ES2617084T3 - Uso de inhibidores de IL-18 para tratar o prevenir lesiones en el SNC - Google Patents

Abstract

Uso de un inhibidor de la IL-18, en donde el inhibidor de la IL-18 es una proteína que se liga a la IL-18 (IL-18 BP) para la producción de un medicamento para el tratamiento de las lesiones traumáticas del cerebro (lesión cerrada de la cabeza), administrándose la IL-18 BP en una única dosis a los tres días después de la lesión.

Description

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DESCRIPCION

Uso de inhibidores de IL-18 para tratar o prevenir lesiones en el SNC Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a las condiciones patologicas del cerebro. Mas espedficamente, se refiere a la utilizacion de un inhibidor de la IL-18 para el tratamiento y/o la prevencion de lesiones en el SNC (sistema nervioso central), en particular de las lesiones traumaticas del cerebro.

Antecedentes de la invencion

En 1989 se describio una actividad del suero, inducida por endotoxina que induda interferon y (IFN-y) obtenido a partir de celulas esplenicas de raton (Nakamura et al., 1989). Esta actividad del suero no funcionaba como un inductor directo del IFN-y sino mas bien como un coestimulante junto con IL-2 o mitogenos. Una tentativa de purificar la actividad a partir de suero de raton postendotoxina revelo una protema aparentemente homogenea de 50-55 kDa. Dado que otras citoquinas pueden actuar como coestimulantes para la produccion de IFN-y, el fracaso para neutralizar anticuerpos en IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 o TNF para neutralizar la actividad del suero sugena que se trataba de un factor distinto, en 1995, los mismos cientfficos demostraron que el coestimulante inducido por IFGN-y para la produccion de IFN-y se hallaba presente en extractos de Idgado de ratones preacondicionados con P. acnes (Okamura et at., 1995). En este modelo, la poblacion de macrofagos hepaticos (celulas de Kupffer) se expande y en estos ratones, una dosis baja de lipopolisacaridos (LPS) bacterianos que en los ratones no preacondicionados no es letal, se hace letal. El factor, denominado factor inductor de IFN-y (IGIF) y posteriormente designado como interleuquina-18 (IL-18), fue purificado hasta homogeneidad a partir de 1.200 g de tngados de raton tratados con P. acnes. Se utilizan oligonucleotidos degenerados a partir de secuencias de aminoacidos de IL-18 purificada para clonar un cADN de IL-18 murino. La IL-18 es una protema de 18-19 kDa de 157 aminoacidos, que no tienen similitudes obvias con ningun peptido en las bases de datos. Los ARNs mensajeros para IL-18 e interleuquina-12 (IL-12) se detectan facilmente en las celulas de Kupffer y en los macrofagos activados. La IL-18 recombinante induce la IFN-gamma mas potentemente que la IL-12, aparentemente a traves de una via separada (Micallef et al., 1996). De manera similar a la actividad del suero, inducida por endotoxina, la IL-18 no induce el IFN-y por sf misma, sino que funciona primariamente como un coestimulante con los mitogenos o la IL-2. La IL-18 refuerza la proliferacion de las celulas T, aparentemente por intermedio de una via dependiente de IL-2, y refuerza la produccion de citoquinas Th1 in vitro y presenta un sinergismo cuando se combina con la IL-12 en terminos de una produccion reforzada de IFN-y (Maliszewski et al., 1990).

Despues de haberse clonado una forma murina, se informo sobre la secuencia de cADN humano para la IL-18 en 1996 (Ushio et al., 1996).

Mediante la clonacion de la IL-18 a partir de tejidos afectados y habiendo estudiado la expresion genica de la IL-18, se encontro una asociacion de esta citoquina con una enfermedad autoinmune. El raton NOD (non-obese diabetic, diabetico no obeso) desarrolla espontaneamente una insulitis autoinmune y diabetes, que pueden acelerarse y sincronizarse mediante una simple inyeccion de ciclofosfamida. Se demostro que el mARN de IL-18 mediante PCR de transcriptasa inversa en el pancreas de ratones NOD durante las etapas tempranas de la insulitis. Los niveles de mARN de IL-18 aumentaron rapidamente con el tratamiento con ciclofosfamida y precedieron una elevacion en IFN-y mARN, y de la diabetes subsiguiente. Es interesante comprobar que esta cinetica mimetiza la de la IL-12-p40 mARN, resultando una estrecha correlacion de los niveles individuales de mARN. La clonacion del cADN de IL-18 a partir del ARN de pancreas seguida por secuenciacion revelo la identidad con la secuencia de IL-18 clonada a partir de celulas de Kupffer y en los macrofagos preactivados in vivo. Tambien los macrofagos de raton NOD respondieron a la ciclofosfamida con la expresion del gen de IL-18 mientras que los macrofagos de ratones Balb/c tratados en paralelo no lo hicieron. Por lo tanto, la expresion de la IL-18 se regula de manera anormal en los ratones NOD autoinmunes y esta estrechamente asociada con el desarrollo de la diabetes (Rothe et al., 1997).

La IL-18 desempena un papel potencial en la inmunorregulacion o la inflamacion por el hecho de aumentar la actividad funcional del ligando Fas sobre las celulas Th1 (Conti et al., 1997). La IL-18 tambien se expresa en la corteza adrenal por lo que podna ser un neuroinmunomodulador secretado, desempenando un rol importante en el funcionamiento del sistema inmune despues de una experiencia estresante (Chater, 1986).

In vivo, la IL-18 se forma por desdoblamiento de la pro-IL-18, y su actividad endogena parece estar relacionada con la produccion de IFN-y en la letalidad mediado por P. acnes y LPS. La IL-18 se produce a partir de su precursor por la enzima convertidora de IL-1p (enzima convertidora de la IL-1 beta, ICE, caspasa-1).

El receptor de IL-18 consiste en por lo menos dos componentes, que cooperan en la ligacion al ligando. Se encontraron sitios de liberacion de alta y baja afinidad para la IL-18 en celulas T estimuladas por IL-12 murinas (Yoshimoto et al., 1998), lo que sugiere un complejo de receptor de cadena multiple. Hasta ahora se han identificado dos subunidades de receptor, ambas pertenecientes de la familia de los receptores de IL-1 y (Parnet et al., 1996). La transduccion de la senal de la IL-18 implica la activacion de NF-kB (DiDonato et al., 1997).

Recientemente, una protema soluble provista de una elevada actividad para la IL-18 ha sido aislada a partir de orina humana, y se han descrito los cADNs humano y de raton (Novick et al„ 1999; WO 99/09063).La protema ha recibido la

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denominacion de protema que se liga a la IL-18 (IL-18BP).

Mas particularmente, en el documento WO 99/09063 se divulgan protemas que se ligan a la IL-18 y protemas homologas a IL-18BP viralmente codificadas, mutemas, derivados funcionales, fragmentos activos (ver pagina 3, lmeas 28-30), capaces de ligarse a la IL-18. Los diversos IL-18BPs pueden emplearse en el tratamiento y alivio de condiciones en las que interviene la IL-18 en un espectro muy amplio de enfermedades tales como las enfermedades autoinmunes, artritis reumatoide, esclerosis multiple, trastornos isquemicos del corazon, lesion isquemica del cerebro.

La IL-18BP no es el dominio extracelular de uno de los receptores de IL-18 conocidos, sino que se trata de una protema secretada, de circulacion normal. Forma parte de una novedosa familia de protemas secretadas. La familia incluye ademas varias protemas codificadas por Poxvirus que tienen una elevada homologfa con respecto a la IL-18BP (Novick et al, 1999). La IL-18BP se expresa constitutivamente en el bazo, forma parte de la superfamilia de las inmunoglobulinas, y presenta una limitada homologfa con respecto al receptor de IL-1 tipo II; su gen ha sido localizado en el cromosoma humano 11q13, y no se encontro un exon que codificacion para un dominio transmembrana en una secuencia genomica de 8,3 kb (Novick et al., 1999).

Cuatro isoformas humanas y dos isoformas de IL-18BP, resultantes del desdoblamiento de mARN han sido halladas en diversas bibliotecas y se las ha expresado, purificado y evaluado para establecer su ligacion y neutralizacion de las actividades biologicas de la IL-18 (Kim et al., 2000). La isoforma a de IL-18 humana (IL-18BPa) presento la maxima afinidad para IL-18 con una velocidad constante, un coeficiente de desintegracion lenta, y una constante de disociacion (K(d)) de 399 pM. La IL-18BPc comparte el dominio Ig de la IL-18BPa con excepcion de los 29 aminoacidos C terminales; el K(d) de IL-18BPc es 15 veces inferior (2,94 nM), Sin embargo, la IL-18BPa y la IL-18BPc neutralizan la IL-18 >95% con un exceso molar de dos. Las isoformas IL-18BPb e IL-18BPd carecen de un dominio Ig completo y carecen de la capacidad de ligarse a o de neutralizar la IL-18. Las isoformas IL-18BPc e IL-18BPd, que poseen el mismo dominio Ig, tambien neutralizan >95% la IL-18 con un exceso molar de dos. Sin embargo, la IL-18BPd murino, que comparte un motivo C terminal comun con la IL-18BPa humana, tambien neutraliza la IL-18 humana. Mediante modelacion molecular se identifico un gran sitio de ligacion electrostatico e hidrofobo mixto en el dominio Ig de IL-18BP, lo que podna explicar su elevada afinidad al ligando (Kim et al., 2000).

La expresion “lesion traumatica del cerebro (TBI, traumatic brain injury)”, tambien simplemente llamada lesion de la cabeza, o lesion cerrada de la cabeza (CHI, closed head injury), se refiere a una lesion del sistema nervioso central en donde existe un dano al cerebro causado por un golpe exterior a la cabeza. Suele suceder durante accidentes de automovil o de motocicleta, pero tambien puede suceder como resultado de casi ahogamiento, ataque cardfaco, accidente cerebrovascular e infecciones. Este tipo de lesion traumatica del cerebro podna habitualmente deberse a la falta de oxfgeno o de suministro de sangre al cerebro, por lo que puede recibir la denominacion de “lesion anoxica”.

Sucede una lesion cerrada de la cabeza cuando hay un golpe a la cabeza como en un accidente con vehroulos motores o una cafda. En este caso, el craneo golpea contra un objeto estacionario y el cerebro, que se halla dentro del craneo, gira y se retuerce alrededor de su eje (el tallo cerebral), lo que causa un dano localizado o difundido. Asimismo, el cerebro, que es una masa blanda rodeada por un fluido que le permite “flotar”, puede rebotar contra el craneo, resultando un mayor dano.

Puede haber un penodo de perdida de conciencia inmediatamente despues del trauma, que puede durar minutos, semanas o meses. Debido al retorcimiento y rebote, el paciente con una lesion traumatica del cerebro usualmente recibe danos o magulladuras en muchas partes del cerebro. Esto lleva la denominacion de “dano difuso”, o “lesion no por misil” (“diffuse damage” o “non-missile injury”). Los tipos de danos cerebrales que tienen lugar en las lesiones no por misiles pueden clasificarse en primarios o secundarios.

El dano cerebral primario tiene lugar en el momento de la lesion, principalmente en los sitios del impacto, en particular cuando haya una fraccion craneana presente. Las grandes contusiones pueden estar asociadas con una hemorragia intracerebral, o estar acompanados por laceraciones corticales. Las lesiones axonales difusas resultan como un resultado de las tensiones de traccion de procesos neuronales producidos por los movimientos rotacionales del cerebro dentro del craneo. Puede haber pequenas lesiones hemorragicas o danos difusos en los axones, que solamente pueden detectarse microscopicamente.

Tiene lugar un dano secundario en el cerebro como resultado de complicaciones que se desarrollan despues del momento de la lesion. Incluye la hemorragia intracraneal, el dano traumatico a las arterias extracerebrales, la herniacion intracraneal, dano hipoxico del cerebro o meningitis.

Una “lesion abierta en la cabeza” es una agresion visible a la cabeza y puede resultar de una herida por arma de fuego, un accidente o un objeto que pase a traves del craneo al interior del cerebro (“lesion al cerebro debido a misil”). Es mas probable que este tipo de lesion dane un area espedfica del cerebro.

Puede ocurrir una “lesion moderada en el cerebro” sin perdida de conciencia y posiblemente solamente una sensacion de mareo o de confusion que dure un periodo corto. Si bien la atencion medica administrada puede ser minima, las personas con una lesion cerebral sin coma pueden experimentar smtomas y deterioros similares a los experimentados por el sobreviviente de una lesion de coma.

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En respuesta al trauma pueden suceder cambios en el cerebro, que requieren una supervision para prevenir mayores danos. El tamano del cerebro aumenta frecuentemente despues de una severa lesion en la cabeza. Esto se llama “hinchazon cerebral” y tiene lugar cuando hay un incremento en la sangre que llega al cerebro. En una etapa ulterior de la enfermedad puede acumularse agua en el cerebro, lo que se llama “edema cerebral”. Tanto la hinchazon del cerebro como el edema cerebral pueden tener como resultado una excesiva presion en el craneo denominada “presion intracraneal (ICP; intracranial pressure)”.

“Coma” es un periodo prolongado de inconciencia despues de la lesion traumatica de la cabeza.

Hay varios niveles de coma. Los niveles de coma pueden medirse mediante la progresion del grado de respuesta de la persona con la lesiona en la cabeza. En la fase aguda de la lesion en la cabeza se utiliza la “Escala de Coma de Glasgow”. A medida que el paciente presenta una mejona o se estabilice, se utiliza la “Escala de Rancho los Amigos” que mide los niveles de pensamiento cognitivo (comprension y razonamiento).

Las lesiones cerebrales resultan frecuentemente en una debilidad persistente, tal como una epilepsia postraumatica, estado vegetativo persistente, o demencia postraumatica.

La lesion de la medula espinal es otro tipo de lesion en el SNC. Las lesiones de la medula espinal constituyen la mayona de las admisiones hospitalarias para paraplejia y tetraplejia. Mas del 80% se presenta como resultado de accidentes viales. Desde el punto de vista clmico se conocen dos grupos principales de lesiones: lesiones abiertas y lesiones cerradas.

Las lesiones abiertas causan un trauma directo sobre la medula espinal y en las rafces de los nervios. Las lesiones perforantes pueden causar una disrupcion extensiva y hemorragia. Las lesiones cerradas representan la mayona de las lesiones espinales y estan usualmente asociadas con una fractura/dislocacion de la columna espinal, lo que usualmente puede reconocerse mediante radiologfa. El dano en la medula depende de la amplitud de las lesiones oseas y puede considerarse en dos etapas principales: dano primario, que son las contusiones, transacciones de las fibras nerviosas y necrosis hemorragica, y danos secundarios que son el hematoma extradural, infarto, infeccion y edema.

Los efectos tardfos de los danos de la medula incluyen: degeneracion anterograda ascendente y descendente de las fibras nerviosas danadas, siringomielia postraumatica, y efectos sistemicos de paraplejia, tales como tracto urinario e infecciones del pecho, llagas de presion y degradacion muscular.

La patologfa de la lesion cerebral traumatica es muy compleja y todavfa mal entendida. Los esfuerzos de investigacion de la ultima decada han senalado un rol importante de las citoquinas liberadas sistematicamente y localmente dentro del compartimiento intratecal despues de una lesion cerebral, y se considero una hipotesis basada en los descubrimientos de los efectos beneficiosos y adversos, funcion del tiempo, de uno de estos mediadores (Morganti-Kossmann et al., 1997; Kossmann et al., 1997; Shohami et at., 1999, Scherbel et al., 1999; Whalen et al., 2000).

Shohami et al., 1997, divulga el efecto neuroprotector de tres inhibidores de TNF-a diferentes: HU-211, pentoxifilina e (PTX) y protema que se liga a TNF-a (TBP, TNF-alpha-binding protein) en las lesiones cerradas de la cabezal (CHI, closed head injury, lesion cerrada de la cabeza) y sugiere (ver pagina 175, columna derecha, los dos ultimos parrafos) que el TNF-a es un mediador primario de la neurotoxicidad en las primeras veinticuatro horas despues del trauma de cabezal y llega a la conclusion que si cada uno de estos agentes moduladores del TNF-a se administra dentro de la ventana temporal temprana poslesion, puede mejorar el desenlace neurologico final en las victimas de trauma cerebral. Por lo tanto, las ensenanzas de Shohami et al., 1997, sugieren tratar la lesion cerebral dentro de las 24 horas.

Como se describio en lo que precede, una citoquina recientemente descubierta de la familia IL-1 es la IL-18. Los estudios recientes han demostrado que la IL-18 se expresa de manera constitutiva en el SNC de ratones, ratas y seres humanos in vivo (Culhane et al., 1998; Jander and Stoll, 1998; Prinz et al., 1999; Fassbender et al., 1999; Wheeler et-al., 2000), como tambien en cultivos primarios de astrocitos y microglia, pero no en las neuronas, 5 in vitro (Conti et al., 1999). Se detectaron niveles incrementados en el fluido cerebroespinal (CSF) de pacientes con enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central, tales como la meningitis bacteriana y la meningoencefalitis viral, pero no en el CSF de pacientes de esclerosis multiple (MS) (Fassbender et al., 1999). A diferencia del descubrimiento de niveles de IL-18 intratecal en niveles finalmente bajos en pacientes de MS, se demostro una expresion incrementada de IL-18 mARN en las medulas espinales de ratas de Lewis con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), el modelo animal para MS (Jander and Stoll, 1998). La expresion y significancia funcional de la IL-18 en los neurotraumas no habfa sido investigada hasta ahora.

SfNTESIS DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere al papel patofisiologico de la IL-18 en las enfermedades del sistema nervioso central. Se basa el descubrimiento de que el tratamiento de ratones con inhibidores de la IL-18, sea al cabo de una hora o al cabo de tres dfas despues de haber experimentado una lesion experimental cerrada en la cabeza (CHI) tiene como resultado una mejor recuperacion y una amplitud atenuada del dano cerebral en comparacion con los animales de control. Por lo tanto, la invencion se refiere a la utilizacion de un inhibidor de la IL-18 para fabricacion de un

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medicamento para el tratamiento de una lesion del sistema nervioso central, y en particular de una lesion traumatica del cerebro (lesion cerrada del cerebro), en donde el inhibidor de IL-18 se administra en una unica dosis a los 3 dfas despues de la lesion.

De acuerdo con la invencion tambien se provee la utilizacion de combinaciones de un inhibidor de la IL-18 con un interferon y/o TNF y/o inhibidores de la inflamacion y/o antioxidantes.

Breve descripcion de las figuras

La Figura 1 muestra un histograma que ilustra los niveles en suero de IL-18 intracerebral (en mg/ml) en cerebro entero (lmeas oblicuas), en el hemisferio izquierdo (en negro) o en el hemisferio derecho (gris), bajo diferentes condiciones.

La Figura 2 muestra el desarrollo de NSS (Neurological Severity Score, Puntuacion de Gravedad Neurologica) medido al cabo de una hora (h); 24 h, 72 h o 168 h despues del trauma, sea con 50 |jg de IL-18BP administrado intraperitoneales, al cabo de una hora despues del trauma (cuadrados), o mediante inyeccion de vehmulo solamente (control, cmculos).

La Figura 3 muestra el ANSS medido a las 24 h, 72 h o 168 h despues del trauma, sea con 50 jg de IL-18BP administrado i.p. al cabo de una hora despues del trauma (cuadrados) o con inyeccion de vehmulos solamente (control, drculo).

La Figura 4 muestra el ANSS medido al cabo de 1 h, 24 h, 3 dfas (d), 7 d o 14 d despues del trauma, sea con 50 jg de IL-18BP administrada i.p., sea en forma de una unica dosis a los 3 d despues del trauma (rombos) o con una dosis doble a la 1 h y 3 d despues del trauma (cuadrados) o inyeccion de vehmulo solamente (control, triangulo)

Descripcion de la invencion

La presente invencion se basa el descubrimiento de un efecto beneficioso estadfsticamente significativo de un inhibidor de la IL-18 sobre la recuperacion a partir de una lesion cerebral en un modelo murino de lesion cerrada en la cabeza. De acuerdo con la presente invencion, se ha descubierto ademas que la IL-18 se regula ascendentemente en el cerebro y en el fluido cerebroespinal despues de una lesion traumatica del cerebro, lo que indica que esta citoquina proinflamatoria desempena un rol importante en la patogenesis de la lesion cerebral.

Por lo tanto, la invencion se refiere a la utilizacion de un inhibidor de la IL-18, en donde el inhibidor de la IL-18 es una protema que se liga a la IL-18, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de la lesion traumatica del cerebro.

La invencion se refiere ademas a la utilizacion de un inhibidor de la IL-18, en donde el inhibidor de la IL-18 es una protema que se liga a la IL-18, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de complicaciones y efectos tardms de una lesion traumatica del cerebro.

En una realizacion de la invencion, la lesion cerebral es de origen vascular.

Dentro del contexto de la presente divulgacion, la expresion “lesion del sistema nervioso central” o “lesion del SNC”, se refiere a cualquier lesion en el cerebro o medula espinal, independientemente de la edad de la presentacion, o de la causa subyacente. La causa subyacente puede ser mecanica, o una infeccion. La lesion del SNC y sus smtomas e implicaciones clmicos han sido descritos en detalle en Antecedentes de la Invencion. La lesion del SNC incluye por ejemplo trauma, o cualquier otro dano en el cerebro o medula espinal, y tambien puede llevar la denominacion de “neurotrauma”.

Por ejemplo, la lesion cerebral puede incluir o resultar en uno o mas de los siguientes: 1. deterioro de la atencion; 2. deterioro cognitivo; 3. deterioro del lenguaje; 4. deterioro de la memoria; 5. trastornos de conducta; 6. trastorno motor; y 6. cualquier otra disfuncion neurologica.

La lesion de la medula espinal puede resultar por ejemplo en paraplejia o tetraplejia.

Las complicaciones o efectos tardms de la lesion del SNC tambien pueden tratarse de acuerdo con la presente divulgacion. Las complicaciones y efectos tardms de las lesiones cerebrales han sido descritos en lo que precede en el capftulo “Antecedentes de la invencion”, incluyen sin limitacion: coma, meningitis, epilepsia postraumatica, demencia postraumatica, degeneracion de las fibras nerviosas, siringomielia postraumatica, o hemorragia, por ejemplo.

La presente invencion se refiere tambien a la utilizacion de los inhibidores de la IL-18 definidos en la presente para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de una lesion del cerebro que tiene un origen vascular, tal como un dano cerebral hipoxico con infarto cerebral, isquemia, accidente cerebrovascular, o ataque apoplejico.

Como se utilizan en la presente, los terminos “tratar” y “tratamiento” debe entenderse en el sentido de prevenir, inhibir, atenuar, de manera parcial o total, ocasionar una mejona en uno o mas de los smtomas o causas de una lesion del SNC, como tambien los smtomas, enfermedades o complicaciones que acompanan una lesion de sistema nervioso central, o de invertir dichos smtomas, enfermedades o complicaciones. Cuando se “trate” una lesion del SNC, las

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sustancias de acuerdo con la invencion pueden administrarse despues de la presentacion de la enfermedad. El termino “prevencion” se refiere a la administracion de las sustancias antes de que se observen smtomas de la enfermedad en el paciente.

Como se muestra en los ejemplos mas abajo, un inhibidor de la IL-18 demostro ejercer su efecto beneficioso sobre las lesiones cerebrales aun cuando se administro despues al cabo de 3 dfas despues de haber tenido lugar la lesion cerebral.

Por lo tanto, para tratar la lesion cerebral, el inhibidor de la IL-18 se administra a los tres dfas despues de la lesion.

Dentro del contexto de esta invencion, la expresion “inhibidor de la IL-18” se refiere a una protema que se liga a la IL-18 (IL-18BP).

La expresion “protema que se liga a la IL-18” se utiliza en la presente como sinonimo con “IL-18BP”. Comprende protemas que se ligan a IL-18 definidas en el documento WO 99/09063 o en Novick et al., 1999, e incluye variantes de escision y/o isoformas de protemas que se ligan a IL-18, como se define en Kim et al., 2000. En particular, las isoformas a y c de IL-18BP son utiles de acuerdo con la presente invencion. Las protemas utiles de acuerdo con la presente invencion pueden estar glicosiladas o no glicosiladas, pueden derivarse de fuentes naturales, tales como orina, o lo que es mas preferible se los puede producir recombinantemente. Las expresion recombinante puede llevarse a cabo en sistemas de expresion procariotas tales E. coli, o en sistema de expresion eucariotas, y preferiblemente en mairnferos. Una lmea de celulas bien adecuadas para los inhibidores de la IL-18 de la presente invencion es la celula de CHO (Chinese Hamster Ovary, Ovario de Hamster Chino).

La produccion recombinante del inhibidor de la IL-18, cuando se exprese de manera recombinante en celulas de marnffero o en lmeas de celulas, puede preferiblemente llevarse a cabo en un medio de cultivo de celulas libre de suero.

Tal como utiliza en la presente, el termino “mutemas” se refiere a analogos de una IL-18BP, o a analogos de una IL-18BP viral, en los que uno o mas de los residuos de aminoacidos de una IL-18BP natural o IL-18BP viral han sido reemplazados por diferentes residuos de aminoacidos, o ha sido delecionados o en los que uno o mas residuos de aminoacidos han sido anadidos a la secuencia natural de una IL-18BP, o de una IL-18BP viral, sin reducir de manera considerable la actividad de los productos resultantes en comparacion con la IL-18BP de tipo salvaje o la IL-18BP viral. Estas mutemas se preparan mediante metodos de smtesis conocidos y/o mediante tecnicas de mutagenesis dirigido a sitio, o mediante cualquier otra tecnica conocida adecuada.

Es preferible que cualquier mutema de este tipo tenga una secuencia de aminoacidos suficientemente duplicativa de la de una IL-18BP, o suficientemente duplicativa de una IL-18BP viral, de manera de tener una actividad sustancialmente similar a la de la 1L-18BP. Una de las actividades de la IL-18BP es su capacidad de ligarse a la IL-18. Siempre y cuando la mutema tenga una suficiente actividad de ligacion a la IL-18, se la puede utilizar para la purificacion de IL-18, tal como mediante cromatograffa de actividad, por lo que puede considerarse que tiene una actividad sustancialmente similar a la de la IL-18BP. Por lo tanto, puede determinarse si cualquier mutema dada tiene una actividad sustancialmente similar a la de la IL-18BP mediante experimentacion rutinaria que comprende someter una mutema de este tipo, por ejemplo, a un simple ensayo de competicion de tipo sandwich para determinar si se liga o no a una IL-18 adecuadamente etiquetada, tal como un ensayo inmunoensayo o un ensayo ELISA. En el documento WO 99/09063 se han descrito con detalle ensayos funcionales simples para evaluar la actividad biologica de la IL-18BP, por ejemplo, en los Ejemplos 2 (ligacion a la IL-18 evaluada mediante reticulacion) o 5 (inhibicion de la IL-18 inducido (induccion de NF-gamma en celulas mononucleares de la sangre).

Cualquier mutema de este tipo tiene una identidad u homologfa de por lo menos el 40% con respecto a la secuencia de una IL-18BP o de un homologo de IL-18BP viralmente codificado. Es mas preferible que tenga una identidad u homologfa de por lo menos el 60%, por lo menos el 60%, por lo menos el 70%, por lo menos el 80%, o de manera sumamente preferible de por lo menos el 90%, con respecto a la secuencia de una IL-BP o de homologo de IL-18BP viralmente codificado.

Las mutemas de polipeptidos de IL-18 o las mutemas de IL-18BP virales, que pueden utilizarse de acuerdo con la presente divulgacion, incluyen un conjunto finito de secuencias sustancialmente correspondientes como peptidos de sustitucion que una persona con la pericia habitual puede obtener de manera rutinaria, sin una experimentacion indebida, sobre la base de las ensenanzas y grnas presentadas en la presente.

Las mutemas de acuerdo con la presente divulgacion incluyen protemas codificadas por un acido nucleico, tal como ADN o ARN, que se hibrida a ADN o ARN, que codifica el inhibidor de la IL-18, de acuerdo con la presente invencion, bajo condiciones moderadamente o sumamente rigurosas. La expresion “condiciones rigurosas” se refiere a las condiciones de hibridacion y lavado subsiguientes, a los que las personas con la pericia habitual se refieren convencionalmente como “estrictas”. Ver: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 and 6.4 (1987, 1992), y Sambrook et al. (Sambrook, J. C.Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Sin limitacion, los ejemplos de condiciones rigurosas incluyen condiciones de lavado a 12-20 °C por debajo de la Tm

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calculada del hibrido en estudio, por ejemplo, 2 x SSC y 0,5% SDS durante 5 minutos, 2 x SSC y 0,1% SDS durante 15 minutes; 0,1 x SSC y 0,5% SDS a 37 °C durante 30-60 minutos y despues, a 0,1 x SSC y 0,5% SDS a 68 °C durante 30-60 minutos. Las personas con la pericia habitual comprenderan que las condiciones de estrictez tambien dependen de la longitud de las secuencias de ADN, sondas oligonucleotidicas (tales como de 10-40 bases) o son das oligonucleotidos mixtas. Si se utilizan sondas mixtas, es preferible utilizar cloruro de tetrametilamonio (TMAC, tetramethyl ammonium chloride) en lugar de SSC. Ver Ausubel, supra.

Cualquier mutema de este tipo tiene una identidad y homologfa del por lo menos el 40% con la secuencia de las SEQ ID NO: 1, 2 o 3 del listado de secuencias adjunto. Es mas preferible que tenga una identidad u homologfa de por lo menos el 50%, por lo menos el 60%, por lo menos el 70%, por lo menos el 80% o lo que es mas preferible, del 90% con respecto a dicha secuencia.

La identidad refleja una relacion entre dos o mas secuencias polipeptfdicas, determinadas mediante la comparacion de las dos secuencias polipeptfdicas, respectivamente, por sobre la longitud de las secuencias sometidas a verificacion.

Para las secuencias para las que no hay una correspondencia exacta, es posible terminar un “porcentaje de identidad”. En terminos generales, las dos secuencias que deben compararse se alinean de manera de obtener una maxima correlacion entre las secuencias. Esto puede incluir insertar “huelgos” en una o en ambas secuencias, para reforzar el grado de alineacion. Es posible determinar un porcentaje de identidad sobre la longitud completa de cada una de las secuencias sometidas a comparacion (denominada “ alineacion global”) que es particularmente adecuada para secuencias de la misma longitud o de una longitud muy similar, o aun longitudes definidas mas cortas (denominada longitud local), que es adecuada para secuencia de longitud desigual.

En la tecnica se conocen bien metodos para comparar la identidad y homologfa de dos o mas consecuencias. Por lo tanto, por ejemplo, pueden utilizarse los programas puestos a disposicion en el Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux J et al., 1984), por ejemplo los programas BESTFIT y GAP, para determinar la identidad porcentual entre dos polinucleotidos y el porcentaje de identidad y el porcentaje de homologfa entre dos secuencias polipeptidicas. El BESTFIT utiliza el algoritmo de “homologfa local” de Smith and Waterman (1981) y encuentra la mejor region de similitud entre dos secuencias. Otros programas para determinar la identidad y/o similitud son tambien conocidos en la tecnica, por ejemplo, la familia BLAST de programas (Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, accesible en el home page del NCBI en
www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson W R, 1990; Pearson 1988).

Los cambios preferidos para las mutemas de acuerdo con la presente divulgacion son lo que se conoce como sustituciones “conservadoras”. Las sustituciones conservadoras de aminoacidos de polipeptidos IL-18BP o de protemas o de IL-18BPs virales, pueden incluir aminoacidos sinonimos dentro de un grupo que tengan propiedades fisicoqmmicas suficientemente similares de manera que la sustitucion entre miembros del grupo preservara la funcion biologica de la molecula (Grantham, 1974). Es evidente que las inserciones y deleciones de aminoacidos tambien pueden efectuarse en las secuencias arriba definidas sin alterar su funcion, particularmente si las inserciones o deleciones implican unos pocos aminoacidos, por ejemplo, menos de 30, y preferiblemente menos de 10, y que no remuevan ni desplacen aminoacidos que son cnticos para una conformacion funcional, por ejemplo, residuos de cistema. Las protemas y mutemas producidas por tales supresiones y/o inserciones recaen dentro de los alcance de la presente divulgacion.

Es preferible que los aminoacidos sinonimos sean aquellos definidos en la Tabla 1.

Es mas preferible que los aminoacidos sinonimos sean aquellos definidos en la Tabla 2, y mas preferiblemente los aminoacidos sinonimos son aquellos definidos en la Tabla 3.

TABLA 1

Grupos preferidos de aminoacidos sinonimos

Aminoacido Grupo sinonimo

Ser Ser, Thr, Gly, Asn

Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His

Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

Pro Gly, Ala, Thr, Pro

Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr

Ala Gly, Thr, Pro, Ala

Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val

Gly

Ala, Thr, Pro, Ser, Gly

lie

Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lie

Phe

Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe

Tyr

Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr

Cys

Ser, Thr, Cys

His

Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His

Gln

Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln

Asn

Gln, Asp, Ser, Asn

Lys

Glu, Gln, His, Arg, Lys

Asp

Glu, Asn, Asp

Glu

Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu

Met

Phe, Ile, Val, Leu, Met

Trp

Trp

TABLA 2

Grupos mas preferidos de aminoacidos sinoniirios

Aminoacido

Grupo sinonimo

Ser

Ser

Arg

His, Lys, Arg

Leu

Leu, Ile, Phe, Met

Pro

Ala, Pro

Thr

Thr

Ala

Pro, Ala

Val

Val, Met, lie

Gly

Gly

Lie

Ile, Met, Phe, Val, Leu

Phe

Met, Tyr, Ile, Leu, Phe

Tyr

Phe, Tyr

Cys

Cys, Ser

His

His, Gln, Arg

Gln

Glu, Gln, His

Asn

Asp, Asn

Lys

Lys, Arg

Aspecto

Asp, Asn

Glu

Glu, Gln

Met

Met, Phe, Ile, Val, Leu

Trp

Trp

TABLA 3

Grupos mas preferidos de aminoacidos sinonimos

Aminoacido

Ser

Arg

Leu

Pro

Thr

Ala

Val

Gly

Lie

Phe

Tyr

Cys

His

Gln

Asn

Lys

Asp

Glu

Met

Trp

Grupo sinonimo

Ser

Arg

Leu, Ile, Met

Pro

Thr

Ala

Val

Gly

Ile, Met, Leu

Phe

Tyr

Cys, Ser

His

Gln

Asn

Lys

Asp

Glu

Met, Ile, Leu Met

Los ejemplos de produccion de sustituciones de aminoacidos en protemas que pueden utilizarse para obtener mutemas para obtener polipeptidos o protemas de IL-18BP, o mutemas de IL-l8BPs vales, para su utilizacion en la presente invencion, incluyen cualquier etapa de metodo conocido, tales como los presentados en las Patentes US 5 Nros. 4.959.314, 4.588.585 y 4.737.462, de Mark et al.; 5.116.943, de Koths et al., 4.965.195 de Namen et al.; 4.879.111 de Chong et al.; y 5.017.691 de Lee et al; y protemas con sustituciones de protema presentadas en la Patente US N.° 4.904.584 (Shaw et al.).

La expresion “protema fusionada” se refiere a un polipeptido que comprende un polipeptido que contiene una IL-18BP, o una IL-18BP viral, o una de sus mutemas, fusionada con otra protema, que, por ejemplo, tiene un tiempo de 10 permanencia prolongado en los cuerpos corporales. Una IL-18BP o una IL-18BP viral, puede por lo tanto estar fusionada a otra protema, polipeptido o similar, por ejemplo, una inmunoglobulina o uno de sus fragmentos.

La expresion “derivados funcionales”, tal como se utiliza en la presente, abarca derivados de IL-18BPs o de una IL-18BP viral, y sus mutemas y protemas fusionadas, que pueden prepararse a partir de los grupos funcionales que se presentan como cadenas laterales en los residuos o en los grupos N o C terminales, mediante medios conocidos en la 15 tecnica, y se hallan incluidos en la invencion siempre y cuando permanezcan siendo farmaceuticamente aceptables, es decir, que no destruyan la actividad de la protema que es sustancialmente similar a la actividad de la IL-18BP, o de las l IL-18BP virales, y que no confiera propiedades toxicas en las composiciones que las contengan.

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Estos derivados pueden incluir por ejemplo, cadenas laterales de polietilenglicol, que pueden enmascarar sitios antigenicos de una IL-18BP o de una IL- 18BP viral en los fluidos corporales. Otros derivados incluyen esteres alifaticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo por reaccion con amomaco o con amidas primarias o secundarias, derivados N-acilo de grupos amino libres de los residuos de aminoacidos formados con restos acilo (por ejemplo, grupos alcanoflo o aroflo carbodclicos) o derivados de O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo, los de grupos serilo o treonilo) formados con restos acilo.

Como “fragmentos activos” de una IL-18BP, o de una IL-18BP viral, mutemas y protemas fusionadas, la presente invencion abarca cualquier fragmento o precursores de la cadena polipeptfdica de la molecula de protema sola junto con moleculas asociadas o residuos ligados a ella, por ejemplo, azucar o residuos fosfato, o agregados de la molecula de protema o del residuo azucar por sf mismos, siempre y cuando dicha fraccion tenga una actividad sustancialmente similar a la de la IL-18BP,

El termino “sales” se refiere tanto a sales de grupos carboxilo como a sales de adicion de acido de grupos amino de la molecula inhibidora de la IL-18, o sus analogos., Las sales de un grupo carboxilo pueden formarse mediante medios conocidos en la tecnica e incluyen sales inorganicas, por ejemplo, sales de sodio, calcio, de amonio, ferricos o de zinc, y similares, y sales con bases organicas tales como aquellos formados por ejemplo con aminas, tales como trietilamina, arginina o lisina, piperidina, procama y similares. Las sales de adicion de acido incluyen por ejemplo, sales con acidos minerales, tales como por ejemplo, acido clorfudrico o acido sulfurico, y sales con acidos organicos tales como por ejemplo acido acetico y acido oxalico. Por supuesto, cualquiera de dichas sales debe conservar la actividad biologica del OPN relevante para la presente invencion, es decir, ejercer un efecto proliferante sobre los oligodendrocitos.

Las secuencias de IL-18BP y de sus variantes de escision/ isoformas pueden tomarse del documento 99/09063 o de Novick et al., 1999, como tambien de Kim et al., 2000.

Los derivados funcionales de la IL-18BP pueden ser conjugados a polfmeros para mejorar las propiedades de la protema, tales como la estabilidad, semivida, biodisponibilidad, tolerancia por el cuerpo humano, o inmunogenicidad. Para lograr este objetivo, el derivado funcional puede comprender por lo menos un resto fijado a uno o mas grupos funcionales, que se presentan en forma de una o mas cadenas laterales en los residuos de aminoacidos. Un grupo funcional de este tipo puede ser polietilenglicol (PEG). La PEGilacion puede llevarse como mediante metodos conocidos, descritos en el documento O 92/13095.

Por lo tanto, en una realizacion preferida de la presente invencion, la IL-18BP esta PEGilada.

En otra realizacion preferida de la invencion, el inhibidor de la IL-18 es una protema fusionada que comprende la totalidad o parte de una protema que se liga a una protema IL-18, que esta fusionada a la totalidad o a parte de una inmunoglobulina. La persona con pericia en especialidad comprendera que la protema de fusion resultante conserva la actividad biologica de la IL-18BP, en particular la liberacion a la IL-18. La fusion puede estar dirigida, o por intermedia de un peptido ligador corto que puede ser breve, tal como de 1 a 3 residuos de aminoacidos de longitud o mayor, por ejemplo, 13 aminoacidos de longitud. Dicho ligador puede ser un tripeptido de la secuencia E-F-M (Glu-Phe-Met), por ejemplo, o una secuencia ligadora de 13 aminoacidos que comprende Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met introducido entre la secuencia de IL-18BP y la secuencia de inmunoglobulina. La protema de fusion resultante tiene propiedades mejoradas, tales como un tiempo de residencia prolongado en los fluidos corporales (semivida), una mayor actividad espedfica, un nivel de expresion incrementado, o se facilita la purificacion de la protema de fusion.

En una realizacion preferida, la IL-18BP esta fusionada a la region constante de una molecula de Ig. Es preferible que este fusionada a regiones de cadena pesada tales como los dominios CH2 y CH3 de la IgG1 humana, por ejemplo. La generacion de protemas de fusion espedficas que comprenden IL-18BP y una porcion de una inmunoglobulina se explico en el Ejemplo 11 de WO 99/09063, por ejemplo. Otras isoformas de molecula de Ig son tambien adecuadas para la generacion de protemas de fusion de acuerdo con la presente invencion, tal como las isoformas lgG2 o lgG4, u otras clases de Ig, tales como IgM o IgA, por ejemplo. Las protemas de fusion pueden monomericas o multimericas, hetero- u homomultimericas.

Los interferones se conocen predominantemente por sus efectos inhibidores sobre la replicacion viral y sobre la proliferacion celular; el Interferon-y, por ejemplo, desempena un papel importante en la promocion de las inmunorrespuestas y de las respuestas inflamatorias. Se afirma que el Interferon p (IFN-p), un tipo de interferon de tipo I, desempena un papel antiinflamatorio.

Por lo tanto, la invencion se refiere tambien a la utilizacion de una combinacion de una IL-18BP con un interferon en la fabricacion de un medicamento para tratamiento de las lesiones cerebrales traumaticas.

Los interferones tambien pueden conjugarse a polfmeros para mejorar la estabilidad de las protemas. Un conjugado entre el interferon p y el poliol polietilenglicol (PEG)) ha sido descrito en el documento WO 99/55377, por ejemplo.

En otra realizacion preferido de la invencion, el interferon es interferon p (IFN-p), mas preferiblemente IFN-p 1a.

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La IL-18BP se utiliza preferiblemente al mismo tiempo, secuencialmente o por separado con el interferon.

El factor de la necrosis de los tumores ha sido descrito en la literatura y tiene efectos tanto protectores como toxicos en las lesiones cerebrales (Shohami et al., 1999). En el siguiente Ejemplo 1, la inyeccion de TNF en ratones despues de un severo trauma cerebral resulto en una disminucion significativa de los niveles de IL-18 en el cerebro, lo que indica que el TNF Puede tener un efecto beneficioso sobre la recuperacion de una lesion cerebral traumatica. Por ello, una realizacion preferida de la invencion se refiere a la utilizacion de un inhibidor de la IL-18 combinado con TNF para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de las lesiones cerebrales para uso simultaneo, secuencial o separado.

De acuerdo con la presente invencion, se prefiere la combinacion de los inhibidores de la IL-18 con TNF alfa.

En otra realizacion preferida de la invencion, el medicamento incluye ademas un agente antiinflamatorio, tal como NSAID (nonsteroidal anti-inflammatory drug, farmaco antiinflamatorio no esteroide). En una realizacion preferida, se utiliza un inhibidor COX, y mas preferiblemente un inhibidor COX-2, combinado con un inhibidor de la IL-18. Los inhibidores COX se conocen en la tecnica. Inhibidores COX espedficos se divulgan en el documento WO 01/00229, por ejemplo. Los componentes activos pueden utilizarse simultaneamente, secuencialmente, o por separado.

Se ha descrito que el estres oxidativo, en particular la ROS (reactive oxygen species, especies reactivas de oxfgeno) desempenan un papel en la patofisiologfa de las lesiones cerebrales (Shohami et al., 1997).

Por ello, en una realizacion preferida de la presente invencion, el medicamento comprende ademas un antioxidante, para su utilizacion simultanea, secuencial o separada. En la tecnica se conoce muchos ante oxidantes, tales como las vitaminas A, Co E, o el acido 5-aminosalidlico, o la superoxido dismutasa.

En otra realizacion preferida de la presente invencion, el inhibidor de la IL-18 se utiliza en la cantidad de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal o de aproximadamente 0,1 a 3 mg/kg de peso corporal o de aproximadamente 1 a 2 mg/kg de peso corporal.

Y en otra realizacion, el inhibidor de la IL-18 se utiliza en una cantidad de aproximadamente 0,1 a 1.000 g/kg de peso corporal o de 1 a 100 pg/kg de peso corporal o de aproximadamente 25 a 50 pg/kg de peso corporal.

La invencion se refiere ademas a composiciones farmaceuticas, particularmente utiles para el tratamiento de las lesiones cerebrales traumaticas inflamatorias, que comprenden una cantidad terapeuticamente efectiva de un inhibidor de la IL-18 y/o una cantidad terapeuticamente efectiva de un interferon y/o de una cantidad farmaceuticamente efectiva de TNF y/o una cantidad terapeuticamente efectiva de un agente inflamatorio y/o de una cantidad farmaceuticamente efectiva de un agente antioxidante.

El interferon comprendido en la composicion farmaceutica es preferiblemente IFN-beta o IFN-alfa.

Y en otra realizacion preferida, la composicion farmaceutica comprende cantidades terapeuticamente efectivas de TNF alfa. La composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion puede ademas comprender uno o mas inhibidores COX.

La definicion de “farmaceuticamente aceptable” tiene por objeto abarcar cualquier portador, que no interfiera con la efectividad de la actividad biologica del ingrediente activo y que no sea toxico para el anfitrion al que se lo administra. Por ejemplo, para la administracion parenteral, la o las protemas activas pueden formularse en un formato de dosis unitaria para la inyeccion en vehmulos tales como soluciones salinas, solucion de dextrosa, albumina de suero, y solucion de Ringer.

Los ingredientes activos de la composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion pueden administrarse a un individuo de diversas maneras. Las vfas de administracion incluyen la via intradermica, transdermica (por ejemplo, en formulaciones de liberacion lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutanea, oral, intracraneal, epidural, rectal, topica e intranasal.

Para la administracion parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutanea, intramuscular), la o las protemas activas pueden formularse como una solucion, suspension, emulsion o polvo liofilizado asociado con un vehmulo parenteral farmaceuticamente aceptable (por ejemplo, agua, solucion salina, solucion de dextrosa) y aditivos que mantienen la isotonicidad (por ejemplo, manitol) o estabilidad qrnmica (por ejemplo, agentes de conservacion y tampones). La formulacion se esteriliza mediante tecnicas de uso comun.

La biodisponibilidad de la o de las protemas activas de acuerdo con la invencion tambien puede mejorarse utilizando procedimientos de conjugacion que incrementan la semivida de la molecula en el cuerpo humano, por ejemplo por el hecho de ligar la molecula a polietilenglicol, tal como se describe en la Solicitud de Patente PCT WO 92/13095.

Las cantidades terapeuticamente efectivas de la o de las protemas activas sera una funcion de muchas variables, que incluyen el tipo de antagonista, la afinidad del antagonista para la IL-18, cualquier actividad citotoxica residual presentada por los antagonistas, la via de administracion, la condicion clmica del paciente (lo que incluye la deseabilidad de mantener un nivel no toxico de la actividad de la IL-18 endogena).

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Una “cantidad terapeuticamente efectiva” es tal que cuando se lo administra, el inhibidor de la IL-18 tiene como resultado una inhibicion de la actividad biologica de la IL-18. La dosis administrada, en forma de dosis simples o multiples, a un individuo variara en funcion de una variedad de factores, que incluyen las propiedades farmacocineticas del inhibidor de la IL-18, la via de administracion, las condiciones y caractensticas del paciente (seco, edad, peso corporal, salud, masa corporal), la amplitud de los smtomas, tratamientos simultaneos, frecuencia del tratamiento y efecto deseado. El ajuste y la manipulacion de los intervalos de dosificacion establecidos se hallan perfectamente dentro de la capacidad de las personas expertas, y ademas pueden utilizarse metodos in vitro e in vivo para determinar la inhibicion de la IL-18 en un individuo.

De acuerdo con la invencion, el inhibidor de la IL-18 se utiliza en la cantidad de aproximadamente 0,0001 a 100 mg/kg o de aproximadamente 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 0,1 a 5 mg/kg de peso corporal o de aproximadamente 1 a 3 mg/kg de peso corporal o de aproximadamente 1 a 2 mg/kg de peso corporal. Como alternativa, los inhibidores de la IL-18 pueden administrarse en cantidades de aproximadamente 0,1 a 1.000 pg/kg de peso corporal o de aproximadamente 1 a 100 pg/kg de peso corporal o de aproximadamente 10 a 50 pg/kg de peso corporal

La via de administracion preferida de acuerdo con la invencion es la administracion por via subcutanea. De acuerdo con la invencion tambien se prefiere la administracion intramuscular. Para administra el inhibidor de la IL-18 directamente a su lugar de accion, tambien se prefiere administrarlo por dfa intracraneal o intratecal. La via intracraneal se prefiere especialmente en forma combinada en el caso de las lesiones abiertas de la cabeza (lesion del cerebro por misiles).

De acuerdo con la invencion, el inhibidor de la IL-18 puede administrarse profilacticamente o terapeuticamente a un individuo antes de, simultaneamente o secuencialmente con otros regfmenes o agentes terapeuticos (por ejemplo, regfmenes de multiples farmacos), en una cantidad terapeuticamente efectiva, en particular con interferon y/o un TNF y/u otro agente inflamatorio tal como un inhibidor CO y/o un antioxidante. En funcion de la lesion cerebral, puede considerarse la administracion conjunta de un antagonista-TNF en lugar de TNF como tal (Shohami et al., 1999). Los agentes activos que se administran al mismo tiempo con otros agentes terapeuticos pueden administrarse en las mismas composiciones o en composiciones diferentes.

La invencion se refiere ademas a un metodo para la preparacion de una composicion farmaceutica que comprende mezclar una cantidad efectiva de un inhibidor de la IL-18 y/o un inhibidor y/o un antagonista de TNF y/o un inhibidor de COX con un vehfculo farmaceuticamente aceptable.

EJEMPLOS

Materiales y Metodos

Modelo de trauma

Los ratones utilizados en este estudio eran machos con una edad de 8 a 16 semanas que pesaban de 30 a 35 g cada uno. Se los crio en un entorno espedficamente libre de agentes patogenos, se los mantuvo bajo condiciones estandar de temperatura y luz en jaulas de 4 a 6 animales, y se los alimento con comida y agua a voluntad. El estudio se llevo a cabo de acuerdo con las directivas del Comite Institucional de Cuidados Animales de la Universidad Hebrea de Jerusalen, Israel. Se llevo a cabo el CHI experimental utilizando el dispositivo de cafda por peso anteriormente desarrollado (Chen et al., 1996). En pocas palabras, despues de inducida la anestesia con eter, se efectuo una incision longitudinal en la lmea central, se retrajo la piel y se expuso el craneo. Se identifico el area frontal anterior y se coloco un cono de teflon en punta a aproximadamente 1 mm lateralmente con respecto a la lmea central, en el plano coronal medio. Se fijo la cabeza y se dejo caer un peso de 75 g sobre el cono desde una altura de 18 cm, resultando una lesion focal en el hemisferio izquierdo. Detras del trauma, los ratones recibiendo oxigenacion de soporte con oxfgeno al 100% durante no mas de 2 minutos y se los llevo de regreso a su jaulas.

Evaluacion de los niveles de IL-18 en los cerebros de raton

Para la cuantificacion de los niveles intracraneanos de la IL-18, unos ratones de la cepa C57BL/6 (B6) (total n=62) fueron asignados a seis grupos distintos: (1) "controles normales”; ratones B6 no tratados (n-10). (2) "anestesia bajo eter"; los ratones fueron anestesiados con eter durante 10 minutos y decapitados despues de 24 h (n=10) o 7 dfas (n=10). (3) ''operacion ficticia”; estos ratones experimentaron anestesia e incision longitudinal en el escalpelo y fueron sacrificados despues de 24 h (n=15) o 7 dfas. (4) ''grupo de trauma”; se llevo a cabo el CHI experimental anteriormente descrito, y los animales fueron decapitados bajo anestesia con eter a las 4 h (n=7), 24 h (n=7), y 7 dfas (n=7) despues del trauma. (5) ”Inyeccion de TNF”; para evaluar un posible rol del TNF en la regulacion de la IL-18 intracerebral, los ratones fueron sea anestesiados con eter, se les inyecto intracerebroventricularmente (i.c.v.) con 200 ng de TNF recombinante murino (R&D Systems, Abingdon, RU) en solucion salina tamponadas con fosfato 10 pl (PBS) y se los sacrifico despues de 24 h

(n=10). (6) ''inyeccion ficticia”; estos animales recibieron inyecciones i.c.v. de veldculo solamente (10 pl de PBS esteril) y se los sacrifico posteriormente despues de 24 h (n=6), como un grupo de control a los animales que recibieron inyecciones de TNF. En la totalidad de los ratones, se extrajeron los cerebros inmediatamente despues de la decapitacion, se congelo instantaneamente en nitrogeno lfquido y se almaceno a -70 °C hasta analisis. Los cerebros

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del grupo de trauma fueron separados en hemisferio izquierdo (ipsilateral) y derecho t (contralateral), para permitir una comparacion de los niveles de la IL-18 en el hemisferio lesionado con el hemisferio no lesionado. Se llevo a cabo la homogeneizacion de los tejidos con un instrumento Polytron (Kinematica, Kriens, Suiza) utilizandose una dilucion 1:4 en tampon de extraccion fno bajo hielo (W/W) que contema Tris 50 mM (pH 7,2), NaCI 150 mM, Triton-X-100 1% (Boehringer Mannheim, Rotkreuz, Suiza), y coctel de inhibidor de proteasa l (Boehringer Mannheim). El material homogeneizado fue sometido a sacudidas sobre hielo durante 90 minutos y seguidamente se sometio a centrifugacion durante 15 minutos a 3.000 g y a 4 °C. Los materiales sobrenadantes fueron distribuidos en alfcuotas y almacenadas a -70 °C hasta analisis. Se midieron las concentraciones de protema total en lo extractos de cerebro mediante el ensayo de Bradford (Bio Rad Laboratories, Munich, Alemania), y se descubrio que era muy constante en todos los ratones evaluados (12,1 ± 2,1 mg/ml; media ± SD). La cuantificacion de los niveles de citoquina intracerebral fue llevada a cabo mediante ELISA espedfico para IL-18 murino, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (R&D Systems, Abingdon, RU). La sensibilidad del ensayo era de 54 pg/ml. Para la comparacion de los niveles de IL-18 intracerebral entre los diferentes grupos de animales, a todas las concentraciones inferiores al lfmite de deteccion de 5 pg/ml se les asigno un valor de 4,9 pg/ml. Las muestras fueron procesadas no diluidas en cavidades por duplicado y se calculo una concentracion final a partir de la OD media de muestras duplicadas. Se determino el OD mediante un espectrofotometro (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA) bajo la longitud de onda de extincion de 405 nm.

Protocolo del tratamiento de la IL-18BPI

Para los estudios se utilizaron ratones Sabra macho de la cepa de la Universidad Hebrea (n=40) para los estudios con la IL-18BP. Se llevaron a cabo la anestesia y el CHI experimental como se describe en lo que precede. Para el protocolo de tratamiento, los animales fueron divididos en dos grupos: en el grupo A (grupo de control, n=16), los ratones fueron sometidos a CHI experimental, se les inyecto vehfculo solamente (PBS) despues de una hora, y se los observo durante 7 para su evaluacion neurologica (ver mas abajo). En el grupo B (“grupo de estudio, n=18), los animales recibieron inyecciones intraperitoneales de 50 p/g de IL-18BP inmediatamente despues de la determinacion de la puntuacion neurologica en el instante t= 1 h despues de CHI. Dado que la primera unidad de la barrera sangre-cerebro incremento de cinco a seis veces entre las uno o cuatro horas despues del CHI, previamente determinado en el mismo modelo experimental (Chen et al. 1996), la IL-18BP esta disponible para el cerebro bajo estas condiciones. Dos grupos adicionales de ratones fueron tratados de acuerdo con los grupos A y B (grupo C: “grupo de control”; grupo D: ''grupo de estudio”, 10 respectivamente) y se los decapito despues de 48 h, seguido por diseccion del cerebro para la evaluacion del edema postraumatica, como se describe mas abajo.

Evaluacion del deterioro neurologico

Para la evaluacion de deterioro neurologico postraumatico, se ha previamente desarrollado y validado un NSS (Neurological Severity Store, Puntuacion de Gravedad Neurologica) (Stahel et al., 2000).

La puntuacion consiste en 10 tareas clmicas individuales relacionados con la funcion motora,, estado de alerta, y comportamiento fisiologico, en donde se asigna un punto por no realizar la tarea y cero puntos por realizarla (Tabla 4). Un NSS maximo de 10 puntos indica una severa disfuncion neurologica, al no realizar la totalidad de las tareas, mientras que una puntuacion de cero se asigna a los ratones no lesionados saludables. El NSS a la 1 hora despues del trauma refleja la gravedad inicial de la lesion y esta estrechamente correlacionado con el desenlace clmico (Beni-Adani et al. 2001). La evaluacion de la realizacion de las tareas hoy llevada a cabo por dos investigadores a ciegas acerca de los grupos de estudio en los instantes de tiempo 1 h, 24 h, 72 h, y 7 dfas despues del CHI experimental. El ANSS, calculado como la diferencia entre el NSS a t=1 h y el NSS en cualquier instante de tiempo posterior, es un parametro que refleja el grado de recuperacion espontanea despues de la lesion cerebral, como anteriormente descrito (Chen et al. 1996).

Tabla 4: Puntuacion de gravedad neurologica (NSS) para los ratones con lesion en la cabeza.

Tarea

Descripcion Puntos por exito

Salir de un drculo

Capacidad e iniciativa para salir de un drculo de 30 cm de diametro con 0 / 1

Mono-/hemiparesia

Paresia del miembro superior o inferior del lado contralateral 0 / 1

Caminar erguido

Estado de alerta, iniciativa y capacidad motora para caminar erguido 0 / 1

Reflejo de sobresalto

Reflejo innato; el raton saltara en respuesta a 0 / 1

Comportamiento de busqueda

Comportamiento fisiologico como signo de “interes” 0 / 1

Equilibrio sobre Viga

Capacidad de equilibrarse sobre una viga de 7 mm de ancho durante por lo menos 0 / 1

Equilibrio sobre varilla redonda

Capacidad de equilibrarse sobre una varilla redonda de 5 mm de diametro durante 0 / 1

Caminata sobre viga: 3 cm

Capacidad de cruzar una viga de 30 cm de longitud de 3 cm de ancho 0 / 1

Caminata sobre viga: 2 cm

Misma tarea, dificultad incrementada sobre una viga de 2 cm de ancho 0 / 1

Caminata sobre viga: 1 cm

idem, dificultad incrementada sobre una viga de 1 cm de ancho 0 / 1

Puntuacion maxima: 10

Evaluacion del edema cerebral

La amplitud del edema cerebral fue evaluada determinando el contenido de agua en los tejidos en el hemisferio 5 lesionado, como se describio anteriormente (Chen et al. 1996). En pocas palabras, 5 ratones fueron anestesiados como anteriormente descritos a las 48 despues del trauma, lo que corresponde a un instante del tiempo en el que el edema es todavfa significativo en este sistema de modelo (Chen et al. 1996). Despues de la decapitacion, se retiraron el cerebelo y el tallo cerebral y se preparo un segmento cortical de aproximadamente 20 mg tomado de un area cercano al sitio del trauma y de su hemisferio contralateral. Se utilizo el hemisferio derecho (no lesionado) como control 10 interno. Las rebanadas de tejido fueron pesadas y secadas durante 24 h a 95 °C. Despues de pesar las secciones “secas”, el porcentaje de contenido del agua en el cerebro se calculo como:

%H2O = [(peso humedo- peso seco) x 100] / peso seco.

Pacientes con lesion cerebral

Diez pacientes con CHI severo aislado (edad media ± SD: 37 ± 10 anos, intervalo 24-57 anos; 9 varones y una mujer), 15 admitidos en la Division Trauma del Hospital de la Universidad de Zurich, fueron incluido en este estudio. Todos los pacientes teman una puntuacion de la Escala de Coma de Glasgow (GCS) e < 8 despues de resucitacion cardiopulmonar (Teasdale and Jennett, 1974). Despues de evaluacion de escaneo CT, todos los pacientes recibieron cateteres intraventriculares para drenado CSF terapeutico cuando la presion intracraneal (ICP, intracranial pressure) supero los 15 mm Hg. Ninguno de los pacientes fue tratado con esteroides. Los pacientes con multiples lesiones que 20 requenan intervenciones por lesiones toracicas, abdominales, pelvicas, espinales, o fracturas de huesos largos, fueron

excluidos del estudio. Los desenlaces individuales fueron evaluados mediante GOS (Glasgow Outcome Scale) (Jennett and Bond, 1975). El protocolo para CSF y para la recoleccion de suero fue aprobado por el Comite Profesional de Etica del Hospital de la Universidad de Zurich.

Recoleccion de muestras y analisis de IL-18s

25 El CSF y muestras de suero correspondientes de los pacientes de CHI (n=10) fue recolectado diariamente en una instante de tiempo fijo. El CSF de control fue recolectado de pacientes que experimentaron drenado espinal de diagnostico (n=5). Estos pacientes no teman signos de enfermedad de SNC inflamatorio, en base a valores de CSF normales de protema, glucosa, y recuento celular (no se muestran los datos). En el grupo CHI, la recoleccion de las muestras fue llevada a cabo durante 10 despues del trauma, a menos que el cateter ventricular haya sido retirado 30 anteriormente, por ejemplo en casos en los que el ICP permanecio en el intervalo normal (< 15 mm Hg) durante mas de 24 horas. Se recolecto un total de 106 CSF correspondientes y de muestras de suero en los pacientes de trauma analizados en este estudio. Todas las muestras fueron inmediatamente centrifugadas despues de la recoleccion, distribuidas en alfcuotas y congeladas a -70 °C hasta analisis. La cuantificacion de los niveles de la IL-18 en el n CSF y en el suero se llevo a cabo mediante ELISA espedfico para IL-18 humana, para lo cual se utilizaron kits disponibles 35 en el comercio (R&D Systems, Abingdon, RU). En cuanto al ensayo murino, la sensibilidad del ELISA era de 5 pg/ml, y la concentracion final de la l IL-18 se calculo a partir del OD medio determinado en muestras por duplicado con una longitud de onda de extincion de 405 nm. Para la comparacion de los niveles de la IL-18 CSF entre los pacientes de CHI y los controles, a todas las concentraciones debajo de un lfmite de deteccion de 5 pg/ml se les asigno un valor de

4,9 pg/ml.

40 Analisis de los datos

Se llevaron a cabo analisis estadfsticos de los datos en software disponible en el comercio (SPSS 9.0 para Windows™). Se utilizo el ensayo U no parametrico de Mann-Whitney para el analisis de los datos que no se distribrnan normalmente, tales como las puntuaciones neurologicas (NSS y ANSS). Se utilizo el ensayo t no apareado de Student para la comparacion de las concentraciones intracerebrales de IL-18 en los diferentes grupos de ratones y para el 45 analisis de las diferencias en el contenido de agua en el cerebro en los ratones tratados con IL-18BP vs. ratones tratados con vehfculo. La comparacion de los niveles de IL-18 humano, sea en CSF diario vs. muestras de suero correspondientes en pacientes de CHI, o en trauma vs. CSF de control, se determino atizando el modelo general lineal para medidas generales de ANOVA. Se considero que un valor p < 0,05 era estadfsticamente significativo

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Resultados

EJEMPLO 1: niveles de IL-18 cerebrales en ratones

Como se muestra en la Figura 1, la IL-18 era detectable mediante ELISA en homogeneizados de cerebro de ratones de control sin tratar ("normales”) de la cepa B6 (/7=10), con un nivel medio de 27,7 ±1,7 [+ SEM] ng/ml. En los grupos experimentales, la induccion de la anestesia con eter solo o en combinacion con operacion “ficticia” (es decir, anestesia con eter e incision longitudinal en el cuero cabelludo) resulto en niveles de IL-18 intracraneales elevados de

48.9 ±1,1 ng/ml (grupo de “eter”, n = 8) y 54,3 + 2,7 ng/ml (grupo “ficticio”, n=13), respectivamente (p<0.01 vs. ratones ''normales”, ensayo de Student no apareado, Figura 1). La diferencia entre los animales tratados con 'eter” y “ficticio” no era estadfsticamente significativo (p = 0,16).

En el grupo de trauma (n = 21), la induccion del CHI resulto en elevados niveles de IL-18 tanto en el hemisferio lesionado como en el contralateral dentro de las 4 h (60,6 ± 3.3 and 59,8 +5.0 ng/ml, respectivamente) a 24 h (56,9 + 2,1 y 56,3 + 3,7 ng/ml, respectivamente) despues del trauma; sin embargo, los niveles no fueron significativamente mas elevados en comparacion con el grupo “eter” ni en comparacion con el grupo “ficticio” (p > 0,05).

En contraste con ello, a los 7 dfas despues del CHI, se detecto un incremento significativo en la concentracion intracerebral de IL-18 en el hemisferio lesionado, en comparacion con los animales anestesiados con eter u operados “ficticio” (67,6 + 5,1 ng/ml vs. 42,2 + 0,8 and 45,.2 + 0,5 ng/ml, respectivamente, p < 0,01), ,mientras que los niveles de IL-18 en el hemisferio contralateral no se habfan elevado de manera significativa por arriba de estos dos grupos de control (63,2 + 6,0 ng/ml; p = 0,06).

Para evaluar el rol del TNF, un mediador crucial de la inflamacion en este modelo de trauma (Shohami et al. 1999), con respecto a la regulacion de los niveles intracerebrales de IL-18, un grupo adicional de ratones of B6 (n=10) recibieron inyecciones i.c.v. de 200 ng TNF recombinante murino en PBS esteril 10 pl y fueron sacrificados despues de 24 h. Como se muestra en la Figura 1, una inyeccion “simulada” con vehfculo solamente (n = 6) resulto en una regulacion ascendente significativa de IL-18 intracerebral dentro de las 24 h, en comparacion con ratones B6 no tratados (53,6 +

3.9 vs. 27,7 + 1,7 ng/ml; p < 0,001).

La inyeccion de TNF indujo una significativa atenuacion de los niveles de IL-18 en el compartimiento intracraneal dentro de las 24 h (22,1 + 6,9 ng/ml; n=10), en comparacion con el grupo de control que recibio inyecciones “simuladas” a las 24 h (53,6 + 3,9 ng/ml; p < 0,001). Los niveles de IL-18 en el “grupo TNF” eran aun inferiores que en los ratones normales no tratados (27,7 + 1,7 ng/ml), si bien en este caso la diferencia no fue estadfsticamente significativa (p = 0,45).

EJEMPLO 2: Efecto del tratamiento con IL-18BP sobre la recuperacion neurologica despues del trauma

Para investigar la hipotesis de que la inhibicion de la IL-18 podna facilitar la recuperacion en el caso de una lesion cerebral, se comparo la recuperacion en diferentes estantes del tiempo despues de una unica inyeccion de IL-18BP. Se sabfa previamente que el NSS (Neurological Severity Store) al cabo de una hora despues del estroma refleja con mayor exactitud la magnitud del trauma y se correlaciona con el volumen del tejido lesionado como puede observarse en MRI y en histologfa.

A efectos de obtener grupos de animales control mas comparable, se asignaron ratones a diferentes grupos de tratamiento despues de haberse evaluado su NSS inicial a t = 1 h. Como se muestra en la Figura 2 (NSS en IL-18BP (cuadrados) vs. Control (drculos) ambos grupos tuvieron un NSS similar (1 h) (7,69 + 0,3023 y 7,44 + 0,3627 control y IL-18BP respectivamente), lo que indica un grado comparable de la gravedad de las lesiones.

La evaluacion del NSS en momentos posteriores (1-7 dfas) revelo que los animales tratados intraperitonealmente (i.p.) con h IL-18BP presentaban un dano neurologico considerablemente menor, como se puso en evidencia mediante los honores de NSS, que alcanzaron una significancia a los siete dfas despues del trauma (p = 0, 045).

Se calculo la velocidad de la cooperacion, expresada como ANSS (t) = NSS (1 h) - NSS (t). Un valor superior de ANSS refleja una mayor recuperacion y un ANSS cero o negativo refleja ausencia de recuperacion o empeoramiento. En la Figura 3 se ilustran los valores de ANSS de los dos grupos. En dos instantes de tiempo, tanto a las 24 horas, a los siete dfas la diferencia entre los valores de ANSS promedios alcanzaron significancia.

Se llevo a cabo otro experimento para investigar si el tratamiento con IL-18BP, administrado a los tres dfas despues la lesion, puede ser efectivo. El tema del momento oportuno para efectuar el tratamiento es cntico, y hasta ahora la terapia ha demostrado ser efectiva cuando se la administra mas alla de unas pocas horas. Ya que se ha descubierto que la IL-18 de por sf se eleva a los siete dfas despues del trauma, y que el tratamiento con IL-18BP administrada una hora despues del trauma condujo a un maximo efecto tambien en el dfa 7, se decidio ahora tratar los ratones en el dfa 3 de la lesion. Para fines de comparacion, se trato otro grupo a 1 h y a 3 d con IL-18BP. El grupo de control fue tratado con el control (solvente) solamente.

Los resultados de estos experimentos se ilustran en la Figura 4, en la cual puede observarse que un unico tratamiento administrado en el dfa 3 es tan efectivo como el administrado 1 h despues del CHI y nuevamente a los 3 dfas.

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Este experimento demuestra el drastico efecto beneficioso de la administracion de una sola vez de IL-18BP, administrada sea 1 h o 3 d despues de una lesion cerrada de la cabeza, sobre la recuperacion de la lesion traumatica de la cabeza en un modelo murino experimental.

EJEMPLO 3: Niveles elevados de IL-18 en CSF humano despues de lesion cerebral

Se evaluaron los niveles de IL-18 en el CSF diario y en mus de suero de 10 pacientes con CHI severo hasta 10 dfas despues del trauma. Los datos demograficos y clmicos de los pacientes se presentan en la Tabla 5.

Tabla 5: datos demograficos y clmicos de pacientes con CHI severoa

Paciente N°

Edad/anos) sexo GCSb GOCc IL-18 en CSFd (pg/m) mediano [intervalo] e IL-18 en el suero (pg/ML) mediano [intervalo]®

1

48/m 3 1 283 [78-966] 57,5 [12-66]

2

31/m 7 4 228,4 [22-745] 19,7 [4.9-108]

3

26/m 5 3 208,5 [20-392] 37,2 [14-163]

4

57/m 5 4 72,6 [30-286] 48,9 [14-104]

5

24/m 4 5 32,6 [4,9-155] 17 [4.9-58]

6

36/m 8 1 49,4 [10-290] 16,7 [12-67]

7

38/f 3 4 17,9 [11-100] 13 [4,9-46]

8

35/m 3 3 69,8 [4,9-329] 19.8 [7-77]

9

37/m 3 4 37 [23-75] 57,3 [25-98]

10

41/m 7 5 4,9 [4,9-169] 26,2 [15-38]

Control CSFG = 10 4,9 [4,9-7,8]

aCHI, closed head injury (lesion cerrada de la cabeza)

bGCS, Puntuacion de Coma de Glasgow (Teasdale and Jennett, 1974).

cGOS = Puntuacion de Desenlace de Glasgow a los 3 meses despues de la lesion; 5 = asintomatico; 4 = discapacidad moderada; 3 = discapacidad severa; 2 = estado vegetativo persistente; 1 = muerte (Jennett and Bond, 1975).

dCSF = cerebrospinal fluid (fluido cerebroespinal).

e A los niveles de IL-18 inferiores al lfmite de deteccion de 5 pg/ml se les asigno un valor de 4,9 pg/ml.

Como se muestra en la Tabla 5, los niveles intratecales de IL-18 eran significativamente elevados en 9/10 pacientes de CHI, en comparacion con el CSF de control de 5 pacientes sin trauma ni enfermedad neurologica inflamatoria (p < 0,05; ANOVA de medidas repetidas). Solamente un paciente (#10) tema niveles de IL-18 CSF, que no eran significativamente elevados en comparacion con el CSF de control (p = 0,31). Los niveles medianos y los intervalos individuales de la IL-18 en el CSF y en el suero se presentan en la Tabla 5.

Lo notable es que las maximas concentraciones de IL-18 en el CSF (966 ng/ml) eran de hasta 200 veces superiores en los pacientes con lesiones de cabeza que en los controles. La IL-18 intracerebral fue detectable mediante ELISA en el 90% de todos los casos de CSF en el grupo de trauma, mientras que solamente el 40% de las muestras de CSF de control teman niveles de IL-18 intracerebral detectables (es decir, > 4,9 ng/ml). En 8/10 pacientes de CHI, las concentraciones medianas de IL-18 era significativamente mas elevadas en el CSF que en el suero (p < 0,05; medidas repetidas de ANOVA). Sin embargo, en dos pacientes (#9,10) los niveles medianos de la IL-10 en el suero superaron las correspondientes concentraciones de CSF, como se muestra en la Tabla 5.

Estos resultados muestran que hay niveles significativamente elevados de IL-18 en el fluido cerebroespinal de los pacientes con lesion traumatica de la cabeza. La adicion de IL-18BP puede reducir estos elevados niveles, y puede por lo tanto ejercer su efecto beneficioso sobre la recuperacion de las lesiones cerradas de la cabeza, como se muestra en el Ejemplo 2 precedente.

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Referencias

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Claims (12)

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   REIVINDICACIONES

   1. Uso de un inhibidor de la IL-18, en donde el inhibidor de la IL-18 es una protema que se liga a la IL-18 (IL-18

   BP) para la produccion de un medicamento para el tratamiento de las lesiones traumaticas del cerebro (lesion cerrada de la cabeza), administrandose la IL-18 BP en una unica dosis a los tres dfas despues de la lesion.
2. 2. El uso segun la reivindicacion 1, en donde la protema que se liga a la IL-18 esta glicosilada en uno o mas

   sitios.
3. 3. El uso segun la reivindicacion 1, en donde la IL-18 BP esta fusionada a la totalidad o a una parte de una inmunoglobulina (Ig).
4. 4. El uso segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento comprende ademas un interferon.
5. 5. El uso segun la reivindicacion 4, en donde el interferon es interferon-a o interferon-p.
6. 6. El uso segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento comprende ademas TNF (Factor de Necrosis de los Tumores).
7. 7. El uso segun la reivindicacion 6, en donde el TNF es TNF alfa.
8. 8. El uso segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el agente comprende ademas un

   agente antiinflamatorio.
9. 9. El uso segun la reivindicacion 8, en donde el agente inflamatorio es un inhibidor de COX, en particular un inhibidor de COX-2.
10. 10. El uso segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el medicamento comprende ademas un antioxidante.
11. 11. El uso segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el inhibidor de la IL-18 se utiliza en gran cantidad de aproximadamente 0,001 a 100 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 0,01 a 10 mg/kg de peso corporal o de aproximadamente 0,1 a 5 mg/kg de peso corporal o de aproximadamente 1 a 3 mg/kg de peso corporal.
12. 12. El uso segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el inhibidor de IL-18 se administra por via subcutanea.