CZ307321B6 - Farmaceutický prostředek - Google Patents

Abstract

Použití inhibitorů IL-18 pro výrobu léčiva k léčbě a/nebo prevenci poškození centrálního nervového systému a zejména traumatického poranění hlavy.

Description

Předkládaný vynález se týká patologických stavů mozku. Konkrétněji se týká použití inhibitoru interleukinu 18 (IL-18) pro léčbu a/nebo prevenci poškození centrálního nervového systému (CNS) a zejména traumatického (úrazového) poškození mozku.

Dosavadní stav techniky

V roce 1989 byla popsána endotoxinem indukovaná sérová aktivita, získaná z myších slezinných buněk, která indukovala interferon-γ (IFN-γ) (Nakamura se spoluautory, Infect Immun. 57, 590595, 1989). Tato sérová aktivita nepůsobila jako přímý induktor IFN-γ, ale spíše společně s interleukinem-2 (IL-2) nebo s mitogeny jako jeho pomocný stimulant. Pokus vyčistit aktivitu z myšího séra po ovlivnění endotoxinem poskytl zjevně homogenní, stejnorodý protein o velikosti 50 000 až 55 000. Vzhledem k tomu, že jiné cytokiny mohou působit jako pomocné stimulátory produkce IFN-γ, neschopnost neutralizujících protilátek vůči interleukinu-1, interleukinu-4, interleukinu-5, interleukinu-6 (IL—1, IL-4, IL-5, IL—6), nebo TNF (faktoru nekrózy tumoru) neutralizovat sérovou aktivitu ukazoval, že se jednalo o určitý, odlišný faktor.

V roce 1995 stejní vědci prokázali, že endotoxinem indukovaný pomocný stimulant produkce IFN-γ byl přítomný i v jaterních extraktech myší, předem ovlivněných P. acnes (Okamura se spoluautory, Infect. Immun. 63(10), 3966-3972, 1995). U tohoto modelu se rozšiřovala populace jaterních makrofágů (Kupfferových buněk) a u těchto myší se pak stala nízká dávka bakteriálního lipopolysacharidu (LPS), která není u předem neovlivněných myší smrtelná, dávkou smrtelnou. Tento faktor, pojmenovaný faktor indukující IFN-γ (IGIF) a později označený jako interleukin-18, tj. IL-18, byl vyčištěn do homogenity z 1 200 gramů jater myší, ovlivněných P. acnes. Degenerované oligonukleotidy, získané derivací z aminokyselinových sekvencí vyčištěného IL-18, byly použity ke klonování myší cDNA pro IL-18. IL-18 je proteinem o velikosti 18 000 až 19 000 o 157 aminokyselinách, který navykazuje žádné obvyklé podobnosti s jakýmkoliv peptidem v databázích. Přenašečové RNA (mRNA) pro IL-18 a interleukin-12 (IL12) jsou snadno detegovatelné v Kupfferových buňkách a v aktivovaných makrofázích. Rekombinantní IL-18 indukuje IFN-γ mnohem účinněji než IL—12, zřejmě oddělenou dráhou (Micallef se spoluautory, Interferon-gamma-inducing factor enhances T helper 1 cytokine production by stimulated human T celíš: synergism with interleukin-12 for interferon-gamma production; Eur. J. Immunol. 26, 1647-1651, ISSN: 0014-2980, 1996). Podobně jako endotoxinem indukovaná sérová aktivita, IL-18 neindukuje IFN-γ sám o sobě, ale působí prvotně jako pomocný stimulátor spolu s mitogeny nebo s IL-2. IL-18 zvyšuje proliferaci buněk T, zřejmě prostřednictvím dráhy závislé na IL-2 a zvyšuje produkci cytokinů Thl in vitro a vykazuje shodné působení (synergismus) v kombinaci s IL—12, pokud se týká zvýšené produkce IFN-γ (Maliszewski se spoluautory, Cytokine receptors and B cell functions. I. Recombinant soluble receptors specifically inhibit IL—1 and IL-4-induced B cell activities in vitro. J. Immunol. 144, 3028-3033, 1990).

Po klonování myší sekvence byla v roce 1996 popsána také lidská sekvence cDNA pro IL-18 (Ushio se spoluautory, J. Immunol. 156(11), 4274-4279, 1996).

Klonováním IL-18 z postižených tkání a studiem genové exprese IL-18 bylo nalezeno blízké spojení tohoto cytokinů s autoimunitním onemocněním. U neobézní diabetické (NOD) myši se spontánně rozvíjejí autoimunitní zánět Langerhansových ostrůvků a diabetes (cukrovka), které lze urychlit a synchronizovat jedinou injekcí cyklofosfamidu. Ve slinivce NOD myši byla během časných stádií zánětu Langerhansových ostrůvků prokázána mRNA pro IL-18 pomocí PCR

-1 CZ 307321 B6 (polymerázové řetězové reakce) reverzní transkriptázy. Hladiny mRNA pro IL-18 po léčbě cyklofosfamidem rychle vzrůstaly a předcházely nárůstu mRNA pro IFN-γ a poté diabetů. Je zajímavé, že tyto kinetiky napodobovaly kinetiky mRNA pro IL-12-p40 a výsledkem byl blízký vzájemný vztah (korelace) hladin jednotlivých mRNA.

Klonování cDNA pro IL-18 ze slinivkové RNA a následné sekvenování odhalilo shodnost se sekvencí IL-18, klonovanou z Kupfferových buněk a z makrofágů, předem aktivovaných in vivo. Také makrofágy, získané od NOD myší, odpovídaly na cyklofosfamid expresí genu IL-18, zatímco makrofágy, získané od paralelně ovlivňovaných myší Balb/c, takto neodpovídaly. Exprese IL-18 je tedy u autoimunitních NOD myší abnormálně regulována a je těsně spojena s rozvojem diabetů (Rothe se spoluautory, J. Clin. Invest. 99(3), 469^474, 1997).

IL-18 hraje možnou roli v imunoregulaci nebo v zánětu zvyšováním funkční aktivity ligandu Fas (Fas = membránový protein, fungující na buněčném povrchu jako receptor) na buňkách Thl (Conti se spoluautory, Induction of interferon-gamma inducing factor in the adrenal cortex, J. Biol. Chem. 272, 2035-2037, 1997). IL-18 je také exprimován v kůře nadledvinek a může být tedy vylučovaným neuroimunomodulátorem, hrajícím důležitou roli v řízení imunitního systému po stresující zkušenosti (Cháter se spoluautory, Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Academiai Kaido, Budapest, Maďarsko, str. 45-54, 1996).

Za podmínek in vivo je 11-18 vytvářen štěpením pro-IL-18 a jeho endogenní aktivita se zdá přispívat produkci IFN-γ při smrtelných účincích (lethalitě), zprostředkovaných P. acnes a LPS. Zralý IL-18 je vytvářen ze svého prekursoru působením enzymu konvertujícího IL—1 β (ICE, IL1β converting enzyme, kaspázy-1).

Receptor IL-18 sestává z nejméně dvou složek, které spolupracují při vazbě ligandu. Málo afinitní a vysoce afinitní vazebná místa pro IL-18 byla nalezena na myších T buňkách, stimulovaných IL—12 (Yoshimoto se spoluautory, J. Immunol. 161, 3400-3407, 1998), což ukazuje na receptorový komplex s násobnými řetězci. Až dosud byly identifikovány dvě receptorové podjednotky, obě patřící do skupiny receptorů IL—1 (Pamet se spoluautory, J. Biol. Chem. 271, 3967-3970, 1996). Signální transdukce IL-18 zahrnuje aktivaci nefritického faktoru NF-κΒ (DiDonato se spoluautory, Nátuře 388, 16 514-16 517, 1997).

Nedávno byl z lidské moči isolován rozpustný protein, mající vysokou afinitu k IL-18 a klonovány byly lidská a myší cDNA (Novick se spoluautory, Immunity 10, 127-136, 1999; WO 99/09063). Protein byl označen jako vazebný protein IL-18 (1L-18BP).

IL-18BP není extracelulámí, vně buněčnou doménou jednoho ze známých receptorů IL-18, ale vylučovaný, přirozeně obíhající protein. Patří do nové skupiny vylučovaných proteinů, která dále zahrnuje několik proteinů kódujících virus neštovic, vykazujících vysokou homologii s IL-18BP (Novick se spoluautory, 1999). IL-18BP je základním způsobem exprimován ve slezině, patří do skupiny imunoglobulinů a vykazuje omezenou homologii s receptorem typu II pro IL—1. Jeho gen byl lokalizován na lidském chromosomu 1 lq 13 a v genové sekvenci o velikosti 8,3 kilobazí nebyl nalezen žádný exon, kódující transmembránovou doménu (Novick se spoluautory, 1999).

Čtyři lidské a dvě myší isoformy IL-18BP, které jsou výsledkem spojování mRNA a nalézající se v různých knihovnách cDNA, byly pojmenovány, vyčištěny a testovány vzhledem k vazbě IL18 a neutralizování jeho biologických aktivit (Kim se spoluautory, Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18; Proč. Nati. Acad. Sci. USA 97, 1190-1195, 2000). Lidská isoforma IL-18BP a (IL-18BPa) vykazuje největší afinitu k IL-18 s rychlým nástupem, pomalým ústupem účinku a s disociační konstantou K(d) 399 pmol.F ’. IL-18BPc sdílí imunoglobulinovou (Ig) doménu IL-18BPa kromě oblasti 29 aminokyselin na C-konci; K(d) pro IL-18BPc je desetkrát nižší (2,94 nmol.F¹). Přesto IL-18BPa a IL-18BPc neutralizují v dvojnásobném molámím přebytku IL-18 z více než 95 %. Isoformy IL-18BPb a IL—1 8BPd postrádají úplnou Ig doménu a postrádají i schopnost vázat nebo neutralizovat 11-18.

-2CZ 307321 B6

Myší isoformy IL-18BPc a IL-18BPd, vykazující shodnou Ig doménu, rovněž v dvojnásobném molámím přebytku neutralizují IL-18 z více než 95 %. Ovšem myší IL-18BPd, sdílející běžnou C-koncovou sekvenci s lidskou isoformou lL-18BPa, také neutralizuje lidský IL-18. Molekulární modelování identifikovalo široké smíšené elektrostatické a hydrofobní vazebné místo v Ig doméně IL-18BP, které může přispívat k jeho vazbě na ligand, probíhající s vysokou afinitou (Kim se spoluautory, 2000).

Traumatické (úrazové) poškození mozku (TBI, traumatic brain injury), nazývané také jednoduše poranění hlavy, nebo uzavřené poranění hlavy (dosed head injury, CHI), se týká poškození centrálního nervového systému, kde došlo k poškození mozku, způsobenému vnějším úderem do hlavy. Nejčastěji je příčinou automobilová nebo cyklistická nehoda, ale takové poškození může vzniknout také jako výsledek tonutí, infarktu, mrtvice a infekcí. Tento typ traumatického poškození mozku je obvykle následkem nedostatku kyslíku v mozku nebo nedostatečného krevního zásobování mozku a může být tedy označen jako anoxické poškození.

Uzavřené poranění hlavy nastává při úderu do hlavy, jako například při automobilové nehodě nebo při pádu. V takovém případě lebka narazí na pevný, nehybný předmět a mozek, který je uzavřen v lebce, se pootočí a zkroutí podél své osy (mozkového kmene), což vyvolá místní nebo rozšířené poškození. Mozek, měkká hmota obklopená tekutinou, která mu umožňuje se vznášet, se od lebky může také zpětně odrazit, což vyvolá další poškození.

Bezprostředně po úrazu, traumatu, může nastat období bezvědomí, které může přetrvávat minuty, týdny nebo měsíce. Vzhledem k překroucení a zpětnému odražení může pacient s traumatickým poškozením mozku obvykle prodělat poškození nebo zranění mnoha částí mozku. To je nazýváno difuzním, rozptýleným poškozením, nebo neřízeným poškozením mozku. Typy poškození mozku, ke kterým dochází při neřízených poškozeních, mohou být klasifikovány jako primární (prvotní) nebo sekundární (druhotné).

Primární poškození mozku nastává v době poranění, zejména na místech dopadu, zvláště pokud je přítomna fraktura lebky. Rozsáhlé zhmožděniny mohou být spojeny s nitrolebním krvácením, nebo odprovázeny korovým potrháním (lacerací). Rozptýlená poškození nervových výběžků (axonální poranění) se vyskytují jako důsledek smykové deformace a tahových deformací neuronových procesů, vytvářených rotačními pohyby mozku v lebce. Mohou vzniknout malé krvácivé leze nebo rozptýlená poškození axonů, která je možné detegovat pouze pod mikroskopem.

Sekundární poškození mozku nastává v důsledku komplikací, které se vyvinuly po okamžiku poranění. Zahrnují nitrolební krvácení, traumatické poškození extracerebrálních tepen, nitrolební vyhřeznutí, hemiaci, hypoxické poškození mozku nebo zánět mozkových blan, meningitidu.

Otevřené poranění hlavy je viditelné vniknutí do hlavy a může být následkem střelného poranění, nehody nebo předmětu, procházejícího lebkou do mozku (střelného poškození mozku). Tento typ poškození je spíše poškozením specifické oblasti mozku.

Tak zvané mírné poškození mozku může nastat bez ztráty vědomí a případně kratší dobu přetrvá pocit omámení nebo zmatený stav. I když poskytnutá léčebná péče může být minimální, osoby s poraněním mozku, které proběhlo bez kómatu, mohou pociťovat stejné příznaky a obtíže jako jsou ty, které zažívají osoby přeživší zranění s hlubokým bezvědomím (kómatem).

V odpovědi na trauma, úraz, v mozku nastávají změny, které vyžadují sledování k zabránění dalšího poškození. Velikost mozku se po těžkém poškození mozku často zvětšuje. To se nazývá otokem mozku a takový stav nastává při výskytu zvýšeného množství krve v mozku. Později během onemocnění se v mozku může hromadit voda, což je nazýváno mozkovým edémem. Jak otok, tak edém mozku jsou výsledkem nadměrného tlaku v mozku, nazývaného nitrolebním tlakem (ICP, intracranial pressure).

-3 CZ 307321 B6

Hluboké bezvědomí, kóma, je prodlouženým obdobím bezvědomí, které následuje bezprostředně po traumatickém úrazu hlavy.

Existuje několik úrovní kómatu. Tyto úrovně mohou být měřeny růstem citlivosti osoby s poraněním hlavy. V akutní fázi poranění hlavy se používá tzv. Glasgowská škála kómatu. Když dojde ke zlepšení stavu pacienta nebo k jeho stabilizaci, používá se tzv. Raného Los Amigos škála, která měří hladiny poznávacího myšlení (pochopení a logické myšlení).

Poškození mozku má často za následek přetrvávající debilitu, ochablost, jako poúrazovou epilepsii, přetrvávající vegetativní stav nebo poúrazovou demenci.

Jiným typem poškození CNS je poškození míchy. Poškození míchy přispívají k většině nemocničních příjmů z důvodů paraplegie a tetraplegie. Přes 80 % z nich je důsledkem nehod na silnicích. Klinicky se rozeznávají dvě hlavní skupiny poranění: otevřená poškození a uzavřená poškození.

Otevřená poškození zapříčiňuje přímé trauma (úraz) míchy a nervových kořenů. Pronikající poškození mohou vyvolat extenzivní přerušení a krvácení. Uzavřená poškození zodpovídají za většinu míšních poškození a jsou obvykle spojena s frakturou/dislokací (posunem) páteře, které je obvykle prokazatelné radiologicky. Poškození míchy závisí na rozsahu poškození kosti a může být uvažováno ve dvou stadiích: Primární poškození, jako jsou zhmožděniny, přerušení nervových vláken a krvácivé nekrózy a sekundární poškození, jakým jsou extradurální hematom, infarkt, infekce a edém.

Pozdní následky poškození míchy zahrnují: vzestupnou a sestupnou anterográdní degeneraci poškozených nervových vláken, potraumatickou syringomyelii a systémové účinky paraplegie, jako jsou infekce močového traktu a hrudní infekce, proleženiny a chřadnutí svalů.

Patologie traumatického poškození mozku je velmi složitá a stále jen málo známá. Výzkumné úsilí v poslední dekádě upozornilo na důležitou roli cytokinů, uvolňovaných po mozkovém poškození systémově i místně do intratekálního prostoru a na základě nálezů časově závislých přínosných i nežádoucích účinků prozánětlivých cytokinů, jako jsou TNF, IL-6 nebo IL-8, byl vysloven předpoklad duálního účinku těchto mediátorů (Morganti-Kossmann se spoluautory: Production of cytokines following brain injury: beneficial and deleterious for the damaged tissue; Mol. Psychiatry 2, 133-136, 1997; Kossmann se spoluautory: Interleukin-8 released into the cerebrospinal fluid after brain injury is associated with blood brain-barrier dysfunction and nerve growth factor production; J. Cereb. Blood Flow Metab. 17, 280-289, 1997; Shohami se spoluautory: Duál role of tumor necrosis factor alpha in brain injury, Cytokine Growth Factor Rev. 10, 119-130, 1999; Scherbel se spoluautory: Differencial acute and chronic responses of tumor necrosis factor—deficient mice to experimental brain injury, Proč. nati. Acad. Sci. USA 96, 8721-8726, 1999; Whalen se spoluautory: Interleukin-8 is increased in cerebrospinal fluid of children with severe head injury, Crit. Care Med. 28, 929-934, 2000). Jak bylo popsáno výše, nedávno objeveným cytokinem ze skupiny IL-1 je IL-18. Nedávné studie prokázaly, že IL-18 je základním způsobem, podstatně exprimován in vivo v CNS myší, potkanů albínů a lidí (Culhane se spoluautory: Cloning of rat brain interleukin-18 cDNA, Mol. Psychiatry 3, 362-366, 1998; Jander a Stolí: Differential induction of interleukin-12, interleukin-18 and interleukin-1 β converting enzyme mRNA in experimental autoimmune encephalomyelitis of the Lewis rat, J. Neuroimmunol 91, 93-99, 1998, Prinz a Hanisch: Murine microglial celis produce and respond to interleukin-18, J. Neurochem. 72, 2215-2218, 1999; Fassbender se spoluautory: Interferon-γinducing factor (IL-18) and interferon-γ in inflammatory CNS diseases, Neurology 53, 1104-1 106, 1999; Wheeler se spoluautory: Detection of the interelukin-18 family in rat brain by RTPCR, Mol. Brain Res. 77, 290-293, 2000), stejně jako in vitro v primárních kulturách astrocytů a mikroglií, ne však neuronů (Conti se spoluautory: Cultures of astrocytes and microglia express interleukin-18, Mol. Brain Res. 67, 46-52, 1999). Zvýšené úrovně IL-18 byly detekovány v mozkomíšním moku (CSF, cerebrospinal fluid) pacientů se zánětlivými chorobami CNS, jako

-4CZ 307321 B6 jsou bakteriální meningitida (zánět mozkových blan) a virová meningoencefalitida, ne však v CSF pacientů s roztroušenou sklerózou (MS, multiple sclerosis) (Fassbender se spoluautory, 1999). Na rozdíl od nálezu obecně nízkých intratekálních hladin IL-18 u pacientů s MS, zvýšená exprese mRNA pro 11-18 byla nalezena v míchách potkanů albínů kmene Lewis s pokusnou autoimunitní encefalomyelitidou (EAE), což je zvířecí model pro MS (Jander a Stolí, 1998). Exprese a funkční významnost IL-18 při nervovém poškození (traumatu) nebyly až do této doby zkoumány.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká patofýziologické role IL-18 v onemocněních CNS. Je založen na zjištění, že léčba myší inhibitory IL-18, buď 1 hodinu, nebo 3 dny po pokusném uzavřeném poranění hlavy (CHI) má za následek zlepšené zotavení a zmírněný rozsah poškození mozku ve srovnání s kontrolními zvířaty. Vynález se proto týká použití inhibitoru IL-18 pro výrobu léčiva k léčbě a/nebo prevenci poškození centrálního nervového systému (CNS) a zejména traumatického poškození mozku.

Podle tohoto vynálezu je rovněž poskytnuto použití kombinací inhibitoru IL-18 a interferonu a/nebo TNF a/nebo inhibitorů zánětu a/nebo antioxidantů. K aplikaci genových léčebných přístupů k dodání inhibitoru IL-18 do nemocných tkání nebo buněk se další aspekty tohoto vynálezu týkají použití molekul nukleových kyselin, obsahujících kódující sekvence inhibitoru IL-18 pro léčbu a/nebo prevenci poškození CNS. Vynález se také týká použití genetickým inženýrstvím upravených buněk k expresi inhibitorů IL-18 pro prevenci a/nebo léčbu poškození CNS.

Objasnění výkresů

Obr. 1 znázorňuje histogram, zobrazující sérové hladiny intracerebrálního (nitromozkového) IL18 (ng/ml) v celém mozku (šrafované sloupce), v levé hemisféře (plné sloupce) nebo v pravé hemisféře (šedé sloupce) za různých podmínek.

Obr. 2 znázorňuje vývoj NSS (hodnocení neurologické závažnosti, neurological severity score), měřený 1 hodinu (h), 24 h, 72 h nebo 168 h po traumatu, buď za poskytnutí 50 pg IL-18BP, aplikovaného intraperitoneálně 1 h po traumatu (čtverečky), nebo za injikace pouze vehikula (kontrola, čtverečky).

Obr. 3 znázorňuje ANSS, měřenou 24 h, 72 h nebo 168 h po traumatu, buď za poskytnutí 50 pg IL-18BP, aplikovaného intraperitoneálně 1 h po traumatu (čtverečky), nebo za injikace pouze vehikula (kontrola, čtverečky).

Obr. 4 znázorňuje ANSS, měřenou 1 h, 24 h, 3 dny (d), 7 dnů nebo 14 dnů po traumatu, buď za poskytnutí 50 pg IL-18BP, aplikovaného intraperitoneálně v podobě jedné dávky 3 dny po traumatu (kosočtverečky), nebo v podobě dvou dávek, poskytnutých 1 h a 3 dny po traumatu (čtverečky), anebo za injikace pouze vehikula (kontrola, trojúhelníčky).

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález je založen na zjištění statisticky významného přínosného účinku inhibitoru IL-18 k zotavení z poškození mozku, sledovaném na myším modelu uzavřeného poranění hlavy. Podle tohoto vynálezu bylo rovněž zjištěno, že IL-18 je po traumatickém poranění mozku v mozkomíšním moku a v mozku samotném regulován směrem k nárůstu, což ukazuje, že tento prozánětlivý cytokin hraje důležitou roli v patogenezi mozkového poranění.

-5 CZ 307321 B6

Vynález se proto týká použití inhibitoru IL-18 pro výrobu léčiva k léčbě a/nebo prevenci poškození centrálního nervového systému (CNS).

Tento vynález se dále týká použití inhibitoru IL-18 pro výrobu léčiva k léčbě a/nebo prevenci komplikací a následných důsledků poškození CNS.

V upřednostňovaných ztělesněních tohoto vynálezu je poškozením CNS traumatické poranění mozku nebo uzavřené poranění hlavy.

V dalším upřednostňovaném ztělesnění je poškozením CNS poškození míchy.

V ještě dalším upřednostňovaném ztělesnění tohoto vynálezu je poranění mozku cévního původu.

V kontextu předkládaného vynálezu se výraz poškození centrálního nervového systému týká jakéhokoliv poškození (poranění) mozku nebo míchy, bez ohledu na věk při jeho nástupu, nebo na základní příčinu. Základní příčina může být například mechanická, nebojí může být infekce. Poškození CNS a jeho klinické příznaky byly podrobně popsány v kapitole Dosavadní stav techniky. Poškození CNS zahrnuje například trauma, nebo jakékoliv jiné poškození mozku nebo míchy a může být označováno také jako neurotrauma.

Poškození mozku může například zahrnovat následující důsledky nebo být příčinou jednoho či více z následujících jevů: 1. zhoršení pozornosti; 2. zhoršení poznávání; 3. poškození řeči; 4. poškození paměti; 5. poruchy chování; 6. motorické poruchy; 7. Jakékoliv jiné neurologické dysfunkce.

Důsledkem poškození míchy může být například paraplegie nebo tetraplegie.

Podle předkládaného vynálezu mohou být také léčeny komplikace nebo pozdější důsledky, následky poškození CNS, a/nebo je jim tak možné předcházet. Komplikace nebo pozdější účinky, důsledky poškození mozku byly podrobně popsány v kapitole Dosavadní stav techniky. Zahrnují, nikoli však výlučně, například kóma (hluboké bezvědomí), meningitidu, potraumatickou epilepsii, potraumatickou demenci, degeneraci nervových vláken, nebo posttraumatickou syringomyelii či krvácení.

Předkládaný vynález se také týká použití inhibitorů IL-18 pro výrobu léčiva k léčbě a/nebo prevenci poškození mozku, které je cévního původu, jako jsou hypoxické poškození mozku s mozkovým infarktem, ischemie, mozková cévní příhoda nebo mrtvice.

Výrazy léčba a prevence, jak jsou zde použity, by měly být chápány jako částečné nebo podstatné inhibování, oslabení, zlepšení nebo zvrácení jednoho nebo více z příznaků nebo jedné či více z příčin poškození CNS, stejně jako příznaků, chorob nebo komplikací doprovázejících poškození CNS a rovněž předejití takovým příznakům či příčinám poškození i doprovodným příčinám a chorobám či komplikacím. Při léčení poškození CNS jsou látky podle tohoto vynálezu podávány po nástupu onemocnění, prevence se pak týká podávání takových látek před tím, než mohou být známky onemocnění u pacienta zaznamenány.

Podle předkládaného vynálezu se upřednostňuje léčba poškození CNS. K léčbě poškození CNS se s výhodou podává inhibitor IL-18 tak brzo po poškození CNS, jak jen je možné; například během první hodiny po poškození (poranění). Ovšem, jak je ukázáno v Příkladech uvedených níže, jeden inhibitor IL-18 prokázal schopnost uplatnit své přínosné účinky na poškození mozku dokonce i při podání provedeném 3 dny po poškození mozku. Proto se k léčbě poškození mozku upřednostňuje podání inhibitoru IL-18 během tří dnů, následujících po tomto poškození.

Výraz inhibitor IL-18 se v kontextu tohoto vynálezu týká jakékoliv molekuly, modulující produkci IL-18 a/nebo jeho působení takovým způsobem, že produkce a/nebo působení IL-18 je

-6CZ 307321 B6 oslabeno, redukováno, nebo částečně, podstatně či úplně zamezeno či blokováno. Výraz inhibitor IL-18je zamýšlen k zahrnutí inhibitorů produkce IL-18, stejně jako inhibitorů funkce IL-18.

Inhibitorem produkce může být jakákoliv molekula, která záporně ovlivňuje syntézu, zpracování nebo zrání IL-18. Takovými inhibitory, uvažovanými podle předkládaného vynálezu, mohou být například supresory genové exprese interleukinu 1L—18, negativní (antikódující) mRNA, redukující nebo zabraňující transkripci mRNA pro IL-18, nebo vedoucí k degradaci mRNA, proteiny poškozující správné skládání anebo částečně či podstatně zabraňující sekreci IL-18, proteázy odbourávající IL-18 hned, jakmile byl syntetizován, inhibitory proteáz štěpících proIL-18 k vytvoření zralého IL-18, jako jsou inhibitory kaspázy-1 a podobně.

Inhibitorem působení IL-18 může být například antagonista IL-18. Antagonisté se mohou vázat buď molekulu na IL-18, nebo ji mohou s dostatečnou afinitou a specifičností vyčleňovat k částečnému nebo podstatnému neutralizování buď IL-18 samotného, nebo vazného místa či vazných míst pro IL-18, odpovědného (odpovědných) za vazbu IL-18 k jeho ligandům (jako například k jeho receptorům). Agonista může také inhibovat signální dráhu IL-18, která je v buňkách aktivována během vazby IL-18 na receptor.

Inhibitory působení IL-18 mohou být také rozpustné receptory IL-18, molekuly napodobující tyto receptory, činidla blokující receptory IL-18, nebo protilátky vůči IL-18, jako jsou polyklonální nebo monoklonální protilátky, nebo jakékoliv jiné činidlo či molekula, zabraňující vazbě IL-18 na cílové struktury, čímž omezuje nebo zabraňuje spuštění intracelulámích nebo extracelulámích reakcí, zprostředkovaných IL-18.

Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu je inhibitor IL-18 zvolen z protilátek proti IL18, inhibitorů kaspázy-1 neboli ICE a vazebných proteinů IL-18, jejich isoforem nebo farmaceuticky přijatelných solí.

Jako inhibitory IL-18 se popisují protilátky zaměřené proti kterékoli z podjednotek receptorů IL18, antagonisté IL-18 kompletující s IL-18 nebo se na něj navazující a blokující tak receptor IL18, isoformy, muteiny, fúzní proteiny, funkční deriváty, aktivní podíly nebo kruhovitě permutované deriváty takových látek.

Výraz vazebný protein IL-18 je zde používán synonymně s výrazem vazebné proteiny IL-18 nebo IL-18BP. Zahrnuje proteiny navazující IL-18, jak jsou definovány ve WO 99/09 063 nebo Novickem a spoluautory v Immunity 10, na str. 127-136, 1999, včetně spojených (spletených) variant a/nebo isoforem vazebných proteinů IL-18, jak jsou definovány Kimem a spoluautory, 2000. Podle předkládaného vynálezu jsou vhodné zejména lidské isoformy IL18BPa a IL-18BPc. Vhodné proteiny podle tohoto vynálezu mohou být glykosylované i neglykosylované, mohou být získány z přírodních zdrojů, jako je moč, nebo mohou být s výhodou vyráběny rekombinantně. Rekombinantní exprese může probíhat v prokaryotických expresních systémech, jako v E. coli, nebo v eukaryotických a s výhodou v savčích, expresních systémech. Buněčnými liniemi, které jsou zvláště vhodné pro inhibitory IL-18 podle předkládaného vynálezu, jsou buňky z vaječníků čínského křečka (CHO buňky, chinese hamster ovary cells).

Rekombinantní produkce inhibitoru IL-18, pokud je rekombinantně exprimován v savčích buňkách nebo buněčných liniích, může být s výhodou prováděna v médiu pro buněčnou kulturu, které neobsahuje sérum.

Tak, jak je zde použit, týká se výraz muteiny analogů IL-18BP, nebo analogů virového IL18BP, u nichž došlo k nahrazení jednoho nebo více z aminokyselinových zbytků přírodního IL— 18BP nebo virového IL—18BP jinými aminokyselinovými zbytky, nebo došlo k jejich odstranění, nebo došlo k přidání jednoho či více aminokyselinových zbytků k přírodní sekvenci IL-18BP či

-7CZ 307321 B6 virového IL-18BP, aniž by byla podstatně změněna aktivita výsledných produktů ve srovnání s divokým typem IL-18BP nebo s virovým IL-18BP. Tyto muteiny jsou připravovány známým syntetickým postupem a/nebo místně zaměřenými mutagenezními postupy, nebo jakoukoli jinou známou metodou, která je k tomu vhodná.

Aby měl aktivitu srovnatelnou s 1L-18BP, vykazuje jakýkoli takový mutein s výhodou sekvenci aminokyselin, která je dostatečně duplikativní vzhledem k sekvenci IL-18BP, nebo dostatečně duplikativní vzhledem k virovému IL-18BP. Jednou aktivitou IL-18BP je schopnost vázat IL18. Pokud má mutein podstatnou aktivitu týkající se IL-18, je možné ho použít pro čištění IL-18, například za využití afinitní chromatografie a proto je možné ho považovat za mající v podstatě podobnou aktivitu jako IL-18BP. Zda má daný mutein v podstatě stejnou aktivitu jako IL-18BP je tedy možné stanovit pomocí rutinního testování. To zahrnuje podrobení takového muteinu například jednoduchému sendvičovému kompetitivnímu testu, například radioimunitnímu stanovení nebo stanovení ELISA (enzymové imunitní stanovení), pro zjištění, zda se váže na vhodně označený IL-18. Jednoduché funkční testy pro stanovení biologické aktivity IL-18BP jsou podrobně popsány ve WO 99/09 063, například v příkladu 2 (vazba na IL-18 stanovovaná zesíťováním) nebo v příkladu 5 (inhibice prostřednictvím IL-18 injikované indukce INF-gama v mononukleámích krevních buňkách).

V upřednostňovaném ztělesnění vykazuje kterýkoliv takový mutein alespoň 40% identitu (shodnost) nebo homologii se sekvencí buď IL-18BP, nebo virově kódovaného IL-18BP homologu. Ještě lépe pak vykazuje alespoň 50%, alespoň 60%, alespoň 70%, alespoň 80% a nejlépe alespoň 90% identitu nebo homologii.

Muteiny polypeptidů IL-18BP nebo muteiny virových IL-18BP, které se popisují, nebo nukleová kyselina která je kóduje, zahrnují omezenou sadu v podstatě souhlasných sekvencí jako substituční peptidy nebo polynukleotidy, které mohou být rutinně získány osobou s běžnou znalostí oboru bez nezbytného experimentování, na základě zde uvedených postupů a pokynů.

Popisované muteiny zahrnují proteiny kódované nukleovými kyselinami jako DNA či RNA, které hybridizují (kříží se) s DNA nebo RNA, kódujícími inhibitor IL-18, podle předkládaného vynálezu, za podmínek mírné nebo značné tísně. Výraz podmínky tísně se týká hybridizace a následných podmínek promývání, které jsou osobami s běžnou znalostí oboru tradičně označovány za tísnivé. Viz Ausebel se spoluautory, Current Protocols in Molecular Biology, Interscience, NY, § 6.3 a §6.4(1987, 1992) a Sambrook se spoluautory (J. C. Sambrook, E. F. Fritsch a T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Bez vymezování zahrnují příklady podmínek tísně podmínky promývání, prováděného 12 až 20 °C pod vypočítanou hodnotou Tm studovaného hybridu, například promývání 2 x SSC (standardním citrátem sodným) a 0,5% SDS (dodecylsulfátem sodným) po dobu 5 minut, 2 x SSC a 0,1% SDS po dobu 15 minut; 0,1 x SSC a 0,5% SDS 30 až 60 minut při 37 °C a potom 0,1 x SSC a 0,5% SDS po dobu 30 až 60 minut při 68 °C. Osobám s běžnou znalostí tohoto oboru bude zřejmé, že podmínky tísně závisí také na délce sekvencí DNA, oligonukleotidových sond (jako 10 až 40 bází) nebo směsných oligonukleotidových sond. Pokud jsou použity směsné sondy, upřednostňuje se použití tetramethylamoniumchloridu (TMAC) místo SSC. Viz Ausbel, ad výše.

Kterýkoli takový popisovaný mutein vykazuje alespoň 40% identitu (shodnost) nebo homologii se sekvencí o identifikačním čísle 1, 2 nebo 3 podle připojeného seznamu sekvencí. Ještě lépe potom vykazuje alespoň 50%, alespoň 60%, alespoň 70%, alespoň 80% a nejlépe alespoň 90% identitu nebo homologii.

Shodnost či identita odráží vztah mezi dvěma nebo více polypeptidovými sekvencemi nebo mezi dvěma či více polynukleotidovými sekvencemi, určený srovnáním těchto sekvencí. Obecně se

-8CZ 307321 B6 shodnost týká přesné shody nukleotidu vůči nukleotidu nebo aminokyseliny vůči aminokyselině dvou polynukleotidových nebo dvou polypeptidových sekvencí, které jsou srovnávány v délkách svých sekvencí.

U sekvencí, u nichž neexistuje přesná shoda, může být stanoveno % shodnosti. Obecně jsou obě srovnávané sekvence zarovnány tak, aby poskytly maximální úměru, vztah mezi sekvencemi. To může zahrnovat vložení mezemíků (gap) do jedné nebo do obou sekvencí pro zvýšení stupně uspořádání. Procento shodnosti může být stanovováno vzhledem k celé délce každé ze srovnávaných sekvencí (tak zvané globální uspořádání, srovnání), což je zvláště vhodné u sekvencí o shodných nebo velmi podobných délkách, nebo vzhledem ke kratším, určeným délkám (tak zvané místní uspořádání), což je vhodnější u sekvencí s nestejnými délkami.

Metody pro srovnávání shodnosti (identičnosti) a homologie dvou nebo více sekvencí jsou v oboru velmi dobře známé. Tak například programy dostupné v balíčku Wisconsin Sequence Analysis Package, verzi 9.1 (J. Devereux se spoluautory, 1984), jako programy BESTFIT a GAP, je možné použít ke stanovení % shodnosti dvou polynukleotidů a % shodnosti a % homologie dvou polypeptidových sekvencí. BESTFIT používá algoritmus místní homologie Smitha a Watermana (1981) a zjišťuje nejlepší jednotlivou oblast podobnosti obou sekvencí. V oboru jsou známé i jiné programy pro určení identity (shodnosti) a/nebo podobnosti sekvencí, například skupina programů BLAST (S. F. Altschul se spoluautory, J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990 a S. F. Altschul se spoluautory, Nucleic Acid Res. 25, 389-3402, 1997, dostupné z homepage NCBI na www.ncbi.nlm.nih.gov) a FASTA (W. R. Pearson, Methods in Enzymology 183, 63-99, 1980 a Pearson a Lipman, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 2444-2448, 1988).

Upřednostňovanými změnami muteinu jsou změny, známé jako konzervativní substituce. Konzervativní aminokyselinové substituce polypeptidů nebo proteinů IL-18BP či virových IL-18BP mohou zahrnovat synonymní aminokyseliny v rámci skupiny, mající dostatečně podobné fyzikálně chemické vlastnosti k tomu, aby substituce mezi členy skupiny zachovala biologickou funkci molekuly (Grantham, Science 185, 862-864, 1974). Je jasné, že ve výše uvedených sekvencích je bez pozměnění jejich funkce možné provádět také inserce a delece aminokyselin, zvláště pokud takové delece a inserce zahrnují pouze několik aminokyselin, například méně než 30 a lépe méně než 10 a netýkají se odstranění nebo přemístění aminokyselin, které jsou kritické pro funkční konformaci, například cysteinových zbytků. Proteiny a muteiny vytvářené takovými delecemi a/nebo insercemi rovněž spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Synonymní aminokyselinové skupiny jsou s výhodou ty, definované v tabulce 1. Výhodněji jsou synonymními aminokyselinovými skupinami ty, definované v tabulce 2 a nejvýhodněji jsou synonymními aminokyselinovými skupinami ty, definované v tabulce 3.

Tabulka 1

Upřednostňované skupiny synonymních aminokyselin:

aminokyseliny Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile

synonymní skupina Ser, Thr, Gly, Asn Arg, Gin, Lys, Glu, His Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu Gly, Ala, Thr, Pro Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr Gly, Thr, Pro, Ala Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val Ala, The, Pro, Ser, Gly Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile,

-9CZ 307321 B6

Phe Tyr Cys His Gin Asn Lys Asp Glu Met Trp

Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr Ser, Thr, Cys Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, Gin Gin, Asp, Ser, Asn Glu, Gin, His, Arg, Lys Glu, Asn, Asp Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu Phe, Ile, Val, Leu, Met Trp

Tabulka 2

Upřednostňovanější skupiny synonymních aminokyselin:

aminokyseliny Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile, Phe Tyr Cys His Gin Asn Lys Asp Glu Met Trp

synonymní skupina Ser His, Lys, Arg Leu, Ile, Phe, Met, Ala, Pro Thr Pro, Ala Val, Met, Ile Gly Ile, Met, Phe, Val, Leu, Met, Tyr, Ile, Leu, Phe Phe, Tyr Ser, Cys His, Gin, Arg, Glu, Gin, His Asp, Asn Lys, Arg Asn, Asp Glu, Gin Met, Phe, Ile, Val, Leu, Trp

Tabulka 3

Nej upřednostňovanější skupiny synonymních aminokyselin:

aminokyseliny Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe

synonymní skupina Ser Arg Leu, Ile, Met Pro Thr Ala Val Gly Ile, Met, Leu Phe

- 10CZ 307321 B6

Tyr	Tyr
Cys	Ser, Cys
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, Ile, Leu
Trp	Met

Příklady vytváření aminokyselinových náhrad v proteinech, které lze použít k získání muteinu polypeptidů nebo proteinů IL-18BP, či muteinu virových IL-18BP pro použití v předkládaném vynálezu, zahrnují kroky jakýchkoliv známých metod, jaké jsou například uvedeny v patentech US 4 959 314, US 4 588 585 a US 4 737 462 (Mark se spoluautory); US 5 116 943 (Koths se spoluautory); US 4 965 195 (Namen se spoluautory); US 4 879 111 (Chong se spoluautory); US 5 017 691 (Lee se spoluautory); a zahrnují i lysinové substituované proteiny, předložené v patentu US 4 904 584 (Shaw se spoluautory).

Výraz fúzní protein se týká polypeptidů, obsahujícího IL-18BP, nebo virový 1L-18BP, nebo mutein či fragment takových látek, spojený s jiným proteinem, který má například prodlouženou dobu dostupnosti (setrvání) v tělních tekutinách. 1L-18BP nebo virový IL-18BP tedy mohou být připojeny na jiný protein, polypeptid nebo podobně, jako například na imunoglobulin či na jeho fragment.

Funkční deriváty, jak jsou zde používány, zahrnují deriváty 1L-18BP nebo virových IL-18BP a jejich muteiny a fúzní proteiny, které mohou být připraveny z funkčních skupin, které se vyskytují jako vedlejší řetězce na zbytcích, nebo z N- a C-koncových skupin, takovými prostředky které jsou známé v oboru a jsou do vynálezu zahrnuty potud, pokud zůstávají farmaceuticky přijatelné, což znamená, že neničí aktivitu proteinu, která je v podstatě stejná jako aktivita IL-18BP nebo virových IL-18BP a nepropůjčují prostředkům, které je obsahují, toxickou aktivitu.

Takové deriváty mohou obsahovat například polyethylenglykolové vedlejší řetězce, které mohou maskovat antigenní místa a prodlužovat přetrvání IL-18BP nebo virového IL-18P v tělních tekutinách. Jiné deriváty zahrnují alifatické estery karboxylových skupin, amidy karboxylových skupin vzniklé reakcí s amoniakem nebo s primárními či sekundárními aminy, N-acylové deriváty volných aminových skupin aminokyselinových zbytků, vytvářené s acylovými částicemi (například s alkanoylem nebo s karbocyklickými aroylovými skupinami), či O-acylové deriváty volných hydroxylových skupin (například serylových nebo threonylových zbytků), vytvářené s acylovými částicemi.

Jako aktivní podíly IL-18BP nebo virového IL-18BP, muteinu a fúzních proteinů, zahrnuje předkládaný vynález jakékoliv fragmenty nebo prekursory polypeptidového řetězce proteinové molekuly samotné nebo dohromady s asociovanými molekulami nebo zbytky na ni navázanými, například s cukry či fosfátovými zbytky; nebo agregáty proteinové molekuly či cukerné zbytky samy o sobě, s tou podmínkou, že uvedený podíl má v podstatě stejnou aktivitu jako IL-18BP.

Výraz sole se v tomto vynálezu vztahuje jak na sole karboxylových skupin, tak na kyselé adiční sole aminových skupin molekuly inhibitoru IL-18, nebo analogů takových látek. Sole karboxylové skupiny mohou být vytvářeny prostředky které jsou v oboru známé a zahrnují anorganické sole, například sodné, vápenaté, amonné, železité nebo zinečnaté sole a podobně a sole s organickými bázemi jako jsou ty, vytvořené například s aminy jako jsou triethanolamin, arginin nebo lysin, piperidin, prokain a podobně. Kyselé adiční sole zahrnují například sole s minerálními kyselinami, jako například s kyselinou chlorovodíkovou nebo sírovou a sole s

- 11 CZ 307321 B6 organickými kyselinami, jako například s kyselinou octovou nebo šťavelovou. Každá taková sůl si ovšem musí zachovat biologickou aktivitu OPN odpovídající předkládanému vynálezu, tj. musí vykazovat proliferativní působení na oligodendrocyty.

V dalším upřednostňovaném ztělesnění tohoto vynálezu je inhibitorem IL-18 protilátka zaměřená proti IL-18. Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být polyklonální nebo monoklonální, chimérické, humanizované, nebo dokonce plně humánní. Rekombinantní protilátky a jejich fragmenty jsou charakterizovány vysokou vazebnou afinitou k IL-18 in vivo a nízkou toxicitou. Protilátky, které lze použít v tomto vynálezu, jsou charakterizovány svou schopností léčit pacienty po dobu, která je dostačující k dosažení dobré až vynikající regrese nebo zmírnění patogenního či chorobného stavu nebo jakéhokoliv příznaku či skupiny příznaků, vztahujících se k chorobnému stavu, a svou nízkou toxicitou.

Neutralizující protilátky jsou u zvířat, jako jsou králíci, kozy nebo myši, snadno zvýšeny imunizací prostřednictvím IL-18. Imunizované myši jsou zvláště vhodné k zajištění zdrojů buněk B pro výrobu hybridomů, které jsou naopak kultivovány k produkci velkých množství monoklonálních protilátek vůči IL-18.

Chimérickými protilátkami jsou imunoglobulinové molekuly, charakterizované dvěma nebo více segmenty či podíly, získanými od různých zvířecích druhů. Obecně se variabilní oblast chimérické protilátky získá z nehumánní savčí protilátky, jako je myší monoklonální protilátka a konstantní oblast imunoglobulinu se získá z lidské imunoglobulinové molekuly. Obě oblasti i jejich kombinace s výhodou vykazují nízkou imunogenitu, jak se rutinně stanoví podle Elliota a spoluautorů, Lancet 344, 1125-1 127, 1994.

Humanizované protilátky jsou imunoglobulinové molekuly vytvořené postupy genetického inženýrství, u nichž byly myší konstantní oblasti nahrazeny svými lidskými protějšky při zachování myších vazebných oblastí pro antigen. Výsledná myší-lidská chimérická protilátka u lidí s výhodou vykazuje sníženou imunogenitu a zlepšenou farmakokinetiku (Knight se spoluautory: Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody; Mol. Immunol. 30(16), 1443-1453, 1993).

V dalším upřednostňovaném ztělesnění je tedy protilátkou vůči IL-18 humanizovaná protilátka vůči IL-18. Výhodné příklady humanizovaných protilátek vůči IL-18 jsou popsány například v evropské patentové přihlášce EP 0 974 600.

V ještě dalším upřednostňovaném ztělesnění je protilátka plně humánní, lidská. Technika produkování lidských protilátek je podrobně popsána například ve WO 00/76 310, WO 99/53 049, US 6 162 963 nebo AU 5 336 100. Plně humánními protilátkami jsou s výhodou rekombinantní protilátky vytvářené transgenními zvířaty, například xeno myšmi, a zahrnují celý lokus funkční lidského Ig, nebo jeho části.

Ve vysoce upřednostňovaném ztělesnění předkládaného vynálezu je inhibitorem IL-18 vazebný protein IL-18, tj. IL18BP, nebo jeho isoforma, mutein, fúzní protein, funkční derivát, aktivní podíl nebo kruhovitě permutovaný derivát. Tyto isoformy, muteiny, fúzní proteiny nebo funkční deriváty si zachovávají biologickou aktivitu IL-18BP, zejména schopnost vazby na IL-18 a s výhodou mají v podstatě alespoň stejnou aktivitu jako IL-18BP. V ideálním případě mají takové proteiny ve srovnání s nemodifikovaným, nepozměněným IL-18BP zvýšenou biologickou aktivitu. Upřednostňované aktivní frakce, podíly, mají aktivitu lepší než je aktivita IL-18BP nebo vykazují aktivitu mající další výhody, jako je lepší stálost či nižší toxicita nebo imunogenita, anebo jsou snadněji produkovatelné ve velkých množstvích, či se snadněji čistí.

Sekvence II-18BP a jejich spojené (spletené) varianty/isoformy mohou být převzaty z WO 99/09 063 nebo z práce Novicka a spoluautorů, 1999, stejně jako z práce Kima a spoluautorů, 2000.

- 12CZ 307321 B6

Funkční deriváty IL-18BP mohou být konjugovány s polymery pro zlepšení takových vlastností proteinu, jako jsou stálost, poločas, biologická dostupnost, snášenlivost lidským tělem nebo imunogenita. K dosažení tohoto účelu může funkční derivát obsahovat alespoň jednu částici, připojenou na jednu nebo více z funkčních skupin, které se vyskytují jako jeden nebo více z postranních řetězců aminokyselinových zbytků. Takovou funkční skupinou může být například polyethylenglykol, PEG. Navázání na PEG může být prováděno známými postupy, popsanými například ve WO 92/13 095.

V upřednostňovaném ztělesnění tohoto vynálezu jsou tedy inhibitory IL-18 a zejména IL-18BP vázány na PEG (PEGylovány).

V dalším upřednostňovaném ztělesnění tohoto vynálezu je inhibitor IL-18 fúzním proteinem, obsahujícím část vazebného proteinu IL-18 nebo celý takový protein, který je spojen (fúzován) s částí imunoglobulinu nebo s celým imunoglobulinem. Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že výsledný fúzní protein podle tohoto vynálezu vykazuje biologickou aktivitu IL-18BP, zejména pokud se týká vazby IL—18.

Fúze může být přímá nebo prostřednictvím krátkého spojovníku, spojovacího peptidu, který může být tvořen třeba jen jedním až třemi aminokyselinovými zbytky nebo může být delší, například mít délku 13 aminokyselinových zbytků. Zmíněným spojovníkem může být tripeptid o sekvenci E-F-M (Glu-Phe-Met) nebo sekvence, tvořená 13 aminokyselinami, kterými jsou GluPhe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met, vložené mezi sekvenci IL-18BP a sekvenci imunoglobulinu. Výsledný fúzní protein má zlepšené vlastnosti, jako jsou prodloužená doba výskytu v tělních tekutinách (poločas), zvýšená specifická aktivita, zvýšená úroveň exprese, nebo se fúzní protein snáze čistí.

V upřednostňovaném ztělesnění fúzuje IL-18BP s konstantní oblastí imunoglobulinové molekuly. S výhodou je připojen do oblastí těžkých řetězců, jako jsou například domény CH2 a CH3 lidského IgG 1. Vytváření specifických fúzních proteinů, obsahujících IL-18BP a imunoglobulinovou část, je například popsáno v příkladu 11 patentu WO 99/09 063. Pro vytváření fúzních proteinů podle předkládaného vynálezu se hodí i další isoformy imunoglobulinových molekul, jako například lgG₂ nebo lgG₄ nebo jiné třídy imunoglobulinu, jako IgM nebo IgA. Fúzní proteiny mohou být monomerní nebo multimemí, hetero- nebo homomultimerní.

Interferony jsou známé především svými inhibičními účinky na virovou replikaci a buněčnou proliferaci. Například interferon-γ hraje významnou roli v podpoře imunitní a zánětové odpovědi. Uvádí se, že interferon-β (IFB-β, interferon typu I) má protizánětlivý účinek.

Tento vynález se tedy týká také použití kombinace inhibitoru IL-18 a interferonu k výrobě léčiva pro léčbu poškození CNS.

Interferony mohou být pro zlepšení stálosti proteinů také konjugovány s polymery. Ve WO 99/55 377 byl například popsán konjugát interferonu-β a polyolu polyethylenglykolu (PEG).

V jiném upřednostňovaném ztělesnění je interferonem interferon-β IFN-β) a ještě lépe interferon-β la.

Inhibitor produkce a/nebo působení IL-18 se s výhodou používá souběžně, následně nebo odděleně vzhledem k interferonu.

V literatuře bylo popsáno, že faktor nekrózy tumoru, TNF, má při poškození mozku jak ochranné, tak i toxické účinky (Shohami se spoluautory, 1999). V příkladu 1 (viz níže) vyvolala injikace TNF myši po vážném mozkovém traumatu významné snížení hladiny IL-18 v mozku, což ukazuje, že TNF může mít přínosný účinek na zotavení se z traumatického poškození mozku.

- 13 CZ 307321 B6

Upřednostňované ztělesnění tohoto vynálezu se tedy týká použití inhibitoru IL-18 v kombinaci s TNF pro výrobu léěiva k léčbě a/nebo prevenci mozkového poškození, určeného pro souběžné, následné nebo oddělené použití.

Podle předkládaného vynálezu se upřednostňuje kombinace inhibitorů IF-18 a TNF-a.

V dalším upřednostňovaném ztělesnění tohoto vynálezu léčivo dále obsahuje protizánětlivé činidlo, jako NSAID (nesteroidní protizánětlivé léčivo). V upřednostňovaném ztělesnění se v kombinaci s inhibitorem IF-18 používá inhibitor-COX (cyklooxigenázy) a nejlépe inhibitor COX-2. Inhibitory COX jsou v oboru známé. Specifické inhibitory COX-2 jsou uvedeny například ve W001/00 229. Aktivní složky mohou být použity souběžně, následně nebo odděleně.

V literatuře bylo popsáno, že roli v patofyziologii poškození mozku hraje i oxidativní stres a zejména druhy reaktivního kyslíku (ROS, reactive oxygen species) (Shohami se spoluautory, J. Cereb. Blood Flow Metab. _F7, 1007-1019, 1997.

V upřednostňovaném ztělesnění předkládaného vynálezu tedy léčivo dále obsahuje antioxidant pro souběžné, následné nebo oddělené použití. V oboru je známo mnoho antioxidantů, jako například vitamíny A, C nebo E, kyselina 5-aminosalicylová, nebo superoxiddismutáza.

V dalším upřednostňovaném ztělesnění předkládaného vynálezu se inhibitor IF-18 používá v množství přibližně od 0,001 do 100 mg/kg tělesné hmotnosti, nebo přibližně od 0,01 do 10 mg/kg tělesné hmotnosti, nebo přibližně od 0,1 do 3 mg/kg tělesné hmotnosti anebo v množství přibližně od 1 do 2 do mg/kg tělesné hmotnosti.

V ještě výhodnějším ztělesnění se inhibitor IF-18 používá v množství přibližně od 0,1 do lOOOu.g/kg tělesné hmotnosti, nebo přibližně od 1 do 100 pg/kg tělesné hmotnosti, nebo v množství přibližně od 10 do 50 pg/kg tělesné hmotnosti.

Tento vynález se dále týká použití molekuly nukleové kyseliny obsahující kódující sekvenci inhibitoru 1L-18, muteinu, funkčního derivátu, nebo aktivního podílu takového inhibitoru, pro výrobu léčiva k léčbě a/nebo prevenci poškození CNS.

Molekula takové nukleové kyseliny s výhodou dále obsahuje sekvenci expresního vektoru, například pro použití genové léčby k poskytnutí inhibitoru IF-18 podle tohoto vynálezu.

Molekula takové nukleové kyseliny se s výhodou podává nitrosvalově.

Pro léčbu a/nebo prevenci poškození CNS může být vektor pro genovou léčbu, obsahující sekvenci inhibitoru produkce a/nebo působení IF-18, injikován například přímo do nemocné tkáně, což vyloučí obtíže, spojené se systémovým podáváním vektorů pro genovou léčbu, mezi které patří naředění vektorů, dosažení cílových buněk nebo tkání a vedlejší účinky.

Podle tohoto vynálezu je rovněž předpokládáno použití vektoru pro indukci a/nebo zvýšení endogenní produkce inhibitoru IF-18 v buňce, normálně nečinné (mlčící) pokud se týká exprese inhibitoru IF-18, nebo v buňce, exprimující taková množství inhibitoru, která nejsou dostatečná. Vektor může obsahovat regulační sekvence, které jsou funkční v buňkách, u nichž je žádoucí exprese inhibitoru IF-18. Takovými regulačními sekvencemi mohou být například promotory nebo enhancery, zesilovače. Regulační sekvence pak může být zavedena do správného lokusu genomu homologní rekombinací, čímž operativně spojí regulační sekvenci s genem, jehož exprese má být indukována nebo zvýšena. Tato technika se obvykle označuje jako endogenní genová aktivace (EGA) a je popsána například ve WO 91/09 955.

- 14CZ 307321 B6

Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že expresi IL-18 je možné vypnout přímo, bez použití inhibitoru IL-18, a to stejnou technikou. K. takovému účelu může být do lokusu genu IL-18 zaveden negativní regulační prvek, jako například umlčující prvek, což vede k zastavení nebo prevenci exprese IL-18. Odborníkovi v oboru zřejmé, že takové vypnutí nebo umlčení exprese IL-18 má pro prevenci a/nebo léčbu onemocnění stejný účinek, jako použití inhibitoru IL-18.

Předkládaný vynález se dále týká použití buněk, které byly geneticky pozměněny k produkci inhibitoru IL-18, pro výrobu léčiva k léčbě a/nebo prevenci poškození CNS.

Tento vynález se dále týká farmaceutických prostředků, které jsou zvláště vhodné k prevenci a/nebo léčbě zánětlivého poškození CNS a zahrnují léčebně účinné množství inhibitoru IL-18 a/nebo léčebně účinné množství interferonu a/nebo farmaceuticky účinné množství TNF a/nebo farmaceuticky účinné množství protizánětlivého činidla a/nebo farmaceuticky účinné množství antioxidačního činidla.

Jako inhibitor IL-18 může prostředek obsahovat inhibitory kaspázy-1, protilátky vůči 1L—18, protilátky vůči podjednotkám receptorů IL-18, inhibitory signální dráhy IL-18, antagonisty IL18, kteří s IL-18 kompetují a blokují receptor IL-18 a vazebné proteiny IL-18, nebo isoformy, muteiny, fúzní proteiny, funkční deriváty, aktivní podíly nebo kruhovitě permutované deriváty takových látek, mající stejnou aktivitu.

Upřednostňovanými aktivními složkami farmaceutických prostředků jsou IL-18BP a jeho isoformy, muteiny, fúzní proteiny, funkční deriváty, aktivní podíly nebo kruhovitě permutované deriváty, jak byly popsány výše.

Interferonem, obsaženým ve farmaceutickém prostředkuje s výhodou lFN-β nebo IFN-a.

V ještě dalším upřednostňovaném ztělesnění farmaceutický prostředek obsahuje léčebně účinná množství TNF-α. Farmaceutický prostředek podle tohoto vynálezu může dále obsahovat jeden nebo více z inhibitorů COX.

Definice farmaceuticky přijatelný zahrnuje jakýkoliv nosič, který není na překážku účinnosti biologické aktivity aktivní přísady, a který není toxický vůči hostiteli, jemuž je podáván. Pro parenterální podávání mohou být aktivní proteiny například formovány do jednotkové formy dávkování pro injekce v nosných prostředích (vehikulech), jako jsou fyziologický roztok, roztok dextrózy, sérový albumin a Ringerův roztok.

Aktivní přísady farmaceutického prostředku podle tohoto vynálezu mohou být jedinci podávány různými způsoby. Cesty podávání zahrnují intradermální, transdermální (například u pomalu uvolňovaných prostředků), intramuskulámí, intraperitoneální, intravenózní, subkutánní, orální, intrakraniální, epidurální, místní a intranasální cesty podání. Použity mohou být i kterékoliv jiné, léčebně účinné cesty podání, například absorpce přes epiteliální nebo endoteliální tkáně nebo genová léčba, u níž se pacientovi podává molekula DNA, kódující aktivní činidlo, (například cestou vektoru), což vyvolá expresi aktivního činidla a jeho sekreci in vivo. Nadto mohou být proteiny podle tohoto vynálezu podávány společně s dalšími složkami biologicky aktivních činidel, jako jsou farmaceuticky přijatelné povrchově aktivní látky, pomocná činidla, nosiče, ředidla a nosná prostředí.

Pro parenterální (například intravenózní, subkutánní, intramuskulámí) podání mohou být aktivní proteiny formovány jako roztok, suspenze, emulze nebo lyofilizovaný prášek ve spojení s farmaceuticky přijatelným parenterálním nosným prostředím (s vodou, fyziologickým roztokem, roztokem dextrózy) a s přídavnými látkami, které udržují isotoničnost (například s mannitolem) nebo chemickou stálost (například konzervačními látkami a pufry). Prostředek se sterilizuje běžně používanými postupy.

- 15 CZ 307321 B6

Biologická dostupnost aktivního proteinu nebo proteinů podle tohoto vynálezu může být také zlepšena použitím konjugačních postupů, které zvyšují poločas molekuly v lidském těle, například navázáním molekuly na polyethylenglykol, jak je popsáno v PCT patentové přihlášce WO 92/13 095.

Léčebně účinná množství aktivního proteinu nebo proteinů budou funkcí mnoha proměnných, zahrnujících typ antagonisty, afinitu antagonisty k IL-18, jakoukoliv zbytkovou cytotoxickou aktivitu vykazovanou antagonisty, způsob podávání, klinický stav pacienta (včetně požadavku udržení netoxické hladiny endogenní aktivity IL-18).

Léčebně účinné množství je takové množství inhibitoru IL-18, jehož podáváním se dosáhne inhibice biologické aktivity IL-18. Dávka, podávaná jedinci, ať už ve formě jediné dávky nebo více dávek, se bude lišit v závislosti na množství faktorů, které zahrnují farmakokinetické vlastnosti inhibitoru IL—18, způsob podávání, stav a charakteristiky pacienta (pohlaví, věk, tělesná hmotnost, zdraví, tloušťka), rozsah příznaků, souběžné léčby, četnost léčení a požadovaný účinek. Úprava a vytvoření stanoveného dávkového rozmezí jsou v silách odborníka v oboru, stejně jako metody prováděné in vivo a in vitro, stanovující inhibici IL-18 daného jedince.

Podle tohoto vynálezu se inhibitor IL-18 používá v množství přibližně od 0,0001 do 100 mg/kg, nebo přibližně od 0,01 do 10 mg/kg tělesné hmotností, nebo v množství přibližně od 0,1 do 5 mg/kg tělesné hmotnosti, nebo přibližně od 1 do 3 mg/kg tělesné hmotnosti, nebo přibližně v množství od 1 do 2 mg/kg tělesné hmotnosti. Alternativně mohou být inhibitory IL-18 podávány v množství přibližně od 0,1 do 1000 pg/kg tělesné hmotnosti nebo přibližně od 1 do 100 pg/kg či přibližně od 10 do 50 pg/kg tělesné hmotnosti.

Cestou podávání, která se upřednostňuje podle tohoto vynálezu, je subkutánní (podkožní) podání. Dále se podle tohoto vynálezu upřednostňuje také intramuskulámí (nitrosvalové) podání. K. podání inhibitoru IL-18 přímo do místa jeho působení se upřednostňuje také jeho intrakraniální (nitrolební) nebo intratekální podání. Intrakraniální podání se zvláště upřednostňuje v kombinaci s otevřeným poraněním hlavy (střelné poranění mozku).

V dále upřednostňovaných ztělesněních se inhibitor IL-18 podává denně, nebo každý druhý den.

Denní dávky jsou obvykle podávány rozdělené na části nebo ve formě s prodlouženým uvolňováním, která je účinná pro získání požadovaných výsledků. Je možné uskutečnit také druhé nebo následné podání v dávkách, které jsou stejné, menší nebo větší než původní či předchozí dávka, podávaná jedinci. Druhé nebo následné podání může být aplikováno před nástupem onemocnění, nebo během jeho nástupu.

Podle tohoto vynálezu může být inhibitor IL—18 jedinci podáván profylakticky nebo léčebně předem, souběžně nebo následně s ohledem na další léčebné režimy nebo činidla (například násobné léčebné režimy), v léčebně účinném množství, zejména s interferonem a/nebo s TNF a/nebo s jiným protizánětlivým činidlem, jako je inhibitor COX a/nebo antioxidační činidlo. V závislosti na poškození mozku je místo společného podání samotného TNF možné zvažovat také společné podání antagonisty TNF (Shohami se spoluautory, 1999). Aktivní činidla, která se podávají souběžně s jinými léčebnými činidly, mohou být podávána ve stejných nebo v odlišných prostředcích.

Tento vynález se dále týká způsobu výroby farmaceutického prostředku, který zahrnuje smísení účinného množství inhibitoru IL-18 a/nebo interferonu a/nebo antagonisty TNF a/nebo inhibitoru COX s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Tento vynález se dále týká způsobu léčby poškození CNS, který zahrnuje podávání farmaceuticky účinného množství inhibitoru IL-18 pacientovi, který to potřebuje.

- 16CZ 307321 B6

Veškeré odkazy, které jsou zde citovány, zahrnující články nebo souhrny z časopisů, zveřejněné nebo nezveřejněné US nebo zahraniční patentové přihlášky, udělené US nebo zahraniční patenty nebo jakékoliv jiné odkazy, jsou zde plně začleněny jako odkaz, včetně veškerých údajů, tabulek, obrázků a textu, obsažených v citovaných odkazech. Nadto jsou jako odkaz plně začleněny také úplné obsahy odkazů, uváděných ve zde citovaných odkazech.

Odkaz na známé kroky způsobu, kroky běžných metod, známé metody nebo běžné metody není žádným způsobem přiznáním toho, že jakýkoliv aspekt, popis nebo ztělesnění předkládaného vynálezu jsou uvedeny, popsány nebo navrženy v dosavadním stavu techniky.

Následující popis specifických ztělesnění bude tedy plně ukazovat obecnou povahu vynálezu, kterou mohou ostatní, za použití znalostí z oboru (včetně obsahů odkazů zde uváděných) snadno pozměnit a/nebo upravit pro různá použití takových specifických ztělesnění bez dalších pokusů, aniž by překročili obecný koncept předkládaného vynálezu. Proto takové úpravy a změny patří do smyslu a rozsahu ekvivalentu předkládaných ztělesnění na základě zde uvedených údajů a vodítek. Mělo by být zřejmé, že zde uváděná terminologie nebo výrazové prostředky jsou pro účely popisu a nikoliv jako omezení a že taková terminologie nebo výrazové prostředky, použité v předkládaném popisu, mají být odborníkem v oboru vykládány ve světle údajů a vodítek zde uváděných, v kombinaci se znalostmi člověka s běžnou znalostí oboru.

Nyní, po popsání tohoto vynálezu, bude vynález mnohem snadněji srozumitelný s odkazem na následující příklady, které jsou poskytnuty pouze pro dokreslení a nejsou zamýšleny k omezení tohoto vynálezu.

Příklady uskutečnění vynálezu

Materiály a metody

Model traumatu

V této studii byli použiti myší samci ve věku 8 až 16 týdnů o hmotnosti 30 až 35 gramů. Byli ustájeni ve speciálním prostředí bez přítomnosti patogenů, udržováni při standardních teplotních a světelných podmínkách v klecích po 4 až 6 zvířatech a bylo jim poskytováno krmivo a voda ad libitum. Studie byla prováděna podle pravidel výboru Institutional Animal Care Committee of the Hebrew University of Jerusalem, Izrael. Uzavřené poranění hlavy, CHI, bylo získáno za použití dříve vyvinutého zařízení s padajícím závažím (Chen se spoluautory: An experimental model of dosed head iniury in mice: pathophysiology, histopathology and cognitive deficits; J. Neurotrauma 13, 557-568, 1996).

V krátkosti, po použití etherové anestezie byl proveden podlouhlý střednicový řez, pokožka byla rozevřena a byla obnažena lebka. Po identifikaci levé přední čelní oblasti byl zahrocený teflonový kužel umístěn přibližně 1 mm bočně od střednice, do střední koronární roviny. Hlava byla upevněna a závaží o hmotnosti 75 g bylo spuštěno na kužel z výšky 18 cm, čímž bylo vytvořeno ložiskové (fokální) poškození levé hemisféry. Po traumatu myši obdržely podpůrné okysličení 100% O₂ v trvání nejvýše 2 minut a byly vráceny do klecí.

Stanovení hladin IL—18 v myším mozku

Pro kvantifikaci intrakraniálních (nitrolebních) hladin IL-18 byly myši kmene C57BL/6 (B6), v celkovém počtu n=62, rozděleny do šesti oddělených skupin. Byly to skupiny (1) normální kontroly, tj. neovlivňované myši B6 (n = 10); (2) etherová anestezie; tj. myši podrobené desetiminutové etherové anestezii a usmrcené dekapitací po 24 hodinách (n=10) nebo po 7 dnech (n=10); (3) předstíraná či klamná operace, tj. myši podrobené anestezii a podlouhlému rozříznutí pokožky na hlavě, usmrcené po 24 hodinách (n = 15) či po 7 dnech; (4)

- 17CZ 307321 B6 traumatizovaná skupina, tj. myši, které podstoupily pokusné CHI, jak bylo popsáno výše a byly usmrceny dekapitací pod etherovou anestezii po 4 hodinách (n = 7), 24 hodinách (n = 7) a po 7 dnech (n = 7) po traumatu; (5) injikace TNF, tj. pro stanovení možné role TNF v regulaci intracerebrálního IL-18 byly myši podrobeny etherové anestezii a intracerebroventrikulámě (i.c.v., do mozkové dutiny) jim byla injikováno 200 ng myšího rekombinantního TNF (R&D Systems, Abingdon, Velká Británie) v 10 μΙ sterilního fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS); po 24 hodinách byly usmrceny (n = 10); (6) klamná injikace, tj. těmto myším bylo i.c.v. injikováno 10 μΐ sterilního, fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku a byly usmrceny po 24 hodinách (n=6), jako kontrolní skupina ke zvířatům, jimž byl podán TNF.

U veškerých myší byly mozky odebrány bezprostředně po dekapitaci, poté byly rychle zmrazený v kapalném dusíku a až do analýzy byly uchovávaný při teplotě -70 °C. Mozky ze skupiny podrobené traumatu byly rozděleny na levou (ipsilaterální) a pravou (kontralaterální, protilehlou) hemisféru, což umožnilo srovnání hladin IL—18 v poškozené hemisféře a v nepoškozené hemisféře. Tkáňová homogenizace byla provedena za použití zařízení Polytron (Kinematica, Kriens, Švýcarsko) a naředění 1:4 v ledově studeném extrakčním pufru (hmotn./hmotn.), obsahujícím 50 mmol.F¹ Tris o pH 7,2, 150 mmol.F¹ NaCl, 1% Triton X-100 (Boehringer Mannheim, Rotkreuz, Switzerland) a kokteil inhibitorů proteázy (Boehringer Mannheim). Homogenát byl protřepáván na ledu 90 minut a poté byl 15 minut odstřeďován při 3000 g a teplotě 4 °C. Supernatanty byly rozděleny na alikvotní části a uchovávány až do doby analýzy při -70 °C.

Koncentrace celkové bílkoviny byly v mozkových extraktech měřeny Bradfordovým stanovením (Bio Rad Laboratories, Mnichov, Německo) a bylo zjištěno, že jsou u všech hodnocených myší velmi stálé (12,1 ± 2,1 mg/ml; průměr ± směrodatná odchylka). Kvantifikace intracerebrálních hladin cytokinů byla stanovena pomocí testu EL1SA, specifického pro myší IL-18, podle údajů uváděných výrobcem (R&D Systems, Abingdon, Velká Británie). Citlivost testu byla 5 pg/ml. Pro srovnání intracerebrálních hladin IL-18 u jednotlivých zvířecích skupin byla veškerým koncentracím pod hranicí detegovatelnosti 5 pg/ml přiřazena hodnota 4,9 pg/ml. Vzorky byly použity duplicitně ve dvou jamkách, nenaředěné a konečná koncentrace byla počítána z průměru OD (optické hustoty) duplicitních vzorků. OD byla stanovována spektrofotometrem (Dynatech Laboratories lne., Chantilly, VA) při vlnové délce extinkce 405 nm.

Protokol působení IL-18BP

Pro studie IL-18BP byli použiti myší samci kmene Sabra z Hebrejské University (Sabra mice of the Hebrew University strain), n = 40. Anestezie a pokusné CHI byly stejné jako při stanovení IL-18 (viz výše). Pro protokol působení byla zvířata rozdělena do dvou skupin: ve skupině A (kontrolní skupina, n = 16) byly myši podrobeny pokusnému CHI, po jedné hodině jim bylo injikováno samotné vehikulum, nosné prostředí (PBS) a 7 dní byly pozorovány k neurologické analýze. Ve skupině B (studovaná skupina, n = 18) bylo myším bezprostředně po stanovení neurologického hodnocení (viz níže), prováděném v čase t=l hodina po CHI, injikováno intraperitoneálně 50 pg IL-18BP. Vzhledem k tomu, že podle dřívějšího zjištění u stejného pokusného modelu (Chen se spoluautory, 1996) je průstupnost bariéry mezi krví a mozkem mezi 1 a 4 hodinami po CHI 5-6 násobně zvýšena, je za těchto podmínek IL-18BP pro mozek dostupný. Stejně jako skupiny A a B byly ovlivněny i dvě další skupiny, skupina C, tj. kontrolní skupina a skupina D, tj. studovaná skupina, zvířata byla po 48 hodinách usmrcena dekapitací a jejich mozky byly nakrájeny pro stanovení posttraumatického edému, jakje popsáno níže.

Hodnocení neurologického poškození

Pro určení posttraumatického neurologického poškození bylo již dříve vyvinuto a ověřeno Hodnocení neurologické závažnosti (NSS, Neurological Severity Score) (Stahel se spoluautory, 2000).

- 18CZ 307321 B6

Hodnocení sestává z 10 jednotlivých klinických úkolů, zaměřených na motorické funkce, bystrost a fyziologické chování, přičemž jeden bod se uděluje za neúspěch při úkolu a za úspěšné provedení se nedává žádný bod (tabulka 4). Maximální NSS v hodnotě 10 bodů indikuje vážnou neurologickou dysfunkci, s neúspěchem ve všech úkolech, zatímco nulové hodnocení je dosaženo u zdravých, neporaněných myší. NSS v čase 1 hodinu po traumatu odráží počáteční závažnost poškození a je vysoce v souladu s klinickým výsledkem (Beni-Adani se spoluautory, 2001). Hodnocení úspěšnosti úkolů bylo prováděno dvěma hodnotícími, kteří hodnotili na slepo (aniž by znali hodnocenou skupinu) v časech 1 h, 24 h, 72 h a 7 dnů po pokusném CHI. ANSS, vypočítaná jako rozdíl mezi NSS v čase t=lhaNSS ve kterémkoliv pozdějším časovém intervalu, je parametrem, který odráží stupeň spontánního zotavení po poškození mozku, jak bylo popsáno dříve (Chenem se spoluautory, 1996).

Tabulka 4: Hodnocení neurologické závažnosti (NSS) u myší s poraněním hlavy

úkol	popis	body (úspěch/neúspěch)
únikový kruh	schopnost a iniciativa opustit kruh o průměru 30 cm v průběhu 3 minut	0/1
mono/hemi-	ochrnutí horní a/nebo dolní končetiny	0/1
paréza	na protilehlé straně
rovná chůze	čilost, iniciativa a motorická schopnost jít rovně	0/1
lekavý reflex	vrozený reflex; myš odskočí v odpovědi na hlasité tlesknutí rukou	0/1
hledači chování	fyziol. chování jako známka zájmu o okolí	0/1
rovnováha	schopnost udržet rovnováhu na břevnu
na břevnu	o šířce 7 mm alespoň 10 sekund	0/1
rovnováha na	schopnost udržet rovnováhu na tyči
kulaté tyči	o průměru 5 mm alespoň 10 sekund	0/1
přechod břevna:	schopnost přejít břevno o délce 30 cm
3 cm	a šířce 3 cm	0/1
přechod břevna:	stejný úkol, obtížnější na břevnu o šířce
2 cm	2 cm	0/1
přechod břevna:	stejný úkol, obtížnější na břevnu o šířce
1 cm	1 cm	0/1
maxim, hodnocení		10

Stanovení mozkového edému

Rozsah cerebrálního edému byl hodnocen stanovením obsahu vody v tkáni poškozené hemisféry tak, jak bylo popsáno dříve (Chen se spoluautory, 1996). V krátkosti, myši byly podrobeny anestezii tak, jak bylo dříve popsáno a to 48 hodin po traumatu, což odpovídá časovému okamžiku, kdy je edém v tomto modelovém systému stále významný (Chen se spoluautory, 1996). Po usmrcení dekapitací byly odebrány mozeček a mozkový kmen a byl připraven korový segment, odpovídající přibližně 20 mg, z oblasti hraničící s místem poškození (traumatu) a z protilehlé (kontraiaterální) hemisféry. Jako vnitřní kontrola byla použita pravá, nepoškozená hemisféra. Tkáňové řezy byly zváženy a sušeny 24 hodin při 95 °C. Po zvážení vysušených řezů byl procentní obsah vody v mozku vypočítán jako:

% H₂O = [(vlhká hmotnost - suchá hmotnost) x 100] / vlhká hmotnost

- 19CZ 307321 B6

Pacienti s poškozením mozku

Do této studie bylo zařazeno deset pacientů s isolovaným vážným CHI (průměrný věk ±SD: 37±10 roků; od 24 do 57 let, 9 mužů a 1 žena), přijatých na Traumatické oddělení Universitní nemocnice v Ziirichu. Všichni pacienti měli hodnocení podle škály pro hodnocení kómatu Glasgow Coma Scale (GCS) po kardiopulmonámí resuscitaci menší nebo rovnající se 8 (Teasdale a Jennett, Lancet 2(7872), 81-84, 1974). Po hodnocení za použití skenovací počítačové tomografie (CT scan evaluation) byly všem pacientům zavedeny intraventrikulární katétry pro léčebnou drenáž (odvodnění) CSF (mozkomíšního moku) v případě vzestupu nitrolebního tlaku (ICP) nad 50,79 kPa (15 mm sloupce Hg). Žádný z pacientů nebyl léčen steroidy. Ze studie byli vyloučeni pacienti, léčení na vícečetná zranění, vyžadující zásahy, týkající se průvodních zranění hrudi, břicha, pánve či zad, nebo zlomenin dlouhých kostí. Za použití výsledkové škály Glasgow Outcome Scale (GOS) (Jennet a Bond, Lancet 1 (7905), 480-484, 1975) byly získány jednotlivé výsledky. Protokol pro shromažďování CSF a séra byl schválen etickou komisí Universitní nemocnice v Ziirichu (Ethics Board Committee of the University Hospital, Ziirich).

Shromažďování vzorků a analýza IL—18

Mozkomíšní mok (CSF) a odpovídající vzorky séra pacientů s CHI (n = 10) byly shromažďovány denně v jednu stanovenou hodinu. Kontrolní CSF byl shromážděn od pacientů, kteří podstoupili diagnostický míšní odběr (n=5). Tito pacienti neměli známky zánětlivého onemocnění CNS, což bylo zjištěno na základě normálních hodnot proteinu, glukózy a počtu buněk v CSF (údaje nejsou uvedeny). Ve skupině s CHI probíhalo shromažďování vzorků 10 dní po traumatu kromě případů, kdy byl ventrikulámí katétr vyjmut dříve, například pokud ICP zůstal v normálním rozmezí (< 50,79 kPa) po dobu delší než 24 hodin. Celkem bylo od pacientů po traumatu, analyzovaných v této studii, shromážděno 106 odpovídajících vzorků CSF a séra. Veškeré vzorky byly ihned po získání odstředěny, rozděleny na alikvotní části a zamraženy při -70 °C; při této teplotě byly skladovány až do analýzy. Kvantifikace hladin IL-18 v CSF a v séru byla stanovena pomocí testu ELISA, specifického pro lidský IL-18, za použití komerčně dostupných sad (R&D Systems, Abingdon, Velká Británie). Stejně jako u myšího testu byla citlivost testu ELISA 5 pg/ml a konečná koncentrace byla počítána z průměru OD (optické hustoty) duplicitních vzorků při vlnové délce extinkce 405 nm. Pro srovnání hladin IL-18 v CSF u pacientů s CHI a u kontrol byla veškerým koncentracím pod hranicí detegovatelnosti 5 pg/ml přiřazena hodnota 4,9 pg/ml.

Analýza údajů

Statistická analýza údajů byla prováděna za použití komerčně dostupného software (SPSS 9.0 for Windows™). Neparametrický Mann-Whitneyův U test byl použit k analýze údajů, které nebyly normálně rozdělené, jako neurologického hodnocení (NSS a ANSS). Nepárový Studentův T test byl použit ke srovnání intracerebrálních koncentrací IL—18 u různých skupin myší a pro analýzu rozdílného obsahu vody v mozku myší, které obdržely IL-18BP oproti myším, kterým bylo injikováno vehikulum. Srovnání hladin lidského IL-18, ať v denních vzorcích CSF oproti odpovídajícím vzorkům séra pacientů s CHI, nebo v CSF pacientů po traumatu oproti hladinám v CSF kontrolních pacientů, byla prováděna za použití všeobecného lineárního modelu pro opakovaná měření ANOVA. Za statisticky významnou byla považována hodnota p<0,05.

Výsledky

Příklad 1: Intracerebrální hladiny IL-18 u myší

Jak je znázorněno na obr. 1, IL-18 byl detegovatelný testem ELISA v mozkových homogenátech neléčených (normálních) kontrolních myší kmene B6 (n=l0) s průměrnou hodnotou 27,7±1,7 [± střední chyba průměru, SEM]. V pokusných skupinách bylo výsledkem indukce etherovou narkózou samotnou nebo v kombinaci s klamnou operací (tj. etherovou narkózou a podélným

-20CZ 307321 B6 rozříznutím pokožky hlavy) významné zvýšení nitrolebních (intrakraniálních) hladin IL-18 na 48,9±1,1 (etherová skupina, n = 8) a na 54,3±2,7 ng/ml (klamná skupina, n=13) (p<0,01, srovnáni s normálními myšmi, nepárový Studentův t-test, obr. 1). Rozdíl mezi etherovými a klamně operovanými zvířaty nebyl statisticky významný (p=0,16).

Ό skupiny po traumatu (n=21) bylo výsledkem indukce CHI zvýšení hladin IL-18 jak v poškozené, tak i v protilehlé hemisféře v časovém rozmezí od 4 hodin (60,6±3,3 a 59,8±5,0 ng/ml) do 24 hodin (56,9±2,1 a 56,3±3,7 ng/ml) po traumatu, ovšem při srovnání etherové skupiny a skupiny po klamné operaci hodnoty nebyly statisticky významně vyšší (p>0,05).

Naproti tomu sedmý den bylo u zvířat po CHI při srovnání s etherovou skupinou a se skupinou po klamné operaci detegováno významné zvýšení intracerebrální koncentrace IL-18 v poškozené hemisféře (67,6±5,1 ng/ml oproti 42,2±0,8 a 45,2±0,5 ng/ml; p<0,01), zatímco hladiny IL-18 v protilehlé hemisféře nebyly významně zvýšeny oproti hodnotám, získaných u těchto dvou kontrolních skupin (63,2±6,0 ng/ml; p = 0,06).

Pro stanovení role TNF, rozhodujícího mediátoru zánětu u tohoto modelu traumatu (Shohami se spoluautory, 1999) pokud se týká regulace intracerebrálních hodnot IL-18, bylo další skupině myší B6 (n = 10) intracerebroventrikulámě injikováno 200 ng myšího rekombinantního TNF v 10 μΐ sterilního PBS a myši byly usmrceny po 24 hodinách. Jak je znázorněno na obr. 1, výsledkem klamné injikace pouze vehikula (n=6) bylo ve srovnání s neovlivněnými normálními myšmi B6 významné zvýšení (regulace směrem k nárůstu) intarcerebrálního IL-18 v průběhu 24 hodin (53,6±3,9 oproti 27,7±1,7 ng/ml; p<0.001).

Injikace TNF indukovala v průběhu 24 hodin významné oslabení hladin IL-18 v intrakraniálním oddílu (kompartmentu) (22,1 ±6,9 ng/ml; n = 10) ve srovnání s kontrolní skupinou po klamné injikaci (u níž byla po 24 hodinách zjištěna hodnota 53,6±3,9 ng/ml; p<0,001). Hladiny IL-18 u skupiny TNF byly dokonce nižší než u normálních, neovlivněných myší (27,7±1,7 ng/ml), ačkoliv v tomto případě není rozdíl statisticky významný (p=0,45).

Příklad 2: Účinek podání IL-18BP na neurologické zotavení po traumatu

K prozkoumání hypotézy, že inhibice IL-18 může usnadnit zotavení při poškození mozku, bylo srovnáváno zotavení v různém čase po jedné injikaci IL-18BP. Již dříve bylo prokázáno, že hodnocení neurologické závažnosti (NSS) 1 hodinu po traumatu nejpřesněji odráží velikost traumatu a je ve vztahu k objemu poškozené tkáně, jak je zřejmé z MRI a z histologie.

Pro získání skupin zvířat se srovnatelným traumatem byly myši po stanovení jejich počátečního NSS v čase t=l h rozděleny do odlišných léčených skupin. Jak je znázorněno na obr. 2, (NSS u IL-18BP (čtverečky) oproti kontrolám (kolečka)) obě skupiny vykazovaly podobnou počáteční hodnotu NSS v čase t=l h (kontroly:7,69±0,3023 a IL-18BP:7,44±0,3627), což ukazuje na srovnatelnou závažnost poškození.

Stanovení NSS v pozdějších časových intervalech (1-7 dní) ukázalo, že zvířata, léčená intraperitoneálně prostřednictvím IL-18BP, vykazovala výrazně menší neurologické poškození, jak je zřejmé z hodnot NSS, které dosáhly statistické významnosti 7 dní po traumatu (P=0,045).

Vypočítána byla rychlost zotavení, vyjádřená jako

ANSS (t) = NSS (1 h) - NSS (t).

Vyšší hodnota ANSS odráží větší zotavení a nulová nebo záporná hodnota ANSS odráží nulové zotavení nebo zhoršení. Obr. 3 předkládá hodnoty ANSS dvou skupin. Ve dvou časových intervalech, jak po 24 hodinách, tak i po 7 dnech, dosáhl rozdíl v průměrných hodnotách ANSS statistické významnosti.

-21 CZ 307321 B6

Jiný pokus byl proveden k učení toho, zda může být účinné působení IL-18BP, je-li poskytnut 3 dny po poškození. Nejdůležitější je načasování ovlivnění a až doposud byla léčba prokázána jako účinná, pokud byla poskytována po několika hodinách. I když bylo zjištěno, že samotný IL-18 vzrůstá 7 dní po traumatu a léčba (ovlivnění) IL-18BP, podávaným 1 hodinu po traumatu, vedla k největšímu účinku také v den 7 po traumatu, bylo nyní rozhodnuto léčit (ovlivnit) myši v den 3 po poranění. Pro srovnání byla jiná skupina léčena (ovlivněna) 1 h a 3 dny po poranění. Kontrolní skupina byla ovlivněna pouze rozpouštědlem (vehikulem).

Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 4, z něhož je zřejmé, že jediné ovlivnění, poskytnuté v den 3, je stejně účinné jako ovlivnění, poskytnuté 1 hodinu po CHI a poté po 3 dnech.

Tento pokus ukazuje dramatický přínosný účinek jedné aplikace IL-18BP, podávaného buď 1 hodinu, nebo 3 dny po uzavřeném poranění hlavy, na zotavení se z traumatického poranění hlavy za použití pokusného myšího modelu.

Příklad 3: Zvýšené hladiny IL-18 v lidském CSF po poškození mozku

Hladiny IL-18 byly stanovovány v denních vzorcích CSF a séra od 10 pacientů se závažným CHI, odebíraných až do 10 dnů po traumatu. Demografické a klinické údaje, týkající se pacientů, jsou uvedeny v tabulce 5.

Tabulka 5: Demografické a klinické údaje, týkající se pacientů se závažným CHI^a

pacient č.	věk (roky)/ pohlaví	GCSb	GOSC	IL-18 v CSFd	IL-18 v séru
(pg/ml) stř.hodn.	[rozmezí]	(pg/ml) stř.hodn.	[rozmezí]
1	48/m	3	1	283	[78-996]	57,5	[12-66]
2	31/m	7	4	228,4	[22-745]	19,7	[4,9-108]
3	26/m	5	3	208,5	[20-392]	37,2	[14-163]
4	57/m	5	4	72,6	[30-286]	48,9	[14-104]
5	24/m	4	5	32,6	[4,9-155]	17	[4,9-58]
6	36/m	8	1	49,4	[10-290]	16,7	[12-67]
7	38/ž	3	4	17,9	[11-100]	13	[4,9-46]
8	35/m	3	3	69,8	[4,9-329]	19,8	[7-77]
9	37/m	3	4	37	[23-75]	57,3	[25-98]
10	41/m	7	5	4,9	[4,9-169]	26,2	[15-38]
kontrolní CSF (n=5)		4,9	4,9-7,8

^a CHI, uzavřené poranění hlavy ^b GSC, Glasgowské hodnocení kómatu, Glasgow Coma Score (Teasdale a Jennett, 1974)

-22CZ 307321 B6 ^c GOS = Glasgowské výsledné hodnocení (Glasgow outcome score) 3 měsíce po poranění; 5 = asymptotické, 4 = průměrná nezpůsobilost, 3 = těžká nezpůsobnost, 2 = přetrvávající vegetativní stav, 1 = smrt (Jennet a Bond, 1975).

^d CSF = mozkomíšní mok ^e hladinám IL-18, nedosahujícím detekčního limitu 5 pg/ml, byla přiřazena hodnota 4,9 pg/ml.

Jak je znázorněno v tabulce 5, intratekální hladiny IL-18 byly významně zvýšeny u 9 z 10 pacientů s CHI ve srovnání s kontrolními CSF od 5 pacientů bez traumatu nebo zánětlivého neurologického onemocnění (p < 0,05; opakovaná měření ANOVA). Pouze jeden pacient (č. 10) měl hladiny IL-18 v CSF, které nebyly významně vyšší ve srovnání s kontrolním CSF (p = 0,31). Střední hodnoty hladin a individuální rozmezí IL-18 v CSF a v séru jsou uvedeny v tabulce 5.

Maximami koncentrace IL-18 v CSF (966 ng/ml) byly až dvěstěkrát vyšší u pacientů s poškozením mozku než u kontrol. Intracerebrální IL-18 byl detegovatelný stanovením ELISA u 90 % všech vzorků CSF u skupiny s traumatem, zatímco detegovatelné intracerebrální hladiny IL-18 (tj . > 4,9 ng/ml) poskytovalo pouze 40 % kontrolních vzorků CSF. U 8 z 10 pacientů s CHI byly střední hodnoty koncentrací IL-18 významně vyšší v CSF než v séru (p < 0,05, opakovaná měření ANOVA). Ovšem u dvou pacientů (č. 9 a 10) střední hodnoty koncentrací IL18 v séru překročily odpovídající koncentrace v CSF, jak je znázorněno v tabulce 5.

Tyto výsledky ukazují, že u pacientů s traumatickým poraněním hlavy dochází k významnému zvýšení hladin IL-18 v mozkomíšním moku. Kromě toho může tyto zvýšené hladiny snížit IL18BP, čímž může projevit svůj přínosný účinek na zotavení z uzavřeného poranění hlavy, jak je prokázáno výše v příkladu 2.

Claims (14)

1. Použití inhibitoru IL-18 zvoleného z protilátek proti IL-18, inhibitorů kaspázy-1 neboli ICE, vazebných proteinů IL-18, jejich fúzních proteinů s imunoglobulinem, jejich isoforem nebo farmaceuticky přijatelných solí, pro výrobu léčiva pro léčení traumatického poškození mozku, kde inhibitor IL-18 se podává v jedné dávce 3 dny po poškození.

2. Použití podle nároku 1, kde traumatické poškození mozku je uzavřené poranění hlavy.

3. Použití podle nároku 1, kde protilátkou proti IL-18 je humanizovaná protilátka proti IL— 18.

4. Použití podle nároku 1, kde protilátka proti IL— 18 je lidská protilátka proti IL— 18.

5. Použití podle nároku 1, kde vazebný protein IL-18 je na jednom nebo více místech glykosylovaný.

6. Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde léčivo dále obsahuje interferon pro souběžné, následné nebo oddělené použití.

7. Použití podle nároku 6, kde interferonem je interferon-α nebo interferon-β.

8. Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde léčivo dále obsahuje faktor nekrózy tumoru, TNF, pro souběžné, následné nebo oddělené použití.

9. Použití podle nároku 8, kde TNF je TNF alfa.

-23 CZ 307321 B6

10. Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde léčivo dále obsahuje protizánětlivé činidlo pro souběžné, následné nebo oddělené použití.

11. Použití podle nároku 10, kde protizánětlivým činidlem je inhibitor cyklooxygenázy, COX, 5 zvláště inhibitor COX-2.

12. Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde léčivo dále obsahuje antioxidant pro souběžné, následné nebo oddělené použití.

10

13. Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde inhibitor IL-18 se použije v množství 0,001-100 mg/kg tělesné hmotnosti, nebo 0,01-10 mg/kg tělesné hmotnosti nebo 0,1— 5 mg/kg tělesné hmotnosti nebo 1-3 mg/kg tělesné hmotnosti.

14. Použití podle kteréhokoli z předcházejících nároků, kde inhibitor IL-18 se podává 15 podkožně.