PL216228B1 - Zastosowanie białka wiążącego IL-18 - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka wiążącego IL-18 (IL-18BP).

Niniejszy wynalazek dotyczy dziedziny patologii mózgu, a w szczególności dotyczy zastosowania inhibitora IL-18, IL-18BP, do leczenia uszkodzeniom ośrodkowego układu nerwowego (CNS), w szczególności urazowym uszkodzeniom mózgu.

W roku 1989 opisano aktywność surowicy, indukowaną endotoksyną pobudzającą interferon-γ (IFN-γ), uzyskaną z komórek mysiej śledziony (Nakamura i in., 1989). Ta aktywność surowicy nie działała wprost jako czynnik pobudzający IFN-γ, ale raczej jako kostymulator wspólnie z IL-2 lub mitogenami. Próba oczyszczenia aktywności z po-endotoksynowej mysiej surowicy ujawniła najwyraźniej jednorodne białko o masie 50-55 kDa. Ponieważ inne cytokiny mogą występować jako kostymulatory produkcji IFN-γ, niepowodzenie neutralizacji aktywności surowicy przeciwciałami przeciwko IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 lub TNF sugerowało, że był to odrębny czynnik. W 1995 roku ci sami badacze dowiedli, że indukowany endoksyną kostymulator wytwarzania IFN-γ był obecny w wyciągu z mysiej wątroby uprzednio traktowanej P. acnes (Okamura i in., 1995). W tym modelu populacja makrofagów wątrobowych (komórek Kupffera) rozrasta się i u tych myszy, mała dawka bakteryjnego lipopolisacharydu (LPS), która nie jest śmiertelna dla myszy uprzednio nietraktowanych, staje się śmiertelna. Czynnik nazwany czynnikiem indukującym IFN-γ (IGIF) i później określany jako interleukina-18 (IL-18), oczyszczono do stanu homogenności z 1200 gramów mysiej wątroby traktowanej P. acnes. Zdegenerowane oligonukleotydy wyprowadzone z sekwencji aminokwasowej oczyszczonej IL-18, zastosowano do klonowania cDNA mysiej IL-18. IL-18 jest białkiem o masie 18-19 kDa, składającym się ze 157 aminokwasów, które nie posiada oczywistego podobieństwa do żadnego peptydu w bazach danych. Informacyjne RNA dla IL-18 i interleukiny-12 (IL-12) są łatwo wykrywane w komórkach Kupffera i aktywowanych makrofagach. Rekombinowana IL-18 indukuje IFN-gamma silniej niż IL-12, najwyraźniej innym szlakiem (Micallef i in., 1996). Podobnie do indukowanej endotoksyną aktywności surowicy, IL-18 nie indukuje IFN-γ sama w sobie, ale w pierwszym rzędzie pełni funkcję kostymulatora z mitogenami lub IL-2. IL-18 zwiększa proliferację limfocytów T, najwyraźniej szlakiem zależnym od IL-2 i zwiększa wytwarzanie cytokiny w Th1 in vitro oraz wykazuje synergizm w połączeniu z IL-12, którego wynikiem jest nasilone wytwarzanie IFN-γ (Maliszewski i in., 1990).

Po sklonowaniu mysich form, w roku 1996 opisano ludzkie sekwencje cDNA dla IL-18 (Ushio i inn.,1996).

Przez klonowanie IL-18 z zaatakowanych tkanek i badanie ekspresji genu dla IL-18, ujawniono bliski związek tej cytokiny z chorobami autoimmunizacyjnymi. Myszy z cukrzycą niezwiązaną z otyłością (NOD) samoistnie rozwijają autoimmunizacyjne zapalenie wysp trzustkowych i cukrzycę, które mogą ulec przyspieszeniu i synchronizacji w odpowiedzi na pojedynczą iniekcję cyklofosfamidu. mRNA dla IL-18 wykazano, za pomocą reakcji odwrotnej transkryptazy PCR, w trzustce myszy z NOD we wczesnych stadiach zapalenia wysp trzustkowych. Poziomy mRNA dla IL-18 wzrastały gwałtownie po traktowaniu cyklofosfamidem i poprzedzały wzrost mRNA dla IFN-γ oraz późniejszą cukrzycę. Interesujące jest to, że ta kinetyka zmian naśladuje tę obserwowaną przy mRNA dla IL-12-p40, skutkując bliską korelacją poszczególnych poziomów mRNA. Po klonowaniu cDNA dla IL-18 z RNA trzustki i następnie sekwencjonowaniu stwierdzono identyczność tej sekwencji z sekwencją dla IL-18 klonowaną z komórek Kupffera i w uprzednio aktywowanych in vivo makrofagach. Także makrofagi myszy z NOD zareagowały na cyklofosfamid ekspresją genu dla IL-18, podczas gdy makrofagi od myszy Balb/c traktowane równolegle nie reagowały. Zatem wyrażanie IL-18 jest nieprawidłowo regulowane u myszy z autoimmunizacyjną NOD i pozostaje w bliskim związku z występowaniem cukrzycy (Rothe i in., 1997).

IL-18 odgrywa ważną rolę w immunoregulacji lub w zapaleniu wzmacniając aktywność czynnościową liganda Fas na limfocytach Th1 (Conti i in., 1997). IL-18 jest także wyrażana w korze nadnerczy i dlatego może być wydzielanym neuroimmunomodulatorem, odgrywającym ważną rolę w organizowaniu układu odpornościowego po stresującym doświadczeniu (Chater, 1986).

IL-18 jest wytwarzana in vivo przez rozszczepienie pro-IL-18, a jej endogenna aktywność wydaje się wyjaśniać wytwarzanie IFN-γ w P. acnes i śmiertelność związaną z LPS. Dojrzała IL-18 jest wytwarzana z jej prekursorów przez enzym konwertujący IL-18 (enzym konwertujący IL-1beta, ICE, kaspaza-1).

Receptor dla IL-18 składa się z co najmniej dwóch części, współdziałających w wiązaniu liganda.

Miejsca wiązania IL-18, o wysokim i niskim do niej powinowactwie, znaleziono na stymulowanych IL-12

PL 216 228 B1 mysich limfocytach T (Yoshimoto i in., 1998), sugerując receptor złożony z wielu łańcuchów. Do tej pory zostały zidentyfikowane dwie podjednostki receptora, obie należące do rodziny receptora IL-1 (Parnet i in., 1996). Transdukcja sygnału IL-18 obejmuje aktywację NF-κΒ (DiDonato i in., 1997).

Niedawno wyizolowano z ludzkiego moczu rozpuszczalne białko mające wysokie powinowactwo do IL-18 i opisano ludzkie i mysie cDNA (Novick i in., 1999); WO 99/09063). Białko to określono jako białko wiążące IL-18 (IL-18BP).

IL-18BP nie jest zewnątrzkomórkową domeną żadnego ze znanych receptorów IL-18, ale wydzielanym, naturalnie krążącym białkiem. Należy do nowej rodziny wydzielanych białek. Ta rodzina ponadto obejmuje kilka białek kodowanych przez Poksywirusa, które wykazują wysoką homologię z IL-18BP (Novick i in., 1999). IL-18BP jest konstytutywnie wyrażana w śledzionie, należy do nadrodziny immunoglobulin i wykazuje ograniczoną homologię z receptorem II typu dla IL-1. Jej gen jest zlokalizowany na ludzkim chromosomie 11q13 i nie znaleziono w tej 8,3 kb sekwencji genomowej żadnego eksonu kodującego domenę przezbłonową (Novick i in., 1999).

Cztery ludzkie i dwie mysie izoformy IL-18BP, wynikające z alternatywnego składania mRNA i znajdowane w różnych bibliotekach cDNA, zostały wyrażone, oczyszczone i ocenione pod względem wiązania i neutralizacji własności biologicznych IL-18 (Kim i in., 2000). Ludzka izoforma IL-18BP (IL-18Bpa) wykazywała najwyższe powinowactwo do IL-18 z szybkim przyłączaniem, wolnym odłączaniem i stałą dysocjacji (K(d)) 399 pM. IL-18BPc ma wspólną domenę Ig z IL-18BPa z wyjątkiem 29 C-końcowych aminokwasów; K(d) IL-18BPc jest 10-krotnie niższa (2,94 nM). Pomimo to, IL-18BPa i IL-18BPc neutralizują IL-18 w >95% przy podwójnym nadmiarze molowym. Izoformy IL-18BPb i IL-18BPd nie mają kompletnej domeny Ig i nie mają zdolności do wiązania lub neutralizowania IL-18. Mysie izoformy IL-18BPc i IL-18BPd, posiadające identyczną domenę Ig, również neutralizują mysią IL-18 w 95% przy podwójnym nadmiarze molowym. Jednak, mysia IL-18BPd, która ma wspólny zwykły C-końcowy motyw z ludzką IL-18BPa, również neutralizuje ludzką IL-18. Modelowanie cząsteczkowe wykazało duże, mieszane elektrostatyczne i hydrofobowe miejsce wiązania w domenie Ig IL-18BP, które może odpowiadać za jego wysokie powinowactwo do liganda (Kim i in., 2000).

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI, ang. traumatic brain injury), nazywane również po prostu urazem głowy lub zamkniętym urazem głowy (CHI, ang. closed head injury), odnosi sie do urazu ośrodkowego układu nerwowego, w którym dochodzi do uszkodzenia mózgu spowodowanego uderzeniem w głowę z zewnątrz. Najczęściej zdarza się to podczas wypadków samochodowych lub rowerowych, ale może również wystąpić w następstwie tonięcia, zawału serca, udaru i infekcji. Ten typ urazowego uszkodzenia mózgu zwykle jest następstwem niedostatecznego zaopatrzenia mózgu w tlen lub w krew i z tego powodu może być określany jako „uszkodzenie z niedotlenienia.

Zamknięty uraz głowy występuje przy uderzeniu w głowę, takim jak przy wypadku pojazdu mechanicznego lub upadku. W tym przypadku, czaszka zderza się z obiektem stacjonarnym i mózg, który znajduje się wewnątrz czaszki, obraca się i skręca wzdłuż swojej osi (pnia mózgu), powodując miejscowe lub uogólnione uszkodzenie. Ponadto mózg, miękka masa otoczona płynem, który pozwala na jego „unoszenie, może odbić się od czaszki powodując dalsze uszkodzenia.

Bezpośrednio po urazie może wystąpić okres utraty świadomości, trwający minuty, tygodnie lub miesiące. Z powodu skręcenia i odbicia pacjenci z urazowym uszkodzeniem mózgu doznają uszkodzenia lub stłuczenia wielu okolic mózgu. Nazywa się to rozległym uszkodzeniem lub „niedrążącym urazem mózgu. Rodzaje uszkodzeń mózgu występujące przy niedrążących urazach mogą być zakwalifikowane jako pierwotne lub wtórne.

Pierwotne uszkodzenia mózgu powstają w momencie urazu, głównie w miejscach uderzenia, w szczególności przy złamaniach czaszki. Duże urazy mogą być połączone z krwawieniem wewnątrzmózgowym lub mogą im towarzyszyć rozerwania kory. Rozlane uszkodzenia aksonów występują jako następstwo odcięcia i nadmiernego rozciągnięcia wypustek neuronu, wywołanych obrotowymi ruchami mózgu wewnątrz czaszki. Mogą występować małe zmiany krwotoczne lub rozlane uszkodzenia aksonów, które mogą być wykryte jedynie za pomocą mikroskopu.

Wtórne uszkodzenia mózgu występują jako następstwo powikłań rozwijających się po momencie urazu. Obejmują krwawienie wewnątrzczaszkowe, urazowe uszkodzenie tętnic zewnątrzmózgowych, wgłębienie, uszkodzenie z niedotlenienia lub zapalenie opon mózgowych.

„Otwarty uraz głowy jest widocznym atakiem na głowę i może być następstwem postrzału, wypadku lub wtargnięcia obiektu poprzez czaszkę do mózgu („penetrujący uraz mózgu). Ten typ urazu głowy zwykle dotyczy określonej okolicy mózgu.

PL 216 228 B1

Tak zwany „łagodny uraz mózgu może pojawić się bez utraty świadomości i dawać jedynie wrażenie oszołomienia i splątania trwające krótko. Jakkolwiek stosowana opieka medyczna może być minimalna, to pacjenci z urazem mózgu bez śpiączki mogą doznać objawów i zaburzeń podobnych do tych, z powodu których cierpią ci, którzy przeżyli uraz ze śpiączką.

W odpowiedzi na uraz występują w mózgu zmiany, które wymagają monitorowania, aby zapobiec następnym uszkodzeniom. Wymiary mózgu zwiększają się po ciężkim urazie. Jest to nazwane przekrwieniem mózgu i występuje, gdy przyrasta ilość krwi w mózgu. Następnie w tym schorzeniu może gromadzić się w mózgu woda, co nazywa się obrzękiem. Zarówno przekrwienie jak i obrzęk prowadzą do wzrostu ciśnienia wywieranego na mózg, tak zwanego ciśnienia śródczaszkowego („ICP, ang. intracranial pressure).

Śpiączka jest przedłużonym okresem utraty świadomości występującym natychmiast po urazowym uszkodzeniu głowy.

Istnieje kilka stopni śpiączki. Stopień śpiączki może być mierzony postępem zdolności do odpowiadania osoby z urazem głowy. W ostrej fazie urazu głowy stosuje się „Klasyfikację Stanu Przytomności w skali Glasgow (ang. Glasgow Coma Scale). Gdy pacjent poprawia się lub stabilizuje, stosuje się „Skalę Rancho Los Amigos (ang. Rancho Los Amigos Scale) mierzącą poziomy myślenia (rozumienie i kojarzenie).

Następstwem urazu mózgu często jest przetrwałe upośledzenie, takie jak padaczka pourazowa, przetrwały stan wegetatywny lub otępienie pourazowe.

Urazy rdzenia kręgowego są następnym typem urazów CNS. Urazy rdzenia kręgowego zaliczają się do najczęstszych przyczyn hospitalizacji z powodu porażenia kończyn dolnych lub porażenia wszystkich kończyn. Ponad 80% jest następstwem wypadków drogowych. Klinicznie rozpoznaje się dwie główne grupy urazów: urazy zamknięte i otwarte.

Urazy otwarte powodują bezpośrednie uszkodzenie rdzenia kręgowego i korzeni nerwowych. Urazy drążące mogą spowodować zniszczenie i krwawienie. Zamknięte urazy zaliczają się do najczęstszych urazów rdzenia i zwykle są związane ze złamaniem/przemieszczeniem kręgosłupa, które zwykle można wykazać radiologicznie. Uszkodzenie rdzenia zależy od rozmiarów uszkodzenia kości i może być rozważane w dwóch głównych stadiach: uszkodzenia pierwotnego stłuczenia, przecięcia włókien nerwowych i martwicy krwotocznej i uszkodzenia wtórnego - krwiaka nadoponowego, zawału, zakażenia i obrzęku.

Późne następstwa uszkodzenia rdzenia kręgowego obejmują: postępującą; wstępującą i zstępującą degenerację uszkodzonych włókien nerwowych, pourazową jamistość rdzenia i układowe następstwa porażenia wszystkich kończyn, takie jak zakażenia układu moczowego i płuc, odleżyny i utratę masy mięśniowej.

Patologia urazowych uszkodzeń mózgu jest bardzo skomplikowana i nadal słabo rozumiana. Wysiłek badawczy w ostatniej dekadzie naświetlił istotną rolę cytokin uwalnianych układowo i lokalnie z przestrzeni podoponowej po uszkodzeniu mózgu i zasugerowano podwójne działanie cytokin prozapalnych takich jak TNF, IL-6 lub IL-8, w oparciu o stwierdzenie zależnych od czasu korzystnych i niekorzystnych działań tych mediatorów (Morganti-Kossmann i in., 1997; Kossmann i in., 1997; Shohami i in.,1999; Scherbel i in.,1999; Whalen i in.,2000). Jak opisano powyżej, ostatnio poznaną cytokiną z rodziny IL-1 jest IL-18. Ostatnie badania wykazały, że IL-18 jest konstytutywnie wyrażana w CNS myszy, szczura i człowieka in vivo (Culhane i in., 1998; Jander i Stoll, 1998; Prinz i in., 1999; Fassbender i in., 1999; Wheeler i in., 2000), jak również w pierwotnych hodowlach astrocytów i mikrogleju, ale nie w neuronach in vitro (Conti i in., 1999). Zwiększone poziomy IL-18 wykryto w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) pacjentów z zapalnymi chorobami CNS, takimi jak bakteryjne zapalenie opon mózgowych i wirusowe zapalenie mózgu i opon, ale nie w CSF pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (SM) (Fassbender i in., 1999). W przeciwieństwie do zwykle niskich podoponowych poziomów IL-18 u pacjentów z SM, zwiększona ekspresja mRNA dla IL-18 została wykazana w rdzeniach kręgowych szczurów rasy Lewis z eksperymentalnym autoimmunizacyjnym zapaleniem mózgu i rdzenia (EAE), w zwierzęcym modelu SM (Jander i Stoli, 1998). Ekspresja i znaczenie czynnościowe IL-18 w urazach układu nerwowego nie zostały dotąd wykazane.

Wynalazek niniejszy dotyczy w ogólności patofizjologicznej roli IL-18 w chorobach CNS. Opiera się on na stwierdzeniu, że traktowanie myszy inhibitorami IL-18, zarówno godzinę jak i trzy dni po eksperymentalnym zamkniętym urazie czaszki (CHI), powoduje znaczną poprawę i zmniejszenie rozległości uszkodzenia mózgu w porównaniu do zwierząt kontrolnych.

PL 216 228 B1

Przedmiotem wynalazku jest zatem zastosowanie białka wiążącego IL-18 (IL-18BP) do wytwarzania leku do leczenia urazowych uszkodzeń mózgu, w szczególności zamkniętego urazu głowy, przy czym IL-18BP jest podawane w pojedynczej dawce 3 dni po urazie mózgu.

W korzystnej postaci wykonania wiążące IL-18 jest glikozylowane w jednym lub wielu miejscach.

W innej korzystnej postaci wykonania lek otrzymany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku ponadto zawiera interferon, korzystnie interferon-α lub interferon-β, do jednoczesnego, kolejnego lub osobnego zastosowania.

Ponadto korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku ponadto zawiera czynnik martwicy nowotworu, korzystniej czynnik martwicy nowotworu alfa, do jednoczesnego, kolejnego lub osobnego zastosowania.

Również korzystnie lek otrzymywany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku ponadto zawiera czynnik przeciwzapalny, korzystniej inhibitor COX, w szczególności inhibitor COX-2, do jednoczesnego, kolejnego lub osobnego zastosowania.

W innej korzystnej postaci wykonania lek otrzymany zgodnie z zastosowaniem według wynalazku ponadto zawiera przeciwutleniacz do jednoczesnego, kolejnego lub osobnego zastosowania.

Zgodnie z wynalazkiem białko wiążące IL-18 jest korzystnie stosowane w ilości około 0,001 do 100 mg/kg ciężaru ciała lub około 0,01 do 10 mg/kg ciężaru ciała lub około 0,1 do 5 mg/kg ciężaru ciała lub około 1 do 3 mg/kg ciężaru ciała.

Najkorzystniej białko wiążące IL-18 jest według wynalazku podawane podskórnie.

KRÓTKI OPIS FIGUR

Fig. 1 Przedstawia histogram opisujący poziomy w surowicy, wewnątrzmózgowej IL-18 (ng/ml) w całym mózgu (zakreskowane), w lewej półkuli (czarne) lub w prawej półkuli (szare) w różnych warunkach.

Fig. 2 przedstawia rozwój NSS (Wskaźnik Nasilenia Neurologicznego, ang. Neurological Severity Score) zmierzony 1 godzinę, 24 godziny, 72 lub 168 godzin po urazie, zarówno przy podaniu 50 ąg IL-18BP podanych i.p., 1 godzinę od urazu (kwadraty) lub po podaniu samej substancji pomocniczej (kontrola, kółka).

Fig. 3 przedstawia ANSS zmierzone 24, 72 lub 168 godzin po urazie, zarówno przy podaniu 50 ąg IL-18BP podanych i.p., 1 godzinę od urazu (kwadraty) lub po podaniu samej substancji pomocniczej (kontrola, kółka).

Fig. 4 przedstawia ANSS zmierzone 1, 24 godziny lub 3, 7 lub 14 dni po urazie, zarówno przy podaniu 50 ąg IL-18BP podanych i.p., zarówno w pojedynczej dawce w 3 dniu po urazie (romby) lub z podwójną dawką 1 godzinę i 3 dni od urazu (kwadraty) lub po podaniu samej substancji pomocniczej (kontrola, trójkąty).

OPIS WYNALAZKU

Wynalazek niniejszy opiera się na stwierdzeniu statystycznie istotnego korzystnego działania inhibitora IL-18 na poprawę stanu po urazie mózgu w mysim modelu zamkniętego urazu głowy. Niniejszym ponadto ujawniono, że ilość IL-18 ulega zwiększeniu w mózgu i płynie mózgowo-rdzeniowym po urazowym uszkodzeniu mózgu, wskazując, że ta prozapalna cytokina odgrywa ważną rolę w patogenezie uszkodzenia mózgu.

Zatem, wynalazek dotyczy zastosowania IL-18BP inhibitora IL-18 - do wytwarzania leku do leczenia urazowych uszkodzeń mózgu.

Niniejszym ujawniono także zastosowanie inhibitora IL-18 do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania powikłaniom i późnym następstwom uszkodzenia CNS.

Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, uszkodzenie CNS jest urazowym uszkodzeniem mózgu, a korzystnie stanowi zamknięty uraz głowy.

Jednakże ujawnienia niniejszego zgłoszenia wskazują, że możliwe jest stosowanie inhibitora IL-18 do leczenia uszkodzeń rdzenia kręgowego lub uszkodzeń mózgu pochodzenia naczyniowego.

W kontekście niniejszego wynalazku, wyrażenie „uszkodzenie ośrodkowego układu nerwowego lub „uszkodzenie CNS odnosi się do dowolnego uszkodzenia mózgu lub rdzenia kręgowego, niezależnie od wieku, w którym wystąpił uraz lub leżącej u podstaw przyczyny. Przyczyna leżąca u podstaw może np. być mechaniczna lub zakaźna. Uszkodzenie CNS i jego objawy kliniczne i następstwa zostały szczegółowo opisane powyżej, w części dotyczącej stanu techniki. Uszkodzenie

PL 216 228 B1

CNS obejmuje np. uraz lub inne zniszczenie mózgu lub rdzenia kręgowego i może być również nazywane neurotraumą.

Uszkodzenia mózgu, na przykład, mogą obejmować lub powodować jedną lub kilka następujących patologii: 1. zaburzoną uwagę; 2. zaburzone myślenie; 3. zaburzoną mowę; 4. zaburzoną pamięć; 5. zaburzenie przewodnictwa; 6. zaburzenie motoryki; 7. każdą inną dysfunkcję neurologiczną.

Następstwem urazu rdzenia kręgowego może być porażenie kończyn dolnych lub porażenie wszystkich kończyn.

Powikłania lub późne następstwa urazu CNS mogą również być leczone i/lub można im zapobiegać z zastosowaniem inhibitora IL-18. Powikłania i późne następstwa urazu CNS zostały opisane powyżej w części dotyczącej stanu techniki. Obejmują one, na przykład, ale nie są do nich ograniczone, śpiączkę, zapalenie opon mózgowych, pourazową padaczkę, pourazowe otępienie, degenerację włókien nerwowych lub pourazową jamistość rdzenia lub krwotok.

Inhibitory IL-18 można także stosować do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania dowolnemu urazowi mózgu o podłożu naczyniowym, tak jak na przykład uszkodzenie mózgu z niedotlenienia w zawale mózgu, niedokrwienie, incydent naczyniowo-mózgowy lub udar.

Pojęcie „leczenie i „zapobieganie, w znaczeniu tu stosowanym, powinno być rozumiane jako częściowe lub całkowite zapobieganie, hamowanie, osłabianie, poprawianie lub odwracanie jednego lub kilku objawów lub przyczyny (przyczyn) uszkodzenia CNS, jak również objawów, chorób lub powikłań towarzyszących uszkodzeniu CNS. Gdy „leczy się uraz CNS, inhibitory IL-18 podaje się po momencie wystąpienia objawów choroby, „zapobieganie odnosi się do podawania ich przed wystąpieniem objawów u pacjenta.

Leczenie urazów CNS jest szczególnie korzystne. W celu leczenia urazu CNS, inhibitor IL-18 jest podawany tak szybko jak tylko to możliwe po urazie CNS np. w ciągu godziny po urazie. Jednak, jak pokazano poniżej w Przykładach, jeden z inhibitorów IL-18 wykazał swe korzystne działanie na uraz mózgu przy podawaniu po 3 dniach od urazu. Z tego powodu, w celu leczenia CNS, korzystnie podaje się inhibitory IL-18, przez 3 dni po urazie.

Pojęcie „inhibitor IL-18 odnosi się do dowolnej cząsteczki modulującej wytwarzanie i/lub działanie IL-18, w ten sposób, że wytwarzanie i/lub działanie IL-18 jest osłabione, zredukowane lub częściowo, zasadniczo lub całkowicie zabezpieczone lub zablokowane. Pojęcie „inhibitora IL-18 w założeniu obejmuje inhibitory wytwarzania IL-18, jak również inhibitory jej działania.

Inhibitorem wytwarzania może być dowolna cząsteczka negatywnie wpływająca na syntezę, obróbkę lub dojrzewanie IL-18. Inhibitorami branymi pod uwagę mogą być na przykład supresory ekspresji genu dla IL-18, antysensowne mRNA zmniejszające lub zapobiegające transkrypcji mRNA dla IL-18 lub prowadzące do degradacji mRNA, białka zaburzające prawidłowe fałdowanie lub częściowo lub zasadniczo zapobiegające wydzielaniu IL-18, proteazy rozkładające IL-18, po tym gdy zostanie ona zsyntetyzowana, inhibitory proteaz rozszczepiających pro-IL-18, w celu wytworzenia dojrzałej IL-18, takie jak inhibitor kaspazy-1 i podobne.

Inhibitorem działania IL-18 może być, na przykład, antagonista IL-18. Antagoniści mogą albo wiązać albo maskować samą cząsteczkę IL-18 z wystarczającym powinowactwem i swoistością aby częściowo lub zasadniczo zneutralizować miejsce (miejsca) wiązania IL-18, odpowiedzialne za wiązanie IL-18 z jej ligandami (jak np. z jej receptorami). Antagonista może także hamować szlak przekazywania sygnału IL-18, który jest aktywowany w komórkach po związaniu IL-18 z jej receptorem.

Inhibitory działania IL-18 mogą być również rozpuszczalnymi receptorami IL-18 lub cząsteczkami naśladującymi receptory, lub czynnikami blokującymi receptory dla IL-18, lub przeciwciałami przeciwko IL-18, takimi jak przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne, lub każdym innym czynnikiem lub cząsteczką zabezpieczającą przed wiązaniem IL-18 z jej czynnikami docelowymi, w ten sposób zmniejszającymi lub zabezpieczającymi przed uruchomieniem zewnątrz- lub wewnątrzkomórkowych reakcji odbywających się za pośrednictwem IL-18.

Inhibitor IL-18 może być wybrany spośród inhibitorów kaspazy-1 (ICE), przeciwciał przeciwko IL-18, przeciwciał przeciwko dowolnym podjednostkom receptora dla IL-18, inhibitorów szlaków sygnałowych dla IL-18, antagonistów IL-18, które konkurują z IL-18 lub wiążą się i blokują receptor IL-18 oraz białek wiążących IL-18, ich izoform, mutein, białek fuzyjnych, funkcjonalnych pochodnych, aktywnych frakcji lub kolistych permutacji, lub ich soli.

Pojęcie „białek wiążących IL-18 jest stosowane tu jako synonim „IL-18BP. Obejmuje ono wszystkie białka wiążące IL-18 określone w WO 99/09063 lub przez Novick i in., 1999, włączając w to odmiany wynikające ze splicingu i/lub izoformy białek wiążących IL-18, jak określono w Kim i in., 2000.

PL 216 228 B1

W szczególności, ludzkie izoformy a i c IL-18BP są korzystne do zastosowania według niniejszego wynalazku.

Białka korzystne do zastosowania według wynalazku mogą być glikozylowane lub nieglikozylowane, mogą pochodzić z naturalnych źródeł, takich jak mocz lub korzystnie mogą być wytwarzane drogą rekombinacji. Ekspresja rekombinantów może być prowadzona w prokariotycznych układach ekspresyjnych, takich jak E. coli lub w eukariotycznych i korzystnie w ssaczych układach ekspresyjnych. Linią komórkową szczególnie odpowiednią dla inhibitorów IL-18, jest linia komórek jajnika chomika chińskiego (CHO).

Wytwarzanie rekombinowanego inhibitora IL-18, gdy jest rekombinacyjnie wyrażany w komórkach lub liniach komórkowych ssaków, korzystnie może być przeprowadzone w hodowlach na podłożach wolnych od surowicy.

W znaczeniu tu stosowanym, pojęcie „muteina odnosi się do analogów IL-18BP lub analogów wirusowego IL-18BP, w których jedna lub więcej reszt aminokwasowych występujących w naturalnym IL-18BP lub wirusowym IL-18BP jest wymienionych na inne reszty aminokwasowe, lub uległo delecji, lub jedna lub więcej reszt aminokwasowych zostało dodanych do naturalnej sekwencji IL-18BP lub wirusowego IL-18BP, nie powodując istotnego obniżenia aktywności powstałych produktów, w porównaniu do typu dzikiego IL-18BP lub wirusowego IL-18BP. Te muteiny wytwarza się znanymi metodami i/lub za pomocą technik ukierunkowanej mutagenezy, lub dowolną znaną, odpowiednią do tego celu, technika.

Każda taka muteina może posiadać sekwencję aminokwasów, która w wystarczającym stopniu jest duplikatem sekwencji IL-18BP lub wirusowej IL-18BP, tak aby miała zasadniczo podobne działanie do IL-18BP. Jedną z właściwości IL-18BP, jest jej zdolność do wiązania IL-18. Dopóki muteina posiada zdolność wiązania do IL-18, można ją stosować do oczyszczania IL-18, środkami takimi jak chromatografia powinowactwa i w ten sposób może być rozpatrywana jako mająca zasadniczo podobne właściwości do IL-18BP. Zatem, można określić, czy dana muteina posiada aktywność zasadniczo podobną do IL-18BP, za pomocą rutynowych metod badawczych obejmujących poddanie takiej muteiny, np. prostemu testowi kompetycji metodą „kanapkową, w celu określenia, czy wiąże ona lub nie, odpowiednio znakowaną IL-18, jak badanie radioimmunologiczne lub ELISA. Proste testy do oceny aktywności biologicznej IL-18BP opisano szczegółowo w WO 99/09063, np. w przykładzie 2 (wiązanie do IL-18 ocenione przez sieciowanie) lub (hamowanie wywołanej przez IL-18 indukcji INF-gamma w komórkach jednojądrzastych).

Każda taka muteina posiada przynajmniej 40% identyczności lub homologii z sekwencją albo IL-18BP lub wirusowo kodowanego homologu IL-18BP. Korzystniej, ma przynajmniej 50%, przynajmniej 60%, przynajmniej 70%, przynajmniej 80% lub najkorzystniej 90% identyczności lub homologii z nimi.

Muteiny polipeptydów IL-18BP lub wirusowych IL-18BP, które mogą być stosowane, lub kodujące je kwasy nukleinowe, obejmują pełny zestaw zasadniczo odpowiadających sekwencji, jak w przypadku podstawionych peptydów lub polinukleotydów, które specjalista może uzyskać rutynowymi sposobami, bez wykonywania dodatkowych eksperymentów, opierając się na tu zamieszczonych informacjach i wskazówkach.

Muteiny obejmują białka kodowane przez kwasy nukleinowe, takie jak DNA lub RNA, które hybrydyzują z DNA lub RNA, które kodują inhibitor IL-18 w średnio lub bardzo ostrych warunkach. Termin „ostre warunki odnosi się do warunków hybrydyzacji i następującego po niej płukania, które specjalista standardowo określi jako „ostre. Zobacz Ausbel i in., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 i 6.4 (1987, 1992) i Sambrook i in., (Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., i Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Przykłady ostrych warunków obejmują warunki płukania w 12-20°C poniżej obliczonej Tm dla badanej hybrydy, 2xSSC i 0,5% SDS przez 5 minut, 2xSSC i 0,1% SDS przez 15 minut; 0,1xSSC i 0,5% SDS w 37°C przez 30-60 minut, a następnie 0,1xSSC i 0,5% SDS w 68°C przez 30-60 minut. Specjalista zrozumie, że ostrość warunków zależy również od długości sekwencji DNA, sond oligonukleotydowych (takich jak te o 10-40 parach zasad) lub sond mieszanych oligonukleotydów. Gdy stosuje się mieszane sondy, korzystnie stosuje się chlorek terametyloamoniowy (TMAC) zamiast SSC. Patrz Ausubel, powyżej.

Identyczność odzwierciedla zależność pomiędzy dwiema lub więcej sekwencjami polipeptydowymi lub dwiema lub więcej sekwencjami polinukleotydowymi, określoną przez porównanie sekwencji.

Ogólnie, identyczność odnosi się do dokładnej zgodności nukleotydu z nukleotydem lub aminokwasu z aminokwasem, odpowiednio dwóch sekwencji polinukleotydowych lub dwóch sekwencji polipeptydowych, przez całą długość porównywanych sekwencji.

PL 216 228 B1

W przypadku sekwencji, które nie odpowiadają sobie dokładnie, można określić % identyczności. Na ogół, dwie porównywane sekwencje są zestawiane tak, by uzyskać maksymalną korelację pomiędzy sekwencjami. Może to obejmować „przerwy w jednej albo w obu sekwencjach, w celu zwiększenia stopnia zgodności. % identyczności może być określony dla całej długości każdej z porównywanych sekwencji (tak zwanej zgodności ogólnej), co jest szczególnie odpowiednie dla sekwencji o tej samej lub bardzo podobnej długości, lub dla mniejszych, określonych długości (tak zwanej zgodności lokalnej), która jest bardziej odpowiednia dla sekwencji o nierównej długości.

Sposoby porównywania identyczności i homologii dwóch lub więcej sekwencji są dobrze znane w dziedzinie. Tak na przykład, można stosować programy dostępne w Wisconsin Sequence Analysis Package, wersja 9.1 (Devereux J i in., 1984), na przykład programy BESTFIT i GAP, do określenia % identyczności pomiędzy dwoma polinukleotydami lub % identyczności i % homologii pomiędzy dwoma sekwencjami polipeptydowymi. BESTFIT stosuje algorytm „homologii lokalnej Smith'a i Waterman'a (1981) i wyszukuje najlepszy pojedynczy, najbardziej podobny region pomiędzy dwiema sekwencjami. Są znane w tej dziedzinie również inne programy określające identyczność i/lub podobieństwo pomiędzy sekwencjami, na przykład rodzina programów BLAST (Altschul S F i in., 1990, Altschul SF i in., 1997, dostępne przez stronę główną NCBI www.ncbi.nlm.nih.gov) i FASTA (Pearson W R, 1990; Pearson 1988.

Korzystne zmiany w muteinach, to zmiany znane jako podstawienie „konserwatywne. Podstawienia konserwatywne aminokwasu w peptydach lub białkach IL-18BP lub wirusowych IL-18BP, mogą obejmować równoznaczne aminokwasy z grupy mającej wystarczająco podobne właściwości fizykochemiczne tak, że zamiana pomiędzy członkami grupy zachowuje biologiczne właściwości cząsteczki (Grantham, 1974). Jest oczywiste, że insercje i delecje aminokwasów mogą być dokonane w określonych powyżej sekwencjach bez zmiany ich funkcji, szczególnie gdy delecje lub insercje obejmują tylko kilka aminokwasów, np. mniej niż trzydzieści i korzystnie mniej niż dziesięć, i nie usuwa lub nie zamienia aminokwasów istotnych dla konformacji czynnościowej, np. reszt cysternowych. Białka i muteiny wytworzone w następstwie takich delecji i/lub insercji mogą być stosowane do leczenia urazów CNS.

Korzystnie, równoznaczne grupy aminokwasowe są określone w tabeli 1.

Korzystniej, grupy równoznacznych aminokwasów są określone w tabeli 2; i najkorzystniej grupy równoznacznych aminokwasów są określone w tabeli 3.

TABELA 1

Korzystne grupy równoznacznych aminokwasów

Aminokwas Grupa równoznacznych

Ser	Ser,	Thr,	Gly	Asn
Arg	Arg,	Gln,	Lys,	Glu,	His
Leu	Ile,	Phe,	Tyr,	Met,	Val,	Leu
Pro	Gly,	Ale,	Thr,	Pro
Thr	Pro,	Ser,	Ala,	Gly,	His,	Gln,	Thr
Ala	Gly,	Thr,	Pro,	Ala
Val	Met,	Tyr,	Phe,	Ile,	Leu,	Val
Gly	Ala,	Thr,	Pro,	Ser,	Gly
Ile	Met,	Tyr,	Phe,	Val,	Leu,	Ile
Phe	Trp,	Met,	Tyr,	Ile,	Val,	Leu,	Phe
Tyr	Trp,	Met,	Phe,	Ile,	Val,	Leu,	Tyr
Cys	Ser,	Thr,	Cys
His	Glu,	Lys,	Gln,	Thr,	Arg,	His
Gln	Glu,	Lys,	Asn,	His,	Thr,	Arg,	Gln
Asn	Gln,	Asp,	Ser,	Asn
Lys	Glu,	Gln,	His,	Arg,	Lys
Asp	Glu,	Asn,	Asp
Glu	Asp,	Lys,	Asn,	Gln,	His,	Arg,	Glu
Met	Phe,	Ile,	Val,	Leu,	Met
Trp	Trp

PL 216 228 B1

TABELA 2 Korzystniejsze grupy równoznacznych aminokwasów
Aminokwas	Grupa równoznacznych
Ser	Ser
Arg	His, Lys, Arg
Leu	Leu, Ile, Phe, Met
Pro	Ala, Pro
Thr	Thr
Ala	Pro, Ala
Val	Val, Met, Ile
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Phe, Val, Leu
Phe	Met, Tyr, Ile, Leu, Phe
Tyr	Phe, Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His, Gln, Arg
Gln	Glu, Gln, His
Asn	Asp, Asn
Lys	Lys, Arg
Asp	Asp, Asn
Glu	Glu, Gln
Met	Met, Phe, Ile, Val, Leu
Trp	Trp
TABELA 3
Najkorzystniejsze grupy równoznacznych aminokwasów
Aminokwas	Grupa równoznacznych
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, Ile, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
Ile	Ile, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gln	Gln
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, Ile, Leu
Trp	Met

PL 216 228 B1

Przykłady podstawień aminokwasów w białkach, które mogą być stosowane do uzyskania mutein, polipeptydów lub białek IL-18BP lub mutein wirusowych IL-18BP, obejmują dowolne znane etapy sposobów, takie jak przedstawione w patentach US 4,959,314, 4,588,585 i 4,737,462, Mark i in.; 5,116,943 Koths i in.; 4,965,195 Namen i in; 4,879,111 Chong i in.; i 5,017,691 Lee i in.; oraz białek z podstawieniem lizyną przedstawiono w patencie US nr 4,904,584 (Shaw i in.).

Termin „białka fuzyjne odnosi się do polipeptydu obejmującego IL-18BP lub wirusową IL-18PB lub do muteiny lub jej fragmentów, poddanych fuzji z innym białkiem, które np. ma wydłużony okres przetrwania w płynach ustrojowych. Zatem, IL-18BP lub wirusowa IL-18BP może być w fuzji z innym białkiem, polipeptydem i podobnym, np. immunoglobuliną lub jej fragmentem.

„Funkcjonalne pochodne, w znaczeniu tu stosowanym, obejmują pochodne IL-18BP lub wirusowej IL-18BP oraz ich mutein i białek fuzyjnych, które mogą być wytworzone z grup funkcyjnych, które występują jako łańcuchy boczne reszt albo grupy N-końcowe, albo C-końcowe, środkami znanymi w tej dziedzinie i mogą być stosowane w medycynie o ile pozostają farmaceutycznie dopuszczalne, tj. nie niszczą aktywności białek, która jest zasadniczo podobna do aktywności IL-18BP lub wirusowej IL-18BP i nie wywołują toksycznych właściwości kompozycji je zawierających.

Te pochodne obejmują, na przykład, boczne łańcuchy glikolu polietylenowego, które maskują miejsca antygenowe i wydłużają czas krążenia IL-18BP i wirusowej IL-18BP w płynach ustrojowych. Inne pochodne obejmują estry alifatyczne grup karboksylowych, amidy grup karboksylowych wytworzone w reakcji z amoniakiem lub z pierwszo- lub drugorzędową aminą, N-acylowe pochodne wolnych grup aminowych reszt aminokwasowych wytworzone z resztami acylowymi (np. grup alkanoilowych lub aroilokarbocyklicznych) lub O-acylowe pochodne wolnych grup hydroksylowych (na przykład grup reszt serylowej lub treonylowej) wytworzone z reszt acylowych.

Przez „aktywne frakcje IL-18BP lub wirusowego IL-18BP, mutein i białek fuzyjnych, należy rozumieć każdy fragment lub prekursor łańcucha polipeptydowego samej cząsteczki białka lub razem z towarzyszącymi cząsteczkami lub resztami z nią połączonymi, np. z resztami cukrowymi lub fosforanowymi lub agregatami cząsteczki białka lub reszt cukrowych połączonymi ze sobą, pod warunkiem, że omawiana frakcja ma zasadniczo podobne działanie jak IL-18BP.

Termin „sole, w znaczeniu tu stosowanym, odnosi się zarówno do soli grup karboksylowych i soli addycyjnych z kwasami grup aminowych cząsteczki inhibitora IL-18 lub jego analogów. Sole grup karboksylowych mogą być wytwarzane środkami znanymi w tej dziedzinie i mogą obejmować sole nieorganiczne, na przykład sodu, wapnia, amonu, żelaza lub cynku i podobne oraz sole wytworzone z zasadami organicznymi, na przykład z aminami, takimi jak trietanolamina, arginina lub lizyna, piperydyna, prokaina i podobne. Sole addycyjne z kwasami obejmują, na przykład, sole z kwasami mineralnymi, takimi jak na przykład kwas solny lub kwas siarkowy i sole z kwasami organicznymi takimi jak na przykład kwas octowy lub kwas szczawiowy. Oczywiście każda taka sól musi zachowywać biologiczną aktywność OPN, tj. wywierać wpływ nasilający proliferację oligodendrocytów.

Inhibitorem IL-18 może być również przeciwciało przeciwko IL-18. Przeciwciała przeciwko IL-18 mogą być poliklonalne lub monoklonalne, chimeryczne, humanizowane lub nawet całkowicie ludzkie. Rekombinowane przeciwciała i ich fragmenty charakteryzują się bardzo wysokim powinowactwem w wiązaniu IL-18 in vivo oraz niską toksycznością. Przeciwciała, które mogą być stosowane charakteryzują się zdolnością do leczenia pacjentów przez czas wystarczający do znacznego lub całkowitego ustąpienia lub zmniejszenia stanu patologicznego lub dowolnego objawu lub grupy objawów związanych ze stanem patologicznym oraz małą toksycznością.

Przeciwciała neutralizujące można łatwo wywołać u zwierząt takich jak króliki, kozy lub myszy, przez immunizuję IL-18. Immunizowane myszy są szczególnie korzystne w dostarczaniu źródeł limfocytów B do wytwarzania hybrydoma, które z kolei są hodowane w celu wytwarzania dużych ilości przeciwciał monoklonalnych przeciwko IL-18.

Przeciwciała chimeryczne są cząsteczkami immunoglobulin charakteryzującymi się dwoma lub wieloma segmentami lub częściami, pochodzącymi od różnych gatunków zwierząt. Ogólnie region zmienny przeciwciała chimerycznego pochodzi z przeciwciała od ssaka innego niż człowiek, takiego jak mysie przeciwciało monoklonalne, a region stały immunoglobuliny pochodzi z cząsteczki ludzkiej immunoglobuliny. Korzystnie, obydwa regiony i ich kombinacja mają słabą immunogenność, co jest rutynowo sprawdzane (Elliott i in., 1994). Humanizowane przeciwciała są cząsteczkami immunoglobulin wytworzonymi technikami inżynierii genetycznej, w których mysi region stały został wymieniony na odpowiadającą część ludzką, podczas gdy region wiążący anPL 216 228 B1 tygen pozostał mysi. Powstałe myszo-ludzkie chimeryczne przeciwciało korzystnie ma obniżoną immunogenność i poprawioną farmakokinetykę u ludzi (Knight i in., 1993). Przykłady humanizowanych przeciwciał przeciwko IL-18 są opisane, na przykład, w europejskim zgłoszeniu patentowym EP 0 974 600.

Przeciwciało przeciwko IL-18 może być przeciwciałem całkowicie ludzkim. Technologia wytwarzania ludzkich przeciwciał jest szczegółowo opisana, np. w WO 00/76310, WO 99/53049, w patencie US 6,162,963 lub AU 5336100. Całkowicie ludzkie przeciwciała korzystnie są przeciwciałami rekombinowanymi, wytwarzanymi przez transgeniczne zwierzęta, np. kseno-mysz, obejmującymi wszystkie lub część Ioci czynnościowych ludzkiej Ig.

Inhibitor IL-18 może być IL-18BP lub izoformą, muteiną, białkiem fuzyjnym, funkcjonalną pochodną, aktywną frakcją lub jej kolistą permutacją. Te izoformy, muteiny, białka fuzyjne lub funkcjonalne pochodne zachowują biologiczne właściwości IL-18BP, w szczególności wiązanie IL-18 i korzystnie mają zasadniczo przynajmniej podobną aktywność do IL-18BP. Idealnie takie białka mają aktywność biologiczną, która w porównaniu z niezmodyfikowaną IL-18BP, jest nawet wyższa. Korzystne aktywne frakcje mają właściwości, które są lepsze od właściwości IL-18BP lub, które mają dodatkowe zalety, jak większa stabilność lub mniejsza toksyczność lub immunogenność lub też można je łatwiej wytwarzać w dużych ilościach lub są łatwiejsze do oczyszczania.

Sekwencje IL-18BP i jego warianty wynikające ze splicingu/izoformy można znaleźć w WO 99/09063 lub z Novick i in., 1999 (tak samo jak z Kim i in., 2000).

Funkcjonalne pochodne IL-18BP mogą być połączone z polimerami w celu poprawy właściwości białka, takich jak stabilność, okres półtrwania, biodostępność, tolerancja przez organizm ludzki lub immunogenność. Aby osiągnąć ten cel funkcjonalne pochodne mogą obejmować przynajmniej jedną resztę przyłączoną do jednej lub kilku grup funkcyjnych, które występują jako jeden lub kilka łańcuchów bocznych reszt aminokwasowych. Taką grupą funkcyjną może być glikol polietylenowy (PEG). Łączenie z PEG może być przeprowadzone znanymi metodami, opisanymi na przykład w WO 92/13095.

Dlatego inhibitory IL-18, a w szczególności IL-18BP mogą być połączone z PEG.

Inhibitor IL-18 może być białkiem fuzyjnym obejmującym całość lub część białka wiążącego IL-18, które jest połączone z całą lub częścią immunoglobuliny. Specjalista zrozumie, że wytworzone białko fuzyjne zachowuje biologiczne właściwości IL-18BP, w szczególności wiązanie do IL-18. Fuzja może być bezpośrednia lub przez krótki peptyd łączący, który może być tak krótki, jak 1 do 3 reszt aminokwasowych lub dłuższy, na przykład 13 reszt aminokwasowych. Wymieniony łącznik może być tripeptydem o sekwencji na przykład E-F-M (Glu-Phe-Met) lub 13-aminokwasową sekwencją obejmującą Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met wprowadzoną pomiędzy sekwencję IL-18BP a sekwencję immunoglobuliny. Powstałe białko fuzyjne ma lepsze właściwości, takie jak wydłużony okres trwania w płynach ustrojowych (czas półtrwania), zwiększoną aktywność swoistą, zwiększony poziom wyrażania lub jest ułatwione oczyszczanie białka fuzyjnego.

IL-18BP może być połączone ze stałym regionem cząsteczki Ig. Korzystne jest połączenie z regionami łańcucha ciężkiego, takimi jak na przykład domeny CH2 i CH3 ludzkiej IgG1. Wytwarzanie swoistych białek fuzyjnych obejmujących IL-18BP i fragment immunoglobuliny są opisane na przykład, w przykładzie 11 WO 99/09063. Inne izoformy, takie jak IgG2 lub IgG4 lub inne klasy Ig, jak na przykład IgM, IgA cząsteczek Ig są również odpowiednie do wytwarzania białek fuzyjnych. Białka fuzyjne mogą być monomerami, multimerami, hetero- lub homomultimerami.

Interferony są od dawna znane z hamującego działania na replikację wirusów i proliferację komórek. Interferon-γ na przykład odgrywa istotną rolę w promowaniu odpowiedzi odpornościowej i zapalnej. Interferon-β (IFN-β, interferon typu I) wymienia się jako odgrywający rolę przeciwzapalną.

Z tego powodu wynalazek odnosi się do zastosowania kombinacji IL-18BP oraz interferonu do wytwarzania leku do leczenia urazowych uszkodzeń mózgu.

Interferony mogą również być skoniugowane z polimerami w celu poprawy stabilności białek.

Koniugat pomiędzy interferonem-β a poliolem, glikolem polietylenowym (PEG) został na przykład opisany w WO 99/55377.

W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku, interferonem jest interferon-β (IFN-β) i bardziej korzystnie IFN-31a.

PL 216 228 B1

Inhibitor wytwarzania i/lub działania IL-18 jest korzystnie stosowany jednocześnie, kolejno lub oddzielnie z interferonem.

Czynnik martwicy nowotworu został opisany w literaturze jako mający zarówno właściwości protekcyjne jak i toksyczne w uszkodzeniu mózgu (Shohami i in., 1999). W poniższym Przykładzie 1 iniekcja TNF podana myszy do ciężkim urazie mózgu, powoduje znaczące obniżenie poziomów IL-18 w mózgu, wskazując zatem, że TNF może mieć korzystne działanie na regenerację po urazowym uszkodzeniu mózgu. Z tego powodu korzystne wykonanie wynalazku odnosi się do zastosowania IL-18BP w kombinacji z TNF do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania uszkodzeniu mózgu, do zastosowania jednocześnie, kolejno lub osobno.

Według niniejszego wynalazku korzystna jest kombinacja inhibitora IL-18 z TNF-alfa.

W kolejnym korzystnym wykonaniu wynalazku, lek ponadto obejmuje czynnik przeciwzapalny, taki jak NLPZ (niesteroidowy lek przeciwzapalny). W korzystnym wykonaniu inhibitor COX i najkorzystniej inhibitor COX-2 są stosowane w kombinacji z IL-18BP. Inhibitory COX są znane w dziedzinie. Swoiste inhibitory COX-2 są ujawnione, na przykład, w WO 01/00229. Aktywne składniki mogą być stosowane jednocześnie, kolejno lub oddzielnie.

Stres oksydacyjny, w szczególności reaktywne cząsteczki tlenu (ROS, ang. reactive oxygen species), opisano jako odgrywające rolę w patofizjologii uszkodzenia mózgu (Shohami i in., 1997).

Z tego powodu, lek do leczenia uszkodzeń CNS ponadto może obejmować przeciwutleniacz do zastosowania jednocześnie, kolejno lub oddzielnie. Wiele przeciwutleniaczy jest znanych w dziedzinie, takich jak witaminy A, C lub E lub kwas 5-aminosalicylowy lub dysmutaza nadtlenkowa.

W kolejnym korzystnym wykonaniu niniejszego wynalazku, IL-18BP jest stosowane w ilości około 0,001 do 100 mg/kg ciężaru ciała lub około 0,01 do 10 mg/kg ciężaru ciała lub około 0,1 do 3 mg/kg ciężaru ciała lub około 1 do 2 mg/kg ciężaru ciała.

W jeszcze kolejnym korzystnym wykonaniu, IL-18BP stosuje się w ilości około 0,1 do 1000 ąg/kg ciężaru ciała lub 1 do 100 ąg/kg ciężaru ciała lub około 10 do 50 ąg/kg ciężaru ciała.

Cząsteczki kwasu nukleinowego obejmujące sekwencję kodującą inhibitor IL-18, muteinę, funkcjonalną pochodną lub jej aktywną frakcję mogą być stosowane do zapobiegania i/lub leczenia uszkodzenia CNS.

Możliwe jest wykorzystanie cząsteczki kwasu nukleinowego obejmującej sekwencję wektora ekspresyjnego, np., do zastosowania w terapii genowej do dostarczania inhibitora IL-18.

Korzystnie, cząsteczka kwasu nukleinowego podawana może być podawana domięśniowo.

Do leczenia i/lub zapobiegania uszkodzeniu CNS, wektor terapii genowej zawierający sekwencję inhibitora wytwarzania i/lub działania IL-18 może być wstrzyknięty bezpośrednio do chorej tkanki, na przykład po to, aby uniknąć problemów związanych z układowym podawaniem wektorów terapii genowej, takich jak rozcieńczenie wektorów, osiąganie i naprowadzanie do komórek lub tkanek docelowych oraz działania uboczne.

Zastosowanie wektora do wywołania i/lub wzmocnienia endogennego wytwarzania inhibitora IL-18 w komórkach normalnie niemych pod względem wyrażania inhibitora IL-18 lub wyrażających niewystarczające ilości inhibitora, jest również rozważane do leczenia i/lub zapobiegania uszkodzeniom CNS. Wektory mogą zawierać funkcjonalne elementy regulacji w komórkach potrzebne do wyrażania inhibitora IL-18. Takie sekwencje lub elementy regulatorowe mogą być, na przykład, promotorami lub wzmacniaczami. Następnie sekwencje regulatorowe mogą być wprowadzone do właściwych locus w genomie, drogą rekombinacji homologicznej, w ten sposób łącząc funkcjonalnie sekwencję regulatorową z genem, którego ekspresja ma być wzbudzona lub wzmocniona. Technologia jest zwykle określana jako „Endogenna Aktywacja Genu (EGA, ang. Endogenous Gene Activation) i jest opisana np. w WO 91/09955.

Specjalista zrozumie, że z zastosowaniem tej techniki możliwe jest bezpośrednie wyłączenie ekspresji IL-18, bez zastosowania inhibitora IL-18. W tym celu element negatywnej regulacji, jak np. element wyciszający, może być wprowadzony do locus genu IL-18, prowadząc w ten sposób do obniżenia lub zablokowania ekspresji IL-18. Specjalista zrozumie, że taka „regulacja w dół lub wyciszenie ekspresji IL-18 będzie miało taki sam skutek, jak zastosowanie inhibitora IL-18 w zapobieganiu i/lub leczeniu choroby.

Ponadto możliwe jest zastosowanie komórek genetycznie zmodyfikowanych do wytwarzania inhibitora IL-18, w procesie leczenia i/lub zapobiegania uszkodzeniu CNS.

Niniejszym ujawnione zostały kompozycje farmaceutyczne, szczególnie korzystne do zastosowania w zapobieganiu i/lub leczeniu zapalnego uszkodzenia CNS, które obejmują terapeutycznie skuPL 216 228 B1 teczną ilość inhibitora IL-18 i/lub terapeutycznie skuteczną ilość interferonu i/lub farmaceutycznie skuteczną ilość TNF i/lub farmaceutycznie skuteczną ilość czynnika przeciwzapalnego i/lub farmaceutycznie skuteczną ilość przeciwutleniacza.

Jako inhibitor IL-18, kompozycja może zawierać inhibitory kaspazy-1, przeciwciała przeciwko IL-18, przeciwciała przeciwko dowolnym podjednostkom receptora IL-18, inhibitory szlaku sygnałowego IL-18, antagonistów IL-18, którzy konkurują z IL-18 i blokują receptor IL-18 i białka wiążące IL-18, izoformy, muteiny, białka fuzyjne, funkcjonalne pochodne, aktywne frakcje lub koliste permutacje wykazujące tę samą aktywność.

IL-18BP i jej izoformy, muteiny, białka fuzyjne, funkcjonalne pochodne, aktywne frakcje lub koliste permutacje, jak opisano powyżej, są korzystnymi aktywnymi składnikami kompozycji farmaceutycznych opisanych powyżej.

Interferon zawarty w kompozycji farmaceutycznej jest korzystnie IFN-beta lub IFN-alfa.

Korzystnie kompozycja farmaceutyczna może obejmować terapeutycznie skuteczną ilość TNF-alfa. Kompozycja farmaceutyczna, może ponadto obejmować jeden lub więcej inhibitorów COX.

Definicja „farmaceutycznie dopuszczalny, w założeniu obejmuje dowolny nośnik, który nie zaburza skuteczności działań biologicznych aktywnego składnika i nie jest toksyczny dla gospodarza, któremu jest podawany. Na przykład, do podawania pozajelitowego aktywne białko(ka) może być formułowane w jednostce dawkowania przystosowanej do iniekcji na podłożu takim, jak sól fizjologiczna, roztwór dekstrozy, albumina surowicy i roztwór Ringera.

Aktywne składniki kompozycji farmaceutycznej mogą być podawane różnymi drogami. Drogi podawania obejmują drogę śródskórną, przezskórną (np. postaci o powolnym uwalnianiu), domięśniową, dootrzewnową, dożylną, podskórną, doustną, śródczaszkową, nadtwardówkową, doodbytniczą, miejscową i donosową. Może być zastosowana każda inna terapeutycznie skuteczna droga podawania, na przykład, absorpcja przez nabłonek lub tkanki śródbłonka lub przez terapię genową, w której cząsteczka DNA kodująca aktywny czynnik jest podawana pacjentowi (za pomocą wektora), co powoduje wyrażanie i wydzielanie aktywnego czynnika in vivo. Dodatkowo, białko(ka) może być podawane razem z innymi składnikami biologicznie aktywnych czynników, takimi jak farmaceutycznie dopuszczalne środki powierzchniowo czynne, zaróbki, nośniki, rozcieńczalniki i substancje pomocnicze.

Do podawania pozajelitowego (np. dożylnego, podskórnego, domięśniowego) aktywne białko(ka) może być formułowane jako roztwór, zawiesina, emulsja lub liofilizowany puder w połączeniu z farmaceutycznie dopuszczalnym podłożem pozajelitowym (np. wodą, solą fizjologiczną, roztworem dekstrozy) i dodatkami podtrzymującymi izotoniczność (np. mannitol) lub stabilność chemiczną (np. konserwanty i bufory). Formulacja jest sterylizowana powszechnie stosowanymi sposobami.

Biodostępność aktywnego białka(ek) może być również poprawiona przez zastosowanie technik łączenia, które wydłużają czas półtrwania cząsteczki w organizmie człowieka, na przykład przez łączenie cząsteczki z glikolem polietylenowym, jak opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT WO 92/13095.

Terapeutycznie skuteczna ilość aktywnego białka(ek) będzie funkcją wielu zmiennych, obejmujących rodzaj antagonisty, powinowactwo antagonisty do IL-18, resztkową aktywność cytotoksyczną wykazywaną przez antagonistów, drogę podania, stan kliniczny pacjenta (włączając w to konieczność utrzymania nietoksycznego poziomu aktywności endogennej IL-18).

O „terapeutycznie skutecznej ilości mówimy wtedy, gdy podany inhibitor IL-18 powoduje zablokowanie biologicznej aktywności IL-18. Dawka podana jednorazowo lub kilkakrotnie, będzie zależeć od wielu różnych czynników, włączając w to właściwości farmakokinetyczne inhibitora IL-18, drogę podania, stan pacjenta i jego charakterystykę (płeć, wiek, ciężar ciała, zdrowie, wzrost), nasilenie objawów, prowadzone równolegle inne rodzaje leczenia, częstotliwość leczenia i pożądane efekty. Dobór i operowanie ustalonymi zakresami dawek leży w zakresie możliwości specjalisty w zakresie metody, tak samo jak sposoby in vitro i in vivo określenia zahamowania IL-18 u osobnika.

Inhibitor IL-18 może być stosowany w ilości około 0,0001 do 100 mg/kg ciężaru ciała lub około

0,01 do 10 mg/kg ciężaru ciała lub około 0,1 do 5 mg/kg ciężaru ciała lub około 1 do 3 mg/kg ciężaru ciała lub około 1 do 2 mg/kg ciężaru ciała. Alternatywnie, inhibitory IL-18 mogą być podawane w ilościach około 0,1 do 1000 ąg/kg ciężaru ciała lub około 1 do 100 ąg/kg ciężaru ciała lub około 10 do ąg/kg ciężaru ciała.

PL 216 228 B1

Korzystną drogą podania jest droga podskórna. Ponadto korzystne jest podawanie domięśniowe. W celu podania inhibitora IL-18 bezpośrednio do miejsca jego działania, korzystne jest również jego podawanie drogą doczaszkową lub podoponową. Droga doczaszkowa jest szczególnie korzystna w połączeniu z otwartym urazem głowy (penetrującym urazem mózgu).

W kolejnym korzystnym wykonaniu, inhibitor IL-18 jest podawany codziennie lub co drugi dzień.

Dawka dzienna jest zwykle podawana w dawkach podzielonych lub w postaciach, z których jest uwalniana w sposób ciągły tak, by uzyskać pożądane wyniki. Drugie lub kolejne podanie można przeprowadzić z taką samą dawką, mniejszą lub większą niż dawka początkowa lub poprzednia podana osobnikowi. Drugie lub kolejne podanie może być wykonane podczas lub przed wystąpieniem choroby.

Inhibitor IL-18 może być podawany osobnikowi profilaktycznie lub terapeutycznie, przed, jednocześnie lub kolejno z innymi schematami lub czynnikami leczniczymi (np. terapia wielolekowa) w ilości terapeutycznie skutecznej, szczególnie z interferonem i/lub TNF i/lub innym czynnikiem przeciwzapalnym, takim jak inhibitor COX i/lub przeciwutleniacz. Zależnie od uszkodzenia mózgu powinno być rozpatrzone wspólne podawanie antagonisty i TNF zamiast samego TNF (Shohami i in., 1999). Aktywne czynniki, które są podawane jednocześnie z innymi czynnikami leczniczymi można podawać w tej samej lub innej kompozycji.

Sposób wytwarzania kompozycji farmaceutycznej obejmuje zmieszanie skutecznej ilości inhibitora IL-18 i/lub interferonu i/lub antagonisty TNF i/lub inhibitora COX z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.

PRZYKŁADY

Materiały i Sposoby

Model urazu

W tym badaniu zastosowano samce myszy w wieku 8-16 tygodni, ważące 30-35 g. Hodowano je w swoistym, wolnym od patogenów środowisku, w standardowych warunkach temperatury i dostępu światła w klatkach po 4-6 zwierząt i zaopatrywano je w karmę i wodę ad libitum. Badanie przeprowadzono zgodnie ze wskazówkami Institutional Animal Care Committee Uniwersytetu Hebrew z Jerozolimy, Izrael. Doświadczenie CHI przeprowadzono stosując, wcześniej opracowany (Chen i in., 1996), zestaw do upuszczania ciężarków. Po indukcji znieczulenia eterem, wykonano pośrodkowe podłużne nacięcie, odsunięto skórę i odsłonięto czaszkę. Lokalizowano okolicę czołową przednią i umieszczano tam teflonowy gwóźdź 1 mm od linii pośrodkowej, w środkowej części płaszczyzny wieńcowej. Głowę unieruchamiano i 75 g ciężarek spuszczano na gwóźdź z wysokości 18 cm, powodując ogniskowe uszkodzenie lewej półkuli. Po urazie, mysz otrzymywała podtrzymująco 100% O2, nie dłużej niż 2 minuty i była przenoszona z powrotem do swojej klatki.

Ocena poziomów IL-18 w mózgach myszy

W celu pomiaru wewnątrzczaszkowych poziomów IL-18, myszy linii C57BL/6 (B6) (całkowite n=62) przypisano do sześciu odrębnych grup: (1) „kontrola normalna; nie poddawane żadnemu działaniu myszy B6 (n=10). (2) „znieczulenie eterem; myszy znieczulano eterem przez 10 minut i dekapitowano po 24 godzinach (n=10) lub po 7 dniach (n=10). (3) „pozornie operowane; te myszy przeszły znieczulenie oraz podłużne przecięcie skóry na głowie, a uśmiercano je po 24 godzinach (n=15) lub po 7 dniach. (4) „grupa urazu”; doświadczalne CHI przeprowadzono w sposób opisany powyżej i zwierzęta dekapitowano w znieczuleniu eterowym po 4 godzinach (n=7), po 24 godzinach (n=7) i po 7 dniach (n=7) od urazu. (5) „iniekcja TNF; w celu oceny możliwej roli TNF w regulacji wewnątrzczaszkowej IL-18, myszy znieczulano, podawano im do komór mózgowych (i.c.v.) 200 ng mysiego rekombinowanego TNF (R&D Systems, Abingdon, Wielka Brytania) w 10 μl jałowej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i uśmiercano po 24 godzinach (n=10). (6) „próbna iniekcja”; tym zwierzętom podawano i.c.v. tylko substancję pomocniczą (10 μl jałowego PBS) i uśmiercano po 24 godzinach (n=6), jako kontrolnej grupie dla zwierząt, które otrzymały TNF. U wszystkich myszy, mózgi usuwano natychmiast po dekapitacji, szybko mrożono w płynnym azocie i przechowywano w -70°C aż do czasu badania. Mózgi z grupy urazu dzielono na lewą (ipsilateralną) i prawą (kontralateralną) półkulę, celem umożliwienia porównania poziomów IL-18 w półkuli uszkodzonej w stosunku do nieuszkodzonej. Homogenizację tkanki przeprowadzono za pomocą Polytron (Kinematica, Kriens, Szwajcaria), stosując rozcieńczenie 1:4 w buforze ekstrakcyjnym o temperaturze lodu (W/W), zawierającym Tris 50 mM (pH 7,2), NaCl 150 mM, Triton-X100 1% (Boehringer Mannheim, Rotkreuz, Szwajcaria) i koktail inhibiPL 216 228 B1 torów proteazy (Boehringer Mannheim). Homogenat wytrząsano w lodzie przez 90 minut, a następnie wirowano przez 15 minut przy 3000 g w 4°C. Supernatant dzielono na równe objętości do probówek i przechowywano w -70°C do czasu badania. Stężenie białka całkowitego w ekstraktach mózgu mierzono testem Bradforda (Bio Rad Laboratories, Monachium, Niemcy) i stwierdzono, że było ono bardzo stałe u wszystkich ocenianych myszy (12,1 ± 2,1 mg/ml; średnia ± SD). Pomiar wewnątrzmózgowych poziomów cytokin przeprowadzano metodą ELISA swoiście dla mysiej IL-18, według instrukcji wytwórcy (R&D Systems, Abingdon, Wielka Brytania). Czułość testu wynosiła 5 pg/ml. Dla porównania wewnątrzmózgowych poziomów IL-18 pomiędzy różnymi grupami zwierząt, wszystkie stężenia poniżej progu wykrywalności 5 pg/ml przyjmowano za wynoszące 4,9 pg/ml. Próbki testowano nierozcieńczone w podwójnych studzienkach i ostateczne stężenie obliczano ze średniej OD podwójnych próbek. OD było określone za pomocą spektrofotometru (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA) dla ekstynkcji o długości fali 405 nm.

Protokół podawania IL-18BP

Do badań nad IL-18BP zastosowano samce myszy rasy Sabram, linii Uniwersytetu Hebrew (n=40). Znieczulenie i doświadczalne CHI przeprowadzono w sposób opisany powyżej. Zgodnie z protokołem podawania, myszy podzielono na dwie grupy: W grupie A („grupa kontrolna, n=16), myszy poddawano doświadczalnemu CHI, po godzinie od urazu podawano im samą substancję pomocniczą (PBS) i obserwowano przez 7 dni celem oceny neurologicznej (patrz poniżej). W grupie B („grupa badana, n=18) myszom podawano i.p. 50 ąg IL-18BP natychmiast po określeniu wyniku neurologicznego po t=1 godzina od CHI. Ponieważ przepuszczalność bariery krew-mózg wzrasta 5-6-krotnie po CHI, jak określono wcześniej w tym samym modelu (Chen i in., 1996), IL-18BP jest dostępna w mózgu w tych warunkach. Dwie dodatkowe grupy myszy traktowano według protokołu grup A i B (odpowiednio grupa C: „grupa kontrolna; grupa D: „grupa badana) i dekapitowano po 48 godzinach, po czym wycinano mózg dla oceny pourazowego obrzęku, jak opisano poniżej.

Ocena ubytków neurologicznych

Aby dokonać oceny ubytków neurologicznych po urazie, najpierw opracowano i zatwierdzono Skalę Nasilenia Objawów Neurologicznych (NSS) (Stahel i in., 2000).

Skala składa się z 10 pojedynczych klinicznych zadań z zakresu funkcji motorycznych, uwagi i fizjologicznego zachowania, w której 1 punkt przyznaje się za niewykonanie zadania i 0 punktów za wykonanie (tabela 4). Maksymalny NSS 10 punktów wskazuje na ciężką dysfunkcję neurologiczną, z niezaliczeniem wszystkich zadań, podczas gdy wynik 0 jest osiągany przez zdrową, nieokaleczoną mysz. NSS godzinę po urazie odzwierciedla wstępne nasilenie urazu i jest silnie związane z rokowaniem klinicznym (Beni-Adani i in., 2001). Ocena wykonania zadań była dokonywana przez dwóch badaczy, którzy nie znali grup badawczych, 1 godzinę, 24 godziny, 72 godziny i 7 dni po doświadczalnym CHI. ANSS obliczona jako różnica NSS dla t=1 godzina i NSS w dowolnym późniejszym czasie, jest parametrem odzwierciedlającym stopień samoistnej 10 poprawy po urazie mózgu, jak opisano wcześniej (Chen i in., 1996)

TABELA 4: Skala Nasilenia Objawów Neurologicznych (NSS) dla myszy z urazem głowy.

Zadanie	Opis	Punkty za wykonanie/niewykonanie
Wyjście z koła	Zdolność i inicjatywa do wyjścia z koła o średnicy 30 cm w ciągu 3 minut	0/1
Porażenie pojedynczej kończyny lub kończyn na jednym poziomie	Porażenie kończyny górnej i/lub dolnej po stronie kontralateralnej	0/1
Marsz po prostej	Koncentracja, inicjatywa i zdolność ruchowa do maszerowania na wprost	0/1
Odruch przerażenia	Odruch wrodzony; mysz powinna się wystraszyć w odpowiedzi na głośne klaśnięcia	0/1
Odruch szukania	Fizjologiczne zachowanie polegające na przejawach „zainteresowania środowiskiem	0/1
Równowaga na belce	Zdolność do zachowania równowagi na belce o szerokości 7 mm przynajmniej przez 10 sekund	0/1

PL 216 228 B1

Równowaga na okrągłym pręcie	Zdolność do zachowania równowagi na okrągłym pręcie o średnicy 5 mm przez 10 sekund	0/1
Marsz po belce: 3 cm	Zdolność do przejścia 30 cm wzdłuż belki o szerokości 3 cm	0/1
Marsz po belce: 2 cm	Takie samo zadanie; zwiększony poziom trudności przez 2 cm szerokość belki	0/1
Marsz po belce: 1 cm	Podobnie, zwiększony poziom trudności przez 1 cm szerokość belki	0/1
Maksymalny wynik		10

Ocena obrzęku mózgu

Zasięg obrzęku mózgu badano określając zawartość wody w tkance, w uszkodzonej półkuli, jak opisano wcześniej (Chen i in., 1996). Krótko, mysz znieczulano w sposób opisany powyżej 48 godzin po urazie, to jest w chwili czasu odpowiadającej ciągle znaczącemu obrzękowi w tym układzie modelowym (Chen i in., 1996). Po dekapitacji, móżdżek i pień mózgu usuwano i preparowano z ~20 mg części korowej, z okolicy graniczącej z miejscem urazu i jej kontralateralnego odpowiednika. Prawa (nieuszkodzona) półkula była stosowana jako kontrola wewnętrzna. Skrawki tkanki ważono i suszono przez 24 godziny w 95°C. Po zważeniu „suchych przekrojów, procentową zawartość wody w mózgu obliczano jako:

% H2O=[(ciężar wilgotnej - ciężar suchej) x 100]/ciężar wilgotnej

Pacjenci z urazem mózgu

Do tego badania zostało włączonych dziesięciu pacjentów z izolowanym, ciężkim CHI (średni wiek ±SD: 37 ± 10 lat; zakres 24-57 lat; 9 mężczyzn i jedna kobieta) przyjętych na oddział urazowy Uniwersyteckiego Szpitala w Zurichu. Wszyscy pacjenci mieli wynik w Skali Śpiączki Glasgow (GCS) < 8 po resuscytacji krążeniowo-oddechowej (Teasdale i Jennett, 1974). Po wykonaniu badania TK, wszyscy pacjenci mieli założony wewnątrzkomorowy cewnik do leczniczego drenażu CSF, gdy ciśnienie wewnątrzczaszkowe (ICP) przekraczało 15 mm Hg. Żaden pacjent nie był leczony steroidami. Rokowanie indywidualne oceniano stosując Skalę Rokowania Glasgow (GOS) (Jennett i Bond, 1975). Protokół zbiórki CSF i surowicy został zaaprobowany przez Ethics Board Committee Szpitala Uniwersyteckiego w Zurichu.

Zbieranie próbek i analiza IL-18

Próbki CSF i odpowiadające próbki surowicy pacjentów z CHI (n=10) zbierano codziennie o określonej porze dnia. Kontrolny CSF zbierano od pacjentów przechodzących diagnostyczne nakłucie lędźwiowe (n=5). Ci pacjenci nie mieli objawów choroby zapalnej CNS, w oparciu o normalną zawartość białka, glukozy i komórek (dane nie przedstawione). W grupie CHI, próbki zbierano przez 10 dni po urazie, chyba, że cewnik komorowy usuwano wcześniej np. w przypadku, gdy ICP pozostawało w normalnym zakresie (< 15 mm Hg) dłużej niż 24 godziny. Ogólnie zebrano 106 odpowiadających sobie próbek CSF i surowicy od pacjentów poddanych temu badaniu. Wszystkie próbki natychmiast po pobraniu wirowano, rozdzielano do probówek w równych objętościach i mrożono w -70°C do czasu badania. Pomiar poziomów IL-18 w CSF i surowicy przeprowadzano metodą ELISA swoistą dla ludzkiej IL-18, stosując osiągalny w handlu zestaw (R&D Systems, Abingdon, Wielka Brytania). Tak jak w przypadku mysiego testu, czułość metody ELISA wynosiła 5 pg/ml. Ostatecznie stężenie IL-18 obliczano ze średniej OD określonej na podwójnej próbce dla ekstynkcji o długości fali 405 nm. Dla porównania poziomów IL-18 w CSF pomiędzy pacjentami z CHI i kontrolnymi, wszystkie stężenia poniżej progu wykrywalności 5 pg/ml przyjmowano za wynoszące 4,9 pg/ml.

Analiza danych

Analizę statystyczną danych przeprowadzono za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania (SPSS 9.0 dla Windows™). Dla danych, które nie miały rozkładu normalnego, takich jak wyniki neurologiczne (NSS i ANSS) zastosowano nieparametryczny U-test Mann-Whitney. Niesparowany test t Studenta zastosowano do porównania wewnątrzmózgowych stężeń IL-18 w różnych grupach myszy i do analizy różnic w zawartości wody w mózgach myszy traktowanych IL-18BP, w porównaniu z myszami traktowanymi substancją pomocniczą. Porównanie poziomów ludzkiej IL-18 albo w codziennych próbkach CSF w stosunku do odpowiadających im próbek surowicy, albo w CSF pourazoPL 216 228 B1 wym w stosunku do kontrolnego, określono stosując ogólny liniowy model dla powtarzanych pomiarów ANOVA. Wartość p < 0,05 uznawano za statystycznie istotną.

Wyniki

P r z y k ł a d 1: Wewnątrzmózgowe poziomy IL-18 u myszy

Jak przedstawiono na Fig. 1, IL-18 wykrywano za pomocą ELISA w homogenatach mózgów myszy kontrolnych linii B6 (n=10), nie poddanych żadnemu działaniu („normalnych) ze średnim poziomem 27,7 ± 1,7 [± SEM] ng/ml. W grupach eksperymentalnych, samej indukcji znieczulenia eterowego lub w połączeniu z pozorną operacją (tj. znieczulenie eterowe i podłużne nacięcie skóry na głowie) stwierdzono istotnie podwyższone wewnątrzczaszkowe poziomy IL-18 odpowiednio 48,9 ±1,1 ng/ml (grupa „eterowa n=8) i 54,3 ±2,7 ng/ml (grupa „pozorna, n=13) (p<0,01 vs. myszy „normalne, niesparowany test t Studenta; Fig. 1). Różnice pomiędzy zwierzętami „eterowymi i „pozornie traktowanymi nie były statystycznie istotne (p=0,16).

W grupie urazu (n=21), wywołanie CHI powodowało wzrost poziomów IL-18 zarówno w uszkodzonej jak i kontralateralnej półkuli w ciągu 4 godzin (odpowiednio 60,6 ± 3,3 i 59,8 ± 5,0 ng/ml) do 24 godzin (odpowiednio 56,9 ± 2,1 i 56,3 ± 3,7 ng/ml) po urazie, jednakże poziomy nie były w sposób statystycznie istotny wyższe w porównaniu do grupy „eterowej lub „pozornej (p>0,05).

W przeciwieństwie do tego, po 7 dniach od CHI, wykryto istotne zwiększenie wewnątrzmózgowego stężenia IL-18 w uszkodzonej półkuli, w porównaniu zarówno do znieczulonych lub pozornie-operowanych (odpowiednio 67,6 ± 5,1 ng/ml wobec 42,2 ± 0,8 i 45,2 ± 0,5 ng/ml; p<0,01), podczas gdy poziomy IL-18 w półkuli kontralateralnej nie były istotnie zwiększone w stosunku do tych z grup kontrolnych (63,2 ± 6,0 ng/ml; p=0,06).

W celu zbadania roli TNF, kluczowego mediatora zapalnego w tym modelu urazu (Shohami i in., 1999), w odniesieniu do regulacji wewnątrzmózgowych poziomów IL-18, dodatkowej grupie zwierząt B6 (n=10) podano i.c.v. 200 ng mysiego rekombinowanego TNF w 10 μl jałowego PBS i uśmiercono po 24 godzinach. Jak pokazano na Fig. 1, „pozorna iniekcja z samej substancji pomocniczej (n=6) powodowała istotny wzrost wewnątrzmózgowego IL-18 w ciągu 24 godzin, w porównaniu do normalnych myszy B6 (53,6 ± 3,9 wobec 27,7 ± 1,7 ng/ml; p<0,001).

Iniekcja TNF powodowała istotne zmniejszenie poziomów IL-18 w przedziale wewnątrzczaszkowym w ciągu 24 godzin (22,1 ± 6,9 ng/ml; n=10), w porównaniu do grupy kontrolnej z „pozorną iniekcją po 24 godzinach (53,6 ± 3,9 ng/ml; p<0,001). Poziomy IL-18 były w „grupie TNF niższe nawet od tych w grupie myszy kontrolnych nie poddanych żadnym działaniom (27,7 ± 1,7 ng/ml), chociaż w tym przypadku nie było różnic statystycznie istotnych (p=0,45).

P r z y k ł a d 2: Wpływ leczenia IL-18BP na odzyskanie funkcji neurologicznych po urazie.

Celem sprawdzenia hipotezy, że zablokowanie IL-18 mogłoby ułatwiać zdrowienie po urazach mózgu, porównywano poprawę w różnych momentach po pojedynczej iniekcji IL-18BP. Uprzednio pokazano, że wynik w Neurologicznej Skali Nasilenia Objawów (NSS) w 1 godzinie po urazie odzwierciedla najdokładniej rozmiary urazu i koreluje z objętością uszkodzonej tkanki widocznej w MRI i histologicznie.

W celu uzyskania grup zwierząt z porównywalnym urazem, myszy zostały przypisane do różnych grup leczenia po wstępnej ocenie ich NSS w t = 1 godzina. Jak przedstawiono na Fig. 2 (NSS in IL-18BP (kwadraty) wobec kontroli (kółka), obie grupy miały podobny wstępny NSS(1h) (odpowiednio kontrola i IL- 18BP: 7,69 ± 0,3023 i 7,44 ± 0,3627) wskazując na porównywalność uszkodzenia.

Ocena NSS w późniejszych okresach (1-7 dni) wykazała, że zwierzęta leczone dootrzewnowo (i.p.) IL-18BP wykazują znacznie mniej nasilone ubytki neurologiczne, jak widać poprzez wartości NSS, które wykazują znamienność statystyczną w 7 dniu po urazie (p=0,045).

Obliczono stopień poprawy, wyrażony jako ANSS (t) = NSS (1h) - NSS (t). Wysokie wartości ANSS wskazują na większą poprawę, a zerowe lub ujemne odzwierciedlają brak poprawy lub pogorszenie. Fig. 3 przedstawia wartości ANSS dla dwóch grup. W dwóch momentach, zarówno po 24 godzinach jak po 7 dniach różnice pomiędzy osiąganymi wartościami ANSS były statystycznie istotne.

Kolejny eksperyment przeprowadzono w celu zbadania czy leczenie IL-18BP 3 dni po urazie będzie skuteczne. Podanie ram czasowych dla leczenia jest krytycznie ważne, bo jak do tej pory leczenie okazywało się skuteczne, gdy stosowane je w ciągu kilku godzin. Ponieważ wykazano, że sama IL-18 podnosi swój poziom w 7 dniu od urazu i leczenie w 1 godzinę od urazu daje największy skutek również w 7 dniu po urazie, zdecydowano się w tym momencie leczyć mysz 3 dni po urazie.

PL 216 228 B1

Grupie kontrolnej podawano jedynie rozpuszczalnik (substancja pomocnicza).

Wyniki tego eksperymentu przedstawiono na Fig. 4, na której jasno widać, że leczenie pojedynczą dawką w 3 dniu jest tak skuteczne, jak to z podaniem godzinę po CHI i ponowne po 3 dniach.

Ten eksperyment pokazuje jak bardzo korzystne może być pojedyncze podanie IL-18BP, albo godzinę albo 3 dni po zamkniętym urazie głowy w doświadczalnym modelu u myszy.

P r z y k ł a d 3. Podwyższone poziomy IL-18 w CSF po urazie mózgu u człowieka

Poziomy IL-18 były oceniane codziennie w CSF i próbkach surowicy od pacjentów z ciężkim

CHI, do 10 dni po urazie.

Dane demograficzne i kliniczne pacjentów przedstawiono w Tabeli 5.

TABELA 5. Dane demograficzne i kliniczne pacjentów z ciężkim CHI^a

Nr pacjenta	Wiek (lata) /płeć	GCSb	GOSc	IL-18 w CSFd (pg/ml) mediana	[zakres]e	IL-18 w surowicy (pg/ml) mediana	[zakres]®
1	48 / m	3	1	283	[78-966]	57,5	[12-66]
2	31 / m	7	4	228,4	[22-745]	19,7	[4,9-108]
3	26 / m	5	3	208,5	[20-392]	37,2	[14-163]
4	57 / m	5	4	72,6	[30-286]	48,9	[14-104]
5	24 / m	4	5	32,6	[4,9-155]	17	[4,9-58]
6	36 / m	8	1	49,4	[10-290]	16,7	[12-67]
7	38 / f	3	4	17,9	[11-100]	13	[4,9-46]
8	35 / m	3	3	69,8	[4,9-329]	19,8	[7-77]
9	37 / m	3	4	37	[23-75]	57,3	[25-98]
10	41 / m	7	5	4,9	[4,9-169]	26,2	[15-38]
kontrolny CSF (n=5)	4,9	[4,9-7,8]

^aCHI, zamknięty uraz głowy ^bCGS, Skala Śpiączki Glasgow (Teasdale i Jeanett, 1974) ^cGOS = Skala Rokowania Glasgow 3 miesiące po urazie; 5 = bez objawów, 4 = umiarkowana niestabilność, 3 = ciężka niestabilność, 2 = przetrwały stan wegetatywny, 1 = śmierć (Jennett i Bond, 1975), ^dCSF = płyn mózgowo rdzeniowy, ^e Poziomom IL-18 poniżej progu wykrywalności 5 pg/ml przypisano wartość 4,9 pg/ml

Jak przedstawiono w Tabeli 5, podtwardówkowe poziomy IL-18 są znacząco podwyższone u 9/10 pacjentów z CHI, w porównaniu do CSF od 5 pacjentów bez urazu lub zapalnej choroby neurologicznej (p<0,05; powtarzalne pomiary ANOVA). Tylko jeden pacjent (#10) miał poziomy IL-18 w CSF, które nie były znacząco podwyższone w porównaniu do kontrolnych CSF (p=0,31). Mediany poziomów i indywidualne zakresy IL-18 w CSF pokazano w Tabeli 5.

W szczególności, maksymalne stężenie IL-18 w CSF (966 ng/ml) było 200-krotnie wyższe u pacjentów z urazem głowy niż w kontroli.

Wewnątrzmózg owa IL-18 była wykrywalna metodą ELISA w 90% próbek z grupy urazu, podczas gdy tylko 40% próbek kontrolnych CSF zawierało wykrywalne poziomy wewnątrzmózgowej IL-18 (tj., > 4,9 ng/ml). U 8/10 pacjentów, mediana stężeń IL-18 była znacząco wyższa w CSF niż w surowicy, (p<0,05; powtarzalne pomiary ANOVA). Jakkolwiek, u dwóch pacjentów (# 9,10) mediana poziomów IL-18 w surowicy osiągnęła wartości porównywalne do stężeń w CSF, jak przedstawiono w tabeli 5.

Te wyniki pokazują, że poziomy IL-18 są znacząco podwyższone w płynie mózgowordzeniowym pacjentów z urazowym uszkodzeniem mózgu. Podanie IL-18BP może obniżyć te podwyższone poziomy i może w ten sposób wykazać swój korzystny wpływ na poprawę po zamkniętym urazie głowy, jak wykazano w powyższym przykładzie 2.

PL 216 228 B1

LITERATURA

1. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res.,

25:389-3402, 1997

2. Chater, K. F. et al., in Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), str. 45-54).

3. Chen, Y., S. Constantini, V. Trembovler, M. Weinstock, and E. Shohami. 1996. An experimental model of closed head injury in mice: pathophysiology, histopathology, and cognitive deficits. J. Neurotrauma 13:557-68

4. Conti, C.B., N.Y. Calingasan, Y. Kim, H. kim, Y. Bae, E. Gibson, and T.H. Joh. 1999. Cultures of astrocytes and microglia express interleukin-18. Mol. Brain Res. 67:46-52

5. Conti, B., J. W. Jahng, C. Tinti, J. H. Son, and T. H. Joh. 1997. Induction of interferon-gamma inducing factor in the adrenal cortex. J. Biol. Chem. 272:2035-2037.

6. Culhane, A.C, M.D. Hall, N.J. Rothwell, and G.N. Luheshi. 1998. Cloning of rat brain interleukin-18 cDNA. Mol. Psychiatry 3:362-6

a. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984.

7. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E and Karin, M. (1997), Nature 388, 16514-16517.

8. Elliott, M.J., Maini, R.N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H., and Woody, J.N., 1994, Lancet 344, 1125-1127.

9. Fassbender, K., O. Mielke, T. Bertsch, F. Muehlhauser, M. Hennerici, M. Kurimoto, and S. Rossol.

1999. Interferon^-inducing factor (IL-18) and interferon-γ in inflammatory CNS diseases. Neurology 53:1104-6

10. Jander, S., and G. Stoll. 1998. Differential induction of interleukin-12, interleukin-18, and inter^^^β coverting enzyme mRNA in experimental autoimmune encephalomyelitis of the Lewis rat. J. Neuroimmunol. 91:93-9

11. Lancet 1975 Mar 1;1 (7905) :480-4. Jennett B, Bond M.

12. Izaki, K. (1978) Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742).

13. Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinarello CA. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97:1190-1195.

14. Kossmann, T., P.F. Stahel, P.M. Lenzlinger, H. Redl, R.W. Dubs, O. Trentz, G. Schlag, and M.C. Morganti-Kossmann. 1997. Interleukin-8 released into the cerebrospinal fluid after brain injury is associated with blood brain-barrier dysfunction and nerve growth factor production. J. Cereb. Blood Flow Metab. 17:280-9

15. Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, Scallon B, Moore MA, Vilcek J, Daddona P, et al. Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody. Mol Immunol 1993 Nov 30:16 1443-53

16. Maliszewski, C. R., T. A. Sato, T. Vanden Bos, S. Waugh, S. K. Dower, J. Slack, M. P. Beckmann, and K. H. Grabstein. 1990. Cytokine receptors and B cell functions. I. Recombinant soluble receptors specifically inhibit IL-1- and IL-4-induced B cell activities in vitro. J. Immunol.

144:3028-3033.

17. Micallef, M. J., T. Ohtsuki, K. Kohno, F. Tanabe, S. Ushio, M. Namba, T. Tanimoto, K. Torigoe, M. Fujii, M. Ikeda, S. Fukuda, and M. Kurimoto. 1996. Interferon-gamma-inducing factor enhances T helper 1 cytokine production by stimulated human T cells: synergism with interleukin-12 for interferon-gamma production. Eur-J-Immunol 26:1647-51 issn: 0014-2980.

18. Morganti-Kossmann, M.C., P.M. Lenzlinger, V. Hans, P. Stahel, E. Csuka, E. Ammann, R. Stocker, O. Trentz, and T. Kossmann. 1997. Production of cytokines following brain injury: beneficial and deleterious for the damaged tissue. Mol. Psychiatry 2:133-6

19. Nakamura K, Okamura H, Wada Μ, Nagata K, Tamura T. Infect Immun 1989 Feb; 57(2):590-5.

20. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, and Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136.

21. Okamura H, Nagata K, Komatsu T, Tanimoto T, Nukata Y, Tanabe F, Akita K, Torigoe K, Okura T, Fukuda S, et al. Infect Immun 1995 Oct; 63(10):3966-72

PL 216 228 B1

22. Parnet, P, Garka, K E, Bonnert, T P, Dower, S K, and Sims, J E. (1996), J. Biol. Chem. 271, 3967-3970.

a. Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990

b. Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448,1988

23. Prinz, M., and U.K. Hanisch. 1999. Murine microglial cells produce and respond to interleukin18. J. Neurochem. 72:2215-8

24. J Clin Invest 1997 Feb 1; 99(3):469-74 Rothe H, Jenkins NA, Copeland NG, Kolb H.

25. Scherbel, U., R. Raghupathi, M. Nakamura, K.E. Saatman, J.Q. Trojanowski, E. Neugebauer, M.W. Marino, and T.K. McIntosh. 1999. Differential acute and chronic responses of tumor necrosis factor-deficient mice to experimental brain injury. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8721-6

26. Shohami, E., I. Ginis, and J.M. Hallenbeck. 1999. Dual role of tumor necrosis factor alpha in brain injury. Cytokine Growth Factor Rev. 10:119-30

27. Shohami, E; Beit-Yannai E., Horowitz M; Kohen R (1997): J. Cereb. Blood Flow Metab. 17, 1007-1019.

28. Teasdale G, Jennett B. Lancet 1974 Jul 13;2(7872):81-4

29. Stahel PF, Shohami E, Younis FM, Kariya K, Otto VI, Lenzlinger PM, Grosjean MB, Eugster HP, Trentz O, Kossmann T, Morganti-Kossmann MC.J Cereb Blood Flow Metab 2000 Feb; 20(2):369-80

30. Ushio S, Namba M, Okura T, Hattori K, Nukada Y, Akita K, Tanabe F, Konishi K, Micallef M, Fujii Μ, Torigoe K, Tanimoto Τ, Fukuda S, Ikeda Μ, Okamura H, Kurimoto Μ. J Immunol 1996 Jun 1; 156(11):4274-9

31. Wheeler, R.D., A.C. Culhane, M.D. Hall, S. Pickering-Brown, N.J. Rothwell, and G.N. Luheshi.

2000. Detection of the interleukin-18 family in rat brain by RT-PCR. Mol. Brain Res. 77:290-3

32. Whalen, M.J., T.M. Carlos, P.M. Kochanek, S.R. Wisniewski, M.J. Bell, R.S. Clark, S.T. DeKosky, D.W. Marion, and P.D. Adelson. 2000. Interleukin-8 is increased in cerebrospinal fluid of children with severe head injury. Crit. Care Med. 28:929-34

33. Yoshimoto T, Takeda, K, Tanaka, T, Ohkusu, K, Kashiwamura, S, Okamura, H, Akira, S and Nakanishi, K (1998), J. Immunol. 161, 3400-3407.

Claims (12)

1. Zastosowanie białka wiążącego IL-18 (IL-18BP) do wytwarzania leku do leczenia urazowych uszkodzeń mózgu, przy czym IL-18BP jest podawane w pojedynczej dawce 3 dni po urazie mózgu.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że urazowe uszkodzenie mózgu stanowi zamknięty uraz głowy.

3. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że białko wiążące IL-18 jest glikozylowane w jednym lub wielu miejscach.

4. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-3, znamienne tym, że lek ponadto zawiera interferon do jednoczesnego, kolejnego lub osobnego zastosowania.

5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że interferon jest interferonem-α lub interferonem-β.

6. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-5, znamienne tym, że lek ponadto zawiera czynnik martwicy nowotworu do jednoczesnego, kolejnego lub osobnego zastosowania.

7. Zastosowanie według zastrz. 6, znamienne tym, że czynnikiem martwicy nowotworu jest czynnik martwicy nowotworu alfa.

8. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-7, znamienne tym, że lek ponadto zawiera czynnik przeciwzapalny do jednoczesnego, kolejnego lub osobnego zastosowania.

9. Zastosowanie według zastrz. 8, znamienne tym, że czynnik przeciwzapalny jest inhibitorem COX, w szczególności inhibitorem COX-2.

10. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-9, znamienne tym, że lek ponadto zawiera przeciwutleniacz do jednoczesnego, kolejnego lub osobnego zastosowania.

11. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-10, znamienne tym, że białko wiążące IL-18 jest stosowane w ilości około 0,001 do 100 mg/kg ciężaru ciała lub około 0,01 do 10 mg/kg ciężaru ciała lub około 0,1 do 5 mg/kg ciężaru ciała lub około 1 do 3 mg/kg ciężaru ciała.

12. Zastosowanie według jednego z zastrz. 1-11, znamienne tym, że białko wiążące IL-18 jest podawane podskórnie.