HU226469B1 - Process and kit for diagnosis of diseases associated with coronary twitching - Google Patents
Process and kit for diagnosis of diseases associated with coronary twitching Download PDFInfo
- Publication number
- HU226469B1 HU226469B1 HU0000177A HUP0000177A HU226469B1 HU 226469 B1 HU226469 B1 HU 226469B1 HU 0000177 A HU0000177 A HU 0000177A HU P0000177 A HUP0000177 A HU P0000177A HU 226469 B1 HU226469 B1 HU 226469B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- mutation
- coronary
- coronary artery
- pcr
- angina
- Prior art date
Links
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title claims description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 48
- 201000010099 disease Diseases 0.000 title description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 title description 7
- 206010028347 Muscle twitching Diseases 0.000 title 1
- 206010003225 Arteriospasm coronary Diseases 0.000 claims description 39
- 210000004351 coronary vessel Anatomy 0.000 claims description 29
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 claims description 28
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 claims description 24
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 claims description 7
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 claims description 4
- 238000002583 angiography Methods 0.000 claims description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 112
- 108010075520 Nitric Oxide Synthase Type III Proteins 0.000 description 72
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 33
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 31
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 28
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 23
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 102000008052 Nitric Oxide Synthase Type III Human genes 0.000 description 18
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 230000037429 base substitution Effects 0.000 description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 14
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 13
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 12
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 12
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 12
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 10
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 208000003890 Coronary Vasospasm Diseases 0.000 description 8
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 8
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 8
- 201000011634 coronary artery vasospasm Diseases 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 7
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 4
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 3
- 101000829171 Hypocrea virens (strain Gv29-8 / FGSC 10586) Effector TSP1 Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000007477 logistic regression Methods 0.000 description 3
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 3
- 230000024883 vasodilation Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100028452 Nitric oxide synthase, endothelial Human genes 0.000 description 2
- 101710090055 Nitric oxide synthase, endothelial Proteins 0.000 description 2
- 101710089543 Nitric oxide synthase, inducible Proteins 0.000 description 2
- 239000000006 Nitroglycerin Substances 0.000 description 2
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000001068 Prinzmetal angina Diseases 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 229960003711 glyceryl trinitrate Drugs 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000007834 ligase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002388 Angina unstable Diseases 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- WVVSZNPYNCNODU-CJBNDPTMSA-N Ergometrine Natural products C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@@H](CO)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 WVVSZNPYNCNODU-CJBNDPTMSA-N 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- WVVSZNPYNCNODU-XTQGRXLLSA-N Lysergic acid propanolamide Chemical compound C1=CC(C=2[C@H](N(C)C[C@@H](C=2)C(=O)N[C@H](CO)C)C2)=C3C2=CNC3=C1 WVVSZNPYNCNODU-XTQGRXLLSA-N 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N Nitroglycerin Chemical compound [O-][N+](=O)OCC(O[N+]([O-])=O)CO[N+]([O-])=O SNIOPGDIGTZGOP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 208000007814 Unstable Angina Diseases 0.000 description 1
- JZSWZDBPGBBRNA-UHFFFAOYSA-N [hydroxymethyl(methyl)amino]methanol Chemical compound OCN(C)CO JZSWZDBPGBBRNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 230000002920 convulsive effect Effects 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008753 endothelial function Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229960001405 ergometrine Drugs 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 208000013403 hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 201000004332 intermediate coronary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 238000007410 oral glucose tolerance test Methods 0.000 description 1
- 239000012285 osmium tetroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000489 osmium tetroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003950 pathogenic mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- -1 sex Diseases 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 229940124549 vasodilator Drugs 0.000 description 1
- 239000003071 vasodilator agent Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Pulse, Heart Rate, Blood Pressure Or Blood Flow (AREA)
- Electrotherapy Devices (AREA)
- Measuring And Recording Apparatus For Diagnosis (AREA)
Description
A leírás terjedelme 28 oldal (ezen belül 5 lap ábra)
HU 226 469 Β1
A találmány tárgya adott betegség diagnosztizálására alkalmas eljárás, pontosabban koszorúérgörccsel kapcsolatos betegségben szerepet játszó gén kiszűrésére alkalmas eljárás és reagenskészlet.
A belső (intrinsic) nitrogén (ll)-oxidot (intrinsic NO) a közelmúltban azonosították in vivő, és kimutatták, hogy vazodilátorként [Lamas S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6348-6352 (1992); Sessa, W. C. et al., J. Bioi. Chem. 267, 15 274-15 276 (1992); Nishida K. et al., J. Clin. Invest. 90, 2092-2096 (1992); Janssens S. P. et al., J. Bioi. Chem. 267, 14 519-14 522 (1992); Marsden P. A. et al., FEBS Lett. 307, 287-293 (1992); Nadaud S. et al., Bichem. Biophys. Rés. Commun. 198, 1027-1033 (1994); Marsden P. A. et al., J. Bioi. Chem. 268, 17 478-17 488 (1993); Miyahara K. et al., Eur. J. Biochem. 223, 719-726 (1994)], neurotranszmitterként [Bredt D. S. et al., Natúré 351, 714-718 (1991); Nakane M. et al., FEBS Lett. 316, 175-180 (1993)] vagy immunoreaktánsként [Lyons, C. R. et al., J. Bioi. Chem. 267, 6370-6374 (1992); Xie Q. et al., Science 256, 225-228 (1992); Lowenstein C. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6711-6715 (1992); Geller D. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3491-3495 (1993); Chartrain N. et al., J. Bioi. Chem. 269, 6765-6772 (1994)] hat. A belső NO L-argininből szintetizálódik, legalább három nitrogén-oxid-szintetázt (NOS), azaz neurális NOS-t, endoteliális NOS-t és makrofág-NOS-t tartalmazó enzimcsalád aktivitása következtében. A neurális és az endoteliális NOS konstitutívak, és aktivitásuk az intracelluláris kalcium koncentrációjától függően növekszik meg. Másrészt, a makrofág-NOS kalciumtól független, és gyulladás következtében aktiválódik. Korábban néhány kutató meghatározta az endotél sejtből származó nitrogén-oxidszintetáz (eNOS)-gén szerkezetét, és közleményben ismertették, hogy az eNOS-gén a 7q35-36-nél helyezkedik el a kromoszómában, 26 exonból áll, és kiterjedése 21 kb [Lamas S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6348-6352 (1992); Sessa, W. C. et al., J. Bioi. Chem. 267, 15 274-15 276 (1992); Nishida K. et al., J. Clin. Invest. 90, 2092-2096 (1992); Janssens S. P. et al., J. Bioi. Chem. 267, 14 519-14 522 (1992); Marsden P. A. et al., FEBS Lett. 307, 287-293 (1992); Nadaud S. et al., Bichem. Biophys. Rés. Commun. 198, 1027-1033 (1994); Marsden P. A. et al., J. Bioi. Chem. 268, 17 478-17 488 (1993); Miyahara K. et al., Eur. J. Biochem. 223, 719-726 (1994)].
A koszorúérgörcs ismereteink szerint különféle ischaemiás szívbetegségek, például koszorúérgörcsös angina és a variáns angina patogén faktora [Hillis L. D. et al., N. Engl. J. Med. 299, 695-702 (1978); Conti C. R. et al., N. Engl. J. Med. 309, 238-239 (1983); Yasue H. et al., A review Circ. Rés. 52 (Supple I.), 147-152 (1983); Maseri A. et al., Circulation 81, 1983-1991 (1990); Yasue H. et al., Circulation 58, 56-62 (1978); Yasue H. et al., Circulation 59, 938-948 (1979)]. A koszorúérgörcs mechanizmusa azonban alig ismert.
Vizsgálatokat végeztünk tehát a koszorúérgörcs mechanizmusának tisztázására, figyelembe véve azt, hogy ezek a vizsgálatok hozzájárulhatnak a koszorúérgörccsel kapcsolatos ischaemiás betegségek korai diagnosztizálásának és kezelésének kifejlesztéséhez. Meg kell jegyeznünk, hogy a korábbi tanulmányok többsége kimutatta, hogy a simaizom hiperkontraktilitásának nagyobb jelentősége van a koszorúérgörcs patogén mechanizmusában, mint a hemangioendotélium károsodásának [Egashira K. et al., Endothelial Function and Coronary Vasospasm 89, 1047-1052 (1992)].
Az acetil-kolin általában a simaizomra hat úgy, hogy kiváltja annak kontrakcióját, de az acetil-kolin végső soron vazodilatációhoz vezethet a simaizomra ható nitrogén(ll)-oxid (NO) szekréciójának kiváltása által, az endotélium sérülése esetén. A koszorúérgörcsös anginában szenvedő pácienseknél azonban a koszorúérbe juttatott acetil-kolin-dózis inkább koszorúérgörcsöt indukál, mint vazodilatációt [Yasue H. et al., Circulation 74, 955-963 (1986); Okumura K. et al., Circulation 77, 535-542 (1988)]. Ezzel összefüggésben korábban már kimutatták, hogy az NO acetil-kolinnal kiváltott bazális szekréciója a koszorúérgörcsös anginában szenvedő pácienseknél alacsony [Yasue H., J. Jap. Soc. Intern. Med. 84, 1407-1415 (1995)].
Miközben nitro-glicerint és salétromsavat tartalmazó gyógyszerek hatással lehetnek a vazodilatációra az NO in vivő kialakulása következtében, az NO bazális szekréciója csökkenhet a koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciensek koszorúerében, amelyet alátámaszt az a tény, hogy annak a véredénynek a reakciója, amelyben az NO-szintézis szuppresszálva van, a salétromsavszármazékot tartalmazó gyógyszerekre szuperszenzitív [Moncada S. et al., Pharmacol. Rév. 43, 109-142 (1991)], és koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciensek koszorúere a nitro-glicerinre szuperszenzitív. Ezek az eredmények szoros kapcsolatot tesznek valószínűvé a koszorúérgörcs és a NO között, pontosabban az endotélium között, ahol az NO szekretálódik. Idáig senki sem fordított figyelmet a koszorúérgörcs és az endotélium (ahol az NO szekretálódik) közötti kapcsolatra, csak olyan körülmények között, amikor az NO ismert bazális szekréciója csökken.
Más szempontból felismertük, hogy a koszorúérgörcs oka genetikai hátterű is lehet, azt a tény figyelembe véve, hogy a koszorúérgörcs sokkal gyakoribb Japánban, mint az Amerikai Egyesült Államokban és Európában [Yasue H. et al„ Coronaryartery disease 1, 668-673 (1990); Bertrand Μ. E. et al., Circulation 65, 1299-1306 (1982)].
A fenti felismerések alapján az egyik NOS-enzim génjére összpontosítottunk, amely a belső (intrinsic) NO-t termeli, azaz az endotél sejtből származó nitrogén-oxid-szintetázra (eNOS); azt vizsgáltuk, hogy vajon ez a gén felelős-e a koszorúérgörcs kifejlődéséért, amellyel végül is megoldottuk a találmány szerinti megoldás kidolgozása során kitűzött célt.
A találmány tárgya koszorúérgörccsel kapcsolatos betegségben szerepet játszó gén kiszűrésére alkalmas eljárás, amely az endoteliális nitrogén-oxid-szintetáz (eNOS) génjében egy vagy több nukleotidcserét
HU 226 469 Β1 detektál, amely cserék lehetnek az eNOS-gén cDNSszekvenciájában guaninról (G) timinre (T) a 894. helyzetben, és citozinról (C) timinre (T) a 774. helyzetben, valamint az eNOS-gén 5’-végi szegélyező régiójában timinről (T) citozinra (C) a 815. (-786.) helyzetben, adeninről (A) guaninra (G) a 679. (-922.) helyzetben, és timinről (T) adeninre (A) a 133. (-1468.) helyzetben, valamint cserék a komplementer láncok megfelelő helyzeteiben is. (A leírásban a bázisok helyzetét a mellékelt szekvenciavázlatokban (SEQUENCE LISTING) szereplő 1. és 2. számú szekvenciákban használt számozásnak megfelelően adjuk meg; zárójelben megadjuk azonban a Marsden és társai közleményében [J. Bioi. Chem. 268, 17 478-17 488 (1993)] az eNOS-gén 5'-végi szegélyező régiót is tartalmazó szekvencia leírásánál használt, -1600-nál kezdődő számozást is.) Előnyösen a találmány tárgya a fenti eljárás, amelyben az eNOS-génben lévő nukleotidcserék, valamint annak 5’-végi szegélyezőrégiójában lévő nukleotidcserék közül bármelyik kettő vagy több nukleotidcsere jelenlétének detektálását tartalmazza, és még előnyösebben a fenti eljárás, amelyben a koszorúérgörccsel kapcsolatos betegség angina, továbbá előnyösen a fenti eljárás, amelyben a koszorúérgörccsel kapcsolatos betegség koszorúérben fellépő görcsös angina.
Egy vonatkozásban a találmány tárgya a fenti cserék kiszűrésére alkalmas, RFLP-módszert alkalmazó eljárás, amelyben restrikciós enzimek hasításának jelenlétét vagy hiányát detektáljuk. A találmány tárgya különösen olyan eljárás, amelyben a cserék jelenlétét úgy detektáljunk, hogy az eNOS-t kódoló cDNS-ben, az exon-7 megfelelő régióját PCR-rel amplifikáljuk, az amplifikált fragmentumokat Banll- és/vagy Mbol-restrikciós enzimekkel emésztjük, és az enzimekkel emésztett fragmentumokat elektroforetizáljuk; valamint olyan eljárás, amelyben az exon-6-ban lévő cserék jelenlétét úgy detektáljuk, hogy Foki-restrikciós enzimmel kezeljük; olyan eljárás, amelyben az eNOS-gén 5-végi szegélyezőrégiójában, a 815. (-786.) helyzetben lévő változások jelenlétét úgy detektáljuk, hogy Mspl-restrikciós enzimmel kezeljük; és olyan eljárás, amelyben az eNOS-gén 5’-végi szegélyezőrégiójában, a 133. (-1468.) helyzetben lévő változások jelenlétét úgy detektáljuk, hogy Mbol-restrikciós enzimmel kezeljük.
Egy vonatkozásban, a találmány tárgya a találmány szerinti eljárás végrehajtására alkalmas reagenskészlet, és speciálisan, koszorúérgörccsel kapcsolatos betegség diagnosztizálására alkalmas reagenskészlet, amely az eNOS-t kódoló cDNS-ben, az exon-7 megfelelő régiójának PCR-amplifikációjára alkalmas amplifikációs láncindító oligonukleotidot, és Banll- és/vagy Mbol-restrikciós enzim(ek)et tartalmaz; olyan koszorúérgörccsel kapcsolatos betegség diagnosztizálására alkalmas reagenskészlet, amely az eNOS-t kódoló cDNS-ben, az exon-6 megfelelő régiójának PCR-amplifikációjára alkalmas amplifikációs láncindító oligonukleotidot, és Foki-restrikciós enzim(ek)et tartalmaz; olyan koszorúérgörccsel kapcsolatos betegség diagnosztizálására alkalmas reagenskészlet, amely az eNOS-gén 815. (-786.) helyzetét magában foglaló, 5’-végi szegélyező régiójának PCR-amplifikációjára alkalmas amplifikációs láncindító oligonukleotidot, és Mspl-restrikciós enzimet tartalmaz; és olyan koszorúérgörccsel kapcsolatos betegség diagnosztizálására alkalmas reagenskészlet, amely az eNOS-gén -1468. helyzetét magában foglaló, 5’-végi szegélyezőrégiójának PCR-amplifikációjára alkalmas amplifikációs láncindító oligonukleotidot, és Mbol-restrikciós enzimet tartalmaz. Meg kell jegyeznünk, hogy a találmány szerinti reagenskészletben lévő amplifikációs primerek különböznek a leírás 1. táblázatában felsorolt oligonukleotidoktól, és az eNOS genomiális szekvenciájának megfelelő oligonukleotidok közül bármilyen oligonukleotid választható.
Egy vonatkozásban, a találmány tárgya eljárás koszorúérgörccsel kapcsolatos betegség diagnosztizálására, amelynek során az eNOS-génben egy vagy több nukleotidcsere jelenlétét detektáljuk, amely a fenti meghatározás szerint, a koszorúérgörccsel kapcsolatos betegségért felelős.
Az 1. ábrán látható fényképen az eNOS-génből származó, exon-7-et tartalmazó DNSfragmentumok PCR-SSCP-analízisével kapott elektroforézis eredményét mutatjuk be. A nyíl a sávok eltolódását indikálja.
A 2. ábrán látható görbe mindkét esetet, azaz a mutáns és a mutáció nélküli (vad típusú) eNOS-génből származó, exon-7-et tartalmazó DNS-fragmentumok direkt szekvenálásának eredményét mutatja be. A mutáns típus a heterozigótát reprezentálja.
A 3. ábra az eNOS-génből származó, exon-7-et tartalmazó DNS-fragmentumok PCR-RFLP-szűrésének eredményét mutatja be. A restrikciós enzim Banll és/vagy Mbol. A 3/A. ábra ennek restrikciós térképét mutatja be. A 3/B. ábrán látható fénykép az eredeti elektroforézis eredményét mutatja be.
A 4. ábrán látható fénykép az eNOS-génből származó, exon-6-ot tartalmazó DNS-fragmentumok PCR-RFLP-szűrésével kapott elektroforézis eredményét mutatja be. A restrikciós enzim Foki.
Az 5. ábrán látható fénykép az eNOS-gén 5’-végi szegélyezőrégiójában, a 815. (-786.) és 133. (-1468.) helyzetet tartalmazó DNS-fragmentumok PCR-RFLP-kiszűrésével kapott elektroforézis eredményét mutatja be. A restrikciós enzim Mspl volt a 815. (-786)-mutáció esetén, és Mbol volt a 133. (-1468)-mutáció esetén.
Ahogyan fentebb leírtuk, az eNOS-génre helyezzük a hangsúlyt, azt vizsgálva, hogy a gén felelős-e a koszorúérgörcs kialakulásáért, és a következő felismerésekhez jutottunk:
HU 226 469 Β1
A) Mutációk az eNOS-gén exonjaiban
1) Mutáció az exon-7-ben: az eNOS-gént kódoló cDNS 894. helyzetében guanin (G) helyettesítése timinre (T)
PCR-SSCP-eljárást (polimeráz-láncreakció - egyláncú konformációs polimorfizmus) és direkt szekvenciamódszert alkalmazva egy pontmutációt azonosítottunk koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciensekből származó eNOS-génben lévő exon-7-ben. A mutációban GAG cserélődött GAT-re, ami megfelel glutaminsavról aszparaginsavra cserélődött aminosavmutációnak (Glu298Asp). Ezt a mutációt vizsgáltuk 96, koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciensben, és 86 kontroliban, amelyben azt kaptuk, hogy 22 páciens és 7 kontroll rendelkezett a mutációval.
2) Mutáció az exon-6-ban: az eNOS-gént kódoló cDNS 774. helyzetében a citozin (C) helyettesítése timinre (T)
PCR-SSCP-eljárás alkalmazásával ezt a bázisszubsztitúciót tíz koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciensből négy páciensben megtaláltuk. Másrészt, a bázisszubsztitúciót 9 kontroll közül egyikben sem találtuk meg (P=0,03). Ez a bázisszubsztitúció nem jár együtt aminosavcserével.
B) Mutációk az eNOS-gén 5’-végi szegélyezőrégiójában
Számos mutációt találtunk az eNOS-gén 5’-szegélyezőrégiójában, és ezen mutációk, valamint a koszorúérgörcsös megbetegedések közötti kapcsolat elemzésével a következő eredményeket kaptuk.
(1) Timin (T) helyettesítése citozinra (C) az 5’-végi szegélyezőrégióban [815. (-786). helyzet.] PCR-SSCP-eljárás alkalmazásával ezt a bázisszubsztitúciót 123 koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciensből 34 páciensben (27,6%) megtaláltuk, míg a bázisszubsztitúciót 86 kontroll közül csak 4-ben (4,7%) találtuk meg (P<0,0001).
(2) Adenin (A) helyettesítése guaninra (G) az
5’-végi szegélyezőrégióban [679. (-922). helyzet.]
PCR-SSCP-eljárás alkalmazásával ezt a bázisszubsztitúciót 104 koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciensből 31 páciensben (29,1%) megtaláltuk, míg a bázisszubsztitúciót 83 kontroll közül csak 3-ban (3,6%) találtuk meg (P<0,0001).
(3) Timin (T) helyettesítése adeninre (A) az 5’-végi szegélyezőrégióban [133. (-1468). helyzet.] PCR-SSCP-eljárás alkalmazásával ezt a bázisszubsztitúciót 98 koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciensből 26 páciensben (26,5%) megtaláltuk, míg a bázisszubsztitúciót 26 kontroll közül egyikben sem találtuk meg (P<0,0006).
Az eNOS-génnel asszociált fenti mutációk felhasználhatók koszorúérgörccsel kapcsolatos betegségek diagnózisában.
A „koszorúérgörccsel kapcsolatos betegség(ek)en” a leírásban anginát, főleg koszorúérgörcsös anginát, variáns anginát, instabil anginát, effort anginát, nyugalmi anginát, akut szívizominfarktust, mikrovazulátor-betegséget és hasonlókat értünk.
A koszorúérgörcs és az eNOS-génnel asszociált mutációk közötti kapcsolatot mutatjuk be a találmány megvalósításában, és eszerint, ha olyan páciensben mutatunk ki mutációkat az eNOS-génben vagy annak 5'-végi szegélyezőrégiójában, akiknél koszorúérgörccsel kapcsolatos betegségeket detektáltunk, megállapítható, hogy a kérdéses páciens a koszorúérgörccsel kapcsolatos betegségek rizikófaktorával rendelkezhet. Ezen mutációk csak egyike is elegendő indikátora a betegségeknek, és két vagy mutáció még jobb indikátor. Továbbá úgy találtuk, hogy mind az eNOSgénben és mind annak 5’-végi szegélyezőrégiójában detektált mutációk a koszorúérgörccsel kapcsolatos betegség súlyosságát jelzik.
A fentebb leírtak szerint, a találmány tárgya eljárás koszorúérgörccsel kapcsolatos betegségben szerepet játszó gén kiszűrésére, amely szerint egy vagy több nukleotidcserét detektálunk az endoteliális nitrogénoxid-szintetáz (eNOS) génjében, amely cserék lehetnek az eNOS-gén cDNS-szekvenciájában guaninról (G) timinre (T) a 894. helyzetben, és citozinról (C) timinre (T) a 774. helyzetben, és lehetnek cserék az eNOS-gén 5’-végi szegélyezőrégiójában timinröl (T) citozinra (C) a 815. (-786.) helyzetben, adenlnről (A) guaninra (G) a 679. (-922.) helyzetben és timinröl (T) adeninre (A) a 133. (-1468.) helyzetben, valamint lehetnek cserék a komplementer láncok megfelelő helyzeteiben.
A „cserék a komplementer láncok megfelelő helyzeteiben” kifejezés azt jelenti, hogy például abban az esetben, ha az eNOS-gén cDNS-ének 894. helyzetében nukleotidcsere történt guaninról (G) timinre (T), akkor a komplementer láncban a megfelelő, 894. helyzetben lévő mutáció citozinról (C) adeninre (A) való cserét jelent.
Először is, az eNOS-gén és az 5’-végi szegélyezőszekvencia páciensekből való izolálására szolgáló eljárásokat az alábbiakban ismertetjük.
Minden biopszia esetén vehetünk mintákat a gén izolálásához, tipikusan fehérvérsejtmintákat, továbbá májbiopszia esetén is gyűjthetünk mintát. A mintákat proteáz-K/SDS-el kezeljük proteolízis és denaturálás céljából, azután fenol/kloroformmal extraháljuk azokat a DNS(+RNS) kinyerése céljából. Kívánt esetben az RNS-t RNázzal eltávolíthatjuk.
Azután PCR-t hajtunk végre bármilyen, az alábbiakban bemutatott primer alkalmazásával a genomiális DNS amplifikálására. Azután a mutációkat az alábbi, nukleinsavmutáció detektálására alkalmas eljárásokkal igazoljuk.
1) RFLP-módszer (restrikciós fragmenthossz polimorfizmus)
2) PCR-SSCP-eljárás (egyláncú DNS konformációs polimorfizmus analízis)
3) ASO-hibridizációs eljárás (allélspecifikus oligonukleotidhibridizáció)
A PCR-termékeket valamilyen hordozóra, például nejlon szűrőre blottoljuk, és olyan, körülbelül 18 tagú, szintetikus oligonukleotidpróbával hibridizáltatjuk, amely a detektálandó mutációt tartalmazó bázisszek4
HU 226 469 Β1 venciával rendelkezik, és amelyet megjelölhetünk radioaktív izotóppal vagy biotinnal, hogy jelet kapjunk. Azután, ha a szűrőt a próba Tm-értéke szerint mossunk, egy bázispár hibridizációs hibáját („mismatch”) detektálhatjuk, mivel a „mismatch megolvaszthatja a hibridet. Az eljárást tipikusan a PCR-nél bekövetkező specifikus bázismutáció detektálására alkalmazzuk.
4) Szekvenálásos módszer
5) Southern-blot-eljárás
Mutációk detektálására alkalmazott tipikus módszer, amelyben DNS-t restrikciós enzimmel emésztünk, elektroforézisre visszük fel és egy próbával hibridizáltatjuk. Ehhez az eljáráshoz tartozik a genomiális Southern-blot és a PCR-Southem-blot eljárás. Az utóbbi, amely a (3) pontban ismertetett eljárás elvét használja fel, a pontosság tekintetében előnyös, amennyiben migrációs információkat képes szolgáltatni.
6) ARMS (amplifikációs refrakciós mutációs rendszer)
A PCR-ben prímért hibridizáltatunk templát-DNShez, és azután DNS-polimerázzal előállítjuk a komplementer DNS-t, 5’-től 3'-végi irányban. Az ARMS arra az elvre épül, hogy a PCR amplifikációs hatékonysága csökken, és a PCR-termékeket nem tudjuk gélelektroforézissel detektálni, ha a primer 3'-vége „mismatch”-et ad a templát DNS-sel. Ha olyan prímért alkalmazunk a PCR-amplifikációban, amely a detektálandó mutációval rendelkezik a 3’-végénél, úgy detektálhatjuk a mutációt, hogy azt vizsgáljuk, megjelennek-e az amplifikált termékek, vagy nem.
7) DGGE (denaturálógradiens-gélelektroforézis)
Ez az eljárás arra az elvre épül, hogy az a heteroduplex, amely „mismatch-et tartalmaz a PCR-termékekben, sokkal inkább disszociálhat, mint egy homoduplex. Ebben az eljárásban „mismatch-et tartalmazó, duplaszálú DNS-t, azaz mutációt detektálunk elektroforézisgélben történő migráció alapján azt felhasználva, hogy az ilyen DNS migrációs képessége sokkal rosszabb gélben a disszociáció következtében, amely tovább fokozható karbamid és formamid sűrüséggradiensének emelésével az elválasztó poliakrilamid-gélben.
8) Hasítás Rnáz-A-val
Az RN-áz-A (ribonukleáz) olyan enzim, amely nem bontja el a duplaszálú RNS-t vagy az RNS/DNS-hibridet, viszont szelektíven elbontja az egyláncú RNS-t. Tehát, ha 32P-vel megjelölt RNS-próbát hibridizáltatunk egy olyan DNS-mintával, amelyet még denaturáltunk is egyláncúvá, és a hibridet RNáz-A-val kezeljük, és a termékeket elektroforézisben vizsgáljuk, két csíkot detektálhatunk amiatt, mert az RNS-próbából származó egyláncú RNS hibridizált az RNáz-A-val hasított mutáns DNS-el.
9) Kémiai hasítás
Egy hibridben, a „mismatch-nál lévő „C-nukleotid és „T-nukleotid hidroxil-aminnal vagy ozmium-tetroxiddal, sorrendben, módosítható, és azután a módosított DNS-t piperidinnel kezeljük a cukorcsoportok hasítása céljából. Egy jelölt próba és a minta-DNS hibridjét alkalmazzuk ebben az eljárásban, és elektroforézisben vizsgáljuk. Ha mutáció van a minta-DNS-ben, a jelölt próbát kisebb méretűnek detektáljuk. Glu298Asp detektálása esetén, a „mismatch” C-T, és így a vad típus reverz szekvenciáját is felhasználhatjuk a „mismatch” detektálása céljából.
10) Ligáz-módszer
A módszer arra az elvre épül, hogy két oligonukleotid nem ligálható egymáshoz DNS-ligázzal, ha a templát-DNS ,,mismatch”-et(eket) tartalmaz a kötőhelynél.
i) LMGD (ligáz-közvetített géndetekció)
Például egy oligo-DNS-t 32P-vel megjelölünk, miközben a másik DNS-t biotinnal jelöljük. Egymáshoz ligáljuk azokat, és a ligáit terméket sztreptavidinabszorpcióval megkötjük. Ha biztonságosan egymáshoz ligálódtak, más szavakkal, nem képződött „mismatch”, detektálhatok, mivel a 32P radioaktivitása magasabb lett.
ii) LCR (ligáz-láncreakció)
A fenti ligálást megismételjük, kivéve azt, hogy termostabil iigázt alkalmazunk, egy oligo-DNS-t összehibridizálunk egy DNS-lánccal, a PCR-hez hasonlóan, és így a mutáció nagyobb érzékenységű detekcióját tesszük lehetővé.
A találmány előnyös megvalósítási módja
1. Mutáció az exon-7-ben
A exon-7-ben lévő mutáció, pontosabban az eNOS-t kódoló cDNS 894. helyzetében lévő mutáció, ahol a guanint (G) timin (T) helyettesíti, amely megfelel GAG cseréjének GAT-ra, és amelyek mindegyike más-más restrikciós hasítóhelyet alakít ki. A mutációt restrikciós enzim alkalmazásával határozhatjuk meg. Pontosabban, az amplifikációs termékek vagy Banll, vagy Mbol restrikciós enzimmel való emésztése teszi lehetővé a mutáció detektálását. Még pontosabban, a mutációt meglévőnek tekinthetjük, ha a Banll restrikciós enzim képes hasítani a kérdéses helyen, míg nincs mutáció, ha az Mbol restrikciós enzim képes hasítani a kérdéses helyen.
Más módszer szerint, az eNOS-t kódoló cDNS 894. helyzetében lévő mutáció, ahol a guanint (G) timin (T) helyettesíti, és amely aminosavszinten megfelel glutaminsav mutációjának aszparaginsavra (Glu298Asp), megváltoztatja az eNOS aminosavszekvenciáját, azaz a glutaminsav cseréje aszparaginsavra az eNOS aminosavszekvenciája 298. helyzetében indikátor lehet.
2. Mutáció az exon-6-ban
A exon-6-ban lévő mutáció, pontosabban az eNOS-t kódoló cDNS 774. helyzetében lévő mutáció, ahol a citozint (C) timin (T) helyettesíti, különböző restrikciós hasítóhelyeket eredményez, így a mutációt restrikciós enzim alkalmazásával határozhatjuk meg. Pontosabban, az amplifikációs termékek Foki restrikciós enzimmel való emésztése teszi lehetővé a mutáció detektálását. Még pontosabban, a mutációt meglévőnek tekinthetjük, ha a Foki restrikciós enzim képes hasítani a termékeket, míg nincs mutáció, ha a Foki enzim nem képes hasítani a termékeket.
3. Mutáció az 5’-végi szegélyezőrégió 815. (-786.) helyzetében
Az eNOS-gén 5’-végi szegélyezőrégiójában lévő mutáció, pontosabban a timin (T) citozinnal (C) való he5
HU 226 469 Β1 lyettesítése szintén különböző restrikciós hasítási helyeket eredményez, így a mutációt restrikciós enzim alkalmazásával határozhatjuk meg. Pontosabban, az amplifikációs termékek Mspl restrikciós enzimmel való emésztése teszi lehetővé a mutáció detektálását. Még pontosabban, nincs mutáció, ha az Mspl restrikciós enzim egy helyen képes hasítani az amplifikált termékeket, míg a mutációt meglévőnek tekinthetjük, ha az Mspl enzim két helyen képes hasítani az amplifikált termékeket.
4. Mutáció az 5’-végi szegélyezőrégió 133.
(-1468.) helyzetében
Az eNOS-gén 5'-végi szegélyezőrégiójában lévő mutáció, pontosabban a timin (T) adeninnel (A) való helyettesítése szintén különböző restrikciós hasítási helyeket eredményez, így a mutációt restrikciós enzim alkalmazásával határozhatjuk meg. Pontosabban, az amplifikációs termékek Mbol restrikciós enzimmel való emésztése teszi lehetővé a mutáció detektálását. Még pontosabban, nincs mutáció, ha az Mbol restrikciós enzim egy helyen képes hasítani az amplifikált termékeket, míg a mutációt meglévőnek tekinthetjük, ha az Mbol-enzim két helyen képes hasítani az amplifikált termékeket.
1. példa
Mutáció detektálása az eNOS-génben lévő exon-7ben
A kísérleti alanyok: 96, koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciens és 86 kontrollszemély. Minden koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciens spontán rohamon ment át, nyugalomban (férfi 53, nő 43, átlagéletkor 61 év, 33-86 évesek). Szívkatéteres vizsgálatot végzünk minden páciensen, amely megerősíti, hogy a koszorúérgörcsöt acetil-kolin vagy ergonovin indukálta a koszorúér arteriográfiában, valamint az elektrokardiogram szignifikáns ST-T-változását is megerősíti [Yasue H. et al., Circulation 74, 955-963 (1986); Okumura K. et al., Circulation 77, 535-542 (1988)]. Szignifikáns szűkületet nem találunk egyik páciensben sem (>75%).
A 86 kontroll közül 61 mell-pung-csoportot, 12 abnormális elektrokardiogrammal rendelkező csoportot, és 13 enyhe szívbillentyűzavarral rendelkező csoportot alkot (férfi 35, nő 51, átlagéletkor 61 év, 13-83 évesek). Koszorúér-arteriográfia egyik kontroliban sem mutat ki szignifikáns szűkületet. Ha acetil-kolin- vagy ergonovindózist koszorúérbe adagolva, koszorúérgörcsöt indukáló tesztet végzünk a mell-pung-csoportot alkotó 61 személyen, és az abnormális elektrokardiogrammal rendelkező csoportot alkotó 12 személyen, minden személy negatív. A kontrollok között nincs olyan személy, aki szívizominfarktusban, X-szindrómában, miokardiopátiában vagy szívelégtelenségben szenvedne.
(1) Az eNOS-génben lévő mutáció vizsgálata
PCR-SSCP-vel
i) DNS izolálása
Perifériás vénás vért veszünk 10, tipikus koszorúérgörcsben szenvedő pácienstől és 9 kontrolitól, és DNS-t extrahálunk fehérvérsejtekből [Saiki R. K. et al., Science
230, 1350-1354 (1985)], „DNAQUICH” DNS-extrakciós készlet (DAINIPPON SEIYAKU) alkalmazásával.
ii) PCR-lépés
Az eNOS-gén közölt [Lamas S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6348-6352 (1992); Sessa, W. C. et al., J. Bioi. Chem. 267, 15 274-15 276 (1992); Nishida K. et al., J. Clin. Invest. 90, 2092-2096 (1992); Janssens S. P. et al., J. Bioi. Chem. 267, 14 519-14 522 (1992); Marsden P. A. et al., FEBS Lett. 307, 287-293 (1992); Nadaud S. et al., Bichem. Biophys. Rés. Commun. 198, 1027-1033 (1994); Marsden P. A. et al., J. Bioi. Chem. 268, 17 478-17 488 (1993); Miyahara K. et al., Eur. J. Biochem. 223, 719-726 (1994)] szerkezete alapján, PCR-SSCP-eljárást hajtunk végre az eNOSgénben lévő valamennyi exonra [Orita M. et al., Genomics 5, 874-879 (1989)].
A primereket az egyes exonokat szegélyező intronok szekvenciája alapján szintetizáljuk. Valamennyi, ebben a lépésben alkalmazott prímért az 1. táblázatban bemutatunk.
1. táblázat
Endotél sejtből származó nitrogén-oxid-szintetáz-gén (eNOS) valamennyi 26 exonjához alkalmazott primerek polimeráz-láncreakcióban - egyláncú konformációs polimorfizmus (PCR-SSCP) eljárásban.
1. 5'-CAGCAGAGTGGACGCACAGTAAC 5’-TTGTTGCCCACCTGCTCCTAGCTG (217)
2. 5'-AACCCTTCCTGATGACCCTATCCC 5’-CTTACCCACCCTTTCCCTGGAGAC (200)
3. 5'-TCCTGACCTTTGCACTCCCTCGA 5’-ATGGGAAGGTCGTCACGGGGTTTC (250)
4. 5'-ACAACTTCCTGCTTGTCCCCTTCC 5’-ACCCCGCTCCCCTTTTGGTA (259)
5. 5'-TCTGGAGCTGATACTCAAGACCCC 5'-CGCATGGGGAAAGAGCTGGTCAGA (246)
6. 5’-TCTGACCAGCTCTTTCCCCATGCG 5'-CCACTGGTTTCCTCATTCTCCACC (232)
7. 5’-AAGGCAGGAGACAGTGGATGGA 5'-CCCAGTCAATCCCTTTGGTGCTCA (248)
8. 5'-GCTGATCCCACACCCCAACA 5’-TGCCTTGGACAGGTGCATTC (250)
9. 5’-TGATCACCTCTGTCCCTACCGA 5’-ATGCAAACCCTTTGCCTTCCTG (189)
10. 5’-AAGAATGGGCGAGGTCTGTGGGT 5’-CAGGGGCTGCTTAGAATTAGAGC (311)
11. 5’-TCCCTCCCAACCCATCATCTCTCT 5’-AGTGGTAGGCCCAGAACACTGCT (208)
12. 5'-CAGGACACCCTCACACCTTCCTCT 5’-TCTTTCTAGCTCCCTGCTCCC (210)
13. 5'-ACAGCACCCAGGACATCTGTCTTC 5’-AGCCCCTTTCCTGGAAGTTCTCA (163)
14. 5’-TGATGTCAAACACTCCCCTCG 5’-AAAACGGACTTGAGGCACAG (178)
15. 5’-GTGACAACCTTGTCTTTGTCC 5’-TCGTCAGTGGAGCTCCCTTT (231)
16. 5’-AAAGGGAGCTCCACTGACGA 5'-AGAATCAGGGCAGAGTGAGG (284)
HU 226 469 Β1
1. táblázat (folytatás)
17. 5’-AGCAAGACGCAGTGAAGCCG 5’-TGGCCCCAGAGTGCTITAGT (275)
18. 5'-ACTAAAGCACTCTGGGGCCA 5’-AGGGTCAGGGTGTTCAGGACA (203)
19. 5’-TGTCCTGAACACCCTGACCCT 5’-GCTGGTGTGCCCTGTTGCTT (322)
20. 5’-CTCCCTGTGCACTATCCCCA 5’-TCTAGCCCCTGTGCCTCATT (329)
21. 5’-TCCAACCCACTGCATCCTGC 5’-TGCTCCTGCTTGTTGCCTCA (259)
22. 5’-TGAGGCAACAAGCAGGAGCA 5’-CACCAAGTCTTCCATCTCAC (202)
23. 5’-ATGGAGTGTCTCTCCTGCCA 5’-TTCAGGCAGTCCTTTAGTGC (173)
24. 5’-AGAAGAGCCTTCCCAACCCG 5’-ATCTTCAGGTTACCA'ITGCG (219)
25. 5'-CAGACCTACGTGCAGGACAT 5'-ACCTTAGCAGGAACCCCGCA (276)
26-1. 5'-GTTCTGATCCACTGTGCTCT
5'-TCTCCCGGAACTGGAAGGGA (226)
26-2. 5’-ACACCAACAGCCCCTGAGAG
5'-TGGCAGTAGGCCCTGGGGTA (273)
26-3. 5'-TTAATCTGGAAGGCCCCTCC
5’-GAGGGAGACTCCGTTTCAAA (267)
Felső sor: szensz primer, alsó sor: antiszensz primer, az egyes primerkészletekben. Az amplifikált fragmentumok hosszát (bázispárban) zárójelbe tettük. Az exon-26 analíziséhez három primerkészletet használtunk.
Csövenként 5 μΙ térfogatú oldathoz, amely 50 mM kálium-kloridot, 20 mM Tris-HCI-ot (pH 8,4), 0,75 mM magnézium-kloridot, 0,1 mM dNTP-ket, 0,2 ml a-[32P] dCTP-t, 5 pmol egyik prímért és 0,01 U Taq-polimerázt (GIBCO BRL, Life Technologies Inc., MD, USA) tartalmaz, 30 ng páciensből származó DNS-t adagolunk.
A PCR-t a következők szerint végezzük: egy ciklus 94 °C-on 2 percig; 30 ciklus 94 °C-on 30 másodpercig, 55-58 °C-on 30 másodpercig és 72 °C-on egy percig; az így kapott amplifikált termékeket 4 °C-on tároljuk. Az exon-7 amplifikációját 57 °C-on végezzük.
iii) SSCP-lépés
Háromféle, különböző körülmények között végzett elektroforézist hajtunk végre, az egyiket 5% glicerint tartalmazó gélben, szobahőmérsékleten, és a többit 5% és 10% glicerint tartalmazó gélben, 4 °C-on.
Glicerint tartalmazó gélt az alábbiak szerint készítünk:
1) 5%-os oldatot készítünk, amely 49:1 arányban tartalmaz akrilamidot és N,N'-metilén-biszakrilamidot.
2) 0,5><TBE-t készítünk [10*TBE-t 20* hígítunk: 108 g fr/sz(hidroxi-metil)-amino-metán+55 g bórsav+40 ml 0,5 M EDTA+vízzel végtérfogatát 500 ml-re kiegészítjük].
3) elkészítjük a gélt úgy, hogy 160 μΙ 10%-os APS-t (ammónium-perszulfát) és 60 μΙ TEMED-et (Ν,Ν,Ν’,Ν* 1 2 3tetrametil-etilén-diamin) adunk 5%-os vagy 10%-os glicerinoldathoz.
iv) Eredmény
Az exon-7 amplifikációjával kapott eredményt az 1. ábrán mutatjuk be. Az ábrán látható az exon-7-et tartalmazó fragmentum sáveltolódása, 10 közül 3 koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciensből származó mintában. Másrészt, nincs eltolódás a kontroliokban.
(2) A mutáns gén analízise direkt szekvenciamódszerrel
Azokból a páciensekből származó DNS-t, akiknél mutációt találtunk, és a mutációval nem rendelkező kontroliokból származó DNS-t újraamplifikáljuk az (1) lépés szerinti PCR-SSCP-eljárással, az (1) lépésben leírtakkal megegyező körülményeket alkalmazva, és az amplifikált termékeket „Wizard PCR Preps DNA” tisztítórendszer (Wizard PCR Preps DNA Purification System, Promega, USA) alkalmazásával tisztítjuk. Azután meghatározzuk a báziszekvenciát „ΑΒΓ (USA) cég által gyártott autoszekvenátor alkalmazásával.
A mutáns DNS és a vad típusú DNS direkt szekvenciamódszerrel való elemzésével pontmutációkat találtunk az eNOS-génben lévő exon-7 894. helyzetében guaninról (G) timinre (T). A pontmutáció igazolásaképpen, azt három olyan páciensben megtaláltuk, akiknél korábban mutációt találtunk. A mutáció következtében változás történt az aminosavszekvenciában is („missense” mutáció) glutaminsavról aszparaginsavra (Glu298Asp). A direkt szekvenálást a 2. ábrán mutatjuk be. Az ábrán láthatók a mutáció nélküli vad típus és a heterozigóta-típus eredményei is.
(3) „G\T”-mutáció kiszűrése PCR-RFLP-vel
Miután a Glu298Asp-et indukáló „missence”-mutációt megtaláltuk az eNOS-génben lévő exon-7-ben, a (2) lépésben leírtak szerint, az összes 96, koszorúérgörcsös anginában szenvedő pácienst és a 86 kontrollt vizsgálunk a mutációra. A kiszűrést PCR-RFLP-vel (polimeráz-láncreakció - restrikciós fragmenthossz-polimorfizmus) végeztük. Kétfajta restrikciós enzimet, Banll-t és Mbol-et (TAKARA cégtől szereztük be) alkalmazunk abból a célból, hogy elkerüljünk minden olyan tévedést, ami restrikciós enzimek tökéletlen hasításából adódik.
Az eNOS-génben lévő exon-7-et minden esetben az (1) lépésben leírt (ii) eljárás szerint amplifikáljuk. Az exon-7-et tartalmazó amplifikált fragmentumok mérete 248 bp. Azután az amplifikált fragmentumokat vagy Banll vagy Mbol enzimmel emésztjük, a gyártó utasításai szerint. Az emésztett termékeket 4%-os „Nusieve GTG” agarózgélben elektroforetizáljuk.
Az eredményeket három típusba sorolhatjuk, ahogyan a 3. ábrán látható. A 3A. ábrán egy restrikciós térkép látható, és a 3B. ábrán a tényleges elektroforézis eredménye látható. Ahogyan a 3B. ábrán bemutatjuk, a Banll enzimmel végzett emésztéssel két, 163 bp és 85 bp hosszúságú fragmentumhoz jutunk, és az Mbol enzimmel végzett emésztéssel egy, 248 bp méretű csíkhoz jutunk, amely mutáció nélküli, vad típusban
HU 226 469 Β1 nem hasad. Ez alátámasztja azt, hogy a mutációval rendelkező vad típus egy Banll restrikciós hasítási hellyel rendelkezik, viszont nem rendelkezik Mbol restrikciós hasítási hellyel.
Az eNOS-gén cDNS-ében, a 894. helyzetben T/T-vel rendelkező homozigóta esetében a Banll enzim nem hasított (248 bp), míg az Mbol enzimes hasítással két, 158 bp és 90 bp hosszúságú fragmentumhoz jutunk. Ez alátámasztja azt, hogy a homozigóta nem rendelkezik Banll hasítási hellyel, viszont egy Mbol hasítási hellyel rendelkezik.
Volt néhány eset, amelyben három csíkot kapunk, egy 248 bp, 163 bp és 85 bp hosszúságút Banll enzimes hasítással, és 248 bp, 158 bp és 90 bp hosszúságút Mbol enzimes hasítással. Ezt heterozigótának (G/T) tekintjük, mivel a kettő közül az egyik fragmentumban van egy Banll hasítási hely, a másikban egy Mbol hasítási hely.
A fent bemutatott három különböző típus alapján, az eNOS-génben található Glu298Asp-mutáció gyakoriságát vizsgáljuk a koszorúérgörcsös anginás és kontrollcsoportok valamennyi esetében. Minden esetre elvégezzük az emésztést mindkét enzimmel. A két enzim alkalmazásával kapott eredmények minden esetben konzisztensek.
A Glu298Asp-mutációt a 96, koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciens közül 22-ben (23%) megtaláltuk, amelyek közül egy homozigóta volt, és 21 heterozigóta volt. Másrészt, a 86 kontroll közül 7-ben (8%) megtaláltuk a mutációt, amelyek mindegyike heterozigóta volt.
(4) Statisztikus analízis: összefüggés a koszorúérgörcs és a Glu298Asp-mutáció, vagy más kockázati faktor között
A (3) lépésben kapott mutációs gyakoriságot összehasonlítottuk más, koszorúér-megbetegedéssel kapcsolatos rizikófaktorral, például korral, nemmel, magas vérnyomással, cukorbetegséggel, magas koleszterinszinttel, testtömegindexszel és dohányzással, a kontroll és koszorúérgörcsös anginában szenvedő csoportok esetén, khi-négyzet-analízist és páratlan t-tesztet alkalmazva, Fisher-féle egzakt valószínűséggel. Továbbá multivarianciaanalízlst végeztünk (többszörös logisztikai regressziós analízis) annak vizsgálata céljából, hogy a rizikófaktor asszociált-e koszorúér10 görccsel, „SPSS Advanced Statistics 6.Γ programot Macintoshon alkalmazva (SPSS Japan Inc., Japan). Fiktív változókat alkalmazunk független változókként, az alábbiak szerint. A számszerű értékek átlagot ±SD-t jelentenek.
Nem; 0: férfi, 1: nő.
Kor; 0: 60 alatt, 1: 60 vagy fölötte.
Testtömegindex; 0: 26 alatt, 1: 26 vagy fölötte. Koleszterinszint; 0: normál, 1: magas koleszterinszint (küszöbérték: 260 mg/dl fölött).
Dohányzás; 0: nem dohányzó, 1: dohányzó.
Cukorbetegség: 0: nincs, 1: van (küszöbérték:
140 mg/dl gyorsan bomló vércukor vagy 200 mg/dl OGTT).
A khi-négyzet analízis eredményeit és lépésenként előrehaladó szelekciót (Wald) alkalmazó analízis eredményeit a 2. és 3. táblázatokban ismertetjük, ahol p=0,05-t tekintjük szignifikáns értéknek a statisztikában.
A statisztikus analízis eredményei
A koszorúérgörcs és a Glu298Asp-mutáció, vagy más rizikófaktorok, például kor, nem, magas vérnyomás, cukorbetegség, magas koleszterinszint, testtömegindex és dohányzás közötti kapcsolat vizsgálata alapján a nem (p=0,035), a dohányzás (p=0,00001) és a Glu298Asp-mutáció szignifikáns, ahogyan a 2. táblázatban láthatjuk.
2. táblázat
A kísérletben megfigyelt páciensek jellemzői; a kontroll- és a koszorúérgörcsös anginában szenvedő csoport összehasonlítása
| Kontroll n=86 | Görcsös n=96 | p-érték | |
| Kor | 61±12 | 61±11 | 0,97* |
| Férfi:nő | 35:51 | 53:43 | 0,035** |
| Testtömegindex | 23,4±3,7 | 23,1±3,0 | 0,48* |
| Magas vérnyomás | 29/85 | 35/94 | 0,39** |
| Cukorbetegség | 15/84 | 10/93 | 0,13** |
| Magas koleszterinszint | 31/82 | 31/93 | 0,32“ |
| Dohányzók | 17/84 | 50/95 | 0,00001“ |
| Glu298Asp-mutáció | 7/86 | 22/96 | 0,005 |
* Páratlan t-teszt.
“Khi-négyzet-analízis Fisher-féle egzakt valószínűséggel.
A multivarianciaanalízis (többszörös logisztikai reg- juk be. A 3. táblázat szerint a dohányzás az elsődleges ressziós analízis) eredményeit a 3. táblázatban mutat- 60 tényező, amely felelős a koszorúérgörcs kialakulásáért
HU 226 469 Β1 (p=0,0005), és a Glu298Asp-mutáció a második lég- regressziós analízis nem mutat semmilyen szignifikáns fontosabb tényező (p=0,0272). A többszörös logisztikai kapcsolatot a nem és koszorúérgörcs között.
3. táblázat
Koszorúérgörcsös anginával asszociált paraméterek többszörös logisztikai regressziós analízissel; a végső változók az egyenletben, lépésenként előrehaladó regressziós analízist alkalmazva (Wald)
| Változó | β | SE | Wald | df | Szign.* | R | Exp (β) |
| Dohányzás | 1,2342 | 0,3529 | 12,2316 | 1 | 0,0005 | 0,2120 | 3,4355 |
| Glu298Asp | 1,0746 | 0,4866 | 4,8771 | 1 | 0,0272 | 0,1124 | 2,9288 |
| Konstans | -,4371 | 0,2139 | 4,1747 | 1 | 0,0410 | - | - |
* Szignifikancia.
2. példa
Mutáció detektálása az eNOS-génben lévő exon-6ban
Az 1. példában leírt eljárás szerint genomiális DNS-t izolálunk 10 koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciensből és 9 kontroliból. PCR-t végzünk az 1. táblázatban ismertetett primereket alkalmazva, azután SSCP-eljárást hajtunk végre a mutáció detektálására az exon-6-ban. Azután az exon-6-ot szekvenáljuk, hogy közvetlenül azonosítsuk a bázisszubsztitúciót, citozinról (C) timinre (T) az eNOS-gén cDNS-ének 774. helyzetében.
Ezt a bázisszubsztitúciót 10 koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciens közül 4-ben megtaláltuk, míg a szubsztitúciót a 9 kontroliban nem találtuk meg (p=0,03). A szubsztitúció következtében nem volt aminosavcsere.
3. példa
Mutáció detektálása az eNOS-gén 5’-végi szegélyezőrégiójában (1)
Lényegében az 1. példában leírt eljárást ismételjük meg, kivéve azt, hogy a következő primereket alkalmaztuk a bázisszubsztitúció azonosítására, timinről (T) citozinra (C) az 5'-végi szegélyezőrégióban [815. (-786) helyzet],
PCR-SSCP [781-1016. (-585—820). bp; 236 bp] 5'-végi primer: 5’-ATGCTCCCACCAGGGCATCA-3' 3’-végi primer: 5'-GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG-3'
Ezt a bázisszubsztitúciót 123 koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciens közül 34-ben (27,6%) megtaláltuk, míg a szubsztitúciót a 86 kontroll közül csak 4-ben (4,7%) találtuk meg (P<0,0001).
4. példa
Mutáció detektálása az eNOS-gén 5’-végi szegélyezőrégiójában (2)
Lényegében az 1. példában leírt eljárást ismételjük meg, kivéve azt, hogy a következő primereket alkalmazzuk a bázisszubsztitúció azonosítására, adeninről (A) guaninra (G) az 5’-végi szegélyezőrégióban [679. (-922). helyzet.]
PCR-SSCP [593-800. (-801—1008). bp; 208 bp] 5’-végi primer: 5’-TCAGTCTCTGAGGTCTCGAA-3’ 3'-végi primer: 5'-TGATGCCCTGGTGGGAGCAT-3'
Ezt a bázisszubsztitúciót 104 koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciens közül 31-ben (29,1%) megtaláltuk, míg a szubsztitúciót a 83 kontroll közül csak 3-ban (3,6%) találtuk meg (P<0,0001).
5. példa
Mutáció detektálása az eNOS-gén 5’-végi szegélyezőrégiójában (3)
Lényegében az 1. példában leírt eljárást ismételjük 25 meg, kivéve azt, hogy a következő primereket alkalmazzuk a bázisszubsztitúció azonosítására, timinről (T) adeninre (A) az 5’-végi szegélyezőrégióban [133.
(-1468). helyzet.]
PCR-SSCP [111-387. (-1214—1490). bp; 30 221 bp]
5’-végi primer: 5'-CCATTAACTGGAACCTAGGAA-3’ 3'-végi primer; 5’-AGCCTGGGCTTTGTCCCATGA-3'
Ezt a bázisszubsztitúciót 98 koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciens közül 26-ban (26,5%) meg35 találtuk, míg a szubsztitúciót a 26 kontroliban nem találtuk meg (0%) (P<0,0006).
6. példa
Kiszűrés a mutációkra
A fenti példákban azonosított öt mutációra szűrünk, például nagyszabású ASO-hibridizációs eljárással (hibridizáció allélspecifikus oligonukleotidokkal). A széles körű kiszűrésre alkalmazott ASO-hibridizációs eljárást az alábbiakban ismertetjük:
1) SSCP-hez hasonló PCR-t hajtunk végre. Ebben az esetben a végtérfogat 20 μΙ. Az reakció összetétele és a cikluskörülmények az 1. példában leírtakkal megegyeznek;
2) a PCR-reakciókeverékből 10 μΙ-es aliquotot veszünk, 100 μΙ aliquotot immobilizálunk nejlon membránra a vad típushoz a 200 μΙ-es, következő oldatból: 0,5 M nátrium-hidroxid+1,5 M nátrium-klorid+25 mM EDTA2Na, azután 100 μΙ-t immobilizálunk nejlon membránra a mutáns típushoz;
3) az egyes immobilizált nejlon membránokat különböző hibridizálózacskóba („hybribag) tesszük, prehibridizációs oldatot töltünk a zacskókba (3*SSPE, 5*Denhart-féle reagens, 0,5% SDS, 1 pg/μ 1 heringspermából származó DNS), és inkubáljuk a zacskókat 65 °C-on, 2 óra hosszáig;
HU 226 469 Β1
4) 32P-vel (5* 106 dpm/ml) jelölt normál próbát, és bármilyen jelölés nélküli, abnormális próbát ötszörös térfogatban adunk egyik zacskóhoz, míg 32P-vel (5*106 dpm/ml) jelölt abnormális próbát, és bármilyen jelölés nélküli, normál próbát ötszörös térfogatban adunk egy 5 másik zacskóhoz;
5) az egyes zacskókat 60 °C-on, 30 percig inkubáljuk, és tovább inkubáljuk ugyanezeket a zacskókat további egy óra hosszáig a hőmérsékletet lecsökkentve °C-ról X °C-ra, ahol X 53 °C a 3. példában, 50 °C a 10 4. példában, 46 ’C az 5. példában;
6) a nejlon membránokat kivesszük a zacskókból, és a membránokat kétszer inkubáljuk 2*SSPE-ben (0,1% SDS) szobahőmérsékleten 10 percig, azután egyszer inkubáljuk azokat 5*SSPE-ben (0,1% SDS) X °C-on 15 10 percig;
7) befedjük a membránokat saran-csomagolóval, röntgenfilmre tesszük azokat, és exponáljuk a röntgenfilmet (autoradiográfia).
7. példa
A mutációk kiszűrése az exon-6-ban és az eNOS-gén 5'-szegélyezőrégiójában
A 2., 3. és 5. példában leírt direkt szekvenálómódszer alkalmazásával az eNOS-gén cDNS-ének 774. helyzetében citozinról (C) timinre (T) változott bázisszubsztitúciót, valamint a 815. (-786.) helyzetben timinről (T) citozinra (C) módosult bázisszubsztitúciót, és az eNOS-gén 5’-végi szegélyezőrégiójában, a 133. (-1468.) helyzetben timinről (T) adeninre (A) módosult bázisszubsztitúciót azonosíthatjuk. Ezen mutációk kiszűrésére PCR-RFLP-eljárást hajtunk végre. A PCR-ben alkalmazott oligonukleotidokat és az amplifikáció körülményeit a 4. és 5. táblázatban mutatjuk be:
4. táblázat
PCR-amplifikációhoz alkalmazott oligonukleotidok bázisszekvenciája (a) exon-6
5’-TCTGACCAGCTCTTTCCCCATTCG-3’ (szensz) 5’-CCACTGGTTTCCTCATTCTCCACC-3’ (antiszensz) (b) 5’-végi szegélyezőrégió [133. (-1468).]
5’-CTCCAGCCCCTCAGATGA-3’ (antiszensz 1)
5'-TCCAGCCCCTCAGATGG-3’ (antiszensz 2) 5’-GTCCTTGAGTCTGACATTAGGG-3' (szensz) (c) 5’-végi szegélyezőrégió [815. (-786).]
5’-AATGAGTCATCCTTGGTCATG-3’ (antiszensz)
5’-GGGTTTGTAGTTCTGTGT-3’ (szensz 1)
5'-GGGTTTGTAGTTCTGTGC-3’ (szensz 2)
5. táblázat
PCR-amplifikáció körülményei
| Amplifikált régió | Hőmérséklet (°C) | Idő* (másodperc) | Ciklus | ||||
| De. | An. | Ex. | De. | An. | Ex. | ||
| Exon-6 | 94 | 63 | 72 | 60 | 60 | 60 | 32 |
| 5'-szeg. régió | 94 | 58 | 72 | 45 | 75 | 60 | 32 |
| 5’-szeg. régió | 94 | 60 | 72 | 45 | 75 | 60 | 32 |
A PCR-t 25 ml pufferben végeztük (összetétele: 10 mM Tris-HCI, pH 9,0, 50 mM kálium-klorid, 1,5 mM magnézium-klorid és 0,1% Triton X-100; 0,5 mM az egyes PCR-primerből; 200 mM dezoxinukleotid; 0,5 U Taq-polimeráz).
*: A hőmérsékletet „DNA Thermal Cyclar 480 (Perkin-Elmer Cytus) készülékben szabályozzuk.
De: denaturáció; An: összehibridizálás; Ex: láncnövekedés.
(1) Mutáció exon-6-ban
Az 1. példa (2) lépésében leírt eljárás szerint az eNOS-génben lévő exon-6-ot amplifikáljuk egy mintá- 55 ból, az 4. táblázatban ismertetett prímért, és az 5. táblázatban ismertetett körülményeket alkalmazva. Az így kapott amplifikált fragmentumot (232 bp) Foki enzimmel emésztjük a gyártó utasításai szerint, és az emésztett termékeket 10%-os poliakrilamid-gélben 60 elektroforetizáljuk, a csíkok azonosítása céljából. Mivel a Foki enzim csak mutáns gént képes hasítani, azt találtuk, hogy C/C-vel rendelkező homozigóta 232 bp méretű csíkot ad, a C/T-vel rendelkező heterozigóta 232 bp, 133 bp és 99 bp méretű csíkokat ad, és a T/T-vel rendelkező homozigóta 133 bp és 99 bp méretű csíkokat ad. A PCR-RFLP-eljárással végzett kiszűrés eredményét a 4. ábrán mutatjuk be.
HU 226 469 Β1 (2) Mutáció az 5’-végi szegélyezőrégió 815. (-786.) helyzetében
Az 1. példa (2) lépésében leírt eljárás szerint az eNOS-gén 5’-végi szegélyezőrégiójának 815. (-786.) helyzetében lévő mutációt tartalmazó szakaszt amplifikáljuk egy mintából, az 4. táblázatban ismertetett prímért, és az 5. táblázatban ismertetett körülményeket alkalmazva. Az így kapott amplifikált fragmentumot (354 bp) Mspl enzimmel emésztettük a gyártó utasításai szerint, és az emésztett termékeket 10%-os poliakrilamid-gélben elektroforetizáljuk, a csíkok azonosítása céljából. Az Mspl enzim a vad típusú gén homozigótáját (T) hasítja egy helyen, két, 196 bp és 158 bp méretű csíkokat adva. Másrészt, az Mspl enzim a mutáns gén homozigótáját (G) két helyen hasítja, három, 158 bp, 154 bp és 44 bp méretű csíkokat adva. A PCR-RFLPeljárással végzett kiszűrés eredményét a 4. ábrán mutatjuk be.
(3) Mutáció az 5'-végi szegélyezőrégió 133.
(-1468.) helyzetében
Az 1. példa (2) lépésében leírt eljárás szerint az eNOS-gén 5’-végi szegélyezőrégiójának 133. (-1468.) helyzetében lévő mutációt tartalmazó szakaszt amplifikáljuk egy mintából, az 4. táblázatban ismertetett prímért, és az 5. táblázatban ismertetett körülményeket alkalmazva. Az így kapott amplifikált fragmentumot (627 bp) Mbol enzimmel emésztjük a gyártó utasításai szerint, és az emésztett termékeket 10%-os poliakrilamid-gélben elektroforetizáljuk, a csíkok azonosítása céljából. Az Mbol enzim a vad típusú gén homozigótáját (T) hasítja egy helyen, két, 515 bp és 112 bp méretű csíkokat adva. Másrészt, az Mbol enzim a mutáns gén homozigótáját (A) két helyen hasítja, három, 515 bp, 61 bp és 41 bp méretű csíkokat adva. A PCR-RFLP-eljárással végzett kiszűrés eredményét a 4. ábrán mutatjuk be.
(4) Mutáció az 5’-végi szegélyezőrégió 679. (-922.) helyzetében
Ezt a mutációt PCR-SSP-vel (SSP=szekvenciaspecifikus primer) detektáltuk. A két típusú primer előre és hátra növekvő változatát (összesen négyfajtát) úgy terveztük, hogy a lánc a -922. helyzetben lévő „A” vagy „G” helyzetből indulva 3’-irányban növekedjen. Ezek a primerek megegyeznek a 4. táblázatban, a (b) és (c) pontban leírtakkal. Ezekhez a primerekhez párosított szensz és antiszensz primereket (két fajta) terveztünk úgy, hogy az amplifikálandó régió tartalmazza a 133. (-1468.) és 815. (-786.) helyzetben lévő mutációt. A PCR-eljárás alapján kiderül, hogy a 679. (-922.) helyzetben lévő, A/A-t tartalmazó homozigóta csak olyan primerrel amplifikálható, amely „A”-t vagy „T-t (komplementer szekvencia) tartalmaz a 3’-origóban, míg a G/G-t tartalmazó homozigóta csak olyan primerrel amplifikálható, amely „G’’-t vagy „C”-t (komplementer szekvencia) tartalmaz a 3’-végi terminálnál.
Az így kapott amplifikált fragmentumok ugyanazok voltak, mint fentebb, a (2) és (3) pontban leírtak. Néhány mintából amplifikált fragmentumok vizsgálata szerint, fentebb, a (2) pontban kapott amplifikált fragmentummal (354 bp), amely a 679. (-922.) helyzetben „A”-t tartalmazó alléiból (vad típus) származott, csak a 815. (-786.) helyzetben „T-vel rendelkező vad típust kaptunk, míg fentebb, a (2) pontban kapott amplifikált fragmentummal (354 bp), amely a 679. (-922.) helyzetben „G”-t tartalmazó alléiból (mutáns típus) származott, csak a 815. (-786.) helyzetben „G”-vel rendelkező mutáns típust kaptunk. Ehhez hasonlóan, fentebb, a (3) pontban kapott amplifikált fragmentummal (627 bp), amely a 679. (-922.) helyzetben „A”-t tartalmazó alléiból (vad típus) származott, csak a 133. (-1468.) helyzetben „Τ'vei rendelkező vad típust kaptunk, míg fentebb, a (3) pontban kapott amplifikált fragmentummal (627 bp), amely a 679. (-922.) helyzetben „G”-t tartalmazó alléiból (mutáns típus) származott, csak a 133. (-1468.) helyzetben „A”-vel rendelkező mutáns típust kaptunk. Ezek azt mutatják, hogy a találmány bizonyos előnyös megvalósítási módja szerint, az 5’-végi szegélyezőrégióban található összes fentebb leírt mutáció ugyanazon az allélon egymással összefüggésben alakulhat ki, azt indikálva, ha a három közül akár az egyiket is detektáljuk, akkor a másik két mutáció is megtalálható.
Diszkusszió
A fentebb leírtak alapján feltételezzük, hogy az eNOS-génben lévő mutációk felelősek a NOS-enzim aktivitásának csökkenéséért, amely csökkenés koszorúérgörcsöt indukálhat, és néhány kísérletet végeztünk hipotézisünk alátámasztására. Ha a hipotézis igaz, összhangban van azzal a ténnyel, hogy a koszorúérgörcs nemcsak egy (ér)ágban fordul elő, hanem több ágban is [Okumura K. et al., Circulation 77, 535-542 (1988)]. Az 1. példában bemutatott Glu298Asp-mutáció, amelyet Marsden és munkatársai korábban közölték [J. Bioi. Chem. 268, 17 478-17 488 (1993)] ugyan, de a mutáció jelentőségét nem írták le.
Az 1. példában bemutatott Glu298Asp-mutációt a koszorúérgörcsös anginában szenvedő páciensek 23%-ában találtuk meg, míg a kontrollok 8%-ában találtuk meg, indikálva, hogy a mutáció gyakorisága az anginás csoportban szignifikánsan magas, a kontrollcsoporthoz hasonlítva. A multivarianciaanalízis eredménye szerint a koszorúérgörcs és a Glu298Asp-mutáció közötti kapcsolat szignifikánsnak tekinthető.
Úgy tekinthetjük, hogy míg a mutáció gyakorisága a koszorúérgörcsös csoportban alig 23%, a páciensek maradék 77%-a esetén a koszorúérgörcsöt a mutációtól különböző, más patogén faktor váltotta ki. Feltételezzük, hogy mutációk olyan régiókban is lehetnek, amelyek az 1. példában leírtak szerinti, eNOS-génben lévő exon-7-től különböző promotereket és intronokat tartalmaznak; valamint néhány kísérletet végeztünk, hogy alátámasszuk ezt a feltételezést (2-5. példák). Ennek megfelelően, ha ezen mutációk kapcsolatát még specifikusabban vizsgáljuk, lehetséges, hogy a koszorúérgörccsel kapcsolatos betegségek még megbízhatóbb diagnózisához jutunk.
Másképpen fogalmazva, úgy is tekinthetjük, hogy koszorúérgörcsöt nemcsak eNOS-gén okozhat, hanem
HU 226 469 Β1 más gének is. Továbbá meg kell jegyeznünk, hogy koszorúérgörcsöt nemcsak genetikai faktorok okozhatnak, hanem környezeti faktorok is, olyan páciensek esetében, akiknél a koszorúérgörcs kialakulásának oka viszonylag kis mértékben örökölt típusú. Az 1. példában bemutatottak szerint, a dohányzás az egyik kockázati tényezője a koszorúérgörcs kialakulásának. Ez az eredmény összhangban van korábbi közleményekkel [Dennis G. et al., Circulation 85, 905-909 (1989); Sugiishi M. et al., Circulation 87, 76-79 (1993)]. A leírásban alkalmazott többszörös logisztikai regressziós analízis szerint a dohányzás a legdominánsabb faktor az összes rizikófaktor között, beleértve a mutációt is, ami azt indikálja, hogy a környezeti tényezőknek különösen fontos szerepük van a koszorúérgörcs patogenezisében. Más kutatók szintén kimutatták, hogy a dohányzás endotél károsodást okoz [Celermajer D. S. et al., Circulation 88, 2149-2155 (1993); Zeiher A. M. et al., Circulation 92, 1094-1100 (1995)].
A Glu298Asp-mutációt a kontrollok (786, 1. példa) 8%-ában megtaláltuk. Az okát nem egészen értjük, de azt azonban megjegyezzük, hogy míg hat személy nemdohányzó volt hét mutációval rendelkező személy közül, ez a hat személy nem hozható kapcsolatba a dohányzással, amely komoly rizikófaktor. A koszorúér10 görcs diagnózisának nehézségeit is figyelembe kell venni. Pontosabban, a koszorúérgörcsöt bizonyos okok miatt nem lehet észlelni, és bizonyos eseteket a koszorúérgörcsös csoporthoz kellett volna sorolni, de a kontrollcsoportba kerültek a következők miatt:
Claims (4)
1) A rohamot azért nem lehet észlelni, mert a roham gyakran az éjszaka közepén, reggelig zajlik le, és általában napközben nem jelentkezik.
2) Acetil-kolin beadása a koszorúér-artériába koszorúérgörcsöt indukál, és a koszorúérgörcs gyakran a koszorúérgörcsös angina súlyosságától függ.
3) A koszorúérgörcsös rohamok több, mint kétharmada néma (orvosilag nem kimutatható).
4) Sőt, ha a vizsgálat nem mutat ki koszorúérgörcsös anginát, az angina a jövőben jelentkezhet. Viszont, a leírásban példaként felhozott koszorúérgörcsös anginában szenvedő csoport olyan esetpopuláció volt, amelyben kétség nélkül azonosították a koszorúérgörcsöt arteriográfiával.
A találmány szerint tehát kimutattuk, hogy a koszorúérgörcsöt genetikai faktorok, valamint elsődlegesen környezeti faktorok okozzák, valamint jobb diagnosztikai módszert bocsátunk rendelkezésre a koszorúérgörccsel kapcsolatos betegségek diagnosztizálására.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31950495 | 1995-11-13 | ||
| JP16876196 | 1996-06-28 | ||
| PCT/JP1996/003324 WO1997018327A1 (en) | 1995-11-13 | 1996-11-13 | Diagnosis of diseases associated with coronary twitching |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0000177A2 HUP0000177A2 (hu) | 2000-06-28 |
| HUP0000177A3 HUP0000177A3 (en) | 2005-11-28 |
| HU226469B1 true HU226469B1 (en) | 2008-12-29 |
Family
ID=26492342
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0000177A HU226469B1 (en) | 1995-11-13 | 1996-11-13 | Process and kit for diagnosis of diseases associated with coronary twitching |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6569618B1 (hu) |
| EP (1) | EP0875581B1 (hu) |
| JP (1) | JP3928140B2 (hu) |
| KR (1) | KR100449060B1 (hu) |
| CN (1) | CN1165628C (hu) |
| AT (1) | ATE351920T1 (hu) |
| AU (1) | AU710395B2 (hu) |
| BR (1) | BR9611309A (hu) |
| DE (1) | DE69636856T2 (hu) |
| HU (1) | HU226469B1 (hu) |
| IL (1) | IL124348A (hu) |
| NO (1) | NO323560B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ322185A (hu) |
| RU (1) | RU2185442C2 (hu) |
| WO (1) | WO1997018327A1 (hu) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100888377B1 (ko) * | 2001-06-28 | 2009-03-13 | 노바티스 백신즈 앤드 다이아그노스틱스 인코포레이티드 | 파르보바이러스 ｂ19의 진단 분석 |
| US20060177830A1 (en) * | 2004-12-02 | 2006-08-10 | Council Of Scientific & Industrial Research (Csir) | Method of detection of predisposition to emphysema in chronic obstructive pulmonary disease |
| DK2515899T3 (en) * | 2009-12-23 | 2016-08-15 | Arca Biopharma Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR CARDIOVASCULAR DISEASES AND CONDITIONS |
| RU2469096C2 (ru) * | 2011-02-28 | 2012-12-10 | Государственное Учебно-Научное Учреждение Факультет Фундаментальной Медицины Московского Государственного Университета Имени М.В. Ломоносова | Способ определения наследственной предрасположенности к развитию инфаркта миокарда у лиц без клинических проявлений ишемической болезни сердца |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993018156A1 (en) * | 1992-03-05 | 1993-09-16 | The General Hospital Corporation | Endothelial nitric oxide synthase |
-
1996
- 1996-11-13 AU AU75865/96A patent/AU710395B2/en not_active Expired
- 1996-11-13 IL IL12434896A patent/IL124348A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-11-13 EP EP96938453A patent/EP0875581B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-13 CN CNB961982810A patent/CN1165628C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-13 RU RU98111689/14A patent/RU2185442C2/ru active
- 1996-11-13 BR BR9611309A patent/BR9611309A/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-11-13 NZ NZ322185A patent/NZ322185A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-11-13 KR KR10-1998-0702818A patent/KR100449060B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-11-13 WO PCT/JP1996/003324 patent/WO1997018327A1/ja active IP Right Grant
- 1996-11-13 JP JP51873697A patent/JP3928140B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-13 AT AT96938453T patent/ATE351920T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-11-13 DE DE69636856T patent/DE69636856T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-13 HU HU0000177A patent/HU226469B1/hu unknown
- 1996-11-13 US US09/068,506 patent/US6569618B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-05-12 NO NO19982162A patent/NO323560B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0875581A1 (en) | 1998-11-04 |
| HUP0000177A2 (hu) | 2000-06-28 |
| BR9611309A (pt) | 1999-03-02 |
| JP3928140B2 (ja) | 2007-06-13 |
| CN1165628C (zh) | 2004-09-08 |
| IL124348A (en) | 2001-10-31 |
| EP0875581A4 (en) | 2004-03-24 |
| AU7586596A (en) | 1997-06-05 |
| NO982162D0 (no) | 1998-05-12 |
| DE69636856D1 (de) | 2007-03-08 |
| DE69636856T2 (de) | 2007-10-11 |
| EP0875581B1 (en) | 2007-01-17 |
| NZ322185A (en) | 1999-05-28 |
| KR19990064321A (ko) | 1999-07-26 |
| KR100449060B1 (ko) | 2004-11-16 |
| NO323560B1 (no) | 2007-06-11 |
| IL124348A0 (en) | 1998-12-06 |
| CN1202205A (zh) | 1998-12-16 |
| WO1997018327A1 (en) | 1997-05-22 |
| HUP0000177A3 (en) | 2005-11-28 |
| NO982162L (no) | 1998-07-10 |
| RU2185442C2 (ru) | 2002-07-20 |
| ATE351920T1 (de) | 2007-02-15 |
| US6569618B1 (en) | 2003-05-27 |
| AU710395B2 (en) | 1999-09-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bowne et al. | Mutations in the inosine monophosphate dehydrogenase 1 gene (IMPDH1) cause the RP10 form of autosomal dominant retinitis pigmentosa | |
| Nussbaum et al. | Physical mapping and genomic structure of the Lowe syndrome gene OCRL1 | |
| US9868989B2 (en) | Mutation within the connexin 26 gene responsible for prelingual non-syndromic deafness and method of detection | |
| Whittock et al. | Comparative mutation detection screening of the type VII collagen gene (COL7A1) using the protein truncation test, fluorescent chemical cleavage of mismatch, and conformation sensitive gel electrophoresis | |
| Bourdon et al. | A detailed analysis of the MECP2 gene: prevalence of recurrent mutations and gross DNA rearrangements in Rett syndrome patients | |
| Furuya et al. | Adult onset globoid cell leukodystrophy (Krabbe disease): analysis of galactosylceramidase cDNA from four Japanese patients | |
| US11214834B2 (en) | Methods of detecting Charcot-Marie tooth disease type 2A | |
| Wedell et al. | Characterization of mutations on the rare duplicated C4/CYP21 haplotype in steroid 21-hydroxylase deficiency | |
| US20180346983A1 (en) | Methods for identifying subjects susceptible to ataxic neurological disease | |
| US6566064B1 (en) | Method for anticipating sensitivity to medicine for osteoporosis | |
| US20040076968A1 (en) | Method for detecting pre-disposition to hepatotoxicity | |
| HU226469B1 (en) | Process and kit for diagnosis of diseases associated with coronary twitching | |
| US6462190B1 (en) | Polynucleotides and kits for detection of an age-related mutation | |
| US6939674B2 (en) | Medicine response assay in respiratory disease | |
| US7960108B2 (en) | DNA polymorphisms in sterol-regulator-element binding proteins | |
| CA2236809C (en) | Diagnosis of coronary artery spasm-associated diseases | |
| FR2730745A1 (fr) | Procede de detection d'une mutation intervenant dans la maladie d'alzheimer et sequences nucleotidiques pour sa mise en oeuvre | |
| JP3222850B2 (ja) | ウシのＣｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群の遺伝子診断法 | |
| US20040259087A1 (en) | Use | |
| Beuten et al. | Mutation analysis of the human pancreatic phospholipase A2 gene in a family with distal hereditary motor neuropathy type II linked to 12q24 | |
| JP3222867B2 (ja) | ウシのＣｈｅｄｉａｋ−Ｈｉｇａｓｈｉ症候群の遺伝子診断法 | |
| JP5044780B2 (ja) | アンギオテンシン変換酵素阻害薬またはアンギオテンシン受容体拮抗薬投与有効群の選別方法 | |
| JP3684921B2 (ja) | 骨粗鬆症薬剤感受性予測方法 | |
| KR20100100529A (ko) | 산재성 위암 감수성 예측용 다형성 마커 및 이를 이용한 산재성 위암 감수성 예측 방법 | |
| WO2006073183A1 (ja) | 一塩基多型を用いた炎症性疾患の判定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FH91 | Appointment of a representative |
Free format text: FORMER REPRESENTATIVE(S): BELICZAY LASZLO, S.B.G. & K. BUDAPESTI NEMZETKOEZI SZABADALMI IRODA, HU Representative=s name: RATHONYI ZOLTAN, S.B.G. & K., SZABADALMI UEGYV, HU |
|
| FH92 | Termination of representative |
Representative=s name: BELICZAY LASZLO, S.B.G. & K. BUDAPESTI NEMZETK, HU |