ME00554B - KORIŠĆENJE IL-18 INHIBITORA ZA LIJEČENJE l/ILI PREVENCIJU ATEROSKLEROZE - Google Patents

Abstract

Ovaj pronalazak se odnosi na inhibitor IL-18 za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze.

Description

POLJE PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na polje vaskularnih bolesti. Još preciznije, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu IL-18 inhibitora za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze.

STANJE TEHNIKE

Ateroskleroza je najčešća i najvažnija vaskularna bolest, ali postoje i mnogi drugi vaskularni poremećaji. Ateroskleroza najčešće pogađa velike i srednje arterije, a lezije uključuju masne trake, fibrolitične plakove i komplikovane lezije. Ateroskleroza je hronično zapaljensko oboljenje koje se odlikuje progresivnim nagomilavanje masti, kao što je holesterol, ćelija kao što su makrofagi, T limfociti ili glatke mišićne ćelije, kao i ekstraćelijski matriks (1). Veće naslage nazivaju se ateromima ili plakovimna, i oni često sadrže kalcijum. Masno tkivo može da erodira zid arterije, smanji elastičnost arterije, i utiče na protok krvi. Na kraju, ugrušci mogu da se stvore oko deponovanih plakova, dodatno utičući na protok krvi, što može da dovede do potpune okluzije krvnog suda. Obično je ateroskleroza povezana s povećanim nivoima LDL-holesterola, Lp(a) fibrinogena i faktora VIII, kao i smanjenim nivoom HDL-holesterola. U faktore rizika spadaju starost, muški pol, pušenje, dijabetes, gojaznost, visoki nivo holesterola u krvi. ishrana bogata mastima, kao i lična i porodična istorija srčanih oboljenja. Ona je i glavni uzrok ishemije organa, na pr. infarkta miokarda.

Aterom je najuobičajenija lezija u arterijama, koja može dodatno da se komplikuje trombo-embolijom. Ateromski plakovi često sužavaju lumen arterija dovodeći do ishemije i ponekad atrofije tkiva u hipoperfundovanoj teritoriji. U teške posledice spadaju simptomi angine pektoris zbog ishemije miokarda, srčana insuficijencija zbog ishemije ili neishemičnih događaja, kao i hipertenzija zbog sužavanja bubrežne arterije i hipoperfuzija bubrega koja fiziološki reaguje povećanom sekrecijom renina.

Ponekad se ateroskleroza i arterioskleroza smatraju potpuno nezavisnim patološkim stanjima, i u tom slučaju, ateroskleroza se definiše kao stvrdnjavanje (skleroza) ili gubitak elastičnosti arterija specifično zbog ateronta, dok se arterioskleroza se definiše kao stvrdnjavanje (skleroza) ili gubitak elastičnosti arterija iz bilo kog uzroka.

Komplikacije ili posledice ateroskleroze uključuju oboljenje koronarnih arterija (ateroskleroza koronarnih arterija), nedovoljno snabdevanje krvlju zbog opstrukcije (ishemija/angina pektoris), akutni IM (infarkt miokarda, srlani napad), prolazni ishemični napad (TIA) ili moždani udar, kao i oštećenje krvnih sudova, mišića ili telesnih organa.

Aneurizme, koje su trajne, abnormalne dilatacije krvnih sudova, predstavljaju takođe uobičajene posledice ateroskleroze. Aterosklerotične aneurizme abdominalne aorte se često razvijaju kod pacijenata starijeg životnog doba. One mogu da se raspuknu (ruptura) u retroperitonelani prostor. Kok aterosklerotskih aneurizmi, često postoji izraženi gubitak elastičnog tkiva i fibroze medije, uglavnom zbog ishemije mišića aortne medije, posle čega dolazi do oslobađanja enzima makrofaga koji izazivaju fragmentaciju elastičnih vlakana.

U lekove koji se preporučuju za lečenje ili prevenciju ateroskleroze spadaju oni za smanjenje masti/holesterola u krvi. Pre svega, široko se primenjuje terapija za smanjenje LDL-holesterola. U ovom trenutku se najšire koriste statini koji su specifični inhibitori HMG CoA reduktaze. U ostale agense za smanjenje masti spadaju holestiramin, kolestipol, nikotinska kiselina, gemfibrozil, probukol, lovastatin i drugi.

Drugi pristup je da se na najmanju meru svede rizik od formiranja tromba na oformljenoj ateromatoznoj leziji. Aspirin, koji je izgleda specifični inhibitor tromboksan A2 posredovane agregacije trombocita, ili antikoagulansi, mogu da se koriste da se smanji rizik od formiranja tromba.

Perkutana «balon angioplastika» koristi kateter koji na vrhu ima balon kojim se plak spljošti i poveća se protok krvi kroz okluziju. Ova tehnika je slična onoj koja se koristi za otvaranje srčanih arterija, ali može da se primeni i na mnoge druge arterije u telu. Stenoza koronarnih arterija se premošćuje segmentima vene safene koja se uliva u proksimalnu aortu ili se disecira mamama arterija iz zida grudnog koša i pravi se anastamoza njenog distalnog kraja za arteriju na prednjoj površini srca.

Hirurško uklanjanje depozita (endarterektomija) može da se preporuči u nekim slučajevima (na primer: karotidna endarterektomija).

Međutim, ipak se najviše preporučuje da se leće ili kontrolišu faktori rizika, kao održavanje nivoa masti na niskom nivou, niskog holesterola, kao i ishrana siromašna solju i preporuke zdravstvenih radnika za lečenje ili kontrolu hipertenzije, dijabetesa i drugih bolesti, smanjenje telesne težine i prestanak pušenja, ako i redovno vežbanje da se popravi kondicija srca i cirkulacije.

Zapaljenski proces je uključen u sve stadijume ateroskleroze (1). Smatra se da je aktivacija endotela različitim faktorima uključujući niski tangencijalni napon, modifikovane lipoproteine i proinflamatome citokine, prvi korak u aterosklerozi i daje pod kontrolom inflamacije (1). Mnoge novije studije su pokazale daje interakcija između vaskularnih i inflamatomih ćelija ključna za aterogenezu (1). Pre svega, inhibicija definisanih pro-inflamatomih puteva smanjuje razvoj ateroskleroze (1).

I zapaljenje igra važnu ulogu u pucanju aterosklerotskih plakova i trombozi (2-5), i na taj način utiče na pojavu sindroma akutne ishemije i prateći mortalitet (6). I stvarno, teže kliničke manifestacije ateroskleroze, uključujući infarkt srca, mozga i ma kog drugog organa koji je zahvaćen aterosklerozom, uglavnom su posledica okluzije lumena krvnih sudova tromboni joji se stvara pri kontaktu sa pokidanim aterosklerotskim plakom (3, 4). Patološke studije pokazale su da se vulnerabilni ili nestabilni plakovi, t.j. planovi skloni rupturi ili koji su već prsli, u mnogome u mnogome razlikuju u sastavu ćelija ili matriksa u poređenju sa stabilnim plakovima koji nisu skloni rupturi (7). Vulnerabilni plakovi su bogati inflamatornim ćelijama (makrofagima i T limfocitima), sadrže trombogenu masnu srž i odlikuju se tankom fibroznom kapicom s substancijalnim gubitkom ekstraćelijskog matriksa (7).

Smanjena sinteza kolagena, posredovana proinflamatornim citokinom IFNyi povećana aktivnost metaloproteinaza koje degradiraju matriksa dobijenih iz makrofaga odgovorni su za istanjenje fibrozne kapice i fragilnost (7). Ruptura fragilne fibrozne kapice izlaže visoko trombogenu lipidnu srž krvi u cirkulaciji i dovodi do formiranja

okluzivnog tromba (1,7). Prema tome, gustina zapaljenskih ćelija u datoj aterokslerotskoj leziji smatra se dobrim indikatorom nestabilnosti.

Klinička prognoza pacijenta s aterosklerozom zavisi samo delimično od veličine lezije (19, 20). Sada je široko prihvaćeno da kvalitet (sastav plaka), a ne veličina njegove lezije, može da bude još bol ji prediktor pojave ishemičnih događaja. I stvarno, teške kliničke manifestacije ateroskleroze (infarkta mozga i srca) uglavnom su posledica okluzije krvnog suda tromboni koji se formira pri kontaktu s erodiranim aterosklerotskim plakom (19). Patološke studije su pokazale da su vulnerabilni ili nestabilni plakovi koji su skloni rupturi ili koji su već erodirali, bogati zapaljenskim ćelijama i da pokazuju znatan gubitak glatkih mišićnih ćelija i kolagenskog sadržaja (20, 21). Staviše, takvi plakovi pokazuju značajno povećanje apoptotične ćelijske smrti koja vodi do formiranja visoko trombogene lipidne srži (13, 22). -

U zapaljenje su uključeni i proinflamatorni citokini. Citokinski interleukin 18 (IL- 18) je inicijalno opisivan kao faktor koji indukuje interferon-γ (IFNγ) (8). To je rani signal razvoja odgovora ćelija pomagača tipa i (Thl ) T limfočita. IL-18 deluje zajedno sa IL-12, IL-2, antigenima, mitogenima, i verovatno još nekim faktorima da se indukuje produkcija IFNγ. IL-18 takođe pojačava produkciju GM-CSF i IL-1, pojačava proliferaciju T ćelija indukovanu anti-CD3, i pojačava ubijanje ćelija prirodnih ubica posredstvom Fas. Zreli IL-18 su proizvedeni iz svojih prekursora IL-1 β konvertujućim enzimom (ICE, kaspaze-1). Receptor IL-18 sastoji se od najmanje dve komponente, koje sarađuju u vezivanju liganda. Mesta vezivanja IL-18 visokog i niskog afiniteta nađena su u mišjim T ćelijama koje su stimulisane IL-12 (19), što govori o receptorskom kompleksu multiplih lanaca. Do sada su identiflkovane dve receptorske podjeđinice. i obe pripadaju porodici IL-1 receptora (10). Transdukcija signala IL-18 uključuje aktivaciju NF-κB (11).

Nedavno je iz urina čoveka izolovan solubilni protein koji ima visoki afinitet za IL-18, pa su klonirani humana i mišja cDNK kao i taj humani gen (12; WO99/09()63). Ovaj protein je nazvan IL-18 vezuućim proteinom (IL-18BP).

IL-18BP nije vanćelijki domen jednog od poznatih IL-18 receprota, već protein koji se sekretuje i prirodno cirkuliše. On pripada novoj porodici sekretujućih proteina, koji još uključuju nekoliko proteina enkodiranih za Poxvirus (12). 1L18BP se konstitutivno eksprimira u slezini (12). I urinami i rekombinantni IL18BP specifično vezuju IL-18 visokim afinitetom i moduliraju biološki afinitet IL-18.

Gen IL18BP lokalizovan je na humanom hromozomu 11 q 113 i u genomskoj sekvenci 8,3'mb nije nađen ekson koji kodira za transmembranski đomen. Četiri nadovezane varijante izoforma IL18BP nađene su kod ljudi, i nazvan su IL18BP a. b, c i d, a sve dele isti N-terminus i razlikuju se u C-terminusu (12).

Četiri humana i dva mišja izoforma IL-18BP dobijenih od nadovezivanja mRNK i koji su nađeni u raznim cDNK bibliotekama eksprimirani su, prečišćeni i procenjeni na vezivanje i neutralizaciju bioloških aktivnosti IL-18 (23). Humani IL18BP izoform a (IL18Bpa) ispoljava najveći afinitet za IL-18 s brzim on-rate, sporim off-rate i konstantom disocijacije (K(đ)) od 399 pM. IL-18BPc deli Ig domen IL-18Bpa osima za 29 C-terminalne arnino kiseline; K(d)) IL-18BPc je deset puta manja (2,94 nM). Ipak, IL- 18BPa i IL-18BPc neutralizuju IL-18 >95% kada je molaritet više od dva. lL-18BPb i IL- 18BPd izoformi nemaju potpuni Ig domen i nemaju sposobnost da vezuju ili neutralizuju IL-18. Mišji IL-18BPc i IL-18BPd izoformi imaju identičan Ig domen, i oni neutralizuju >95% mišji IL-18 kada je molaritet više od dva. Međutim, mišji IL-18BPd, koji ima zajednički C-terminalni motiv identifikuje jedno veliko mešano elektrostatsko i hidrofobno mesto vezivanja u Ig domenu IL-18BP, što može da objasni visoki afinitet vezivanja za ligand (23).

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

Ovaj pronalazak se zasniva nalazu da inhibitor IL-18 ima izrađeno korisno dejstvo na razvoj plaka, progresiju plaka i stabilnost plaka u mišjem modelu ateroskleroze. Inhibitor IL-18 ne samo sprečava nastajanje lezije u torakalnoj aorti, već indukuje i prelazak na stabilni fenotip plaka kod već oformljenih aterosklerotičnih plakova.

Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu inhibitora IL-18 za proizvodnju leka za prevenciju i/ili lečenje ateroskleroze. Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metode lečenja genskim terapijskim pristupom lečenja i /ili sprečavanja nastanka ateroskleroze.

KRAĆI OPIS CRTEŽA

Slika 1 opisuje histogram koji opisuje procenat preživljavanja endotelijalnih ćelija iz humane umbilikalne vene po inkubaciji samim oksidisanim lipoproteinima ili inkubacije s kombinacijom oksidisanib lipoproteina i IL-18 antitela odnosno IL18BP.

Slika 2 pokazuje Western Blot test urađen na ekstraktima proteina iz aterosklerotičnih arterija u poređenju s kontrolnim aterijama. Kada se radio Westem Blot, korišćena su antitela protiv IL-18BP (hILISBP), IL-18 receptorska a podjedinica (hIL18Ra), IL-18 (hILl8) i Kaspase-1 (Kaspase-1 plO).

Slika 3 pokazuj etidijum bromidom obojeni agarozni gel koji pokazuje rezultate analize RT-PCR na IL-18 i IL-18BP mRNK u ćelijama aterosklerotičnih plakova.

Slika 4 Representativni rezultati RT-PCR za IL-18BP i IL-18 u aterosklerotičnim plakovima u poređenju sa ha-actin (kontrolnom) ekspresijom kod simptomatsdkih i asimptomatskih plakova.

Slika 5 pokazuje mapu vektora ekspresije koji se koristi za intramuskularni elektrotransfer kod miševa.

Slika 6 pokazuje histogram koji oslikava polje prebojene masnoće u aterosklerotičnim aterijama. Kvantitativna analize slike deponovane masnoće uz pomoć kompjutera. Ovi podaci predstavljaju srednje vrednosti s s.e.m. (n = 19 za prazni plasmiđ, n = 14 za IL-18BP plasmid). Četvorostruke zvezdice označavaju P < 0.0001.

Slika 7 pokazuje histogram koji oslikava polje lezije aortnog sinusa posle tretmana IL-18BP u poređenju s kontrolom (prazni plasmid). Kvantitativna analize slike ledirane površine uz pomoć kompjutera. Ovi podaci predstavljaju srednje vrednosti s s.e.m. (n = 19 za prazni plasmid, n = 14 za IL-18BP plasmid). Dvostruke zvezdice označavaju P < 0.01.

Slika 8 pokazuje dejstvo tretmana IL-18BP na lezije sa sadržajem zapaljenskih ćelija. Kvantitativna analize slike uz pomoć kompjutera je korišćena za određivanje procenta makrofag-pozitivnih površina (crvni stubići) i broja infiltrirani!) T limfocita na mm2 (sivi stubići) u leziji aortnog sinusa kod kontrola (n = 12 za makrofagno bojenje, n = 15 za prebojavanje T limfocita) ili miševa tretiranih sa IL-18BP (n = 13 za makrofage, n = 12 za prebojavanje T limfocita) Podaci predstavljaju srednje vrednosti sa s.e.m. Trostruke zvezdice označavaju P < 0.005; a četvorostruke zvezdice označavaju P <

0. 0001.

Slika 9 pokazuje dejstvo tretmana IL-18BP lezija na glatke mišićne ćelije i sadržaj kolagena. Kvantitativna analize slike uz pomoć kompjutera je korišćena za određivanje procenta površina pozitivnih na glatke mišićne ćelije (crni stubići) i akumulaciju kolagena (sivi stubići) u lezijama aortnog sinuda kontrola (n = 6 za glatke mišićne ćelije, n = 11 za kolagen) i miševe tretirane IL-18BP (n = 6 za glatke mišićne ćelije, n = 13 za kolagen). Podaci predstavljaju srednje vrednosti sa s.e.m. Pojedinačne zvezdice označavaju P < 0.05; a dvostruke zvezdice označavaju P < 0.01.

OPIS PRONALASKA

Ovaj pronalazak se zasniva na nalazu povećanih nivoa IL-18 u cirkulaciji pacijenata s akutnim koronarnim sindromom i povećanom produkcijom IL-18 kod nestabilnih aterosklerotičnih karotidnih plakova koji su odgovorni za moždani udar. Uz to, pokazano je da in vivo elektrotransfer ekpresije plazmida DNK koji kodiraju za IL- 18BP sprečava razvoj masnih traka u torakalnoj aorti i usporava progresiju uznapredovali!) aterosklerotskih plakova u aortnom sinusu u dobro utvrđenom mišjem modelu ateroskleroze. Još važnije, transfekcija sa plazmidom IL-18BP dovodi do dubokih pramena u sastavu plaka (smanjenje makrofaga, T ćelija, ćelijske smrti i sadržaja lipida i povećanje glatkih mišićnih ćelija i sadržaja kolagena) što dovodi do stabilnog fenotipa plaka. Ovi rezultati po prvi put pokazuju važnu ulogu inhibitora IL-18 u smanjenju razvoja plaka ili njihove progresije i promocije stabilnosti plaka.

Prema tome, opvaj pronalazak se odnosi na korišćenje inhibitora IL-18 za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze.

Izraz “prevencija” u kontekstu ovog pronalaska odnosi se ne samo na kompletnu prevenciju nekih dejstava, već i na svaku delimičnu ili znatniju prevenciju, ublaženje, redukciju, smanjenje ili značajno umanjenje dejstva pre početka ili na samom početku bolesti.

Izraz “lečenje” u kontekstu ovog pronalaska odnosi se na svako blagotvorno dejstvo na progresiju bolesti, uključujući i ublaženje, redukciju, smanjenje ili značajno umanjenjivanje patološkog razvoja po započinjanju bolesti.

Izraz “inhibitor IL-18” u kontekstu ovog pronalaska odnosi se na svaki molekul koji modulira produkciju IL-18 i/ili delovanje na takav način da su produkcija i/ili dejstvo IL-18 ublaženi, smanjeni ili delimično ili substancijalno ili potpuno sprečeni ili blokirani.

Inhibitor produkcije može da bude svaki molekul koji negativno utiče na sintezu, procesiranje ili maturaciju IL-18. Inhibitori koji se uzimaju u obzir u skladu sa ovim pronalaskom mogu da budu, na primer, supresori genske ekspresije interleukina IL-18, antisense mRNK koja smanjuje ili sprečava transkripciju IL-18 mRNK ili dovodi do degradacije mRNK. proteina koji slabi ispravno savijanje ili delimično ili supstancijalno sprečavaju maturaciju ili sekreciju IL-18, proteaze koja degradira IL-18, kada se jednom sintetizuje, i slično. Jedan inhibitor produkcije može da bude inhibitor Kaspase-1 ili jedan ICE inhibitor, na primer, koji sprečava maturaciju IL-18.

Jedan inhibitor dejstva IL-18 može da bude, na primer antagonista IL-18. Antagonista može da veže ili sekvestrira sam molekul IL-18 s dovoljnim afinitetom i specifičnošću da delimično ili supostancijalno neutralizuje mesta vezivanja IL-18 ili IL- 18 koja su odgovoRNK za vezivanje IL-18 za svoje ligande (kao na pr. za svoje receptore). Jedan antagonist može da inhibira i put signalizacije IL-18, akoji se aktivira u ćeliji po vezivanju IL-18 za receptor.

Inhibitori dejstva IL-18 mogu da budu i solubilni IL-18 receptori ili molekuli koji podražavaju receptore, ili agensi koji blokiraju IL-18 receptore, IL-18 antitela, kao monoklonska antitela, na primer, ili ma koji drugi agens ili molekul koji sprečava vezivanje IL-18 za svoje ciljeve, i na taj način smanjuje ili sprečava trigerovanje intra- ili ekstraćelijskih reakcija posredovanih preko IL-18.

Ateroskleroza se naziva i arterioskleroza ili stvrdnjavanje arterija. U kontekstu ovog pronalaska, izraz ateroskleroza obuhvata sve bolesti ili stanja bolesti arterija koja se obično nazivaju ateroskleroza, gde se masni materijal deponuje u zidovima krvnih sudova, što na kraju dovodi do sužavanja i slabljenja protoka krvi kao i rupture i/ili erozije sa stvaranjem ugruška.

U skladu sa ovim pronalaskom, izraz ateroskleroza obuhvata i sklerozu i gubitak elastičnosti arterija zbog ateroma (ateroskleroza) kao i iz ma kog drugog razloga (arterioskleroza). Patološko stanje ateroskleroza, kao i komplikacije ili posledice ateroskleroze, koje su ovde obuhvaćene izrazom “ateroskleroza” u smislu u kome se ovde koristi, detaljno su opisani u delu pod naslovom “Stanje tehnike”, gore.

Progresija ateroskleroze uključuje formaciju aterosklerotskih plakova i njihov razvoj u sve nestabilniju formu. Prema tome ovaj pronalazak se odnosi i na upotrebu inhibitora IL-18 inhibitor za proizvodnju medikamenta za smanjenje ili prevenciju progresije ateroskleroze.

Okluzija krvnih sudova ugruškom (trombom) koji se stvara na aterosklerotskom plaku je kritični događaj u infarktu srca i mozga, koji spadaju u najteže posledice ateroskleroze. Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi i na korišćenje inhibitora IL-18 za proizvodnju medikamenta za tretman i/ili preveciju tromboze aterosklerotskog plaka.

Stabilnost plaka utiče na razvoj aterosklerotskog plaka u štetni i vulnerabilni plak, koji ima tendenciju da izazove trombozu. Prema tome, ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje inhibitora IL-18 za proizvodnju medikamenta za tretman i/ili prevenciju for nestabilnosti aterosklerotskog plaka.

Nestabilni plak ima tendecniju da erodira, a erozija, t.j. disrupcija plaka može da dovede do tromboze. Prema tome, ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje inhibitora IL-18 za proizvodnju medikamenta za prevenciju erozije ili rupture aterosklerotskog plaka.

Nestabilnost plaka i tromboza mogu, na pr. Da budu posledica apoptotske ćelijske smrti koja novi visoku prokoagulantnu aktivnost i može da bude ključni element koji dovodi do tromboze ili rupture aterosklerotskog plaka, kao i embolijskog događaja (13, 14). Pokazano je da oksidizovani lipoproteini (oxLDL) indukuju makrofage i apoptozu endotelijalnih ćelija u kulturi (15). Kao stoje prikazano u primeru dole, utvrđeno je daje jedan inhibitor IL-18 u stanju da u mnogome smanji smrt ćelija izazvanu oxLDL.

U skladu sa ovim pronalaskom, s iznenađenjem je utvrđeno da su nivoi IL-18 signifikantno povišeni kod pacijenata sa srčanom insuficijencijom koji pate od rekurentnih napada, kao na pr. smrt, rekurentna ishemija, re-vaskularizacija, progresija ateroskleroze ili ponovna hospitalizacija zbog srčane insuficijencije u poređenju s pacijentima koji nisu ponovo hospitalizovani. Ovo povećanje nivoa IL-18 bilo je posebno naglašeno kod onih pacijenata koji su preminuli kasnije, u poređenju s onima koji su preživeli. Povišeni nivoi IL-18 u krvnoj cirkulaciji zapaženi su i u ihemičnih bolesnika kao i kod onih bez ishemije.

Prema tome, ovaj pronalazak se odnosi i na upotrebu inhibitora IL-18 za proizvodnju medikamenata za tretman i/ili prevenciju rekurentnih epizoda srčane insuficijencije. Ove rekurentne epizode mog biti svaki događaj posle srčane insuficijencije, kao što je smrt, rekurentna ishemija, re-vaskularizacija, progresija ateroskleroze ili ponovna hospitalizacija zbog srčane insuficijencije.

U prerefencijalnom obliku ovog pronalaska srčana insuficijencija je izazvana ishemijom, t.j. infarktom miokarda.

U drugom preporučenom obliku ovog pronalaska srčana insuficijencija nije izazvana ishemijom. odnosno ona je ne-ishemijska, izazvana na primer hiperetenzijom, oboljenjem srčanih zalistaka, ili plućnim oboljenjem koje dovodi do desne i o+nda kongestivne srčane insuficijencije.

U preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 se odabire iz grupe koja se sastoji od ICE-inhibitora, antitela protiv IL-18, antitela protiv IL-18 receptorskih pođjedinica, inhibitora signalnih puteva IL-18 receptora, antagonista IL-18 koji se nadmeću sa IL-18 i blokiraju IL-18 receptor, i proteina koji vezuju IL-18, muteina, fuziranih proteina, funkcionalnih derivata, aktivnih frakcija ili njihovih cirkularno permutovanih derivata koji imaju istu aktivnost.

Kao što se ovde koristi, izraz "muteini" odnosi se na analoge jednog IL-18BP, ili analoge virusnog IL-18BP,gde jedan ili više amino kiselinskih ostataka prirodnog IL-18BP ili virusnog IL-18BP bivaju zamenjeni amino kiselinskim ostatkom, ili se brišu, ili se jedan ili više aminokiselinskih ostataka dodaje prirodnoj sekvenci IL-18BP, ili virusnom IL-18BP, ne menjajući značajnije aktivnost rezultujućeg proizvoda u poređenju s divljim tipom IL-18BP ili virusnim IL-18BP. Ovi muteini se pripremaju poznatom sintezom i/ili tehnikom mutageneze usmerenom na jedno mesto, ili ma kojom drugom poznatom pogodnom tehnikom.

Svaki takav mutein po mogućstvu sadrži jednu sekvencu amino kiselina dovoljno duplikativan za jedan IL-18BP, ili dovoljno duplikativan za jedan virusni IL-18BP, tako da ima aktivnost dovoljno sličnu aktivnosti IL-18BP. JeDNK od aktivnosti IL-18BP jeste sposobnost da vezuje IL-18. Sve dok taj mutein ima dovoljnu aktivnost vezivanja IL-18, može da se koristi za prečišćavanje IL-18, na primer pomoću afinitetne hromatografije, i tako može da se smatra da ima supstancijalno sličnu aktivnost kao i IL-18BP. Na taj način može da se odredi da li ma koji dati mutein ima supstancijalno istu aktivnost kao i IL-18BP uz pomoć rutinskih eksperimenata uključujući recimo mutein na primer prostom eseju sendvič kompeticije da se odredi da li se vezuje ili ne za odgovarajuće obeleženi IL-18 kao što je radioimunoesej ili ELISA esej.

Muteini IL-18BP polipeptida ili muteini virusnih IL-18BP. koji mogu da se koriste u skladu sa ovim pronalaskom, ili nukelinske kiseline koje kodiraju za njih,

uključuju konačni skup supstancijalno odgovarajućih sekvenci kao supstitucioni peptidi ili polinukleotidi koji ritinski mogu da se dobijaju na način poznat u ovoj oblasti, bez nepotrebnog eksperimentisanja na osnovu saznanja i smernica datih ovde.

Preporučene promene za muteine u skladu sa ovim pronalaskom poznate su kao “konzervativne” supstitucije. Konzervativne supstitucije amino kiselina IL-18BP pohpeptida ili proteina ili virusnih lL-18BPs, mogu da uključe sinonimne amino kiseline u grupi koja ima dovoljno slična fizikohemijska svojstva da supstitucija između članova grupa očuva biološku funkciju molekula (16). Jasno je da se insercije i delecije amino kiselina mogu obaviti i u gore navedenim sekvencama ne menjajući njihovu funkciju, posebno ako ove insercije ili delecije uključuju samo manji broj amino kiselina, na pr. Manje od trideset, i po mogućstvu manje od deset, i ne uklanjaju se i ne pomeraju amino kiseline koje su kritične za funkcionalnu konformaciju, na primer cisteinski ostatak. Proteini i muteini koji se proizvedu takvim delecijama i/ili insercijama spadaju u okvire ovog pronalaska.

Po mogućstvu, sinonimske grupe amino kiselina su one koje su definisane na Tabeli I. Još je bolje ako su sinonimske grupe amino kiselina one koje su definisane na Tabeli II; a najbolje je ako su sinonimske grupe amino kiselina one koje su definisane na Tabeli III.

Primeri produkcije supstitucija amino kiselina u proteinima koji mogu da se koriste za dobijanje muteina IL-18BP polipeptida ili proteina, ili muteina virusnog IL-18BPs, za upotrebu u ovom pronalasku uključuje sve metode i korake koji su prikazani u patentima SAD 4,959,314, 4,588,585 i 4,737,462, na Mark i sar; 5,116,943 na Koths i sar., 4,965,195 na Namen i sar; 4,879.111 na Chong i sar; i 5.017,691 na Lee i sar; lizinom supstituisane proteine prikazane u patentu SAD No. 4,904,584 (Shaw i sar).

Izraz "fuzirani protein" odnosi se na jedan polipeptid koji obuhvata IL-18BP, ili virusni IL-18BP. ili njihov mutein, koji je fuziran s drugim proteinom, koji na pr. ima produženo vreme boravka u telesnim tečnostima. IL-18BP ili jedan virusni IL-18BP.

mogu na taj način da se spoje s drugim proteinom, polipeptidom ili slično, na pr. imunoglobulinim ili njegovim fragmentom.

"Funkcionalni derivati " u smislu u kome se ovde koriste uključuje derivate IL-18BPs ili virusni IL-18BP, i njihove muteine i fuzirane proteine, koji mogu da se pripremaju od funkcionalnih grupa koje nastaju kao bočni lanci na ostatcima ili na N- ili C-terminalnim grupama, na načine poznate u struci, i uključeni su u ovaj pronalazak sve dotle dok su farmaceutski prihvatljivi, t.j. ne uništavaju aktivnost IL-18BP. ili virusnog IL-18BPs, i ne daju toksična svojstva preparatima koji ih sadrže. Ovi derivati mogu, na primer, da uključe polietilenske glikolne bočne lance, koji mogu a maskiraju antigena mesta i produže boravak jednog IL-18BP ili virusnog IL-18BP u telesnim točnostima. U druge derivate spadaju alifatični estri karboksilnih grupa, amidi karboksilnih grupa, reakcijom s amonijakom ili s primamim ili sekundarnim aminima, N-acil derivati slobodnih arnino grupa amino kiselinskih ostataka koji se formiraju s acilnim sredinama (na pr. alkanoil ili karbociklične aroil grupe) ili O-acil derivati slobodnih hidroksilnih grupa (na primer seril ili treonil ostataka) koji se formiraju s acilnim sredinama.

Kao "aktivne frakcije" 1L-18BP, ili virusnog IL-18BP, muteina i fuziranih proteina, ovaj pronalazak obuhvata svaki fragment ili prekursore polipeptidnih lanaca samog proteinskog molekula alone ilio zajedno s pratećim molekulima ili ostatcima povezanim za njega, na pr., šećer ili fosfatni ostatci, ili agregati proteinskog molekula ili sami šećerni ostatci, pod uslovom da navedena frakcija ima aktivnost koja je supstancijalno slična aktivnosti L-18BP.

U dodatnom preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 je jedno IL- 18 antitelo. Anti-IL-18 antitela mogu biti poliklonska ili monoklonska, himerska, humanizovana, ili čak potpuno humana. Rekombinantna antitela i njihovi fragmenti se odlikuju visokim afinitetom vezivanja za IL-18 in vivo i niskom toksičnošću. Antitela koja mogu da se koriste u ovom pronalasku odlikuju se sposobnošću da tretiraju pacijente tokom perioda dovoljno dogog da se dobije dobra do odlična regresija ili ublaženje patogenog stanja ili svakog simptoma ili grupe simptoma koji su vezani za to patogeno stanje, i niskom toksičnošću.

Neutralizujuća antitela se lako dobiajju od životnja kao što je zec, koza ili miš imunizacijom sa IL-18. Imunizovani miševi su posebn o pogodni za obezbeđivanje izvora B ćelija za proizvodnju hibridoma, koji se za uzvrat gaje da proizvedu velike količine anti-IL-18 monoklonskih antitela.

Himerska antitela su imunoglobulinski molekuli koji se odlikuju sa dva ili više segmenata ili delova koji se dobijaju od različitih životinjskih vrsta. Generalno, variabilni region himerskog antitela dobija se od ne-humanog antitela sisara, kao što je mišje monoklonsko antitelo, a konstantni region imunoglobulina dobija se od jednog humanog imunoglobulinskog molekula. Po mogućstvu, oba regiona i kombinacija imaju nisku imunogenost što se rutinski određuje (24). Humanizovana antitela su imunoglobulinski molekuli stvoreni tehnikama genetskog inženjeringa gde se konstantni mišji regioni zamenjuju odgovarajućim humanim delovima dok istovremeno zadržavaju mišje regione vezivanja antigena. Dobijeno mišje-humano himersko antitelo ima po mogućstvu smanjenu imunogenost i poboljšanu farmakokinetiku kod ljudi (25).

Tako, u još jednom preporučenom obliku, IL-18 antitelo je humanizovano IL-18 antitelo. Preporučeni primeri humanizovanih anti-IL-18 antitela opisani su u European Patent Application EP 0 974 600, na primer.

U još jednom preporučenom obliku IL-18 antitelo je potpuno humano. Tehnologija proizvodnje humanih antitela detaljno je opisana u na pr. WOOO/7631(), WO99/53049. US 6.162,963 ili AU 5336100. Potpuno humana antitela su po mogućstvu rekombinantna antitela, proizvedena u transgenim životinjama, na pr. ksenomišu, i obuhvataju sve delove funkcionalnih humanih Ig lokusa.

U visoko preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 je IL-18BP, ili izoform, mutein, fuzirani protein, funkcionalni derivat, aktivna frakcija ili cirkularno permutivani derivat istih. Ovi izoformi, muteini, fuzirani proteini ili funkcionalni derivati zadržavaju biološku aktivnost IL-18BP, pre svega vezivanje za IL-18, i po mogućstvu imaju bar jednu aktivnost sličnu IL-18BP. Idealno, ovakvi proteini imaju biološku aktivnost koja je čak povećana u poređenju s nemodifikovanim IL-18BP. Preporučene aktivne frakcije imaju aktivnost koja je bolja od aktivnosti IL-18BP, ili koja ima druge prednosti, kao što je bolja stabilnost ili niža toksičnost ili imunogenost, ili ih je lakše proizvesti u većim količinama, ili ih je lakše prečistiti.

Sekvence IL-18BP i nadovezane variante/izoforme mogu da se preuzmu iz W099/09063 ili iz (12), kao i iz (23).

Funkcionalni derivati IL-18BP mogu da se konjuguju za polimere da bi se poboljšale osobine proteina, kao što su stabilnost, poluživot, biološka raspoloživost, tolerancija od strane ljudskog organizma ili imunogenost. Da bi se postigao ovaj cilj.

IL18-BP može da se poveže na pr. za Polietilenglicol (PEG). PEGilacija može da se obavi poznatim metodama, opisanim u WO 92/13095, na primer.

Prema tome, u preporučenom obliku ovog pronalaska, IL-18BP je PEGiliran.

U drugom preporučenom obliku ovog pronalaska, inhibitor EL-18 je jedan fuzirani protein koji obuhvata ćelo ili delove IL-18 vezujućeg proteina, koji se vezuje za ceo ili za delove imunoglobulina. Stručnjak za ovu oblast će razumeti da rezultujući fuzioni protein zadržava biološku aktivnost 1L-18BP, pre svega vezivanje za IL-18. Ova fuzija može da bude direktna, ili da se odvija preko kratkih linker peptida koji mogu biti kratki samo 1 do 3 amino kiselinska ostatka dužine ih mogu biti duži, na primer, 13 amino kiselinskih ostataka dužine. Ovaj linker može da bude tripeptid sekvence E-F-M (Glu-Phe-Met), na primer, ili linker sa 13-amino kiselinskih sekvenci i da obuhvata Glu-Phe-Gly-Ala-Gly- Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met koji se uvode između 1L-18BP sekvence i imunoglobulinske sekvence. Rezultujući fuzioni protein ima poboljšana svojstva, kao što je produženo vreme boravka u telesnim tečnostima (polu-život), povećanu specifičnu aktivnost, povećani nivo ekspresije ili je olakšana purifikacija fuzionog proteina.

U jednom preporučenom obliku, IL-18BP je spoje za konstantni region jednog Ig molekula. Po mogućstvu, spaja se za region teških lanaca, kao CH2 i CH3 domeni humanog IgGl, na primer. Generisanje specifičnih fuzionih proteina koji uključuju IL- 18BP i deo jednog imunoglobulina opisano je u primeru 11 iz WP99/09063, na primer. Drugi izoformi Ig molekula su takođe pogodni za generisanje fuzionih proteina u skladu sa ovim pronalaskom, kao što su izoformi IgG2 ili IgG4, ili druge Ig klase, kao IgM ili IgA, na primer. Fuzioni proteini mogu biti monomerni ili multimerni, hetero- ili homomulti merni.

Interferoni su pre svega poznati po inhibitornom dejstvu na replikaciju virusa i ćelijsku proliferaciju. Interferon-γ, na primer, igra važnu ulogu u promociji imuno i inflamatomih odgovora. Smatra se da Interferon β (IFN-β, interferon tip I), igra anti- inflamatornu ulogu.

Ovaj pronalazak se odnosi i na korišćenje kombinacije inhibitora IL-18 i jednog interferona za proizvodnju lekova za lečenje ateroskleroze.

Interferoni mogu da se konjuguju u polimere da bi se poboljšala stabilnost proteina. Konjugat Interferona β i poliol Polietilenglikol (PEG) opisan je na primer u W099/55377.

U drugom preporučenom obliku ovog pronalaska, interferon je Interferon-β (IFN- β), ili još bolje IFN-β la.

Inhibitor produkcije i/ili dejstva IL-18 se po mogućstvu koristi istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno od interferona.

U još jednom obliku ovog pronalaska, inhibitor IL-18 se koristi u kombinaciji sa antagonistom TNF. Antagonisti TNF svoje dejstvo vrše na nekoliko načina. Prvo, antagonisti mogu da se vezuju ili da sekvestriraju sam TNF molekul s dovoljnim afinitetom i specifičnošću da delimično ili supstancijalno neutralizuju TNF epitop ili epitope odgovorne za vezivanje receptora TNF (u daljem tekstu nazivaće se “sekvestrirajući antagonisti”)- Jedan sekvestrirajući antagonist može biti, na primer, i antitelo protiv TNF.

Alternativno, TNF antagonisti mogu da inhibiraju signalni put TNF koji se aktivira od strane receptora na površini ćelije po vezivanju TNF (u daljem tekstu “signalizirajući antagonisti”). Obe grupe antagonista su korisne, bilo same ili zajedno, u kombinaciji s IL-18 inhibitorom, za lečenje ateroskleroze.

TNF antagonisti se lako identifikuju i procenjuju rutinskim skriningom kandidata za njihovo dejstvo na aktivnost nativnog TNF na osetljive ćelijske linije in vitro, na primer humane B ćelije, u kojima TNF izaziva proliferaciju i sekreciju imunoglobulina. Ovaj esej sadrži TNF formulaciju u različitim razblaženjima kandidata antagonista, na pr. od 0,1 do 100 puta molarne količine TNF koja se koristi u eseju, i kontrole bez TNF ili samo sa antagonistom (26).

Sekvestrirajući antagonisti su preporučeni TNF antagonisti koje treba koristiti u skladu sa ovim pronalaskom. Među sekvestrirajućim antagonistma, prednost se daje onim polipeptidima koji vezuju TNF visokim afinitetom a imaju nisku imunogenost. Solublni molekuli TNF receptora and neutralizujuća antitela na TNF se posebno preporučuju. Na primer, solubilni TNF-RI i TNF-RII su korisni za ovaj pronalazak. Skraćene forme ovih receptora, koje obuhvataju ekstraćelijske domene receptora ili njihovih funkcionalnih delova, su posebno preporučeni antagonisti u skladu sa ovim pronalaskom. Skraćene solubilni TNF tip-I i tip-II receptori opisani su u EP914431, na primer.

Skraćene forme TNF receptora su solubilne i detektovane su urinu i serumu kao 30 kDa i 40 kDa TNF inhibitorni vezujući proteini, koji se nazivaju TBPI odnosno

TBPII (27). U skladu sa ovim pronalaskom, prednost se daje simultanoj, sekvencijalnoj ili odvojenoj upotrebi inhibitora IL-18 sa TNF antagonistom i/ili Interferonom.

U skladu sa ovim pronalaskom, TBP I i TBPII su preporučeni TNF antagonisti koje treba koristiti u kombinaciji sa inhibitorom IL-18. Derivati, fragmenti, regioni i biološki aktivni delovi receptorskih molekula funkcionalni podsećaju na receptorske molekule koji takođe mogu da se koriste u ovom. Ovakav biološki aktivan ekvivalent ili derivat receptorskog molekula odnosi se da deo polipeptida, ili sekvence koja enkodira receptorski molekul, koji je dovoljno veliki i u stanju je da veže TNF takvim afinitetom da interakcija sa TNF receptorom vezanim za membranu biva inhibirana ili blokirana.

U još jednom preporučenom obliku, humani solubilni TNF-RI (TBPI) je TNF antagonist koji se koristi u skladu sa ovim pronalaskom. Prirodni i recombinantni solubilni TNF receptorski molekuli i metode njihove produkcije opisani su u evropskim patentima EP 308 378. EP 398 327 i EP 433 900.

Inhibitor IL-18 može da se koristi istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno od inhibitora TNF. Bolje je kada se koristi kombinacija IL-18 antitelo ili antiserum i jedan solubilni receptor TNF, koji ima inhibitornu aktivnost TNF.

U još jednom preporučenom obliku ovog pronalaska, ovaj medikament još obuhvata i COX-inhibitor, po mogućstvu COX-2 inhibitor. COX inhibitori su poznati u struci. Specifični COX-2 inhibitori su otkriveni u WO 01/00229, naprimer.

Inhibitori tromboksana, pre svega tromboksana A2, trenutno se široko koriste za lečenje ateroskleroze. Prema tome, u dodatnom preporučenom obliku ovog pronalaska ovaj medikament još obuhvata i inhibotor tromboksana pre svega inhibitor tromboksana A2, za simultanu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu. Aspirin se posebno preporučuje za upotrebu sa inhibitorom IL-18, u skladu sa ovim pronalaskom.

Jedan od uzroka ateroskleroze je izgleda i visoka koncentracija lipida u krvi. Prema tome, u dodatnom obliku ovog pronalska, ovaj medicament dodatno obuhvata i agens za snižavanje koncentracije lipida za simultanu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu. Svaki agens za snižavanje lipida poznat u struci može da se koristi za ovaj pronalazak, uključujući holestiramin, kolestipol, nikotinsku kiselinu, gemfibrozil, probukol, i druge. Prednost se daje posebno inhibtorima HMG CoA Reduktaze a posebno takozvanim statinima. Mnogi statini su poznati u struci, recimo Simvastatin ili lovastatin.

Da bi se još bolje sprečila i/ili lečila ateroskleroza preporučeni oblik ovog pronalaska odnosi se na korišćenje inhibitora IL-18 u kombinaciji sa ishranom siromašnom mastima i/ili holesterola i/ili soli.

U preporučenom obliku ovog ponalaska, inhibitor IL-18 se koristi u količini od oko 0.0001 do 10 mg/kg telesne težine, ili oko 0.01 do 5 mg/kg telesne težine ili oko 0.1 do 3 mg/kg telesne težine ili oko 1 do 2 mg/kg telesne težine. U još jednom preporučenom obliku, inhibitor IL-18 se koristi u količini od oko 0.1 do 1000 μg/kg telesne težine ili 1 do 100 μg/kg telesne težine ili oko 10 do 50 μg/kg telesne težine.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na korišćenje vektora ekspresije koji obuhvata sekvencu kodiranja inhibitora IL-18 za pripremu medikamenta za prevenciju i/ili lečenje ateroskleroze. Prema tome, za lečenje i/ili prevenciju bolesti koristi se genski terapijski pristup. Prednost se ogleda u tome sa će ekspresija inhibitora IL-18 tako biti in siru, i na tak način efikasno blokirati IL-18 direktno u tkivima ili ćelijama zahvaćenim bolešću.

Kao što je u donjim primerima detaljno objašnjeno, pokazano je da efikasna ekspresija IL-18BP može da se pokaže na mišjem modelu po bolesti po elektrotransferu vektora ekspresije koji obuhvata sekvencu kodiranja IL-18BP.

Prema tome, u preporučeno m obliku, vektor ekspresije se daje elektrotransferom, po mogućstvu intramuskularno.

Korišćenje vektora ua indukciju i/ili pojačanje endogene produkcije inhibitora IL- 18 u ćeliji koja je normalno nema za ekspresiju inhibitora IL-18, ili koja eksprimira nedovoljne količine inhibitora uzimaju se u obzir, takođe, po ovom pronalasku. Ovaj vektor može da obuhvata regulatorne sekvence koje su funkcionalne u ćeilijama koje želimo da ekprimiraju inhibitor IL-18. Opvakve regulatorne sekvences mogu da budu promoteri ili pojačivači, na primer. Ove regulatorne sekvence onda mogu da se uvedu u pravi lokus genoma homolognom rekombinacijom, i na taj način operativno povežu regulatorne sekvence sa genom, čiju ekspresiju treba indukovati ili pojačati. Ova tehnologija se obično naziva “endogenom genskom aktivacijom” (EGA), i opisana jena pr. u WO 91/09955.

Stručnjaci za ovu oblast će razumeti i da da se spreči ekspresija IL-18 korišćenjem iste tehnike, t.j. uvođenjem negativnog regulacionog elementa, kao na pr. elementa za

utišavanje, u genski lokus IL-18. što tako dovodi do nishodne regulacije ili sprečavanja ekspresije IL-18. Stručnjaci za ovu oblast će razumeti i da takva nishodna regulacija ili utišavanje ekspresije IL-18 ima isto dejstvo kao i IL inhibitor -18 za sprečavanje i/ili lečenje bolesti.

Ovaj pronalazak se dodatno odnosi na korišćenje ćelije koja je genetski modifikovana da proizvede inhibitor IL-18 za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na farmaceutski sastav koji je posebno koristan za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze, koji uključuje terapijski efikasne količine inhibitora IL-18 i terapijski efikasne količine interferona. Kao inhibitor IL-18, ova formulacija može da obuhvati inhibotore kaspaze-1, antitela protiv IL-18, antitela protiv ma koje IL- 18 receptorske podjedinice, inhibitore IL-18 signalnog puta, antagoniste IL-18 koji se nadmeću sa IL-18 i blokiraju receptor IL-18, kao i IL-18 vezujuće proteine, izoforme, muteine, fuzirane proteine, funkcionalne derivate, aktivne frakcije ili njihove cirkulatorno permutovane derivate koji imaju istu aktivnost.

IL-18BP i njegovi izoformi, muteini, fuzirani proteini, funkcionalni derivati, aktivne frakcije ili njihovi cirkulatorno permutovani kako su gore opisani predstavljaju preporučene aktivne sastojek farmaceutske formulacije.

Interferon koji je uključen u ovu farmaceutsku foprmulaciju je po mogućstvu

IFN-p.

U još jednom preporučenom obliku, farmaceutska formulacija obuhvata terapisjki aktivne količine inhibitora IL-18, po želji interferon, i jedan TNF. Ovi antagonisti TNF mogu biti antitela koja neutralizuju aktivnost TNF ili solubilni antagonist skraćeni TNF receptorski fragmenti, koji se nazivaju i TBPI i TPBII. Farmaceutska formulacija u skladu sa ovim pronalaskom može da uključi još i inhibitore COX, po mogućstvu inhibitore COX-2. Farmaceutska formulacija u skladu sa ovim pronalaskom može da uključi još i inhibitore tromboksana, kao stoje aspirin, i/ili agens za snižavanje lipida kao stoje statin.

Definicija “farmaceutski prihvatljivog" ima za cilj da obuhvati nosač, koji ne utiče na efikasnost biološke aktivnosti aktivnog sastojka i koji nije toksičan za domaćina kome se daje. Na primer, za parenteralnu primenu, aktivni protein(i) mogu da se formulišu u jedinici doziranja za injekcije sa nosačima kao što su fiziološki rastvor, rastvor dekstroze, serumski albumin i Ringerov rastvor.

Aktivni sastojci farmaeutske formulacije u skladu sa ovim pronalaskom mogu da se daju pojedincima na različite načine. U načine davanje spadaju intradermalni, transdermalni (na pr. za formulacije sa sporim oslobađanjem), intramuskularni, intraperitonealni, intravenski, supkutani. oralni, epiduralni, površinski, i intranazalni način. Može se koristiti i svaki drugi terapijski efikasan način davanja, na primer apsorpcija kroz epitelijalno ili endotelijalno tkivo, ili genskom terapijom gde molekul DNK koji enkodira aktivni agens biva dat pacijentu (na pr. preko vektora) što dovodi do ekspresije ili sekrecije aktivnog agensa in vivo. Uz to, protein(i) u skladu sa ovim pronalaskom mogu da se daju zajedno s drugim komponentama biološki aktivnih agenasa kao što su farmaceutski prihvatljivi surfaktanti, ekscipienti, nosači, razblaživači i slično.

Za parenteralnu (na pr. intravensku, supkutanu, intramuskulamu) primenu, aktivni protein(i) mogu da se formulišu kao rastvori, suspenzije, emulzije ili liofilizovani prah u kombinaciji s farmaceutski prihvatljivim (na pr. voda,, fiziološki rastvor, rastvor dekstroze) i dodaci koji održavaju izotoničnost (na pr. manitol) ili hemijsku stabilnost (na pr. konzervansi i puferi). Formulacija se sterilizuje uobičajenim tehnikama.

Biološka raspoloživost aktivnih protein(a) u skladu sa ovim pronalaskom može da se poboljša i korišćenjem procedure konjugacije koja pojačava polu-život ovog molekula u telu čoveka, na primer povezivanjem ovog molekula za polietilenglicol, kao stoje opisano u zahtevu za patent PCT WO 92/13095.

Terapijski efikasne količine aktivnih protein(a) biće u funkciji mnogih promenljivih, uključujući tip antagoniste, afinitet tog antagoniste za IL-18, svu preostalu citotoksičnu aktivnost koju manifestuju antagonisti, način davanja, kliničko stanje pacijenta (uključujući i poželjnost da se održi ne-toksični nivo aktivnosti IL-18 ).

"Terapijski efikasna količina" je takva da kada se daje, inhibitor IL-18 dovodi do inhibicije biološke aktivnosti IL-18. Primenjena doza, u vidu pojedinačne ili multiplih doza, svakom pojedinom pacijentu zavisiće od brojnih činilaca, uključujući i farmakokinetička svojstva inhibitora IL-18, način davanja, osobine pacijenta i njegovo stanje (pol, godine starosti, telesna težina, veličina), težinu simptoma, prateću terapiju, učestalost lečenja i željeno dejstvo. Podešavanje i manipulacije utvrđenog režima doziranja znatno se razlikuju zavisno od sposobnosti stručnjaka kao i zavisno od in vitro i in vivo metoda određivanja inhibicije IL-18 kod svakog pojedinca.

U skladu sa ovim pronalaskom, inhibitor IL-18 se koristi u količini od oko 0.0001 do 10 mg/kg ili oko 0.01 do 5 mg/kg telesne težine, ili oko 0.01 do 5 mg/kg telesne težine, ili oko 0.1 do 3 mg/kg telesne težine, ili oko 1 do 2 mg/kg telesne težine. Druge preporučene količine inhibitora IL-18 su količine od oko 0.1 do 1000 μg/kg telesne težine, ili oko 1 to 100 μg/kg telesne težine, ili oko 10 to 50 μg/kg telesne težine.

U skladu sa ovim pronalaskom, što se tiče načina davanja, prednost se daje supkutanoj administraciji. U skladu sa ovim pronalaskom preporučuje se i intramuskularna administracija.

U drugim preporučenim oblicima, inhibitor IL-18 se daje svaki dan ili svaki drugi

dan.

Dnevne doze se obično daju u podeljenim dozama ili u oblicima sa kontrolisanim oslobađanjem da bi se dobilo željeno dejstvo. Drugo ili naredno davanje može da se obavi u dozi koja je ista, manja ili veća od inicijalne ili prethodne doze koja se da individualnom pacijentu. Drugo ili naredno davanje može da se obavi tokom bolesti ili pre početka bolesti.

U skladu sa ovim pronalaskom, inhibitor IL-18 može da se daje profilaktički ili terapijski, istovremeno, sekvencijalno sa drugim terapijskim režimima ili agensima (na pr. režimi sa više lekova) u terapijski efikasnoj količini. Aktivni agensi koji se daju istovremeno s drugim terapijskim agensima mogu da se daju u istim ili drugačijim sastavima.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metodu lečenja i/ili prevencije ateroskleroze kojom se podrazumeva davanje efikasne inhibirajuće doze inhibitora IL-18 domaćinu kome je to potrebno.

Ovaj pronalazak se dalje odnosi na metodu lečenja i/ili prevencije ateroskleroze uključuje davanje ekspresivnog vektora koji uključuje sekvencu inhibitora IL-18 domaćinu kome je to potrebno.

U preporučenom obliku ovog pronalaska, vektor ekspresije se daje sistemski, i po mogućstvu u vidu intramuskularne injekcije.

Ovaj proizvod se dalje odnosi na korišćenje IL-18 kao dijagnostičkog markera za lošu kliničku prognozu kod srčane insuficijencije. Loša klinička prognoza obuhvata svako pogoršanje stanja pacijenta, kao rekurentni napad, ili čak smrt, po prvom infarktu miokarda.

Preporučuje se da se IL-18 koristi kao dijagnostički marker rekurentih napada po prvoj srčanoj insuficijenciji. U rekurentne događaje spadaju sledeći: smrt, rekurentna ishemija, re-vaskularizacija, progresija ateroskleroze ili ponovna hospitalizacija zbog srčane insuficijencije, i drugi.

Pošto smo opisali pronalazak, lakše ćemo ga razumeti pozivom na sledeće primere koji su dati u cilju ilustracije, a ne ograničavanja ovog pronalaska.

PRIMER1

Materijal i metode

Uzorci

Prikupljeno je četrdeset jedan humanih aterosklerotskih plakova dobijenih od 36 bolesnika podvrgnutih karotidnoj enđarterektomiji. Kao kontrola služile su 2 karotidne i 3 interne mamarne arterije bez ateroskleroze (2 sa minimalnim fibromuskularnim zadebljanjem) koje su dobijene ili autopsijski ili tokom operacije koronarnog bajpasa. One su odmah uronjene u tečni azot i čuvane na -80°C. Plakovi koji su korišćeni za ekstrakciju proteina i DNK odmah su oprani, uronjeni u tečni azot i čuvani na -80°C. Za imunohistohemijska ispitivanja, plakovi su 2 sata čuvani u svežem 4% para- formaldehidu, a zatim preneti u 30% rastvor saharoze-PBS pre brzog zamrzavanja na optimalnu temperaturu za sekciju tkiva u medijumu za obradu (O.C.T. Compound, Miles Ine, Diagnostics Division) s tečnim azotom i čiuvani na -80°C for za kriostatske preseke. Za svaki uzorak dobijeno je po nekoliko preseka debljine 8- to 10-μm za histološku analizu i imunohistohemijska ispitivanja.

Klasifikacija pacijenata

Da bi se ispitao potencijalni odnos između ekspresije IL-18/IL-18BP i znakova nestabilnosti plaka, prospektivno i slepo smo prikupljali kliničke podatke od 23 uzastopna pacijenta (od 36) koji su podvrgnuti endarterektomiju u periodu između maja i avgusta 2000. Prisustvo ili odsustvo ulkusa na plaku na makroskopskom pregledu sistematski je beležio hirurg koji je obavljao samu endarterektomiju. Ovo nam je omogućilo da plakove klasifikujemo kao ulcerisane i ne-ulcerisane. Uz to, pacijenti su klasifikovani u dve posbne grupoe po svojim simptomima. Oni koji su e pojavili sa kliničkim simptomima cerebralnoj ishemijskog napada vezanog za karotidnu stenozu klasifikovani su kao simptomatski. Endarterektomija je urađena 2-66 dana (17.6 + 5.3 dana) po prvoj pojavi kliničkih simptoma kod tih bolesnika. Pacijenti koji nikada nisu imali simptome cerebralne ishemije na teritoriji karotidne arterije klasifikovani su kao asimptomatski. Asimptomatska karotidna stenoza je otkrivena na bazi sistematskog kliničkog pregleda pacijenata s koronarnom ili perifernom bolešću, a težina je određena korišćenjem ponovljene Doppler ehografije od strane iskusnog pouzdanog ehografiste. lako asimptomatski bolesnici nikada nisu imali ishemičnu epizodu na teritoriji karotine stenoze, karotidna endarterektomija se pokazala korisnom kod ovih bolesnika što je pokazala studija asimptomatske karotidne ateroskleroze (ACAS) (28).

Analiza Western Blot

Proteini su ekstrahovani iz 12 aterosklerotskih plakova i 5 kontrolnih normalnih arterija. Zamrznuti uzorci su pulverizovani u tečnom azotu. Prah je ponovo suspendovan u ledenom puferu za liziranje [20 mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 5 mmol/L EGTA. 150 mmol/L NaCl, 20 mmol/L glicerofosfate, 10 mmol/L NaF, 1 mmol/L natrijum ortovanadat, 1% Triton X-100, 0.1% Tween 20, 1 pg/mL aprotinin, 1 mmol/L PMSF. 0.5 mmol/L N-tosil-L-fenilalanin hlorometil keton (TPCK), 0.5 mmol/L N(a)-p-tosil-L-lizin hlorometil keton (TLCK)] u odnosu od 0.3 rnL/10 mg mokre težine. Ekstrakti su inkubirani na ledu 15 minuta a onda su centrifugirani (12 000 g, 15 minuta, 4°C). Frakcije supernatanta rastvorljive u deterdžentu su zadržane, a koncentracije proteina u uzorcima su ujednačene korišćenjem Bio-Rad protein eseja.

Da bi se uradili Western blot analize na IL-18 i 1L-18R, ekstrakti proteina su kuvani 5 minuta u stavljani na 7.5% ili 15% SDS-poliakrilamid gel. Za IL-18BP. rhlL- 18 prečišćen iz E.Coli (Serono Pharmaceutical Research Institute, Geneva) kupliran je sa Affligel 15 (Biorad) nalmg/ml smole u skladu sa protokolom proizvođača. Ekstrakt proteina (60 pg) inkubiran je preko noći na 4°C na roleru sa 20 pl smole podešeno na 500 pl PBS 0.05% Tween. Da bi se uklonilo svako nespecifično vezivanje, smola je centrifugirana i oprana salO mM Tris pH 8. 140 mM NaCl, 0.5% Triton-X-100 (Fluka), 0.5% deoksiholata, a zatim sa 50 mM Tris pH 8, 200 mM NaCl, 0.05% TX100. 0.05% nonidet P40 (Fluka). 2 mM CHAPS (Boehringer, Mannheim) i potom je poslednji put prana sa 50 niM Tris pH 8. Smola je potom centrifugirana, ponovo suspendovana u puferu uzorka u redukovanim uslovima, kuvana 5 minuta i konačno postavljana na 10% SDS-poliakrilamid NuPAGE gel (Invitrogen).

Uzorci su elektroforetski preneseni sa poliakrilamid gela na nitrocelulozu. Nitrocelulozne membrane su saturisane 2 sata na sobnoj temperaturi TBST [50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5), 250 mmol/L NaCl, i 0.1% Tween slani rastvor] sa sadržajem 5% obranog suvog mleka. Membrane su onda inkubirane kozjim anti-humanim IL-18 i IL- 18R (a-lanac) poliklonskim antitelima (1 pg/ml) (R & D Systems), mišjim anti-humanim IL-18 BP monoklonskim antitelom (Mab 657.27 na 5 μg/ml) (Corbaz i sar., 2000, rukopis podnet), zečjim anti-humanim kaspaze-1 poliklonskim antitelom (1 μg/ml) (A- 19, Santa Cruz). Specifičnost Mab 657.27 analizirana je na trakama membrana kompeticijom korišćenjem 200 x molarni višak rhIL-18BP-6his (prečišćen iz ćelija jajnika kineskog hrčka, Serono Pharmaceutical Research Institute) koji se inkubira zajedno sa Mab 657.27 na 5 μg/ml tokom 1 h. Po inkubaciji sa HRP konjugovanim odgovarajućim antitelima, substrati hetniluminescencije (ECL, Western blotting; Amersham Corp) su korišćeni da se otkriju pozitivne trake u skladu sa uputstvima proizvođača, a trake su vizualizovane po izlaganju Hyperfilm ECL (Amersham Corp).

Imunohistohemija

Zamrznute sekcije 6 aterosklerotskih plakova inkubirane su sa 1:10 normalnim konjskim serumom ili 1:10 normalnim kozjim serumom 30 minuta na sobnoj temperaturi, oprane jednom u PBS, onda inkubirani bilo primarnim mišjim monoklonskim antitelom protiv CD68 za identifikaciju makrofaga (DAKO-CD68, KP1), ili primarnim mišjim monoklonskim antitelom protiv α-aktina humanog glatkog mišića (1A4, DAKO) za identifikaciju ćelija glatkih mišića. Za identifikaciju receptora IL-18 i IL-18 u aterosklerotskim plakovima, specifična kozja poliklonska antitela (R & D Systems) su korišćena u razblaženju od 5 μg/mL. IL-18 BP su detektovana korišćenjem specifičnih monoklonskih antitela protiv rekombinantnog humanog IL-18BP izoforma a (H20) (Corbaz i sar., 2000 rukopis podnet). Po pranju u PBS, pločice su inkubirane sledećim sekundarnim biotiniliranim antitelima: biotinilirani konjski anti-miš IgG (Vector Laboratories, Ine) u razblaženju od 1:200 za detekciju mrlja sa antitelima protiv CD68, a-actina glatkih mišića i IL-18 BP, kao i biotinilirani konjski anti-kozji IgG (Vector) u razblaženju od 1:200 za detekciju anti-IL-18 i anti-IL-18 receptorskih antitela.

Imuno-mrlje su vizualizovane korišćenjem avidin-biotin HRP sistema vizualizacije (Vectastain ABC kit PK-6100 Vector). Za negativne kontrole, okolne sekcije su prebojavane izotip-usklađenim irelevantnim antitelima umesto primarnim antitelima.

Priprema RNK

Ukupna RNK je ekstrahovana iz 29 aterosklerotskih plakova u kiselom guanidium tiocijanat rastvoru i ekstrahovana fenolom i hloroformom korišćenjem metode Chomczynski i Sacchi (29). Prečišćena RNK je rastvorena u vodi, a koncentracija je merena apsorbancom na 260 nm. Integritet RNK procenjen je elektroforezom na 1% agarosa gelu. cDNK je sintetizovana iz 1 pig ukupne RNK korišćenjem Promega sistema reverzne transkripcije u skladu sa protokolom proizvođača.

Polikvantitativna i Real-time PCR humanog IL-18 i IL-18BP u humanim aterosklerotskim plakovima.

Polukvantitativne reakcije PCR obavljane su u ukupnoj zapremini od 50 pl prisustvu 1U AmpliTaq DNK Polimerase (Perkin Elmer, Roche. U.S.A), 2.5 mM dNTPs (Amersham, U.S.A), i 50 pmoles ushodnih i reverznih PCR prajmera. Reakcije su inkubirane u PTC-200 Peltier Effect Thermal Cycler (MJ Research, U.S.A) u sledećim uslovima: denaturacija 1 min na 94°C, kaljenje 1 min na 55°C i ekstenzija 1 min na 72°C. Da bi se obezbedilo poređenje količine PCR proizvoda tokom linearne faze PCR reakcije, IL-18BP, IL-18 i (3-aktin su analizovani posle 25, 28 i 31 ciklusa. Određivanje optimalni broj ciklusa za IL-18BP, IL-18 i (3-aktin pre saturacije traka (31, 28 i 25, u istom redosledu). PCR prajmeri su određeni na bazi objavljenih sekvenci (AF 110799, D49950, X00351) na sledeći način: IL-18, reveryni 5’-GCGTCACTACACTCAGCTAA- 3’; ushodni 5’-GCCTAGAGGTATGGCTGTAA-3’; IL18BP. ushodni 5’-

ACCTGTCTACCTGGAGTGAA-3’; reverzni 5 ’ -GCACGAAGATAGGAAGTCTG-3 ’; p-aktin, reverzni 5’-GGAGGAGCAATGATCTTGATCTTC-3'; ushodni 5’-

GCTCACCATGGATGATGATATCGC-3’. Da se isključi amplifikacija potencijalno genomske DNK koja bi kontaminirala uzorke, PCR reakcije su rađene uz odsustvu cDNK templata. PCR proizvodi (lOpl) su analizirani na 1% agarosa gelu i podvrgnuti elektroforei u lx TAE puferu. Veličina PCR proizvoda verifikovana je poređenjem sa markerima od 1 kb ladder (Gibco) po prebojavanju gelova. Relativna kvantifikacija traka prebojenih etidijum-bromidom rađena je pod UV svetlom Kodak Digital Sciences analitičkog softvera, i beležena je kao koeficijent ciljnog gena (hIL-18BP, hIL-18) i liousekeeping gena (gena koji je svuda prisutan) (hβ-actin).

SYBR Green Real Time PCR prajemri za IL-18, IL-18BP i GAPDH (house- keeping kontrola) određeni su korišćenjem the Primer Express softvera koji proizvodi PE Biosystems u skladu sa objavljenim sekvencama (AF110799, D49950, NM 002046) na sledeći način: IL-18, reveryni 5-CAGCCGCTTTAGCAGCCA-3’; ushodni 5’- CAAGGAATTGTCTCCCAGTGC-3’; IL18BP, reverzni 5'-

AACCAGGCTTGAGCGTTCC-3’; forward 5 ’ -TCCCATGTCTCTGCTCATTTAGTC- 3’; GAPDH, reverzni 5'-GATGGGATTTCCATTGATGACA-3’; forward 5’- CCACCCATGGCAAATTCC-3’; intron-GAPDH. reverzni 5’-

CCTAGTCCCAGGGCTTTGATT-3’; ushodni 5’CTGTGCTCCCACTCCTGATTTC- 3’. Testirani su specifičnost i optimalna koncentracija prajmera. Potencijalna genomska DNK kontaminacija isključena je obavljanjem PCR reakcija sa specifičnim intron- GAPDH prajmerima. Odsustvo ne -specifične amplifikacije potvrđeno je analizom PCR proizvoda elektroforezom na 3.5% agarosa gelu. SYBR Green Real-Time PCR je rađen sa 5 pl / udubljenju RT-proizvoda (0.5 ng ukupne RNK), 25 μl / udubljenju SYBR Green PCR master mix (PE Biosystem, CA, USA) sa AmpErase Uracil N-Glycosylase (UNG) (0.5 Jedinica / udubljenju) i 20 μl prajmera (300 nM). PCR je rađen na 50°C tokom 2 min (za inkubaciju AmpErase UNG ukloniti sav uracil inkorporisan u cDNK), 95°C tokom 10 min (za aktivaciju AmpliTaq Gold) z zatim raditi 40 ciklusa na 95°C tokom 15 sec, 60°C tokom 1 min na ABI PRISM 7700 Detection System. Uzorci reverzne-transkribovane cDNK su tako amplifikovani a određene su vrednosti njihovih Ct (pragovi ciklusa). Sve vrednosti Ct su normalizovane za liousekeeping gen GAPDH. Pojedinačna specifična traka DNK za IL-18, IL-18BP i GAPDH je posmatrana korišćenjem gel elektroforeze.

The principle detekcije u realnom vremenu korišćenjem “SYBR Green PCR master mix” zasniva se na direktnoj detekciji PCR proizvoda merenjem povećanja fluorescencije izazvane vezivanjem SYBR zelene boje za DNK sa dvostrukim lancem.

Statistička analiza

Podaci su izraženi kao srednja vrednost + SEM. Nivoi IL-18 upoređeni su između grupa korišćenjem Mann-Whitney testa. Vrednost p 0.05 smatrala se statistički signifikantnom.

Primer 1: Zaštita inhibitora IL-18 od smrti endotelijalnih ćelija izazvane

oksidizovanim lipoproteinima (oxLDL)

Endotelijalne ćelije humane umbilikalne vene u kulturi (HUVECs) izlagane su tokom 16 sati oxLDL u prisustvu ili odsustvu IL-18 vezujućeg proteina ili anti-IL-18 antitela. Kako je prikazano na SI. 1, 83% HUVECs sušenim posle izlaganja oxLDL. Ko- inkubacija sa IL-18BP ili anti-IL-18 antitelom skoro potpuno spašava ćelije od smrti. Kada je korišćen IL-18BP nije bilo ćelijske smrti. 89% ćelija preživelo je korišćenjem anti-IL-18 antitela.

Ovaj eksperiment pokazuje protektivno dejstvo dva različita inhibitora IL-18 protiv ćelijske smrti zbog apoptoze u aterosklerotskom plaku.

Primer 2: Ekspresija proteina IL-18 i njegovog endogenog inhibitora IL-18

BP u aterosklerotskim plakovima

Analize Western blot rađene su na proteinskim ekstraktima 12 karotidnih aterosklerotskih arterija i 5 normalnih kontrola. Protein IL-18, uključujući i aktivnu formu, bio je visoko eksprimiran u svim aterosklerotskim plakovima dopk je malo ili nimalo ekspresije detektovano u normalnim arterijama (SI. 2). Linije 1 do 4 sadrže uzorke aterosklerotskih plakova, linije 5 do 7 sadrže uzorke normalnih arterija. Interesantno je da je detekcija aktivne forme IL-18 u korelaciji s aktivnom formom kaspaze-1, koja je uključena u procesovanje IL-18 (SI. 2 četvrti red). Signifikantna ekspresija IL-18 receptorskog proteina (α lanac) otkrivena je u aterosklerotskim plakovima u poređenju sa veoma niskim nivoima ekspresije u normalnim arterijama (SI. 2 drugi red). Uz to, većina aterosklerotskih plakova eksprimira IL-18BP iako su nivoi ove ekspresije heterogeni (SI. 2 prvi red).

Primer 3: Celijska lokalizacija proteina IL-18 i njegovog endogenog

inhibitora IL-18BP u aterosklerotskim plakovima

Da bi se odredila ćelijska lokalizacija IL-18 i IL-18BP, imunohistohemijska ispitivanja urađena su na 6 karotidnih aterosklerotskih plakova. Kao stoje ilustrovano na Slici 2, IL-18 je uglavnom eksprimiran u makrofagima, a te ćelije su verovatno glavni izvor IL-18 u plaku (nije prikazano). Ova polja su bogata i CD3-pozitivnim limfocitima. međutim, T limfociti izgleda nisu direktno uključeni u produkciju IL-18. IL-18 je takođe eksprimiran i u nekim ćelijama intime glatkih mišića i ponekoj endotelijalnoj ćeliji. Za razliku od toga, značajna ekspresija IL-18BP otkrivena je u endotelijalnim ćelijama plakova mikro krvnih sudova i u onima na luminalnoj površini, iako ekspresija nije nađena u svim krvnim sudovima. Relativno niska i heterogenija ekspresija IL-18 BP otkrivena je, uglavnom ekstracelularno u oblastima bogatim makrofagima.

Primer 4: Ekspresija IL-18 i IL-18BP mRNK transkripta u aterosklerotskim

plakovima i odnos sa nestabilnošću plaka

Da bi se utvrdilo da li se humani IL-18 i IL-18BP mRNK eksprimiraju u humanim karotidnim aterosklerotskim plakovima, urađen je polu-kvantitativni RT-PCR na šest aterosklerotskih plakova (SI. 3). IL-18 i 1L-18BP mRNK su deteklovani u svim aterosklerotskim plakovima iako je količina mRNK za IL-18 i IL-18BP bila heterogena. Prema tome, da bismo tačno kvantifikovali nivoe ekspresije IL-18 i IL-18BP mRNK. 23 aterosklerotskih plakova je analizovano dodatno uz pomoć metode SYBR Green Real- Time PCR (SI. 4). Ovi plakovi su karakterisani kliničkim i patološkim pregledom kao simptomatski (nestabilni) ili asimptomatski (stabilni) plakovi sa sadržajem makroskopskog ulkusa ili bez njega. Kliničke karakteristike ovih pacijenata prikazane su na Tabeli 4. Procenat smanjenja prečnika karotide (60%-95%) i faktori rizika uključujući godine starosti, dijabetes, hiperholesterolemiju, hipertenziju, i pušenje cigareta nije se razlikovalo između ovih grupa.

'Kod ovih pacijenata registrovan je prolazni ili pcrzistcntni ishemični cerebralni napad 2-66 dana pre endarterektomije.

"Broj pacijenata s kliničkom hipertenzijom koji se lece antihipertenzivima.

'Broj pacijenata s kliničkom hiperholesterolemijom koji se leče lekovima za snižavanje lipida .

Utvrđeno je da je količina IL-18 ushodno regulisana kod simptomatskih u poređenju sa asimptomatskim aterosklerotskim plakovima (2.03 ± 0.5 prema 0.67 ± 0.17) (SI. 4A). Statistička analiza je pokazala da je ovo povećanje produkcije IL-18 koje je zabeleženo kod simptomatskih plakova visoko signifikantno (p < 0.0074), dok povećana količina IL-18BP koja je zabeležena kod simptomatskih u poređenju sa asimptomatskim plakovima nije (4.64 + 0.98 prema 2.5 + 0.92) (SI. 4B). Drugim rečima, iako su i simptomatska i asimptomatska grupa pokazale pozitivnu korelaciju između IL-18 i IL- 18BP mRNK, ovi nagibi su se signifikantno razlikovali između ove dve grupe 2 (simptomatska grupa: nagib 1.16 [0.19-2.14], r2 = 0.36 prema asimptomatskoj grupi: nagib 4.79 [2.39-7.20], r2 = 0.76; p < 0.05). Prema tome, izgleda da povećana ekspresija IL-18BP u simptomatskoj grupi nije dovoljna da kompenzuje ekspresije IL-18. Štaviše, kako je prisustvo ulceracije smatrano osobinom nestabilnosti plaka, statistička analiza je urađena dodatno na plakovima bez ulkusa ili sa ulkusima unutar plakova i pokazana je signifikantna ushodna regulacija IL-18 u plakovima koji su imali ulkus (p < 0.018) (SI. 4C).

Ovi podaci pokazuju da je povećanje ekspresije IL-18 koje se vidi u aterosklerotskim plakovima u korelaciji sa nestabilnošću plaka.

Primer 5: IL-18BP modulira razvoj aterosklerotskih lezija i stabilnost na in vivo modelu bolesti

Metode

Osobine pacijenata

Uzorci plazme dobijeni su od pacijenata s akutnim ishemičnim koronarnim sindromima (nestabilna angina pektoris i infarkt miokarda), manje od 7 dana po pojavi simptoma. Nestabilna angina definisana je kao povezanost tipičnog bola u grudima sa bilo ishemičnim promenama na elektrokardiogramu ili prisustvo koronarne arterijske bolesti. Infarkt miokarda dijagnostikovan je na osnovu tipičnih ishemijskih promena na elektrokardiogramu koje su praćene značajnim povećanjem miokardijalnih enzima (kreatin fosphokinaza i troponin I) u krvi u cirkulaciji. Neishemični bolesnici regrutovani su na istom odeljenju za kardiologiju i bili su potpuno bez simptoma ishemije. Nivoi humanog IL-18 u plazmi određivani su korišćenjem komercijalnih kitova (MBL, Japan).

ln vivo intramuskularni elektrotransfer mišjeg IL-18BP ekspresionog plazmida Četrnaest mužjaka miševa C57BL/6 apoE KO, starosti 14-nedelja, primili su u intervalima od 3 nedelje, 3 injekcije sa IL-18BP ekspresionim plasmidom, pcDNK3- IL18BP. Kontrolnim miševima (n = 19) ubrizgan je kontrolni prazni plazmid. Mišji IL- 1 8BP izoform d cDNK izolovan kako je opisano (broj # Q9ZOM9) (23) subkloniran je u EcoRl/Notl mesta sisarskog ćelijskog ekspresionog vektora pcDNK3 koji je pod kontrolom promotora citomegalovirusa (Invitrogen). Ovaj konstrukt, nazvan 334.yh, prikazan je na SI. 5. Kontrolni plazmid bio je slični konstrukt bez terapijske cDNK. IL- 18BP ili kontrolni ekspresioni plazmid (60 μg) ubrizgavani su u oba tibijalna kranijalna mišića anestetiziranih miševa, kako je prethodno opisano (13). Ukratko, transkutani električni pulsevi (8 kvadratnih talasa električnih pulseva od 200 V/cm, 20 msec trajanja na 2 Hz) davani su preko PS-15 elektropulsatora (Genetronics, France) korišćenjem dve pločaste elektrode od nerđajućeg čelika koje su postavljane sa razmakom 4.2 do 5.3 mm, na svaku stranu noge.

Elisa mIL-18BP

Ove ploče su preko noći oblagane prečišćenim zečjim poliklonskim antitelom r- mlL-koja imaju afinitet za 18BPd(5 μg/udubljenju). Rastvorljive mIL-18BP je otkriven korišćenjem biotiniliranim zečjeg poliklonskog antitela (0.3 μg/ml) koje je dobijeno protiv E. coli r-mIL-18BP (Peprotec) a potom se koristila ekstravidin peroksidaza (1/1000) (Sigma). Ovako dobijeno zečje poliklonsko antitelo testirano je Western Blot metodom da se potvrdi specifičnost mlL-18BP. Rekombinantno mIL-18BPd proizvedeno od strane HEK 293 ćelija korišćeno je kao standard. Osetljivost ELISA testa iznosila je 5 ng/ml.

Analiza miševa

Kriostatski preseci (8 pm) dobijeni su iz aortnog sinusa i korišćeni su za detekciju depozita lipida korišćenjem Uljano crvenog, za detekciju kolagena korišćenjem Sirius crvenog i za imunohistohemijsku analizu kako je prethodno opisano (13). Ovi preseci su bojeni specifičnim primarnim antitelima: anti-miš makrofag, klon MOMA2 (BioSource), fosfataze alkalno-konjugovani anti-a-aktin za ćelije glatkih mišića i anti-CD3 za T limfocite (Dako) kako je prethodno opisano (13). Detekcija ćelijske smrti obavljana je korišćenjem tehnike TUNEL (13). CD3 pozitivne su mikroskopski bojene na slepi način. Aterosklerotski plakovi u aortnom sinusu i oblastima koje su bojene pozitivno na makrofage, ćelijama glatkih mišića, kolagenu ili TUNEL mereni su kvantifikacijom slike uz pomoć kompjutera (NS 15000, Microvision) kako je prethodno opisano (13). Bojenje ne-imuno izotip-usklađenim imunoglobulinima procenilo je specifičnost imunološkog prebojavanja. Specifičnost TUNEL procenjena je uz pomoć deoksinukleotidil transferaze. Torakalne aorte, koje se šire od leve subklavijalne arterije do bubrežnih arterija, fiksirane su u 10% puferovanom formalinu i bojene Uljano crvenim da se otkriju lipidni depoziti. Otvoreni su longitudinalno a procenat lipidnih naslaga izračunat je (NS 15000, Microvision).

t

Rezultati

U ovoj studiji je testirana hipoteza da regulacija IL-18/IL-18BP igra ključnu ulogu u aterogenezi i stabilnosti plaka. Mereni su nivoi IL-18 u plazmi pacijenata s akutnim koronarnim sindromima (30 muškaraca, 18 žena, srednja starost 66.2 ± 1.8 godina, od kojih je 14 imalo nestabilnu anginu pektoris, a 34 infarkt miokarda) i neishemičnih

kontrolnih pacijenata (10 muškaraca, 3 žena, srednja starost 60.0 + 5.2 godina). Nivoi IL-

18 u plazmi pacijenata a akutnom koronarnom bolešću bili su značajno veći nego kod kontrolnih (146.9 ±17.1 prema 73.0 ± 12.2 pg/ml, p < 0.05) za razliku od nivoa 1L-18BP u cirkulaciji koji su bili blago povišeni (20.1 ± 2.7 prema 7.5 ± 2.5 ng/ml, p = 0.06). Uz to, nivoi IL-18 bili su u korelaciji sa težinom bolesti jer su najviši nivoi zabeleženi kod pacijenata sa težom ishemičnom srčanom disfunkcijom i kliničkim znacima plućnog edema (224.03 ± 39.1 pg/ml, p < 0.001 u poređenju s kontrolom). Ovi rezultati dobijeni od pacijenata s akutnom koronarnom bolešću zajedno s prethodnim opažanjima da je nivo IL-18 povišen u aterosklerotskim plakovima kod pacijenata sa moždanim udarom [Mallat, 2001], govori o potencijalno važnoj ulozi regulacije IL-18/IL-18BP u procesu ateroskleroze.

Prema tome, ovu hipotezu smo proveravali korišćenjem apoE nokaut (KO) miševa koji su spontano razvili aterosklerotske lezije slične humanim. Četrnaest mužjaka miša starih 14 nedelja primilo je suplement IL-18BP in vivo intramuskularnim elektrotransferom ekspresionog plazmida DNK koji nekodira za mišji IL-18BPd, dok je

19 kontrola iste starosti primilo prazni plazmid. Elektrotransfer plazmida ponavljan je svake 3 nedelje, a miševi su žrtvovani u uzrastu od 23 nedelje po 9 nedelja tretmana. Nivoi mišjeg 1L-18BP u plazmi bili su ispod granica detekcije (5 ng/ml) kod apoE KO miševa kojima je ubrizgavan prazan plazmid. Međutim, pojedinačna injekcija IL-18BP plazmida rezultirala je u visokim nivoima IL-18BP u krvi gde je maksimum dostizan 2 dana po injekciji (323.5 ± 100.9 ng/ml) i 127.4 ± 35.4 ng/ml je izmereno posle 2 nedelje. Posle devet nedelja tretmana bilo IL-18BP bilo praznom plazmidom, ukupni holesterol (489.4 ± 34.6 prema 480.8 ± 36.3 mg/dl) i nivoi lipoproteina visoke gustine u serumu (52.3 ± 9.4 prema 48.8 ± 5.1 mg/dl) nisu se razlikovali između ove dve grupe. Umereni, ali značajan porast težine životinja zabeležen je kod grupe tretirane IL-18BP u poređenju s kontrolnom (31.8 ± 0.9 prema 28.6 ± 0.8 g, p < 0.05).

Ishod dodavanja IL-18BP na aterosklerozu ispitivan je na dve različite lokacije: u descendentoj torakalnoj aorti i u aortnom sinusu. Torakalna aorta je odabrana za određivanje uloge IL-18BP u razvoju masnih traka (aterogeneza) jer torakalne aterosklerotske lezije skoro ne postoje na uzrastu od 14 nedelja (podaci nisu prikazani) gde je počela transfekcija IL-18BP. Aortni sinus, gde su aterosklerotske lezije već prisutne na uzrastu od 14 nedelja (podaci nisu prikazani), ispitivani su na uznapredovalu progresiju plaka i njegov sastav, što je važna odrednica stabilnosti plaka. Tretman miševa apoE KO sa IL-18BP značajno je uticao na razvoj aterosklerotskih lezija i njihovu progresiju. Ispitivanje torakalne aorte pokazalo je značajno smanjenje depozita masti kod miševa tretiranih IL-18BP plazmidom u poređenju s praznim plazmidom (SI. 6). Kvantitativna analiza slike uz pomoć kompjutera pokazala je 69% smanjenja obima aterosklerotskih lezija (p < 0.0001) (SI. 6), čime se ukazuje na kritičnu permisivnu ulogu IL-18 u aterogenezi. Uz to, tretman plazmidom IL-18BP tokom samo 9 nedelja značajno umanjuje progresiju uznapredovalih aterosklerotskih plakova u aortnom sinusu (24% smanjenje veličine plaka, p = 0.01) u poređenju s tretmanom praznim plazmidom (SI. 7).

Sto je još važnije, sastav uznapredovalih lezija, što je glavna odrednica nestabilnosti plaka, značajno je pogođena tretmanom IL-18BP. Aterosklerotske lezije miševa tretiranih plazmidom IL-18BP pokazale su veoma značajno smanjenje infiltracije makrofaga od 50% (p < 0.0001) (SI. 8), gde je sadržaj T limfocita bio manji za 67% (p < 0.005) (SI. 8), a pokazano je dvostruko povećanje akumulacije u glatkim mišićnim ćelijama (p < 0.05) (SI. 9). Uz to, ove važne promene u ćelijskom sastavu lezija bile su praćene značajnim povećanjem sadržaja kolagena od 85% (p < 0.0005) što je određeno bojenjem Sirius crvenim, kao i smanjenjem ukupnog sadržaja masti.

Prema tome, tretman IL-18BP značajno smanjuje zapaljenski proces u aterosklerotskim lezijama i indukuje proces zalečenja koji odlikuje stabilne aterosklerotske plakove. Staviše, značajno smanjenje inflamatorne komponente lezija kod miševa tretiranih IL-18BP praćeno je značajnim smanjenjem pojave ćelijske smrti u plakovima (2.9 ± 0.9%- kod miševa tretiranih IL-18BP prema 10.5 ± 3.6% kod kontrolnih, p < 0.05), i na taj način se ograničava ekspanzija i trombogenost acelularne lipidne srži [Mallat, 1999],

Zaključci:

Korišćenjem dobro validiranog mišjeg modela ateroskleroze slične humanoj, dobijeni su rezultati koji jasno utvrđuju nesumnjivu i ključnu ulogu IL-18 i IL-18BP regulacije u razvoju aterosklerotskih plakova, njihovoj progresiji i stabilnosti. Dok se sprečava rano formiranje lezija u torakalnoj aorti, inhibicija aktivnosti IL-18 uz pomoć dodavanja IL-18BP takođe značajno utiče na sastav uznapredovalih lezija u aortnom sinusu, i na taj način indukuje prelazak ka stabilnom fenotipu plaka.

Klinička prognoza pacijenata s aterosklerozom zavisi samo delimično od veličine lezije. Sada je široko prepoznato da kvalitet (sastav plaka), a ne veličina lezije može da bude još bolji prediktor pojave ishemičnog događaja. I stvarno, teške kliničke manifestacije ateroskleroze (infarkti srca i mozga) uglavnom su posledica okluzije krvnih sudova zbog tromba koji se stvorio zbog rupture aterosklerotskog plaka (19). Patološke studije su pokazale da vulnerabilni ili nestabilni plakovi, koji su skloni rupturi ili su već erodirali, sadrže puno zapaljenskih ćelija i ispoljavaju značajan gubitak glatkih mišićnih ćelija (20, 21). Štaviše, ovakvi plakovi manifestuju značajni porast apoptotične smrti ćelija koja dovodi do formiranja visoko trombogenoe lipidne srži (13, 22). Vredi pomenuti i da su svi ovi znaci povećane nestabilnosti plaka značajno oslabljeni kod miševa tretiranih IL-18BP što govori da IL-18 signalizacija predstavlja glavnu odrednicu nestabilnosti plaka.

Relevantnost rezultata dobijenih kod miševa apoE KO za bolest ljudi ojačana je i našim nalazima povišenih nivoa IL-18 u cirkulaciji pacijenata s akutnim koronarnim sindromima, kao i povećanom produkcijom IL-18 u nestabilnim karotidnim aterosklerotskim plakovima odgovornim za šlog. Ovi nalazi skupa identifikuju inhibitor aktivnosti IL-18 kao novo terapeutsko sredstvo za sprečavanje i lečenje aterosklerotskih plakova, njihovog razvoja i ograničavanje komplikacija.

Primer 6: Povišeni nivoi IL-18 su u korelaciji sa rekurentnim zbivanjima u pacijenata sa srčanom insuficijencijom

Nivoi IL-18 mereni su ELISA tehnikom u krvnom serumu pacijenata uz pomoć IL-18 specifičnog antitela.

Ukupno je testirano 56 ishemičnih i neishemičnih bolesnika sa srčanom insuficijencijom ili bez nje.

Kod pacijenata koji su potom umrli, nivoi IL-18 su bili 216.0 + 41.5 pg/ml u poređenju sa 112.2 + 12.2 pg/ml kod pacijenata bez smrtnog ishoda (p = 0.0018).

Kod pacijenata sa ma kojim rekurentim događajem, kao što je smrtni ishod, rekurentna ishemija, re-vaskularizacija ili progresija ateroskleroze ili ponovna hospitalizacija izmereni su sledeći nivoi: 165.8 + 23.8 prema 107.7 + 14.6 kod pacijenata bez rekurentnih događaja (p=0.03).

Ovi rezultati pokazuju da su nivoi IL-18 značajno povišeni kod pacijenata koji imaju lošu kliničku prognozu, kao što je rekurentni događaj ili čak smrtni ishod.

Uzeti su uzorci krvi 16 neishemičnih pacijenata sa srčanom insuficijencijom ili bez nje, da bi se izmerili njihovi nivoi IL-18. Kod pacijenata koji su potom preminuli, nivoi su bili 199.0 +_34.8 pg/ml u poređenju sa 95.3 + 20.4 pg/ml kod pacijenata koji su preživeli (p=0.09).

Pacijenti sa ma kojim rekurentnim događajem: 146.6 + 34.4 pg/ml IL-18 prema 95.4 + 23.9 pg/ml kod pacijenata bez rekurentnih događaja (p=0.03). Iako razlika u nivoima IL-18 nije dostigla nivo statističke značajnosti, zbog malog broja obrađenih bolesnika, može se uočiti jasan trend ka povišenim nivoima IL-18.

Kod ishemičnih bolesnika, nivoi IL-18 su bili 214.2 + 45.9 pg/ml kod onih koji su umrli, prema 118.4 + 12.8 pg/ml kod onih koji su preživeli (p=0.007).

162.8 + 24.7 pg/ml IL-18 izmereno je kod pacijenata koji su imali ma kakav rekurentni događaj u poređenju sa 116.2 + 16.0 kod onih bez takvih događaja.

LITERATURA

1. Ross R. Ateroskleroza-an inflammatory disease. N Engl J Med 1999;340:115-126.

2. van der Wal AC, Becker AE, van der Loos CM. Das PK. Site of intimal rupture or erosion of throrabosed coronary aterosklerotski plaques is characterized by an inflammatory process irrespective of the dominant plaque morphology. Circulation 1994;89:36-44.

3. Fuster V, Badimon L, Badimon JJ, Chesebro JH. The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes (1). N Engl J Med 1992;326:242-250.

4. Fuster V, Badimon L. Badimon JJ, Chesebro JH. The pathogenesis of coronary artery disease and the acute coronary syndromes (2). N Engl J Med 1992;326:310-318.

5. Lee RT, Libby P. The unstable atheroma. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997;17:1859-1867.

6. Ridker PM. Cushman M, Stampfer MJ, Tracy RP. Hennekens CH. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N Engl .1 Med 1997;336:973-979.

7. Libby P. Molecular bases of the acute coronary syndromes. Circulation 1995;91:2844-2850.

8. Nakamura, K. Okamura, H, Nagata, K i Tamura T ) 1989) Infect. Imun, 57, 590-595.

9. Yoshimoto T, Takeda, K, Tanaka, T. Ohkusu, K. Kashivvamura, S, Okamura. H, Akira, S and Nakanishi. K (1998). J. Imuno]. 161, 3400-3407.

10. Parnet. P, Garka, K E, Bonnert, T P. Dower, S K, and Sims, J E. (1996). J. Biol. Cliem. 271, 3967-3970.

I I. DiDonato, J A, Hayakawa, M. Rothwarf, D M, Zandi. E and Karin, M. (1997). Nature 388, 16514-16517.

12. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, and Rubinstein, M (1999). Imunity 10. 127-136.

13. Mallat Z. Hugel B. Ohan J. Leseche G, Freyssinet JM, Tedgui A. Shed membrane microparticles with procoagulant potential in human aterosklerotski plaques. A role for apoptosis in plaque thrombogenicity. Circulation 1999;99:348-353.

14. Trico! O, Mallat Z, Heymes C, Belmin J, Leseche G, Tedgui A. Relation Between Endothelial Cell Apoptosis and Blood Flow Direction in Human Aterosklerotski Plaque.Circulation 2000;in press.

15. Dimmeler S, Haendeler J, Galle J, Zeiher AM. Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis of human endothelial cells by activation of CPP32-like proteases. A mechanistic clue to the 'response to injury' hypothesis. Circulation 1997;95:1760-3.

16. Grantham, Science, Vol. 185, pp. 862-864 (1974).

17. Dimmeler S, Haendeler J, Galle J, Zeiher AM. Oxidized low-density lipoprotein induces apoptosis of human endothelial cells by activation of CPP32-like proteases. A mechanistic clue to the 'response to injury' hypothesis. Circulation 1997;95:1760-3.

18. Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D. Caillaud JM, Dellere P. Branellec D, Schwartz B, Scherman D. High efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96:4262-7.

19. Lee, R.T. & Libby, P. The unstable atheroma. Arterioscler Thromb Vasc BioI 17. 1859-1867 (1997).

20. Davies, M.J. The composition of coronary-artery plaques [editorial; comment]. N Engl J Med 336, 1312-1314 (1997).

21. Virmani, R., Kolodgie, F.D.. Burke, A.P., Farb, A. & Schvvartz. S.M. Lessons from sudden coronary death: a comprehensive morphological classification scheme for aterosklerotski lesions. Arterioscler Thromb Vasc Biol 20. 1262-1275. (2000).

22. Kolodgie, F.D. i sar. Localization of apoptotic makrofags at the site of plaque rupture in sudden coronary death [In Process Citation], Am J Patliol 157, 1259-1268 (2000).

23. Kim, S.H. i sar. Structural requirements of six naturally occurring izoforms of the IL- 18 binding protein to inhibit IL-18. Proc Natl Acad Sci USA 97. 1190-1195 (2000).

24-EHiott, M.J., Maini, R.N., Feldmann, M.. Long-Fox, A.. Charles, P., Bijl, H.. and Woody. J.N., 1994, Lancet 344. 1125-1127.

25. Knight DM. Trinh H, Le J, Siegel S. Shealy D. McDonough M. Scallon B. Moore MA, Vilcek J, Daddona P, i sar. Construction and initial characterization of a mouse- human chimeric anti-TNF antitelo.Mol Imunol 1993 Nov 30:16 1443-53

26. Tucci, A., James, H., Chicheportiche, R., Bonnefoy, J.Y., Dayer, J.M., and Zubler, R.H., 1992, J.Imuno], 148,2778-2784.

27. Engelmann, H., D. Novick. and D. Wallach. 1990. Two tumor necrosis factor- binding proteins purified from human urine. Evidence for imunological cross-reactivity with cell surface tumor necrosis factor receptors. J. Biol. Chem. 265:1531-1536.

28. Moore WS, Barnett HJ. Beebe HG. i sar. Guidelines for carotid endarterectomy. A multidisciplinary consensus statement from the Ad Hoc Committee. American Heart Association. Circulation 1995:91:566-79.

29. Chomczynski P. Sacchi N. Single-step method of RNK isolation by kiseline guanidium thiocyanate-phenol-chlorofonn extraction. Anal Biochem 1987;162:156-9.

Claims (48)

1.Korišćenje inhibitora IL-18, naznačeno time, za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze.

2.Korišćenje inhibitora IL-18, naznačeno t i m e, za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju tromboze aterosklerotskog plaka.

3.Korišćenje inhibitora IL-18, naznačeno t i m e, za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju ulkusa aterosklerotskog plaka.

4.Korišćenje inhibitora IL-18, naznačeno time, za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju destabilizacije aterosklerotskog plaka.

5.Korišćenje inhibitora IL-18, naznačeno t i m e, za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju ishemičnog sindroma usled destabilizacije plaka.

6.Korišćenje inhibitora IL-18, naznačeno time, za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju prskanja aterosklerotskog plaka.

7.Korišćenje inhibitora IL-18, naznačeno time, za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju rekurentih epizoda srčane insuficijencije.

8.Korišćenje u skladu sa zahtevom 7, naznačeno time, da je srčana insuficijencija ishemična.

9.Korišćenje u skladu sa zahtevom 7, naznačeno time, da srčana insuficijencija nije ishemična.

10.Korišćenje u skladu sa ma kojim zahtevom od 1 do 9, naznačeno t i m e, daje inhibitor IL-18 odabran iz grupe ICE-inhibitora, antitela protiv IL-18, antitela protiv ma koje od IL-18 receptorskih podjedinica, inhibitora IL-18 receptorskog signalnog puta, antagonista IL-18 koji su u kompeticiji sa IL-18 i blokiraju receptor IL- 18, i proteini koji vezuju IL-18, izoformi, muteini, fuzirani proteini, funkcionalni derivati, aktivne frakcije ili njihovi cirkulatorno permutovani derivati.

11.Korišćenje u skladu sa zahtevom 10, n a z n a č e n o time, da je inhibitor IL-18 antitelo protiv IL-18.

12.Korišćenje u skladu sa zahtevom 11,naznačeno time, da je ovo antitelo jedno humanizovano antitelo

13.Korišćenje u skladu sa zahtevom 11, naznačeno time, da je ovo antitelo jedno humano antitelo.

14.Korišćenje u skladu sa zahtevom 10, naznačeno time, da je inhibitor dejstva IL-18 IL-18BP, ili izoform, mutein, derivat ili fragment.

15.Korišćenje u skladu sa ma kojim zahtevom od 10 do 14, naznačeno time, gde je protein za vezivanje IL-18 PEGiliran.

16.Korišćenje u skladu sa ma kojim zahtevom od 10 do 15, naznačeno time da je inhibitor IL-18 jedan fuzirani protein koji obuhvata IL-18 vezujući potein koji se fuzira za sve ili za deo imunolgonbulina, i gde se taj fuzirani protein vezuje IL-18.

17.Korišćenje u skladu sa zahtevom 16, naznačeno time, da fuzirani protein ceo ili deo konstantnog regiona jednog imunoglobulina.

18.Korišćenje u skladu sa zahtevom 17, n a z n a č e n o time, da je taj imunoglobulin izotipa IgGl ih IgG2.

19.Korišćenje u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno time, da ovaj medikament dalje obuhvata interferon za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

20.Korišćenje u skladu sa zahtevom 19, naznačeno time, da ovaj interferon bude interferon-β.

21.Korišćenje u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno t i m e, da ovaj medikament dalje obuhvata antagonist faktora tumorske nekroze (TNF) za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

22.Korišćenje u skladu sa zahtevom 21,naznačeno time, da ovaj antagonist bude TNF TBPI i/ili TBPII.

23.Korišćenje u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno time, da ovaj medikament dalje obuhvata COX-inhibitor za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

24.Korišćenje u skladu sa zahtevom 23, naznačeno time, da ovaj COX-inhibitor bude COX-2 inhibitor.

25.Korišćenje u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno time, da ovaj medikament dalje obuhvata jedan tromboksanski inhibitor, za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

26.Korišćenje u skladu sa zahtevom 25, naznačeno time, da ovaj tromboksanski inhibitor bude aspirin.

27.Korišćenje u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno time, da ovaj medikament dalje obuhvata jedan agens za snižavanje nivoa lipida, za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu upotrebu.

28.Korišćenje u skladu sa zahtevom 27, naznačeno time, da ovaj agens za snižavanje nivoa lipida bude inhibitor HMG CoA.

29.Korišćenje u skladu sa zahtevom 27, naznačeno time, da inhibitor HMG CoA bude statin.

30.Korišćenje u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno time, da se ovaj medikament koristi u kombinaciji sa dijetom siromašnom mastima i/ili holesterolom kao i /ili siromašnom solju.

31.Korišćenje u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno time, da se inhibitor IL-18 koristi u količini od oko 0.0001 do 10 mg/kg telesne težine ili oko 0.01 do 5 mg/kg telesne težine ili oko 0.1 do 3 mg/kg telesne težine ili oko 1 to 2 mg/kg telesne težine.

32.Korišćenje u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno t i m e, da se inhibitor IL-18 koristi u količini od oko 0.1 do 1000 pg/kg telesne težine ili oko 1 do 100 μg/kg telesne težine ili oko 10 do 50 μg/kg telesne težine.

33.Korišćenje u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno t i m e, da se inhibitor IL-18 daje supkutano.

34.Korišćenje u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom. naznačeno time, da se inhibitor IL-18 daje intramuskularno.

35.Korišćenje u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno time, da se inhibitor IL-18 daje svakodnevno.

36.Korišćenje u skladu sa ma kojim prethodnim zahtevom, naznačeno time, da se inhibitor IL-18 daje svaki drugi dan.

37.Korišćenje vektora ekspresije, naznačeno time, koji obuhvata sekvence kodiranja za inhibitor IL-18 za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze.

38.Korišćenje u skladu sa zahtevom 37, naznačeno time, da se ekspresioni vektor daje putem elektrotransfera.

39.Korišćenje u skladu sa zahtevom 37 ili 38, naznačeno time, da se ekspresioni vektor daje sistemski.

40.Korišćenje u skladu sa ma kojim od prethodnih zahteva, naznačeno time, da se ekspresioni vektor daje sistemski intramuskularno.

41.Korišćenje vektora, naznačeno time, za indukciju i/pojačanje endogene produkcije inhibitora IL-18 u ćeliji za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze.

42.Korišćenje ćelije, naznačeno time, koja je genetski modifikovana za proizvodnju inhibitora IL-18 za proizvodnju medikamenta za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze.

43.Metoda za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze, naznačena time, da obuhvata davanje efikasne inhibirajuće količine inhibitora IL-18 domaćinu kome je to potrebno.

44.Metoda za lečenje i/ili prevenciju ateroskleroze, naznačena time, da obuhvata davanje ekspresionog vektora koji obuhvata kodirajuću sekvencu inhibitora IL-18 domaćinu kome je to potrebno.

45.Metoda u skladu sa zahtevom 44, naznačena time, da se ovaj ekspresioni vektor daje sistemski.

46.Metoda u skladu sa zahtevom 44 ili 45, naznačena time, da se ovaj ekspresioni vektor daje intramuskulamom injekcijom.

47.Korišćenje IL-18, naznačeno time, kao dijagnostičkog markera loše kliničke prognoze kod srčane insuficijencije.

48. Korišćenje IL-18, naznačeno time, kao dijagnostičkog markera rekurentnih događaja posle prve epizode srčane insuficijencije .