморфный маркер Сys311Ser гена PON2
Генотипы
Cys/Cys
Cys/Ser	0,41 [0,26-0,64]
Ser/Ser	1,92 [1,23-3,01]
Аллели
Cys
Ser
Полиморфный маркер I/D гена АроВ
Генотипы
I/I	2,14 [1,12-4,08]
I/D	0,57 [0,30-1,09]
D/D	0,47 [[0,14-1,62]
Аллели
I	1,81 [1,09-3,00]
D	0,55 [0,33-0,92]

Таблица 5
Риск гипертонической болезни, ассоциированный с генотипами и аллелями основных генов-кандидатов
Генотип	Относительный риск [95% CI]
Полиморфный маркер Ser447Ter гена LPL
Генотипы
Ser/Ser
Ser/Ter
Ter/Ter
Аллели
Ser	1,51 [1,01-2,34]
Ter	0,66 [0,42-0,99]
Полиморфный маркер Рrо12Ala гена PPARG2
Генотипы
Pro/Pro	0,64 [0,41-0,98]
Pro/Ala
Ala/Ala
Аллели
Pro	0,64 [0,43-0,94]
Ala	1,87 [1,29-2,69]
Полиморфный маркер А1298С гена MTHFR
Генотипы
АА	0,61 [0,38-0,98]
АС
СС
Аллели
А	0,76 [0,58-0,99]
С	1,30 [1,02-1,78]
Полиморфный маркер Т(-262)С гена CAT
Генотипы
ТТ
TC	1,56 [1,01-2,48]
СС	0,51 [0,29-0,86]
Аллели
Т
С
Полиморфный маркер Lys198Asn гена END1
Генотипы
Lys/Lys	0,63 [0,38-0,97]
Lys/Asn
Asn/Asn
Аллели
Lys
Asn

Таблица 6
Риск «спортивного сердца», ассоциированный с генотипами и аллелями основных генов-кандидатов
Генотип	Относительный риск [95% CI]
Полиморфный маркер 4а/4b гена NOS3
Генотипы
4b/4b	0,43 [0,23-0,79]
4b/4a	2,10 [1,14-3,86]
4а/4а
Аллели
4b	0,59 [0,37-0,93]
4а	1,68 [1,07-2,62]
Полиморфный маркер A(-153)G гена AT2R1
Генотипы
АА	0,31 [0,13-0,71]
AG	2,23 [1,02-5,26]
GG
Аллели
А	0,39 [0,20-0,75]
G	2,55 [1,33-4,91]
Полиморфный маркер А1298С гена MTHFR
Генотипы
АА
АС
СС	3,79 [1,13-12,69]
Аллели
А	0,54 [0,31-0,94]
С	1,83 [1,05-3,17]
Полиморфный маркер G7831A гена АСЕ
Генотипы
GG	0,29 [0,13-0,64]
GA	2,82 [1,35-5,88]
АА	1,25 [0,34-4,57]
Аллели
А	1,86 [1,09-3,17]
G	0,53 [0,31-0,91]

3. Формируют таблицы причинных генотипов и аллелей генов-кандидатов

Причинными считают аллели и генотипы, достоверно связанные с заболеванием в однофакторном регрессионном анализе (таблицы 7-9).

Таблица 7
Предрасполагающие и защитные аллели и генотипы ишемической болезни сердца у спортсменов
Предрасполагают	Защищают
Полиморфный маркер Т174М гена AGT
Аллель М	Аллель Т
Полиморфный маркер A(-153)G гена AT2R1
Генотипы AG, GG	Генотип АА
Аллель G	Аллель А
Полиморфный маркер А1298С гена MTHFR
Генотип СС
Аллель С	Аллель А
Полиморфный маркер С825Т гена GNB3
Генотипы СС	1.62 [1.07-2.45]
Полиморфный маркер Ala(-9)Val гена SOD2
Генотип АА	Генотип W
Аллель А	Аллель V
Полиморфный маркер Т(-262)С гена CAT
Генотип СС
Полиморфный маркер Сys311Ser гена PON2
Генотип Ser/Ser	Генотип Cys/Ser
Полиморфный маркер I/D гена АроВ
Генотип I/I	Генотипы ID и DD
Аллель I	Аллель D

Таблица 8
Предрасполагающие и защитные аллели и генотипы гипертонической болезни у спортсменов
Предрасполагают	Защищают
Полиморфный маркер Ser447Ter гена LPL
Аллель Ser	Аллель Ter
Полиморфный маркер Рго12Ala гена PPARG2
	Генотип Pro/Pro
Аллель Ala	Аллель Pro
Полиморфный маркер А1298С гена MTHFR
	Генотип АА
Аллель С	Аллель А
Полиморфный маркер Т(-262)С гена CAT
Генотип ТС	Генотип СС
Полиморфный маркер Lys198Asn гена END1
	Генотип Lys/Lys

Таблица 9
Предрасполагающие и защитные аллели и генотипы гипертонического сердца у спортсменов
Предрасполагают	Защищают
Полиморфный маркер 4а/4b гена NOS3
Генотип 4b/4а	Генотип 4b/4b
Аллель 4а	Аллель 4b
Полиморфный маркер A(-153)G гена AT2R1
Генотип AG	Генотип АА
Аллель G	Аллель А
Полиморфный маркер А1298С гена MTHFR
Генотип СС
Аллель С	Аллель А
Полиморфный маркер G7831A гена АСЕ
Генотипы GA и АА	Генотип GG
Аллель А	Аллель G

4. Детальное описание способа

Выполняют исследование отдельного спортсмена

Определение аллелей полиморфных маркеров генов-кандидатов проводят с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) [5].

Для проведения исследования выполняют взятие венозной крови в стерильные пробирки типа "вакутейнер" с ЭДТА. Образцы при необходимости замораживают и до проведения исследования хранят при температуре -50÷-70°С.

Выделение геномной ДНК из венозной крови обследуемых проводят методом фенол-хлороформной экстракции. Агарозные гели окрашивают бромистым этидием, полиакриламидные - нитратом серебра.

Определение аллелей и генотипов основных генов-кандидатов проводят по описанным ниже методикам.

Полиморфный маркер G7831A гена АСЕ в интроне 7

Определение аллелей и генотипов полиморфного маркера G7831A гена АСЕ проводят с использованием следующих праймеров:

АСЕ-Р1 5'-ctcggcttgggacttcta-3' и

АСЕ-Р2 5'-agagctggtccatcgtga-3'.

После амплификации получают фрагмент ДНК длиной 800 п.н., который инкубируют с рестриктазой PstI в буфере, с последующим электрофоретическим разделением полученных фрагментов ДНК в 1,5%-ном агарозном геле. Фрагмент ДНК, содержащий аллель G, расщепляется с образованием двух фрагментов, приблизительно, 600 и 200 п.н. длиной, в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель А, не расщепляется рестриктазой PstI. Таким образом, в случае генотипа АА наблюдают одну полосу длиной 800 п.н., в случае генотипа GG наблюдают две полосы (600 и 200 п.н.) и в случае GA наблюдают 3 полосы (800, 600 и 200 п.н.).

Полиморфный маркер A(-153)G гена рецептора ангиотензина II типа 1

Для анализа ассоциации гена рецептора ангиотензина II типа 1 (AT2R1) используют полиморфный однонуклеотидный маркер, представленный двумя аллелями А и G (остаток аденина и гуанина) в позиции -153. Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего данный полиморфный маркер, используют следующие праймеры:

AT1R-L 5`-cctgcaccatgttttgaggttgagtgac-3` и

AT1R-R 5`-aaaataacaggacaaaagcaggctagggag-3`

В результате амплификации участка ДНК, содержащего данную полиморфную последовательность, получается фрагмент ДНК длиной 352 п.н. Для идентификации аллелей маркера A(-153)G фрагмент ДНК, образующийся после амплификации, расщепляют рестриктазой BstDEI. Фрагмент ДНК, содержащий аллель (-153)G, расщепляется рестриктазой BstDEI, образуя продукты размером 114 и 238 п.н., в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель А(-153), остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 352 п.н. после обработки BstDEI соответствует генотипу АА, двух фрагментов (114 и 238 п.н.) - генотипу GG и трех (114, 238 и 352 п.н.) - гетерозиготному генотипу AG.

Полиморфный маркер Thr174Met гена ангиотензиногена (AGT)

Для определения генотипов полиморфного маркера Thr174Met гена AGT используют следующие праймеры:

AGT1 5'-gatgcgacaaggtcctg-3' и

AGT2 5'-cagggtgctgtccactggctcgc-3'.

Для идентификации аллелей полиморфного участка Thr174Met гена AGT к 15 мкл амплификационной смеси добавляют 2 мкл 10-кратного буфера Y, содержащего 33 мМ Трис-ацетат, рН 7,9; 10 мМ ацетат калия и 66 мМ ацетат натрия, 2 мкл БСА (1 мг/мл) и 0,5 мкл рестриктазы NcoI (10 ед./мкл). Пробы выдерживают в течение 3 ч при 37°С. Продукты расщепления разделяют с помощью электрофореза в 2%-ном агарозном геле. Гель окрашивают бромистым этидием.

В результате амплификации получают фрагмент длиной 303 п.н. Фрагмент ДНК, содержащий аллель Met, расщепляется рестриктазой NcoI, образуя продукты размером 197 и 106 п.н., а фрагмент ДНК, содержащий аллель Thr, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 303 п.н. после обработки NcoI соответствует генотипу ТТ, двух фрагментов (197 и 106 п.н.) - генотипу ММ и трех (106, 197 и 303 п.н.) - гетерозиготному генотипу ТМ.

Полиморфный маркер А1166С гена рецептора ангиотензина II типа 1

Для анализа ассоциации гена рецептора ангиотензина II типа 1 (AT2R1) используют полиморфный однонуклеотидный маркер, представленный двумя аллелями А и С (остаток аденина и цитозина в позиции 1166) в 3'-нетранслируемой области гена. Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего данный полиморфный маркер, используют следующие праймеры:

AT1R-L 5`-cctgcaccatgttttgaggttgagtgac-3` и

AT1R-R 5`-aaaataacaggacaaaagcaggctagggag-3`.

В результате амплификации участка ДНК, содержащего данную полиморфную последовательность, получается фрагмент ДНК длиной 352 п.н. Для идентификации аллелей маркера А1166С фрагмент ДНК, образующийся после амплификации, расщепляют рестриктазой BstDEI. Фрагмент ДНК, содержащий аллель С1166, расщепляется рестриктазой BstDEI, образуя продукты размером 114 и 238 п.н., в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель А1166, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 352 п.н. после обработки BstDEI соответствует генотипу АА, двух фрагментов (114 и 238 п.н.) - генотипу СС и трех (114, 238 и 352 п.н.) - гетерозиготному генотипу АС.

Полиморфный маркер 4а/4b гена эндотелиальной NO-синтетазы

Для анализа ассоциации гена эндотелиальной NO-синтетазы (NOS3) используют полиморфный маркер ecNOS4a/4b, расположенный в интроне 4 гена. Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего этот полиморфный маркер, применяют следующие праймеры:

NOS3-VNTR1 5'-aggccctatggtagtgccttt-3' и

NOS3-VNTR2 5'- tctcttagtgctgtggtcat-3'.

Амплификацию фрагмента гена NOS3, содержащего полиморфный мини-сателлитный маркер ecNOS4a/4b, проводят в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 67 мМ Трис-HCl, рН 8,8; 16,7 мМ сульфат аммония, 1,0 мМ хлорид магния, по 0,2 мМ каждого dNTP, 0,1%-ный Твин-20, 10%-ный диметилсульфоксид, по 5 пикомолей каждого из праймеров, 50-100 нг геномной ДНК человека и 2 ед. полимеразы Taq. ПЦР проводят по программе: первый цикл - 94°С/3 мин, следующие 35 циклов - 94°С/1 мин, 60°С/1 мин, 72°С/1 мин, последний цикл - 72°С - 6 мин.

Идентификацию аллелей проводят после электрофоретического разделения амплифицированных фрагментов ДНК в 2%-ном агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием. Аллель 4а имеет длину 393 п.н. и аллель 4b - 420 п.н.

Полиморфный маркер Lys198Asn гена эндотелина I

Мононуклеотидный полиморфизм G/T гена эндотелина I (EDN1), расположенный в экзоне 4 в положении 9272, соответствует аминокислотному полиморфизму в положении 198 полипептидной цепи (Lys198Asn).

Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего полиморфный маркер Lys198Asn, используют следующие праймеры:

EDN1.1F 5'-atgatcccaagctgaaaggcta-3'

EDN1.1R 5'-cagggctctccgtggaggctat-3'.

Условия амплификации: реакцию проводят в две стадии: 10 циклов при температуре отжига 57°С и 25 циклов при температуре отжига 61°С. Используется концентрация Мg2+ - 2,0 mM. В результате амплификации участка ДНК, содержащего данную полиморфную последовательность, образуется фрагмент ДНК длиной 116 п.н. Фрагмент ДНК, содержащий аллель Lys, расщепляется рестриктазой NheI, образуя продукты размером 19 и 97 п.н., в то время, как фрагмент ДНК, содержащий аллель Asn, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 116 п.н. после обработки NheI соответствует генотипу Asn/Asn, двух фрагментов (19 и 97 п.н.) - генотипу Lys/Lys и трех (116, 97 и 19 п.н.) - гетерозиготе Asn/Lys.

Полиморфный маркер I/D гена АРОВ

Определение аллелей и генотипов полиморфного маркера I/D гена АРОВ проводят с использованием следующих праймеров:

ApoB-L 5'-cagctggcgatggacccgccga-3' и

ApoB-R 5'-accggccctggcgcccgccagca-3'.

Наличие только фрагмента длиной 92 п.н. после электрофоретического разделения соответствует генотипу II, наличие фрагмента длиной 83 п.н. - генотипу DD и наличие двух фрагментов 92 и 83 п.н. - гетерозиготному генотипу ID.

Полиморфный маркер Ser447Ter гена LPL

Полиморфный маркер представлен двумя аллелями С и G, что приводит к полиморфизму аминокислотных остатков в положении 447 (Ser и терминирующий кодон - Ter). Определение аллелей и генотипов полиморфного маркера Ser447Ter гена LPL проводят с использованием следующих праймеров:

LPL-F 5'-catccattttcttccacaggg-3' и

LPL-R 5'-tagcccagaatgctcaccagact-3'.

В обратный праймер вводят нуклеотидную замену для создания искусственного участка узнавания рестриктазы Hinf I.

После расщепления амплифицированного фрагмента рестриктазой Hinf I фрагмент ДНК, содержащий аллель С, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 141 п.н. после обработки рестриктазой Hinf I соответствует генотипу СС, двух фрагментов (118 и 23 п.н.) - генотипу GG и трех (141, 118 и 23 п.н.) - гетерозиготному генотипу GC.

Полиморфный участок Ala(-9)Val гена SOD2

Полиморфный участок Ala(-9)Val гена SOD2 амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 50 мкл среды, содержащей 67 мМ Трис-HCl, рН 8,8; 16,7 мМ хлорид аммония, 1,0 мМ MgCl₂, 0,1% Твин-20, 10% ДМСО, 0,2 мМ каждого dNTP, 2,5 ед. ДНК-полимеразы Taq, 50-100 нг геномной ДНК и по 33 нг праймеров:

SOD2-16F2 5'-ccagcaggcagctggcaccg-3'

SOD2-16R2 5'-tccagggcgccgtagtcgtagg-3'

Условия амплификации фрагмента ДНК: 94°C/3 мин - 1-й цикл; 94°С/1 мин, 60°С/1 мин, 72°С/1 мин - 35 циклов; 72°С/6 мин - последний цикл. Размер продукта амплификации: 91 п.н.

Расщепление рестриктазой AsiAl амплифицированного фрагмента ДНК проводят в буфере В+/Tango (10 мМ Трис-HCl, рН 7,5; 10 мМ хлорид магния, 1 мг/мл БСА) при 37°С в течение 3-16 часов в присутствии 0,3-1 ед. рестриктазы AsiAl.

Фрагмент ДНК, содержащий аллель Val, расщепляется рестриктазой AsiAI, образуя продукты размером 74 и 17 п.н., в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель А/а, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 91 п.н. после обработки рестриктазой AsiAl соответствует генотипу Ala/Ala, двух фрагментов (74 и 17 п.н.) - генотипу Val/Val и трех (91, 74 и 17 п.н.) - гетерозиготному генотипу Ala/Val. Электрофоретическое разделение амплифицированных фрагментов ДНК и продуктов расщепления рестриктазы AsiAl проводят в 8% ПААГ с последующей окраской нитратом серебра,

Полиморфный участок Т(-262)С гена CAT

Полиморфный участок Т(-262)С гена CAT амплифицируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 50 мкл среды, содержащей 67 мМ Трис-HCl, рН 8,8; 16,7 мМ хлорид аммония, 2,0 мМ MgCl₂, 0,1% Твин-20, 10% ДМСО, 0,2 мМ каждого dNTP, 2,5 ед. ДНК-полимеразы Taq, 50-100 нг геномной ДНК и по 33 нг праймеров:

CAT262F 5'-agagcctcgccccgccggaccg-3'

CAT262R 5'-taagagctgagaaagcatagct-3'.

Условия амплификации фрагмента ДНК: 94°С/3 мин - 1-й цикл; 94°С/1 мин, 60°С/1 мин, 72°С/1 мин - 35 циклов; 72°С/6 мин - последний цикл. Размер продукта амплификации 185 п.н.

Фрагмент ДНК, содержащий аллель С, расщепляется рестриктазой Smal, образуя продукты размером 155 и 30 п.н., в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель Т, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 185 п.н. после расщепления рестриктазой Smal соответствует генотипу Т/Т, двух фрагментов 155 и 30 п.н. - генотипу С/С и трех (185, 155 и 30 п.н.) - гетерозиготному генотипу Т/С.

Полиморфный маркер А1298С гена MTHFR

Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего точечную замену в положении 1298 (А1298С) в экзоне 7 гена 5,10-метилентетрагидрофолейтредуктазы, используют следующие праймеры:

MTHFR-1 5'-agatgtggggggaggagctgaccagtgcag-3' и

MTHFR-2 5'-caggccaggggcaggggatgaaccag-3'.

Условия амплификации:

Первый цикл - 94°С/3 мин;

35 циклов - 94°С/40 сек, 61,5°С/40 сек, 72°С/40 сек;

последний цикл - 72°С/7 мин.

В результате амплификации участка ДНК, содержащего данную полиморфную последовательность, получается фрагмент ДНК длиной 143 п.н. Фрагмент ДНК, содержащий аллель С 1298, расщепляется рестриктазой Fnu 4 Н1, образуя продукты размером 115 и 28 п.н., в то время как фрагмент ДНК, содержащий аллель А, остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 143 п.н. после обработки Fnu 4 Н1 соответствует генотипу АА, двух фрагментов (115 и 28 п.н.) генотипу СС и трех (143, 115 и 28 п.н.) - гетерозиготе АС.

Полиморфный маркер Рrо12Ala гена PPARG2

Мононуклеотидный полиморфизм C/G гена PPARG2, расположенный в 1 экзоне в положении 34, приводит к аминокислотной замене Рrо12Ala. Для амплификации фрагмента ДНК, содержащего полиморфный маркер Рrо12Ala, используют следующие праймеры:

PPARG2-01 5'-ctgggagattctcctattggc-3'

PPARG2-02 5'-ctggaagacaactacaagag-3'.

Условия амплификации. Реакцию проводили по стандартной схеме: 35 циклов при температуре отжига 55°С. Использованная концентрация Мg2+ - 2,0 mM. В результате амплификации участка ДНК, содержащего данную полиморфную последовательность, образуется фрагмент ДНК длиной 153 п.н. Фрагмент ДНК, содержащий аллель С (Pro), расщепляется рестриктазой HaeIII, образуя продукты размером 133 и 20 п.н.; в то время, как фрагмент ДНК, содержащий аллель G (А/а), остается нерасщепленным. Наличие фрагмента длиной 153 п.н. после обработки HaeIII соответствует генотипу GG, двух фрагментов (133 и 20 п.н.) - генотипу СС и трех (153, 133 и 20 п.н.) - гетерозиготе GC.

Полиморфный маркер С825Т гена, кодирующего субъединицу β3 протеина G (GNB3)

Полиморфный участок С825Т гена GNB3 (однонуклеотидный полиморфизм С/Т в экзоне 10 в положении 825 по последовательности мРНК) амплифицируют с помощью ПЦР в 50 мкл среды, содержащей 15 мМ Трис-HCl, рН 8,8; 75 мМ KCl, 2,0 мМ MgCl₂, по 0,2 мМ каждого dNTP, 2,5 ед. ДНК-полимеразы Taq, 50-100 нг геномной ДНК и по 33 нг праймеров:

СNВ3_F+5500 5`-gtctgatccctgacccactt-3`

GNB3_R+5500 5`-ccttacccacacgctcagac-3`.

Условия амплификации: 94°С/2 мин - 1-й цикл; 94°С/10 сек, 65°С/40 сек, 72°С/20 сек - 35 циклов; 72°С/6 мин - последний цикл. Размер продукта амплификации: 260 п.н. Для идентификации аллелей полиморфного маркера С825Т гена GNB3 используют расщепление амплифицированного фрагмента ДНК рестриктазой BssECl или BseDl. Расщепление рестриктазами проводили в 20 мкл буферов, при 37°С в случае BssECl и 55°С в случае BseDl, используя 1-3 ед. рестриктазы на пробу в течение 2-3 ч. Фрагмент ДНК, содержащий аллель Т, остается нерасщепленным. Фрагмент ДНК, содержащий аллель С, расщепляется рестриктазами BssECl или BseDl, образуя продукты размером 163 и 97 п.н. Наличие фрагмента длиной 260 п.н. после обработки рестриктазами BssECl или BseDl соответствует генотипу ТТ, двух фрагментов (163 и 97 п.н.) - генотипу СС и трех (260, 163 и 97 п.н.) - гетерозиготному генотипу CT. Электрофоретическое разделение амплифицированных фрагментов ДНК и фрагментов ДНК, образующихся при действии рестриктазы BssECl или BseDl, проводят в 2% агарозном геле с последующей окраской бромистым этидием.

5. Сопоставляют данные спортсмена с табличными.

6. В случае относительного риска больше 1,5 делают заключение о наличии генетической предрасположенности, при относительном риске менее 0,7 - о защитном генотипе

7. Пример 1

У пациента М., 36 лет, при типировании полиморфных маркеров генов-кандидатов получены следующие генотипы (таблица 10).

Таблица 10
Генотипы полиморфных маркеров спортсмена М
Маркер	Генотип	OR ИБС	OR АГ	OR ГЛЖ
Полиморфный маркер Т174М гена AGT	ТМ
Полиморфный маркер A(-153)G гена AT2R1	AG	4,73		2,23
Полиморфный маркер А1298С гена MTHFR	АА		0,61	0,54
Полиморфный маркер С825Т гена GNB3	СТ
Полиморфный маркер Ala(-9)Val гена SOD2	АА	2,30
Полиморфный маркер Т(-262)С гена CAT	TC		1,56
Полиморфный маркер Cys311Ser гена PON2	Cys/Ser	0,41
Полиморфный маркер I/D гена ApoB	II
Полиморфный маркер Ser447Ter гена LPL	Ser/Ser	2,14	1,51
Полиморфный маркер Рrо12Ala гена PPARG2	Ala/Ala		1,87
Полиморфный маркер Lys198Asn гена END1	Lys/Asn
Полиморфный маркер 4а/4b гена NOS3	4a/4a			1,68
Полиморфный маркер G7831A гена АСЕ	GG			0,29

В целом у пациента отмечается высокая предрасположенность к развитию ИБС (3 предрасполагающих генотипа и 1 защитный), артериальной гипертонии (3 предрасполагающих генотипа и 1 защитный). Риска развития спортивного сердца нет - 2 предрасполагающих генотипа и 2 протективных.

8. Пример 2

У пациентки О., 31 года, при типировании полиморфных маркеров генов-кандидатов получены следующие генотипы (таблица 11).

Таблица 11
Генотипы полиморфных маркеров спортсменки 0
Маркер	Генотип	OR ИБС	OR АГ	OR ГЛЖ
Полиморфный маркер Т174М гена AGT	ТТ	0,43
Полиморфный маркер A(-153)G гена AT2R1	АА	0,13
Полиморфный маркер А1298С гена MTHFR	АА		0,61	0,54
Полиморфный маркер С825Т гена GNB3	СТ
Полиморфный маркер Ala(-9)Val гена SOD2	VV	0,24
Полиморфный маркер Т(-262)С гена CAT	TC		1,56
Полиморфный маркер Cys311Ser гена PON2	Cys/Ser	0,41
Полиморфный маркер I/D гена ApoB	ID	0,57
Полиморфный маркер Ser447Ter гена LPL	Ter/Ter		0,66
Полиморфный маркер Рrо12Ala гена PPARG2	Ala/Pro
Полиморфный маркер Lys198Asn гена END1	Lys/Lys		0,63
Полиморфный маркер 4а/4b гена NOS3	4b/4b			0,43
Полиморфный маркер G7831A гена АСЕ	GG			0,29

В целом у пациентки имеется низкий риск ишемической болезни сердца (5 протективных генотипов), артериальной гипертонии (3 протективных генотипа и 1 предрасполагающий) и развития спортивного сердца - 3 протективных генотипа.

9. Эффективность способа

Предложенный способ был проведен у 137 спортсменов. Высокая предрасположенность к артериальной гипертонии выявлена у 24 человек, к ишемической болезни сердца - у 14 человек, к развитию спортивного сердца - у 18 человек. Протективные генотипы по отношению к ИБС выявлены у 24 человек, к артериальной гипертонии - у 17 человек, к развитию спортивного сердца - у 11 человек.

Выводы

Способ позволяет

1. Повысить надежность путем определения нескольких полиморфных маркеров генов-кандидатов.

2. Повысить точность комплексной оценки генетической предрасположенности к развитию поражения сердечно-сосудистой системы у спортсменов.

Список литературы

1. Cambien, F.; Poirier, O.; Lecerf, L.; Evans, A.; Cambou, J. - P.; Arveiler, D.; Luc, G.; Bard, J.-M.; Bara, L.; Ricard, S.; Tiret, L.; Amouyel, P.; Alhenc-Gelas, F.; Soubrier, F.: Deletion polymorphism in the gene for angiotensin-converting enzyme is a potent risk factor for myocardial infarction. Nature 359: 641-644, 1992.

2. Jeunemaitre, X.; Soubrier, F.; Kotelevtsev, Y.V.; Lifton, R.P.; Williams, C.S.; Charru, A.; Hunt, S.C.; Hopkins, P.N.; Williams, R.R.; Lalouel, J.-M.; Corvol, P.: Molecular basis of human hypertension: role of angiotensinogen. Cell 71: 7-20, 1992.

3. Diet F, Graf C, Mahnke N ACE and angiotensinogen gene genotypes and left ventricular mass in athletes. Eur J Clin Invest. 2001 Oct; 31 (10): 836-42.

4. Патент Российской федерации: RU 2194982 C2. Способ выявления предрасположенности к длительной физической работе.

5. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Eriich HA, Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20; 230 (4732): 1350-1354.

Claims

Способ оценки генетического риска сердечно-сосудистых заболеваний у спортсменов, включающий определение полиморфных маркеров генов-кандидатов, отличающийся тем, что выполняют генетическое исследование крови спортсмена, определяют предрасполагающие и защищающие аллели и генотипы полиморфных маркеров генов-кандидатов: для ишемической болезни сердца маркер Т174М гена AGT предрасполагающая аллель М и защищающая аллель Т, маркер A(-153)G гена AT2R1 предрасполагающие генотипы AG, GG и аллель G и защищающие генотип АА и аллель А, маркер А1298С гена MTHFR предрасполагающие генотип СС и аллель С и защищающая аллель А, маркер С825Т гена GNB3 предрасполагающий генотип СС, маркер Ala(-9) Val гена SOD2 предрасполагающие генотип АА и аллель А и защищающие генотип W и аллель V, маркер Т(-262)С гена CAT предрасполагающий генотип СС, маркер Cys311Ser гена PON2 предрасполагающий генотип Ser/Ser и защищающий генотип Cys/Ser, маркер I/D гена АроВ предрасполагающие генотип I/I и аллель I и защищающие генотипы ID и DD и аллель D; для гипертонической болезни маркер Ser447Ter гена LPL предрасполагающая аллель Ser и защищающая аллель Ter, маркер Рrо12Ala гена PPARG2 предрасполагающая аллель Ala и защищающие генотип Pro/Pro и аллель Pro, маркер А1298С гена MTHFR предрасполагающая аллель С и защищающие генотип АА и аллель А, маркер Т(9282) гена CAT предрасполагающий генотип ТС и защищающий генотип СС, маркер Lys198Asn гена END1 предрасполагающий генотип Lys/Lys; для гипертонического сердца маркер 4а/4b гена NOS3 предрасполагающие генотип 4b/4а и аллель 4а и защищающие генотип 4b/4b и аллель 4b, маркер A(-153)G гена AT2R1 предрасполагающие генотип AG и аллель G и защищающие генотип АА и аллель А, маркер А1298С гена MTHFR предрасполагающие генотип СС и аллель С и защищающая аллель А, маркер G7831A генаАСЕ предрасполагающие генотипы GA и АА и аллель А и защищающие генотип GG и аллель G и делают заключение о предрасположенности при количественном преобладании предрасполагающих генотипов и аллелей, а о генетической защите от развития патологии при равном значении предрасполагающих и защищающих генотипов и аллелей или количественном преобладании защищающих.