CN1535160A - Il-18抑制剂在治疗或预防中枢神经系统损伤中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及IL－18抑制剂在制备治疗和/或预防中枢神经系统损伤特别是创伤性头部外伤的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及脑的病理状况领域。更具体地说，本发明涉及IL-18抑制剂在治疗和/或预防中枢神经系统损伤特别是创伤性脑损伤中的应用。
发明背景
1989年有人叙述了一种内毒素诱导的血清活性，该活性能诱导由小鼠脾细胞获得的干扰素-γ(IFN-γ)(Nakamura等人，1989)。这种血清活性的作用不是IFN-γ的直接诱导剂，而是与IL-2或有丝分裂原一起作为共刺激剂。有人尝试由内毒素后小鼠血清纯化这种活性，结果揭示了一种分子量为50-55kDa表观均一的蛋白质。由于其他细胞因子可以作为产生IFN-γ的共刺激剂，所以无法通过中和抗IL-1、IL-4、IL-5、IL-6或TNF的抗体来中和该血清活性，提示它是一种截然不同的因子。1995年同一批科学家证实了以疮疱棒状杆菌(P.acnes)预处理的小鼠肝脏提取物中含有由内毒素诱导产生IFN-γ的共刺激剂(Okamura等人，1995)。此模型中肝脏巨噬细胞群(Kupffer细胞)扩展，低剂量细菌脂多糖(LPS)對这些小鼠来說是可致命的，但对于未经预处理的小鼠是不致命的。该因子被命名为IFN-γ诱导因子(IGIF)，后来又被称为白细胞介素-18(IL-18)，由1,200克经疮疱棒状杆菌处理过的小鼠肝脏提纯至均浆。采用由纯化IL-18的氨基酸序列所产生的简并寡核苷酸来克隆小鼠IL-18cDNA。IL-18是18-19kDa蛋白质，含有157个氨基酸，与数据库中任何一种肽没有明显的相似性。在Kupffer细胞与活化的巨噬细胞中不难检测到IL-18和白细胞介素-12(IL-12)的信使RNAs。重组IL-18似乎通过一个独立的途径诱导IFN-γ，比IL-12更有效力(Micallef等人，1996)。与由内毒素诱导的血清活性相似，IL-18本身不会诱导IFN-γ，但其主要功能是与有丝分裂原或IL-12一起作为共刺激剂。IL-18似乎通过一条依赖于IL-12的途径来增强T细胞增殖，在体外增强Th1细胞因子的产生，并且当与IL-12结合时对增强IFN-γ的产生具有协同作用(Maliszewski等人，1990)。
在克隆小鼠之后，1996年已有了IL-18的人cDNA序列的报导(Ushio等人，1996)。
用受感染的组织克隆IL-18，并对IL-18基因表达进行了研究，发现这个细胞因子与自身免疫疾病之间有密切联系。非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠会自发地发展为自身免疫胰岛炎和糖尿病，单次注射环磷酰胺可使这些病加快或同步发展。在胰岛炎早期的非肥胖型糖尿病小鼠的胰腺中通过逆转录酶PCR技术证实了IL-18mRNA。经过环磷酰胺治疗后，IL-18mRNA水平很快上升，先于IFN-γmRNA的增加，然后再发展为糖尿病。有趣的是，这些动力学酷似IL-12-p40mRNA的动力学，致使各种mRNA水平有密切联系。由胰腺RNA克隆IL-18cDNA，再作序列分析，结果发现与由Kupffer细胞及体内预活化的巨噬细胞克隆的IL-18序列相同。另外，非肥胖型糖尿病小鼠的巨噬细胞以IL-18基因表达应答环磷酰胺，而经过平行处理的Balb/c小鼠却不会作这样的应答。所以，IL-18表达在自身免疫非肥胖型糖尿病小鼠中是反常调节的，与糖尿病的发展有密切关系(Rothe等人，1997)。
IL-18可能通过增加Fas配体对Th1细胞的功能活性而对免疫调节和炎症具有一定作用(Conti等人，1997)。IL-18也在肾上腺皮质中表达，因而可能是一种分泌型神经免疫调节剂，受压后在使免疫系统和谐配合上发挥重要作用(Chater，1986)。
在体内切割pro-IL-18形成IL-18，它的内源活性似乎解释了在疮疱棒状杆菌中产生IFN-γ以及LPS介导的致死现象。成熟IL-18通过IL-1β转化酶(IL-1β转化酶、ICE、caspase-1)由它的前体产生。
IL-18受体由至少两种成分组成，共同操作配体的结合。在由小鼠IL-12刺激的T细胞中发现了IL-18的高亲和力和低亲和力结合位点(Yoshimoto等人，1998)，提示存在着一个多链受体复合物。迄今为止鉴定了两个受体亚基，二者均属于IL-1受体家族(Parnet等人，1996)。IL-18的信号转导涉及NF-κB的活化(DiDonato等人，1997)。
最近，从人尿液分离出对IL-18有高亲和力的可溶性蛋白质，并且叙述了人和小鼠cDNAs(Novick等人，1999；WO99/09063)。该蛋白被命名为IL-18结合蛋白(IL-18BP)。
IL-18BP不是已知的IL-18受体之一的胞外结构域，而是一种分泌型天然循环蛋白。它属于分泌型蛋白的一个新家族，该家族还包括几种痘病毒编码的蛋白质，其与IL-18BP高度同源(Novick等人，1999)。IL-18BP在脾中固有地表达，属于免疫球蛋白超家族，与IL-1II型受体具有有限同源性。它的基因位于人染色体11q13上，在8.3kb的基因组序列中没发现编码跨膜结构域的外显子(Novick等人，1999)。
业已对由mRNA剪接产生以及在各种cDNA库中发现的四种人IL-18BP同种型和两种小鼠IL-18BP同种型进行了表达、纯化，并评估其结合与中和IL-18生物活性的能力(Kim等人，2000)。人IL-18BP同种型a(IL-18BPa)对IL-18的亲和力最高，结合速率快，解离速率慢，解离常数(K(d))为399pM。除了29个C末端氨基酸外，IL-18BPc与IL-18BPa都有Ig结构域；IL-18BPc的K(d)低10倍(2.94nM)。然而，过量2摩尔时IL-18BPa和IL-18BPc均能中和95％以上的IL-18。IL-18BPb和IL-18BPd同种型缺少完整的Ig结构域，因而不能结合或中和IL-18。小鼠IL-18BPc和IL-18BPd同种型具有完全一样的Ig结构域，过量2摩尔时能中和95％以上的小鼠IL-18。不过，小鼠IL-18BPd的C-末端基序与人IL-18BPa相同，故也能中和人IL-18。分子模型鉴定了IL-18BP的Ig结构域中一个较大的静电疏水混合结合位点，这可解释它与配体能以高亲和力结合的现象(Kim等人，2000)。
创伤性脑损伤(TBI)，也可简称为头部外伤或闭合性头部外伤(CHI)，指头部受到外来撞击导致脑部受损的中枢神经系统损伤。它大多数发生于车祸或自行车意外，但也可因溺闭、心脏病发、中风和受感染而引发。这一类创伤性脑损伤通常是因为脑部缺氧或缺血而引起，因而可称为“缺氧性损伤”。
发生车祸或跌倒时，头部受到撞击引致闭合性头部外伤。在此情况下，头骨撞到一个固定物体，头骨内的脑绕它的轴线(脑干)扭转，造成局部或大范围损害。另外，脑部即由允许其“漂浮”的流体所包围的软质可反弹至头骨上，导致将来可能会再受伤。
受伤后可能即时有一段时间失去意识，这段时间可持续数分钟、数星期或数个月。由于扭转或反弹，创伤性脑损伤患者的脑部很多部位受损或有瘀伤。这种情况称为脑部弥漫性损伤或“非枪弹损伤(non-missile injury)”。非枪弹损伤所造成的这类脑受损可分为原始或继发性脑损伤。
原始脑损伤发生于受伤当时，主要在撞击部位，特别是当头骨碎裂时。大面积挫伤可能与大脑内出血有关，或者伴随有皮层破裂。弥漫性轴索损伤是头骨内脑旋转运动所产生的神经元过程的剪应变与拉伸应变所引致。轴索还可能有小的出血性病变或弥漫性损伤，这只能用显微镜才能检测到。
继发性脑损伤是受伤后并发症所引致。它们包括颅内出血、脑外动脉创伤性损伤、颅内疝形成、缺氧性脑受损或脑膜炎。
“开放性头部外伤”是一种看得见的对头部的袭击，可由枪伤、意外或从头骨穿过脑的物体引起(“脑部枪弹损伤”)。这类头部外伤更可能对脑的特定区域造成伤害。
所谓“中度脑损伤”指无失去意识，可能只在短时间内感到晕眩或处于错乱状态。虽然可给予的医学护理非常少，但没有昏迷的脑损伤患者的症状和受到的损害与那些曾经昏迷的幸存者很相似。
受伤后脑内发生变化，因此有必要进行监控以防止遭受进一步的损伤。头部严重受创后脑体积往往会增大。这种情况称为脑肿胀，当脑血量增多就会出现脑肿胀。患病后期脑内可能积水，称为脑水肿。脑肿胀和脑水肿导致脑内压力过大，称为颅内压(ICP)。
昏迷是头部受到创伤性损伤后即时陷入长时间无意识。
昏迷有几个级别。由头部受伤人员的反应进展可衡量昏迷级别。头部外伤的急性时相采用“格拉斯哥昏迷量表(Gasgow Coma Scale)”。随着病人逐渐好转或情况稳定，可用“Rancho Los Amigos量表”衡量认知(理解与推理)思考水平。
脑损伤通常会造成长期虚弱，例如创伤后癫痫症、永久性植物人状态或创伤后痴呆。
脊髓损伤是另一种中枢神经系统损伤。入院治疗截瘫和四肢瘫痪大多数是脊髓损伤。80％以上由交通事故造成。临床上将损伤分为2大组：开放性损伤和闭合性损伤。
开放性损伤直接对脊髓和神经根造成创伤。穿孔伤可引起大面积破裂和出血。大部分脊髓损伤是闭合性损伤，它通常与脊柱骨折/移位相关，一般以放射方式就可以得到证实。脊髓损伤取决于骨损伤程度，可分两个阶段考虑：受伤原始阶段，其损伤是挫伤、神经纤维横断和出血性坏死，受伤继发阶段，其损伤是脑膜外血肿、梗塞、感染和水肿。
脊髓损伤的迟发效应包括：受损神经纤维顺向变性上升和下降、创伤后脊髓空洞症和截瘫全身性效应，如尿道和胸部感染、压力疼痛和肌肉萎缩。
创伤性脑损伤的病理学非常复杂，人们对这方面的认识还很贫乏。过去数十年的研究方面的努力着重于脑部受损后在鞘内室里面系统地和局部地释放出的细胞因子的重要作用，并且基于如TNF、IL-6或IL-8等促炎细胞因子与时间有关的有益及不利作用的研究结果，假定这些介导剂有双重作用(Morganti-Kossmann等人，1997：Kossmann等人，1997：Shohami等人，1999：Scherbel等人，1999；Whalen等人，2000)。如上所述，IL-18是IL-1家族最新发现的细胞因子。近期研究显示，IL-18在体内固有地表达在小鼠、大鼠和人的中枢神经系统中(Culhane等人，1998：Jander和Stoll，1998；Prinz等人，1999；Fassbender等人，1999；Wheeler等人，2000)，在体外表达在星形胶质细胞和小胶质细胞的原代培养液中，但不表达在神经元中(Conti等，1999)。在诸如细菌性脑膜炎和病毒性脑膜脑炎等炎症性中枢神经系统疾病患者的脑脊髓液中检测到IL-18水平上升，但在多发性硬皮病患者的脑脊髓液中却检测不到IL-18水平有上升(Fassbender等人，1999)。与多发性硬皮病患者一般具有较低鞘内IL-18水平的发现相反，在多发性硬皮病动物模型即实验性自身免疫脑脊髓炎Lewis大鼠的脊髓中证实了IL-18mRNA表达增加(Jander和Stoll，1998)。直到现在，还未有关于神经损伤中IL-18的表达与功能意义的研究。
发明内容
本发明涉及IL-18在中枢神经系统疾病中的病理生理学作用。它基于以下研究结果：小鼠受到实验性闭合性头部外伤后1小时或第3天用IL-18抑制剂进行治疗，与对照动物相比改善了复原效果并减弱了脑损伤程度。因此，本发明涉及IL-18抑制剂在制备治疗和/或预防中枢神经系统损伤特别是创伤性脑损伤的药物中的应用。
本发明还提供IL-18抑制剂与干扰素和/或TNF和/或炎症抑制剂和/或抗氧化剂组合的应用。为了应用基因疗法将IL-18抑制剂输送到患病组织或细胞，本发明还涉及包括IL-18抑制剂编码序列的核酸分子在治疗和/或预防中枢神经系统损伤的中的应用。本发明还涉及经过基因改造表达IL-18抑制剂的细胞在治疗和/或预防中枢神经系统损伤中的应用。
附图说明
图1所示为不同条件下整个脑部(阴影线)、左半球(黑色)或右半球(灰色)中大脑内血清IL-18水平(纳克/毫升)的直方图。
图2所示为受伤后1小时腹膜内给予50微克IL-18BP(方形)或者仅注射介质(对照，圆形)在受伤后1小时、24小时、72小时或168小时所测到的神经损伤严重程度评分(Neurological Severity Score，NSS)的结果。
图3所示为受伤后1小时腹膜内给予50微克IL-18BP(方形)或者仅注射介质(对照，圆形)在受伤后24小时、72小时或168小时所测到的复原率(ΔNSS)。
图4所示为受伤后第3日以单剂量腹膜内给予50微克IL-18BP(菱形)、或受伤后1小时与第3日以双剂量腹膜内给予50微克IL-18BP(方形)或者仅注射介质(对照，三角形)在受伤后1小时、24小时、第3日、第7日或第14日所测到的ΔNSS。
具体实施方式
本发明基于IL-18抑制剂对闭合性头部外伤小鼠模型的脑损伤复原有显著性差异的有益效果的发现。本发明还发现，受到创伤性脑损伤后脑部和脑脊髓液中的IL-18上调，这表示该促炎细胞因子在脑损伤的发病机理中具有重要作用。
所以，本发明涉及IL-18抑制剂在制备治疗和/或预防中枢神经系统(CNS)损伤的药物中的应用。
本发明还涉及IL-18抑制剂在制备治疗和/或预防中枢神经系统损伤并发症和迟发效应的药物中的应用。
在本发明的优选实施例中，中枢神经系统损伤是创伤性脑损伤或闭合性头部外伤。
在另一优选实施例中，中枢神经系统损伤是脊髓损伤。
在本发明的又一优选实施例中，脑损伤由血管引起。
本发明上下文中的术语“中枢神经系统损伤”或“CNS损伤”指任何脑损伤或脊髓损伤，与发病年龄或者发病主因无关。发病主因可以是例如机械性的或者受到感染。中枢神经系统损伤及其临床症状与表现已在“背景技术”作了详细叙述。中枢神经系统损伤包括例如外伤或其他任何一种脑损伤或脊髓损伤，它也可称为神经创伤(neurotrauma)。
脑损伤例如可包括或导致下列任何一种或多种症状：1.注意力减退；2.认知力下降；3.语言能力下降；4.记忆力减退；5.行为异常；6.运动障碍；7.其他任何一种神经功能障碍。
脊髓损伤可引致例如截瘫和四肢瘫痪。
中枢神经系统损伤的并发症或迟发效应可按本发明的方法进行治疗和/或预防。脑损伤的并发症或迟发效应已在上述“背景技术”中作了叙述。例如它们包括但不限于，昏迷、脑膜炎、创伤后癫痫症、创伤后痴呆、神经纤维退化、或创伤后脊髓空洞症或出血。
本发明也涉及IL-18抑制剂在制备治疗和/或预防由血管引起的任何脑损伤，如由脑梗塞、局部缺血、脑血管意外或中风造成的缺氧性脑损伤，的药物中的应用。
本发明所用的术语“预防”和“治疗”，指部分地或完全地预防、抑制、减缓、改善或扭转中枢神经系统损伤的一种或多种症状或病因以及伴随中枢神经系统损伤的症状、疾病或并发症。“治疗”中枢神经系统损伤是在发病后给予本发明的物质，“预防”指在看到患者出现发病迹象之前给予本发明的物质。
本发明优选用于治疗中枢神经系统损伤。要治疗中枢神经系统损伤，最好在受到中枢神经系统损伤后在最短时间内，例如在受伤后1小时内给予IL-18抑制剂。然而，如以下实施例所述，即使在脑损伤发生后3天给予IL-18抑制剂，也对脑损伤有有益的效果。所以，要治疗中枢神经系统损伤，最好在受伤后3天内给予IL-18抑制剂。
本发明上下文中的术语“IL-18抑制剂”，指能以减弱、降低或部分地、基本上或完全地防止或阻断IL-18产生和/或作用的方式来调节IL-18的产生和/或作用的任何分子。术语“IL-18抑制剂”包括IL-18产生的抑制剂与IL-18作用的抑制剂。
IL-18产生的抑制剂是任何一种对IL-18合成、加工或成熟有负面影响的分子。本发明考虑的抑制剂可以是，例如，白介素IL-18基因表达的抑制剂、降低或阻止IL-18mRNA转录或导致该mRNA降解的反义mRNA、损害正确折叠或部分或基本上阻止IL-18分泌的蛋白质、IL-18一旦合成后能降解它的蛋白酶、切割pro-IL-18产生成熟的IL-18的蛋白酶的抑制剂，如Caspase-1抑制剂等。
IL-18作用的抑制剂可以是IL-18拮抗剂，例如IL-18BP。拮抗剂可以以足够亲和力和特异性结合或隔离IL-18分子本身而部分或基本上中和负责IL-18与其配体结合的IL-18或IL-18结合位(例如，与其受体)。拮抗剂也可抑制在IL-18与其受体结合后细胞中所激活的IL-18信号通道。
IL-18作用的抑制剂也可以是可溶性IL-18受体或仿真受体的分子，或阻断IL-18受体的物质、IL-18抗体，如多克隆或单克隆抗体，或阻止IL-18与其靶结合，从而减弱或阻止由IL-18介导的细胞内外反应的触发的其它物质或分子。
在本发明一优选实施例中，IL-18抑制剂选自Caspase-1(ICE)抑制剂、抗IL-18抗体、抗任何IL-18受体亚基的抗体、IL-18信号通道抑制剂、能与IL-18竞争或结合与封闭IL-18受体的IL-18拮抗剂、以及IL-18结合蛋白、其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物、或盐类。
本文所用的术语“IL-18结合蛋白”与“IL-18BP”同义。它包括WO 99/09063或Novick等人(1999)所确定的IL-18结合蛋白，包括Kim等人(2000)所确定的剪接变体和/或同种型。具体地说，人IL-18BP同种型a和c可用在本发明中。本发明所用的蛋白质可以糖基化或非糖基化，它们可来自天然来源，如尿液，或者它们最好是重组产生的。可在原核生物表达系统如大肠杆菌，或真核生物最好是在哺乳动物表达系统中进行重组表达。特别适合本发明IL-18抑制剂的细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
当IL-18抑制剂在哺乳动物细胞或细胞系中重组表达时，可在不含血清的细胞培养基中进行重组生产IL-18抑制剂。
本文所用的术语“突变蛋白”指IL-18BP的同类物，或病毒性IL-18BP的同类物，其中天然IL-18BP或病毒性IL-18BP的一个或多个氨基酸残基被不同氨基酸残基所取代，或缺失，或者IL-18BP或病毒性IL-18BP的天然序列中加入了一个或多个氨基酸残基，但所产生的产物的活性与野生型IL-18BP或病毒性IL-18BP相比无显著降低。这些突变型蛋白可用已知的合成和/或定点诱变技术，或任何适合的其它已知技术制备。
任何这样一种突变蛋白最好具有IL-18BP充分复制、或病毒性IL-18BP充分复制的氨基酸序列，从而具有与IL-18BP基本上相似的活性。IL-18BP的一种活性是它能结合IL-18。只要该突变蛋白对IL-18具有很大的结合活性。它就可用于纯化IL-18，如借助亲和层析法，从而认为其具有与IL-18BP基本上相似的活性。因此，可借助常规实验方法来确定任何一个给定突变蛋白是否具有与IL-18BP基本相同的活性，实验方法包括对这样一种突变蛋白进行例如简单的夹心竞争试验(simplesandwich competition assay)，以确定它是否能与被适当标记的IL-18结合，如放射免疫试验或酶联免疫吸附试验(ELISA)。WO 99/09063，例如在实施例2(通过交联评估与IL-18的结合)或实施例5(抑制由IFN-γ诱导在单核血细胞中诱导产生IL-18)对评估IL-18BP的生物活性的简单功能试验作了详细叙述。
在一优选实施例中，任何这样一种突变蛋白与IL-18BP或病毒性编码的IL-18BP同类物的序列具有至少40％同一性或同源性。更优选具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％，最优选至少90％同一性或同源性。
可用于本发明的IL-18BP多肽突变蛋白或病毒性IL-18BP突变蛋白，或编码它们的核酸，包括一组有限的基本上与取代肽或多核苷酸相应的序列，本领域普通技术人员可根据本文所述和提供的指南用常规方法获得，而无须进行过多实验。
本发明的突变蛋白包括由核酸如DNA或RNA编码的蛋白质，所述的核酸在中等或高度严谨条件下能与编码本发明的IL-18抑制剂的DNA或RNA杂交。术语“严谨条件”指杂交和随后的洗涤条件，这些条件是本领域普通技术人员常规所指“严谨的”条件。参见上述文献Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，Interscience，N.Y.，§§6.3和6.4(1987，1992)，以及Sambrook等人(Sambrook，J.C.，Fritsh，E.F.，和Maniatis，T.(1989)，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。
没有限制作用的严谨条件的例子包括以下洗涤条件：例如在比研究中计算的杂交温度Tm低12-20℃的温度下用2×SSC和0.5％SDS洗5分钟，用2×SSC和0.1％SDS洗15分钟；37℃用0.1×SSC和0.5％SDS洗30-60分钟，然后在68℃用0.1×SSC和0.5％SDS洗30-60分钟。本领域普通技术人员知道严谨条件还取决于DNA序列的长度、寡核苷酸探针(如10-40个碱基)或混合的寡核苷酸探针。如果采用混合的探针，最好用四甲基氯化铵(TMAC)代替SSC。参见上述引用的文献Ausubel。
在一优选实施例中，任何这样一种突变蛋白与所附序列表的SEQ ID NO：1，2或3的序列具有至少40％同一性或同源性。更优选具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％，最优选至少90％同一性或同源性。
同一性反映两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系，通过比较这些序列而确定。通常，同一性指两个多核苷酸或两个多肽序列在各自要比较的序列长度中，它们的核苷酸与核苷酸或者氨基酸与氨基酸之间的对应是完全一样的。
对于其对应不是完全一样的序列，可以确定“同一性百分比”。通常把待比较的两个序列进行序列对比，得出这两个序列之间的最大相关性。这可包括在其中一个或两个序列中插入“缺口(gap)”以增加对比度。比较每一个序列的整个长度(所谓的全域性对比(global alignment))，或者比较它们的较短的限定长度(所谓的区域性对比(local alignment))可确定同一性百分比，前者特别适合长度相等或长度差不多的序列，后者更适合长度不相等的序列。
两个或多个序列同一性和同源性的比较方法已为本领域技术人员所熟知。例如，Wisconsin序列分析软件包9.1版(Devereux J等人，1984)所提供的程序，又例如程序BESTFIT和GAP均可用于确定两个多核苷酸之间的同一性百分比与两个多肽序列之间的同一性百分比及同源性百分比。BESTFIT采用Smith和Waterman的“区域性同源性”算法(1981)，找出两个序列间最佳的单个相似区域。其它确定两个序列间同一性和/或相似性的程序也已为本领域所知，例如BLAST程序家族(Altschul S F等人，1990，Altschul S F等人，1997，登入NCBI主页www.ncbi.nlm.nih.gov可查询得到)与FASTA(Pearson W R，1990，Pearson 1988)。
本发明突变蛋白中的优选变化是称为“保守性”取代。IL-18BP多肽或蛋白或病毒性IL-18BP的保守性氨基酸取代可包括一组内的同义氨基酸，其具有足够相似的生理化学特性，该组成员之间的取代将保留该分子的生物功能(Grantham，1974)。显然，在上述序列中也可进行氨基酸的插入和缺失而不改变其功能，特别是如果这种插入或缺失只涉及少数氨基酸时，如30个以下，最好为10个以下，而且不除去或取代对功能性构型起关键作用的氨基酸，如半胱氨酸残基。这类缺失和/或插入所产生的蛋白质和突变蛋白属于本发明范围。
优选同义氨基酸组是表1列出的那些组；更好的同义氨基酸组是表2列出的那些组；最好的同义氨基酸组是表3列出的那些组。
表1 优选同义氨基酸组
氨基酸 同义组
Ser Ser，Thr，Gly，Asn
Arg Arg，Gln，Lys，Glu，His
Leu Ile，Phe，Tyr，Met，Val，Leu
Pro Gly，Ala，Thr，Pro
Thr Pro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，Thr
Ala Gly，Thr，Pro，Ala
Val Met，Tyr，Phe，Ile，Leu，Val
Gly Ala，Thr，Pro，Ser，Gly
Ile Met，Tyr，Phe，Val，Leu，Ile
Phe Trp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，Phe
Tyr Trp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，Tyr
Cys Ser，Thr，Cys
His Glu，Lys，Gln，Thr，Arg，His
Gln Glu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，Gln
Asn Gln，Asp，Ser，Asn
Lys Glu，Gln，His，Arg，Lys
Asp Glu，Asn，Asp
Glu Asp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，Glu
Met Phe，Ile，Val，Leu，Met
Trp Trp
表2 更好的同义氨基酸组
氨基酸 同义组
Ser Ser
Arg His，Lys，Arg
Leu Leu，Ile，Phe，Met
Pro Ala，Pro
Thr Thr
Ala Pro，Ala
Val Val，Met，Ile
Gly Gly
Ile Ile，Met，Phe，Val，Leu
Phe Met，Tyr，Ile，Leu，Phe
Tyr Phe，Tyr
Cys Cys，Ser
His His，Gln，Arg
Gln Glu，Gln，His
Asn Asp，Asn
Lys Lys，Arg
Asp Asp，Asn
Glu Glu，Gln
Met Met，Phe，Ile，Val，Leu
Trp Trp
表3 最好的同义氨基酸组
氨基酸 同义组
Ser Ser
Arg Arg
Leu Leu，Ile，Met
Pro Pro
Thr Thr
Ala Ala
Val Val
Gly Gly
Ile Ile，Met，Leu
Phe Phe
Tyr Tyr
Cys Cys，Ser
His His
Gln Gln
Asn Asn
Lys Lys
Asp Asp
Glu Glu
Met Met，Ile，Leu
Trp Met
在蛋白质中产生氨基酸取代的实施例可用来获得本发明中所用的IL-18BP多肽或蛋白质的突变蛋白，或病毒性IL-18BP的突变蛋白，其包括任何已知的方法步骤，如Mark等人的美国专利4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等人的5,116,943；Namen等人的4,965,195；Chong等人的4,879,111和Lee等人的5,017,691专利中提出的方法，以及美国专利4,904,584(Shaw等人)中提出的赖氨酸取代蛋白质。
术语“融合蛋白”指一多肽包含IL-18BP或病毒性IL-18BP或其突变蛋白或片段与另一蛋白质，如在体液中停留时间延长的蛋白质，融合。故IL-18BP或病毒性IL-18BP可与另一蛋白质、多肽等，如免疫球蛋白或其片段，融合。
本文使用的“功能性衍生物”，包括IL-18BP或病毒性IL-18BP衍生物及其突变蛋白和融合蛋白，它们可用本领域已知方法从残基或N端或C端基团上以侧链存在的功能性基团制备。只要它们仍然在药学上可接受，即它们没有破坏与IL-18BP或病毒性IL-18BP活性基本上相似的蛋白质活性，并且不会使含它的组合物具有毒性，均包括在本发明中。
这些衍生物例如可以包括聚乙二醇侧链，其可遮蔽抗原位并延长IL-18BP或病毒性IL-18BP在体液中的停留时间。其它衍生物包括羧基脂肪酯，羧基与氨或伯胺或仲胺反应产生的酰胺、氨基酸残基的游离氨基与酰基部分分子(如烷酰基或碳环芳酰基)形成的N-酰基衍生物、或游离羟基(如丝氨酰或苏氨酰残基的游离羟基)与酰基部分分子形成的O-酰基衍生物。
本发明的IL-18BP或病毒性IL-18BP、突变蛋白和融合蛋白的“活性部分”包括单独蛋白分子多肽链的任何片段或前体，或蛋白分子与相关分子或与其相连的残基，如糖或磷酸根残基一起，或蛋白分子或糖残基自身的聚集物，只要所述部分具有与IL-18BP基本上相似的活性。
本文所用的术语“盐”指羧基盐和IL-18抑制剂分子中氨基的酸加成盐，或其类似物。羧基盐可通过本技术领域公知的方法形成，包括无机盐，例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐或锌盐等，以及有机碱盐，例如三乙醇胺等胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶、普鲁卡因(procaine)等形成的盐。酸加成盐包括例如无机酸盐，如盐酸盐或硫酸盐，有机酸盐，如乙酸盐或草酸盐。当然，任何这样的一种盐必须保留与本发明有关的OPN生物活性，即对少突胶质细胞具有增殖作用。
在本发明另一优选实施例中，IL-18抑制剂是抗IL-18抗体。抗IL-18抗体可以是多克隆或单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或甚至完全人抗体。重组抗体及其片段的特点是在体内能与IL-18高亲和力结合，而且毒性低。可用于本发明的抗体应具有的特征是对病人进行足够时间的治疗，它们能良好至优异地减退或缓解病情或与病情相关的任何一种症状或一组症状，并且毒性低。
通过以IL-18免疫的动物不难在家兔、山羊或小鼠等动物中产生中和抗体。免疫小鼠特别适用于提供B细胞来源以制备杂交瘤细胞，进而培养杂交瘤细胞产生大量抗IL-18单克隆抗体。
嵌合抗体是具有衍生自不同种动物的二个或多个节段或部分的免疫球蛋白分子。通常嵌合抗体的可变区来自非人哺乳动物抗体，如小鼠单克隆抗体，而该免疫球蛋白的恒定区来自人免疫球蛋白分子。这两个区及其组合最好如常规方法测定那样具有低免疫原性(Elliott等人，1994)。人源化抗体是用基因工程技术构建的免疫球蛋白分子，其中用人的恒定区置换小鼠恒定区，而保留小鼠抗原结合区。所产生的小鼠—人嵌合抗体宜具有降低的免疫原性，和改善的人体中的药物动力学(Knight等人，1993)。
因此，在另一优选实施例中，IL-18抗体是人源化IL-18抗体，例如，欧洲专利申请EP0974600叙述了人源化抗IL-18抗体的优选例子。
在另一优选实施例中，IL-18抗体是全人抗体。在WO 00/76310，WO 99/53049，US6,162,963或AU5336100中详细叙述了产生人抗体的技术。全人抗体优选是在转基因动物中，例如在包括全部或部分功能性人Ig基因座的异种小鼠中产生的重组抗体。
在本发明的一个更优选实施例中，IL-18抑制剂是IL-18BP，或其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物。这些同种型、突变蛋白、融合蛋白或功能性衍生物保留了IL-18BP的生物活性，特别是结合IL-18的活性，优选具有至少基本上类似于IL-18BP的活性。理想的话，这些蛋白质具有的生物活性比未修饰的IL-18BP更高。优选的活性组分具有的活性比IL-18BP的活性更好或具有其他优点，如稳定性更好，毒性或免疫原性更低，或它们更易大量生产，或更易提纯。
IL-18BP及其剪接变体/同种型的序列可从WO 99/09063或Novick等人(1999)以及Kim等人(2000)所述的方法获得。
可将IL-18BP的功能性衍生物与聚合物偶联以改进该蛋白质的性能，如稳定性、半衰期、生物利用性、人体耐受性、或免疫原性。为达到此目的，功能性衍生物可包括至少一部分连接于一个或多个官能团，所述官能团以氨基酸残基上一个或多个侧链的形式出现。这样一个官能团可以是例如聚乙二醇(PEG)。例如，可按WO92/13095所述的已知方法进行聚乙二醇化。
因此，在本发明的一优选实施例中，IL-18抑制剂特别是IL-18BP是聚乙二醇化的。
在本发明另一优选实施例中，IL-18抑制剂是一种融合蛋白，包含IL-18结合蛋白的全部或一部分，其与免疫球蛋白全部或一部分融合。本领域技术人员知道本发明所得到的融合蛋白保留了IL-18BP的生物活性，特别是结合IL-18的活性。这种融合可以是直接的，或通过一个短接头肽，长度短至1-3个氨基酸残基或较长，如13到20个氨基酸残基的长度相融合。例如，所述接头可以是E-F-M(Glu-Phe-Met)序列的三肽或含有13个氨基酸的接头序列，其包含导入在IL-18BP序列和免疫球蛋白序列之间的Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met。所产生的融合蛋白具有改进的性能，如在体液的停留期(半衰期)延长，比活性提高，表达水平增加或有利于该融合蛋白的纯化。
在一优选实施例中，将IL-18BP融合于Ig分子的恒定区。优选融合于重链区，例如，人IgG1的CH2和CH3区。产生的特异性融合蛋白包含有WO 99/09063的实施例11所述的IL-18BP和免疫球蛋白的一部分。Ig分子的其它同种型也适合用来产生本发明的融合蛋白，例如，同种型IgG2或IgG4，或其它Ig类，如IgM或IgA。融合蛋白可以是单体或多聚体，异质或同质多聚体。
干扰素主要因其对病毒复制和细胞增殖有抑制作用而为人所认知。例如，干扰素-γ在促进免疫和炎症应答中起重要作用。据说干扰素β(IFN-β，I型干扰素)有抗炎症作用。
所以，本发明还涉及IL-18抑制剂与干扰素的组合在制备治疗中枢神经系统损伤的药物中的应用。
也可将干扰素与聚合物结合以改进该蛋白质的稳定性，例如，WO99/55377叙述了干扰素β和多元醇聚乙二醇(PEG)之间的共轭物。
在本发明另一优选实施例中，干扰素是干扰素-β(IFN-β)，更优选是IFN-β1a。
IL-18产生和/或作用的抑制剂最好与干扰素同时、先后或分开使用。
有文献记载了肿瘤坏死因子(TNF)对脑损伤有保护和毒性作用(Shohami等人，1999)。在下面实施例1中，小鼠受到严重脑创伤后注射TNF导致脑内的IL-18水平明显下降，这表示TNF对创伤性脑损伤的复原具有有益的效果。所以，本发明一优选实施例涉及IL-18抑制剂与TNF的组合在制备治疗和/或预防脑损伤的药物中的应用，IL-18抑制剂与TNF可同时、先后或分开使用。
本发明优选的是IL-18抑制剂与TNFα的组合。
在本发明另一优选实施例中，这种药物还包括抗炎药，如非类固醇抗炎药(NSAID)。在一优选实施例中，IL-18抑制剂与COX-抑制剂最好与COX-2抑制剂联用。COX-抑制剂在本领域已公知。例如，WO 01/00229公开了一些具体COX-2抑制剂。活性成分可同时、先后或分开使用。
氧化应激特别是活性氧(ROS)在脑损伤的病理生理学中具有一定作用已有了记载(Shohami等人，1997)
所以，本发明一优选实施例的药物还包括抗氧化剂，可同时、先后或分开使用。有许多抗氧化剂已为本领域公知，如维生素A、C或E，或5-氨基水杨酸或超氧化物歧化酶。
在本发明一优选实施例中，IL-18抑制剂的用量约为0.001-100mg/kg体重，或约0.01-10mg/kg体重，或约0.1-3mg/kg体重，或约1-2mg/kg体重。
在另一优选实施例中，IL-18抑制剂的用量约为0.1-1000μg/kg体重，或约1-100μg/kg体重，或约10-50μg/kg体重。
本发明还涉及一种核酸分子在制备预防和/或治疗中枢神经系统损伤的药物中的应用，所述的核酸分子包含IL-18抑制剂、其突变蛋白、功能性衍生物或活性部分的编码序列。
该核酸分子最好还包含表达载体的序列，例如用于基因疗法给予本发明的IL-18抑制剂。
核酸分子最好以肌肉内给予。
要治疗和/或预防中枢神经系统损伤，可将包含IL-18产生和/或作用抑制剂的序列的基因治疗载体直接注射在患病组织中，例如以避免全身性给予基因治疗载体所涉及的问题，如载体的稀释、到达与靶向靶细胞或组织，以及产生副作用。
本发明还考虑在正常不表达IL-18抑制剂或表达抑制剂的量不充分的细胞中能诱导和/或增强内源性产生IL-18抑制剂的载体在预防和/或治疗中枢神经系统损伤中的应用。该载体可包括在所需表达IL-18抑制剂的细胞中起作用的调控元件。例如，这类调控序列或元件可以是启动子或增强子。然后，可通过同源重组将该调控序列导入基因组的正确基因座中，使调控序列与基因作可操作性相连，所需要的表达即被诱导或被增强。该技术通常称为“内源性基因激活”(EGA)，在WO91/09955中有所叙述。
本领域技术人员知道，也可用同一技术直接关闭IL-18的表达，而无需用到IL-18抑制剂。为此，可将一个负调节元件如沉默元件导入到IL-18的基因座中，从而导致下调或防止IL-18的表达。本领域技术人员懂得，IL-18表达的这种下调或沉默与使用IL-18抑制剂的效果相同，用于预防和/或治疗疾病。
本发明还涉及经过基因改造产生IL-18抑制剂的细胞在制备预防和/或治疗中枢神经系统损伤的药物中的应用。
本发明还涉及药物组合物，特别是用于预防和/或治疗炎症性中枢神经系统损伤的药物组合物，其包括治疗有效量的IL-18抑制剂和/或治疗有效量的干扰素和/或药学上有效量的TNF和/或药学上有效量的抗炎药和/或药学上有效量的抗氧化剂。
作为IL-18抑制剂，该组合物可包括caspase-1抑制剂、抗IL-18抗体、抗任何IL-18受体亚基的抗体、IL-18信号通道抑制剂、与IL-18竞争并阻断IL-18受体的IL-18拮抗剂、以及IL-18结合蛋白、其具有相同活性的同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物。
该药物组合物的优选活性成分是上述IL-18BP及其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物。
该药物组合物的干扰素优选IFN-β或IFN-α。
另一优选实施例的药物组合物包括治疗有效量的TNF-α。本发明的药物组合物还可包括一种或多种COX-抑制剂。
定义“药学上可接受的”指包含不会干扰活性成分的生物活性效果，并对给予的宿主无毒性的任何载体。例如，为了在肠胃外给药，可将这些活性蛋白以注射用单位剂量形式配制在载体中，如盐水，葡萄糖液，血清白蛋白和林格(Ringer)溶液。
本发明药物组合物的活性成分可以以各种途径给予个体。给药途径包括皮内、透皮(如缓释制剂)、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、口服、颅内、硬膜外、直肠、局部和鼻内等途径。也可采用其它有效治疗途径给药，例如通过上皮或内皮组织吸收或通过基因疗法将编码活性药物的DNA分子给予病人(如通过载体)，导致该活性药物在体内表达和分泌。此外，可将本发明的蛋白质与生物活性药物的其它组分，如药学上可接受的表面活性剂、赋形剂、载体、稀释剂和介质等，一起给予。
对于肠胃外(如静脉内、皮下、肌肉内)给药，可将活性蛋白质配制成溶液、悬浮液、乳液或与药学上可接受的肠胃外介质(如水、盐水、葡萄糖液)以及能维持等渗性(如甘露糖醇)或化学稳定性(如防腐剂和缓冲液)的添加剂一起制成冻干粉末。以常规技术给制剂灭菌。
本发明的活性蛋白质也可用共轭方法增加分子在人体内的半衰期而改善其生物利用性。例如，如PCT专利申请WO 92/13095所述那样，使分子与聚乙二醇结合。
活性蛋白的治疗有效量是很多变量的函数，包括拮抗剂类型、拮抗剂对IL-18的亲和力、拮抗剂显示的残留毒性、给药途径、病人的临床状态(包括维持内源性IL-18活性的非毒性水平是否合乎需要)。
“治疗有效量”是给予时IL-18抑制剂抑制IL-18生物活性的量。给予个体单剂或多剂的剂量取决于各种因素，包括IL-18抑制剂的药物动力学性能、给药途径、病人的病情和特征(性别、年龄、体重、健康状况和身型大小)、症状轻重程度、并行治疗、治疗频度和所要求的效果。本领域技术人员都掌握了调整和操作已确定的剂量范围以及在体内外测定个体中IL-18被抑制的方法。
按照本发明，IL-18抑制剂的用量约为0.0001-100mg/kg体重，或约0.01-10mg/kg体重，或约0.1-5mg/kg体重，或约1-3mg/kg体重，或约1-2mg/kg体重。另外，IL-18抑制剂的用量也可以是约0.1-1000μg/kg体重，或约1-100μg/kg体重或10-50μg/kg体重。
本发明优选的给药途径是皮下途径，本发明更优选的是肌肉内给药。为了将IL-18抑制剂直接加在它作用的地方，也可通过颅内或鞘内途径给予IL-18抑制剂。颅内途径特别用于开放性头部外伤(脑部枪弹损伤)。
在另一优选实施例中，IL-18抑制剂是每天或每隔一天给予。
每日剂量通常分成几剂或以缓释形式给予，能有效地获得所希望的效果。第二次或随后给药可以与首次或原先给予该个体的相同剂量、少于或多于此剂量进行。可在发病时或发病前进行第二次或随后给药。
按照本发明，IL-18抑制剂可以以治疗有效量特别是与干扰和/或TNF和/或另一种抗炎药如COX抑制剂和/或抗氧化剂先于、同时或依次与其它治疗方案或药物(如多种药物方案)预防性或治疗性地给予个体。根据脑损伤的状况也可考虑与TNF拮抗剂一起给予而非仅给予TNF(Sholhami等人，1999)。与其它治疗药物同时给予的活性药物可在相同或不同的组合物中。
本发明还涉及一种药物组合物的制备方法，包括将有效量的IL-18抑制剂和/或干扰素和/或TNF拮抗剂和/或COX抑制剂与药学上可接受的载体混合。
本发明还涉及一种治疗和/或预防中枢神经系统损伤的方法，包括把药学上有效量的IL-18抑制剂给予有需要的患者。
本文所引用的全部文献，包括期刊文章或摘要、公开或未公开的美国或外国专利申请、已授权的美国或外国专利或其它文献，均整体纳入本文参考文献中，包括引用文献中提供的全部数据、表格、图形及文字。此外，本文引用文献内所引用的内容也整体纳入作为参考。
参考已知的方法步骤、常规的方法步骤、已知方法或常规方法并不是承认本发明的任何方面、叙述或实施例均已在相关技术领域中公开得到、启发或者暗示。
上述对具体实施例的叙述将完整地揭示本发明的总体特征，其他人运用本领域的一般技术常识(包括本文引用的参考文献的内容)可在无需过多的实验和不脱离本发明总体概念的条件下，不难对这些具体实施例的各种应用作出改变和/或调整。所以，根据本文所述和指引，意味着这样一些改变和/或调整在本发明所公开的实施例相等的范围内。需要知道的是，本文的用语或术语是为了说明而不具有限制性，因此这些术语或用语可由本领域技术人员根据本文所述和提供的指引，并结合本领域普通技术人员所知道的常识作出解释。
上文对本发明进行了叙述，结合下面实施例将会更容易理解本发明，但这些
实施例只用于举例说明，而对本发明没有任何限制作用。
实施例
材料与方法
创伤模型
本研究所用的小鼠是雄性小鼠，8-16周大，重30-35克。它们在无病原体的特定环境下饲养，温度和光线采用标准条件，每只笼有4-6只动物，以食物和水随意喂养。本研究按照以色列耶路撒冷希伯莱大学的机构动物管理委员会(Institutional Animal Care Committee)的指南进行。采用早前建立的重物坠落(weight-drop)装置进行实验性闭合性头部外伤(Chen等人，1996))。简言之，用乙醚麻醉诱导后，在纵向正中线切口，卷起皮肤，露出头骨。辨认左前额区域，在冠状面的中线的外侧约2毫米的位置放一个尖顶聚四氟乙烯锥体。将头固定，一件75克的重物在距离18厘米处坠落在锥体上，使左半球局部损伤。受伤后，小鼠用100％氧气作氧气处理，时间不超过2分钟，然后将它们送回它们的笼中。
小鼠脑内IL-18水平的评估
要定量计算颅内IL-18水平，将C57BL/6(B6)小鼠(共62只)分为6个不同组：(1)“正常对照组”，未经处理的B6小鼠(n＝10)，(2)“乙醚麻醉组”，小鼠用乙醚麻醉10分钟，24小时(n＝10)或7天(n＝10)后处死，(3)“假手术组”，这些小鼠接受麻醉和纵向头皮切口，24小时(n＝15)或7天后处死，(4)“创伤组”，按上述方法进行实验性CHI，动物在受伤后4小时(n＝7)、24小时(n＝7)和7天(n＝7)后用乙醚麻醉处死，(5)“注射TNF组”，评估TNF是否可能有调节大脑内IL-18的作用，小鼠用乙醚麻醉，脑室注射(i.c.v.)在10微升无菌磷酸缓冲盐水(PBS)中的200纳克小鼠重组TNF(R&D Systems，Abingdon，UK)，24小时(n＝10)后处死，(6)“假注射组”，这些动物仅脑室注射介质(10微升无菌PBS)，24小时(n＝6)后处死，用作注射TNF的动物的对照组。所有小鼠在处死后均立即取走脑部，急冻于液氮，并冻存于-70℃，至分析才取出。将创伤组的脑部分割为左半球(同侧)和右半球(对侧)，以对比受伤与无受伤半球的IL-18水平。用提取缓冲液(extraction buffer)的1：4稀释液(重量/重量)在Polytron均浆机(Kinematica，Kriens，Switzerland)内进行组织均化，所述的提取缓冲液含有50mM Tris(pH7.2)、150mM氯化钠、1％Triton-X-100(Boehringer Mannheim，Rotkreuz，Swizerland)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Boehringer Mannheim)。冰上摇动组织均浆90分钟，再在4℃3,000g离心15分钟。等分上清液，冻存于-70℃，至分析才取出。用Bradford分析法(Bio RadLaboratories，Munich，Germany)测定脑提取物中总蛋白质的浓度，发现所有被评估的小鼠的浓度很一致(12.1±2.1毫克/毫升；平均值±SD)。按照制造商(R&DSystems，Abingdon，UK)的说明书，通过小鼠IL-18特定的ELISA试验定量分析大脑内细胞因子的水平。试验的灵敏度为5皮克/毫升。为了比较不同组动物的大脑内IL-18水平，将所有低于5皮克/毫升检测极限的浓度设为4.9皮克/毫升。未经稀释把样本引入双份孔内，由双份样本的平均光密度值(OD)计算终浓度。由分光光度计(Pynatech Laboratories Inc.，Chantilly，VA)在消光波长405nm处测定OD值。
IL-18BP治疗方案
用希伯莱大学的雄性Sabra小鼠进行IL-18BP研究。如上所述进行麻醉和实验性闭合性头部外伤。治疗方案将动物分为2组：A组(“对照组”，n＝16)，使小鼠接受实验性闭合性头部外伤，1小时后仅注射介质(PBS)，再观察7天以便对神经作出评定(见下文)；B组(“研究组”，n＝18)，小鼠接受实验性闭合性头部外伤，测定受伤后1小时的神经病学评分后，立即腹膜内注射50微克IL-18BP。以前在同一个实验模型中已测定了受到CHI后1至4小时之间，血脑屏障渗透率增加5至6倍(Chen等人，1996)，在此条件下脑内含有IL-18BP。根据A和B组，对另外两组小鼠(分别为C组：“对照组”；D组：“研究组”)进行治疗，48小时后它们被处死，再按下文所述解剖脑部以评估创伤后水肿。
神经受损的评估
为了评估创伤后的神经受损，早有人研究了一种神经损伤严重程度评分(NSS)，并且获得了公认(Stahel等人，2000)。
评分由运动功能、机敏性和生理行为等方面的10个不同临床作业组成，其中无法完成一个作业给1分，成功完成作业给0分(表4)。NSS最高分为10分，表示神经功能严重受损，无法完成所有作业，而健康无受伤的小鼠为0分。创伤后1小时的NSS反映最初的受伤程度，与临床结果有密切联系(Bendi-Adani等人，2001)。评估作业的表现由两个研究人员负责，这两个研究人员对研究组动物受到实验性CHI后的时间点1小时、24小时、72小时和7天毫不知情。1小时的NSS与以后任一时间点的NSS之差为ΔNSS，如文献指出(Chen等人，1996)，这是一个反映脑损伤后自发性复原程度的参数。
表4头部受伤小鼠的神经损伤严重程度评分(NSS)
作业 说明 作业成功/失败
的评分
走出圆圈(exit circle) 在3分钟内走出直径为30厘米的圆圈的能力 0/1
与能动性
单侧/轻度偏瘫 对侧上肢和/或下肢局部麻痹 0/1
直线行走(straight walk)直线行走的机敏性、能动性与运动能力 0/1
惊吓反射 先天反射；小鼠听到大声拍掌而弹跳 0/1
寻求行为 生理行为，是对环境“感兴趣”的一种表现 0/1
平衡木的平衡性 在宽7毫米的平衡木上平衡至少10秒的能力 0/1
圆木上的平衡性 在直径5毫米的圆木上平衡至少10秒的能力 0/1
平衡木上行走：3厘米 走过宽3厘米长30厘米的平衡木的能力 0/1
平衡木上行走：2厘米 同上，但提高难度，平衡木宽2厘米 0/1
平衡木上行走：1厘米 同上，进一步提高难度，平衡木宽1厘米 0/1
最高分 10
脑水肿的评估
根据现有方法(Chen等人，1996)，测定损伤半球内组织含水量以评估脑水肿的程度。简言之，按以上所述在受伤后48小时麻醉小鼠，而受伤后48小时对应此模型系统内水肿仍然很明显的时间点(Chen等人，1996)。处死小鼠后，取走小脑和脑干，并准备一块约20毫克的皮质切片，该切片取自接近创伤部位的一区域但来自其对侧半球上。以右(无受伤)半球为内部对照。将组织切片称重，在95℃干燥24小时。称过这些干燥“切片”后，按下式计算脑含水量的百分比：
水的百分比＝[(湿重-干重)×100]/湿重
脑损伤患者
本研究选取10名孤立性重度闭合性头部外伤患者(平均年龄±SD：37±10岁；年龄处于24至57岁之间；9名男性，1名女性)，送入苏黎世大学医院创伤部。所有患者在心肺复苏后的格拉斯哥昏迷量表(GCS)评分小于等于8(Teasdale和Jannett，1997)。经过CT扫描评估后，当颅内压超过15mmHg时，所有患者均插入心室内导管以治疗性引流脑脊髓液。没有一名患者曾接受过类固醇治疗。患者有多处损伤需要同时接受胸部、腹部、盆骨、脊骨等处的损伤治疗或者有长骨骨折的，将他们排除于本研究之外。用格拉斯哥预后积分(Glasgow Outcome Scale，GOS)(Jannett和Bond，1997)评估各个结果。收集脑脊髓液和血清的方案得到了苏黎世大学医院伦理委员会的认可。
采样与IL-18分析
每天在一个固定时间点采集CHI患者(n＝10)的脑脊髓液和相匹配的血清样本。从接受诊断性腰椎穿刺的患者(n＝5)身上采集对照脑脊髓液。根据蛋白质的正常脑脊髓液数值、葡萄糖和细胞数目(数据未示出)可知，这些患者没有炎症性中枢神经系统疾病的症状。对于CHI组，在受伤后10天进行采样，除非心室导管早已被移走，例如当颅内压保持在正常范围内(小于等于15mmHg)24小时的情况下。从要接受本研究分析的受伤患者身上总共采集了106个相匹配的脑脊髓液和血清样本。全部样本在采集后立即进行离心作用，等分试样，并冻存于-70℃，至分析才取出。通过人IL-18特定的ELISA试验用市售试剂盒(R&D Systems，Abingdon，UK)定量计算脑脊髓液和血清中的IL-18水平。对于小鼠试验，ELISA的灵敏度是5皮克/毫升，由双份样本在吸光波长405nm处所测到的平均OD值计算IL-18终浓度。为了比较CHI患者与对照组之间的脑脊髓液IL-18水平，将所有低于检测极限5皮克/毫升的浓度设为4.9皮克/毫升。
数据分析
采用市售软件(SPSS 9.0，操作系统为WindowsTM)对数据进行统计学分析。用非参数曼-惠特尼U检验(Mann-Whiteney-U test)分析分布不正常的数据，如神经病学评分(NSS和ΔNSS)。用未配对Student’s t检验比较不同组小鼠的大脑内IL-18浓度，并对经IL-18BP治疗过的小鼠与注射过介质的小鼠的脑含水量进行差异分析。用一般线性模型进行重复测量方差分析以比较CHI患者每日脑脊髓液与匹配血清样本中人IL-18水平，或者损伤与对照脑脊髓液中人IL-18水平。p值＜0.05被认为差异显著。
结果
实施例1 小鼠大脑内的IL-18水平
如图1所示，用ELISA试验检测未经治疗(“正常”)的对照B6小鼠的脑匀浆中IL-18，平均水平是27.7±1.7[±SEM]纳克/毫升。在实验组中，仅乙醚麻醉或者与“假”手术结合(即乙醚麻醉与纵向头皮切口)诱导的结果是脑内IL-18水平显著上升，分别为48.9±1.1纳克/毫升(“乙醚”组，n＝8)和54.3±2.7纳克/毫升(“假”手术组，n＝13)(与“正常”小鼠相比p＜0.01，未配对Student’s t检验；图1)。用“乙醚”与“假”手术处理过的动物之间的差异不显著(p＝0.16)。
在创伤组(n＝21)中，诱导CHI导致受伤半球与对侧半球在受伤后4小时(分别为60.6±3.3纳克/毫升与59.8±5.0纳克/毫升)至24小时(分别为56.9±2.1纳克/毫升与56.3±3.7纳克/毫升)内IL-18水平上升，不过，这些水平并不比“乙醚”组或“假”手术组高很多。
与此相比，在CHI后第7天，在受伤半球检测到的大脑内IL-18浓度与乙醚麻醉动物或做过假手术的动物(分别为67.6±5.1纳克/毫升对42.2±0.8和45.2±0.5纳克/毫升)相比有了明显上升，而对侧半球的IL-18水平无明显高于这两个对照组(63.2±6.0纳克/毫升，p＝0.06)。
为了评估炎症的主要介导剂TNF在此创伤模型中调节大脑内IL-18水平的作用(Shohami等人，1999)，给另外一组B6小鼠(n-10)脑室注射在10微升无菌PBS中的200纳克小鼠重组TNF，24小时后处死小鼠。如图1所示，“模拟”注射介质(n＝6)后在24小时内大脑内IL-18比未经治疗的正常B6小鼠有明显上调(53.6±3.9纳克/毫升对27.7±1.7纳克/毫升；p＜0.001)。
注射TNF引致在24小时内脑室的IL-18水平(22.1±6.9纳克/毫升；n＝10)比“模拟”注射介质的对照组(53.6±3.9纳克/毫升；p＜0.001)低。“TNF组”甚至比未经处理的正常小鼠(27.7±1.7纳克/毫升)低，虽然在此情况下差异并不显著(p＝0.45)。
实施例2 IL-18BP治疗对创伤后神经复原的影响
为了研究抑制IL-18可能有利脑损伤的复原这一假设，我们比较了单一注射IL-18BP后不同时间点的复原情况。如上所述，受伤后1小时的神经损伤严重程度评分(NSS)最能够正确反映损伤的严重程度，由核磁共振与组织学可见，它与受伤组织的体积相关。
为了获得有可比损伤的动物组，在受伤1小时对小鼠进行NSS评估后将小鼠分成不同治疗组。如图2所示(给予IL-18BP后的NSS与对照组的NSS)，两组的初始NSS(1小时)相近(对照组与IL-18BP组分别为7.69±0.3023纳克/毫升与7.44±0.3627纳克/毫升)，这表示损伤严重程度差不多。
在随后的时间(第1至7天)对NSS进行评估，结果发现腹膜注射IL-18BP的动物显示所受的神经损伤有相当程度的缓减，NSS数值可证明这一点，在受伤后第7天达到了显著水平(p＝0.045)。
复原率以ΔNSS(t)＝NSS(1小时)-NSS(t)来计算。ΔNSS值越高，表示复原得越好，ΔNSS为零或负数表示无任何复原或情况变坏。图3所示为两组的ΔNSS值。在两个时间点24小时与7天，平均ΔNSS值间的差异达到了显著水平。
进行了另一项实验以研究受伤后第3天给予IL-18BP治疗是否有效。关键的问题是治疗时间，到目前为止，受伤后几小时后才给予IL-18BP进行治疗都是有效果的。因为发现了IL-18本身在创伤后第7天上升，受伤后1小时给予IL-18BP治疗在第7天同样达到最理想效果，现在决定在受伤后第3天对小鼠进行治疗。作为比较，另外一组在1小时与第3天给予IL-18BP治疗。对照组仅用溶剂(介质)治疗。
实验结果见图4，由此清楚可见，单在第3天给予治疗与受到CHI后1小时给予再在第3天给予，治疗效果是一样的。
本实验证明了受到闭合性头部外伤后1小时或第3天一次性给予IL-18BP对实验小鼠模型的创伤性头部外伤的复原具有显著的有益效果。
实施例3 脑部损伤后人脑脊髓液中IL水平上升
对10名严重CHI患者在创伤后长达10天内每日评估脑脊髓液与血清样本中IL-18水平。患者的人口数据与临床数据见表5。
表5严重CHIa患者的人口数据与临床数据
患者编号 年龄(岁) GCSb GOSc CSFd中IL-18 清中IL-18
/性别 (皮克/毫升) (皮克/毫升)
中值 [范围]e 中值 [范围]e
1 48/男 3 1 283 [78-966] 57.5 [12-66]
2 31/男 7 4 228.4 [22-745] 19.7 [4.9-108]
3 26/男 5 3 208.5 [20-392] 37.2 [14-163]
4 57/男 5 4 72.6 [30-286] 48.9 [14-104]
5 24/男 4 5 32.6 [4.9-155] 17 [4.9-58]
6 36/男 8 1 49.4 [10-290] 16.7 [12-67]
7 38/女 3 4 17.9 [11-100] 13 [4.9-46]
8 35/男 3 3 69.8 [4.9-329] 19.8 [7-77]
9 37/男 3 4 37 [23-75] 57.3 [25-98]
10 41/男 7 5 4.9 [4.9-169] 26.2 [15-38]
对照组CSF(n＝5) 4.9 [4.9-7.8]
a CHI，闭合性头部外伤
b GCS，格拉斯哥昏迷量表(Teasdale和Jennett，1974)
c GOS，受伤后3个月的格拉斯哥预后积分；5＝无症状，4＝中残，3＝重残，2＝永久性植物人状态；1＝死亡(Jennett和Bond，1975)
d CSF，脑脊髓液
e将低于检测极限5皮克/毫升的IL-18水平设为4.9皮克/毫升
如表5所示，10名CHI患者中有9名的鞘内IL-18水平比5名无损伤或有炎症性神经疾病患者的对照脑脊髓液高很多(p＜0.05；重复测量方差分析)。只有1名患者(编号10)的脑脊髓液IL-18水平与对照脑脊髓液相比没有明显上升(p＝0.31)。脑脊髓液与血清中IL-18的中值水平与各范围见表5。
应注意，头部受伤患者的脑脊髓液IL-18最高浓度(966纳克/毫升)比对照组高出200倍。创伤组全部脑脊髓液样本中有90％的大脑内IL-18用ELISA试验可检测得到，而只有40％对照脑脊髓液样本的大脑内IL-18水平被检测到(即＞4.9皮克/毫升)。10名CHI患者有8名的脑脊髓液IL-18浓度的中值比血清高很多(p＜0.05；重复测量方差分析)。然而，有2名患者的血清IL-18水平的中值较脑脊髓液高，见表5。
这些结果显示，创伤性头部外伤患者的脑脊髓液IL-18水平有明显的上升。加入IL-18BP可使这些水平下降，因而对闭合性头部外伤的复原有有益效果，如以上
实施例2所示。
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Claims (32)
1.一种IL-18抑制剂在制备治疗和/或预防中枢神经系统损伤的药物中的应用。
2.一种IL-18抑制剂在制备治疗和/或预防中枢神经系统损伤并发症与迟发效应的药物中的应用。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的中枢神经系统损伤是创伤性脑损伤。
4.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的中枢神经系统损伤是闭合性头部外伤。
5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的中枢神经系统损伤是脊髓损伤。
6.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的中枢神经系统损伤由血管引起。
7.如权利要求1至6中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂选自Caspase-1(ICE)抑制剂、抗IL-18抗体、抗任何IL-18受体亚基的抗体、IL-18信号传递通道抑制剂、能与IL-18竞争并封闭IL-18受体的IL-18拮抗剂、以及IL-18结合蛋白、其同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物、或盐类。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂是IL-18抗体。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抗体是人源化IL-18抗体。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抗体是人IL-18抗体。
11.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂是IL-18结合蛋白、或其盐、同种型、突变蛋白、融合蛋白、功能性衍生物、活性部分或循环变换衍生物。
12.如权利要求7至11中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂在一个或多个位点上被糖基化。
13.如权利要求7至12中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的融合蛋白包括一个免疫球蛋白(Ig)融合。
14.如权利要求7至13中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的功能性衍生物包括至少一部分连接于一个或多个官能团，所述官能团以氨基酸残基上一个或多个侧链的形式出现。
15.如权利要求14所述的应用，其特征在于：所述的部分是聚乙二醇(PEG)部分。
16.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的药物还包括干扰素，可同时、先后或分开使用。
17.如权利要求15所述的应用，其特征在于：所述的干扰素是干扰素-α或干扰素-β。
18.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的药物还包括肿瘤坏死因子(TNF)，可同时、先后或分开使用。
19.如权利要求18所述的应用，其特征在于：所述的TNF是TNF-α。
20.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的药物还包括抗炎药，可同时、先后或分开使用。
21.如权利要求20所述的应用，其特征在于：所述的抗炎药是COX-抑制剂，特别是COX-2抑制剂。
22.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的药物还包括抗氧化剂，可同时、先后或分开使用。
23.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂的用量约为0.001至100mg/kg体重，或约0.01至10mg/kg体重，或约0.1至5mg/kg体重，或约1至3mg/kg体重。
24.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂以皮下给予。
25.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂每日给予。
26.如上述权利要求中任何一项所述的应用，其特征在于：所述的IL-18抑制剂每隔一日给予。
27.一种包括IL-18抑制剂编码序列的核酸分子在制备治疗/和预防中枢神经系统损伤的药物中的应用。
28.如权利要求27所述的应用，其特征在于：所述的核酸分子还包括一种表达载体的序列。
29.如权利要求27或28所述的应用，其特征在于：所述的核酸分子以肌肉内给予。
30.一种能诱导和/或增强细胞中内源性产生IL-18抑制剂的载体在制备治疗和/或预防中枢神经系统损伤的药物中的应用。
31.一种经基因改造产生IL-18抑制剂的细胞在制备治疗和/或预防中枢神经系统损伤的药物中的应用。
32.一种中枢神经系统损伤的治疗和/或预防方法，其特征在于：所述的方法包括将有效抑制量的IL-18抑制剂给予有需要的人。
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