NO323560B1 - Fremgangsmate for a diagnostisere en koronararteriespasme-assosiert sykdom samt kit derfor - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en teknikk for en diagnose av en spesifikk sykdom, og vedrører en fremgangsmåte for å diagnostisere en koronararteriespasme-assosiert sykdom. Oppfinnelsen vedrører også et.kit derfor.

Intrinsik nitrogenoksyd (intrihsik NO) er en substans som

nylig er blitt identifisert in vivo, og er blitt vist tii å virke som en vasodilator.(18-25), en neurotransmitter (11,

12) eller en immunreaktant (13-17). Intrinsik NO synteti-

seres fra L-arginin på grunn av en gruppe omfattende minst tre nitrogenoksydsyntaser (NOS<*.>er), dvs. nevral NOS, endotel NOS og makrofag NOS. Nevral NOS og endotel NOS er konsti-tutive og deres aktivitet øker avhengig av konsentrasjoner av intracellulær kalsium. På den annen side er makrofag NOS avhengig av kalsium og aktiveres ved inflammasjon. Enkelte forskere har tidlig bestemt genstrukturen til endotelcellenitrogenoksydsyntase (eNOS), og rapportert at eNOS genet er lokalisert ved 7q35-36 i kromosomet, og utgjøres av 2 6

exoner> og strekker seg over 21 kb (18-25).

Koronararteriespasme skal forstås som en patogen faktor av forskjellige ischemiske hjertesykdommer som koronar spastisk angina og variant angina (1-6). En mekanisme for den koror nare spasme er imidlertid ikke særlig godt kjent.

Man har således gjennomført undersøkelser for å forklare mekanismen ved koronar spasme, under betraktning av at slike undersøkelser kan bidra til utviklingen av en tidlig diagnose og behandling av de ischemiske sykdommer som er assosiert med koronar spasme. Det skal bemerkes at de fleste av de tidligere studier har pekt på at en hyperkontraksjon av glatt muskulatur er viktigere i den patogene mekanismen av.koronar spasme enn en skade av hemangioendotel (35).

Acetylcholin virker generelt på glatt muskulatur til å sam-mentrekke dennej men acetylcholin.kan eventuelt føre til vasodilatasjon ved sekresjon av nitrogenoksyd (NO) som virker på glatt muskulatur når endotelet er uskadet. Koronar administrering av acetylcholin til pasienter med koronar spastisk angina induserer imidlertid koronar spasme heller enn vasodilatasjon (7,8). I denne forbindelse har de foreliggende oppfinnere tidligere vist at den basale sekresjon av NO bevirket ved acetylcholin er lav i pasienter med koronar spastisk angina (10).

Da nitroglyserin og en nitrogensyremedisin kan bevirke vasodilatasjon under dannelse av NO in vivo, vil den basale sekresjon av NO kunne nedsettes i koronararterien hos pasienter med koronar spastisk angina, noe som er understøttet ved det faktum at reaksjonen av de kar hvori NO syntesen er undertrykket, overfor nitrogensyremedisin er supersensitiv (9) , og koronararterien i de pasienter med koronar spastisk angina er supersensitiv overfor nitroglyserin. Disse resultater vil foreslå muligheten av en sterk sammenheng mellom koronar spasme og NO, spesielt endotelet hvor NO utskilles.. Til nå har ingen sett på sammenhengen mellom den koronare spasme og endotelet hvor NO utskilles, kun i den forbindelse at nedsettelse i den basale sekresjon av NO er kjent.

Sett ut fra et annet synspunkt, har man nå sett at den koronare spasme kan ha en genetisk bakgrunn i lys av det faktum at koronar spasme er mere hyppig i Japan enn i USA og i Europa (26,27).

På bakgrunn av de ovennevnte funn har man nå fokusert på et gen av ett av NOS enzymene som danner intrinsik NO, dvs.

endotelcellenitrogenoksydsyntase (eNOS), og man har undersøkt om genet er ansvarlig for en utvikling av den koronare spasme og på denne bakgrunn til slutt oppnådd den foreliggende oppfinnelse.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å diagnostisere en koronararteriespasme-assosiert sykdom, og som omfatter deteksjon av tilstedeværelsen av en eller flere nukleotidforandringer i endotelial nitrogenoksydsyntase(eNOS) genet, hvilke forandringer er valgt fra en gruppe som omfatter forandringene fra guanin (G) til tymin (T) i posisjon 894 og fra cytosin (C) til tymin (T) i posisjon 774 av cDNA sekvensen av eNOS genet, og forandringene fra tymin (T) til cytosin (C) i posisjon -786, fra adenin (A) til guanin (G) i posisjon -922 og fra tymin (T) til adenin (A) i posisjon -1468 i 5'-flankeregionen av eNOS genet, såvel som forandringene i de tilsvarende posisjoner i komplementærtråden derav.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører foretrukket den ovennevnte fremgangsmåte som omfatter deteksjon av tilstedeværelsen av to eller flere nukleotidforandringer som er valgt fra hvilken som helst av nukleotidforandringéne i eNOS genet, og hvilke som helst nukleotidforandringer i 5'-flankeregionen derav, og mere foretrukket vedrører oppfinnelsen den ovennevnte fremgangsmåte hvor den koronararteriespasme-assosierte sykdom er angina, og ytterligere foretrukket vedrører oppfinnelsen den ovennevnte fremgangsmåte hvor den koronararteriespasme-assosierte sykdom er koronar spastisk angina.

En fremgangsmåte for screening for de ovennevnte forandringer som omfatter RFLP metoden hvor tilstedeværelse eller fravær av en spalting bevirket ved et restriksjonsenzym detekteres, er beskrevet. I en utførelsesform av oppfinnelsen gjennomføres deteksjonen av tilstedeværelsen av forandringene ved å amplifisere den relevante region til exon 7 i det cDNA som koder for eNOS ved hjelp av PCR, kutting av de amplifiserte fragmenter med ett eller flere av restriksjonsenzymene Banll og/eller Mbol, og utføre elektroforesebehandling av fragmentene kuttet med enzymet. I en utførelsesform av oppfinnelsen gjennomføres deteksjonen av tilstedeværelsen av forandringene i exon 6 ved behandling med restriksjonsenzymet Foki. I en utførelsesform av oppfinnelsen gjennomføres deteksjonen av tilstedeværelsen av forandringene i posisjon -786 i 5'-flankeregionen av eNOS genet ved behandling med restriksjonsenzymet Mspl. I en utførelsesform av oppfinnelsen gjennomføres deteksjonen av tilstedeværelsen av forandringene i posisjon -1468 i 5•-flankeregionen av eNOS genet.ved behandling med restriksjonsenzymet Mbol.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også et kit for diagnostisering av koronararteriespasme-assosiert sykdom, som omfatter et amplifikasjonsoligonukleotid for å amplifisere exon 7 i det cDNA som koder for human eNOS, exon 6 i det cDNA som koder for human eNOS, en del som omfatter -786 posisjonene i 5'-flankeregionen av det humane eNOS-genet, eller en del som omfatter -1469 posisjonene i 5f<->flankeregionen av det humane eNOS genet.

I en utførelsesform omfatter kitet et amplifikasjonsoligonukleotid for å amplifisere exon 7 i det cDNA som koder for eNOS ved PCR, og restriksjonsenzymet/restriksjonsenzymene BanXI og/eller Mbol.

I en utførelsesform omfatter kitet et amplifikasjonsoligonukleotid for å amplifisere exon 6 i det cDNA som koder for eNOS ved PCR, og restriksjonsenzymet Foki.

I en utførelsesform omfatter kitet et amplifikasjonsoligonukleotid for å amplifisere en del som omfatter -786 posisjonen i 5<*->flankeregionen av eNOS genet ved PCR, og restriksjonsenzymet Mspl.

I en utførelsesform omfatter kitet et amplifikasjonsoligonukleotid for å amplifisere en del som omfatter -1468 posisjonen i 5 *-flankeregionen av eNOS genet ved PCR, og restrik-sjonsenszymet Mbol.

Det skal bemerkes at amplifikasjonsoligonukleotidet inneholdt i kitet i henhold til oppfinnelsen omfatter oligonukleotider annet enn dem angitt i den etterfølgende tabell 1, og de kan velges blant hvilke som helst oligonukleotider under henvisning til den genomiske sekvens av eNOS.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 er et fotografi som viser resultatene av elektroforesen oppnådd ved PCR-SSCP analysen av DNA fragmenter inneholdende exon 7 i eNOS genet > Pil indikerer forskyvning av båndene. Fig. 2 er en kurve som viser resultatene fra den direkte sekvensering av DNA fragmentene inneholdende exon 7 i eNOS genet som stammer fra begge tilfeller med (mutanttype) og uten mutasjonen (villtype). Den mutante typen representerer heterozygoten. Fig. 3 er et resultat av screeningen av DNA fragmentene inneholdende exon 7 i eNOS genet ved PCR-RFLP. Restriksjonsenzymet er Banll og/eller Mbol. Fig. 3A er et restriksjonskart derav.. Fig. 3B er et fotografi som viser resultatene fra den ekte elektroforesen. Fig. 4 er et fotografi som viser resultatene fra elektroforesen oppnådd ved PCR-RFLP for screening av DNA fragmenter inneholdende exon 6 i eNOS genet. Restriksjonsenzymet er Foki. Fig. 5 er et fotografi som viser resultatene fra elektroforesen oppnådd ved PCR-RFLP for screening av DNA

fragmentene inneholdende -786 og -1468 posisjonene i 5'-flankeområdet av eNOS genet. Restriksjonsenzymet er Mspl i tilfellet av -786 mutasjonen, mens det er Mbol i tilfellet av -1468 mutasjonen.

Som angitt i det foregående har oppfinnerne fokusert på eNOS genet, undersøkt om genet er ansvarlig for utviklingen av den koronare spasme og oppnådd de følgende funn:

A) Mutasjoner i exoner av eNOS genet

1) Mutasjon i exon 7: auanin ( G) i posisjon 894 av det cDNA som koder for eNOS er mutert til tymin (Tl

Ved hjelp av PCR-SSCP (polymerasekjedereaksjon - enkeltrådet konformasjonspolymorfisme) metoden og den direkte sekvense-ringsmetoden, ble en punktmutasjon definert i exon 7 av eNOS genet oppnådd fra en pasient med koronar spastisk angina. Mutasjonen representerer forandring fra GAG til GAT, og den svarer til mutasjon av aminosyreresten fra glutaminsyre til asparaginsyre (Glu298Asp). Ved screening av 96 pasienter med koronar spastisk angina og 86 kontroller for denne mutasjon, ble det funnet at henholdsvis 22 pasienter og 7 kontroller hadde denne mutasjon.

2) Mutasjon i exon 6: cytosin ( C) i posisjon 774 av det

cDNA som koder for eNOS er mutert til tymin ( T)

PCR-SSCP metoden viste at denne basesubstitusjon ble funnet i

4 pasienter, med koronar spastisk angina blant 10 pasienter.

På den annen side ble denne basesubstitusjon ikke funnet i 9 kontroller (P=0,03). Denne basesubstitusjon er ikke fulgt av aminosyreforandring.

B) Mutasjoner i 5'-flankeregionen av eNOS genet

Eri rekke mutasjoner ble funnet i 5'-flankeregionen av eNOS genet, og sammenhengen mellom disse mutasjoner og koronare spastiske sykdommer ble evaluert for å oppnå følgende resultater.

1) Tymin ( T) i 5'- flankeregionen (-786) er mutert til cytosin ( C)

PCR-SSCP metoden viste at denne basesubstitusjon ble funnet i

34 pasienter med koronar spastisk angina blant 123 pasienter (27,6%), mens denne basesubstitusjon kun ble funnet i 4 kontroller blant 86 kontroller (4,7%) (P<0,0001). 2) Adenin ( A) i 5■- flankeregionen 1- 922) er mutert til guanin ( G\

PCR-SSCP metoden viste at denne basesubstitusjon ble funnet i

31 pasienter med koronar spastisk angina blant 104 pasienter (29,1%), mens denne basesubstitusjon kun ble funnet i 3 kontroller blant 83 kontroller (3,6%) (P<0,000i). 3) Tymin ( Tl i 5'-flankeregionen (-1468) er mutert til adenin (A)

PCR-SSCP metoden viste at denne basesubstitusjon ble funnet i 26 pasienter med koronar spastisk angina blant 98. pasienter (26,5%), mens denne basesubstitusjon ikke ble funnet i 26 kontroller (0%) (P<0,0006).

De ovennevnte mutasjoner assosiert med eNOS genet er nyttige

i diagnosen av koronar spasme-assosierte sykdommer.

Betegnelsen "koronar spasme-assosiert sykdom" som anvendt i den foreliggende beskrivelse omfatter angina, særlig koronar spastisk angina, variantangina, ustabil angina, belastnings-angina, hvileangina, akutt hjerteinfarkt, mikrovaskulær sykdom o. 1.

F

Sammenhengen mellom koronar spasme og mutasjonene assosiert med eNOS genet er blitt vist i forbindelse med den foreliggende oppfinnelse og når mutasjonene i eNOS genet eller i 5'-flankeregionen derav som er oppnådd fra en pasient som antas å ha koronar spasme-assosiert sykdom derfor detekteres, kan det estimeres at den aktuelle pasient kan ha risikofaktoren for de koronare spasme-assosierte sykdommer. Kun en av disse mutasjoner er tilstrekkelig^, som en indikator for sykdommene, og to eller flere mutasjoner kan være en bedre indikator.

Det er videre blitt funnet at deteksjon av mutasjonene i både eNOS genregionen og i 5<1->flankeregionen derav fører til den vurdering at de koronare spasme-assosierte sykdommer er alvorlige.

Betegnelsen "forandringer i de tilsvarende posisjoner i komplementært råden derav" betyr, f.eks. i tilfellet av nukleo-tidf or andr ingen fra guanin (G) til tymin (T) i posisjon 894 i cDNA av eNOS genet, i så fall forandringen hvor.cytosin (C) i posisjonen i komplementærtråden svarende til 894 posisjonen er mutert.til adenin (A).

Fremgangsmåten for å oppnå eNOS genet og 5<1->flankesekvensen fra en pasient er angitt i det etterfølgende.

All biopsi kan anvendes .som en prøve for å oppnå genet, og er typisk en prøve av hvite blodlegemer, og i tillegg kan lever-biopsi også anvendes. Prøven behandles med proteinase K-SDS for å bevirke proteolyse og denaturering, og ekstraheres deretter med fenol/kloroform for å gi genomiske DNA<*>er {+RNA'er). Om ønsket kan RNA<1>ene fjernes ved RNase.

Deretter gjennomføres PCR ved anvendelse av hvilke som helst av de primere som er vist i det etterfølgende for å amplifisere genomisk DNA. Deretter bekreftes tilstedeværelsen av mutasjonene ved hjelp av de følgende prosedyrer for deteksjon av nukleinsyremutasjon. 1) RFLP metode ("restriction fragment length polymorphism") 2) PCR-SSCP metode {"single-stranded DNA conformation polymorphism analysis") 3) ASO hybridiseringsmetode (allel-spesifikk oligonukleotid-hybridisering)

PCR produktene blottes på en bærer som et nylonfilter og hybridiseres med en syntetisk oligonukleotidprobe på omtrent 18-mer med en basesekvens inneholdende den mutasjon som skal detekteres, som kan være merket med en radioaktiv isotop eller biotin til å gi et signal. Deretter, når filteret er vasket i henhold til en Tm verdi av proben, er det mulig å detektere en mismatch i et båsepar, da mismatchen vil bevirke smeltet hybrid. Denne metode er typisk en metode for å detektere en spesifikk basemutasjon ved PCR.

4} Sekvenseringsmetode

5) Southern-blot metode

Dette er den typiske metode for å detektere mutasjoner som omfatter kutting av DNA med et restriksjonsenzym, utvikling ved elektroforese og hybridisering med en probe. Denne metode omfatter både genomisk Southern-blot og PCR Southern-blot metoder. Den sistnevnte, som anvender det samme prinsippet som metoden (3), er fordelaktig med hensyn til nøy-aktighet ved at den kan tilveiebringe informasjon for migrering .

6) ARMS" ("amplification reffacting mutation system"}

I PCR vil en primer anneale til et templat DNA og deretter danner en DNA polymerase et komplementært DNA fra 5' til 3* enden. ARMS er basert på det prinsipp at amplifikasjons-effektiviteten av PCR avtar og PCR produktene kan ikke detekteres ved gelelektroforese når 3' enden av primeren danner mismatch til templat DNA. Når primeren som har en mutasjon som skal detekteres i sin 3' ende anvendes i PCR amplifikasjon, er det mulig å detektere mutasjonen ved å undersøke tilstedeværelse eller fravær av de amplifiserte produkter.

7) DGGE ("denaturing gradient gel electrophoresis")

Denne metode er basert på prinsippet at en heterodupleks inneholdende en mismatch i PCR produkter kan dissosiere raskere enn en homodupleks. I denne metode blir en dobbel-trådet DNA inneholdende en mismatch, dvs i en mutasjon, detektert som migrering på elektroforesegelen på grunn av at migrering av slik DNA er dårlig på gelen under dissosiasjon, som ytterligere akselereres ved å øke densitetsgradienten av et urea og formamid i den utviklende polyakrylamidgelen.

8} RNase A kuttemetode

RNase A (ribonuklease) er et enzym som ikke spalter et dob-beltrådet RNA eller et RNA/DNA hybrid, og som selektivt spalter et enkeltrådet RNA. Når en RNA probe merket med 32P hybridiseres med en prøve DNA som er blitt denaturert til enkeltrådet, behandles hybridet med RNase A og produktene utvikles ved elektroforese, og de to bånd kan så detekteres på grunn av at enkeltrådet RNA avledet fra RNA proben hybri-disert med et mutant DNA kuttes ved RNase A.

9) Metode med kjemisk kutting

"C" nukleotid og "T" nukleotid i mismatch setet av et hybrid DNA modifiseres med henholdsvis hydroksylamin og osmiumtétra-oksyd, og det modifiserte DNA behandles deretter med piperi-din for å kutte sukkerresten. Et hybrid av en merket, probe og prøve DNA innføres i prosedyren og utvikles ved elektroforese. Når mutasjonen er tilstede i prøve DNA, detekteres den merkede probe i mindre størrelse. I tilfellet av deteksjon av Glu298Asp, er mismatch setet C-T, og derfor kan den reverse sekvens av villtypen også anvendes for å detektere mismatchen.

10) Ligasemetode

Denne metode er basert på prinsippet om at to typer av oligonukleotider ikke kan ligeres til hverandre med DNA ligase når templat DNA har en eller flere mismatcher i bindingssetet.

i) LMGD (ligase-mediert gendeteksjon)

Et oligo DNA er f.eks. merket med 32P, mens et annet DNA er merket med biotin. Begge ligeres til hverandre og dét liger-te produkt samles ved absorpsjon til streptavidin. Når de er sikkert ligert til hverandre, med andre ord at mismatch ikke er dannet, kan de detekteres da radioaktivitet av 32P blir større.

ii) LCR (ligasekjedereaksjon)

Ved å gjenta den ovennevnte ligering med unntak av anvendelse av termostabil ligase, blir et oligo DNA annealet med en DNA tråd, som i PCR, og derfor forenkles en mere sensitiv deteksjon av mutasjonen.

1. Mutasjon i exon 7

Mutasjonen i exon 7, særlig mutasjonen fra guanin (G) til tymin (T) i posisjon 894 i det cDNA som koder for eNOS representerer forandring fra GAG til GAT, som begge danner de ulike restriksjonsseter. Tilstedeværelsen av mutasjonen kan således bestemmes ved anvendelse av et restriksjonsenzym. Spesielt gjør kutting av de amplifiserte produkter med enten restriksjonsenzymet Bann eller Mbol det mulig å detektere tilstedeværelsen av mutasjonen. Mere spesiélt finner man at mutasjonen er tilstede når restriksjonsenzymet Banll kan kutte det aktuelle setet, mens mutasjonen finnes å være fraværende når restriksjonsenzymet Mbol kan kutte det aktuelle setet.

Alternativt, siden mutasjonen fra guanin (G) til tymin (T) i posisjon 894 av det cDNA som koder for eNOS svarer til mutasjonen i aminosyren fra glutaminsyre til asparaginsyre (Glu298Asp) , - kan forandringen av aminosyre sekvens en av eNOS, dvs. forandringen fra glutaminsyre til asparaginsyre i posisjon 298 i aminosyresekvensen av eNOS, være en indikator.

2. Mutasjon i exon 6

Mutasjonen i exon 6, særlig mutasjonen fra cytosin (C) til tymin (T) i posisjon 774 i det cDNA som koder for eNOS gir restriksjonsseter som er forskjellige slik at tilstedeværelsen av mutasjonen kan bestemmes ved anvendelse av et restriksjonsenzym. Spesifikt gjør kutting av de amplifiserte produkter med restriksjonsenzymet Foki det mulig å detektere tilstedeværelsen av mutasjonen. Mere spesielt er mutasjonen funnet å være tilstede når produktene kan kuttes med restriksjonsenzymet Foki, mens mutasjonen er funnet å være fraværende når produktene ikke kan kuttes med Foki. 3 . Mutasjon i stilling -786 i 5'-flankeregionen Mutasjonen i 5<1->flankeregionen av eNOS genet, spesifikt, mutasjonen fra tymin (T) til cytosin (C) i posisjon -786 gir også restriksjonsseter som er forskjellige fra hverandre slik at tilstedeværelsen av mutasjonen kan bestemmes ved anvendelse av et restriksjonsenzym. Spesifikt, gjør kutting av de amplifiserte produkter med restriksjonsenzymet Mspl det mulig å detektere tilstedeværelsen av mutasjonen. Mere spesifikt finner man at mutasjonen er fraværende når restriksjonsenzymet Mspl kutter de amplifiserte produkter på ett sted, mens mutasjonen er funnet å være tilstede når Mspl kutter de amplifiserte produkter på to steder. 4 . Mutasjon i posision -1468 i 5'-flankere<g>ionen Mutasjonen i 5•-flankeregionen av eNOS genet, særlig mutasjonen fra tymin (T) til adenin (A) i posisjon -1468 gir også restriksjonsseter som er forskjellige fra hverandre slik at tilstedeværelsen av mutasjonen kan bestemmes ved anvendelse av et restriksjonsenzym. Spesifikt, gjør kutting av de amplifiserte produkter med restriksjonsenzymet Mbol det mulig å detektere tilstedeværelsen av mutasjonen. Mere spesielt finner man at mutasjonen er fraværende når restriksjonsenzymet Mbol kutter de amplifiserte produkter på ett sted, mens mutasjonen er funnet til å være tilstede når Mbol kutter de amplifiserte produkter på to steder.

Eksempler

Eksempel 1

Deteksjon av mutasjonen i exon 7 i eNOS genet

Individene er 96 pasienter med koronar spastisk angina og 86 kontroller. Alle pasientene med koronar spastisk angina gjennomgår spontant slag under hvile (hannkjønn 53, hunnkjønn 43, gjennomsnittlig alder 61, alder 33-86). Hjertekaterer-undersøkelse gjennomføres på alle pasienter for å bekrefte koronar spasme indusert ved acetylcholin eller ergonovin ved koronar arteriografi, såvel som for å bekrefte signifikant ST-T forandring ved elektrokardiogram (7,8). Signifikant konstriksjon i koronararterie ble ikke funnet i alle pasienter (>75%).

Blant 86 kontroller, utgjør 61 en gruppe med stikkende bryst-smerter, 12 utgjør en gruppe med et unormalt elektrokardiogram og 13 utgjør en gruppe med en mild valvulær sykdom (hannkjønn 35, hunnkjønn 51, gjennomsnittsalder 61, alder 13-83) . Koronar arteriografi viste at ingen av kontrollene hadde signifikante konstriksjoner. Når en koronar spasme-induserende test ble utført på 61 individer av gruppen med stikkende brystsmerte og 12 individer av gruppen med unormalt elektrokardiogram ved koronar dosering av acetylcholin eller ergonovin, var alle individene negative. Kontrollen inkluderer ikke individer med hjerteinfarkt, syndrom X, myokardio-pati og kardiell insuffisiens.

(1) Undersøkelse av eNOS oenmutas-ionen ved PCR-SSCP

i} Isolering av DNA

Perifert venøst blod ble samlet fra 10 pasienter med typisk koronar spasme og 9 kontroller, og DNA'ene ble ekstrahert fra hvite blodlegemer (2 8) ved anvendelse av DNA ekstraksjonskit

DNAQUICH [DAINIPPON SEIYAKU] .

. 11) PCR trinn

Under henvisning til strukturen av det eNOS genet som er blitt rapportert (18-25), ble PCR-SSCP metoden utført på alle exoner i eNOS genet (2 9).

Alle primere ble fremstilt på grunnlag av sekvensen av introner for å flankere hvert exon. Alle primere anvendt i dette trinnet er.vist i tabell 1.

Til en oppløsning i et totalt volum på S /il inneholdende

50 mmol/1 KCL, 20 mmol/1 Tris-HCl (pH 8,4), 0,75 mmol/1 MgCl2, 0,1 mmol/1 dNTP'er, 0,2 ml ce-[<32>P]dCTP (0,2 ml), 5 pmol av hver primer og 0,01 U Taq polymerase (GIBCO BRL, Life Technologies Inc., MD, USA) i hvert rør tilsettes 3 0 ng DNA fra pasientene.

PCR prosedyre ble utført som følger: en syklus på 2 min. ved 94°C, 30 sykluser på 30 sek. ved 94°C, 3 0 sek. ved 55-58°C og 1 min. ved 72°C, og de oppnådde amplifiserte produkter ble lagret ved 4°C. Amplifikasjon av exon 7 ble gjennomført ved 57°C.

iii) SSCP trinn

Elektroforese ble utført under tre betingelser hvori en er 5% glyserolgel ved romtemperatur og de andre er 5% og 10% glyserolgel ved 4°C.

Glyserolgelen ble fremstilt som følger:

1) fremstilling av en 5% oppløsning inneholdende 49:1 akryl-amid og N,N<*->metylen-bis-akrylamid. 2) fremstilling av 0,5 x TBE (10 x TBE fortynnes 2 0 ganger: 108 g Tris(hydroksymetyl)aminometan + 55 g borsyre + 40 ml 0,5 M EDTA + vann hvis volum bringer totalvolumet til 500

ml) .

3) fremstilling av en gel ved tilsetning av 160 ( il 10% APS (ammoniumperoksodisulfid) og 60 pl TEMED (N,N,N',N'-tetrametyletylendiamin) til en oppløsning av 5% eller 10% glyserol.

iv) Resultat

Resultatet oppnådd ved amplifikasjon av exon 7 er vist i

fig. 1. Dette viser en bånd-forskyvning av fragmentet omfattende exon 7 i 3 ut av 10 koronar-spastiske anginapasi-enter. På den annen side ble ingen forskyvning vist i kontrollene.

(2) Analyse av mutantgenet'ved direkte sekvens eringsmetode

DNA<f>er fra pasientene som er funnet til å ha mutasjonen og kontrollene som er funnet til ikke å ha mutasjon ved PCR-SSCP i trinn (1) ble igjen amplifisert i henhold til de samme betingelser som i trinn (l), og de amplifiserte produkter ble renset ved Wizard PCR Preps DNA rensesystem {Wizard PCR Préps DNA Purification System, Promega, USA) . Deretter ble base-sekvensen bestemt ved hjelp av en autosekvensator produsert av ABI EUSA].

Ved analyse av mutant DNA og vi11type DNA ved direkte sekvensering, ble punktmutasjon fra guanin (G) til tymin (T) ved posisjon 894 i exon 7 av eNOS cDNA funnet. Denne mutasjon ble bekreftet i 3 pasienter som var blitt funnet til å ha mutasjonen. Punktmutasjonen representerer missense mutasjon som svarer til forandringen fra glutaminsyre til asparaginsyre (Glu298Asp). Resultatene fra den direkte sekvensering er vist i fig. 2. Denne figur omfatter resultatene av villtypen uten mutasjon og den heterozygote type.

(3) Screening for mutasjonen fra "G" til <»>T" ved PCR-RFLP

Etter at missense mutasjonen som induserer Glu298Asp ble funnet i exon 7 av eNOS genet som vist i trinn (2), ble alle 96 pasienter med koronar spastisk angina og 86 kontroller screenet for mutasjonen. Denne screening ble utført ved PCR-RFLP (polymerasekjedereaksjon - restriksjonsfragment-lengde-polymorfisme). To typer av restriksjonsenzymet, Banll og Mbol (fra TAKARA) ble anvendt for å forhindre eventuelle feil på grunn av ufullstendig kutting ved restriksjonsenzymer.

Exon 7 av eNOS genet fra alle tilfellene ble amplifisert i henhold til prosedyrene i (ii) i trinn (1). De amplifiserte fragmenter inneholdende exon 7 strekte seg over 248 bp. Deretter ble de amplifiserte fragmenter kuttet med enten Banll eller Mbol i henhold til produsentens instruksjoner. Det ble utført elektroforese på 4% Nusiéve GTG agarosegel av de kuttede produkter for å oppnå et bånd.

Resultatene kan klassifiseres i tre mønstre som vist i fig.

3. Fig. 3A er et restriksjonskart og fig. 3B er et fotografi av resultatet av den faktiske elektroforese. Som vist i fig. 3B gir Banll to fragmenter med lengde 163 bp og 85 bp og Mbol gir et bånd med 248 bp som ikke er kuttet,, i viiltypen uten mutasjonen. Dette viser at viiltypen med mutasjonen har ett restriksjonssete for Banll og intet restriksjonssete for Mbol.

I tilfellet av en homozygot med T/T i posisjon 894 i eNOS cDNA, gir Banll ingen kutting (248 bp), mens Mbol gir to fragmenter med lengde 158 bp og 90 bp. Dette viser at homozygoten ikke har noe restriksjonssete for Banil og ett restriks jonssete for Mbol..

Der er enkelte tilféller som har gitt tre bånd med lengde 248 bp, 163 bp og 85 bp med Banll, og med lengde 248 bp,

158 bp og 90 bp med Mbol. Dette betraktes som heterozygoten (G/T) da hver Banll og Mbol kun gir ett kuttesete i hvert bånd.

På grunnlag av de tre mønstre som er vist over, ble frekvens av eNOS gen Glu298Asp mutasjonen undersøkt på alle tilfellene av koronar spastisk angina og kontrollgrupper. Kutting med begge enzymer ble utført i alle tilfellene. De oppnådde resultater ved anvendelse av disse to enzymer er konsistent blant alle tilfeller.

Glu2 98Asp mutasjon ble funnet i 22 ut av 96 pasienter méd koronar spastisk angina (23%), hvori en er homozygoten og 21 er heterozygoten. På den annen side ble mutasjonen funnet i

7 av 86 kontroller (8%), hvorav alle er heterozygoten.

(4) Statistisk analyse: sammenheng mellom koronar spasme oa

Glu2 98Asp mutasjon eller andre risikofaktorer Mutasjonshyppigheten oppnådd i trinn (3) ble sammenlignet med hyppigheten av andre koronare risikofaktorer som omfatter alder, kjønn, høyt blodtrykk, diabetes mellitus, hyperkolesterolemi, kroppsmasseindeks og røking mellom kontrollgrupper og grupper med koronar spastisk angina ved Kji-kvadratanalyse og uparet t-test med Fishers eksakte sannsynlighet. Videre ble multivariasjonsanalyse {multippel logistikk regresjonsanalyse) utført for å undersøke hvilken faktor som er mest assosiert med den koronare spasme ved SPSS Advanced Statistics 6.1 for Macintosh (SPSS Japan Inc., Japan). Dummy variabler ble anvendt som alle uavhengige variabler som er som følger. Hver tallverdi representerer i gjennomsnitt standardavvik.

Resultatene fra Kji-kvadratanalysen og resultatene fra analyse ved anvendelse av trinnvis foroverseleksjon (Wald) er vist i henholdsvis tabeller 2 og 3 hvor p = 0,05 som betraktes som en signifikant verdi innen statistikk.

Resultater fra statistisk analyse

Av sammenhengene mellom koronar spasme og 61u298Asp mutasjon eller andre risikofaktorer som alder, kjønn, høyt blodtrykk, diabetes mellitus, hyperkolesterolemi, kroppsmasseindeks og røking, var kjønn (p = 0,035), røking (p = 0,00001) og Glu298Asp mutasjon (p = 0,005) signifikante som vist i tabell 2.

Resultatene fra multivariantanalyse (multippel logistisk regresjonsanalyse) er vist i tabell 3. Tabell 3 viser at røking er den første faktor som viser ansvarligheten for koronar spasme (p = 0,0005), og Glu2 98Asp mutasjon er den andre faktor (p = 0,0272). Multippel logistisk regresjonsanalyse viser ingen signifikant sammenheng mellom kjønn og koronar spasme.

Eksempel 2

Deteksjon av mutasjonen 1 exon 6 i eNOS genet

I henhold til prosedyren i eksempel 1 ble genomisk DNA iso-lert fra 10 pasienter med koronar spastisk angina og 9 kontroller. PCR ble gjennomført ved anvendelse av primerne beskrevet i tabell 1, og deretter ble SSCP prosedyren gjennom-ført for å detektere mutasjonen i exon 6. Deretter ble exon 6 sekvensert direkte for å identifisere substitusjonen av basen fra cytosin ' (C) til tymin (T) i posisjon 774 i cDNA av eNOS genet.

Denne substitusjon av basen ble funnet i 4 ut av 10 pasienter med koronar spastisk angina, mens denne substitusjon ikke ble funnet i 9 kontroller (p = 0,03). Denne substitusjon er ikke forbundet med noen forandring av aminosyre.

Eksempel 3

Deteksjon av mutasjonen i 5'- flankeregionen av eNOS genet ( 1) Prosedyrene i eksempel l ble hovedsakelig gjentatt med unntak av anvendelse av følgende primere for å identifisere substitusjonen av basen fra tymin (T) til cytosin (C) i 5<*->flankeregionen (-786) .

PCR-SSCP (-585-T-820 bp; 236 bp)

Denne substitusjon av base ble funnet i 34 ut av 123 pasienter med koronar spastisk angina (27,6%), mens denne substitusjon kun ble funnet i 4 ut av 86 kontroller (4,7%), (P<0,0001).

Eksempel 4

Deteks-ion av mutasjonen i 5'-flankeregionen av eNOS genet ( 2) Prosedyrene i eksempel l ble hovedsakelig gjentatt med unntak av anvendelse av de følgende primere for å identifisere substitusjonen av basen fra adenin (A) til guanin (6) i 5'-flankeregionen (-922) .

PCR-SSCP(-801--1008 bp; 208 bp)

Denne substitusjon av basen ble funnet i 31 ut av 104 pasienter med koronar spastisk angina (29,1%), mens denne substitusjon kun ble funnet i 3 ut av 83 kontroller (3,6%), (P<0,0001).

Eksempel 5

Deteksjon av mutasjonen i 5■-flankere<g>ionen av eNOS genet (3) Prosedyrene i eksempel 1 ble hovedsakelig gjentatt med unntak av anvendelse av følgende primere for å identifisere substitusjonen av basen fra tymin (T) til adenin (A) i 5<*->flankeregionen (-1468).

PCR-SSCP(-1214--1490 bp; 221 bp)

Denne substitusjon av basen ble funnet i 26 ut av 98 pasienter med koronar spastisk angina (26,5%), mens denne substitusjon ikke ble funnet i 26 kontroller (0%), (p<0,0006).

Eksempel 6

Screening for mutasjonene

De fem mutasjoner som er identifisert i de ovennevnte ut-førelseseksempler kan screenes ved f.eks. ASO hybridiseringsmetoden ("Hybridization with Allelic-Specific Oligonucleotides"). Denne ASO hybridiseringsmetoden for omfattende screening er illustrert-i det etterfølgende: 1) utføring av PCR på samme måte som SSCP. I dette tilfellet er slutt volumet 20 pl. Sammensetning av reaksjons- og syklusbetingeIser er dem som er valgt i eksempel l; 2) en 10 pl prøve tas av PCR reaksjonen, en 100 pl prøve av 200 pl 0,5 M NaOH (1,5 M NaCl + 25 mM EDTA2Na) immobiliseres på en nylonmembran for viiltypen, og deretter immobiliseres resten på 100 pl på en nylonmembran for mutanttypen; 3) hver av de immobiliserte nylonmembraner pakkes inn i ulike "Hybribag", pre-hybridiseringsoppløsningen (3 x SSPE, 5 x Denharts reagens, 0,5% SDS, l [ ig/ pl sildespermie DNA) tilsettes til bagene og bagene inkubéres ved 65°C i to timer; 4) den normale probe merket med <32>P (5 x 10<6> dpm/ml) og den unormale probe uten markører innføres i 5 ganger volumet inn i en bag, mens den unormale probe merket med <32>P (5 x IO<6> dpm/ml) og den normale probe uten noen markør innføres i 5 ganger volumet inn i den andre bag; 5} hver bag inkubéres ved 60°C i 30 min. og de inkubéres videre i ytterligere 1 time idet temperaturen nedsettes fra 60°C til X°C hvor X er 53 i eksempel 3, 50 i eksempel .4, 46 i eksempel 5; 6) nylonmembranene tas ut av bagene og membranene inkubéres 2 ganger i 2 x SSPE (0,1% SDS) ved romtemperatur i 10 min. og deretter inkubéres de en gang i 5 x SSPE (0,1% SDS) ved X°C i 10 min; 7) nylonmembranene pakkes inn i Såran innpakning, de anbring-es på røntgenfilm og røntgenfilmen fremkalles (autoradio-grafi) .

Eksempel 7

Screening for mutasjonene i exon 6 oa 5'-flanker egionen av eNOS genet

Ved den direkte sekvenseringsraetode som beskrevet i eksempel 2, 3 og 5 ble substitusjonen av basen fra cytosin (C) til tymin (T) i posisjon 774 i cDNA av eNOS genet, så vel som substitusjonene fra tymin (T) til cytosin (C) i posisjon -786 og fra tymin (T) til adenin (A) i posisjon -1468 i 5'-flankeregionen av eNOS genet identifisert. Screening for disse mutasjoner ble utført ved PCR-RFLP metoden. Oligonukleotider og betingelser for amplifikasjonen i denne PCR er vist i tabeller 4 og 5:

(1) Mut as-i on i exonjS

I henhold til prosedyrene i trinn (2) i eksempel 1 ble exon 6 av eNOS genet i en prøve amplifisert ved anvendelse av primerne beskrevet i tabell 5 og betingelsene for amplifikasjon beskrevet i tabell 5. Det oppnådde amplifiserte fragment (232 bp) ble kuttet med Pokl i henhold til produsentens instruksjoner, og det ble gjennomført elektroforese for de kuttede produkter på 10% polyakrylamidgeler for å identifisere båndene. Da Foki kun kan kutte mutantgenet, ble det funnet at homozygoten med C/C gir båndet 232 bp, heterozygoten med C/T gir båndene 232 bp, 133 bp og 99 bp, og homozygoten med T/T gir båndene 133 bp og 99 bp. Resultatene fra screeningen ved PCR-RFLP er vist i fig. 4.

(2) - Mutas-ion i posis-ion -766 i 5'-flankere<g>ionen

I henhold til prosedyrene i trinn (2) i eksempel 1 ble en del omfattende mutasjonen i posisjon -786 i 51 -flankeregionen av eNOS genet i en prøve amplifisert ved anvendelse av primerne beskrevet i tabell 5 og amplifikasjonsbetingelsene beskrevet i tabell 5. Det oppnådde amplifiserte fragment (354 bp) ble kuttet med Mspl i henhold til produsentens instruksjoner og det ble gjennomført elektroforese på de kuttede produkter på 10% polyakrylamidgeler for å identifisere båndene. Mspl kutter homozygoten av villtypegenet (T) på ett sted til å gi to bånd på 196 bp og 158 bp. På den annen side kutter Mspl homozygoten av mutantgenet (G) på to steder til å gi tre bånd på 158 bp, 154 bp og 44 bp. Resultatene av screeningen ved PCR-RFLP er vist i fig. 5.

(3) Mutasjonen i posisjon -14S8 i 5'-f lankeregionen

I henhold til prosedyrene i trinn (2) i eksempel l ble en del omfattende mutasjonen i posisjon -1468 i 5'-flankeregionen av eNOS genet i en prøve amplifisert ved anvendelse av primerne beskrevet i tabell 5 og amplifikasjonsbetingelsene beskrevet i tabell 5. Det oppnådde amplifiserte fragment (627 bp) ble kuttet med Mbol i henhold til produsentens instruksjoner og det ble gjennomført elektroforese på de kuttede produkter på 10% polyakrylamidgeler for å identifisere båndene. Mbol kutter homozygoten av villtypegenet (T) på ett sted til å gi to bånd på 515 bp og 112 bp. På den annen side kutter Mbol homozygoten av mutantgenet (A) på to steder til å gi tre bånd på 515 bp, 61 bp og 41 bp. Resultatene av screeningen ved PCR-RFLP er vist i fig. 5. (4) Mutasjonen i posis-ion -922 i 5 ■-flankeregionen Denne mutasjon ble detektert ved PCR-SSP (sekvensspesifikk primer). Hver av de to typer av primere for fremover og bak-over ekstensjon {totalt fire arter) ble utformet til å ekstendere fra "A" eller "G" i posisjon -922 til 3'-retning-en. Disse primere er de samme som dem beskrevet i (b). og (c) i tabell 4. En sense og en anti-sense primer {to arter) som skal pares til disse primere ble utformet slik at regionen som skal *amplifiseres inneholder mutasjonen i henholdsvis posisjon -1468 og -786. PCR prosedyren viste at homozygoten inneholdende A/A i posisjon -922 kan amplifiseres ved kun primer med "A" eller "T" (komplementær sekvens) i 3<*> origo, mens homozygoten inneholdende G/G kan amplifiseres ved kun primer med "G" eller "Ctt (komplementær sekvens) i 3'-side enden.

De oppnådde amplifiserte fragmenter er de samme som dem oppnådd i ovennevnte {2) og (3). Ved undersøkelse av de amplifiserte fragmenter i noen prøver ble det funnet at det amplifiserte fragment (354 bp) oppnådd i ovennevnte (2) som er avledet fra allelet med "A" i posisjon -922 {villtype) kun gir villtype med "T" i posisjon -786, mens det amplifiserte fragment (354 bp) oppnådd i ovennevnte (2) som. er avledet fra allelet med "G" i posisjon -922 (mutanttype) kun gir mutanttype med "G" i posisjon -786. Likeledes gir det amplifiserte fragment (627 bp) av ovennevnte (3) som er avledet fra allelet med "A" i posisjon -922 (villtype) kun villtype. med "T" i posisjon -1468, mens det amplifiserte fragment (627 bp) av ovennevnte (3) som er avledet fra allelet med "G" i posisjon

-922 (mutanttype) kun gir mutanttype med "A" i posisjon -

1468. Disse funn viser at i henhold til en bestemt utførel-sesform kan alle de ovennevnte mutasjoner i 5'-flankeregionen danne en kobling for å være på det samme allel, noe som indikerer at når en ut av tre mutasjoner detekteres da kan de andre to mutasjoner være tilstede.

Som vist i det foregående har de foreliggende oppfinnere fremsatt en hypotese om at mutasjoner i eNOS genet kan være ansvarlig for.en nedgang i aktiviteter av NOS genet og hvis nedgang kan indusere koronar spasme, og man har gjennomført noen forsøk for å understøtte denne hypotese. Når hypotesen er sann, er den i overensstemmelse med det faktum at koronar spasme ikke kun skjer i en gren, men også i flere grener (8). Mutasjon Glu298Asp som vist i eksempel 1 er tidligere rapportert av Marsdeh, et al. (24), men signifikansen av mutasjonen var ikke beskrevet deri.

I eksempel 1 ble mutasjonen Glu298Asp funnet i 23% av pasienter med koronar spastisk angina, mens kun i 8% av kontrollene, noe som indikerer at hyppigheten av mutasjonen i angina-gruppen er signifikant høyere sammenlignet med den i kontrollgruppen. Resultatet av multivariasjonsanalysen viser at sammenhengen mellom den koronare spasme og mutasjonen Glu298Asp betraktes til å være signifikant.

Det kan overveies at, siden raten av denne mutasjon i gruppen med koronar spasme er kun 23%, kan den koronare spasme for de resterende 77% av pasientene skyldes patogene faktorer annet enn denne mutasjon. De foreliggende oppfinnere har fremsatt en hypotese om at mutasjoner kan eksistere i regioner som inkluderer promoteren og introner annet enn exon 7 av eNOS som er beskrevet i eksempel 1, og gjennomført enkelte forsøk for å finne resultater som understøtter hypotesen (eksempler 2-5) . Når sammenhengen mellom disse mutasjoner følgelig undersøkes nærmere, vil dette kunne føre til mere pålitelige diagnoser for koronar spasme-assosierte sykdommer.

Man kan alternativt overveie at den koronare spasme kan skyldes ikke bare eNOS genet, men også andre gener. Videre bør det bemerkes at koronar spasme ikke bare kan skyldes genetiske faktorer men også livsforholdsfaktorer, idet pasienter med den familiære anfallstype av koronar spasme er rela-tivt få. Røking er vist til å være en av risikofaktorene for den koronare spasme i eksempel 1. Dette resultat er i overensstemmelse med tidligere rapporter (30, 31). Resultatene fra den multiple logistiske regresjonsanalyse i den foreliggende beskrivelse viser at røking er den mest domi-nante faktor blant alle risikofaktorer inkluderende mutasjon, noe som indikerer at livsforholdfaktorene er ekstremt viktige i patogenesen av koronar spasme. Andre undersøkelser har også indikert at røking fører til endotelskader {32, 33).

Mutasjonen Glu298Asp er blitt funnet i 8% av kontrollene

{786, eksempel 1). Grunnen til dette har man ikke helt for-stått, men det skal bemerkes at siden seks individer er ikke-røkere blant syv individer som har mutasjonen, er disse seks individer uten forbindelse til røking som er den sterke risi-kofaktor. Vanskeligheter med diagnostisering av den koronare spasme bør også tas i betraktning. Den koronare spasme kan oversees av visse grunner, og det tilfellet som burde vært utpekt til den koronare spastiske gruppen er blitt utpekt til kontrollgruppen av følgende årsaker:

1) anfallet er sannsynligvis oversett fordi anfall ofte skjer fra midnatt til tidlig morgen og det forekommer generelt ikke på dagtid; 2} administrering av acetylcholin inn i koronararterien vil ikke alltid indusere koronar spasme, og den koronare spasme er ofte avhengig av sykdommens aktivitet som koronar spastisk angina; 3) over to tredjedeler av anfall av koronar spasme er stille (sub-klinisk) ; 4) selv om resultatet fra undersøkelsen ikke viser at man har koronar spastisk angina, kan angina forekomme i fremtiden. I motsetning til dette, er gruppen med koronar spastisk angina heri en populasjon av de tilfellene som er blitt

sikkert diagnostisert til å ha koronar spasme ved hjelp av koronar arteriografi.

Ved den foreliggende oppfinnelse har man for første gang vist at koronar spasme skyldes genetiske faktorer såvel som faktorer i forbindelse med livsforhold, og en bedre diagnostisk metode for koronar spasme-assosierte sykdommer kan tilveie-bringes .

Litteraturen som det er vist til i det foregående er angitt som følger:

Litteratur

i

1) Etillis LD, Braunwald E, Coronary-artery- spasm. N Engl J Med. 1978;299:695-702 2) Conti CR. Coronary artery. spasm and myocardial infarction. N Engl J Med. 1983;309:238-23? 3) Yasue H, Omote S, Takizawa A, Nagao M. Coronary arterial spasm in iscnemic heart disease and its pathogenésis. A review:Circ Res. 1983 ;52

-(Supplel):147-152.

4) Maseri A, Davies G, Hackett D, Kaski JC. Coronary artery spasm and

vasoconstriction. The case for a distinction. Circulation. 1990;81:1983-1991

5) Yasue H, Nagao M, Omote S, Takizawa A, Miwa K, Tanaka S. Coronary

artery spasm- and Prinzmetars variant form of angina induced- by hyperventilatidn and tris-buffer infusibn. Circulation. 1978;58:56-62 6) Yasue H, Omote S, . Takizawa A, Nagao M, Miwa K, Tanaka S.

Circadianvariation of exercise oapacity in .patients with Prinzmetars variant angina. Role • of exercise-induced coronary artery spasm. Circulation.

1979;59:938-948 7) Yasue Et, Horio Y, Nakamurå N, Fujii H, Imoto N, Sonoda R, Kugiyama K,

Obata K, Morikami Y, Kimura T. Induction of coronary artery spasm by acetylcholine in patients with variant angina: possible role of the parasympathetic ne.rvoiis system in the pathogenesis of coronary artery spasm. Circulation. 1986;74:955-963 8) Okumura K, Yasue H, Horio Y, Takaoka K, Matsuyama K, Kugiyama K, Fujii H, Morikami Y. Multivessel coronary spasm in patients with variant angina: a study with intracoronary injection of acetylcholine. Circulation.

198B;77:535-542 9) Moncada S, Palmer RM, Higgs EA. Nitric oxide: physiology,

pathophysiology and pharmacology. Pharmacol Rev.. 1991;43:109-142

10) Yasue H. Pathogenesis and clinical features of coronary spasm. J Jap Soc

Intern Med 1995;84:1407-1415

11) Bredt DS, Hwang PM, Glatt CE,-Lowenstein C, Reed RR, Synder SH. Cloned and expressed nitric oxide synthase structurally resembles cytochrome P-450 reductase. Natuje. 1991;351:714-718 12) Nakåne M, Schmidt HHW, Pollock JS, Fdrstermann U,. Murad F.Cloned human brain nitric oxide synthase is highly expressed in skeletal muscle FEBS Let. 1993:316:175-180 13) Lyons, CR, Orloff GJ, Cunningham JM; Molécular cloning and

functionål- expression of an inducible nitric oxide synthase from a murine macrophage cell line J Biol Chem. 1992;267:6370-6374

14) Xie Q; Cho HJ, Cålaycay J, Mumford RA, Swiderek KM, Lee TD, Ding

A.Troso T, Nathan C. Cloning and characterization of inducible nitric. oxide synthase from mouse macrophage Science. i992;256:225-228

15) Lowenstein CJ, Glatt CS; Bredt DS, Synder SH. Cloning and expressed

macrophage nitric oxide synthase contrasts with the brain enzyme Proe Nati Acad Sei U.S.A. 1992;89:6711-6715

16) Geiler DA, Lowenstein CJ, Shapirb RA, Nussler AK. Di Silvio M, Wang

SC, Nakayama DK, Simmons RL, Snyder SH, Billiar TR. Molécular cloning and expression of inducible nitric oxide synthase from human hepatocytes.

Proe Nati Acad Sei USA. 1993;90:3491-3495 17) Chartrain N, Geiler D, Koty P, Sitrin N, Nussler Å, Hoffmann E, Billiar T,

Hutchinson N, Mudgett Jf. Molécular cloning.structure, and chromosomal localization of the human inducible nitric oxide synthase gene. J Biol Chem.

1994;269:6765-6772

18) Lamas S, Marsden PA, Gordon KL, Tempst P, Michel T. Endothelial nitric oxide synthase: Molécular cloning and characterization of a distinct constitutive enzyme isoform.Proc Nati Acad Sei. 1992;89:6348-6352 19) Sessa, WC, Harrison JK,Barber CM, Zeng D, Durieux ME, D'Angelo DD, Lynch KR, Peach MJ. Molécular cloning ånd expression of a c DNA encoding endotheliål cell nitric oxide synthase J Bio Chem. 1992;267:15274-15276 20) Nishida K, Harrison DG, Navas JP, Fisher AA, Docery SP, Uematsu M, Nerem RM, Alexander RW, Murphy TJ. Molécular cloning . and characterization of the constitutive bovine aortic endotheliål cell nitric oxide synthase J Clin Invest. 1992;90:2092-2096 21) . Janssehs SP, Shimouchi A, Quétenhous f, Bloch DB, Bloch KD Clbning and expression of a cDNA encoding human enddthelium-derived relaxing factor/nitric oxide synthase. J Biol Chem. 1992;267:145l9^14522 22) Mårsden PA, Schappert KT, Cheri HS, Flowers M, Sundell CL, Wilcox JN, Lamas S, Michel T. Molécular cloning and characterization of human ehddtheiial nitric oxide synthase FEBS Lett. 1992;307:287-293 23) Nadåud S, Bdnnårdéaux A, Lathrop GM, Sdubrier F. Gene stmcturé, polymorphism and mapping of .the human endotheliål nitric oxide synthase gene. Biochém BiOphys Res Commun. 1994;198:1027-1033 24) Marsden PA, Heng HHQ, Scherer SW, Stewart RJ, Hall AV, Shi XM, Tsui LC, Schappert KT. Structure and chromosomal localizatkm of the human , constitutive endotheliål nitric oxide synthase gene. J Bidi Chem. 1 1993;268:17478-17488 25) Miyahara K, Kawamdto T, Sase K, Yui Y, Toda K, Yangy^LX, Hattori R, ' Aoyama T, Yamamoto Y, Doi Y, Ogoshi S, Hashimoto K, Kawai C, Sasayama S,Shizuta Y. Cloning and structurål characterization of the human endotheliål nitric-qxide^synthase gene Eur J Biochem. 1994;223:719-726 26) Yasue H, Kugiyama K* Cdronary artery spasm: Japånese view.

"Coronaryartery disease. 1990;1:668-673

27) Bertrand ME, LaBlanche JM, Tilmånt PY, Thieuleux FA, Delforge MR,

Carre AG, Asseman PA, Bérzih B, Libersa C, Laurent JM. Frequency of proyoked coronary arterial spasm in 1089 consecutive patients undergoing coronary arteriography. Circulation. 1982;65:1299-1306" 28) Saiki RK, Scharf S, Faloona F;Muliis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim.

N. Hnzymatic amplification of Æ -globin genomic sequences and restriction.

site analysis for diagnosis of sickle ell anemia. Science. 1985;230:1350-<1>

•1354 29) Orita M, Suzuki Y, Sekiya T, Håyashi K. Rapid and sensitive, detection of point mutation and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction. Genomics. 1989;5:874-879 30) Dennis G. Caralis, Ubeydullåh Deligonul, Morton J. Kern, Jerome D.!

Cbhen. Smoking is a fisk factor for coronary spas. ih young women.

Circuiation. 1992;85:905-909

31) Sugiishi M, Takatsu F. Cigarette smoking is a major risk factor for coronary spasm. Circulation. 1993;87:76.-79 32) Celermajer DS, Sofensen KE, Georgakopbulos D, Bull C,' Thomas O,' Robinsbn J, Déanfield JÉ. Cigarette smoking is asso.ciated with dose-rélated and potentially revérsible impairment of endothelium-depéndént dilatibn in healthy young adults. Circulation. 1993;88:2149-2155 33) Zeiher AM, Schåchinger V, Minners J. Long-térm sigarette smoking .impairs endothelium-dépehdent coronary arterial vasodilator function. Circulation.. 1995;92:1094-1100 34) Yasue H, Takizawa A,Nagao M, Nishida S, Horie M, Kubota J, Omote S.Takaokå K, Okumra K. Lohg-term prognosis for patients with variant angina and influential factors. Circuldtion.78<l-9:1988 35) Egashira K et.al. Preserved Éndothelium-dependent Vasodilation at the Vasospastic Site in Patients with Variant Angina. Endotheliål Function and Coronary Vasbspasm Vol.89: 1047-1052:1992

Claims (13)

1. Fremgangsmåte for å diagnostisere en koronararteriespasme-assosiert sykdom, karakterisert ved at den omfatter deteksjon av tilstedeværelsen av en eller flere nukleotidforandringer i endotelial nitrogenoksydsyntase (eNOS) genet, hvilke forandringer er valgt fra en gruppe som omfatter forandringene fra guanin (G) til tymin (T) i posisjon 894 og fra cytosin (C) til tymin (T) i posisjon 774 av cDNA sekvensen av eNOS genet, og forandringene fra tymin (T) til cytosin (C) i posisjon -786, fra adenin (A) til guanin (G) i posisjon -922 og fra tymin (T) til adenin (A) i posisjon -1468 i 5•-flankeregionen av eNOS genet, såvel som forandringene i de tilsvarende posisjoner i komplementærtråden derav.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, som omfatter deteksjon av tilstedeværelsen av to eller flere nukleotidforandringer valgt fra hvilke som helst nukleotidforandringer i eNOS genet, og hvilken som helst nukleotidforandringer i 5'-flankeregionen derav.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, hvori den koronararteriespasme-assosierte sykdom er angina.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, hvori den koronararteriespasme-assosierte sykdom er koronar spastisk angina.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, hvori deteksjonen av tilstedeværelsen av forandringene gjennomføres ved å amplifisere den relevante region til exon 7 i det cDNA som koder for eNOS ved hjelp av PCR, kutting av de amplifiserte fragmenter med restriksjonsenzymene Banll og/eller Mbol og elektroforesebehandling av fragmentene kuttet med enzymet.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, hvori deteksjonen av tilstedeværelsen av forandringene gjennomføres ved å amplifisere den relevante region til exon 6 i det cDNA som koder for eNOS ved hjelp av PCR, kutting av de amplifiserte fragmenter med restriksjonsenzymet Foki og elektroforesebehandling av fragmentene kuttet med enzymet.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav l, hvori deteksjonen av tilstedeværelsen av forandringene gjennomføres ved å amplifisere en del omfattende -786 posisjonen i 5'-flankeregionen av eNOS genet ved hjelp av PCR, kutting av de amplifiserte fragmenter med restriksjonsenzymet Mspl og elektroforesebehandling av fragmentene kuttet med enzymet.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, hvori deteksjonen av tilstedeværelsen av forandringene gjennomføres ved å amplifisere en del omfattende -1468 posisjonen i 5'-flankeregionen av eNOS genet ved hjelp av PCR, kutte de amplifiserte fragmenter med restriksjonsenzymet Mbol og elektroforesebehandle fragmentene kuttet med enzymet.

9. Kit for diagnostisering av koronararteriespasme-assosiert sykdom, karakterisert ved at det omfatter et amplifikasjonsoligonukleotid for å amplifisere exon 7 i det cDNA som koder for human eNOS, exon 6 i det cDNA som koder for human eNOS, en del som omfatter -786 posisjonene i 5'-flankeregionen av det humane eNOS-genet, eller en del som omfatter -1469 posisjonene i 5 *-flankeregionen av det humane eNOS genet.

10. Kit som angitt i krav 9, som omfatter et amplifikasjonsoligonukleotid for å amplifisere exon 7 i det cDNA som koder for eNOS ved PCR,'og restriksjonsenzymet/restriksjonsenzymene Banll og/eller Mbol.

11. Kit som angitt i krav 9, som omfatter et amplifikasjons-oligonukleot id for å amplifisere exon 6 i det cDNA som koder for eNOS ved PCR, og restriksjonsenzymet Foki.

12. - Kit som angitt i krav 9, som omfatter et amplifikasjons-oligonukleot id for å amplifisere en del som omfatter -786 posisjonen i 5'-flankeregionen av eNOS genet ved PCR, og restriksjonsenzymet Mspl.

13. Kit som angitt i krav 9, som omfatter et amplifikasjons-oligonukleot id for å amplifisere en del som omfatter -1468 posisjonen i 5'-flankeregionen av eNOS genet ved PCR, og restriksjonsenzymet Mbol.