KR20040030625A - Ｃｎｓ 손상을 치료하거나 예방하기 위한 ｉｌ-18저해물질의 용도 - Google Patents
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Abstract
본원 발명은 중추신경계(CNS) 손상, 특히 외상성 두부 손상을 치료 및/또는 예방하기 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
Description
1989년에, 생쥐의 비장세포로부터 수득된 인터루킨-γ(IFN-γ)을 유도하는 엔도톡신-유도된 혈청 활성이 보고되었다(Nakamura et al., 1989). 이런 혈청 활성은 IFN-γ의 직접적인 유도인자일 뿐만 아니라, IL-2 또는 세포분열물질과 함께 보조-자극인자로 작용한다. 엔도톡신-이후 생쥐 혈청으로부터 활성을 정제하려는 시도에서 상동한 50-55 kDa 단백질이 발견되었다. 다른 사이토킨이 IFN-γ 생산에 대한 보조-자극물질로 작용할 수 있기 때문에, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 또는 TNF에 대한 중화 항체가 혈청 활성을 중화시키지 못한다는 것은 이것이 별개의 인자라는 것을 의미한다. 1995년 이들 연자들은 여드름균(P.acnes)으로 선처리된 생쥐의 간 추출물에 IFN-γ 생산을 위한 엔도톡신-유도된 보조-자극물질이 존재함을 입증하였다(Okamura et al., 1995). 상기 모델에서 간 대식세포 개체군(Kupffer 세포)은 증폭되는데, 선처리되지 않은 생쥐에서는 치명적이지 않은 적은 용량의 세균성 리포폴리사카라이드(LPS)가 이들 생쥐에게는 치명적이다. 초기에 IFN-γ-유도 인자(IGIF)로 불렸고, 이후 인터루킨-18(IL-18)로 명명된 이 인자는 1,200g 여드름균(P. acnes)-처리된 생쥐 간으로부터 균질하게 정제되었다. 정제된 IL-18의 아미노산 서열에서 유도된 축중 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 뮤린 IL-18 cDNA을 클론하였다. IL-18은 157개 아미노산으로 구성된 18-19 kDa 단백질로, 데이터베이스상의 임의 펩티드와 명백한 유사성을 보이지 않는다. IL-18 및 인터루킨-12(IL-12)에 대한 메신저 RNA는 Kupffer 세포 및 활성화된 대식세포에서 쉽게 검출된다. 재조합 IL-18은 별도의 과정을 통하여, IL-12보다 더 강하게 IFN-감마를 유도한다(Micallef et al., 1996). 엔도톡신-유도된 혈청 활성과 유사하게, IL-18은 스스로 IFN-γ를 유도하지는 못하고 세포분열물질 또는 IL-2와 함께 보조-자극물질로 주로 작용한다. IL-18은 IL-2-의존성 경로를 통하여 T 세포 증식을 강화시키고, Th1 사이토킨in vitro생산을 강화시키고, 강화된 IFN-γ 생산의 측면에서 IL-12와 병용되면 시너지 효과를 나타낸다(Maliszewski et al, 1990).
뮤린형으로 클론된 IL-18에 대한 사람 cDNA 서열은 1996년에 보고되었다(Ushio et al., 1996).
피해를 입은 조직으로부터 IL-18을 클로닝하고 IL-18 유전자 발현을 조사하여, 이런 사이토킨과 자가면역 질환의 밀접한 연관성이 발견되었다. 비-비만 당뇨병 생쥐(NOD)는 자가면역 인슐린증과 당뇨병이 자발적으로 발병하는데, 이는 사이클로포스파미드를 1회 주사하여 가속화하고 동조시킬 수 있다. IL-18 mRNA는 인슐린증의 초기 단계동안 NOD 생쥐 췌장에서 역전사효소 PCR로 입증되었다. 사이클로포스파미드 처리후 IL-18 mRNA 수준은 급격하게 증가되고, 이후 IFN-γ mRNA 상승 및 당뇨로 진행된다. 흥미롭게도, 이들 동태는 IL-12-p40 mRNA의 동태를 모방하고, 따라서 개별적인 mRNA 수준간의 밀접한 상관관계를 유발한다. 췌장 RNA에서 IL-18 cDNA의 클로닝 및 후속적인 서열화에서, Kupffer 세포와in vivo선-활성화된 대식세포로부터 클론된 IL-18 서열과의 동일성이 확인되었다. NOD 생쥐 대식세포 역시 IL-18 유전자 발현으로 사이클로포스파미드에 반응하지만, 동일하게 처리된 Balb/c 생쥐의 대식세포는 이런 반응을 보이지 않았다. 따라서, 자가면역 NOD 생쥐에서 IL-18 발현은 비정상적으로 조절되고 당뇨병 발생과 밀접하게 연관한다(Rothe et al., 1992).
IL-18은 Th1 세포에서 Fas 리간드의 기능 활성을 증폭하여 면역조절이나 염증에서 잠재적인 역할을 수행한다(Conti et al., 1997). IL-18은 부신피질에서도 발현되고 신경-면역조절물질로 분비되어, 스트레스를 받은 면역계를 조정하는데 중요한 역할을 한다(Chater, 1986).
in vivo에서, IL-18은 프로-IL-18 절단으로 생성되고, 이의 내생적 활성은 여드름균(P. acnes)에서 IFN-γ 생산 및 LPS-매개된 치사를 설명하는 것으로 보인다. 성숙 IL-18은 IL-1β전환효소(IL-1베타-전환효소, ICE, 카스파제-1)에 의해 전구물질로부터 만들어진다.
IL-18 수용체는 리간드 결합에서 동시-작동하는 적어도 2개의 요소로 구성된다. 뮤린 IL-12 촉진된 T 세포에서 IL-18에 대한 고-친화성 결합 부위와 저-친화성 결합 부위가 발견되었는데(Yoshimoto et al., 1998), 이는 다중적인 체인 수용체 복합체를 암시한다. 지금까지 2개의 수용체 아단위가 동정되었는데, 이들 둘 모두 IL-1 수용체 계통에 속한다(Parnet et al., 1996). IL-18의 신호 전달에는 NF-κB의 활성화가 관여한다(DiDonato et al., 1997).
최근에, IL-18에 대하여 고친화성을 보이는 가용성 단백질이 사람 소변으로부터 분리되었고, 사람과 생쥐 cDNA가 보고되었다(Novick et al., 1999; WO 99/09063). 상기 단백질은 IL-18 결합단백질(IL-18BP)로 명명되었다.
IL-18BP는 공지된 IL-18 수용체중 한가지의 세포외 도메인이 아닌 분비된 천연 순환 단백질이다. 이는 신규한 분비단백질 군에 속한다. 상기 군에는 IL-18BP에 높은 상동성을 보이는 여러 폭스바이러스-인코드된 단백질이 포함된다(Novick et al., 1999). IL-18BP는 비장에서 구조적으로 발현되고 면역글로불린 대과에 속하며 IL-1 II형 수용체에 제한적인 상동성을 갖는다. 이의 유전자는 사람 크로모좀 11q13에 위치하고, 막통 도메인을 코딩하는 엑손은 8.3kb 게놈 서열에서 발견되지 않았다(Novick et al., 1999).
mRNA 절단접합으로 만들어지고 다양한 cDNA 라이브러리에서 발견되는 IL-18BP의 4가지 사람 동등형과 2가지 생쥐 동등형은 발현시키고 정제하고 결합 및 IL-18 생물활성의 중화를 평가하였다(Kim et al., 2000). 사람 IL-18BP 동등형 a(IL-18BPa)는 빠른 온-레이트(on-rate), 느린 오프-레이트(off-rate), 399 pM의 해리 상수(K(d))로 IL-18에 대하여 가장 높은 친화성을 보였다. IL-18BPc는 29개 C-말단 아미노산을 제외하고 IL-18BPa의 Ig 도메인을 공유한다; IL-18BPc의 K(d)는 10배나 낮다(2.94 nM). 그럼에도 불구하고, IL-18BPa와 IL-18BPc는 과몰량에서IL-18을 >95% 중화시킨다. IL-18BPb와 IL-18BPd 동등형은 완전한 Ig 도메인이 결핍되고, IL-18과 결합하거나 이를 중화시키는 능력이 부족하다. 동일한 Ig 도메인을 보유하는 뮤린 IL-18BPc와 IL-18BPd 동등형 역시 과몰량에서 뮤린 IL-18을 >95% 중화시킨다. 하지만, 사람 IL-18BPa와 공통된 C-말단 모티프를 공유하는 뮤린 IL-18BPd 역시 사람 IL-18을 중화시킨다. 분자 모델링을 통하여, IL-18BP의 Ig 도메인에서 정전성과 소수성이 혼합된 상당히 큰 결합 위치가 확인되었는데, 이런 결합 위치는 리간드에 대한 이의 높은 친화성 결합을 설명할 수 있다(Kim et al., 2000).
두부 손상 또는 폐쇄성 두부 손상(CHI)이라고 하는 외상성 뇌 손상(TBI)은 두부에 대한 외부 타격에 의해 뇌가 손상되는 중추신경계 손상을 의미한다. 이는 대부분의 경우에 자동차나 자전거 사고로 발생하지만, 익수(near drowning), 심장 마비, 발작, 감염의 결과로 발생할 수도 있다. 일반적으로, 이런 유형의 외상성 뇌 손상은 뇌에 산소나 혈액 공급의 부족으로 발생하기 때문에, 무산소성 손상(anoxic injury)"이라고도 한다.
폐쇄성 두부 손상은 자동차 사고나 낙하에서처럼 두부에 타격이 있을 때 발생한다. 이런 경우에, 두개골은 정지된 물체에 충돌하고 두개골 안에 있는 뇌는 회전되고 축(뇌간)이 뒤틀려 국소적인 또는 광범위한 손상이 발생한다. 또한, "떠있도록"하는 유체로 둘러싸인 연한 덩어리인 뇌는 두개골에 되튀어 추가적인 손상이 발생한다.
손상직후에 무의식이 수분, 수주 또는 수개월동안 지속될 수 있다. 일반적으로, 뒤틀림과 되튐으로 인하여 뇌가 외상성으로 손상된 환자는 뇌의 많은 부분에 손상이나 타박상을 입게 된다. 뇌에 대한 확산 손상(diffuse damage) 또는 "비-미사일 손상(non-missile injury)"동안 진행되는 이런 유형의 뇌 손상은 일차 또는 이차 손상으로 구분할 수 있다.
일차 뇌 손상은 특히 두개골 골절이 존재할 때 충돌 부위에서 손상직후에 발생한다. 광범위한 타박상은 뇌내 출혈과 연관하거나 또는 피질성 열상(cortical laceration)을 동반할 수 있다. 확산 축삭 손상은 두개골내에서 뇌의 회전 움직임에 의해 야기된 신경세포돌기(neuronal process)의 전단과 인장 변형율의 결과로 발생한다. 축삭에 대한 작은 출혈성 병소나 확산 손상이 존재할 수 있는데, 이들은 현미경으로만 탐지될 수 있다.
이차 뇌 손상은 손상이후에 진행되는 합병증의 결과로 발생한다. 여기에는 두개강내 출혈, 뇌외 동맥의 외상성 손상, 두개강내 뇌탈출, 저산소성 뇌 손상 또는 뇌막염이 포함된다.
"개방성 두부 손상"은 두부에 가시적인 공격이며, 탄상(gunshot wound), 사고 또는 이물 두개골 관통("뇌에 미사일 손상")으로부터 기인할 수 있다. 이런 유형의 두부 손상은 뇌의 특정 영역을 손상할 가능성이 높다.
"중등도 뇌 손상"은 의식의 상실없이 멍한 감정이나 혼란스런 상태가 짧게 지속한다. 제공되는 보건 의료가 최소한일 수 있지만, 혼수(coma)없는 뇌 손상 환자는 혼수 손상의 생존자들이 겪는 것과 유사한 증상과 장애를 경험할 수 있다.
외상에 반응하여 뇌에서 변화가 발생되는데, 이는 추가적인 손상을 예방하기위하여 모니터링을 필요로 한다. 심한 뇌 손상이후, 뇌 크기가 빈번히 증가한다. 이는 뇌 팽화라고 하며, 뇌로의 혈액량이 증가할 때 발생한다. 이런 질환의 후기 단계에서 뇌에 물이 차게 되는데, 이는 뇌 부종이라 한다. 뇌 팽화와 뇌 부종은 두개내압("ICP")이라고 하는 과도한 뇌압을 유발한다.
혼수는 외상성 두부 손상직후 연장된 기간의 무의식이다.
여러 수준의 혼수가 존재한다. 혼수 수준은 두부 손상된 개체의 응답성(responsiveness)의 진전으로 측정할 수 있다. 환자가 호전되거나 안정화되면, "Rancho Los Amigos Scale"로 인식력(이해력과 판단력) 수준을 측정한다.
뇌 손상은 외상후 간질, 지속적인 식물인간 상태, 또는 외상후 치매와 같은 지속적인 약함(debility)을 빈번히 유발한다.
척수 손상은 다른 유형의 CNS 손상이다. 척수 손상은 하반신 마비와 사지 마비로 인한 입원의 대부분을 차지한다. 80% 이상이 교통사고의 결과로 발생한다. 2가지의 주요 손상이 임상적으로 인정된다: 개방성 손상과 폐쇄성 손상.
개방성 손상은 척수와 신경근의 직접적인 외상을 유발한다. 천공 손상(perforating injury)은 광범위한 파괴와 출혈을 초래할 수 있다. 폐쇄성 손상은 대부분의 척추 손상을 유발하고 방사선으로 입증가능한 척주(spinal column)의 골절/탈구와 일반적으로 연관한다. 척수에 대한 손상은 뼈 손상의 정도에 좌우되며 2가지 주요 단계에서 고찰될 수 있다: 일차 손상(좌상, 신경 섬유 횡절단, 출혈성 괴사) 및 이차 손상(경막외 혈종, 경색, 감염, 부종).
척수 손상의 만발 효과(late effect)는 다음과 같다: 손상된 신경 섬유의 상향과 하향 선행성 퇴행; 외상후 척수공동증(post-traumatic syringomelyia); 하반신 마비의 전신 효과, 예를 들면 요도관과 흉부 감염, 욕창, 근위축.
외상성 뇌 손상의 병인은 매우 복잡하기 때문에 여전히 거의 이해되지 않고 있다. 과거 십년간 연구는 뇌 손상후 척수내 구획에서 전신적ㆍ국소적으로 방출되는 사이토킨의 역할을 밝히는데 집중되었는데, TNF, IL-6 또는 IL-8과 같은 친-염증성 사이토킨의 이중 효과가 이들 매개물질의 시간-의존한 유익한 효과와 유해한 효과의 조사결과에 기초하여 가정되었다(Morganti-Kossmann et al., 1997; Kossmann et al., 1997; Shohami et al., 1999, Scherbel et al., 1999; Whalen et al., 2000). 전술한 바와 같이, IL-1 계통의 최근에 발견된 사이토킨은 IL-18이다. 최근 연구에서, IL-18은 생쥐, 쥐, 사람의 CNS에서 생체내에서(Culhane et al., 1998; Jander and Stoll, 1998; Prinz et al., 1999; Fassbender et al., 1999; Wheeler et al., 2000) 및 신경단위를 제외한 성상세포와 미세교세포의 일차 배양액에서 시험관내에서(Conti et al., 1999) 구조적으로 발현되는 것으로 확인되었다. 상승된 IL-18 수준은 염증성 CNS 질환, 예를 들면 세균성 뇌막염과 바이러스성 수막뇌염 환자의 뇌척수액(CSF)에서는 탐지되지만, 다발성 경화증(MS) 환자의 CSF에서는 탐지되지 않았다(Fassbender et al., 1999). MS 환자에서 전반적으로 낮은 척수내 IL-18 수준의 발견과는 대조적으로, 상승된 IL-18 mRNA 발현이 MS의 동물 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 앓는 Lewis 쥐의 척수에서 확인되었다(Jander and Stoll, 1998). 신경외상(neurotrauma)에서 IL-18의 발현과 기능적 중요성은 아직 조사되지 않고 있다.
본원 발명의 요약
본원 발명은 CNS 질환에서 IL-18의 병리생리학적 역할에 관한다. 이는 실험적 폐쇄성 두부 손상(CHI)후 1h(hour) 또는 3d(day)에 IL-18 저해물질로 생쥐를 처리하면 대조 동물과 비교하여 회복이 향상되고 뇌 손상 정도가 약화된다는 조사결과에 기초한다. 따라서, 본원 발명은 중추신경계(CNS) 손상, 특히 외상성 뇌 손상의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
IL-18 저해물질과 인터페론 및/또는 TNF 및/또는 염증 저해물질 및/또는 항산화제의 병용 역시 본원 발명에서 제시한다. 본원 발명의 다른 측면은 IL-18 저해물질을 병든 조직이나 세포에 전달하는데 유전자 치료 방식을 적용하기 위한 핵산 분자의 용도에 관하는데, 상기 핵산 분자는 CNS 손상의 치료 및/또는 예방을 위한 IL-18 저해물질의 코딩 서열을 포함한다. 또한, 본원 발명은 CNS 손상의 예방 및/또는 치료를 위하여 IL-18 저해물질을 발현하도록 유전자 조작된 세포의 용도에 관한다.
본원 발명은 뇌의 병리학적 이상 분야에 관한다. 좀더 구체적으로, 본원 발명은 중추신경계(CNS) 손상, 특히 외상성 뇌 손상을 치료 및/또는 예방하기 위한 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
도 1에서는 상이한 조건하에 전체 뇌(빗금), 좌측 반구(검은색) 또는 우측 반구(회색)에서 뇌내 IL-18(ng/㎖)의 혈청 수준을 서술하는 히스토그램을 도시한다.
도 2에서는 외상후 1h(hour)에 50 ㎍ IL-18BP(사각형)를 i.p. 투여하거나 또는 운반제 단독(대조, 원)을 주사하고, 외상후 1h, 24h, 72h 또는 168h에 측정한 신경학적 심각도 스코어(Neurological Severity Score, NSS)의 진전을 도시한다.
도 3에서는 외상후 1h(hour)에 50 ㎍ IL-18BP(사각형)를 i.p. 투여하거나 또는 운반제 단독(대조, 원)을 주사하고, 외상후 24h, 72h 또는 168h에 측정한 △NSS를 도시한다.
도 4에서는 50 ㎍ IL-18BP를 외상후 3d(day)에 단일 분량으로(다이아몬드) 혹은 외상후 1h와 3d에 이중 분량으로(사각형) i.p. 투여하거나 또는 운반제 단독(대조, 삼각형)을 주사하고, 외상후 1h, 24h, 3d(day), 7d 또는 14d에 측정한 △NSS를 도시한다.
본원 발명은 폐쇄성 두부 손상의 뮤린 모델에서 뇌 손상으로부터 회복에 대한 IL-18 저해물질의 통계학적으로 유의한 긍정적인 효과의 발견에 기초한다. 본원 발명에서, IL-18은 외상성 뇌 손상이후에 뇌와 뇌척수액에서 상향-조절되는 것으로 밝혀졌는데, 이는 친-염증성 사이토킨이 뇌 손상의 병인에 중요한 역할을 수행한다는 것을 암시한다.
따라서, 본원 발명은 중추신경계(CNS) 손상을 치료 및/또는 예방하는 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
또한, 본원 발명은 CNS 손상의 합병증과 만발 효과를 치료 및/또는 예방하는 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
본원의 바람직한 구체예에서, CNS 손상은 외상성 뇌 손상 또는 폐쇄성 두부 손상이다.
다른 바람직한 구체예에서, CNS 손상은 척수 손상이다.
본원의 또 다른 바람직한 구체예에서, 뇌 손상은 혈관 기원한다.
본원 발명에서 "중추신경계 손상"또는 "CNS 손상"은 발병 연령이나 근본 원인에 상관없이, 뇌 또는 척수에 대한 임의의 손상을 의미한다. 근본 원인은 예로써 기계적 원인 또는 감염일 수 있다. CNS 손상 및 이의 임상적 증상과 결과는 "본원 발명의 배경기술"에서 자세하게 기술하였다. CNS 손상은 예로써 뇌나 척수의 외상 또는 임의의 다른 손상이며, 신경외상(neurotrauma)이라고도 한다.
뇌 손상은 예로써 다음의 증상을 수반하거나 유발한다: 1. 집중력 장애; 2. 인식 장애; 3. 언어 장애; 4. 기억력 장애; 5. 행동 장애; 6. 움직임 장애; 임의의 다른 신경학적 기능장애.
척수 손상은 예로써 하반신 마비와 사지 마비를 유발할 수 있다.
CNS 손상의 합병증이나 만발 효과 역시 본원 발명에 따라 치료 및/또는 예방할 수 있다. 뇌 손상의 합병증과 만발 효과는 "본원 발명의 배경기술"에서 전술하였다. 여기에는 혼수, 뇌막염, 외상후 간질, 외상후 치매, 신경 섬유의 퇴행, 외상후 척수공동증, 또는 출혈 등이 포함된다.
또한, 본원 발명은 혈관 기원한 뇌 손상, 예를 들면 뇌경색, 국소빈혈, 뇌졸중(cerebrovascular accident) 또는 발작에 의한 저산소성 뇌 손상의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 용도에 관한다.
본원에서 "치료"와 "예방"은 CNS 손상의 원인 및 CNS 손상에 동반되는 증상, 질환 또는 합병증의 완전한 혹은 부분적 예방, 저해, 약화, 완화 또는 반전을 의미한다. CNS 손상을 "치료"할 때, 본원 발명에 따른 물질은 발병이후에 제공되고, "예방"은 환자에서 병의 징후가 나타나기 이전 상기 물질의 투여이다.
본원 발명은 CNS 손상의 치료에 적합하다. 적절하게는, IL-18 저해물질은 CNS 손상을 치료하기 위하여 CNS 손상직후에, 예를 들면 손상후 1시간이내에 투여된다. 하지만, 하기 실시예에서 밝힌 바와 같이, IL-18 저해물질은 뇌 손상이 발생하고 3일후에 투여됐을 때에도 뇌 손상에 유익한 효과를 보였다. 이런 이유로, CNS 손상을 치료하기 위하여 손상으로부터 3일이내에 IL-18 저해물질을 투여하는 것이 바람직하다.
본원 발명에서 "IL-18 저해물질"은 IL-18 생산 및/또는 작용을 약화시키거나, 감소시키거나, 또는 부분적으로, 실질적으로 혹은 완전히 예방이나 차단하는 방식으로 IL-18 생산 및/또는 작용을 조절하는 임의의 분자를 의미한다. "IL-18 저해물질"에는 IL-18 생산의 저해물질 및 IL-18 작용의 저해물질이 포함된다.
생산 저해물질은 IL-18의 합성, 가공 또는 성숙에 부정적인 영향을 주는 임의의 분자, 예를 들면 ICE 저해물질일 수 있다. 본원 발명에 따른 저해물질은 예로써 인터루킨 IL-18 유전자의 발현 저해물질; IL-18 mRNA의 전사를 감소시키거나 예방하는 안티센스 mRNA 또는 상기 mRNA의 분해를 유도하는 리보자임; 정확한 접힘을 손상시키는 단백질; IL-18의 분비를 부분적으로 혹은 실질적으로 예방하는 단백질; IL-18을 분해시키는 프로테아제 등일 수 있다.
IL-18 작용의 저해물질은 IL-18 길항물질, 예를 들면 IL-18BP일 수 있다. 길항물질은 리간드(예, 수용체)에 대한 IL-18 결합을 주도하는 IL-18 또는 IL-18 결합부위를 부분적으로 혹은 실질적으로 중화시킬 수 있을 정도로 충분한 친화성과특이성으로 IL-18 분자와 결합하거나 이를 격리시킬 수 있다. 길항물질은 IL-18/수용체 결합 직후에 세포내에서 활성화되는 IL-18 신호전달 경로를 저해할 수도 있다.
IL-18 작용의 저해물질은 가용성 IL-18 수용체나 이를 모방하는 분자; IL-18 수용체를 차단하는 작용제; 다클론이나 단클론 항체와 같은 IL-18 항체; 또는 표적에 대한 IL-18의 결합을 예방하는 임의의 작용제나 분자일 수도 있는데, 이들은 IL-18에 의해 매개되는 세포내 혹은 세포외 반응을 감소시키거나 또는 이의 유인을 예방한다.
본원 발명의 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 카스파제-1 저해물질(ICE), IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 하나에 대한 항체, IL-18 신호전달 경로의 저해물질, IL-18과 경쟁하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질, IL-18 생산의 저해물질 및 IL-18 결합 단백질, 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 IL-18 결합 단백질과 적어도 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 이들의 원형 순열된 유도체에서 선택된다.
본원에서 "IL-18 결합단백질"은 IL-18BP와 동의어로 사용된다. 여기에는 Kim et al., 2000에 정의된 IL-18 결합단백질의 절단접합 변이체 및/또는 동등형을 비롯하여 WO 99/09063 또는 Novick et al., 1999에 정의된 IL-18 결합단백질이 포함된다. 특히, 본원 발명에서 IL-18BP의 사람 동등형 a와 c가 유용하다. 본원 발명에 효과적인 단백질은 당화되거나 또는 당화되지 않을 수 있고, 천연 공급원(예, 소변)으로부터 유래되거나 또는 재조합 방식으로 생산될 수 있다. 재조합 발현은원핵 발현계(예, 대장균(E. coli)) 또는 진핵, 특히 포유동물 발현계에서 실시할 수 있다. 본원 발명의 IL-18 저해물질에 특히 적합한 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포이다.
적절하게는, 포유동물 세포나 세포주에서 재조합 발현되는 IL-18 저해물질의 재조합 생산은 혈청없는 세포 배양 배지에서 실시한다.
본원에서 "뮤테인"은 IL-18BP의 유사체 혹은 바이러스성 IL-18BP의 유사체를 말하는데, 여기서 고유 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 아미노산 잔기중 적어도 하나가 상이한 아미노산 잔기로 치환되거나 결실되고, 대안으로 하나이상의 아미노산 잔기가 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 고유 서열에 부가되는데, 이때 야생형 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP과 비교하여 생성된 산물의 능력에는 큰 변화가 없어야 한다. 이들 뮤테인은 공지된 합성 방법이나 특정부위-돌연변이유발 기술, 또는 임의의 적합한 다른 공지된 기술을 활용하여 만들 수 있다.
임의의 이런 뮤테인은 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 서열과 충분히 유사한 아미노산 서열을 가지기 때문에, IL-18BP와 실제로 유사한 활성을 가진다. IL-18BP의 한가지 활성은 IL-18에 결합하는 능력이다. 뮤테인이 IL-18에 대하여 실제적인 결합 활성을 보유하는 경우에 이는 친화성 크로마토그래피와 같은 수단으로 IL-18의 정제에 사용될 수 있고, IL-18BP와 실제 동일한 활성을 가지는 것으로 간주될 수 있다. 따라서, 통상적인 실험 방법으로 임의의 뮤테인이 IL-18BP와 실질적으로 동일한 활성을 가지는 지를 결정할 수 있는데, 상기 실험 방법은 적절히 라벨된 IL-18과 뮤테인이 결합하는 지를 측정하는 간단한 샌드위치 경합 분석 단계, 예를 들면 방사성면역분석 또는 ELISA 분석에 이런 뮤테인을 적용하는 단계로 구성된다. IL-18BP의 생물학적 활성을 평가하는 간단한 기능 분석은 WO 99/09063에서 자세하게 기술하였는데, 예를 들면 실시예 2의 가교-결합으로 평가된 IL-18에 대한 결합 또는 실시예 5의 단핵 혈액 세포에서 IL-18 유도된 INF-감마 유도의 저해이다.
바람직한 구체예에서, 임의의 이런 뮤테인은 IL-18BP 또는 바이러스-인코드된 IL-18BP 상동체의 서열과 적어도 40% 동일성이나 상동성을 보유한다. 적절하게는, 이는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 가장 바람직하게는 적어도 90% 동일성이나 상동성을 보유한다.
본원 발명에 사용될 수 있는 IL-18BP 폴리펩티드 혹은 바이러스성 IL-18BP의 뮤테인, 또는 이들을 인코드하는 핵산에는 본원에 제시된 교시에 따라 과도한 실험없이 당업자가 용이하게 수득할 수 있는 치환된 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드와 같은 일단의 실질적으로 상응하는 서열이 포함된다.
본원 발명에 따른 뮤테인에는 엄격한 조건하에 핵산, 예를 들면 본원 발명에 따른 IL-18 저해물질을 인코드하는 DNA 혹은 RNA와 혼성화되는 DNA 혹은 RNA에 의해 인코드되는 단백질이 포함된다. "엄격한 조건"은 혼성화 및 후속 세척 조건을 의미한다(Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., &&6.3 and 6.4(1987, 1992); Sambrook et al.(Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., and Maniatis, T.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
제한없이, 엄격한 조건의 예에는 조사중인 하이브리드의 계산된 Tm보다 12-20℃ 낮은 세척 조건, 예를 들면 5분동안 2 x SSC와 0.5% SDS, 이후 15분동안 2 x SSC와 0.1% SDS; 30-60분동안 37℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS, 이후 30-60분동안 68℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS가 포함된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 엄격한 조건은 DNA 서열, 올리고뉴클레오티드 프로브(예, 10-40개 염기) 또는 혼성 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이에도 좌우된다. 혼성 프로브가 이용되면, SSC 대신에 테트라메틸 염화암모늄(TMAC)을 사용하는 것이 바람직하다(Ausubel, supra.).
바람직한 구체예에서, 임의의 이런 뮤테인은 첨부된 서열 목록의 SEQ ID NO: 1, 2 또는 3 서열과 적어도 40% 동일성이나 상동성을 보유한다. 적절하게는, 이는 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 가장 바람직하게는 적어도 90% 동일성이나 상동성을 보유한다.
동일성은 서열을 비교하여 확정된 2개이상 폴리펩티드 서열 또는 2개이상 폴리뉴클레오티드 서열간의 상관관계를 반영한다. 일반적으로, 동일성은 비교되는 서열 범위에서 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 2개의 폴리펩티드 서열의 각각 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 대응 또는 아미노산 대 아미노산 대응을 의미한다.
정확하게 일치하지 않는 서열에서, "동일성 %"를 측정할 수 있다. 일반적으로, 비교되는 두 서열은 정렬시켜 서열간의 최대 상관을 제공한다. 정렬의 정도를 향상시키기 위하여 한 서열이나 양 서열에 "틈새(gap)"를 삽입할 수 있다. 동일성 %는 비교되는 각 서열의 전체 범위(소위, 전역정렬)(동일하거나 매우 유사한 길이의 서열에 적합), 또는 좀더 짧고 한정된 범위(소위, 국부정렬)(동등하지 않은 길이의 서열에 적합)에서 측정할 수 있다.
2개이상 서열의 동일성과 상동성을 비교하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 가령, Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1(Devereux J et al., 1984)에서 가용한 프로그램, 예를 들면 BESTFIT와 GAP 프로그램을 이용하여 두 폴리뉴클레오티드 서열간 동일성 % 및 두 폴리펩티드 서열간 동일성 %와 상동성 %를 측정할 수 있다. BESTFIT에서는 Smith와 Waterman의"국부 상동성(local homology)" 알고리즘(1981)을 이용하여 두 서열간 가장 유사한 단일 영역을 찾는다. 서열간 동일성 및/또는 유사성을 측정하는 다른 프로그램은 당분야에 공지되어 있는데, 예를 들면 BLAST 계통의 프로그램(Altschul S F et al., 1990, Altschul S F et al., 1997, NCBI 홈페이지: www. ncbi.nlm.nih.gov에서 입수가능)과 FASTA(Pearson W R, 1990; Pearson 1988)이다.
본원 발명에 따른 뮤테인에 대한 바람직한 변화는"보존성"치환이다. IL-18BP 폴리펩티드나 단백질 또는 바이러스성 IL-18BP의 보존성 아미노산 치환에는 분자의 생물학적 기능을 보존하면서 유사한 물리화학적 성질을 가지는 일군의 동질성 아미노산간 치환이 포함된다(Grantham, 1974).
기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 상기 정의된 서열에서 실시될 수 있는데, 특히 30개 이하, 바람하게는 10개 이하의 아미노산이 부가 또는 결실되고 기능적 구조에 중요한 아미노산(예, 시스테인 잔기)이 결실 또는 치환되지 않는 경우에, 기능의 변화없는 아미노산의 부가 또는 결실이 가능하다. 이런 결실/부가에 의해 만들어지는 단백질 및 뮤테인은 본원 발명의 목적에 포함된다.
바람직한 동질성 아미노산 군은 표 1에 제시한다. 좀더 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 2에 제시한다; 가장 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 3에 제시한다.
표 1
바람직한 동질성 아미노산 군
아미노산동질성 군
SerSer, Thr, Gly, Asn
ArgArg, Gln, Lys, Glu, His
LeuIle, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
ProGly, Ala, Thr, Pro
ThrPro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr
AlaGly, Thr, Pro, Ala
ValMet, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val
GlyAla, Thr, Pro, Ser, Gly
IleMet, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile
PheTrp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe
TyrTrp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr
CysSer, Thr, Cys
HisGlu, Lys, Gln, Thr, Arg, His
Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln
Asn Gln, Asp, Ser, Asn
LysGlu, Gln, His, Arg, Lys
AspGlu, Asn, Asp
GluAsp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu
MetPhe, Ile, Val, Leu, Met
Trp Trp
표 2
좀더 바람직한 동질성 아미노산 군
아미노산동질성 군
SerSer
ArgHis, Lys, Arg
LeuLeu, Ile, Phe, Met
ProAla, Pro
ThrThr
AlaPro, Ala
ValVal, Met, Ile
GlyGly
IleIle, Met, Phe, Val, Leu
PheMet, Tyr, Ile, Leu, Phe
TyrPhe, Tyr
CysCys, Ser
HisHis, Gln, Arg
GlnGlu, Gln, His
AsnAsp, Asn
LysLys, Arg
AspAsp, Asn
GluGlu, Gln
MetMet, Phe, Ile, Val, Leu
TrpTrp
표 3
가장 바람직한 동질성 아미노산 군
아미노산동질성 군
SerSer
ArgArg
LeuLeu, Ile, Met
ProPro
ThrThr
AlaAla
ValVal
GlyGly
IleIle, Met, Leu
PhePhe
TyrTyr
CysCys, Ser
HisHis
GlnGln
AsnAsn
LysLys
AspAsp
GluGlu
MetMet, Ile, Leu
TrpMet
본원 발명에 사용될 수 있는 IL-18BP 폴리펩티드나 단백질의 뮤테인, 또는 바이러스성 IL-18BP의 뮤테인을 수득하는데 활용할 수 있는 단백질에서 아미노산 치환체의 생산 방법의 예에는 임의의 공지된 방법이 포함되는데, 이들 방법은 예로써 미국 특허 RE 33,653, 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462(Mark et al); 5,116,943(Koths et al.,) 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,); 미국 특허 4,904,584(Shaw et al.,)(리신 치환된 단백질의 경우)에서 제시한다.
"융합단백질"은 예로써 체액에서 연장된 체류 시간을 갖는 다른 단백질과 융합되는 IL-18BP, 바이러스성 IL-18BP 또는 이들의 뮤테인으로 구성되는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, IL-18BP 또는 바이러스성 IL-18BP는 다른 단백질, 폴리펩티드 등, 예를 들면, 면역글로불린이나 이의 단편과 융합될 수 있다.
본원에서 "기능성 유도체"에는 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 유도체, 이들의 뮤테인, 융합된 단백질이 포함되고, 이들은 당분야에 공지된 수단으로 잔기 또는 N- 혹은 C-말단기에 측쇄로 생성되는 작용기로부터 만들 수 있는데, 이들이 제약학적으로 수용가능하면, 다시 말하면 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 활성과 실질적으로 유사한 단백질의 활성을 파괴하지 않고 이를 함유하는 조성물에 독성을 공여하지 않는다면 본원 발명에 포함된다.
가령, 이들 유도체에는 폴리에틸렌글리콜 측쇄가 포함되는데, 이는 항원성 부위를 감추고 체액에서 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP의 체류를 연장시킬 수 있다. 다른 유도체에는 카르복실기의 지방족 에스테르; 암모니아 또는 일ㆍ이차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아마이드; 아실 성분(가령, 알카노일 또는 카르보사이클릭 아로일 작용기)으로 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노기의 N-아실 유도체; 또는 아실 성분으로 형성된 유리 하이드록실기(가령, 세릴 또는 테레오닐잔기)의 O-아실 유도체등이 포함된다.
본원 발명에서 IL-18BP 혹은 바이러스성 IL-18BP, 뮤테인, 융합단백질의 "활성 분획물"에는 단독으로 또는 관련된 분자나 여기에 결합된 잔기(예, 당이나 인산염 잔기, 또는 단백질 분자나 당 잔기의 자체적인 응집체)와 결합된 단백질 분자의 폴리펩티드 사슬의 임의 단편이나 전구물질이 포함되지만, 이런 분획물은 IL-18BP와 실질적으로 유사한 활성을 보유해야 한다.
본원에서 "염"은 IL-18 저해물질 분자 또는 이의 유사체의 카르복실기의 염과 아미노기의 산첨가염을 의미한다. 카르복실기의 염은 당분야에 공지된 방법으로 생성될 수 있는데, 여기에는 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철, 아연 등과 같은 무기 염기로 형성된 염 및 아민, 예를 들면 트리에탄올아민, 아르기닌이나 리신, 피페리딘, 프로케인 등과 같은 유기 염기로 형성된 염이 포함된다. 산 첨가염에는 예로써 무기산, 예를 들면 염산이나 황산과의 염 및 유기산, 예를 들면 아세트산이나 옥살산과의 염이 포함된다. 물론, 이들 염은 본원 발명에 적합한 OPN의 생물학적 활성, 다시 말하면 희소돌기아교세포에 대한 증식 효과를 보유해야 한다.
본원의 다른 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 IL-18 항체다. 항-IL-18 항체는 다클론이나 단클론, 키메라, 인화 또는 사람 항체이다. 재조합 항체와 이의 단편은 생체내에서 IL-18에 대한 높은 친화성 결합 및 낮은 독성으로 특성화된다. 본원 발명에 사용될 수 있는 항체는 낮은 독성으로 병원성 질환이나 이와 관련된 여러 증상을 효과적으로 저하 또는 완화시킬 만큼 충분한 기간동안 환자를 치료할 수 있는 능력으로 특성화된다.
중화 항체는 IL-18 면역주사로 토끼, 염소 또는 생쥐와 같은 동물에서 생성시킨다. 면역화 생쥐는 하이브리도마 제조를 위한 B 세포의 공급원을 제공하는데 특히 유용한데, 상기 하이브리도마는 배양하여 다량의 항-IL-18 단클론항체를 생산한다.
키메라 항체는 상이한 동물 종으로부터 유래된 2개이상의 분절 또는 일부분으로 특성화되는 면역글로불린 분자이다. 일반적으로, 키메라 항체의 가변 영역은 비-사람 포유동물 항체, 예를 들면 뮤린 단클론항체로부터 유래되고, 면역글로불린 불변 영역은 사람 면역글로불린 분자로부터 유래된다. 가급적, 양 영역 및 이들의 조합은 낮은 면역원성을 갖는다(Elliott et al., 1994). 인화 항체는 유전공학 기술로 만들어진 면역글로불린 항체인데, 여기서 뮤린 불변 영역은 사람 불변 영역으로 대체되고 뮤린 항원 결합 영역은 계속 유지된다. 생성된 생쥐-사람 키메라 항체는 사람에서 낮은 면역원성 및 향상된 약동학을 보유한다(Knight et al., 1993).
따라서, 다른 바람직한 구체예에서 IL-18 항체는 인화 IL-18 항체이다. 바람직한 항-IL-18 인화 항체의 예는 유럽 특허 출원 EP 0 974 600에서 기술한다.
다른 바람직한 구체예에서, IL-18 항체는 완전한 사람 항체다. 사람 항체를 생산하는 기술은 WO 00/76310, WO 99/53049, US 6,162,963 또는 AU5336100에서 자세히 기술한다. 바람직한 완전 사람 항체는 기능성 사람 Ig 좌위의 전체 또는 일부분을 포함하는 외래유전자도입 동물, 예를 들면 외래유전자도입 생쥐에서 만들어진 재조합 항체이다.
본원 발명의 좀더 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 IL-18BP, 동등형,뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 이들의 원형 순열된 유도체이다. 이들 동등형, 뮤테인, 융합단백질 또는 기능성 유도체는 IL-18BP의 생물학적 활성, 특히 IL-18에 대한 결합능력을 유지하고, IL-18BP와 적어도 유사한 활성을 보유한다. 이상적으로는, 이런 단백질은 변형되지 않은 IL-18BP와 비교하여 오히려 상승된 생물학적 활성을 갖는다. 적절한 활성 분획물은 IL-18BP의 활성보다 좀더 높은 활성을 보유하거나, 추가적인 장점, 예를 들면 좀더 높은 안정성 혹은 좀더 낮은 독성이나 면역원성을 보유하거나, 또는 좀더 용이하게 대량 생산되거나 정제된다.
IL-18BP 및 이의 절단접합변이체/동등형의 서열은 Kim et al., 2000 뿐만 아니라, WO 99/09063이나 (Novick et al., 1999)에서 얻을 수 있다.
IL-18BP의 기능성 유도체는 중합체에 공액시켜 단백질의 특성, 예를 들면 안정성, 반감기, 생체이용효율, 사람 신체에서 내약성, 또는 면역원성을 향상시킬 수 있다. 이를 달성하기 위하여, 기능성 유도체는 아미노산 잔기에서 하나이상 측쇄로 존재하는 하나이상 기능기(functional group)에 부착된 적어도 일부분을 포함한다. 이런 기능기는 예로써 폴리에틸렌글리콜(PEG)이다. PEG화(PEGlaytion)는 WO 92/13095에서 밝힌 방법으로 실시할 수 있다.
따라서, 본원 발명의 바람직한 구체예에서 IL-18 저해물질, 특히 IL-18BP는 PEG화된다.
본원 발명의 다른 적절한 구체예에서, IL-18 저해물질은 IL-18 결합단백질의 전부 또는 일부로 구성되는 융합단백질이고, 이는 면역글로불린의 전체 또는 일부분과 융합된다. 생성된 융합단백질은 IL-18BP의 생물학적 활성, 특히 IL-18에 대한 결합을 계속 유지한다. 융합은 직접적으로, 또는 짧게는 1 내지 3개 아미노산 잔기 혹은 이보다 좀더 긴, 예를 들면 13개 아미노산 잔기의 링커 펩티드를 통하여 달성할 수 있다. 상기 링커는 트리펩티드 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met), 예를 들면 IL-18BP 서열과 면역글로불린 서열 사이에 도입된 Glu-Phe-Gly-Ala-Gly- Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met을 포함하는 13개 아미노산 링커 서열이다. 생성된 융합단백질은 체액에서 체류 시간(반감기) 연장, 특이적 활성 증가, 발현 수준 증가 또는 융합단백질의 용이한 정제와 같은 향상된 특성을 보유한다.
IL-18BP는 Ig 분자의 불변 영역에 융합된다. 적절하게는, 이는 예로써 사람 IgG1의 CH2와 CH3 도메인과 같은 중쇄 영역에 융합된다. IL-18BP 및 면역글로불린의 일부분으로 구성되는 특이적 융합단백질의 생산은 WP 99/09063에서 기술한다. Ig 분자의 다른 동등형은 본원 발명에 따른 융합단백질, 예를 들면 동등형 IgG2혹은 IgG4, 또는 다른 Ig(IgM이나 IgA)의 생산에도 적합하다. 가령, 융합 단백질은 단량체 또는 다량체(헤테로- 또는 동종-)일 수 있다.
인터페론은 바이러스 복제와 세포 증식에 대한 저해 효과로 잘 알려져 있다. 가령, 인터페론-γ는 면역과 염증 반응을 촉진하는데 중요한 역할을 한다. 인터페론 β(IFN-β, I형 인터페론)는 항-염증 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
또한, 본원 발명은 CNS 손상의 치료를 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질과 인터페론의 병용에 관한다.
인터페론은 또한, 중합체에 공액시켜 이런 단백질의 안정성을 향상시킬 수도 있다. 인터페론-β와 폴리올 폴리에틸렌글리콜(PEG)간의 공액체는 예로써 WO 99/55377에서 기술한다.
본원의 다른 바람직한 구체예에서, 인터페론은 인터페론-β(IFN-β), 바람직하게는 IFN-β1a이다.
적절하게는, IL-18 생산 및/또는 작용의 저해물질은 인터페론과 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용된다.
종양 괴사 인자는 뇌 손상에서 보효 효과와 독성 효과를 동시에 갖는 것으로 기존 문헌에서 보고되었다(Shohami et al., 1999). 하기 실시예 1에서, 중증도 뇌 손상이후 생쥐에 TNF 주사는 뇌에서 IL-18 수준의 현저한 감소를 유도하는데, 이는 TNF가 외상성 뇌 손상의 회복에 긍정적인 효과를 갖는다는 것을 암시한다. 따라서, 본원의 바람직한 구체예는 뇌 손상의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 TNF와 IL-18 저해물질의 동시, 순차적 또는 개별적 이용에 관한다.
본원 발명에서 IL-18 저해물질과 TNF 알파의 병용이 바람직하다.
본원의 다른 바람직한 구체예에서, 약제는 항-염증제, 예를 들면 NSAID(비-스테로이드성 항-염증 약물)을 추가로 함유한다. 바람직한 구체예에서, COX-저해물질, 좀더 바람직하게는 COX-2 저해물질은 IL-18 저해물질과 병용된다. COX-저해물질은 당분야에 공지되어 있다. 특이적인 COX-2 저해물질은 예로써 WO 01/00229에서 개시한다. 이들 활성 구성성분은 동시에, 순차적으로 또는 개별적으로 사용될 수 있다.
산화 스트레스, 특히 반응성 산소종(ROS)은 뇌 손상의 병태생리에 일정한 역할을 하는 것으로 보고되었다(Shohami et al., 1997).
따라서, 본원의 바람직한 구체예에서, 약제는 동시, 순차적 또는 개별적 사용을 위한 항산화제를 추가로 함유한다. 많은 항산화제가 당분야에 공지되어 있는데, 예를 들면 비타민 A, C, E; 5-아미노살리실산; 또는 슈퍼옥사이드 디스뮤타제이다.
본원의 좀더 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 체중 ㎏당 대략 0.001 내지 100 ㎎, 대략 0.01 내지 10 ㎎, 대략 0.1 내지 3 ㎎, 또는 대략 1 내지 2 ㎎의 함량으로 사용된다.
다른 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 체중 ㎏당 대략 0.1 내지 1000 ㎍, 대략 1 내지 100 ㎍, 또는 대략 10 내지 50 ㎍의 함량으로 사용된다.
또한, 본원 발명은 CNS 손상의 예방 및/또는 치료를 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질, 뮤테인, 기능성 유도체 또는 활성 분획물의 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자의 용도에 관한다.
적절하게는, 핵산 분자는 본원 발명의 IL-18 저해물질을 투여하는데 유전자 요법을 이용하기 위하여 발현 벡터 서열을 추가로 포함한다.
적절하게는, 핵산 분자는 근육내 투여된다.
CNS 손상을 치료 및/또는 예방하기 위하여, IL-18 생산 및/또는 작용 저해물질의 서열을 포함하는 유전자 치료 벡터는 병든 조직에 직접 주사하여, 유전자 치료 벡터의 전신 투여와 관련된 문제, 예를 들면 벡터의 희석, 표적 세포나 조직으로의 도달과 표적화, 부작용을 회피할 수 있다.
정상 상태에서는 IL-18 저해물질의 발현이 중단되는 또는 충분한 함량의 저해물질을 발현하지 못하는 세포에서 IL-18 저해물질의 내생적 생산을 유도 및/또는 강화하기 위한 벡터의 용도 역시 본원 발명에 포함된다. 상기 벡터는 IL-18 저해물질을 발현하도록 소요의 세포에서 작동하는 조절 서열을 포함한다. 이런 조절 서열은 프로모터 또는 인헨서일 수 있다. 이후, 조절 서열은 동종 재조합으로 게놈의 정확한 좌위에 도입할 수 있는데, 여기서 이런 조절 서열은 발현을 유도 혹은 강화시켜야 하는 유전자에 동작가능하도록 연결된다. 이런 기술은 "내생적 유전자 활성화(EGA)"라 한다(WO 91/09955).
당업자가 인지하는 바와 같이, IL-18 저해물질을 사용하지 않고 동일 기술로 IL-18 발현을 직접적으로 차단하는 것도 가능하다. 이를 위하여, 네거티브 조절 요소(예, 억제 인자)를 IL-18의 유전자 좌위에 도입하여 IL-18 발현의 하향-조절 또는 예방을 결과할 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, IL-18 발현의 이런 하향-조절 또는 억제는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 IL-18 저해물질의 사용과 동일한 효과를 갖는다.
또한, 본 발명은 CNS 손상의 치료 및/또는 예방을 위한 약물의 제조에서 IL-18 저해물질을 생산하도록 유전자 조작된 세포의 용도에 관한다.
또한, 본 발명은 염증성 CNS 손상의 예방 및/또는 치료에 특히 유용한 제약학적 조성물에 관하는데, 이는 치료요법적 효과량의 IL-18 저해물질 및/또는 치료요법적 효과량의 인터페론 및/또는 제약학적 효과량의 TNF 및/또는 제약학적 효과량의 함-염증제 및/또는 제약학적 효과량의 항-산화제로 구성된다.
IL-18 저해물질로서 상기 조성물은 카스파제-1 저해물질, IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 임의 하나에 대한 항체, IL-18 신호전달 경로의 저해물질, IL-18과 경합하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18 길항물질 및 IL-18 결합단백질, 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 동일 활성을 보유하는 이들의 원형 순열된 유도체를 함유할 수 있다.
IL-18BP와 이의 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 원형 순열된 유도체는 이런 제약학적 조성물의 바람직한 활성 성분이다.
제약학적 조성물에 포함되는 인터페론은 IFN-베타 또는 IFN-알파이다.
다른 바람직한 구체예에서, 제약학적 조성물은 TNF 알파의 치료요법적 효과량을 함유한다. 본원 발명에 따른 제약학적 조성물은 하나이상의 COX-저해물질을 추가로 함유할 수 있다.
"제약학적으로 수용가능한"은 활성 성분의 생물학적 효능을 방해하지 않고 투여된 숙주에 독성을 보이지 않는 임의의 담체를 의미한다. 가령, 장관외 투여에서 활성 단백질은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민, 링거액과 같은 운반제에 녹인 주사용 단위 약형으로 만들 수 있다.
본원 발명에 따른 제약학적 조성물의 활성 성분은 다양한 방법으로 개체에 투여할 수 있다. 투여 경로에는 피내, 경피(예, 서방 제형), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구, 경막외, 표면, 비강내 경로가 포함된다. 치료요법적으로 유효한 임의의 투여 경로, 예를 들면 상피나 내피 조직을 통한 흡수, 또는 활성 성분을인코드하는 DNA 분자를 환자에 투여하고(예, 벡터를 통하여) 상기 DNA 분자가 생체내에서 활성 성분을 발현 및 분비하는 유전자 요법을 활용할 수 있다. 이에 더하여, 본원 발명에 따른 단백질은 제약학적으로 수용가능한 계면활성제, 부형제, 담체, 희석제, 운반제와 같은 다른 생물학적 활성 성분과 함께 투여할 수 있다.
장관외(예, 정맥내, 피하, 근육내) 투여에서, 활성 단백질은 제약학적으로 수용가능한 장관외 운반제(예, 물, 식염수, 덱스트로스 용액) 및 등장성(예, 만니톨) 또는 화학적 안정성(예, 방부제와 완충제)을 유지시키는 첨가제와 혼합된 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말 형태로 만들 수 있다. 상기 제형은 통상의 기술로 멸균한다.
본원 발명에 따른 활성 단백질의 생체이용효율은 사람 체내에서 분자의 반감기를 증가시키는 공액 과정으로, 예를 들면 상기 분자에 폴리에틸렌글리콜을 부착시켜 개선할 수 있다(PCT 특허 출원 WO 92/13095).
치료요법적 효과량의 활성 단백질은 길항물질의 유형, IL-18에 대한 길항물질의 친화성, 길항물질에 의한 임의 잔기의 세포독성, 투여 경로, 환자의 임상적 상태(내생적 IL-18 활성의 비-독성 수준 유지 필요성 포함)를 비롯한 다양한 변수의 함수다.
"치료요법적 효과량"은 IL-18의 생물학적 활성을 저해하는 IL-18 저해물질 복용량이다. 개체에 투여된 단일 또는 다중 복용량은 IL-18 저해물질 약동학, 투여 경로, 환자 상태와 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증상의 정도, 병행 치료법, 치료 빈도, 소요 효과를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라진다. 개체에서IL-18의 저해를 측정하는 시험관내와 생체내 방법을 비롯하여, 기존 용량 범위의 조정은 당업자에게 공지된 것이다.
본 발명에 따라, IL-18 저해물질은 체중 ㎏당 대략 0.0001 내지 100 ㎎, 대략 0.01 내지 10 ㎎, 대략 0.1 내지 5 ㎎, 대략 1 내지 3 ㎎ 또는 대략 1 내지 2 ㎎의 함량으로 사용된다. 대안으로, IL-18 저해물질은 체중 ㎏당 대략 0.1 내지 1000 ㎍, 대략 1 내지 100 ㎍ 또는 대략 10 내지 50 ㎍의 함량으로 사용된다.
본원 발명에서 바람직한 투여 루트는 피하 루트를 통한 투여이다. 본원 발명에서 다른 바람직한 투여 경로는 근육내 투여이다. IL-18 저해물질을 작용 부위에 직접 투여하기 위하여, 이의 두개내 또는 척수내 투여도 바람직하다. 두개내 투여는 개방성 두부 손상(뇌의 미사일 손상)과의 조합에서 특히 바람직하다.
다른 바람직한 구체예에서, IL-18 저해물질은 매일 또는 격일로 투여된다.
일일 복용량은 분할 분량으로 또는 소요 결과를 달성하는데 효과적인 서방 형태로 제공된다. 2차 또는 후속 투여는 개체에 투여된 초기량 또는 이전 분량과 동일한, 이보다 적은 또는 이보다 많은 복용량으로 실시될 수 있다.
본 발명에 따라, IL-18 저해물질은 예방이나 치료 목적으로 치료요법적 효과량의 다른 섭생이나 약물(예, 다중 약물 요법), 특히 인터페론 및/또는 TNF 및/또는 다른 항-염증제, 예를 들면 COX 저해물질 및/또는 항산화제에 앞서, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 뇌 손상에 따라, TNF 대신에 TNF-길항물질의 공동-투여도 고려될 수 있다(Shohami et al., 1999). 다른 치료제와 동시에 투여되는 활성 약물은 동일하거나 상이한 조성물로 투여될 수 있다.
또한, 본원 발명은 제약학적 조성물을 제조하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 IL-18 저해물질 및/또는 인터페론 및/또는 TNF 길항물질 및/또는 COX 저해물질의 효과량 및 제약학적으로 수용가능한 담체를 혼합하는 단계로 구성된다.
또한, 본원 발명은 CNS 손상을 치료하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 IL-18 저해물질의 제약학적 효과량을 병든 환자에 투여하는 단계로 구성된다.
논문이나 초록, 공개되거나 공개되지 않은 특허 출원, 특허 혹은 외국 특허, 또는 임의 다른 자료를 비롯한 본원에 언급된 모든 자료, 예를 들면 모든 데이터, 표, 도면 및 언급된 자료에 제시된 참고문헌은 여기에 순전히 참고로 한다.
공지된 방법 단계, 통상적인 방법 단계, 공지된 방법 또는 통상적인 방법에 대한 참고문헌은 본원 발명의 임의 측면, 설명 또는 구체예가 선행 기술에 개시, 설시 또는 제안되었음을 인정하는 것이 아니다. 이에 덧붙여, 본원에 언급된 참고문헌의 전체내용은 순전히 참고로 한다.
특정 구체예의 전술한 설명에서는 본원 발명의 전반적인 특성을 제시하는데, 당업자는 통상적인 지식을 활용하여 과도한 실험없이 본원 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 범위에서 이런 특정 구체예를 용이하게 개변할 수 있다. 따라서, 이런 개변은 본원에 제시된 내용에 기초하여 개시된 구체예의 균등물 범위에 속한다. 본원에서 사용된 용어는 본원을 설명하기 위한 것으로, 이를 제한하지 않으며, 본원에 개시된 내용에 비추어 당업자가 통상적인 지식으로 이해할 수 있다.
다음의 실시예를 참고하면 본원 발명을 좀더 쉽게 이해할 수 있지만, 이들 실시예는 본원 발명을 제한하지 않는다.
재료와 방법
외상 모델(Trauma model)
본 연구에 사용된 생쥐는 8-16주된 30-35 g 수컷이었다. 이들은 특정 병원균-없는 환경에서 사육하고 표준 온도와 광 조건하에 4-6 마리의 우리에서 유지시키며 물과 사료를 자유롭게 먹게 하였다. 본 연구는 Institutional Animal Care Committee of the Hebrew University of Jerusalem, Israel의 가이드라인에 따라 실시하였다. 실험적 CHI는 기존에 개발된 중력추(weight-drop) 장치를 이용하여 실시하였다(Chen et al. 1996). 간단히 말하면, 에테르 마취후 정중선 세로 절개(midline longitudinal incision)를 실시하고 피부를 수축시키며 두개골을 노출시켰다. 좌전두(left anterior frontal) 부위를 확인하고, 팁 테플론 원뿔(tipped teflon cone)을 정중-관상면(mid-coronal plane)에서 정중선의 ~1㎜ 측면에 위치시켰다. 머리는 고정시키고 75 g 추를 18 cm 높이의 원뿔에서 떨어뜨려 좌반구(left hemisphere)에 국소 손상을 유발시켰다. 외상후, 이들 생쥐는 2분동안 100% O2로 산소를 공급하고, 이후 우리에 다시 집어넣었다.
생쥐 뇌에서 IL-18 수준의 평가
두개내(intracranial) IL-18 수준을 정량하기 위하여, C57BL/6(B6) 계통의 생쥐(총 n=62)는 6개 군으로 설정하였다: (1) "정상 대조": 처리되지 않은 B6 생쥐(n=10); (2) "에테르 마취": 생쥐는 10분동안 에테르로 마취시키고24h(hour)(n=10) 또는 7d(day)(n=10)이후 단두하였다; (3) "겉보기 수술(sham operation)": 이들 생쥐는 마취 및 세로 머리가죽 절개를 실시하고 24h(n=15) 또는 7d이후 희생시켰다; (4) "외상 군": 실험적 CHI는 전술한 바와 같이 실시하고, 동물은 외상후 4h(n=7), 24h(n=7), 7d(n=7)에 에테르 마취하에 단두하였다; (5) "TNF 주사": 뇌내(intracerebral) IL-18의 조절에서 TNF의 역할을 평가하기 위하여, 생쥐는 에테르 마취시키고 10 ㎕ 무균 인산완충액(PBS)에 넣은 200 ng 뮤린 재조합 TNF(R&D Systems, Abingdon, UK)를 뇌내-뇌실(i.c.v)에 주사하고 24h(n=10)이후 희생시켰다; (6) "모의 주사": 이들 동물은 TNF-주사된 동물에 대한 대조군으로, 운반제 단독(10 ㎕ 무균 PBS)을 i.c.v. 주사하고 24h(n=6)이후 희생시켰다. 모든 동물에서, 뇌는 단두후 즉시 떼어내고 액체 질소에서 즉석 동결하며 분석 때까지 -70℃에 저장하였다. 외상 군의 뇌는 손상된 반구 vs. 손상되지 않은 반구에서 IL-18 수준을 비교하기 위하여 좌측(동측)과 우측(반대측) 반구로 분리하였다. 조직 균질화(homogenization)는 Tris 50 mM(pH 7.2), NaCl 150 mM, Triton-X-100 1%(Boehringer Mannheim, Rotkreuz, Switzerland), 프로테아제 저해물질 칵테일(Boehringer Mannheim)을 함유하는 차가운 추출완충액(W/W)에서 1:4로 희석된 Polytron(Kinematica, Kriens, Switzerland)으로 실시하였다. 균질화액(homogenate)은 90분동안 얼음에서 교반하고 3,000 g와 4℃에서 15분동안 원심분리하였다. 상층액은 등분하고 분석 때까지 -70℃에 저장하였다. 뇌 추출물에서 전체 단백질의 농도는 Bradford 분석(Bio Rad Laboratories, Munich, Germany)으로 측정하였는데, 평가된 모든 생쥐에서 매우 일정한 것으로밝혀졌다(12.1±2.1 ㎎/㎖; 평균±SD). 뇌내 사이토킨 수준의 정량은 제조업자(R&D Systems, Abingdon, UK)의 사용법에 따라, 뮤린 IL-18에 특이적인 ELISA로 실시하였다. 이런 분석의 민감도는 5 pg/㎖이었다. 상이한 동물군간 뇌내 IL-18 수준을 비교하기 위하여, 5 pg/㎖의 탐지 한계(detection limit) 미만의 모든 농도는 4.9 pg/㎖으로 지정하였다. 시료는 희석없이 이중 웰에 부어 넣고 이중 시료의 평균 OD로부터 최종 농도를 계산하였다. OD는 405 nm의 흡광도 파장(extinction wavelength)에서 분광광도계(Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA)로 측정하였다.
IL-18BP 처리 프로토콜
수컷
Hebrew University 계통의 수컷 Sabra 생쥐(n=40)가 IL-18BP 연구에 이용되었다. 마취와 실험적 CHI는 전술한 바와 같이 실시하였다. 처리 프로토콜을 위하여, 동물은 2개의 군으로 나누었다: A군("대조군", n=16)에서, 생쥐는 실험적 CHI를 발생시키고 1h이후 운반제(PBS) 단독을 주사하며 신경학적 평가를 위하여 7d동안 관찰하였다. B군("연구군", n=18)에서, 생쥐는 CHI후 t=1h에서 신경학적 스코어의 측정직후에 50 ㎍ IL-18BP를 i.p. 주사하였다. 혈관-뇌 문맥( blood-brain barrier) 투과성은 동일한 실험 모델(Chen et al. 1996)에서 앞서 측정된 바와 같이 CHI후 1-4h사이에 5-6배 증가하기 때문에, IL-18BP는 이들 조건하에 뇌에 가용하다. 다른 2개의 생쥐군은 A군과 B군에 따라 처리하고(C군: "대조군"; D군: "연구군", 각각) 48h이후 단두하며, 후속으로 하기에 밝힌 바와 같이 외상후 부종의평가를 위한 뇌 해부를 실시하였다.
신경학적 손상의 평가
외상후 신경학적 손상을 평가하기 위한 신경학적 심각도 스코어(NSS)는 이미 개발되고 검증되었다(Stahel et al., 2000).
상기 스코어는 운동 기능(motor function), 민첩성(alertness), 생리적 행동(physiological behavior)에 기초한 10가지의 개별적인 임상 과제로 구성되는데, 여기서 과제 실패에는 1점이 부여되고 과제 성공에는 0점이 부여된다(표 4). 10점의 최대 NSS는 모든 과제에 실패한 중증도의 신경학적 기능장애를 지시하고, 반면 0점은 손상을 입지 않은 건강한 생쥐에 의해 달성된다. 외상후 1h에 NSS는 손상의 초기 심각도를 반영하고 임상 결과와 높게 상관한다(Beni-Adani et al. 2001). 과제 수행의 평가는 실험적 CHI후 1h, 24h, 72h, 7d 시점에 연구군을 전혀 알지 못하는 2명의 연구원이 실시하였다. t=1h에서 NSS와 임의의 이후-시점에서 NSS간의 차이로 계산된 △NSS는 기준 문헌(Chen et al. 1996)에서 밝힌 바와 같이, 뇌 손상이후 자발적 회복의 정도를 반영하는 파라미터이다.
표 4:두부-손상된 생쥐의 신경학적 심각도 스코어 (NSS)
| 과제 | 설명 | 성공/실패 점수 |
| 원 벗어나기 | 3분내에 30 ㎝ 직경의 원을 벗어나는 능력과 창의. | 0 / 1 |
| 단일부질환 /편측부전마비 | 반대측 상지와 하지의 부전마비(Paresis). | 0 / 1 |
| 바른 걸음 | 바르게 걷는 민첩성, 창의, 운동 능력 | 0 / 1 |
| 놀람 반사 | 자연 반사(Innate reflex); 생쥐는 시끄러운 박수소리에 반응하여 뛰어 다닌다. | 0 / 1 |
| 추구 행동 | 주위환경에 대한 관심의 표시로서 생리적 행동 | 0 / 1 |
| 들보 균형 | 적어도 10초동안 7㎜ 너비의 들보에서 균형을유지하는 능력 | 0 / 1 |
| 원형 막대 균형 | 적어도 10초동안 5㎜ 직경의 원형 막대에서 균형을유지하는 능력 | 0 / 1 |
| 들보 걸음: 3 cm | 30cm 길이와 3cm 너비의 들보를 건너가는 능력. | 0 / 1 |
| 들보 걸음: 2 cm | 동일한 과제, 2cm 너비의 들보에서 난이도 증가 | 0 / 1 |
| 들보 걸음: 1 cm | 동일한 과제, 1cm 너비의 들보에서 난이도 증가 | 0 / 1 |
| 최대 스코어 | 10 |
뇌 부종의 평가
뇌 부종의 정도는 기존 문헌(Chen et al. 1996)에서 밝힌 바와 같이, 손상된 반구에서 조직 수분 함량을 측정하여 평가하였다. 간단히 말하면, 생쥐는 이런 모델 시스템에서 부종이 여전히 현저한 시점에 해당하는 외상후 48h에 전술한 바와 같이 마취시켰다(Chen et al. 1996). 단두후, 소뇌와 간질은 떼어내고, 외상 부위와 경계를 이루는 부위 및 이의 반대측 반구로부터 ~20㎎ 피질 분절을 준비하였다. 우측(손상되지 않은) 반구는 내부 대조로 이용하였다. 조직 박편은 칭량하고 95℃에서 24h동안 건조시켰다. "건조된"절편을 칭량한 이후, 뇌 수분 함량의 비율은 다음과 같이 계산하였다:
H2O% = [(습식 중량 - 건식 중량) x 100] / 습식 중량.
뇌 손상 환자
Trauma Division of the University Hospital Zurich에 입원한 중증도 CHI 환자(평균 연령±SD: 37±10세; 범위 24-57세; 9명의 남성과 1명의 여성)가 본 연구에 참가하였다. 모든 환자는 심폐소생술(cardiopulmonary resuscitation)이후 ≤8 Glasgow Coma Scale(GCS) 스코어를 보였다(Teasdale and Jennett, 1974). CT 스캔 평가후, 모든 환자는 두개내압(intracranial pressure)(ICP)이 15 mmHg을 초과하면 치료적 CSF 배수를 위하여 뇌실내 카테터를 제공받았다. 어떤 환자도 스테로이드 치료를 받지 않았다. 부수적인 흉관, 복부, 골반, 척추 손상 또는 오래된 골절에 개입을 필요로 하는 다중 손상 환자는 본 연구에서 배제하였다. 개별 결과는 Glasgow Outcome Scale(GOS)로 평가하였다(Jennett and Bond, 1975). CSF와 혈청 수집을 위한 프로토콜은 Ethics Board Committee of the University Hospital, Zurich의 승인을 받았다.
시료 수집과 IL-18 분석
CHI 환자(n=10)의 CSF 및 대합된 혈청 시료는 고정된 한 시점에서 매일 수집하였다. 대조 CSF는 진단 척추천자(spinal tap)를 받은 환자(n=5)로부터 수집하였다. 이들 환자는 단백질, 글루코오스, 세포수의 정상적인 CSF 값에 기초하여, 염증성 CNS 질환의 징후를 보이지 않았다. CHI 군에서 시료 수집은 예로써 24h 이상동안 ICP가 정상 범위(≤ 15 mmHg)에 유지되는 경우에서처럼 뇌실 카테터가 조기에 제거되지 않는 경우에 외상후 10d동안 실시하였다. 총 106개의 대합된 CSF와 혈청 시료는 본 연구에서 분석되는 외상 환자에서 수집하였다. 모든 시료는 수집후 즉시 원심분리하고 등분하며 분석 때까지 -70℃에서 동결시켰다. CSF와 혈청에서IL-18 수준의 정량은 상업적으로 입수가능한 키트(R&D Systems, Abingdon, UK)를 이용하여 사람 IL-18에 특이적인 ELISA로 실시하였다. 뮤린 분석에서, ELISA의 민감도는 5 pg/㎖이었고, IL-18 최종 농도는 405 nm의 흡광도 파장으로 이중 시료에서 측정된 평균 OD로부터 계산하였다. CHI 환자와 대조간 IL-18 CSF 수준을 비교하기 위하여, 5 pg/㎖ 탐지 한계 미만의 모든 농도는 4.9 pg/㎖로 지정하였다.
데이터 분석
데이터의 통계학적 분석은 상업적으로 가용한 소프트웨어(WindowTM용 SPSS 9.0 )로 실시하였다. 비-모수적 만-위트니-U(Mann-Whitney-U) 검증은 정상적으로 분포되지 않은 데이터, 예를 들면 신경학적 스코어(NSS와 △NSS)의 분석에 이용되었다. 홀 스튜던트 t-검증(unpaired Student's t-test)은 서로 다른 생쥐군에서 뇌내 IL-18 농도의 비교 및 IL-18BP-처리된 생쥐 vs. 운반제-주사된 생쥐의 뇌 수분 함량에서 차이 분석에 이용되었다. CHI 환자의 일일 CSF vs. 대합된 혈청 시료에서, 또는 외상 vs. 대조 CSF에서 사람 IL-18 수준의 비교는 반복 측정 ANOVA를 위한 전반적 선형 모델을 이용하여 측정하였다. < 0.05 p-값은 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.
결과
실시예 1: 생쥐에서 뇌내 IL-18 수준
도 1에 도시된 바와 같이, IL-18은 B6 계통의 처리되지 않은("정상") 대조 생쥐(n=10)의 뇌 균질화액에서 ELISA로 탐지하였는데, 평균 수준은 27.7±1.7[±SEM] ng/㎖이었다. 실험군에서, 에테르 마취 단독 또는"겉보기"수술과 함께 에테르 마취(즉, 에테르 마취와 세로 머리가죽 절개)의 유도는 각각, 48.9±1.1 ng/㎖ ("에테르"군,n=8)와 54.3±2.7 ng/㎖("겉보기"군,n=13)의 현저하게 상승된 두개내 IL-18 수준을 결과하였다(p<0.01 vs. "정상" 생쥐, 홀 스튜던트 t-검증; 도 1). "에테르"와"겉보기"-처리된 동물간 차이는 통계학적으로 유의하지 않았다(p=0.16).
외상 군(n=21)에서, CHI의 유도는 외상후 4h(60.6±3.3과 59.8±5.0 ng/㎖, 각각) 내지 24h(56.9±2.1과 56.3±3.7 ng/㎖, 각각)이내에, 손상된 반구와 반대측 반구 모두에서 IL-18 수준을 상승시켰지만, 이들 수준은 "에테르"또는"겉보기"군과 비교하여 현저하게 높지는 않았다(p>0.05).
이와 대조적으로, CHI후 7d까지 에테르-마취되거나 겉보기-수술된 동물과 비교하여 현저하게 상승된 뇌내 IL-18 농도가 손상된 반구에서 탐지되고(67.6±5.1 ng/㎖ vs. 42.2±0.8과 45.2±0.5 ng/㎖, 각각;p<0.01), 반면 반대측 반구에서 IL-18 수준은 이들 두 대조군과 비교하여 현저하게 상승하지 않았다(63.2±6.0 ng/㎖;p=0.06).
뇌내 IL-18 수준의 조절과 관련하여 이런 외상 모델(Shohami et al. 1999)에서 염증의 중요한 매개물질인 TNF의 역할을 평가하기 위하여, 추가의 B6 생쥐군(n=10)은 10㎕ 무균 PBS에 넣은 200 ng 뮤린 재조합 TNF을 i.c.v. 주사하고 24h이후 희생시켰다. 도 1에 도시된 바와 같이, 운반제 단독으로 "모의"주사(n=6)하면 처리되지 않은 정상 B6 생쥐와 비교하여 뇌내 IL-18이 24h내에 현저하게 상향-조절되었다(53.6±3.9 vs. 27.7±1.7 ng/㎖;p<0.001).
TNF 주사는 "모의"-주사된 대조군 24h(53.6±3.9 ng/㎖)와 비교하여, 24h내에 두개내 구획에서 IL-18의 현저한 완화(22.1±6.9 ng/㎖;n=10)를 유도하였다(p<0.001). "TNF 군"에서 IL-18 수준은 처리되지 않은 정상 생쥐(27.7±1.7 ng/㎖)에서보다 훨씬 낮은데, 하지만 이런 차이는 통계학적으로 유의하지 않았다(p=0.45).
실시예 2: 외상후 신경학적 회복에 대한 IL-18BP 처리의 효과
IL-18 저해가 뇌 손상에서 회복을 촉진할 수 있다는 가설을 조사하기 위하여, IL-18BP의 단일 주사후 다양한 시점에서 회복을 비교하였다. 외상후 1h에 신경학적 심각도 스코어(NSS)는 외상의 정도를 좀더 정확하게 반영하고 MRI와 조직구조에서 발견되는 손상된 조직의 크기와 상관하는 것으로 이미 밝혀졌다.
동등한 외상을 가진 동물군을 얻기 위하여, 생쥐는 t=1h에서 초기 NSS를 평가한 이후 서로 다른 처리군으로 설정하였다. 도 2[IL-18BP에서 NSS(사각형) vs. 대조(원)]에 도시된 바와 같이, 이들 두 군은 유사한 초기 NSS(1h)(7.69±0.3023 및 7.44±0.3627, 대조와 IL-18BP 각각)를 보이는데, 이는 손상의 동등한 심각도를 나타낸다.
이후 시점(1-7d)에서 NSS 평가에서 IL-18BP를 복강내(i.p.) 처리한 동물은 NSS 값으로 확인되는 바와 같이 현저하게 줄어든 신경학적 손상을 보이고 외상후 7d후에 유의성에 도달하는 것으로 나타났다(p=0.045).
△NSS(t) = NSS(1h) - NSS(t)로 표시되는 회복 속도를 계산하였다. 좀더 높은 △NSS 값은 좀더 많은 회복을 반영하고, 0이나 네거티브 △NSS는 회복없음이나악화를 반영한다. 도 3에서는 두 군의 △NSS 값을 도시한다. 두 시점, 24h와 7d에서 평균 △NSS 값의 차이는 유의성에 도달하였다.
손상후 3d에 제공된 IL-18BP 처리가 효과적인 지를 조사하는 다른 실험을 실시하였다. 치료 시점의 문제는 중요한데, 지금까지는 수시간이후에 제공된 치료가 효과적인 것으로 나타났다. IL-18 자체가 외상후 7d에 자체적으로 상승하고 외상후 1h에 제공된 IL-18BP 처리가 7d에서 최대 효과를 유도하는 것으로 밝혀졌기 때문에, 외상후 3d에 생쥐를 처리하기로 결정하였다. 비교를 위하여, 다른 군은 1h와 3d에 IL-18BP로 처리하였다. 대조군은 용매(운반제) 단독으로 처리하였다.
도 4에 도시된 이 실험의 결과는 3d에 제공된 단일 처리가 CHI후 1h와 3d에 제공된 처리만큼 효과적이라는 것을 보여준다.
본 실험은 실험적 뮤린 모델에서 외상성 두부 손상으로부터 회복에 대한 폐쇄성 두부 손상(closed haed injury)후 1h 또는 3d에 제공된 IL-18BP 1회 투여의 긍정적인 극적 효과를 입증한다.
실시예 3: 뇌 손상후 사람 CSF에서 상승된 IL-18 수준
IL-18 수준은 외상후 최대 10일동안 10명의 중증 CHI 환자로부터 수집한 일일 CSF와 혈청 시료에서 평가하였다. 환자의 인구통계학적 임상 데이터는 표 5에 제시한다.
표 5: 중증도 CHIa환자의 인구 통계학적 임상 데이터
| 환자 No. | 연령 (years)/ 성별 | GCSb | GOSc | CSFd에서 IL-18 (pg/㎖)중간값[범위]e | 혈청에서 IL-18 (pg/㎖)중간값[범위]e | ||
| 1 | 48 / m | 3 | 1 | 283 | [78-966] | 57.5 | [12-66] |
| 2 | 31 / m | 7 | 4 | 228.4 | [22-745] | 19.7 | [4.9-108] |
| 3 | 26 / m | 5 | 3 | 208.5 | [20-392] | 37.2 | [14-163] |
| 4 | 57 / m | 5 | 4 | 72.6 | [30-286] | 48.9 | [14-104] |
| 5 | 24 / m | 4 | 5 | 32.6 | [4.9-155] | 17 | [4.9-58] |
| 6 | 36 / m | 8 | 1 | 49.4 | [10-290] | 16.7 | [12-67] |
| 7 | 38 / f | 3 | 4 | 17.9 | [11-100] | 13 | [4.9-46] |
| 8 | 35 / m | 3 | 3 | 69.8 | [4.9-329] | 19.8 | [7-77] |
| 9 | 37 / m | 3 | 4 | 37 | [23-75] | 57.3 | [25-98] |
| 10 | 41 / m | 7 | 5 | 4.9 | [4.9-169] | 26.2 | [15-38 |
| 대조 CSF(n=5) | 4.9 | [4.9-7.8] |
aCHI, 폐쇄성 두부 손상
bGCS, Glasgow Coma Score(Teasdale and Jennett, 1974).
cGOS = 손상후 3m(month)에 Glasgow Outcome Score; 5 = 무증상, 4 = 중등도 장애, 3 = 중증도 장애, 2 = 지속적인 식물인간 상태(vegetative state), 1 = 사망(Jennett and Bond, 1975).
dCSF = 뇌척수액.
e5 pg/㎖ 탐지 한계 미만의 IL-18 수준은 4.9 pg/㎖로 지정하였다.
도 5에 도시된 바와 같이, 척수내 IL-18 수준은 외상이나 염증성 신경 질환이 없는 5명의 환자로부터 수집한 대조 CSF과 비교하여 9/10 CHI 환자에서 현저하게 상승하였다(p<0.05; 반복 측정 ANOVA). 1명의 환자(#10)만 IL-18 CSF 수준이대조 CSF와 비교하여 현저하게 상승하지 않았다(p=0.31). CSF와 혈청에서 IL-18의 중간값 수준과 개별 범위는 표 5에 제시한다.
주목할 점은 CSF에서 최대 IL-18 농도(966 ng/㎖)가 대조에서보다 두부-손상 환자에서 최대 200-배 더 높다는 사실이다. 뇌내 IL-18은 ELISA에 의해 외상 군에서 모든 CSF 시료의 90%에서 탐지되는 반면, 대조 CSF 시료에서는 단지 40%만 탐지가능한 뇌내 IL-18 수준(즉, > 4.9 ng/㎖)을 보였다. 8/10 CHI 환자에서, IL-18 중간 농도는 혈청에서보다 CSF에서 현저하게 높았다(p<0.05; 반복 측정 ANOVA). 하지만, 2명의 환자(#9,10)에서는 혈청에서 IL-18 중간 수준이 표 5에 도시된 바와 같이 CSF에서 상응하는 농도를 초과한다.
이들 결과는 외상성 두부 손상 환자의 뇌척수액에서 IL-18 수준이 현저하게 상승한다는 것을 보여준다. IL-18BP의 첨가는 이들 상승된 수준을 감소시키고, 따라서 상기 실시예 2에 도시된 바와 같이 폐쇄성 두부 손상으로부터 회복에 긍정적인 효과를 발휘할 것으로 생각된다.
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Claims (32)
- 중추 신경계(CNS) 손상의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에 사용되는 IL-18 저해물질의 용도.
- CNS 손상의 합병증과 만발 효과(late effect)의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에 사용되는 IL-18 저해물질의 용도.
- 제 1 항 또는 2 항에 있어서, CNS 손상은 외상성 뇌 손상인 것을 특징으로 하는 용도.
- 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, CNS 손상은 폐쇄성 두부 손상인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 또는 2 항에 있어서, CNS 손상은 척수 손상인 것을 특징으로 하는 용도.
- 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, CNS 손상은 혈관 기원하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 1 항 내지 6 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 카스파제-1( 저해물질ICE), IL-18에 대한 항체, IL-18 수용체 아단위중 하나에 대한 항체, IL-18 신호전달 경로의 저해물질, IL-18과 경쟁하고 IL-18 수용체를 차단하는 IL-18의 길항물질, IL-18 생산의 저해물질 및 IL-18 결합 단백질, 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 IL-18 결합 단백질과 적어도 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 이들의 원형 순열된 유도체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 7 항에 있어서, IL-18 저해물질은 IL-18 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 8 항에 있어서, IL-18 항체는 인화 IL-18 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 8 항 또는 9 항에 있어서, IL-18 항체는 사람 IL-18 항체인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 7 항에 있어서, IL-18의 저해물질은 IL-18 결합 단백질이나 염, 동등형, 뮤테인, 융합단백질, 기능성 유도체, 활성 분획물 또는 이들의 원형 순열된 유도체인 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 7 항 내지 11 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 하나이상의 부위에서 당화되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 7 항 내지 12 항중 어느 한 항에 있어서, 융합단백질은 면역글로불린(Ig) 융합을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 7 항 내지 13 항중 어느 한 항에 있어서, 기능성 유도체는 아미노산 잔기의 하나이상의 측쇄로 존재하는 한가지이상의 작용기에 부착되는 적어도 하나의 일부분(moiety)을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 14 항에 있어서, 일부분은 폴리에틸렌글리콜(PEG) 부분인 것을 특징으로 하는 용도.
- 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 약물은 동시, 순차 또는 개별 투여를 위한 인터페론을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 15 항에 있어서, 인터페론은 인터페론-α 또는 인터페론-β인 것을 특징으로 하는 용도.
- 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 약물은 동시, 순차 또는 개별 투여를 위한 종양 괴사 인자(TNF)를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 18 항에 있어서, TNF는 TNF 알파인 것을 특징으로 하는 용도.
- 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 약물은 동시, 순차 또는 개별 투여를 위한 항-염증제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 20 항에 있어서, 항-염증제는 COX-저해물질, 특히 COX-2 저해물질인 것을 특징으로 하는 용도.
- 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 약물은 동시, 순차 또는 개별 투여를 위한 항산화제를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 체중 ㎏당 0.001 내지 100 ㎎, 0.01 내지 10 ㎎, 0.1 내지 5 ㎎, 또는 1 내지 3 ㎎의 함량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 피하 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 매일 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
- 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, IL-18 저해물질은 격일로 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
- CNS 손상을 예방 또는 치료하는 약물의 제조에서 IL-18 저해물질의 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자의 용도.
- 제 27 항에 있어서, 핵산 분자는 발현 벡터의 서열을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
- 제 27 항 또는 28 항에 있어서, 핵산 분자는 근육내 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
- CNS 손상을 예방 또는 치료하는 약물의 제조에서 세포에서 IL-18 저해물질의 내생적 생산을 유도하거나 강화시키는 벡터의 용도.
- CNS 손상을 예방 또는 치료하는 약물의 제조에서 IL-18 저해물질을 생산하도록 유전자 조작된 세포의 용도.
- CNS 손상을 치료 또는 예방하는 방법에 있어서, IL-18 저해물질의 저해 효과량을 병든 환자에 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
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