DE69636856T2

DE69636856T2 - Diagnose von krankheiten, welche mit herzkrämpfen einhergehen

Info

Publication number: DE69636856T2
Application number: DE69636856T
Authority: DE
Inventors: Hirofumi Kumamoto-shi YASUE; Michihiro Kumamoto-shi YOSHIMURA
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 1996-11-13
Publication date: 2007-10-11
Anticipated expiration: 2016-11-14
Also published as: EP0875581A1; NO982162L; HUP0000177A3; DE69636856D1; NO323560B1; EP0875581B1; KR100449060B1; CN1202205A; IL124348A; RU2185442C2; KR19990064321A; NZ322185A; AU710395B2; NO982162D0; US6569618B1; BR9611309A; CN1165628C; JP3928140B2; HU226469B1; HUP0000177A2

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose einer spezifischen Krankheit und insbesondere eines Durchmusterungsprozesses auf ein Gen, welches eine mit Koronararterien-Spasmus verbundene Krankheit umfasst.
Stand der Technik
Intrinsisches Stickoxid (intrinsisches NO) ist eine Substanz, die vor kurzem in vivo identifiziert wurde und von der gezeigt wurde, dass sie als ein Vasodilatator (18-25), ein Neurotransmitter (11, 12) oder ein Immunreaktant (13-17) agiert. Das intrinsische NO wird aufgrund einer Familie, die aus mindestens drei Stickoxid-Synthasen (NOSs) besteht, d.h. neurale NOS, endotheliale NOS und Makrophagen-NOS, aus L-Arginin synthetisiert. Neurale NOS und endotheliale NOS sind konstitutiv und werden in ihrer Aktivität abhängig von den Konzentrationen intrazellulären Calciums verstärkt. Andererseits ist die Makrophagen-NOS von Calcium unabhängig und wird durch Entzündung aktiviert. Früh haben einige Wissenschafter die Genstruktur der Stickoxidsynthase aus Endothelzellen (eNOS) bestimmt und berichtet, dass das eNOS-Gen im Chromosom bei 7q35-36 liegt und aus 26 Exons zusammengesetzt ist und 21 kb umspannt (18-25).
Offenbarung der Erfindung
Von einem Koronararterien-Spasmus wird angenommen, dass er ein pathogener Faktor von verschiedenen ischämischen Herzerkrankungen wie zum Beispiel koronar-spastischer Angina und Prinzmetal Angina (1-6) ist. Der Mechanismus für den Koronar-Spasmus ist jedoch nicht bekannt.
Die hier genannten Erfinder haben daher Untersuchungen zur Aufklärung des Mechanismus des Koronar-Spasmus durchgeführt, wobei sie ins Auge fassten, dass solche Untersuchungen zur Entwicklung einer frühen Diagnose und Behandlung von ischämischen Erkrankungen beitragen können, die mit dem Koronar-Spasmus in Zusammenhang stehen. Es sollte festgehalten werden, dass die meisten früheren Studien darauf hingewiesen haben, dass eine Hyperkontraktilität der glatten Muskulatur im pathogenen Mechanismus des Koronar-Spasmus wichtiger ist als eine Schädigung des Hämangioendothels (35).
Acetylcholin wirkt im Allgemeinen auf die glatte Muskulatur, um sie zusammenzuziehen, aber Acetylcholin kann schließlich durch Sekretion von Stickoxid (NO), das auf glatten Muskel wirkt, zur Vasodilatation führen, wenn das Endothel unverletzt ist. Die koronare Verabreichung von Acetylcholin an Patienten, welche koronar-spastische Angina haben, induziert jedoch eher den Koronar-Spasmus als Vasodilatation (7, 8). In Zusammenhang mit dieser Tatsache haben die hier genannten Erfinder früher gezeigt, dass die durch Acetylcholin hervorgerufene Basalsekretion von NO in Patienten mit koronar-spastischer Angina niedrig ist (10).
Nachdem Nitroglycerin und eine salpetrige Säure-Medizin Vasodilatation im Laufe der Bildung von Stickoxid in vivo bilden können, könnte die Basalabsonderung von NO in der Koronararterie von Patienten, die koronar-spastische Angina aufweisen, vermindert werden; das wird durch die Tatsache unterstützt, dass die Reaktion von Gefäßen, in welchen die Stickoxid-Synthese unterdrückt wird, auf die salpetrige Säure-Medizin hochempfindlich ist (9) und die Koronararterie in den Patienten, welche koronar-spastische Angina aufweisen, hochempfindlich gegen Nitroglycerin ist. Diese Ergebnisse würden auf die Möglichkeit einer starken Beziehung zwischen Koronar-Spasmus und Stickoxid hindeuten, speziell im Endothel, wo NO abgesondert wird. Bis jetzt hat niemand auf die Beziehung zwischen Koronar-Spasmus und dem Endothel, wo NO abgesondert wird, geachtet, außer unter dem Umstand, dass die Abnahme der Basalsekretion von NO bekannt ist.
Von einem anderen Gesichtspunkt aus haben die hier genannten Erfinder im Lichte der Tatsache, dass Koronar-Spasmus in Japan häufiger ist als in den Vereinigten Staaten von Amerika und Europa (26, 27) bemerkt, dass Koronar-Spasmus durch einen genetischen Hintergrund verursacht werden kann.
Basierend auf den vorstehenden Ergebnissen haben sich die vorliegenden Erfinder auf ein Gen von einem der NOS-Enzyme konzentriert, welche intrinsisches Stickoxid produzieren, d.h. Stickoxidsynthase aus Endothelzellen (eNOS), untersucht, ob das Gen für die Entwicklung des Koronar-Spasmus verantwortlich ist, und schließlich die vorliegende Erfindung abgeschlossen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Durchmusterungsverfahren auf ein Gen, das eine mit Koronararterien-Spasmus verbundene Krankheit involviert, wobei das Verfahren den Nachweis der Anwesenheit einer oder mehrerer Nucleotid-Änderungen im Gen der endothelialen Stickoxid-Synthase (eNOS) umfasst, wobei die Änderungen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den Änderungen von Guanin (G) zu Thymin (T) an Position 894 und von Cytosin (C) zu Thymin (T) an Position 774 der cDNA-Sequenz des eNOS-Gens und den Änderungen von Thymin (T) zu Cytosin (C) an Position –786, von Adenin (A) zu Guanin (G) an Position –922 und von Thymin (T) zu Adenin (A) an Position –1468 der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens sowie den Änderungen an den entsprechenden Positionen im komplementären Strang davon. Vorzugsweise betrifft die vorliegende Erfindung das vorstehende Verfahren, welches den Nachweis der Anwesenheit von zwei oder mehreren Nucleotid-Änderungen umfasst, die ausgewählt wurden aus einer der Nucleotid-Änderungen im eNOS-Gen und einer der Nucleotid-Änderungen in der 5'-flankierenden Region davon, und stärker bevorzugt das vorstehende Verfahren, in dem die mit Koronararterien-Spasmus verbundene Erkrankung Angina ist, und weiter bevorzugt das vorstehende Verfahren, in dem die mit Koronararterien-Spasmus verbundene Erkrankung koronar-spastische Angina ist.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung das Durchmusterungsverfahren auf die vorstehenden Veränderungen, welches das RFLP-Verfahren umfasst; wobei die Anwesenheit oder Abwesenheit einer durch ein Restriktionsenzym verursachten Spaltung nachgewiesen wird. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung das Verfahren, in welchem der Nachweis der Anwesenheit der Veränderungen durchgeführt wird durch Amplifizieren des relevanten Abschnitts zu Exon 7 in der cDNA, die eNOS codiert, mittels PCR, Verdauen der amplifizierten Fragmente mit dem (den) Restriktionsenzym(en) BanII und/oder MboI und Elektrophorese der Fragmente, die mit dem Enzym verdaut wurden, sowie das Verfahren, in dem der Nachweis der Anwesenheit der Änderungen in Exon 6 durchgeführt wird durch Behandeln mit dem Restriktionsenzym FokI, das Verfahren, in dem der Nachweis der Anwesenheit der Veränderungen an Position –786 in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens durchgeführt wird durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym MspI, und das Verfahren, in dem der Nachweis der Anwesenheit der Veränderungen an Position –1468 in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens durchgeführt wird durch Behandlung mit dem Restriktionsenzym MboI.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zur Durchführung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, insbesondere einen Kit zum Diagnostizieren einer mit Koronararterien-Spasmus verbundenen Krankheit, der ein Paar an Amplifizierungs-Oligonucleotiden zum Amplifizieren eines relevanten Abschnitts zu Exon 7 in der cDNA, die eNOS codiert, mittels PCR und das/die Restriktionsenzym(e) BanII und/oder MboI umfasst; einen Kit zum Diagnostizieren einer mit Koronararterien-Spasmus verbundenen Erkrankung, der ein Amplifizierungs-Oligonucleotid zum Amplifizieren eines relevanten Abschnitts zu Exon 6 in der cDNA, die eNOS codiert, mittels PCR und das Restriktionsenzym FokI umfasst; einen Kit zum Diagnostizieren einer mit Koronararterien-Spasmus verbundenen Erkrankung, der ein Amplifizierungs-Oligonucleotid zum Amplifizieren eines Abschnitts, der die –786-Position in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens umfasst, mittels PCR und das Restriktionsenzym MspI umfasst; und einen Kit zum Diagnostizieren einer mit Koronararterien-Spasmus verbundenen Erkrankung, der ein Amplifizierungs-Oligonucleotid zum Amplifizieren eines Abschnitts, der die –1468-Position in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens umfasst, mittels PCR und das Restriktionsenzym MboI umfasst. Es sollte beachtet werden, dass das im Kit der vorliegenden Erfindung enthaltene Amplifizierungs-Oligonucleotid andere Oligonucleotide umfasst als jene, die nachstehend in Tabelle 1 aufgelistet sind, und durch Bezugnahme auf die Genomsequenz von eNOS aus irgendwelchen Oligonucleotiden ausgewählt werden kann.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Diagnostizieren einer mit Koronararterien-Spasmus verbundenen Krankheit, das den Nachweis der Anwesenheit von einer oder mehreren Nucleotidveränderungen im eNOS-Gen umfasst, wie vorstehend definiert, die verantwortlich sind für die mit Koronararterien-Spasmus verbundene Krankheit.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Photographie, welche das Ergebnis der Elektrophorese zeigt, erhalten durch PCR-SSCP-Analyse von DNA-Fragmenten, welche Exon 7 in eNOS-Gen enthalten. Der Pfeil kennzeichnet die Verschiebung der Banden.
2 ist eine graphische Darstellung, welche das Ergebnis der direkten Sequenzierung des DNA-Fragments zeigt, das Exon 7 im eNOS-Gen enthält, stammend aus beiden Fällen mit (Mutantentyp) und ohne die Mutation (Wildtyp). Der Mutantentyp stellt die Heterozygote dar.
3 ist ein Ergebnis der Durchmusterung auf DNA-Fragmente, die Exon 7 im eNOS-Gen enthalten, durch PCR-RFLP. Das Restriktionsenzym ist BanII und/oder MboI. 3A ist eine Restriktionskarte davon. 3B ist eine Photographie, welche das Ergebnis der tatsächlichen Elektrophorese zeigt.
4 ist eine Photographie, welche das durch PCR-RFLP erhaltene Ergebnis der Elektrophorese, der Durchmusterung auf DNA-Fragmente zeigt, die Exon 6 im eNOS-Gen enthalten. Das Restriktionsenzym ist FokI.
5 ist eine Photographie, welche die durch PCR-RFLP erhaltenen Ergebnisse der Elektrophorese der Durchmusterung auf DNA-Fragmente zeigt, welche die –786- und –1468-Positionen in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens enthalten. Das Restriktionsenzym ist im Fall der –786-Mutation MspI, während es im Fall der –1468-Mutation MboI ist.
Genau Beschreibung der Erfindung
Wie vorstehend dargelegt, haben sich die hier genannten Erfinder auf das eNOS-Gen konzentriert, untersucht, ob das Gen für die Entwicklung von Koronar-Spasmus verantwortlich ist, und die folgenden Ergebnisse herausgefunden:
A) Mutationen in den Exons des eNOS-Gens
1) Mutation in Exon 7: das Guanin (G) an Position 894 der cDNA, die eNOS codiert, ist zu Thymin (T) mutiert
Mit Hilfe des PCR-SSCP(Polymerase-Kettenreaktion-Einzeistrang-Konformations-Polymorphismus)-Verfahrens und des direkten Sequenzierungsverfahrens wurde eine Punktmutation im Exon 7 des eNOS-Gens identifiziert, erhalten aus einem Patienten, der koronar-spastische Angina aufweist. Die Mutation stellt eine Veränderung von GAG zu GAT dar und entspricht der Mutation des Aminosäurerests von Glutaminsäure zu Asparaginsäure (Glu298Asp). Mittels Durchmusterung von 96 Patienten, die koronar-spastische Angina aufwiesen, und 86 Kontrollen für diese Mutation wurde festgestellt, dass 22 Patienten bzw. 7 Kontrollen diese Mutation tragen.
2) Mutation in Exon 6: Cytosin (C) an Position 774 der cDNA, die eNOS codiert, ist zu Thymin (T) mutiert
Das PCR-SSCP-Verfahren offenbarte, dass diese Basensubstitution in vier von 10 Patienten festgestellt wurde, die koronar-spastische Angina aufwiesen. Andererseits wurde diese Basensubstitution in 9 Kontrollpatienten nicht festgestellt (P = 0,03). Diese Basensubstitution ist nicht von einer Aminosäureveränderung begleitet.
B) Mutationen in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens
Mehrere Mutationen wurden im 5'-flankierenden Abschnitt des eNOS-Gens festgestellt und die Beziehung zwischen dieser Mutation und koronar-spastischen Erkrankungen wurde bewertet, um die folgenden Ergebnisse zu erhalten.
1) Thymin (T) in der 5'-flankierenden Region (–786) ist zu Cytosin (C) mutiert
Das PCR-SSCP-Verfahren offenbarte, dass diese Basensubstitution in 34 von 123 Patienten festgestellt wurde, die koronar-spastische Angina aufwiesen (27,6%), während diese Basensubstitution in nur 4 Kontrollen unter 86 Kontrollen festgestellt wurde (4,7%) (P < 0,0001).
2) Adenin (A) in der 5'-flankierenden Region (–922) ist zu Guanin (G) mutiert
Das PCR-SSCP-Verfahren offenbarte, dass diese Basensubstitution in 31 von 104 Patienten festgestellt wurde, die koronar-spastische Angina aufwiesen (29,1%), während diese Basensubstitution in nur 3 Kontrollen unter 83 Kontrollen festgestellt wurde (3,6%) (P < 0,0001).
3) Thymin (T) in der 5'-flankierenden Region (–1468) ist zu Adenin (A) mutiert
Das PCR-SSCP-Verfahren offenbarte, dass diese Basensubstitution in 26 von 98 Patienten festgestellt wurde, die koronar-spastische Angina aufwiesen (26,5%), während diese Basensubstitution in 26 Kontrollen nicht festgestellt wurde (0%) (P < 0,0006).
Die vorstehenden, mit dem eNOS-Gen in Verbindung stehenden Mutationen sind bei der Diagnose von mit Koronar-Spasmus verbundener Krankheit nützlich.
Der Begriff „mit Koronar-Spasmus verbundene Krankheit(en)" umfasst in der vorliegenden Beschreibung Angina, insbesondere koronar-spastische Angina, Prinzmetal-Angina, instabile Angina, Angina bei Anstrengung, Angina bei Ruhe, akuten Myokardialinfarkt, mikrovaskuläre Erkrankung und ähnliches.
Die Beziehung zwischen dem Koronar-Spasmus und den Mutationen, die mit dem eNOS-Gen in Verbindung stehen, ist durch die vorliegende Erfindung gezeigt worden, und wenn daher die Mutationen in dem eNOS-Gen oder im 5'-flankierenden Abschnitt davon nachgewiesen werden, die aus einem Patienten erhalten werden, bei dem eine mit Koronar-Spasmus verbundene Krankheit vermutet wird, kann erwartet werden, dass der fragliche Patient den Risikofaktor der mit Koronar-Spasmus verbundenen Krankheit aufweisen kann. Nur eine dieser Mutationen ist als ein Indikator für diese Krankheiten ausreichend und zwei oder mehrere Mutationen können ein besserer Indikator sein. Darüber hinaus ist festgestellt worden, dass die Mutationen, sowohl im eNOS-Gen-Abschnitt als auch im 5'-flankierenden Abschnitt davon, zu der Einschätzung führen, dass die mit den Koronar-Spasmus verbundenen Krankheiten schwerwiegend sind.
Wie vorstehend gezeigt, stellt die vorliegende Erfindung ein Durchmusterungsverfahren auf ein Gen bereit, welches eine mit Koronararterien-Spasmus verbundene Krankheit involviert, umfassend den Nachweis der Anwesenheit einer oder mehrerer Nucleotid-Änderungen im Gen der endothelialen Stickoxid-Synthase (eNOS), wobei die Änderungen ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den Änderungen von Guanin (G) zu Thymin (T) an Position 894 und von Cytosin (C) zu Thymin (T) an Position 774 der cDNA-Sequenz des eNOS-Gens und den Änderungen von Thymin (T) zu Cytosin (C) an Position –786, von Adenin (A) zu Guanin (G) an Position –922 und von Thymin (T) zu Adenin (A) an Position –1468 der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens sowie den Änderungen an den entsprechenden Positionen im komplementären Strang davon.
Der Begriff „die Veränderungen an den entsprechenden Positionen im komplementären Strang davon" bedeutet zum Beispiel, dass im Falle der Nucleotid- Änderung von Guanin (G) zu Thymin (T) an Position 894 in der cDNA des eNOS-Gens die Änderung vorliegt, dass Cytosin (C) an der Position im komplementären Strang, die der 894-Position entspricht, dann zu einem Adenin (A) mutiert ist.
Zuerst wird das Verfahren zur Erlangung des eNOS-Gens und der 5'-flankierenden Sequenz aus einem Patienten nachstehend dargestellt.
Jede Biopsie kann als eine Probe zum Erhalt des Gens verwendet werden und üblicherweise kann eine Probe von weißen Blutzellen und zusätzlich eine Biopsieprobe der Leber ebenfalls verwendet werden. Die Probe wird mit Proteinase K-SDS behandelt, um Proteolyse und Denaturierung hervorzurufen, und dann mit Phenol/Chloroform extrahiert, um genomische DNAs (+RNAs) zu ergeben. Falls benötigt, können die RNAs durch RNase entfernt werden.
Dann wird unter Verwendung eines der nachstehend gezeigten Primer eine PCR durchgeführt, um die genomische DNA zu amplifizieren. Dann wird die Anwesenheit von Mutationen durch das folgende Verfahren zum Nachweis von Nucleinsäuremutation bestätigt.

1) RFLP-Verfahren (Restriktions-Fragment-Längen-Polymorphismus)
2) PCR-SSCP-Verfahren (Einzelstrang-DNA-Konformations-Polymorphismus-Analyse)
3) ASO-Hybridisierungsverfahren (Allel-spezifische Oligonucleotid-Hybridisierung) Die PCR-Produkte werden auf einen Träger wie zum Beispiel einen Nylonfilter übertragen und mit einer synthetischen Oligonucleotidsonde von etwa 18-Nucleotiden Länge hybridisiert, die eine Basensequenz aufweist, welche die nachzuweisende Mutation enthält, und die mit einem Radioisotop oder Biotin markiert sein kann, um ein Signal zu ergeben. Wenn dann der Filter entsprechend dem Tm-Wert der Sonde gewaschen wird, ist es möglich eine Fehlpaarung von einem Basenpaar nachzuweisen, da die Fehlpaarung das Hybrid zum Schmelzen bringen würde. Dieses Verfahren ist als ein Verfahren zum Nachweis einer spezifischen Mutation von Basen durch PCR üblich.
4) Sequenzierungsverfahren
5) Southern-Blot-Verfahren Dieses Verfahren ist das übliche Verfahren zum Nachweis von Mutationen, welches die Spaltung einer DNA mit einem Restriktionsenzym, Entwicklung über Elektrophorese und Hybridisierung mit einer Sonde umfasst. Dieses Verfahren schließt sowohl genomische Southern-Blot- als auch PCR-Southern-Blot-Verfahren ein. Das Letztere, welches das gleiche Prinzip wie das Verfahren (3) verwendet, ist dadurch hinsichtlich der Genauigkeit vorteilhaft, dass es Information über die Wanderung bereitstellen kann.
6) ARMS (System der amplifizierungsresistenten Mutationen) In der PCR lagert sich ein Primer an eine Matrizen-DNA an und dann erzeugt eine DNA-Polymerase eine komplementäre DNA vom 5' zum 3'-Ende. ARMS basiert auf dem Prinzip, dass die Wirksamkeit der Amplifizierung von PCR vermindert wird und die PCR-Produkte nicht durch Gelelektrophorese nachgewiesen werden können, wenn das 3'-Ende des Primers mit der Matrizen-DNA eine Fehlpaarung bildet. Wenn der Primer, der am 3'-Ende eine Mutation aufweist, die nachgewiesen werden soll, in der Amplifizierung der PCR verwendet wird, ist es möglich, die Mutation nachzuweisen, indem die Anwesenheit oder Abwesenheit der amplifizierten Produkte untersucht wird.
7) DGGE (Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese) Dieses Verfahren basiert auf dem Prinzip, dass ein Heteroduplexmolekül, das eine Fehlpaarung in PCR-Produkten enthält, leichter dissoziieren kann als ein Homoduplexmolekül. In diesem Verfahren wird eine doppelsträngige DNA, die eine Fehlpaarung enthält, d.h. eine Mutation, aus dem Grund als Migration auf dem Elektrophoresegel nachgewiesen, dass die Migration einer solchen DNA im Gel während der Dissoziation schlecht ist, was durch Erhöhen des Dichtegradienten von Harnstoff und Formamid in dem verwendeten Polyacrylamidgel beschleunigt wird.
8) RNase A-Spaltungsverfahren RNas A (Ribonuclease) ist ein Enzym, das eine doppelsträngige RNA oder ein RNA/DNA-Hybrid nicht abbaut und eine einzelsträngige RNA selektiv abbaut. Wenn daher eine mit ³²P markierte RNA-Sonde mit einer Proben-DNA hybridisiert wird, die in einen Einzelstrang denaturiert worden ist, das Hybrid mit RNase A behandelt wird und die Produkte über Elektrophorese entwickelt werden, dann können zwei Banden aus dem Grund nachgewiesen werden, dass die von der RNA-Sonde stammende einzelsträngige RNA, die mit der mutierten DNA hybridisiert, durch RNase A gespalten wird.
9) Chemisches Spaltungsverfahren Das „C"-Nucleotid und „T"-Nucleotid an der Fehlpaarungsstelle einer Hybrid-DNA können durch Hydroxylamin bzw. Osmiumtetraoxid modifiziert werden und dann wird die modifizierte DNA mit Piperidin behandelt, um den Zuckerrest zu spalten. Ein Hybrid aus einer markierten Sonde und der Proben-DNA wird in diesem Verfahren eingesetzt und mittels Elektrophorese ausgewertet. Wenn die Mutation in der Proben-DNA vorhanden ist, wird die markierte Sonde in einer kleineren Größe nachgewiesen. Im Falle des Nachweises von Glu298Asp ist die Fehlpaarungsstelle C-T und daher kann die umgekehrte Sequenz des Wildtyps auch zum Nachweis der Fehlpaarung verwendet werden.
10) Ligaseverfahren Dieses Verfahren basiert auf dem Prinzip, dass zwei Arten von Oligonucleotiden nicht miteinander mittels DNA-Ligase ligiert werden können, wenn die Matrizen-DNA an der Bindungsstelle (eine) Fehlpaarung(en) aufweist.
i) LMGD (Ligase-vermittelter Gennachweis) Zum Beispiel wird eine Oligo-DNA mit ³²P markiert, während die andere DNA mit Biotin markiert wird. Beide werden miteinander ligiert und das ligierte Produkt wird durch Absorption an Streptavidin gesammelt. Wenn sie sicher miteinander ligiert sind, mit anderen Worten, wenn keine Fehlpaarung gebildet wird, dann können sie nachgewiesen werden, da die Radioaktivität von ³²P höher wird.
ii) LCR (Ligase-Kettenreaktion) Durch Wiederholen der vorhergehenden Ligierung, mit Ausnahme der Verwendung thermo-stabiler Ligase, wird eine Oligo-DNA an einen DNA-Strang angelagert, ähnlich wie in der PCR, und daher wird ein sensitiverer Nachweis der Mutation ermöglicht.

Bestes Verfahren zur Durchführung der Erfindung
1. Mutation in Exon 7
Die Mutation in Exon 7, speziell die Mutation von Guanin (G) zu Thymin (T) an der Position 894 der cDNA, die eNOS codiert, stellt eine Veränderung von GAG zu GAT dar; davon bilden beide unterschiedliche Restriktionsstellen. Die Anwesenheit der Mutation kann daher unter Verwendung eines Restriktionsenzyms bestimmt werden. Speziell ermöglicht die Spaltung der amplifizierten Produkte entweder mit dem Restriktionsenzym BanII oder MboI, den Nachweis der Anwesenheit einer Mutation. Genauer gesagt wird das Vorliegen einer Mutation festgestellt, wenn das Restriktionsenzym BanII die fragliche Stelle spalten kann, während die Mutation nicht vorhanden ist, wenn das Restriktionsenzym MboI die fragliche Stelle spalten kann.
Nachdem die Mutation von Guanin (G) zu Thymin (T) an Position 894 der cDNA, die eNOS codiert, der Mutation in der Aminosäure von Glutaminsäure zu Asparaginsäure (Glu298Asp) entspricht, kann alternativ die Veränderung der Aminosäuresequenz von eNOS, d.h. die Änderung von Glutaminsäure zu Asparaginsäure an der Position 298 der Aminosäuresequenz von eNOS, ein Indikator sein.
2. Mutation in Exon 6
Die Mutation in Exon 6, speziell die Mutation von Cytosin (C) zu Thymin (T) an Position 774 der cDNA, die eNOS codiert, ergibt jeweils eine unterschiedliche Restriktionsstelle, sodass die Anwesenheit der Mutation unter Verwendung eines Restriktionsenzyms bestimmt werden kann. Speziell ermöglicht die Spaltung der amplifizierten Produkte mit dem Restriktionsenzym FokI den Nachweis der Anwesenheit der Mutation. Genauer gesagt wird das Vorliegen einer Mutation festgestellt, wenn die Produkte mit dem Restriktionsenzym FokI gespalten werden können, während die Mutation nicht vorhanden ist, wenn die Produkte nicht mit FokI gespalten werden können.
3. Mutation an Position –786 in der 5'-flankierenden Region
Die Mutation in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens, speziell die Mutation von Thymin (T) zu Cytosin (C) an Position –786, ergibt auch jeweils unterschiedliche Restriktionsstellen, sodass die Anwesenheit der Mutation unter Verwendung eines Restriktionsenzyms bestimmt werden kann. Speziell ermöglicht die Spaltung der amplifizierten Produkte mit dem Restriktionsenzym MspI den Nachweis der Anwesenheit der Mutation. Genauer gesagt wird die Mutation nicht festgestellt, wenn das Restriktionsenzym MspI die amplifizierten Produkte an einer Stelle spaltet, während die Mutation vorhanden ist, wenn MspI die amplifizierten Produkte an zwei Stellen spaltet.
4. Mutation an Position –1468 in der 5'-flankierenden Region
Die Mutation in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens, speziell die Mutation von Thymin (T) zu Adenin (A) an Position –1468, ergibt ebenfalls jeweils unterschiedliche Restriktionsstellen, sodass die Anwesenheit der Mutation durch die Verwendung eines Restriktionsenzyms bestimmt werden kann. Speziell ermöglicht die Spaltung der amplifizierten Produkte mit dem Restriktionsenzym MboI den Nachweis der Anwesenheit der Mutation. Genauer gesagt ist die Mutation nicht vorhanden, wenn das Restriktionsenzym MboI die amplifizierten Produkte an einer Stelle spaltet, während die Mutation vorhanden ist, wenn MspI die amplifizierten Produkte an zwei Stellen spaltet.
Beispiele
Beispiel 1
Nachweis der Mutation in Exon 7 im eNOS-Gen
Testpersonen sind 96 Patienten, welche koronar-spastische Angina aufweisen, und 86 Kontrollen. Alle Patienten mit koronar-spastischer Angina machen bei Ruhe spontanen Schlaganfall durch (männlich 53, weiblich 43, mittleres Alter 61, Alter 33-86). Herzkatheter-Untersuchungen wurden an allen Patienten durchgeführt, um den durch Acetylcholin oder Ergonovin induzierten Koronar-Spasmus durch koronare Arteriographie zu überprüfen sowie auch um wesentliche ST-T-Veränderung über ein Elektrokardiogramm zu bestätigen (7,8). Signifikante Einschnürungen der Koronararterie wurden nicht in allen Patienten gefunden (> 75%).
Unter 86 Kontrollen bilden 61 ein Gruppe mit Stechen in der Brust (breast pung), 12 bilden eine Gruppe, die ein abnormales Elektrokardiogramm aufweist, 13 bilden eine Gruppe, die einen leichten Herzklappenfehler aufweist (männlich 35, weiblich 51, mittleres Alter 61, Alter 13-83).
Koronare Arteriographie offenbarte, dass keiner in den Kontrollen signifikante Einschnürungen aufwies. Wenn an 61 Testpersonen der Gruppe mit Stechen in der Brust und 12 Testpersonen der Gruppe, die ein abnormales Elektrokardiogramm aufwiesen, ein Test durch koronare Verabreichung von Acetylcholin oder Ergonovin durchgeführt wurde, der einen Koronar-Spasmus induzierte, waren alle Testpersonen negativ. Die Kontrolle beinhaltet keine Testpersonen, die Myokardinfarkt, Syndrom X, Myokardiopathie und Herzinsuffizienz aufwiesen.
(1) Untersuchung der eNOS-Genmutation durch PCR-SSCP
Isolierung von DNA
Peripheres venöses Blut wurde aus 10 Patienten, die typische Koronar-Spasmen aufwiesen, und 9 Kontrollen gesammelt und die DNAs wurden unter Verwendung eines DNA-Extraktionskits DNAQUICK [DAINIPPON SEIYAKU] aus den weißen Blutzellen (28) extrahiert.
ii) PCR-Schritt
Mit Bezug auf die Struktur des eNOS-Gens, von welcher berichtet wurde (18-25), wurde ein PCR-SSCP-Verfahren an allen Exons im eNOS-Gen durchgeführt (29).
Alle Primer wurden auf Basis der Intronsequenz erzeugt, um jedes Exon zu flankieren. Alle in diesem Schritt verwendeten Primer werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1. Für den Polymerase-Kettenreaktion-Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (PCR-SSCP) verwendete Primer füralle 26 Exons des Endothelzellen-Stickoxid-Synthase (eNOS)-Gens

Oben: Sense-Primer, Unten: Antisense-Primer in jedem Primersatz Basennpaar-Länge von amplifizierten Fragmenten in Klammern. Drei Primer-Sätze wurden in der Analyse von Exon 26 verwendet.

Zu einer Lösung in einem Gesamtvolumen von 5 μl, enthaltend 50 mMol/l KCl, 20 mMol/l Tris-HCl (pH-Wert 8,4), 0,75 mMol/l MgCl₂, 0,1 mMol/l dNTPs, 0,2 ml α-[³²P] dCTP (0,2 ml), 5 pMol von jedem Primer und 0,01 E Taq-Polymerase (GIBCO BRL, Life Technologies Inc., MD USA), in jedem Röhrchen wurden 30 ng der DNA von den Patienten hinzugefügt.
Das PCR-Verfahren wurde wie folgt durchgeführt: ein Zyklus von 2 Minuten bei 94°C, 30 Zyklen von 30 Sekunden bei 94°C, 30 Sekunden bei 55-58°C und eine Minute bei 72°C; und die daraus resultierenden amplifizierten Produkte wurden bei 4°C gelagert.
Die Amplifizierung von Exon 7 wurde bei 57°C durchgeführt.
iii) SSCP-Schritt
Elektrophorese wurde unter drei Bedingungen durchgeführt, von welchen eine ein 5% Glyceringel bei Raumtemperatur ist, und die anderen sind ein 5% und ein 10% Glyceringel bei 4°C.
Die Glyceringele wurden wie folgt erzeugt.

1) Erzeugung einer 5% Lösung, enthaltend 49:1 Acrylamid und N,N'-Methylen-bis-acrylamid.
2) Erzeugung von 0,5 × TBE (10 × TBE wird 20-fach verdünnt: 108 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan + 55 g Borsäure + 40 ml 0,5 M EDTA + Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 500 ml).
3) Erzeugung eines Gels durch Hinzufügen von 160 μl 10% APS (Ammoniumperoxodisulfid) und 60 μl TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin) zu einer Lösung aus 5% oder 10% Glycerin.

iv) Ergebnis
Das durch Amplifizierung von Exon 7 erhaltene Ergebnis wird in 1 gezeigt. Diese zeigt eine Bandenverschiebung des Fragments, umfassend Exon 7, in drei von 10 Patienten mit koronar-spastischer Angina. Andererseits wurde in den Kontrollen keine Verschiebung gezeigt.
(2) Analyse des Mutantengens durch direktes Sequenzierungsverfahren
DNAs der Patienten, in welchen durch PCR-SSCP in Schritt (1) die Mutation festgestellt wurde, und der Kontrollen, bei denen durch PCR-SSCP in Schritt (1) keine Mutation festgestellt wurde, wurden noch einmal unter den gleichen Bedingungen wie in Schritt (1) amplifiziert und die amplifizierten Produkte wurden durch das Wizard PCR Preps DNA-Reinigungssystem (Wizard PCR Preps DNA-Reinigungssystem, Promega, USA) gereinigt. Dann wurde die Basensequenz durch ein Autosequenziergerät, hergestellt durch ABI [USA], bestimmt.
Durch Analyse der Mutanten-DNA und der Wildtyp-DNA wurde durch das direkte Sequenzierungsverfahren die Punktmutation von Guanin (G) zu Thymin (T) bei Position 894 in Exon 7 der eNOS-cDNA festgestellt. Diese Mutation wurde in drei Patienten bestätigt, bei denen diese Mutation festgestellt wurde. Die Punktmutation stellt eine Missense-Mutation dar, die der Änderung von Glutaminsäure zu Asparaginsäure (Glu298Asp) entspricht. Die Ergebnisse der direkten Sequenzierung werden in 2 gezeigt. Diese Figur umfasst die Ergebnisse des Wildtyps ohne Mutation und des Heterozygoten-Typs.
(3) Durchmusterung auf die Mutation aus „G" nach „T" durch PCR-RFLP
Nachdem, wie in Schritt (2) gezeigt, die Missense-Mutation, die Glu298Asp induziert, in Exon 7 des eNOS-Gens festgestellt wurde, wurden alle 96 Patienten, die koronar-spastische Angina aufwiesen, und 86 Kontrollen auf die Mutation durchmustert. Diese Durchmusterung wurde durch PCR-RFLP (Polymerase-Kettenreaktion–Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus) durchgeführt. Zwei Typen der Restriktionsenzyme, BanII und MboI (erworben von TAKARA), wurden verwendet, um Fehler zu vermeiden, die auf der unvollständigen Spaltung durch Restriktionsenzyme basieren.
Exon 7 des eNOS-Gens aus allen Fällen wurde gemäß den Verfahren von (ii) in Schritt (1) amplifiziert. Die amplifizierten Fragmente, welche Exon 7 enthalten, umfassten 248 bp. Dann wurden die amplifizierten Fragmente entweder mit BanII oder MboI gemäß den Anweisungen des Herstellers gespalten. Die gespaltenen Produkte wurden auf einem 4% Nusieve-GTG-Agarosegel einer Elektorphorese unterworfen, um eine Bande zu ergeben.
Die Ergebnisse konnten, wie in 3 gezeigt, in drei Muster eingeteilt werden. 3A ist eine Restriktionskarte und 3B ist eine Photographie des Ergebnisses der tatsächlichen Elektrophorese. Wie in 3B gezeigt wird, ergibt BanII zwei Fragmente, die 163 bp und 85 bp lang sind, und MboI ergibt eine Bande, die 248 bp aufweist, die im Wildtyp ohne der Mutation nicht gespalten wird. Das zeigt, dass der Wildtyp mit der Mutation eine Restriktionsstelle von BanII und keine Restriktionsstelle von MboI aufweist.
Im Fall von Homozygotie, bei welcher T/T an Position 894 der eNOS-cDNA vorliegt, ergibt BanII keine Spaltung (248 bp), während MboI zwei Fragmente von 158 bp und 90 bp in Länge ergibt. Das zeigt, dass bei Homozygotie keine Restriktionsstelle von BanII und eine Restriktionsstelle von MboI vorliegt.
Es gibt einige Fälle, die drei Banden von 248 bp, 163 bp und 85 bp Länge durch BanII und 248 bp, 158 bp und 90 bp Länge durch MboI ergeben haben. Das wird als Heterozygote (G/T) angesehen, da sowohl BanII als auch MboI lediglich eine Spaltungsstelle in jeder Bande ergeben.
Auf der Basis der vorstehend gezeigten drei Muster wurde die Häufigkeit der eNOS-Gen-Glu298Asp-Mutation in allen Fällen der koronar-spastischen Angina und der Kontrollgruppen untersucht. Die Spaltung mit beiden Enzymen wurde in allen Fällen durchgeführt. Die durch diese beiden Enzyme erhaltenen Ergebnisse stimmen in allen Fällen überein.
Die Glu298Asp-Mutation wurde in 22 der 96 koronar-spastischen Anginapatienten (23%) nachgewiesen, in welchen einer homozygot ist und 21 heterozygot sind. Andererseits wurde die Mutation in 7 der 86 Kontrollen (8%) festgestellt, alle davon sind heterozygot.
(4) Statistische Analyse: Beziehung zwischen Koronar-Spasmus und der Glu298Asp-Mutation oder anderen Risikofaktoren

Die in Schritt (3) erhaltene Mutationshäufigkeit wurde mit der Frequenz von anderen koronaren Risikofaktoren einschließlich Alter, Geschlecht, hohem Blutdruck, Diabetes meleitus, Hypercholesterinämie, Body-Mass-Index und Rauchen zwischen der Kontrolle und den koronar-spastischen Anginagruppen durch Chi-Quadrat-Analyse und ungepaartem t-Test mit der Fisher Exact-Wahrscheinlichkeit verglichen. Ferner wurde, mittels SPSS Advanced Statistics 6.1 für Macintosh (SPSS Japan Inc. Japan), eine multivariate Analyse (multiple logistische Regressionsanalyse) durchgeführt, um zu untersuchen, welcher Faktor am meisten mit dem Koronar-Spasmus in Zusammenhang steht. Dummy-Variable wurden als alle unabhängige Variable wie folgt verwendet. Jeder nummerische Wert stellt den Mittelwert ± SA (f. Standardabweichung) dar.

Geschlecht;	0: männlich, 1: weiblich
Alter;	0: unter 60, 1: 60 oder darüber
Body-Mass-Index;	0: unter 26, 1: 26 oder darüber
Cholesterinämie;	0: normal, 1: Hypercholesterinämie (Grenzwert, 260 mg/dl)
Rauchen;	0: Nichtraucher, 1: Raucher
Bluthochdruck;	0: normal, 1: hoch (Grenzwert, 160/95 mmHg)
Diabetes mellitus;	0: fehlend, 1: vorhanden (Grenzwert, 140 mg/dl an Blut-Glucose beim Fasten oder 200 mg/dl in OGTT)

Die Ergebnisse der Chi-Quadrat-Analyse und die Ergebnisse der Analyse, die eine schrittweise Vorwärtsauswahl (Wald) verwendet, werden in den Tabellen 2 bzw. 3 gezeigt, wobei p = 0,05 in der Statistik als ein signifikanter Wert betrachtet wird.
Ergebnisse der statistischen Analyse
Von den Beziehungen zwischen Koronar-Spasmus und der Glu298Asp-Mutation oder anderen Risikofaktoren wie zum Beispiel Alter, Geschlecht, Bluthochdruck, Diabetes meleitus, Hypercholesterinämie, Body-Mass-Index und Rauchen waren, wie in Tabelle 2 gezeigt, Geschlecht (p = .035), Rauchen (p = .00001) und die Glu298Asp-Mutation (p = .005) signifikant. Tabelle 2. Klinische Charakteristika der Studienpatienten; Vergleich zwischen der Kontrolle und koronar-spastischen Anginapatienten

* nicht gepaarter t-Test und ** Chi-Quadrat-Analyse mit Fisher Exact-Wahrscheinlichkeit wurden durchgeführt.

Die Ergebnisse der Multivarianten-Analyse (multiple logistische Regressions-Analyse) werden in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 zeigt, dass Rauchen der erste Faktor ist, der Verantwortlichkeit für Koronar-spasmus zeigt (p = .0005) und die Glu298Asp-Mutation ist der zweite Faktor (p = .0272). Multiple logistische Regressions-Analyse zeigt keine signifikante Beziehung zwischen Geschlecht und Koronar-Spasmus.
Beispiel 2
Nachweis der Mutation in Exon 6 des eNOS-Gens
Gemäß den Verfahren von Beispiel 1 wurde genomische DNA aus 10 Patienten mit koronar-spastischer Angina und 9 Kontrollen isoliert. PCR wurde unter Verwendung der in Tabelle 1 beschriebenen Primer durchgeführt und dann wurde ein SSCP-Verfahren durchgeführt, um die Mutation in Exon 6 nachzuweisen. Dann wurde das Exon 6 direkt sequenziert, um die Substitution der Base von Cytosin (C) zu Thymin (T) bei Position 774 in der cDNA des eNOS-Gens nachzuweisen.
Diese Basensubstitution wurde in 4 von 10 Patienten festgestellt, die koronar-spastische Angina aufwiesen, während diese Substitution in 9 Kontrollen nicht gefunden wurde (p = 0.03). Diese Substitution steht nicht mit einer Änderung der Aminosäure in Zusammenhang.
Beispiel 3
Nachweis der Mutation in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens (1)
Die Verfahren von Beispiel 1 wurden im Wesentlichen wiederholt, außer der Verwendung der folgenden Primer zur Identifikation der Basensubstitutionen von Thymin (T) zu Cytosin (C) in der 5'-flankierenden Region (–786).
PCR-SSCP (–585~–820 bp; 236 bp)

Primer 5'-Seite: 5'ATGCTCCCACCAGGGCATCA-3'
Primer 3'-Seite: 5'-GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG-3'

Diese Basensubstitution wurde in 34 von 123 Patienten gefunden, die koronar-spastische Angina aufwiesen (27,6%), während diese Substitution in nur 4 von 86 Kontrollen (4,7%) gefunden wurde. (P < 0,0001)
Beispiel 4
Nachweis der Mutation in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens (2)
Die Verfahren von Beispiel 1 wurden im Wesentlichen wiederholt, außer dass die folgenden Primer verwendet wurden, um die Basensubstitution von Adenin (A) zu Guanin (G) in der 5'-flankierende Region zu identifizieren (–922).
PCR-SSCP(–801~–1008 bp; 208 bp)

Primer 5'-Seite: 5'-TCAGTCTCTGAGGTCTCGAA-3'
Primer 3'-Seite: 5'-TGATGCCCTGGTGGGAGCAT-3'

Diese Basensubstitution wurde in 31 von 104 Patienten gefunden, die koronar-spastische Angina aufwiesen (29,1%), während diese Substitution in nur 3 von 83 Kontrollen (3,6%) gefunden wurde. (P < 0,0001)
Beispiel 5
Nachweis der Mutation in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens (3)
Die Verfahren von Beispiel 1 wurden im Wesentlichen wiederholt, außer dass die folgenden Primer verwendet wurden, um die Basensubstitution von Thymin (T) zu Adenin (A) in der 5'-flankierende Region zu identifizieren (–1468).
PCR-SSCP(–1214~–1490 bp; 221 bp)

Primer 5'-Seite: 5'-CCATTAACTGGAACCTAGGAA-3'
Primer 3'-Seite: 5'-AGCCTGGGCTTTGTCCCATGA-3'

Diese Basensubstitution wurde in 26 von 98 Patienten gefunden, die koronar-spastische Angina aufwiesen (26,5%), während diese Substitution in 26 Kontrollen nicht gefunden wurde (0%). (P < 0,0006)
Beispiel 6
Durchmusterung der Mutationen
Die fünf Mutationen, die in den vorstehenden Arbeitsbeispielen identifiziert wurden, können zum Beispiel mittels des ASO-Hybridisierungsverfahrens (Hybridisierung mit Allel-spezifischen Oligonucleotiden) in großem Rahmen durchmustert werden. Dieses ASO-Hybridisierungsverfahren für umfangreiche Durchmusterung wird nachstehend erklärt:

1) Durchführen von PCR, ähnlich zu SSCP. In diesem Fall ist das Endvolumen 20 μl. Die Reaktionszusammensetzung und Zyklusbedingungen sind die gleichen wie jene in Beispiel 1;
2) Entnehmen eines 10 μl-Aliquots der PCR-Reaktion, Immobilisieren eines 100 μl-Aliquots von 200 μl 0,5 M NaOH (1,5 M NaCl + 25 mM EDTA2Na) auf einer Nylonmembran für den Wildtyp und dann Immobilisieren der verbleibenden 100 μl auf einer Nylonmembran, für den Mutantentyp;
3) Verpacken von jeder der immobilisierten Nylonmembranen in einen getrennten Hybri-Beutel, Hinzufügen der Vorhybridsierungslösung (3 × SSPE, 5 × Denhardt-Reagenz, 0,5% SDS, 1 μg/μl Heringssperma-DNA) zu den Beuteln und Inkubieren der Beutel bei 65°C für 2 Stunden;
4) Einführung der normalen mit ³²P (5 × 10⁶ ZpM (f. Zerfälle pro Minute)/ml) markierten Sonde und die abnormale Sonde ohne alle Markierungen in einen Beutel in fünffachem Volumen, während die abnormale Sonde, markiert mit ³²P (5 × 10⁶ dpm/ml), und die normale Sonde ohne alle Markierungen in fünffachem Volumen in den anderen Beutel eingeführt wird;
5) Inkubieren von jedem der Beutel bei 60°C für 30 Minuten und ferner Inkubieren derselben für eine weitere Stunde, während die Temperatur von 60°C auf X°C gesenkt wird, wobei X 53 in Beispiel 3, 50 in Beispiel 4 und 46 in Beispiel 5 darstellt;
6) Entnehmen der Nylonmembranen aus den Beuteln und zweifaches Inkubieren der Membranen in 2 × SSPE (0,1% SDS) bei Raumtemperatur für 10 Minuten und dann einmal Inkubieren in 5 × SSPE (0,1% SDS) bei X°C für 10 Minuten.
7) Umwickeln der Nylonmembranen mit Klarsichtfolie, Überlagerung mit einem Röntgenfilm und Entwickeln des Röntgenfilms (Autoradiogramms).

Beispiel 7
Durchmusterung auf Mutationen in Exon 6 und in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens
Durch das in den Beispielen 2, 3 und 5 beschriebene direkte Sequenzierungsverfahren wurden die Basensubstitution von Cytosin (C) zu Thymin (T) bei Position 774 in der cDNA des eNOS-Gens sowie auch die Substitutionen von Thymin (T) zu Cytosin (C) bei Position –786 und von Thymin (T) zu Adenin (A) bei Position –1468 in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens identifiziert. Die Durchmusterung auf diese Mutationen wurde durch das PCR-RFLP-Verfahren durchgeführt. Oligonucleotide und Bedingungen für die Amplifizierung in dieser PCR werden in den Tabellen 4 und 5 gezeigt: Tabelle 4
Tabelle 5
Die PCR-Reaktion wurde in einem Volumen von 25 ml Puffer durchgeführt (Zusammensetzung: 10 mM Tris-HCl, pH-Wert 9,0, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂ und 0,1% Triton X-100; 0,5 mM von jedem der PCR-Primer; 200 mM Desoxynucleotid; 0,5 E Taq-Polymerase)

*: Temperatur wurde auf einem DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer Cytus) durchgeführt.
De.¹⁾: Denaturierung An.²⁾: Anlagerung; Ex.³⁾: Verlängerung

(1) Mutation in Exon 6
Gemäß den Verfahren von Schritt (2) in Beispiel 1 wurde Exon 6 des eNOS-Gens in einer Probe unter Verwendung der in Tabelle 5 beschriebenen Primer und den in Tabelle 5 beschriebenen Amplifikationsbedingungen amplifiziert. Das resultierende amplifizierte Fragment (232 bp) wurde mit FokI gemäß den Instruktionen des Herstellers gespalten und die gespaltenen Produkte wurden auf 10% Polyacrylamidgelen einer Elektrophorese unterworfen, um die Banden zu identifizieren. Da FokI nur das mutierte Gen spalten kann, wurde festgestellt, dass die Homozygote, die C/C aufweist, die Bande von 232 bp ergibt, die Heterozygote, die C/T aufweist, ergibt die Banden von 232 bp, 133 bp und 99 bp, und die Homozygote, die T/T aufweist, ergibt die Banden von 133 bp und 99 bp. Die Ergebnisse der Durchmusterung durch PCR-RFLP werden in 4 gezeigt.
(2) Die Mutation an Position –786 in der 5'-flankierenden Region
Gemäß den Verfahren von Schritt (2) in Beispiel 1 wurde unter Verwendung der in Tabelle 5 beschriebenen Primer und von den in Tabelle 5 beschriebenen Bedingungen für die Amplifizierung ein Teil amplifiziert, der die Mutation an Position –786 in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens in einer Probe umfasste. Das daraus resultierende amplifizierte Fragment (354 bp) wurde mit MspI gemäß den Anweisungen des Herstellers gespalten und die gespaltenen Produkte wurden auf 10% Polyacrylamidgelen einer Elektrophorese unterworfen, um die Banden zu identifizieren. MspI spaltet die Homozygote des Wildtyp-Gens (T) an einer Stelle, um zwei Banden von 196 bp und 158 bp zu ergeben. Andererseits spaltet MspI die Homozygote des mutierten Gens (G) an zwei Stellen, um drei Banden von 158 bp, 154 bp und 44 bp zu ergeben. Die Ergebnisse der Durchmusterung durch PCR-RFLP werden in 5 gezeigt.
(3) Die Mutation an Position –1468 in der 5'-flankierenden Region
Gemäß den Verfahren von Schritt (2) in Beispiel 1 wurde unter Verwendung der in Tabelle 5 beschriebenen Primer und von den in Tabelle 5 beschriebenen Bedingungen für die Amplifizierung ein Teil amplifiziert, der die Mutation an Position –1468 in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens in einer Probe umfasste. Das daraus resultierende amplifizierte Fragment (627 bp) wurde mit MboI gemäß den Anweisungen des Herstellers gespalten und die gespaltenen Produkte wurden auf 10% Polyacrylamidgelen einer Elektrophorese unterworfen, um die Banden zu identifizieren. MboI spaltet die Homozygote des Wildtyp-Gens (T) an einer Stelle, um zwei Banden von 515 bp und 112 bp zu ergeben. Andererseits spaltet MboI die Homozygote des mutierten Gens (A) an zwei Stellen, um drei Banden von 515 bp, 61 bp und 41 bp zu ergeben. Die Ergebnisse der Durchmusterung durch PCR-RFLP werden in 5 gezeigt.
(4) Die Mutation an Position –922 in der 5'-flankierenden Region
Diese Mutation wurde durch PCR-SSP (Sequenzspezifischer Primer) nachgewiesen. Ein jeder der beiden Primertypen, für Vorwärts- und Rückwärts-Verlängerung (im Ganzen 4 Arten) wurde entworfen, um von „A" oder „G" an Position 922 in 3'-Richtung zu verlängern. Diese Primer sind die gleichen wie jene, die in Tabelle 4 in (b) und (c) beschrieben wurden. Ein Sense- und ein Anti-Sense-Primer (zwei Arten), die mit diesen Primern gepaart werden sollen, wurden so entworfen, dass die zu amplifizierenden Abschnitte die Mutation an Position –1468 bzw. –786 enthielten. Das PCR-Verfahren offenbarte, dass die Homozygote, die A/A an Position 922 enthält, nur durch einen Primer amplifiziert werden kann, der „A" oder „T" (komplementäre Sequenz) am 3'-Ursprung enthält, während die Homozygote, welche G/G enthält nur durch einen Primer amplifiziert werden kann, der „G" oder „C" (komplementäre Sequenz) am 3'-Terminus enthält.
Die daraus resultierenden amplifizierten Fragmente sind die gleichen wie jene, die vorstehend in (2) und (3) erhalten wurden. Durch Untersuchung der amplifizierten Fragmente in manchen Proben wurde festgestellt, dass das amplifizierte Fragment (354 bp), das vorstehend unter (2) erhalten wurde und von dem Allel stammt, das „A" an Position –922 (Wildtyp) aufweist, nur Wildtyp ergibt, der „T" an Position –786 aufweist, während das vorstehend in (2) erhaltene amplifizierte Fragment (354 bp), das von dem Allel stammt, das „G" an Position –922 (Mutantentyp) aufweist, nur Mutantentyp ergibt, der „G" an Position –786 aufweist. Auf ähnliche Weise ergibt das amplifizierte Fragment (627 bp) des vorstehenden (3), welches von dem Allel stammt, das „A" an Position –922 (Wildtyp) aufweist, nur Wildtyp, der „T" an Position –1468 aufweist, während das amplifizierte Fragment (627 bp) des vorstehenden (3), welches von dem Allel stammt, das „G" an Position –922 aufweist (Mutantentyp), nur Mutantentyp ergibt, der "A" an Position –1468 aufweist. Diese Ergebnisse zeigen, dass in einer bestimmten Ausführungsform alle der vorstehenden Mutationen in der 5'-flankierenden Region eine Kopplung bilden können und auf dem gleichen Allel anwesend sind, was darauf hindeutet, dass, wenn eine der drei Mutationen nachgewiesen wird, die anderen beiden Mutationen vorhanden sein können.
Diskussion
Wie vorstehend gezeigt, haben die hier genannten Erfinder angenommen, dass Mutationen in dem eNOS-Gen für die Verminderung der Aktivitäten von NOS verantwortlich sein sollten, wobei diese Verminderung einen Koronar-Spasmus auslösen kann, und sie haben einige Experimente zur Untermauerung ihrer Hypothese durchgeführt. Wenn die Hypothese wahr ist, stimmt sie mit der Tatsache überein, dass Koronar-Spasmus nicht nur bei einem Ast, sondern auf mehreren Ästen vorkommt (8). Die Mutation Glu298Asp, wie sie in Beispiel 1 gezeigt wurde, ist früher durch Marsden et al. (24) aufgezeigt worden, aber dort wurde die Wichtigkeit der Mutation nicht beschrieben.
In Beispiel 1 wurde die Mutation Glu298Asp in 23% der koronar-spastischen Anginapatienten festgestellt, während sie in 8% der Kontrollen festgestellt wurde, was darauf hindeutet, dass die Frequenz der Mutation in der Angina-Gruppe verglichen mit der Kontrollgruppe signifikant höher ist. Das Ergebnis der multivariaten Analyse zeigt, dass die Beziehung zwischen dem Koronar-Spasmus und der Mutation Glu298Asp als signifikant betrachtet wird.
Es kann in Erwägung gezogen werden, dass, da die Mutationsrate in der koronar-spastischen Gruppe nur 23% beträgt, die Koronar-Spasmen der verbleibenden 77% der Patienten durch andere pathogene Faktoren als diese Mutation verursacht werden können. Die hier genannten Erfinder haben angenommen, dass Mutationen in anderen Abschnitten als Exon 7 von eNOS vorliegen können, welches in Beispiel 1 beschrieben wird, einschließlich dem Promotor und Introns und haben einige Experimente durchgeführt, um Resultate zu erlangen, die ihre Hypothese unterstützen (Beispiele 2-5). Wenn die Beziehung dieser Mutation spezieller untersucht wird, ist es demgemäß möglich eine verlässlichere Diagnose für mit einem Koronar-Spasmus verbundene Krankheit zu erzielen.
Alternativ kann in Erwägung gezogen werden, dass der Koronar-Spasmus nicht nur durch das eNOS-Gen, sondern auch durch andere Gene verursacht wird. Ferner sollte festgehalten werden, dass Koronar-Spasmus nicht nur durch genetische Faktoren hervorgerufen werden kann, sondern auch durch Umweltfaktoren, da Patienten, die den familiären Anfallstyp des Koronar-Spasmus aufweisen, relativ selten sind. In Beispiel 1 wird gezeigt, dass Rauchen einer der Risikofaktoren für den Koronar-Spasmus ist. Dieses Ergebnis stimmt mit früheren Berichten überein (30, 31). Die Ergebnisse der multiplen logistischen Regressionsanalyse in der vorliegenden Beschreibung zeigen, dass Rauchen der dominanteste Faktor unter allen Risikofaktoren einschließlich der Mutation ist, was darauf hindeutet, dass die Umweltfaktoren in der Pathogenese des Koronar-Spasmus äußerst wichtig sind. Andere Wissenschafter haben auch darauf hingewiesen, dass Rauchen endothelialen Schaden verursacht (32, 33).
Die Mutation Glu298Asp ist in 8% der Kontrollen festgestellt worden (786, Beispiel 1). Dieser Grund wird nicht vollständig verstanden und es wird jedoch angemerkt, dass, nachdem sechs der sieben Testpersonen, die diese Mutation aufweisen, Nichtraucher sind, diese sechs Testpersonen nicht mit Rauchen, dem starken Risikofaktor, in Beziehung stehen. Schwierigkeiten bei der Diagnose des Koronar-Spasmus sollten auch in Betracht gezogen werden. Speziell kann der Koronar-Spasmus aus verschiedenen Gründen übersehen werden und der Fall, der zur koronar-spastischen Gruppe zugeordnet werden sollte, wird aus den folgenden Gründen der Kontrollgruppe zugeordnet:

1) Der Anfall wird wahrscheinlich nicht bemerkt, da der Anfall oft in der Mitte der Nacht bis zum frühen Morgen stattfindet und im Allgemeinen nicht während des Tages stattfindet;
2) Verabreichung von Acetylcholin in die Koronararterie kann nicht immer einen Koronar-Spasmus hervorrufen und der Koronar-Spasmus ist oft von der Krankheitsaktivität der koronar-spastischen Angina abhängig.
3) Über zwei Drittel von Attacken von Koronar-Spasmen verlaufen symptomlos (subklinisch);
4) Sogar wenn das Ergebnis der Untersuchung nicht anzeigt, dass es eine koronar-spastische Angina war, kann die Angina in der Zukunft auftreten. Andererseits besteht die koronar-spastische Angina-Gruppe hierin aus den Fällen, die durch koronare Arteriography eindeutig dahingehend diagnostiziert wurde, dass sie einen Koronar-Spasmus aufwiesen.

Es wird durch die vorliegende Erfindung zum ersten Mal gezeigt, dass der Koronar-Spasmus durch genetische Faktoren sowie durch Umweltfaktoren hervorgerufen wird und dass ein besseres diagnostisches Verfahren für mit Koronar-Spasmus verbundene Krankheiten bereitgestellt werden kann.
Die Literatur, auf die hier Bezug genommen wird, ist wie folgt aufgelistet:
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35) Egashira K et. al. Preserved Endothelium-dependent Vasodilation at the Vasospastic Site in Patients with Variant Angina. Endothelial Function and Coronary Vasospasm Vol. 89: 1047-1052: 1992 SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Diagnostizieren einer mit Koronararterien-Spasmus verbundenen Krankheit, das den Nachweis der Anwesenheit einer oder mehrerer Nucleotid-Änderungen im Gen der endothelialen Stickoxid-Synthase (eNOS) umfasst, wobei die Änderungen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus den Änderungen von Guanin (G) zu Thymin (T) an Position 894, und von Cytosin (C) zu Thymin (T) an Position 774 der cDNA-Sequenz des eNOS-Gens, und den Änderungen von Thymin (T) zu Cytosin (C) an Position –786, von Adenin (A) zu Guanin (G) an Position –922, und von Thymin (T) zu Adenin (A) an Position –1468 der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens, sowie den Änderungen an den entsprechenden Positionen im komplementären Strang davon.
Verfahren gemäß Anspruch 1, das den Nachweis der Anwesenheit von zwei oder mehreren Nucleotid-Änderungen umfasst, die ausgewählt wurden aus einer der Nucleotid-Änderungen im eNOS-Gen und einer der Nucleotid-Änderungen in der 5'-flankierenden Region davon.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, in dem die mit Koronararterien-Spasmus verbundene Erkrankung Angina ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, in dem die mit Koronararterien-Spasmus verbundene Erkrankung koronar-spastische Angina ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem der Nachweis der Anwesenheit der Änderungen durchgeführt wird durch Amplifizieren des relevanten Abschnitts zu Exon 7 in der cDNA, die eNOS codiert, mittels PCR, Verdauen der amplifizierten Fragmente mit dem (den) Restriktionsenzym(en) BanII und/oder MboI und Elektrophorese der Fragmente, die mit dem Enzym verdaut wurden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem der Nachweis der Anwesenheit der Änderungen durchgeführt wird durch Amplifizieren des relevanten Abschnitts zu Exon 6 in der cDNA, die eNOS codiert, mittels PCR, Verdauen der amplifizierten Fragmente mit dem Restriktionsenzym FokI und Elektrophorese der Fragmente, die mit dem Enzym verdaut wurden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem der Nachweis der Anwesenheit der Änderungen durchgeführt wird durch Amplifizieren eines Abschnitts, der die –786-Position in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens umfasst, mittels PCR, Verdauen der amplifizierten Fragmente mit dem Restriktionsenzym MspI und Elektrophorese der Fragmente, die mit dem Enzym verdaut wurden.
Verfahren gemäß Anspruch 1, in dem der Nachweis der Anwesenheit der Änderungen durchgeführt wird durch Amplifizieren eines Abschnitts, der die –1468-Position in der 5'-flankierenden Region des eNOS-Gens umfasst, mittels PCR, Verdauen der amplifizierten Fragmente mit dem Restriktionsenzym MboI und Elektrophorese der Fragmente, die mit dem Enzym verdaut wurden.
Kit zum Diagnostizieren einer mit Koronararterien-Spasmus verbundenen Erkrankung, der umfasst (a) ein Amplifizierungs-Oligonucleotid zum Amplifizieren eines Abschnitts, der Position 894 zu Exon 7 umfasst, in der cDNA, die eNOS codiert, mittels PCR, und das (die) Restriktionsenzym(e) BanII und/oder MboI; (b) ein Amplifizierungs-Oligonucleotid zum Amplifizieren eines Abschnitts, der Position 774 zu Exon 6 umfasst, in der cDNA, die eNOS codiert, mittels PCR, und das Restriktionsenzym FokI; (c) ein Amplifizierungs-Oligonucleotid zum Amplifizieren eines Abschnitts, der die –786-Position im 5'-flankierenden Abschnitt des eNOS-Gens umfasst, mittels PCR, und das Restriktionsenzym MspI; (d) ein Amplifizierungs-Oligonucleotid zum Amplifizieren eines Abschnitts, der die –1468-Position im 5'-flankierenden Abschnitt des eNOS-Gens umfasst, mittels PCR, und das Restriktionsenzym MboI, wobei die Amplifizierungs-Oligonucleotide unter Bezugnahme auf die genomische Sequenz von eNOS ausgewählt wurden.