KR100449060B1

KR100449060B1 - 관연축관련질환의진단

Info

Publication number: KR100449060B1
Application number: KR10-1998-0702818A
Authority: KR
Inventors: 히로후미 야스에; 미찌히로 요시무라
Original assignee: 시오노기세이야쿠가부시키가이샤
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 2004-11-16
Also published as: AU7586596A; NO982162D0; CN1202205A; EP0875581A1; IL124348A; HUP0000177A3; EP0875581A4; HU226469B1; KR19990064321A; WO1997018327A1; NZ322185A; CN1165628C; HUP0000177A2; JP3928140B2; AU710395B2; IL124348A0; ATE351920T1; RU2185442C2; NO323560B1; DE69636856D1

Abstract

혈관내피형 일산화 질소 합성효소 (eNOS) 유전자의 특이 뉴클레오티드의 변화 유무를 판정하는 것을 포함하는 관연축 관련질환의 유전자를 스크리닝하는 방법. 이 방법은 종래 방법에 의해 통상적으로 스크리닝되지 않는 관연축 협심증과 같은 관연축 관련질환의 진단을 용이하게 한다.

Description

관연축 관련질환의 진단 {DIAGNOSIS OF DISEASES ASSOCIATED WITH CORONARY TWITCHING}

생체내 일산화질소 (생체내 NO) 는 최근 생체내에 동정 (同定) 된 물질이며, 혈관확장물질 (18-25) 이나 신경전달물질로서 (11,12), 또는 면역반응물질 (13-17) 로 작용하는 일이 나타나 있다. 생체내 (NO) 는 L-아르기닌으로부터 합성되며 그 합성에는 3 개 이상의 일산화질소 합성효소 (nitric oxide synthase : NOS), 즉 신경형 NOS, 혈관내피형 NOS 및 매크로파지형 NOS 가 하나의 패밀리로 관여한다. 신경형 NOS 와 혈관내피형 NOS 는 각각 구성형으로서 세포내의 칼슘 농도에 의존하여 그 활성은 증대한다. 한편, 매크로파지형 NOS 는 칼슘 비의존성으로서 염증에 따라 활성화한다. 최근 몇몇의 그룹에서 혈관내피형 NOS (endothelial cell nitric oxide synthase : eNOS) 의 유전자 구조가 나타나고, 그 eNOS 유전자는 제 7 염색체의 7q35-36 에 존재하는 것으로서 26 의 엑손으로 이루어지며 그리고 21kb 의 길이를 갖는 것이 보고되었다 (18-25).

발명의 개시

관동맥의 연축 (관연축) 은 관연축성 협심증 또는 이형 협심증을 생기시키는데, 관연축은 그 밖에도 널리 허혈성 심질환에 있어서 그 발증요인의 커다란 인자로 생각되고 있다 (1-6). 그렇지만 관연축의 메카니즘은 아직 거의 해명되어 있지 않다.

그래서, 관연축의 메카니즘이 해명돼면 관연축이 관련된다고 생각되는 허혈성 질환을 조기에 진단하여 처치할 수 있다고 생각하여 예의 연구를 거듭하였다. 그리고, 지금까지의 보고에서는 관연축의 발증 메카니즘으로서 혈관내피의 장해라기 보다는 평활근의 과수축성 (hyper-contractility) 이 문제라는 지적이 많다 (35).

아세틸콜린은 평활근에 작용하여 그것을 수축시키는데, 내피가 정상인 경우에는 내피에서 일산화질소 (NO) 를 분비시켜 분비된 NO 가 혈관평활근에 작용한 결과 혈관을 확장시킨다. 그러나, 관연축성 협심증의 증례에 아세틸콜린 관동맥내 투여를 행하면 혈관은 확장되지 않고 관연축이 유발된다 (7,8). 본 발명자들은 이 사실에 주목하여 관연축성 협심증의 증례에서는 아세틸콜린 유발의 NO 의 기초분비가 저하된 것을 이미 나타내고 있다 (10).

그리고, 니트로글리세린이나 아질산제는 생체내에서 NO 로 되어 혈관을 확장시키는데, 미리 NO 합성을 억제해 둔 혈관에 대한 아질산제의 반응은 과민한 것 (9), 및 관연축성 협심증의 관동맥이 니트로글리세린에 대하여 과민하게 반응하는 것 (6) 으로 보아도 관연축성 협심증의 관동맥에서는 NO 의 기초분비가 저하하고 있는 것을 생각할 수 있다. 이상과 같은 결과로부터 관연축과 NO, 상세하게는관연축과 NO 를 분비하는 내피 사이에는 많은 관련이 있다고 생각된다. 지금까지 NO 의 기초분비의 저하라는 사실만으로 관연축과 NO 의 내피의 관련에 주목한 보고는 없다.

한편, 관연축은 구미인보다 일본인에게 많은 질환으로서 (26,27), 그 점에서 그 발병인자에 유전적인 배경이 있는 것은 아닌지 생각된다.

이상의 지견을 바탕으로 본 발명자들은 생체내 NO 를 합성하기 위한 NOS 중 혈관내피형 일산화질소 합성효소 (endothelial cell nitric oxide synthase:eNOS) 의 유전자에 주목하여 그것이 관연축의 발증에 관여하는지의 여부를 검토한 결과 본 발명을 완성하였다.

발명의 개요

즉, 본 발명은 혈관내피형 일산화질소 합성효소 (eNOS) 유전자의 뉴클레오티드의 변화로서, 그 cDNA 로서 894 번째의 구아닌 (G) 에서 티민 (T) 으로의 변화 및 774 번째 시토신 (C) 에서 티민 (T) 으로의 변화, 그리고 eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역의 뉴클레오티드의 변화로서, -786 번째의 티민 (T) 에서 시토신 (C) 으로의 변화, -922 번째의 아데닌 (A) 에서 구아닌 (G) 으로의 변화 및 -1468 번째의 티민 (T) 에서 아데닌 (A) 으로의 변화, 혹은 그들의 상보쇄에서의 대응하는 변화 중에서 선택되는 어느 한 개 또는 두 개 이상의 변화의 유무를 판정하는 것을 특징으로 하는, 관연축 관련질환 유전자의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 eNOS 유전자내의 변화 중 어느 한 개 및 그 5′프랭킹 영역내의 변화의 한 개 또는 두 개 이상의 변화의 유무를 판정하는 방법, 특히 바람직하게는 관연축 관련질환이 협심증인 방법, 더욱 바람직하게는 관연축 관련질환이 관연축성 협심증인 방법이다.

다른 양태로서 본 발명은 상기 변화를 제한효소에 의한 절단의 유무에 따라 스크리닝하는 RFLP 를 이용하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로는 eNOS 를 코드하는 cDNA 상, 엑손 7 에 상당하는 부분을 PCR 에 의해 증폭하여 그 증폭 프래그먼트를 제한효소 BanⅡ 및/또는 MboⅠ 에 의해 처리하고, 이어서 효소처리한 프래그먼트를 전기영동에 작용시킴으로서 변화의 유무를 판정하는 방법, 및 마찬가지로 eNOS 를 코드하는 cDNA 상, 엑손 6 에 존재하는 변화를 제한효소 FokⅠ 에 의해, eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역중 -786 번째의 변화를 제한효소 MspⅠ 에 의해, eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역중 -1468 번째의 변화를 제한효소 MboⅠ 에 의해 처리하여 변화의 유무를 판정하는 방법에 관한 것이다.

그리고, 본 발명은 본 발명방법을 실시하기 위한 키트, 즉 eNOS 를 코드하는 cDNA 상, 엑손 7 에 상당하는 부분을 PCR 에 의해 증폭하기 위한 증폭용 올리고뉴클레오티드 및 제한효소 BanⅡ 및 /또는 MboⅠ 을 포함하는, 관연축 관련질환을 진단하기 위한 키트 ; eNOS 를 코드하는 cDNA 상, 엑손 6 에 상당하는 부분을 PCR 에 의해 증폭하기 위한 증폭용 올리고뉴클레오티드 및 제한효소 FokⅠ 을 포함하는, 관연축 관련질환을 진단하기 위한 키트 ; eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역중 -786 번째를 포함하는 부분을 PCR 에 의해 증폭하기 위한 증폭용 올리고뉴클레오티드 및 제한효소 MspⅠ 을 포함하는, 관연축 관련질환을 진단하기 위한 키트 ; eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역중 -1468 번째를 포함하는 부분을 PCR 에 의해 증폭하기 위한증폭용 올리고뉴클레오티드 및 제한효소 MboⅠ 을 포함하는, 관연축 관련질환을 진단하기 위한 키트에 관한 것이다. 그리고, 본 발명 키트에 포함되는 증폭용 올리고뉴클레오티드는 이하에 나타내는 표 1 에 기재된 것 이외의 올리고뉴클레오티드라도 되고, 그것은 eNOS 의 게놈 DNA 의 배열을 참조하여 어느 것도 사용할 수 있다.

그리고, 본 발명은 관연축 관련질환에 부수 (附隨) 되는 eNOS 유전자의 상기 뉴클레오티드의 변화 중에서 선택되는 어느 한 개 또는 두 개 이상의 변화의 유무를 판정하는 것을 특징으로 하는, 관연축 관련질환의 진단방법에 관한 것이다.

본 발명은 특정질환의 진단에 응용할 수 있는 기술에 관한 것으로써, 상세하게는 관연축 (冠攣縮) 관련질환 유전자의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

도 1 은 eNOS 유전자의 엑손 7 을 포함하는 DNA 프래그먼트를 PCR-SSCP 해석에 적용시킨 전기영동의 결과를 나타내는 도면을 대신한 사진이다. 화살표는 밴드상의 시프트 (shift) 를 나타낸다.

도 2 는 eNOS 유전자의 엑손 7 을 포함하는 DNA 프래그먼트의 PCR-SSCP 로 변이가 있는 증례 (변이형) 와 변이가 없는 증례 (정상형) 를 직접 시퀀싱한 결과를 나타내는 그래프이다. 변이형에서는 헤테로접합체의 결과를 나타낸다.

도 3 은 eNOS 유전자의 엑손 7 을 포함하는 DNA 프래그먼트를 PCR-RFLP 에 의해 스크리닝한 결과를 나타내고 있다. 제한효소는 BanⅡ 및/또는 MboⅠ 을 사용하고 있다. 도 3 (a) 는 그 제한효소지도이다. 도 3 (b) 는 실제의 전기영동의 결과를 나타내는 도면을 대신하는 사진이다.

도 4 는 eNOS 유전자의 엑손 6 을 포함하는 DNA 프래그먼트를 PCR-RFLP 에의해 스크리닝한 결과를 나타내는 전기영동의 결과를 나타내는 도면을 대신하는 사진이다. 제한효소는 FokⅠ 을 사용한다.

도 5 는 eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역중 -786 번째 및 -1468 번째를 포함하는 DNA 프래그먼트를 각각 PCR-RFLP 에 의해 스크리닝한 결과를 나타내는 전기영동의 결과를 나타내는 도면을 대신하는 사진이다. 제한효소는 -786 번째의 변화에서는 MspⅠ 을, -1468 번째의 변화에서는 MboⅠ 을 사용한다.

발명의 개시

상기와 같이 본 발명자들은 eNOS 유전자에 주목하여 그것이 관연축의 발증에 관여하는지의 여부를 검토한 결과 다음 사실을 발견하였다.

A)eNOS 유전자의 엑손 내의 변이

1)엑손 7 에서의 변이 : eNOS 를 코드하는 cDNA 상, 894 번째에서의 구아닌 (G) 이 티민 (T) 으로 변이

PCR-SSCP (polymerase chain reaction - single-strand conformation polymorphism) 와 직접 시퀀스법을 사용하여 관연축성 협심증 환자로부터 얻은 eNOS 유전자의 엑손 7 에 점변이 (point mutation) 가 인정되었다. 그 변이는 GAG 에서 GAT 로의 변화로서, 아미노산에서는 글루타민산에서 아스파라긴산으로 변화시키는 변이 (Glu298Asp) 이었다. 이 변이에 대하여 96 명의 관연축성 협심증과 86 명의 컨트롤 증례를 스크리닝하여 관연축성 협심증군에서는 22 명, 컨트롤군에서는 7 명에게 변이가 인정되었다.

2)엑손 6 에서의 변이 : eNOS 를 코드하는 cDNA 상, 774 번째에서의 시토신(C) 이 티민 (T) 으로 변이

PCR-SSCP 법을 사용하여 관연축성 협심증 환자 10 명 중 4 명에게 이 염기치환을 발견하였다. 한편, 컨트롤군의 9 명에게는 이 염기치환이 인정되지 않았다 (P=0.03). 그리고, 이 치환은 아미노산 변화를 초래하지 않는다.

B)eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역에서의 변이

eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역에 몇 개의 변이를 발견하여 그들의 변이와 관연축 질환의 상관성을 평가하여 이하의 결과를 얻었다.

1)5′프랭킹 영역 (-786) 의 티민 (T) 이 시토신 (C) 으로 변이

PCR-SSCP 법을 이용하여 관연축성 협심증 환자 123 명 중 34 명 (27.6%) 에게 이 염기치환을 발견하였다. 한편, 컨트롤군에서는 86 명 중 4 명 (4.7 %) 밖에 이 염기치환이 인정되지 않았다. (P ＜ 0.0001)

2)5′프랭킹 영역 (-922) 의 아데닌 (A) 이 구아닌 (G) 으로 변이

PCR-SSCP 법을 이용하여 관연축성 협심증 환자 104 명 중 31 명 (29.1%) 에게 이 염기치환을 발견하였다. 한편, 컨트롤군에서는 83 명 중 3 명 (3.6 %) 밖에 이 염기치환이 인정되지 않았다. (P ＜ 0.0001)

3) 5′프랭킹 영역 (-1468) 의 티민 (T) 이 아데닌 (A) 으로 변이

PCR-SSCP 법을 이용하여 관연축성 협심증 환자 98 명 중 26 명 (26.5%) 에게 이 염기치환을 발견하였다. 한편, 컨트롤군 26 명 에게는 이 염기치환이 인정되지 않았다 (0 %). (P ＜ 0.0006)

앞서 발견된 eNOS 유전자의 변이는 관연축 관련질환의 진단에 유용하다.

「관연축 관련질환」 이란 본 명세서에서는 협심증, 특히 관연축성 협심증, 이형 협심증, 불안정 협심증, 노작성 협심증, 안정 협심증, 급성심근경색, 또는 미소혈관질환 (microvasculor disease) 등을 의미한다.

본 발명으로 증명된 관연축과 eNOS 유전자 변이의 관련성에 의해 관연축 관련질환이 의심되는 환자로부터 입수한 eNOS 유전자 및 그 5′프랭킹 영역에서의 상기 변이를 확인하면 그 환자는 관연축 관련질환의 커다란 위험인자를 지니고 있다고 추정할 수 있다. 이들 변이는 어느 한 개라도 관연축 관련질환의 지표로 할 수 있는데 두 개 이상의 변이가 발견되면 보다 확실한 지표로 할 수 있다. 또한, eNOS 유전자 영역 및 그 5′프랭킹 영역 모두 변이가 인정되면 중독 (重篤) 한 관연축 관련질환을 나타낸다는 것도 발견되어 있다.

이와 같이, 본 발명은 혈관내피형 일산화질소 합성효소 (eNOS) 유전자의 뉴클레오티드의 변화로서 그 cDNA 로서 894 번째의 구아닌 (G) 에서 티민 (T) 으로의 변화 및 774 번째의 시토신 (C) 에서 티민 (T) 으로의 변화, 그리고 eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역의 뉴클레오티드의 변화로서 -786 번째의 티민 (T) 에서 시토신 (C) 으로의 변화, -922 번째의 아데닌 (A) 에서 구아닌 (G) 으로의 변화 및 -1468 번째의 티민 (T) 에서 아데닌 (A) 으로의 변화, 혹은 그들의 상보쇄에서의 대응하는 변화 중에서 선택되는 어느 한 개 또는 두 개 이상의 변화의 유무를 판정하는 것을 특징으로 하는 관연축 관련질환 유전자의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

「그들의 상보쇄에서의 대응하는 변화」 란, 예컨대 eNOS 유전자의 뉴클레오티드의 변화인 그 cDNA 로서 894 번째의 구아닌 (G) 에서 티민 (T) 으로의 변화인경우에는 894 번째의 구아닌 상보쇄에서의 시토신 (C) 이 아데닌 (A) 으로 변이하는 변화를 의미한다.

우선, 환자로부터 eNOS 유전자 및 그 5′프랭킹 배열을 입수하는 방법을 개략 설명한다.

유전자를 채취하는 시료로서는 온갖 생검시료를 사용할 수 있으나, 전형적으로는 백혈구이며, 간조직 바이옵시도 사용할 수 있다. 얻어진 시료를 프로테이나아제 K-SDS 에 의해 단백질 분해·변성 후, 페놀/클로로포름 추출에 의해 게놈 DNA (+RNA) 가 얻어진다. 소망에 따라 RNA 는 RNase 에 의해 제거할 수 있다.

이어서, 얻어진 게놈 DNA 를 이하에 기재한 프라이머 중 어느 하나를 사용하여 PCR 에 의해 증폭시킨다. 이어서, 이하에 기재한 핵산변이 검출수법으로 변이의 유무를 확인한다.

1) RFLP 법 (제한 단편 길이 다형, restriction fragment length polymorphism)

2) PCR-SSCP 법 (1 쇄 DNA 고차 구조 다형 해석)

3) ASO 하이브리다이제이션법 (allele specific oligonucleotide hybridization)

PCR 산물을 나이론 필터 등의 지지체에 도트블롯하여 검색하는 변이부위에 대응한 염기배열을 갖는 18 mer 정도의 합성올리고뉴클레오티드프로브 (시그널을 얻기 위해서는 방사성동위원소 혹은 비오틴 표식이 필요) 와의 하이브리다이제이션 후, 그 프로브의 Tm 치에 준한 포스트 세정에 의해 1 염기 미스매치 (mismatch) 의검출 (미스매치가 있으면 하이브리드가 빠진다) 이 가능해진다. 이는 PCR 을 사용한 특정의 염기치환의 검출법으로는 가장 전형적인 방법이다.

4) 시퀀스법

5) 써던 브롯팅법 (Southern blot method)

DNA 를 제한효소처리하고 전기영동으로 전개하여 프로브와 하이브리다이제이션을 하는 일반적인 방법이다. 게노믹 써던 블롯팅법, PCR 써던 블롯팅법 모두 사용할 수 있다. 후자라면, 상기 (3) 과 원리는 동일하지만 이동도의 정보가 얻어진다는 점에서 정확도상의 이점을 갖고 있다.

6) ARMS (amplification refracting mutation system)

PCR 에서는 주형 DNA 에 프라이머가 어니일 (aneal) 된 후, DNA 폴리메라제에 의해 5′ 에서 3′ 으로 상보쇄 DNA 가 합성되는데 프라이머의 3′ 말단 염기에 미스매치가 있으면 PCR 의 효율이 저하한다. 즉 전기영동적으로 관찰불가능하게 되는 것을 이용하는 것으로서, 프라이머의 3′말단 염기가 검출하고자 하는 변이염기에 상보적인 것을 사용하여 PCR 을 실시하여 증폭산물의 유무를 검출할 수 있다.

7) DGGE (denaturing gradient gel electrophoresis, 변성제 농도구배 겔 전기영동법)

PCR 산물 중의 미스매치를 갖는 헤테로듀플렉스가 호모듀플렉스보다 그 해리가 용이한 것을 이용한 방법으로서 해리 (解離) 가 진행됨에 따라 겔 전기영동의 이동도가 떨어지므로 전개하는 폴리아크릴아미드겔에 요소 및 포름아미드의 밀도구배를 첨가함으로써 그것이 더욱 강조되므로, 미스매치를 포함한 2 쇄 DNA 의 존재, 즉 변이의 존재가 검출된다.

8) RNase A 절단법

RNase A (RNA 분해효소) 는 2 쇄의 RNA 혹은 RNA/DNA 콤플렉스를 분해하지 않고 1 쇄의 RNA 만을 분해하는 특성을 갖는다. 따라서, 예컨대 32 P 에 의해 표식한 RNA 프로브를 1 쇄 변성한 샘플 DNA 와 하이브리다이즈시켜 RNase A 처리후, 전기영동으로 전개하면 변이형과 하이브리다이즈한 RNA 프로브는 미스매치부위에서 절단되므로 2 개의 밴드로 검출할 수 있다.

9) 화학절단 (chemical cleavage) 법

2 쇄의 DNA 의 미스매치부위의 「C」 에 대해서는 히드록실아민, 「T」 에 대해서는 오스뮴테트라옥시드로 별개로 수식한 후, 피페리딘 처리를 하면 당이 절단된다. 표식 프로브를 사용하여 2 쇄를 형성시켜 본처리후에 전기영동하여 프로브의 사이즈가 짧아지면 변이가 검출된 것이다. Glu298Asp 검출의 경우, 프로브를 정상형 역쇄의 배열로 하면 미스매치는 C-T 이므로 어느쪽의 수식도 사용할 수 있다.

10) 리가아제법

2 개의 올리고뉴클레오티드를 DNA 리가아제로 연결할 때, 결합위치에 주형 DNA 와의 사이에 미스매치가 있으면 결합할 수 없는 것이 원리이다.

ⅰ) LMGD (ligase-mediated gene detection) 법

한쪽의 올리고 DNA 는 예컨대 32 P 표식, 다른 쪽은 비오틴 표식하여 라이게이션 후, 스트렙토아비딘 흡착에 의한 회수를 행한다. 이들이 연결 (즉, 미스매치하지 않음) 된다면 32 P 의 방사선량이 높은 값을 나타내므로 검출할 수 있다.

ⅱ) LCR (ligase chain reaction)

상기 라이게이션 반응을 내열성 리가아제를 사용하여 반복 실시함으로써 PCR 과 마찬가지로 발생한 DNA 쇄에 대하여도 올리고 DNA 가 어니일하므로 고감도로 변이의 검출을 할 수 있게 된다.

발명의 바람직한 양태

1. 엑손 7 상의 변이

엑손 7 에서의 변이, 즉 eNOS 를 코드하는 cDNA 상, 894 번째에서의 구아닌 (G) 에서 티민 (T) 으로의 변이는 GAG 에서 GAT 로의 변화이며, 각각 다른 제한효소부위를 형성하는 것이다. 따라서, 제한효소를 사용하여도 변이의 유무를 알 수 있다. 구체적으로는 얻어진 증폭산물을 제한효소 BANⅡ, MboⅠ 중 어느 하나를 사용하여 소화함으로서 상기 변이의 유무를 알 수 있다. 상세하게는 제한효소 BanⅡ 에 의해 절단되면 변이는 존재하지 않는다는 것을 알 수 있고, 또한 MboⅠ 에 의해 절단되면 변이가 존재하는 것을 알 수 있다.

혹은, eNOS 의 cDNA 상, 894 번째의 구아닌 (G) 에서 티민 (T) 으로의 변이는 아미노산에서는 글루타민산에서 아스파라긴산으로 변화시키는 변이 (Glu298Asp) 이다. 따라서, eNOS 의 아미노산 배열의 변화, 즉 eNOS 아미노산 배열상, 298 번째의 글루타민산이 아스파라긴산으로 변화된 것을 지표로 할 수도 있다.

2. 엑손 6 상의 변이

엑손 6 에서의 변이, 즉 eNOS 를 코드하는 cDNA 상, 774 번째의 시토신 (C) 에서 티민 (T) 으로의 변화도 각각 다른 제한효소부위를 형성한다. 따라서, 제한효소를 사용하여 변이의 유무를 알 수 있다. 구체적으로는 얻어진 증폭 프래그먼트를 제한효소 FokⅠ 에 의해 소화함으로써 상기 변이의 유무를 알 수 있다. 상세하게는 FokⅠ 에 의해 소화되면 변이가 존재함을 알 수 있고, 소화되지 않으면 변이가 존재하지 않는 것을 알 수 있다.

3. 5′프랭킹 영역의 -786 번째의 변이

eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역의 뉴클레오티드의 변화로서 -786 번째의 티민 (T) 에서 시토신 (C) 으로의 변화도 다른 제한효소부위를 형성한다. 따라서, 제한효소를 사용하여도 변이의 유무를 알 수 있다. 구체적으로는 얻어진 증폭산물을 제한효소 MspⅠ 을 사용하여 소화함으로써 상기 변이의 유무를 알 수 있다. 상세하게는 제한효소 MspⅠ 에 의해 1 개소가 절단되면 변이는 존재하지 않는 것을 알 수 있고, 또한 MspⅠ 에 의해 2 개소가 절단되면 변이가 존재하는 것을 알 수 있다.

4. 5′프랭킹 영역의 -1468 번째의 변이

eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역의 뉴클레오티드의 변화로서 -1468 번째의 티민 (T) 에서 아데닌 (A) 으로의 변화도 다른 제한효소부위를 형성한다. 따라서, 제한효소를 사용하여도 변이의 유무를 알 수 있다. 구체적으로는 얻어진 증폭산물을 제한효소 MboⅠ 을 사용하여 소화함으로써 상기 변이의 유무를 알 수 있다. 상세하게는 제한효소 MspⅠ 에 의해 1 개소가 절단되면 변이는 존재하지않는 것을 알 수 있고, 또한 MspⅠ 에 의해 2 개소가 절단되면 변이가 존재하는 것을 알 수 있다.

실시예 1

eNOS 유전자의 엑손 7 에서의 변이의 검출

시험대상은 96 명의 관연축성 협심증례와 86 명의 컨트롤증례이다. 관연축성 협심증군의 증례는 모두 안정시 자연발작의 경험을 갖고 있다 (남성 53 명, 여성 43 명, 평균 61 세, 33 세 ∼ 86 세). 모든 증례에 있어서 심장 카테테르 검사를 실시하고, 관동맥조영상, 아세틸콜린이나 에르고노빈 유발에 의한 관연축이 인정되고, 동시에 심전도상, 유의한 ST-T 변화가 인정된다 (7,8). 또 이들 증례에 유의한 관동맥협착 소견 (＞ 75 %) 은 인정되지 않았다.

86 명의 컨트롤 증례 중에서 61 명은 흉통증후군이고, 12 명은 심전도이상이고, 또 13 명은 가벼운 변막증례이었다 (남성 35 명, 여성 51 명, 평균연령 61 세, 13 세 ∼ 83 세). 컨트롤 증례도 모두에 있어서 관동맥조영을 시행하였으며, 그 결과 관동맥에는 유의 협착은 인정되지 않았다. 컨트롤 증례군 중 61 명의 흉통증후군과 12 명의 심전도 이상예에는 아세틸콜린 또는 에르고노빈 관동맥내 투여에 의한 관연축의 유발시험을 실시하였는데 모두 음성이었다. 또 컨트롤 증례에서는 심근경색, 신드롬 X, 심근증, 심부전증례를 제외하였다.

(1) PCR-SSCP 에 의한 eNOS 유전자변이의 검색

ⅰ) DNA 의 단리

전형적인 관연축성 협심증례 10 명 및 컨트롤증례 9 명으로부터 말초정맥 채혈하여 백혈구에서 DNA 를 추출하였다 (28). DNA 의 추출에는 DNA 추출약 키트DNAQUICH 〔다이닛뽕세이야꾸〕 을 사용하였다.

ⅱ) PCR 공정

이미 보고된 eNOS 유전자의 구조를 참고하여 (18-25), PCR-SSCP 법을 시행하였다 (29). PCR-SSCP 법은 eNOS 유전자의 모든 엑손에 걸쳐 시행하였다.

모든 프라이머는 각각의 엑손을 사이에 끼우는 형태로 인트론 중에 작성하였다. 사용한 모든 프라이머를 다음 표 1 에 나타낸다.

PCR-SSCP 에 사용한 eNOS 유전자의 26 엑손에 대한 프라이머

주)각 프라이머의 조에서는 상단이 센스 프라이머, 하단이 안티센스 프라이머이다.괄호안은 증폭 프래그먼트의 염기쌍의 길이이다.엑손 26 의 분석에는 3 개의 프라이머를 사용하였다.

50 mmol/L KCL, 20 mmol/L 트리스-염산 (pH 8.4), 0.75 mmol/L MgCl₂, 0.1 mmol/L dNTPs, α-〔³²P〕dCTP(0.2 ml), 각 프라이머 (5 pmol) 및 0.01 U Taq 폴리머라아제 (GIBCO BRL, Life Technologies Inc., MD USA) 를 함유하는 용액 5 ㎕ 을 각 튜브당 작성하고 이어서 환자유래의 DNA 30 ng 를 첨가한다.

PCR 조작은 다음과 같다. 우선, 94 ℃ 에서 2 분간 1 사이클하고 이어서 94 ℃ 에서 30 초, 55 ∼ 58 ℃ 에서 30 초 및 72 ℃ 에서 1 분의 사이클을 30 사이클 실행하여 얻어진 PCR 증폭산물을 4 ℃ 로 보존한다. 엑손 7 의 증폭은 57 ℃ 로 실시한다.

ⅲ) SSCP 공정

전기영동은 실온에서 5 % 글리세롤 겔의 조건과, 4 ℃ 에서 5 % 및 10 % 글리세롤 겔의 조건의 3 가지 조건으로 실시한다.

글리세롤 겔은 다음과 같이 하여 작성한다.

1) 아크릴아미드와 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드를 49 : 1 로 혼화한 용액 5 % :

2) 0.5 × TBE (10 × TBE : 트리스(히드록시메틸)아미드메탄 108 g + 붕산 55 g + 0.5 M EDTA 40 ml + 물 (전량 500 ml 가 되는 양) 을 20 배로 희석) :

3) 5 % 혹은 10 % 글리세롤로 조제한 용액 60 ml 에 10 % APS (펠옥소이황산암모늄) 160 ㎕ 과 TEMED (N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민) 60 ㎕ 을 첨가하여 겔을 제조한다.

ⅳ) 결과

엑손 7 을 증폭시킨 결과를 도 1 에 나타낸다. 이에 따라 엑손 7 을 포함한 프래그먼트에 있어서 관연축성 협심증군의 10 명중, 3 명에게 밴드시프트가인정되었다. 한편, 컨트롤군에는 전혀 시프트가 인정되지 않았다.

(2)직접 시퀀스법에 의한 변이유전자의 검토

공정 (1) 의 PCR-SSCP 로 변이가 인정된 증례와 정상 패턴을 발생시킨 증례의 DNA 를 다시 공정 (1) 의 (ⅱ) 의 조건하에서 증폭하여 Wizard PCR Preps DNA 정제 시스템 (Wizard PCR Preps DNA Purification System, Promega, USA) 으로 정제한다. ABI 제조 (USA) 의 오토시퀀서로 직적 시퀀스법으로 염기배열을 결정한다.

변이가 있는 DNA 와 정상례의 DNA 를 직접 시퀀스법으로 해석한 결과, 엑손 7 에 eNOS, cDNA 의 894 번째가 구아닌 (G) 에서 티민 (T) 으로 변화된 점변이를 발견하였다. 이는 변이가 있었던 3 예 모두에서 확인되었다. 이 점변이는 eNOS 아미노산 배열상, 글루타민산에서 아스파라긴산으로 변화를 일으키는 미스센스 변이였다 (Glu298Asp). 도 2 에 직접 시퀀스의 결과를 나타낸다. 여기에서는 변이가 없는 정상형과 헤테로 접합체를 나타내었다.

(3)PCR-RFLP 에 의한 G 에서 T 로의 변이의 스크리닝

공정 (2) 로 나타낸 바와 같이 eNOS 유전자의 엑손 7 에 Glu298Asp 변이를 일으키는 미스센스 변이가 발견되었으므로 그 스크리닝을 모든 관연축성 협심증례와 컨트롤증례, 즉 관연축성 협심증례 96 명과 컨트롤증례 86 명에 대하여 실시하였다. 이 스크리닝에는 PCR-RFLP (polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism) 법을 사용한다. 제한효소의 불완전 절단의 오인을 방지하는 목적으로 BanⅡ 와 MboⅠ 의 2 가지 제한효소를 사용한다 〔모두 다까라 주조에서 입수〕.

공정 (1) 의 (ⅱ) 에 기재한 수법으로 모든 증례의 eNOS 유전자의 엑손 7 을 증폭시켰다. 엑손 7 을 포함하는 PCR 증폭 프래그먼트는 248 bp 이다. 이어서, 얻어진 증폭 프래그먼트를 제조원의 교시에 따라 BanⅡ 및 MboⅠ 중 어느 하나로 소화한다. 얻어진 소화물을 4 % Nu Sieve GTG 아가로오스겔의 전기영동에 제공하여 밴드를 인정하였다.

그 결과는 도 3 에 나타내는 바와 같이 3 가지 패턴으로 유별되었다. 그리고, 도 3 A 는 제한효소지도이고, 도 3 B 는 실제 전기영동의 사진이다.

도 3 B 에 나타난 바와 같이 변이가 없는 야생형에서는 BanⅡ 에 의해 163 bp 와 85 bp 의 길이의 2 개의 프래그먼트가 형성되고, MboⅠ 에서는 절단되지 않은 248 bp 의 밴드가 인정되었다. 이에 따라 변이가 없는 야생형에는 BanⅡ 부위가 한 개이고 MboⅠ 부위는 존재하지 않는 것이 증명되었다.

eNOS 의 cDNA 의 894 번째가 T/T 인 호모접합체의 증례는 BanⅡ 에 의해 절단되는 일없이 (248 bp), MboⅠ 에서는 158 bp 와 90 bp 길이의 두 개의 프래그먼트가 형성되었다. 이에 따라 호모접합체의 증례에서는 BanⅡ 부위는 없고 MboⅠ 부위가 한 개 존재하는 것이 증명되었다.

BanⅡ 에 의해 248 bp, 163 bp 및 85 bp 의 3 개의 밴드가 형성되고, MboⅠ 에서는 248 bp 158 bp 및 90 bp 의 3 개의 밴드가 인정되는 증례가 존재하였다. 이는 BanⅡ 및 MboⅠ 의 어느 하나로 소화하면 각각 한쪽의 밴드에만 1 개의 절단부위가 존재하기 때문에 헤테로 접합체 (G/T) 이다.

상기 3 개의 패턴을 바탕으로 관연축성 협심증군과 컨트롤 군에서의 eNOS 유전자 Glu298Asp 변이의 빈도에 대한 검토를 모든 증례에서 실시하였다. 각 증례에 대하여 상기 2 개의 효소에서의 소화를 각각 실시하였다. 그 결과 이들 2 개의 효소에서 실시한 결과는 전 증례에서 일치하였다.

Glu298Asp 변이는 96 명의 관연축성 협심증례 중 22 명에서 인정되었으며 (23 %), 이 중 호모접합체가 1 명이고, 헤테로 접합체가 21 명이었다. 한편, 86 예의 컨트롤군에서는 7 명이 변이를 갖고 있었으며 (8 %) 이들은 모두 헤테로 접합체였다.

(4)통계해석 : 관연축과 Glu298Asp 변이 및 다른 위험인자와의 관계

Fisher′s exact probabillity 에 의한 카이제곱검정 및 unpaired-t 검정으로 공정 (3) 에서 얻어진 변이의 빈도, 및 연령, 성, 고혈압, 당뇨병, 고콜레스테롤 혈증, 비만도 및 흡연의 관위험인자의 빈도를 관연축성 협심증례군과 컨트롤 증례군 사이에서 비교하였다. 또한, 다변량해석 (로지스틱 중회귀분석) 으로 어떤 인자가 가장 관연축에 관여하고 있는지 검토하였다. 해석은 SPSS Advanced Statistics 6.1 for the Macintosh (SPSS Japan Inc., Japan) 로 시행하였다. 독립변수는 다음과 같이 모두 더미 변수를 사용하였다. 모든 수치는 평균 ± SD 로 나타낸다.

성별 ; 0 : 남성, 1 : 여성

연령 ; 0 : 60 미만, 1 : 60 이상

비만도 (body mass index) ; 0 : 26 미만, 1 : 26 이상

콜레스테롤 혈증 ; 0 : 정상, 1 : 고콜레스테롤 혈증 (임계치, 260 ㎎/dl)

흡연 ; 0 : 비흡연자, 1 : 흡연자

고혈압 ; 0 : 정상혈압, 1 : 고혈압 (임계치, 160/95 ㎜Hg)

당뇨병 ; 0 : 당뇨병 없음, 1 : 당뇨병 있음 (임계치, 공복시 혈당 140 ㎎/dl 또는 OGTT 로 200 ㎎/dl)

카이제곱검정의 결과를 이하의 표 2 에 forward stepwise selection (Wald) 을 사용한 검정을 이하의 표 3 에 나타낸다. 모든 통계상 p = 0.05 를 유의로 한다.

통계해석의 결과

Glu298Asp 의 변이 및 다른 위험인자 : 연령, 성별, 혈압, 당뇨병, 고콜레스테롤 혈증, 비만도, 흡연과 관연축의 관계에 있어서, 성별 (p = .035), 흡연 (p = .00001) 및 Glu298Asp 변이 (p = .005) 가 이하의 표 2 에 나타내는 바와 같이 유의차를 나타내었다.

피검환자의 임상특성

	컨트롤n = 86	연축n = 96	P 값
연령	61±12	61±11	.97＊
남성 : 여성	35:51	53:43	.035＊＊
비만도	23.4±3.7	23.1±3.0	.48＊
고혈압	29/85	35/94	.39＊＊
당뇨병	15/84	10/93	.13＊＊
고콜레스테롤혈증	31/82	31/93	.32＊＊
흡연	17/84	50/95	.00001＊＊
Glu298Asp 변이	7/86	22/96	.005＊＊
＊Unpaired t-검정, ＊＊Fisher's exact probability 의 카이제곱검정

다변량해석 (로지스틱 중회귀분석) 의 결과를 이하의 표 3 에 나타낸다. 가장 관연축에 기여하는 인자는 흡연이고 (p = .0005), 다음이 Glu298Asp 변이이었다 (p = .0272). 로지스틱 중회귀분석으로는 성별과 관연축의 관계는 인정되지 않았다.

로지스틱 중회귀분석의 결과

변수	β	SE	Wald	df	유의차	R	Exp(β)
흡연	1.2342	.3529	12.2316	1	.0005	.2120	3.4355
Glu298Asp	1.0746	.4866	4.8771	1	.0272	.1124	2.9288
Constant	-.4371	.2139	4.1747	1	.0410	-	-

실시예 2

eNOS 유전자의 엑손 6 에서의 변이의 검출

실시예 1 에 기재한 바와 같이 하여 관연축성 협심증례 10 명 및 컨트롤 증례 9 명으로부터 게놈 DNA 를 단리하고, 표 1 에 기재한 프라이머를 사용하여 PCR 을 실시하고, SSCP 공정을 행하여 엑손 6 에 변이를 인정하였다. 이어서, 엑손 6 의 직접 시퀀싱을 실시하여 eNOS 유전자의 cDNA 상, 774 번째에서의 시토신 (C)이 티민 (T) 으로 염기치환된 것을 발견하였다.

이 염기치환은 관연축성 협심증 환자 10 명 중 4 명에게 인정되었는데 컨트롤 증례의 9 명에게는 이 염기치환은 인정되지 않았다 (P = 0.03). 그리고, 이 치환은 아미노산 변화를 초래하는 것은 아니었다.

실시예 3

eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역에서의 변이의 검출 (1)

프라이머로서 다음의 것을 사용하는 것 이외에는 실질적으로 실시예 1 에 기재한 수법에 따라 5′프랭킹 영역 (-786) 의 티민 (T) 에서의 시토신 (C) 으로의 염기치환을 발견하였다 :

PCR-SSCP(-585∼-820bp;236bp)

프라이머 5′측 : 5′-ATGCTCCCACCAGGGCATCA-3′

프라이머 3′측 : 5′-GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG-3′

이 염기치환은 관연축성 협심증 환자 123 명 중 34 명 (27.6 %) 에게 인정되었는데 컨트롤 증례에서는 86 명 중 4 명 (4.7 %) 에게밖에 치환은 인정되지 않았다 (P＜0.0001).

실시예 4

eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역에서의 변이의 검출 (2)

프라이머로서 다음의 것을 사용하는 것 이외에는 실질적으로 실시예 1 에 기재된 수법에 따라 5′프랭킹 영역 (-922) 의 아데닌 (A) 에서의 구아닌 (G) 으로의 염기치환을 발견하였다 :

PCR-SSCP(-801∼-1008bp;208bp)

프라이머 5′측 : 5′-TCAGTCTCTGAGGTCTCGAA-3′

프라이머 3′측 : 5′-TGATGCCCTGGTGGGAGCAT-3′

이 염기치환은 관연축성 협심증 환자 104 명 중 31 명 (29.1 %) 에게 인정되었는데 컨트롤 증례에서는 83 명 중 3 명 (3.6 %) 에게밖에 치환은 인정되지 않았다 (P＜0.0001).

실시예 5

eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역에서의 변이의 검출 (3)

프라이머로서 다음의 것을 사용하는 것 이외에는 실질적으로 실시예 1 에 기재된 수법에 따라 5′프랭킹 영역 (-1468) 의 티민 (T) 에서의 아데닌 (A) 으로의 염기치환을 발견하였다 :

PCR-SSCP(-1214∼-1490bp;221bp)

프라이머 5′측 : 5′-CCATTAACTGGAACCTAGGAA-3′

프라이머 3′측 : 5′-AGCCTGGGCTTTGTCCCATGA-3′

이 염기치환은 관연축성 협심증 환자 98 명 중 26 명 (26.5 %) 에게 인정되었는데 컨트롤 증례 26 명에게 이 치환은 인정되지 않았다 (0 %). (P＜0.0006)

실시예 6

변이의 스크리닝

상기에서 얻어진 5 개의 변이는 예컨대 ASO 하이브리다이제이션법 (Hybridization with Allelic-Specific Oligonucleotides) 으로 대규모로 스크리닝할 수 있다. 대규모 스크리닝용 ASO 하이브리다이제이션법을 이하에 예시한다 :

1) SSCP 와 마찬가지로 PCR 을 실시한다. 이 경우, 최종적으로 20 ㎕ 이 되도록 한다. 반응액의 조성 및 사이클 조건은 실시예 1 의 엑손 7 의 경우와 동일하다.

2) PCR 반응액 10 ㎕ 를 채취하여 0.5 M NaOH (1.5 M NaCl + 25 mM EDTA 2Na) 200 ㎕ 중, 100 ㎕ 을 야생형용 나이론막에 정착시키고 남은 100 ㎕ 를 변이형용 나이론막에 정착시킨다.

3) 정착시킨 나이론막을 각각 다른 하이브리백에 넣고, 프레하이브리다이제이션액 (3 × SSPE, 5 × Denhart's 시약, 0.5 % SDS, 1 ㎍/㎕ 청어 정자 DNA) 을 첨가하여 65 ℃ 로 2 시간 인큐베이트한다.

4)³²P 표식정상형 프로브 (5 × 10⁶dpm/㎖) 및 5 배량 비표식 이상형 프로브를 넣고, 또 한쪽의 백에는³²P 표식 이상형 프로브 (5 × 10⁶dpm/㎖) 및 5 배량의 비표식 정상형 프로브를 넣는다.

5) 각각 백을 60 ℃, 30 분간 인큐베이트하고, 그리고 온도를 60 ℃ 에서 X ℃ (실시예 3 에서는 53 ℃, 실시예 4 에서는 50 ℃, 실시예 5 에서는 46 ℃) 로 저하시키면서 1 시간 인큐베이트한다.

6) 백에서 나이론막을 꺼내 2 × SSPE (0.1 % SDS) 로 10 분간 2 회 실온에서 인큐베이트하고, 이어서 5 × SSPE (0.1% SDS) 로 10 분간 1 회 X ℃ 로 인큐베이트한다.

7) 나이론막을 사란 랩에 싸아 X 선 필름에 포개어 현상한다 (오토라디오그래피).

실시예 7

eNOS 유전자의 엑손 6 및 5′프랭킹 영역에서의 변이의 스크리닝

실시예 2, 3 및 5 에 나타낸 직접 시퀀스법으로 eNOS 유전자의 cDNA 상, 엑손 6 의 774 번째가 시토신 (C) 에서 티민 (T) 으로, 또한 그 5′프랭킹 영역의 -786 번째가 티민 (T) 에서 시토신 (C) 으로, 마찬가지로 5′프랭킹 영역의 -1468 번째가 티민 (T) 에서 아데닌 (A) 으로 염기치환된 것을 발견하였다. 이들 변이의 스크리닝을 PCR-RFLP 법으로 이하와 같이 실시하였다. 그리고, PCR 에 사용한 올리고뉴클레오티드 및 증폭조건을 각각 이하의 표 4 및 표 5 에 나타낸다.

PCR 증폭용 염기배열특이 올리고누클레오티드

(a) 엑손 65'-TCTGACCAGCTCTTTCCCCATGCG-3' (센스)5'-CCACTGGTTTCCTCATTCTCCACC-3' (안티센스)

(b) 5′프랭킹 영역 (-1468)5'-CTCCAGCCCCTCAGATGA-3' (안티센스 1)5'-TCCAGCCCCTCAGATGG-3' (안티센스 2)5'-GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG-3' (센스)

(C) 5′프랭킹 영역 (-786)5'-AATGAGTCATCCTTGGTCATG-3' (안티센스)5'-GGGTTTGTAGTTCTGTGT-3' (센스 1)5'-GGGTTTGTAGTTCTGTGC-3' (센스 2)

PCR 증폭조건

증폭영역	온도 (℃)	시간 (초)	사이클
	변성	어니일	신장	변성	어니일	신장
엑손 6	94	63	72	60	60	60	32
5′프랭킹영역	94	58	72	45	75	60	32
5′프랭킹영역	94	60	72	45	75	60	32

PCR 의 버퍼 조성은 10 mM Tris-HCl pH 9.0, 50mM KCl, 1.5 mM MgCl₂0.1 % Triton X-100 이며, 0.5 mM 의 각 PCR 프라이머 200 mM 데옥시뉴클레오티드와 0.5 U 의 Taq polymerase 를 사용하여 각각 25 ㎕ 용량으로 실시하였다.

온도 컨트롤은 퍼킨엘마시터스사 제조 DNA Thermal Cyclar 480 을 사용하였다.

(1)엑손 6 상의 변이

실시예 1 의 공정 (2) 에 기재된 방법을 실질적으로 따라 표 4 에 기재된 프라이머 및 표 5 에 기재된 증폭조건을 사용하여 시료의 eNOS 유전자의 엑손 6 을 증폭시킨다. 얻어진 증폭 프래그먼트 (232bp) 를 제조원의 교시에 따라 FokⅠ 에 의해 소화한 후, 이것을 10 % 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 제공하여 밴드를 확인하였다. 변이형 유전자만이 FokⅠ 에 의해 소화되기 때문에, C/C 의 호모접합체는 232bp 밴드가, C/T 의 헤테로 접합체에서는 232bp, 133bp, 99bp 의 밴드가, T/T 인 호모접합체에서는 133bp, 99bp 의 밴드가 각각 확인되었다. 얻어진 PCR-RFLP 에 의한 스크리닝의 결과를 도 4 에 나타낸다.

(2)5′프랭킹 영역의 -786 번째의 변이

실시예 1 의 공정 (2) 에 기재한 방법을 실질적으로 따라 표 4 에 기재된 프라이머 및 표 5 에 기재된 증폭조건을 사용하여 시료의 5′프랭킹 영역의 -786 번째의 변이를 포함하는 부분을 증폭시킨다. 얻어진 증폭 프래그먼트 (354bp) 를 제조원의 교시에 따라 MspⅠ 에 의해 소화한 후, 이것을 10 % 폴리아크릴아미드겔전기영동에 작용시켜 밴드를 확인하였다. 정상 유전자 (T) 의 호모접합체에서는 MspⅠ 에 의해 1 개소가 소화되어 196bp 및 158bp 의 2 개의 밴드를 부여한다. 한편, 변이형 유전자 (G) 의 호모접합체는 MspⅠ 에 의해 2 개소가 소화되기 때문에 158bp, 154bp, 44bp 의 3 개의 밴드를 부여한다. 얻어진 PCR-RFLP 에 의한 스크리닝의 결과를 도 5 에 나타낸다.

(3)5′프랭킹 영역의 -1468 번째의 변이

실질적으로 실시예 1 의 공정 (2) 에 기재한 방법에 따라 표 4 에 기재된 프라이머 및 표 5 에 기재된 증폭조건을 사용하여 시료의 5′프랭킹 영역의 -1468 번째의 변이를 포함하는 부분을 증폭시킨다. 얻어진 증폭 프래그먼트 (627bp) 를 제조원의 교시에 따라 MboⅠ 에 의해 소화한 후, 이것을 10 % 폴리아크릴아미드겔 전기영동에 제공하여 밴드를 확인하였다. 정상형 유전자 (T) 의 호모접합체에서는 MboⅠ 에 의해 1 개소가 소화되어 515bp 및 112bp 의 2 개의 밴드를 부여한다. 한편, 변이형 유전자 (A) 의 호모접합체는 MboⅠ 에 의해 2 개소가 소화되기 때문에 515bp, 61bp, 41bp 의 3 개의 밴드를 부여한다. 얻어진 PCR-RFLP 에 의한 스크리닝의 결과를 도 5 에 나타낸다.

(4)5′프랭킹 영역의 -922 번째의 변이

이 변이의 검출은 PCR-SSP (Sequence-Specific Primer) 법으로 실시한다. -922 번째의 A 또는 G 가 3′방향 신장측의 기점이 되도록 상하류방향의 각각으로 프라이머를 2 종류 (계 4 종류) 설정한다. 이 프라이머는 표 4 기재의 (b) 및 (c) 기재의 것과 동일하다. 이들의 프라이머와 페어가 되는 센스 혹은 안티센스 프라이머 (2 종) 는 각각 -1468 번째, -786 번째의 변이개소를 증폭영역내에 포함하도록 설정한다. 이들 PCR 을 실시한 결과, -922 번째가 A/A 의 호모접합체인 경우에는 3′측의 기점이 A 이거나 T (상보배열) 인 프라이머만으로 증폭하고, A/G 의 헤테로 접합체는 모든 프라이머에서 증폭하였고, G/G 의 호모접합체인 경우에는 3′방향의 기점이 G 이거나 C (상보배열) 인 프라이머만으로 증폭하였다.

얻어진 증폭 프래그먼트는 상기 (2) 및 상기 (3) 으로 얻어진 증폭 프래그먼트와 동일하다. 얻어진 증폭 프래그먼트를 검토한 결과, 어떤 종류의 검체에서는 -922 번째가 A (정상형) 인 아레르에 유래하는 상기 (2) 의 증폭 프래그먼트 (354bp) 는 -786 번째의 염기가 T 로서 정상형만을 부여하고, 한편 -922 번째가 G (이상형) 인 아레르에 유래하는 상기 (2) 의 증폭 프래그먼트 (354bp) 는 -786 번째의 염기가 G 로서 이상형만을 부여하는 것이 판명되었다. 마찬가지로 -922 번째가 A (정상형) 인 아레르에 유래하는 상기 (3) 의 증폭 프래그먼트 (627bp) -1468 번째의 염기가 T 로서 정상형만을 부여하고, 한편 -922 번째가 G (이상형) 인 아레르에 유래하는 상기 (3) 의 증폭 프래그먼트 (627bp) 는 -1468 번째의 염기가 A 로서 이상형만을 부여하는 것이 판명되었다. 이와 같은 점에서 어떤 종류의 양태에서는 5′프랭킹 영역내의 상기 변이는 모두 동일 아레르상에 연쇄하는 것이 확인되었으며 3 개소 중 어느 1 개의 변이를 검출하면 다른 2 개소의 유무도 예측가능한 것을 알수 있다.

고안

상기와 같이 본 발명자들은 eNOS 유전자에 변이가 있어 NOS 의 활성을 낮추고, 이것이 관연축에 관여하는 것은 아닌가 하는 가설을 세워 실험을 행하였다. 만약 이것이 맞는다면 관연축이 일지 (一枝) 만이라기 보다는 다지 (多枝) 에 걸친 것이 많은 사실에도 합치한다 (8). 그리고, 실시예 1 에서 발견된 Glu298Asp 변이는 Marsden 등에 의해 보고되어 있으나 (24), 그 의의에 대해서는 전혀 조사되어 있지 않다.

실시예 1 에서는 Glu298Asp 변이는 관연축성 협심증군 23 %, 한편 컨트롤군 8 % 에 인정되고, 관연축성 협심증군은 컨트롤군에 비교하여 그 빈도가 유의하게 높은 것이 나타난다. 또한, 다변량 해석의 결과로도 관연축과 Glu298Asp 변이 사이에서 유의한 상관이 있음이 나타난다.

단, 이 변이의 비율은 관연축 증례의 23 % 정도인 점으로 보아 관연축 증례의 남은 77 % 에 대하여는 다른 인자가 그 성인에 관여하고 있을 가능성이 있다. 실시예 1 에서는 eNOS 의 엑손 7 중의 변이를 지표로 하였으나, 이 변이와는 별개로 eNOS 의 다른 영역 (프로모터 영역이나 인트론 영역 등) 에도 변이가 있는 것은 아닌가 하는 가설하에 실험을 반복하여 그 사실을 밝혀냈다 (실시예 2 ∼ 5). 따라서, 이들 변이의 상관성을 상세하게 조사하면 한층 확실한 관연축 관련질환의 진단을 할 수 있게 된다.

혹은 또, eNOS 유전자뿐 아니라 다른 유전자가 관연축의 성인일 가능성도 있다. 나아가 유전적 요인외에 환경인자가 관연축의 병태에 관련되어 있는 것도 감안하여야 한다. 그 이유는 가족발증형 관연축 증례가 비교적 적기 때문이다. 실시예 1 에서도 흡연이 관연축의 위험인자인 것이 나타났다. 이 결론은 다른보고와 일치한다 (30,31). 금번, 로지스틱 중회귀분석의 결과, 변이를 포함한 모든 위험인자 중에서 흡연이 관연축의 가장 강한 인자라는 것이 나타났고, 환경인자가 관연축의 성인상 매우 중요한 것이 시사되었다. 흡연이 내피장해를 일으키는 것은 다른 연구자도 지적하고 있다 (32,33).

Glu298Asp 변이는 컨트롤군에서도 8 % 인정되었다 (786 명, 실시예 1). 이 이유에 대하여 상세한 것은 명확하지 않으나 변이가 나타난 7 명 중 6 명은 비흡연자이며 따라서 이 증례에는 흡연이라는 강한 영향을 초래하는 위험인자가 없다는 말이된다. 또하나의 이유로서 관연축을 진단하기 어려움에 있다. 즉, 몇가지의 이유로 관연축을 간과하고 관연축 증례를 컨트롤 증례군에 포함시킬 가능성이 있다. 그 이유는

1) 발작은 보통 심야부터 조조에 걸쳐 일으키는 일이 많아, 일반적으로 주간에는 잘 일으키지 않으므로 간과하기 쉬운 점.

2) 아세틸콜린을 관동맥내에 투여하여도 항상 관연축을 유발할 수 있다고는 할 수 없고, 아세틸콜린 유발의 관연축은 관연축성 협심증의 “disease activity” (병의 활동성) 에 의존하는 일이 많은 점.

3) 3 분의 2 이상 관연축의 발작은 사일런트 (증상없음) 인 점.

4) 검사의 결과, 관연축성 협심증이 아니라고 판단되어도 장래 관연축이 출현할지도 모르는 점이다. 반대로 관연축성 협심증군의 진단은 관동맥조영을 하여 확실하게 관연축을 인식하므로 확정진단에 이르는 증례이다.

본 발명은 환경인자뿐 아니라 유전적 요인도 관연축의 병인에 관여하고 있다는 것을 나타낸 최초의 발명으로서 보다 우수한 관연축 관련질환의 진단을 제공하는 것이다.

이하에 본 명세서 중에 인용한 문헌명을 열기한다.

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Claims

관연축 관련질환에 부수되는 혈관내피형 일산화질소 합성효소 (eNOS) 유전자의 뉴클레오티드의 변화로서, 그 cDNA 로서 894 번째의 구아닌 (G) 에서 티민 (T) 으로의 변화 및 774 번째 시토신 (C) 에서 티민 (T) 으로의 변화, 그리고 eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역의 뉴클레오티드의 변화로서, -786 번째의 티민 (T) 에서 시토신 (C) 으로의 변화, -922 번째의 아데닌 (A) 에서 구아닌 (G) 으로의 변화 및 -1468 번째의 티민 (T) 에서 아데닌 (A) 으로의 변화, 혹은 그들의 상보쇄에서의 대응하는 변화 중에서 선택되는 어느 한 개 또는 두 개 이상의 변화의 유무를 판정하는, 관연축 관련질환 유전자의 스크리닝 방법.
제 1 항에 있어서, eNOS 유전자내의 변화 중 어느 한 개 및 그 5′프랭킹 영역내의 변화의 한 개 또는 두 개 이상의 변화의 유무를 판정하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 관연축 관련질환이 협심증인 방법.
제 3 항에 있어서, 관연축 관련질환이 관연축성 협심증인 방법.
제 1 항에 있어서, eNOS 를 코드하는 cDNA 상, 엑손 7 에 상당하는 부분을 PCR 에 의해 증폭하여 그 증폭 프래그먼트를 제한효소 BanⅡ 및/또는 MboⅠ 에 의해 처리하고, 이어서 효소처리한 프래그먼트를 전기영동에 작용시킴으로서 변화의 유무를 판정하는 방법.
eNOS 를 코드하는 cDNA 상, 엑손 7 에 상당하는 부분을 PCR 에 의해 증폭하기 위한 증폭용 올리고뉴클레오티드 및 제한효소 BanⅡ 및 /또는 MboⅠ 을 포함하는, 관연축 관련질환을 진단하기 위한 키트.
제 1 항에 있어서, eNOS 를 코드하는 cDNA 상, 엑손 6 에 상당하는 부분을 PCR 에 의해 증폭하여 그 증폭 프래그먼트를 제한효소 FokⅠ 에 의해 처리하고, 이어서 효소처리한 프래그먼트를 전기영동에 작용시킴으로써 변화의 유무를 판정하는 방법.
eNOS 를 코드하는 cDNA 상, 엑손 6 에 상당하는 부분을 PCR 에 의해 증폭하기 위한 증폭용 올리고뉴클레오티드 및 제한효소 FokⅠ 을 포함하는, 관연축 관련질환을 진단하기 위한 키트.
제 1 항에 있어서, eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역중 -786 번째를 포함하는 부분을 PCR 에 의해 증폭하여 그 증폭 프래그먼트를 제한효소 MspⅠ 에 의해 처리하고, 이어서 효소처리한 프래그먼트를 전기영동에 작용시킴으로써 변화의 유무를 판정하는 방법.
eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역중 -786 번째를 포함하는 부분을 PCR 에 의해 증폭하기 위한 증폭용 올리고뉴클레오티드 및 제한효소 MspⅠ 을 포함하는, 관연축 관련질환을 진단하기 위한 키트.
제 1 항에 있어서, eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역중 -1468 번째를 포함하는 부분을 PCR 에 의해 증폭하여 그 증폭 프래그먼트를 제한효소 MboⅠ 에 의해 처리하고, 이어서 효소처리한 프래그먼트를 전기영동에 작용시킴으로써 변화의 유무를 판정하는 방법.
eNOS 유전자의 5′프랭킹 영역중 -1468 번째를 포함하는 부분을 PCR 에 의해 증폭하기 위한 증폭용 올리고뉴클레오티드 및 제한효소 MboⅠ 을 포함하는, 관연축 관련질환을 진단하기 위한 키트.
제 1 항에 따른 관연축 관련질환에 부수되는 eNOS 유전자의 뉴클레오티드의 변화 중에서 선택되는 어느 한 개 또는 두 개 이상의 변화의 유무를 판정하는 것을 특징으로 하는 관연축 관련질환의 진단방법.