UA80396C2 - Use of il-18 inhibitors for treating or traumatic head injury - Google Patents

Description

25. Застосування за п. 24, де ТМЕ є ТМЕ- 9, 29. Застосування за будь-яким з пп. 17-28, де інгі- 26. Застосування за будь-яким з пп. 17-25, де ліка- бітор ІІ-18 застосовують у кількості близько 0,001- рський препарат, крім того, включає протизапаль- 100 мг/кг ваги тіла або близько 0,01-10 мг/кг ваги ний агент для одночасного, послідовного або роз- тіла, або близько 0,1-5 мг/кг ваги тіла, або близько дільного застосування. 1-3 мг/кг ваги тіла. 27. Застосування за п. 26, де протизапальним аге- 30. Застосування за будь-яким з пп. 17-29, де інгі- нтом є СОХ інгібітор, особливо СОХ-2 інгібітор. бітор І--18 вводять підшкірно. 28. Застосування за будь-яким з пп. 17-27, де ліка- 31. Застосування за будь-яким з пп. 17-30, де інгі- рський препарат, крім того, включає антиоксидант бітор ІІ-18 вводять щодня. для одночасного, послідовного або роздільного 32. Застосування за будь-яким з пп. 17-31, де інгі- застосування. бітор І--18 вводять через день.

Даний винахід відноситься до сфери патологі- Після клонування мишачої форми, у 1996 р. чних станів головного мозку. Точніше, він відно- було повідомлено про послідовність КДНК 1-18 ситься до застосування інгібітору І--18 для ліку- людини (О5пПіо еї аї., 1996). вання і/або запобігання пошкодженню центральної Шляхом клонування 1-18 з уражених тканин і нервової системи (ЦНС), особливо, травматичного вивчення експресії гена І--18 була виявлена тісна пошкодження головного мозку. асоціація даного цитокіну з аутоїмунними захво-

У 1989 році була описана ендотоксин- рюваннями. У мишей без ожиріння з діабетом індукована активність сироватки, яка індукує інте- (МОБ) спонтанно розвивається аутоімунний інсуліт рферон-у (ІЕМ-у), одержаний в клітинах селезінки і діабет, які можуть бути посилені і синхронізовані мишей (МаКатига еї а!Ї., 1989). Дана активність шляхом однієї ін'єкції циклофосфаміду. Наявність сироватки діяла не як прямий індуктор ІЕМ-у, а МРНК 1С-18 продемонстрована методом ПЛР. із швидше як костимулятор разом з 1-2 або мітоге- зворотною транскриптазою в підшлунковій залозі нами. У спробі виділити активну речовину з сиро- МОЮО-мишей під час ранніх стадій інсуліту. Рівні ватки мишей після впливу ендотоксину був вияв- МРНАК 1-18 швидко збільшувалися після лікування лений, ймовірно, гомогенний білок масою 50-55 кД. циклофосфамідом і передували збілошенню мРНК

Оскільки інші цитокіни можуть діяти як костимуля- ІЕМ-у і, згодом, діабету. Цікаво, що дана кінетика тори продукції ІЕМ-у, через нездатність нейтралі- повторює таку мРНК 1І--12-р40, приводячи до тіс- зуючих антитіл до 1І--1, ІІ -4, ІІ -5, І -6 або ТМЕ ней- ної кореляції між індивідуальними рівнями мРНК. тралізовувати активність сироватки передбачили, Клонування кДНК 1-18 з панкреатичної РНК з по- що вона визначалася особливим фактором. У дальшим секвенуванням виявило ідентичність з 1995 році тими ж дослідниками було продемон- послідовністю 1-18, клонованою з клітин Купфера стровано, що ендотоксин-індукований костимуля- і заздалегідь активованих іп мімо макрофагів. Та- тор продукції ІРМ-у знаходиться в екстрактах печі- кож макрофаги МОО-мишей реагували на цикло- нки мишей, заздалегідь підданих впливу Р.аспе5 фосфамід експресією гена 1-18, в той час як мак- (Окатига еї аї., 1995). У даній моделі популяція рофаги мишей лінії ВаїЇр/с, оброблених печінкових макрофагів (клітини Купфера) збільшу- паралельно, не реагували. Отже, регуляція екс- валася, і у даних мишей низькі дози бактерійного пресії І--18 порушена у МОО-мишей з аутоїмунною ліпополісахариду (І РБ), які у заздалегідь непідго- патологією і тісно асоційована з розвитком діабету товлених мишей не були смертельними, ставали (Боїне єї а)ї., 1997). смертельними. Фактор, названий ПплЬРУу- І/-18 грає потенційну роль в імунорегуляції індукуючим фактором (ІСІР) і пізніше позначений або в запаленні шляхом посилення функціональ- як інтерлейкін-18 (11-18), був очищений до гомо- ної активності Раз-ліганду на клітинах ТІ (Сопії еї генності з 1200 грамів печінки мишей, підданих а!., 1997). ІІ -18 також експресується в корі наднир- впливу Р.аспез5. Вироджені олігонуклеотиди, що кових залоз і, отже, може бути секретованим ней- походять з послідовностей амінокислот очищеного роіїмуномодулятором, що грає важливу роль в га-

І/-18, застосовували для клонування кДНК 1-18 рмонійній роботі імунної системи у відповідь на мишей. 1-18 є білком з масою 18-19 кД, що скла- стресовий вплив (Спагїег, 1986). дається з 157 амінокислот, який не має очевидної Іп мімо І--18 утворюється шляхом розщеплен- схожості з яким-небудь пептидом з баз даних. Мо- ня про-1Ї-18 і, ймовірно, його ендогенна активність лекули матричної РНК для 1-18 і інтерлейкіну-12 відповідає за продукцію ІЄМ-у при смертності, опо- (І/-12) легко визначають в клітинах Купфера і ак- середкованій Р. аспез і ГРБ5. Зрілий 1-18 утворю- тивованих макрофагах. Рекомбінантний 1-18 сти- ється з його попередника за допомогою 1І-1рД- мулює ІЕМ-гамма більш ефективно, ніж 1-12, ймо- конвертуючого ферменту (І--1бета-конвертуючий вірно, через окремий механізм (МісаПеї еї аї., фермент, ІСЕ, каспаза-1). 1996). Подібно до ендотоксин-індукованої актив- Рецептор 1-18 складається як мінімум з двох ності сироватки, І--18 стимулює ІЕМ-у не самостій- компонентів, діючих спільно при скріпленні ліган- но, а діє переважно як костимулятор з мітогенами ду. Високо- і низькоафінні зв'язуючі ділянки для ІІ! - або 1-2. 11-18 посилює проліферацію Т-клітин, 18 були виявлені на стимульованих 1-12 Т- ймовірно по І-2-залежному шляху і посилює про- клітинах мишей (Хозпітоїйю еї аї!., 1998), що дозво- дукцію цитокінів ТП іп міго і надає синергічну дію лило передбачити наявність рецепторного ком- при поєднанні з І--12 відносно продукції ІЄМ-у плексу з множиною ланцюгів. До цього часу були (МаїїзгемувкКі ега!, 1990). ідентифіковані дві субодиниці рецептора, що оби-

дві належать до сімейства рецепторів 1--1 (Рагпеї більній аварії або при падінні. У цьому випадку, еї а!., 1996). У трансдукцію сигналу 1-18 залучена череп ударяється об стаціонарний об'єкт, і голов- активація МЕ-В (Оібопаю егїа!., 1997). ний мозок, що знаходиться всередині черепа, по-

Недавно з сечі людини був виділений розчин- вертається і скручується навколо осі (стовбура ний білок, що володіє високою афінністю до І1--18, і головного мозку), викликаючи місцеве або поши- були описані КДНК людини і миші (Моміск еї аї., рене пошкодження. Також, головний мозок, м'яка 1999; УМО 99/09063). Даний білок був названий І-- маса, оточена рідиною, що дозволяє йому «плава- 18-зв'язуючим білком (І--188Р). ти», може рикошетувати від черепа, що сприяє

І/-188ВР є не позаклітинним доменом одного з подальшому пошкодженню. відомих рецепторів І/-18, а секретованим, який Після травми може мати місце період несві- зустрічається в природі, циркулюючим білком. Він домого стану, який може продовжуватися хвилини, належить до нового сімейства секретованих білків. тижні або місяці. Внаслідок обертання і віддачі,

Дане сімейство, крім того, включає декілька білків, пацієнт з травматичним пошкодженням головного що кодуються поксвірусом, які володіють високою мозку звичайно має пошкодження або контузію гомологічністю з І--18ВР(МОомісК еї аї., 1999). 1І- багатьох відділів головного мозку. Це називається 18ВР постійно експресується в селезінці, нале- дифузним пошкодженням або «нереактивним по- жить до суперсімейства імуноглобулінів і має об- шкодженням» головного мозку. Типи пошкодження межену гомологію з рецептором 1-1 типу ІІ. Його головного мозку, що є при нереактивних пошко- ген локалізований на людській хромосомі 11413 і в дженнях, можуть бути класифіковані як первинні геномній послідовності розміром 8,3 т.п.н. не ви- або вторинні. явлено екзону, що кодує трансмембранний домен Первинне пошкодження головного мозку роз- (Моміск еї а!., 1999). вивається в момент травми, переважно в місцях

Чотири людські і дві мишачі ізоформи 1І--188Р, впливу, особливо, коли має місце перелом черепа. що виходять в результаті сплайсінгу МРНК, вияв- Великі контузії можуть бути асоційовані з внутріш- лені в різних бібліотеках кКДНК, були одержані, ньомозковим крововиливом або можуть супрово- очищені і оцінені відносно біологічної активності джуватися кортикальними розривами. Розсіяні зв'язування і нейтралізації 1І--18 (Кіт еї аї., 2000). пошкодження аксонів з'являються внаслідок зсуву

Людська ізоформа с. 1І/-188Р (ІІ -18ВРа) показала і деформації розтягнення нейрональних паростків, найбільшу афінність до І--18 з швидким зв'язуван- що викликаються ротаційними рухами головного ням і повільним від'єднуванням і константою дисо- мозку всередині черепа. Також можуть мати місце ціації (К(а)), що становить 399 пМ. І--18ВРе має Ід- невеликі геморагічні пошкодження або дифузне домен такий же як І -18ВРа, крім 29 С-кінцевих пошкодження аксонів, що може бути визначено амінокислот; К(а) І--18ВРс в 10 раз менше (2,94 тільки за допомогою мікроскопа.

НМ). Проте, І--18ВРа і І--18ВРе нейтралізують ІЇ- Вторинне пошкодження головного мозку роз- 18 » 9595 при молярному надлишку в два рази. У вивається внаслідок ускладнень, що розвиваються ізоформ 1І--18ВРБ ії І/-18ВРА відсутній повний Ід- після моменту травми. Ці пошкодження включають домен і відсутня здатність до зв'язування або ней- внутрішньочерепний крововилив, травматичне тралізації І/-18. Мишачі ізоформи І--18ВРес і 1І-- пошкодження позачерепних артерій, утворення 18ВРа, що володіють ідентичним Ід-доменом, та- внутрішньочерепних гриж, гіпоксичне пошкоджен- кож нейтралізують 29595 мишачого 1-18 примоля- ня головного мозку або менінгіт. рному надлишку в два рази. Однак, мишачий І/-- «Відкрита травма голови» являє собою види- 188, який володіє такою ж С-кінцевою послідов- ме пошкодження голови і може розвинутися вна- ністю, що і людський ІІ-18ВРа, також нейтралізує слідок вогнепального поранення, нещасного випа- людський І/-18. Молекулярне моделювання до- дку або пошкодження головного мозку предметом, зволило ідентифікувати великі комбіновані елект- що пройшов через череп («реактивне пошкоджен- ростатичні і гідрофобні зв'язуючі ділянки в Ід- ня головного мозку»). Для даного тину травм голо- домені І/-18ВР, які можуть відповідати за його ви більш характерне пошкодження специфічної високоафінне зв'язування з лігандом (Кіт еї аї., ділянки головного мозку. 2000). Так зване «м'яке пошкодження головного моз-

Травматичне пошкодження головного мозку ку» може розвиватися без втрати свідомості і, мо- (ТВІ), яке також просто називається травмою го- жливо, супроводжуватися тільки почуттям оніміння лови або закритою травмою голови (СНІ), відно- або сплутаного стану свідомості протягом коротко- ситься до пошкодження центральної нервової сис- го часу. Хоча забезпенуваний медичний догляд теми, при якому пошкодження головного мозку може бути мінімальним, пацієнти з пошкодженням викликане зовнішнім ударом по голові. Це частіше головного мозку без коми можуть відчувати симп- за все зустрічається при автомобільних або вело- томи і порушення, схожі на такі, що відчуваються сипедних аваріях, але може також розвиватися тими, що вижили після травматичної коми. внаслідок неповного утоплення, серцевого присту- У відповідь на травму, в головному мозку роз- пу, інсульту або інфекцій. Даний тип травматично- виваються зміни, які вимагають спостереження го пошкодження головного мозку звичайно розви- для запобігання подальшому пошкодженню. Роз- вається внаслідок нестачі кисню або мір головного мозку часто збільшується після сер- кровопостачання головного мозку і внаслідок цьо- йозної травми голови. Цей стан називається набу- го може бути віднесений до «аноксичного пошко- ханням головного мозку і розвивається при дження». збільшенні кількості крові в головному мозку. З

Закрите пошкодження голови розвивається плином захворювання вода може скупчуватися в внаслідок удару по голові, наприклад, при автомо- головному мозку, що називається набряком голов-

ного мозку. Як набухання головного мозку, так і а!.,, 1999). Підвищені рівні І--18 визначали в спин- набряк головного мозку приводить до надмірного номозковій рідині (СМР) пацієнтів із запальними тиску в головному мозку, який називається внутрі- захворюваннями ЦНС, такими як бактерійний ме- шньочерепним тиском (СР). нінгіт і вірусний менінгоенцефаліт, але не в СМР у

Кома є тривалим періодом несвідомого стану, пацієнтів з розсіяним склерозом (М5) (Раззрепаег що розвивається безпосередньо після травматич- ега!., 1999). На відміну від виявленого, як правило, ного пошкодження голови. низького підоболонкового рівня 1-18 у пацієнтів з

Існує декілька ступенів коми. Ступені коми мо- М5, в спинному мозку щурів лінії Гемжмі5 з експери- жуть бути оцінені по прогресуванню міри реагу- ментальним аутоїмунним енцефаломієлітом вання пацієнта з травмою голови. У гострій фазі (ЕАЕ), моделі дослідження на тваринах М5, була травми голови застосовується шкала коми Глазго. продемонстрована підвищена експресія мРНК 1--

При поліпшенні стану пацієнта або його стабіліза- 18 (Чапаег апа егарІ, 1998). Експресія і функціона- ції застосовується шкала «Капспо Го5 Атідо5 льне значення 1І--18 при нейротравмі до цього ча- зсаіе», яка оцінює міру когнітивного (розуміння і су не досліджувалося. здібності до міркування) мислення.

Пошкодження головного мозку часто приво- Даний винахід відноситься до патофізіологіч- дить до персистуючих порушень, таких як постт- ної ролі І--18 при захворюваннях ЦНС. Він осно- равматична епілепсія, персистуючий вегетативний ваний на виявленні того, що лікування мишей інгі- стан або посттравматична деменція. біторами 1-18, через одну годину або три дні після

Пошкодження спинного мозку є іншим типом експериментального закритого пошкодження голо- пошкоджень ЦНС. Пошкодження спинного мозку є ви (СНІ), приводить до поліпшення відновлення і причиною більшості госпіталізацій з параплегією і меншої протяжності пошкодження головного мозку тетраплегією. Більше 8095 розвиваються внаслідок в порівнянні з контрольними тваринами. Тому да- дорожніх аварій. Клінічно виділяють дві головних ний винахід відноситься до застосування інгібітору групи пошкоджень: відкриті пошкодження і закриті І/-18 для одержання лікарського препарату для пошкодження. лікування і/або запобігання пошкодженню центра-

Відкриті пошкодження викликають пряму тра- льної нервової системи (ЦНС) і зокрема травмати- вму спинного мозку і нервових корінців. Проривні чному пошкодженню головного мозку. пошкодження можуть викликати поширені розриви Застосування комбінацій інгібітору 1-18 з інте- і крововиливи. Закриті пошкодження, що є причи- рфероном і/або ТМЕ, і/або інгібіторами запалення, ною більшості спинномозкових пошкоджень, зви- і/або антиоксидантами також забезпечується згід- чайно асоційовані з переломом/зміщенням хребе- но з даним винаходом. З метою застосування під- тного стовпа, що звичайно визначається ходів генної терапії для доставки інгібітору 1-18 в радіологічно. Пошкодження спинного мозку зале- пошкоджені тканини або клітини, подальші аспекти жить від протяжності пошкодження кісток і розгля- даного винаходу відносяться до застосування мо- дається як дві головні стадії: первинне пошко- лекул нуклеїнових кислот, що включають кодуючу дження, яким є удари, розтин нервових волокон і послідовність інгібітору І/-18 для лікування і/або геморагічний некроз, і вторинне пошкодження, запобігання пошкодженню ЦнНео. Даний винахід яким є екстрадуральна гематома, інфаркт, інфек- також відноситься до застосування клітин, генети- ція і набряк. чно сконструйованих з метою експресії інгібіторів

Пізні результати пошкодження спинного мозку І--16, для запобігання і/або лікування пошкоджен- включають: висхідну і низхідну антероградну деге- ня ЦНеЄ. нерацію пошкоджених нервових волокон, посттра- Фіг.1 показує гістограму, що зображує рівень в вматичну сирингомієлію і системні вияви парапле- плазмі внутрішньомозкового 1-18 (нг/мл) в цілому гії такі як інфекції сечового тракту і грудної мозку (заштрихований), в лівій півкулі (чорний), клітини, пролежні і м'язова слабкість. або в правій півкулі (сірий) в різних умовах.

Патологія травматичного пошкодження голов- Фіг.2 показує розвиток оцінки по шкалі М55 ного мозку є комплексною і до цього часу неясною. (МеигоіодісаІ Земегйу зсоге) через 1 годину (год.),

Науково-дослідні праці в останні десять років підк- 24 год., 72 год. або 168 год. після травми, з вве- реслюють важливу роль цитокінів, що вивільня- денням внутрішньочеревинно 50 мкг І.-18ВР через ються системно і локально в підоболонковому від- 1 год. після травми (квадрати) або з ін'єкцією тіль- ділі після пошкодження головного мозку і ки розчинника (контроль, кола). передбачають наявність подвійного ефекту проза- Фіг.3 показує ДАМ5З5, що оцінюється через 24 пальних цитокінів, таких як ТМЕ, 1--6 або 1-8, на год., 72 год. або 168 год. після травми, з введен- основі виявлення залежних від часу корисних і ням внутрішньочеревинно 50 мкг ІЇ/-18ВР через 1 побічних ефектів даних медіаторів (Могдапії- год. після травми (квадрати) або з ін'єкцією тільки

Коззтапп еї аї.,, 1997; Коззтапп еї аї., 1997; розчинника (контроль, кола).

Зпопаті еї аї., 1999; бепегьеї! еї аї., 1999; М/наІеп фіг4 показує АМ55, що оцінюється через 1 еї аї., 2000). Як описано вище, недавно відкритим год., 24 год., З дні (д), 7 д або 14 д після травми з цитокіном сімейства ІЇ/-1 є 1--18. Недавні дослі- введенням внутрішньочеревинно 50 мкг І--188Р дження продемонстрували, що 1-18 постійно екс- однократно на 3-іїй після травми (ромби) або в по- пресується в ЦНС мишей, щурів і людини іп мімо двійній дозі через 1 годину і на 3-ій день після тра- (СшиНапе еї а/!., 1998; дапаег апа віаїІ, 1998; Ріїпа єї вми (квадрати) або ін'єкції тільки розчинника (кон- аІ., 1999; Разврепаег еї аї., 1999; Мнееїег еї аї., троль, трикутники). 2000), так само, як і в первинних культурах астро- Даний винахід оснований на виявленні статис- цитів їі мікроглії, але не нейронів, іп міго (Сопії еї тично достовірного корисного ефекту інгібітору І--

18 на відновлення після пошкодження головного Терміни «лікування» і «запобігання», що за- мозку в моделі закритої травми голови на мишах. стосовується в даному описі, розуміють як частко-

Відповідно до даного винаходу, надалі було вияв- ве або повне запобігання, інгібування, послаблен- лено, що І--18 підвищується в головному мозку і ня, поліпшення або регресію одного або більше спинномозковій рідині після травматичного пошко- симптомів або причин пошкодження ЦНС, а також дження головного мозку, що показує, що даний симптомів, захворювань або ускладнень, супрово- прозапальний цитокін грає важливу роль в патоге- джуючих пошкодження ЦНС. При «лікуванні» пош- незі пошкодження головного мозку. кодження ЦНС речовини згідно з даним винаходом

Отже, даний винахід відноситься до застосу- вводять після початку захворювання, «запобіган- вання інгібітору І--18 для одержання лікарського ня» відноситься до введення речовин до того, як у препарату для лікування і/або запобігання пошко- пацієнта будуть помічені симптоми захворювання. дженню центральної нервової системи (ЦНО). Лікування пошкодження ЦНС є переважним

Даний винахід крім того відноситься до засто- відповідно до даного винаходу. Переважно, з ме- сування інгібітору І--18 для одержання лікарського тою лікування пошкодження ЦНС, інгібітор 1-18 препарату для лікування і/або запобігання усклад- вводять по можливості якнайшвидше після пошко- ненням і пізнім наслідкам пошкодження ЦНО. дження ЦНС, наприклад, протягом першої години

У переважних варіантах втілення винаходу після пошкодження. Однак, як показано в прикла- пошкодженням ЦНС є травматичне пошкодження дах, нижче, було показано, що один інгібітор 1-18 головного мозку або закрита травма голови. надає свою позитивну дію на пошкодження голов-

У подальших переважних варіантах втілення ного мозку навіть при введенні через три дні після винаходу пошкодженням ЦНоС є пошкодження розвитку пошкодження головного мозку. Тому, з спинного мозку. метою лікування пошкодження ЦНС, переважне

Крім того, в подальшому переважному варіанті введення інгібітору І--18 протягом трьох днів після втілення винаходу пошкодження головного мозку пошкодження. має судинне походження. Термін «інгібітор І--18» в контексті даного ви-

У контексті даного винаходу, вираження «пош- находу відноситься до будь-якої молекули, що кодження центральної нервової системи» або модулює продукцію і/або дію ІЇ/-18 таким чином, «пошкодження ЦНС» відноситься до будь-якого що продукція і/або дія ІІ -18 ослабляється, меншає пошкодження головного або спинного мозку, неза- або частково, істотно або повністю запобігається лежно від періоду часу від початку або причини, або блокується. Термін «інгібітор І--18» містить в що його викликала. Причиною може бути, напри- собі інгібітори продукції І--18, так само як інгібітори клад, механічний вплив або інфекція. Пошкоджен- дії І--18. ня ЦНС, його клінічні симптоми і наслідки деталь- Інгібітором продукції може бути будь-яка мо- но описані в розділі «Передумови винаходу». лекула, що негативно впливає на синтез, процесінг

Пошкодження ЦНС включає, наприклад, травму або дозрівання 1-18. Інгібітори, що розглядаються або інше пошкодження головного або спинного згідно з даним винаходом, можуть бути, напри- мозку і також може бути назване нейротравмою. клад, супресорами експресії гена інтерлейкіну 1--

Пошкодження головного мозку може, напри- 18, антисмисловими мРНК, що зменшують і що клад, включати або приводити до одного або декі- запобігають транскрипції мРНК 1-18 або ведуть до лькох виявів з наступного: 1. погіршення уваги; 2. деградації мРНК, білками, що порушують прави- порушення когнітивних функцій; 3. порушення мо- льне укладання, або частково або істотно запобі- вних функцій; 4. порушення пам'яті; 5. порушення гають секреції І--18, протеазами, сприяючими де- поведінки; 6. моторні розлади; 7. будь-які інші нев- градації 1-18, після того, як він був синтезований, рологічні порушення. інгібіторами протеаз, що розщеплюють про-1Ї-18 з

Пошкодження спинного мозку може, напри- метою утворення зрілого ІІ--18, такими як інгібітори клад, приводити до розвитку параплегії або тетра- каспази-1 і подібними. плегії. Інгібітором дії І--18 може бути, наприклад, ан-

Ускладнення або пізні результати пошкоджен- тагоніст І--18. Антагоністи можуть зв'язувати або ня ЦНС також можна лікувати і/або запобігти від- ізолювати саму молекулу 1-18 з достатньою афін- повідно до даного винаходу. Ускладнення і пізні ністю і специфічністю з частковою або істотною результати пошкодження головного мозку описані нейтралізацією 1-18 або ІІ/-18-зв'язуючої ділян- вище в розділі «Передумови винаходу». Вони ки(ок), відповідальним за зв'язування 1-18 з його включають, але не обмежені вказаним, наприклад, лігандами (як, наприклад, з його рецепторами). кому, менінгіт, посттравматичну епілепсію, постт- Антагоніст може також інгібувати шлях передачі равматичну деменцію, дегенерацію нервових во- сигналу з участю 1-18, який активується в клі- локон або посттравматичну сирингомієлію, або тинах після зв'язування ІІ -18 з його рецептором. крововилив. Інгібіторами дії І--18 також можуть бути роз-

Даний винахід також відноситься до застосу- чинні рецептори 1І--18 або молекули, що імітують вання інгібіторів І--18 для одержання лікарського рецептори, або агенти, що блокують рецептори ІЇ-- препарату для лікування і/або запобігання будь- 18, або антитіла до 1І--18, такі як поліклональні або якому пошкодженню головного мозку судинного моноклональні антитіла або будь-які інші агенти походження, такого як гіпоксичне пошкодження або молекули, що запобігають скріпленню 1-18 з головного мозку при церебральному інфаркті, його мішенями, що зменшують або запобігають ішемія, цереброваскулярна катастрофа або ін- ініціюванню внутрішньо- або позаклітинних реак- сульт. цій, опосередкованих 1І--18.

У переважному варіанті втілення даного вина- імуноаналіз або аналіз ЕГІЗА. Прості функціона- ходу інгібітор І--18 вибирають з інгібіторів каспази- льні дослідження для оцінки біологічної активності 1 (СЕ), антитіл до 1-18, антитіл до будь-яких І/-188Р були детально описані в М/О 99/09063, субодиниць рецептора 1-18, інгібіторів шляху пе- наприклад, в прикладах 2 (зв'язування 1І/-18, що редачі сигналу з участю 1І--18, антагоністів 1-18, оцінюється шляхом утворення поперечних міжмо- які конкурують з 1-18 або зв'язуються і блокують лекулярних зв'язків) або 5 (інгібування індукованих рецептор 1-18, ії І--18-зв'язуючих білків, ізоформ, І/-18 індукції ІЕМ-у в мононуклеарних клітинах мутеїнів, злитих білків, функціональних похідних, крові). активних фракцій або похідних циркулярної перес- У переважному варіанті втілення винаходу тановки або їх солей. будь-який такий мутеїн має, щонайменше, 4095

Термін «І--18-зв'язуючі білки» в даному описі ідентичності або гомології з послідовністю 1І-188Р застосовується синонімічно з «І -18ВР». Він вклю- або кодованим вірусом гомологом І--18ВР. Більш чає 1--18 зв'язуючі білки, визначені в УМО 99/09063 переважно, щоб він мав, щонайменше, 5095, що- або в Моміск еї аі., 1999, включаючи варіанти найменше, 60956, щонайменше, 7095, щонайменше, сплайсінгу і/або ізоформи ІІ--18-зв'язуючих білків, 8095 або, найбільш переважно, щонайменше, 9095 як визначено в Кіт еї аї!., 2000. Зокрема, людські ідентичності або гомології з ними. ізоформи а і с І/-18ВР є корисними відповідно до Мутеїни поліпептидів І.-18ВР або мутеїни ві- даного винаходу. Білки, корисні відповідно до да- русних І--188Р, які можуть бути використані відпо- ного винаходу, можуть бути глікозильованими або відно до даного винаходу, або нуклеїнова кислота, неглікозильованими і можуть бути одержані з на- що кодує їх, включають обмежений набір значною туральних джерел, таких як сеча, або вони можуть мірою відповідних послідовностей як, наприклад, переважно бути одержані рекомбінантним шля- що замінюють пептиди або полінуклеотиди, які хом. Рекомбінантна експресія може виконуватися можуть бути звичайно одержані звичайним фахів- за допомогою прокаріотичних систем експресії, цем в області техніки без надмірного експериме н- таких як Е. соїї, або еукаріотичних, і переважно, тування, основуючись на вченні і керівництві, систем експресії ссавців. Клітинною лінією, особ- представленому в даному описі. ливо добре відповідною для інгібіторів 1-18 дано- Мутеїни відповідно до даного винаходу вклю- го винаходу, є клітини яєчника китайського хом'яка чають білки, що кодуються нуклеїновою кислотою, (СНО). такою як ДНК або РНК, яка гібридизується з ДНК

Рекомбінантна продукція інгібітору І/-18, при або РНК, яка кодує інгібітор І--18, відповідно до рекомбінантній експресії в клітинах ссавців або даного винаходу, при помірно або дуже жорстких клітинних лініях, може переважно здійснюватися в умовах. Термін «жорсткі умови» відноситься до середовищі для клітинних культур, що не містить умов гібридизації і подальшого промивання, які сироватку. звичайно розглядаються фахівцями в даній облас-

Термін "мутеїн", що застосовується в даному ті техніки як «жорсткі». Дивись А!йЄзиреї еї аї., описі, відноситься до аналогів ІІ-18ВР або анало- Ситепі Ргоїосої5 іп МоїІесшіаг Віоіоду, раніше, гів вірусного ІІ-18ВР, в яких один або більше амі- Іпіегзсіепсе, М.М., 556.3, 64 (1987, 1992), і нокислотних залишків ІІ--188Р, що зустрічається в Затогоок еї а). (Затогоок, 9У.С., Епівсп, Е.Р., апа природі, або вірусного І-18ВР заміщені відмінни- Мапіаїйх, Т. (1989) МоїІесшаг Сіопіпд: А І арогайфгу ми амінокислотними залишками або делетовані, Мапиаї, Соїй 5ргіпд Нагсог І арогаїюгу Ргевз, Соїа або один або більше амінокислотних залишків Зрііпд Наттог, МУ). додані до послідовності І -188Р, що зустрічається Без обмежень, приклади жорстких умов вклю- в природі, або вірусного ІІ/-18ВР, без значного чають умови промивання при температурі на 12- зниження активності одержаних продуктів в порів- 207"С нижче розрахованої Тер гібрида, що дослі- нянні з диким типом 1ІІ--18ВР або вірусним ІІ -188Р. джується, в, наприклад, 2 х 55С (хлорид натрію ж

Дані мутеїни одержують шляхом відомої технології цитрат натрію) і 0,596 505 (додецилсульфат на- синтезу імабо шляхом технології сайт- трію) протягом 5 хвилин, 2 х З5С і 0,196 505 про- направленого мутагенезу, або будь-якої іншої ві- тягом 15 хвилин; 0,1 х 550 і 0,595 505 при 3770 домої відповідної технології. протягом 30-60 хвилин і потім, 0,1 х З5С і 0,590

Будь-який такий мутеїн переважно має послі- ЗО5 при 68"С протягом 30-60 хвилин. Звичайні довність амінокислот, що достатньо дублює таку фахівці в даній області техніки розуміють, що жор-

І/-18ВР, або достатньо дублюючу вірусний І/-- сткість умов також залежить від довжини послідо- 18ВР так, щоб володіти значною мірою схожою вностей ДНК, олігонуклеотидних зондів (таких як активністю з І/-18ВР. Однією з дій І/-18ВР є його 10-40 основ) або суміші олігонуклеотидних зондів. здатність зв'язувати ІЇ/-18. Поки мутеїн володіє При застосуванні суміші зондів, переважно засто- істотною активністю зв'язування 1-18, він може совувати хлорид тетраметиламонію (ТМАС), за- застосовуватися для очищення ІІ -18, такого як за мість 55202. Дивись А!йзибеї, раніше. допомогою афінної хроматографії, і тому можна У переважному варіанті втілення винаходу вважати, що він володіє значною мірою схожою будь-який такий мутеїн має, щонайменше, 4095 активністю з І--18ВР. Отже, можна визначити, чи ідентичності або гомології з послідовністю 5ЕО ІЮ володіє будь-якою конкретний мутеїн активністю, МО:1, 2 або З в прикладеному списку послідовнос- значною мірою схожою з І/-18ВР, за допомогою тей. Більш переважно, щоб він мав, щонайменше, звичайних експериментів, що включають як об'єкт 5095, щонайменше, 6095, щонайменше, 70905, що- такий мутеїн, наприклад, методом простого конку- найменше, 8095 або, найбільш переважно, щонай- рентного сендвіч-аналізу для визначення, чи зв'я- менше, 9095 ідентичності або гомології з ним. зує він спеціально помічений ІІ--18, такого як радіо-

Ідентичність відображає взаємовідношення Зтій апа Ууаїегптап (1981) і виявляє найкращу між двома або більше поліпептидними послідов- єдину аналогічну ділянку між двома послідовнос- ностями або двома або більше полінуклеотидними тями. Інші програми для визначення ідентичності послідовностями, що визначається шляхом порів- іабо схожості між послідовностями також відомі в няння послідовностей. У загальних рисах, ідентич- області техніки, наприклад, сімейство програм ність відноситься до точної відповідності нуклео- ВІ А5Т (АїЇївспці 5.Р. єї аї, 1990, Айвспиці 5.Е. еї аї., тиду з нуклеотидом або амінокислоти з 1997, доступне на домашній сторінці МСВІ за ад- амінокислотою в двох полінуклеотидних або полі- ресою ммлу.псобрі.піт.піпй.дом) і ЕАБЗТА (Реагзоп пептидних послідовностях, відповідно, при порів- М.А., 1990; Реагзоп 1988). нянні по всій довжині послідовності. Переважними змінами для мутеїнів відповідно

Для послідовностей, в яких немає точної від- до даного винаходу є такі, відомі як «консерватив- повідності, можна визначати «9о ідентичності». У ні» заміни. Консервативні амінокислотні заміни загальних рисах, дві послідовності, що порівню- поліпептидів або протеїнів ІІ-18ВР або'вірусних І-- ються, вирівнюють для одержання максимальної 18ВР можуть включати синонімічні амінокислоти в відповідності між послідовностями. Даний процес межах групи, які володіють в достатній мірі схожи- може включати додання «інтервалів» в одну або ми фізико-хімічними властивостями, такі заміни обидві послідовності для посилення міри вирівню- між членами групи дозволяють зберегти біологічну вання. до ідентичності можна визначати по всій функцію молекули (Сгапіпат, 1974). Ясно, що довжині кожної послідовності, що порівнюється, вставки і делеції амінокислот також можуть бути (так зване глобальне вирівнювання), яке особливо зроблені в охарактеризованих вище послідовнос- підходить для послідовностей однакової або дуже тях без порушення їх функції, особливо, якщо схожої довжини, або для більш коротких, визначе- вставки або делеції залучають усього декілька них послідовностей (так зване локальне вирівню- амінокислот, наприклад, менше тридцяти, і пере- вання), що більш підходить для послідовностей важно, менше десяти і не видаляють або не пере- нерівної довжини. міщують амінокислоти, що є критичними для фун-

Способи порівняння ідентичності і гомології кціональної конформації, наприклад, залишки двох або більше послідовностей добре відомі в цистеїну. Протеши і мутеїни, одержані шляхом області техніки. Так, наприклад, програми, що є в таких делецій і/або вставок, відносяться до сфери

Умізкопбзіп зедцепсе Апаїїзуз Раскаде, версія 9.1 дії даного винаходу. (Оемегеих 9. еї аІ,, 1984), наприклад, програми Переважно, групи синонімічних амінокислот

ВЕ5ТРЇТ ії БАР, можуть застосовуватися для ви- визначені в Таблиці 1. Більш переважно, групи значення 95 ідентичності між двома полінуклеоти- синонімічних амінокислот визначені в Таблиці 2; і дами і 95 ідентичності і 95 гомології між двома по- найбільш переважно, групи синонімічних аміноки- ліпептидними послідовностями. ВЕ5ТРІТ слот визначені в Таблиці 3. використовує алгоритм «локальної гомології»

Таблиця 1

Переважні групи синонімічних амінокислот

Таблиця 2

Більш переважні групи синонімічних амінокислот

Таблиця З

Найбільш переважні групи синонімічних амінокислот

Приклади одержання замін амінокислот в біл- виданому Г ее еї аї; і лізинзаміщених білків, пред- ках, які можуть бути використані для одержання ставлених в патенті США Ме 4 904 584 (Зпаму еї аї). мутеїнів поліпептидів або білків І--18ВР, або муте- Термін «злитий білок» відноситься до поліпеп-

Тнів вірусних І--188Р. для застосування в даному тиду, що включає І/-188Р або вірусний ІІ/-188ВР винаході, включають будь-які відомі стадії спосо- або їх мутеїн, або їх фрагмент, в злитті з іншим бу, такі як представлені в патентах США 4 959 314, білком, який, наприклад, має більш тривалий час 4 588 585 і 4 737 462, видані МагкК еї аї.; 5 116 943, існування в рідких середовищах організму. Так, ІІ-- виданому Коїйз еї аї., 4 965 195, виданому Матеп 18ВР або вірусний І/-18ВР може бути злитий з еї аї., 4 879 111, виданому Спопдеїаї!; і 5 017 691, іншим білком, поліпептидом або т.п. наприклад, імуноглобуліном або його фрагментом.

Термін «функціональні похідні», що застосо- нього для досягнення хорошої регресії або полег- вуються в даному описі, включає похідні І--18ВР шення патогенного стану або будь-якого симптому або вірусного 1ІІ-188Р і їх мутеїни і злиті білки, які або групи симптомів, що відноситься до патоген- можуть бути одержані з функціональних груп, які ного стану, і низькою токсичністю. зустрічаються у вигляді бічних ланцюгів на залиш- Нейтралізуючі антитіла легко одержують від ках або М- або С-кінцевих груп, за допомогою спо- тварин, таких як кролики, кози або миші, шляхом собів, відомих в області техніки, і вони включають- імунізації І--18. Імунізовані миші є особливо кори- ся в даний винахід доти, поки вони залишаються сними для забезпечення джерела В-клітин для фармацевтично прийнятними, тобто вони не по- одержання гібридом, які в свою чергу культивують рушують активність білка, яка значною мірою схо- для одержання великих кількостей анти-1Її-18 мо- жа з активністю ІІ-18ВР або вірусного І--188Р, і не ноклональних антитіл. додають токсичних властивостей композиціям, що Химерними антитілами є молекули імуногло- містять їх. буліну, що характеризуються двома або більше

Дані похідні можуть, наприклад, включати бічні сегментами або частинами, що походять від різних ланцюги поліетиленгліколю, які можуть маскувати видів тварин. Як правило, варіабельну ділянку антигенні ділянки і подовжувати час життя 1 -188Р химерного антитіла одержують з антитіла ссавця, або вірусного І--18ВР в рідких середовищах орга- не людини, такого як мишаче моноклональне ан- нізму. Інші похідні включають аліфатичні складні титіло, а константну ділянку імуноглобуліну одер- ефіри карбоксильних груп, аміди карбоксильних жують з молекули людського імуноглобуліну. Пе- груп внаслідок реакції з аміаком або з первинними реважно, щоб обидві ділянки і їх комбінація або вторинними амінами, М-ацильні похідні віль- володіли низькою імуногенністю при звичайному них аміногруп амінокислотних залишків, що утво- визначенні (ЄПойк еї а!., 1994). Гуманізовані антиті- рюються з ацил-складовими (наприклад, алканої- ла є молекулами імуноглобулінів, створеними льні або карбоциклічні ароїльні групи), або О- шляхом технологій генної інженерії, при яких ми- ацильні похідні вільних гідроксильних груп (напри- шачі константні ділянки замінюють людськими клад, таких серинових або треонінових залишків), копіями, зберігаючи мишачі ділянки, зв'язуючі ан- що утворюються з ацил-складовими. тиген. Одержане мишаче-людське химерне анти-

Як «активні фракції» І--18ВР або вірусного ІІ-- тіло переважно володіє зниженою імуногенністю і 188Р, мутеїнів і злитих білків, даний винахід охоп- поліпшеною фармакокінетикою у людей (Кпідні еї лює будь-які фрагменти або попередники поліпеп- а!., 1993). тидного ланцюга білкової молекули як такої, або Таким чином, в подальшому переважному ва- разом з асоційованими молекулами або залишка- ріанті втілення винаходу антитілом до 1-18 є гу- ми, пов'язаними з нею, наприклад, залишками ну- манізоване антитіло до 1-18. Переважні приклади кру або фосфату, або агрегати білкових молекул гуманізованих анти-1ІЇ-18 антитіл описані, напри- або тільки залишків нукру, при умові, що вказана клад, в Європейській патентній заявці ЕР 0974600. фракція має активність, значною мірою схожу з ЇЇ - У ще одному переважному втіленні винаходу 188Р. антитіло до 1-18 є повністю людським. Технологія

Термін «солі» в даному описі відноситься як одержання людських антитіл описана детально, до солей карбоксильних груп, так і до кислотно- наприклад, в УМО 00/76310, М/О 99/53049, 05 6 162 адитивних солей аміногрупи молекули |інгібітору 963 або А 5336100. Повністю людськими антиті-

І/-18 або його аналогів. Солі карбоксильної групи лами є переважно рекомбінантні антитіла, що можуть бути утворені за допомогою способів, ві- одержуються від трансгенних тварин, наприклад, домих в області техніки, і включають неорганічні ксеномишей, що включають повністю або частково солі, наприклад, солі натрію, кальцію, амонію, за- функціональні локуси людського Ід. ліза або цинку і т.п., і солі з органічною основою, У високо переважному варіанті втілення дано- як такі, що утворюються, наприклад, з амінами, го винаходу інгібітором 1-18 є І/-18ВР, або його такими як триетаноламін, аргініном або лізином, ізоформа, мутеїн, злитий білок, функціональне піперидином, прокаїном і т.п. Кислотно-адитивні похідне, активна фракція або похідне циркулярної солі включають, наприклад, солі з мінеральними перестановки. Дані ізоформи, мутеїни, злиті білки кислотами, такими як, наприклад, соляна кислота або функціональні похідні зберігають біологічну або сірчана кислота, і солі з органічними кислота- активність ІІ-18ВР, особливо в зв'язуванні ІЇ--18, і ми, такими як, наприклад, оцтова кислота або ща- переважно мають по суті як мінімум активність, влева кислота. Звичайно, будь-яка така сіль по- схожу з ІІ -188Р. В ідеалі, такі білки володіють біо- винна зберігати біологічну активність ОРМ, логічною активністю, яка навіть вище при порів- відповідну для даного винаходу, тобто надавати нянні з немодифікованим І/-18В8Р. Переважні ак- проліферативну дію на олігодендроцити. тивні фракції володіють активністю, кращою, ніж

У наступному переважному варіанті втілення активність І--188Р, або мають подальші переваги, винаходу інгібітором 1-18 є антитіло до 1-18. Ан- такі як краща стабільність або більш низька токси- титіла до І/-18 можуть бути поліклональними або чність або імуногенність, або їх легше одержувати моноклональними, химерними, гуманізованими у великих кількостях, або легше очищати. або навіть повністю людськими. Рекомбінантні Послідовності І--188ВР і його варіантів/зоформ антитіла і їх фрагменти характеризуються високою сплайсінгу можуть бути одержані з УУО 99/09063 афінністю зв'язування з ІІ -18 іп мімо і низькою ток- або з Моміск еї аї., 1999, так само як з Кіт еї аї., сичністю. Антитіла, які можуть застосовуватися в 2000. даному винаході, характеризуються їх здатністю Функціональні похідні І -18В8Р можуть бути до лікування пацієнтів протягом періоду, достат- кон'юговані з полімерами з метою поліпшення властивостей білка, таких як стабільність, час на- В іншому переважному варіанті втілення вина- півжиття, біодоступність, переносимість організ- ходу інтерфероном є інтерферон-в (ІЄМ-В), і більш мом людини або імуногенність. Для досягнення переважно, ІМ-В та. цієї цілі функціональні похідні можуть включати, Інгібітор продукції і/або дії І--18 переважно за- щонайменше, одну складову, прикріплену до одні- стосовується одночасно, послідовно або роздільно єї або більше функціональних груп, які зустріча- з інтерфероном. ються як один або більше бічних ланцюгів на за- Фактор некрозу пухлини, як описано в літера- лишках амінокислот. Такою складовою може бути, турі, володіє як захисною, так і токсичною дією при наприклад, поліетиленгліколь (РЕС). РЕО- пошкодженні головного мозку (Зпопаті еї аї., илювання може здійснюватися відомими способа- 1999). У Прикладі 1, нижче, ін'єкція ТМЕ мишам ми, наприклад, описаними в МО 92/13095. після тяжкої травми головного мозку, приводила

Отже, в переважному варіанті втілення даного до істотного зниження рівнів ІЇ/-18 в головному винаходу інгібітори І/-18, і особливо ІІ/-18ВР, є мозку, що показує, що ТМЕ може володіти корис-

РЕС-ильованими. ним ефектом на відновлення після травматичного

У наступному переважному варіанті втілення пошкодження головного мозку. Отже, переважний винаходу інгібітором 1-18 є злитий білок, що варіант втілення даного винаходу відноситься до включає цілий ІІ.-18-зв'язуючий білок або його час- застосування інгібітору І/-18 в комбінації з ТМЕ тину, який зв'язаний з цілим імуноглобуліном або для одержання лікарського препарату для ліку- його частиною. Фахівці в області техніки розумі- вання і/або запобігання пошкодженню головного ють, що злитий білок, що одержується, зберігає мозку, для одночасного, послідовного або роз- біологічну активність І--18ВР, особливо відносно дільного застосування. зв'язування з 1-18. Злиття може бути безпосеред- Комбінація інгібіторів І--18 з ТМЕ альфа є пе- нім або через короткий лінкерний пептид, який реважною відповідно до даного винаходу. може складати від 1 до З амінокислотних залишків У наступному переважному варіанті втілення в довжину або більше, наприклад, 13 амінокислот- даного винаходу лікарський препарат крім того них залишків в довжину. Вказаний лінкер може містить протизапальний агент, такий як НСПЗЗ3 бути, наприклад, трипептидом з послідовністю Е- (нестероїдні протизапальні засоби). У переважно-

Е-М (Сіи-Рпе-Меб або лінкер з послідовністю з 13 му варіанті втілення винаходу в комбінації з інгібі- амінокислот, що включає Сіш-РНе-Спіу-АІа-С1у-І еи- тором 1-18 застосовується СОХ-інгібітор, і більш

Ма!-Геи-Спіу-Спту-СіІп, вставленим між послідовністю переважно, СОХ-2-інгібітор. СОХ-інгібітори відомі

І/-18ВР ії послідовністю імуноглобуліну. Одержа- в області техніки. Специфічні інгібітори СОХ-2, ний злитий білок володіє поліпшеними властивос- наприклад, описані в УМО 01/00229. Активні компо- тями, такими як збільшений час існування в рідких ненти можуть застосовуватися одночасно, послі- середовищах організму (час напівжиття), збільше- довно або роздільно. на специфічна активність, збільшений рівень екс- Була описана роль окислювального стресу, пресії або полегшене очищення злитого білка. особливо реактивних форм кисню (КО), в пато-

У переважному варіанті втілення винаходу ІІ - фізіології пошкодження головного мозку (Зпопаті 18ВР з'єднаний з константною ділянкою молекули еїаї., 1997).

Ід. Переважно, він з'єднаний з ділянками важких Отже, в переважному варіанті втілення даного ланцюгів, наприклад, такими як домени СНІ і СНЗ винаходу лікарський препарат крім того включає людського ді. Утворення специфічних злитих антиоксидант, для одночасного, послідовного або білків, що включають ІІ-18ВР і частину імуногло- роздільного застосування. Безліч антиоксидантів буліну, описане, наприклад, в прикладі 11 У відомі в області техніки, такі як вітаміни А, С або Е, 99/09063. Інші ізоформи молекули Ід також є від- або 5-аміносаліцилова кислота, або супероксид- повідними для утворення злитих білків згідно з дисмутаза. даним винаходом, такі як ІдДс2 або Ідс4 або інші У наступному переважному варіанті втілення класи Ід, наприклад, такі як ІДМ або ІдА. Злиті біл- даного винаходу інгібітор І--18 застосовується в ки можуть бути мономерними або мультимерними, кількості близько 0,001-100 мг/кг ваги тіла або бли- гетеро- або гомомультимерними. зько 0,01-10 мг/кг ваги тіла, або близько 0,1-3 мг/кг

Інтерферони особливо відомі своєю інгібую- ваги тіла, або близько 1-2 мг/кг ваги тіла. чою дією на реплікацію вірусів і клітинну проліфе- У ще одному варіанті втілення винаходу інгібі- рацію. Інтерферон-у, наприклад, грає важливу тор І--18 застосовується в кількості близько 0,1- роль в стимуляції імунної і запальної відповідей. 1000 мкг/кг ваги тіла або 1-100 мкг/кг ваги тіла або

Вважається, що інтерферон В (ІЄМ-В, інтерферон близько 10-50 мкг/кг ваги тіла. тину І) грає протизапальну роль. Даний винахід крім того відноситься до засто-

Отже, даний винахід відноситься до застосу- сування молекули нуклеїнової кислоти, що вклю- вання комбінації інгібітору І--18 і інтерферону в чає кодуючу послідовність інгібітору І--18, мутеїну, одержанні лікарського препарату для лікування функціонального похідного або їх активної фракції, пошкодження ЦНе. в одержанні лікарського препарату для запобіган-

Інтерферони також можуть бути кон'юговані з ня і/або лікування пошкодження ЦНО. полімерами з метою поліпшення стабільності біл- Переважно, молекула нуклеїнової кислоти крім ків. Кон'югат між інтерфероном В і високомолеку- того включає послідовність вектора експресії, на- лярним спиртом поліетиленгліколем (РЕС), напри- приклад, для застосування генної терапії для вве- клад, описаний в М/О 99/55377. дення інгібітору 1-18 згідно з винаходом.

Переважно, молекулу нуклеїнової кислоти вводять внутрішньом'язово.

З метою лікування і/або запобігання пошко- циркулярної перестановки, як описано вище, є дженню ЦНС, вектор генної терапії, що включає переважними інгредієнтами фармацевтичних ком- послідовність інгібітору продукції і/або дії 1-18, позицій. можна вводити прямо в уражену тканину, напри- Інтерфероном, включеним в фармацевтичну клад, внаслідок цього уникаючи проблем, пов'яза- композицію, є переважно ІЕМ-бета або ІЕМ-альфа. них з системним введенням векторів генної тера- У ще одному переважному варіанті втілення пії, таких як розведення векторів, досягнення і даного винаходу фармацевтична композиція вплив на клітини-мішені або тканини-мішені, і побі- включає терапевтично ефективну кількість ТМЕ» чних ефектів. альфа. Фармацевтична композиція згідно з даним

Застосування вектора для стимуляції і/або по- винаходом може крім того містити один або біль- силення ендогенної продукції інгібітору 1-18 в клі- ше СОХ-інгібіторів. тинах, в нормі не секретуючих інгібітор І--18, або Визначення «фармацевтично прийнятний» які експресують недостатні кількості інгібітору, та- означає будь-який носій, який не впливає на ефек- кож розглядається відповідно до даного винаходу тивність біологічної активності активного інгредієн- для лікування і/або запобігання пошкодженню та і не є токсичним для організму-хазяїна, якому

ЦНО. Вектор може включати регуляторні елемен- вводиться. Наприклад, для парентерального вве- ти, що функціонують в клітинах, в яких бажана дення активний білок(ки) можуть бути складені в експресія інгібітору І--18. Такими регуляторними формі . одиниці дозування для ін'єкцій в розчинни- послідовностями або елементами можуть бути, ках, таких як фізіологічний розчин, розчин декстро- наприклад, промотори або енхансери. Регулятор- зи, сироватковий альбумін або розчин Рінгера. на послідовність потім може бути вбудована в Активні інгредієнти фармацевтичної композиції правильний локус геному шляхом гомологічної згідно з даним винаходом можна вводити індивіду рекомбінації, відповідно, оперативно зв'язуючи різними шляхами. Шляхи введення включають регуляторну послідовність з геном, експресію яко- інтрадермальний, трансдермальний (наприклад, в го потрібно індукувати або посилити. Дана техно- препаративних формах повільного вивільнення), логія звичайно відноситься до "ендогенної актива- внутрішньом'язовий, внутрішньочеревинний, внут- ції гена" (ЕСА), і вона описана, наприклад, в МО рішньовенний, підшкірний, пероральний, інтракра- 91/09955. ніальний, епідуральний, ректальний, місцевий і

Фахівці в області техніки розуміють, що також інтраназальний шляхи. Можуть бути використані можливо безпосередньо зупинити експресію 1-18, будь-які інші терапевтично ефективні шляхи вве- без використання |інгібітору І/-18, за допомогою дення, наприклад, всмоктування через епітеліаль- такої ж технології. Щоб це здійснити, негативний ні або ендотеліальні тканини або шлях генної те- регуляторний елемент, як, наприклад, елемент, рапії, де молекулу ДНК, що кодує активний агент, що викликає мовчання, можна вбудувати в локус вводять пацієнту (наприклад, за допомогою векто- гена ІС-18, що приводить до зниження або запобі- ра), що викликає експресію активного агента і його гання експресії І--18. Фахівці в області техніки ро- секрецію іп мімо. Крім того, білок(ки) згідно з даним зуміють, що таке пониження регуляції або припи- винаходом можна вводити разом з іншими компо- нення експресії ІЇ/-18 володіє таким же ефектом, нентами біологічно активних агентів, такими як що і застосування інгібітору 1/-18 з метою запобі- фармацевтично прийнятні поверхнево-активні гання і/або лікування захворювання. речовини, наповнювачі, носії, розріджувачі і роз-

Даний винахід більше того відноситься до за- чинники. стосування клітини, яка була генетично модифіко- Для парентерального (наприклад, внутрішньо- вана з метою продукції інгібітору 1-18, в одержан- венного, підшкірного, внутрішньом'язового) вве- ні лікарського препарату для лікування і/або дення активний білок(ки) можуть бути представле- запобігання пошкодженню ЦНе. ні у вигляді розчину, суспензії, емульсії або

Крім того, даний винахід відноситься до фар- ліофілізованого порошку разом з фармацевтично мацевтичної композиції, особливо корисної для прийнятним розчинником для парентерального запобігання і/або лікування запального пошко- введення (наприклад, водою, фізіологічним розчи- дження ЦНС, яка включає терапевтично ефектив- ном, розчином декстрози) і допоміжними речови- ну кількість інгібітору 1-18 і/або терапевтично нами, які підтримують ізотонічність (наприклад, ефективну кількість інтерферону, і/або фармацев- маніт) або хімічну стабільність (наприклад, консе- тично ефективну кількість ТМЕ, і/або фармацевти- рванти і буферні розчини). Препаративну форму чно ефективну кількість протизапального агента, стерилізують шляхом звичайних технологій, що іМабо фармацевтично ефективну кількість антиок- застосовуються. сидантного агента. Біодоступність активного білка(ів) згідно з да-

Як інгібітори 1-18 дана композиція може ним винаходом також може бути поліпшена шля- включати інгібітори каспази-1, антитіла до 1-18, хом застосування процесів кон'югації, які збільшу- антитіла до будь-якої субодиниці рецептору 1-18, ють час напівжиття молекули в людському тілі, інгібітори шляху передачі сигналу з участю 1І-18, наприклад, зв'язуванням молекули з поліетиленг- антагоністи 1І--18, які конкурують з 1-18 і блокують ліколем, як описано в патентній заявці РСТ УМО рецептор 1-18, і І--18-зв'язуючі білки, їх ізоформи, 92/13095. мутеїни, злиті білки, функціональні похідні, активні Терапевтично ефективні кількості активного фракції або похідні циркулярної перестановки, що білка(ів) є похідним від безлічі параметрів, вклю- володіють такою ж активністю. чаючи тип антагоніста, афінність антагоніста 1І--18,

І/-188Р ії його ізоформи, мутеїни, злиті білки, будь-яку залишкову цитотоксичну активність, що функціональні похідні, активні фракції або похідні виявляється антагоністами, шлях введення, кліні-

чний стан пацієнта (включаючи бажаність досяг- Даний винахід крім того відноситься до спосо- нення нетоксичного рівня активності ендогенного бу лікування пошкодження ЦНС, що включає вве-

ІП/-18). дення фармацевтично ефективної кількості інгібі- «Терапевтично ефективна кількість» є такою, тору І--18 пацієнту, потребуючому цього. при введенні якої інгібітор І--18 приводить до інгі- Всі посилання, що цитуються в даному описі, бування біологічної активності І--18. Дозування, включаючи журнальні статті або реферати, ону- яке вводять, в одній дозі або в декількох дозах бліковані або неонубліковані патенти США або індивіду, варіює в залежності від безлічі чинників, зарубіжні патентні заявки, видані патенти СІЛА або включаючи фармакокінетичні властивості інгібіто- зарубіжні патенти або будь-які інші посилання по- ру І--18, шлях введення, стан пацієнта і його хара- вністю включені в даний опис у вигляді посилання, ктеристики (стать, вік, вага тіла, стан здоров'я, включаючи всі дані, таблиці, креслення і текст, ріст), вираженість симптомів, супутнє лікування, представлений в посиланнях, що цитуються. Крім частота лікування і бажані ефекти. Кваліфіковані того, повний зміст посилальних документів, що фахівці здатні здійснювати корекцію і маніпуляцію цитуються в посилальних документах, що приво- у встановленому діапазоні доз, а також методи як дяться в даному описі, також повністю включені як іп міго, так і іп мімо для визначення інгібування І/-- посилання. 18 у індивіда. Посилання на відомі стадії способів, стадії

Згідно з даним винаходом інгібітор 1-18 за- традиційних способів, відомі способи або тради- стосовують в кількості близько 0,0001-100 мг/кг ційні способи в будь-якому випадку не є донущен- або близько 0,01-10 мг/кг ваги тіла, або близько ням того, що будь-який аспект, опис або варіант 0,1-5 мг/кг ваги тіла, або близько 1-3 мг/кг ваги втілення даного винаходу описаний, розкритий тіла, або близько 1-2 мг/кг ваги тіла. Як альтерна- або передбачений у відповідній області техніки. тива, інгібітори І/-18 можна вводити в кількості Вищенаведений опис специфічних варіантів близько 0,1-1000 мкг/кг ваги тіла або близько 1-100 втілення винаходу так повно розкриває загальну мкг/кг ваги тіла, або близько 10-50 мкг/кг ваги тіла. суть даного винаходу, що інші, застосовуючи спе-

Шляхом введення, переважним згідно з даним ціальні знання в області техніки (включаючи зміст винаходом, є введення підшкірно. Внутрішньом'я- посилальних документів, що цитуються в даному зове введення також переважне згідно з даним описі), легко можуть модифікувати і/або адаптува- винаходом. З метою введення інгібітору 1-18 без- ти для різного застосування такі специфічні варіа- посередньо в місце його дії, також переважно його нти втілення винаходу, без надмірного експериме- вводити інтракраніальним або підоболонковим нтування, без відхилення від загальної ідеї даного шляхом. Інтракраніальний шлях є особливо пере- винаходу. Отже, така адаптація і модифікації ма- важним при відкритому пошкодженні голови (реак- ють на меті знаходитися в діапазоні еквівалентів тивне пошкодження головного мозку). описаних варіантів втілення винаходу, основаних

У наступних переважних варіантах втілення ін- на вченні і керівництві, представленому в даному гібітор І--18 вводять щодня або через день. описі. Зрозуміло, що фразеологія або термінологія

Добові дози звичайно застосовують у вигляді в даному описі застосовується з метою опису, а не окремих доз або в формах з уповільненим вивіль- для обмеження, так що термінологія і фразеологія ненням, ефективних для досягнення бажаних ре- даного опису повинна бути інтерпретована фахів- зультатів. Друге або подальші введення можуть цем в області техніки в світлі вчення і керівництва, здійснюватися в таких же дозах, менших або бі- представленого в даному описі, в комбінації зі льших в порівнянні з початковою або попередньою знаннями звичайного фахівця в області техніки. дозою, що вводиться даному індивіду. Друге або Після опису винаходу, для більш повного його подальші введення можна вводити під час або до розуміння представлені посилання на наступні розвитку захворювання. приклади, які представлені для ілюстрації і не ма-

Згідно з даним винаходом інгібітор І--18 мож- ють на меті обмежити даний винахід. на вводити профілактично або терапевтично інди- Приклади віду до, одночасно або послідовно з іншими тера- Мишами, що застосовуються в даному дослі- певтичними заходами або агентами (наприклад, дженні, були самці у віці 8-16 тижнів, що важили прийом множини лікарських препаратів), в терапе- 30-35 г. їх вирощували в специфічному вільному втично ефективній кількості, особливо з інтерфе- від патогенів середовищі, тримали при стандарт- роном і/або ТМЕ, і/або іншим протизапальним аге- них умовах температури і світла в клітках по 4-6 нтом, таким як СОХ-інгібітор і/або антиоксидант. У тварин і забезпечували їжею і водою у вільному залежності від пошкодження головного мозку мож- режимі. Дослідження проводили відповідно до на представити спільне введення антагоніста ТМЕ керівництва Іпзійшіопа! Апіта! Саге Соттіцеє, замість самого ТМЕ (Зпопаті еї аї!., 1999). Активні Небгем/ Опімегзпйу, Уегизаіет, ІзгаеІ. Експеримен- агенти, які вводять одночасно з іншими терапев- тальне закрите пошкодження голови проводили з тичними агентами, можна вводити в тих же самих використанням пристрою з падаючим вантажем, або в інших композиціях. розробленим раніше (Спеп еї аї. 1996). Коротко,

Даний винахід крім того відноситься до спосо- після проведення ефірної анестезії проводили бу одержання фармацевтичної композиції, що серединний подовжній розріз, шкіру розсовували і включає суміш ефективної кількості інгібітору 1-18 оголяли череп. Визначали ліву передню лобову іМабо інтерферону, і/або антагоніста ТМЕ, і/або область і туди вміщували тефлоновий конус з на-

СОХ-інгібітору з фармацевтично прийнятним носі- конечником на - 1мм убік від серединної лінії, в

ЄМ. середньо-вінцевій площині. Голову фіксували, і вантаж вагою 75 г онускали на конус з висоти 18 см, що приводило до локального пошкодження інтрацеребрального 1-18 між різними групами лівої півкулі. Після травми, миші одержували підт- тварин, всі концентрації нижче за рівень визначен- римуючу оксигенацію 10095 О2 не довше 2 хвилин, ня в 5 пг/мл були оцінені як 4,9 пг/мл. Потім нероз- і потім їх вміщували назад в клітки. ведені зразки були вміщені в парні комірки, і була

Оцінка рівнів І--18 в головному мозку мишей розрахована їх остаточна концентрація по серед-

Для визначення інтракраніальних рівнів 1-18, ній оптичній щільності (00). ОО визначали з допо- миші лінії С57ВІ /6 (Вб) (всього п-62) були розпо- могою спектрофотометра (Оупасесп ГІ арогаюгіе5 ділені на шість окремих груп: (1) «група нормаль- Іпс., СпапіШу, МА) при гасінні довжини хвилі 405 ного контролю», неліковані миші лінії Вб (п-10). (2) нм. «група ефірної анестезії», мишам виробляли ане- Протокол лікування 1І-18ВР стезію ефіром протягом 10 хвилин і обезголовлю- Самців щурів Зарга лінії Нергем/ Опімегейу вали через 24 години (п-10) або 7 днів (п-10). (3) (п-40) застосовували для дослідження 1І--188Р. «група псевдооперації»; дані миші піддавались Анестезію і експериментальну СШ проводили, як анестезії і подовжньому розрізу скальпа і були описано вище. Для протоколу лікування тварин умертвлені через 24 години (п-15) або 7 днів. (4) розділили на дві групи: в групі А («контрольна гру- «група травми»; виконували експериментальну па», п-16) мишей піддали експериментальній СШ, закриту травму голови, як описано вище, і тварин через 1 годину зробили ін'єкцію тільки розчинника обезголовлювали під ефірною анестезією через 4 (РВ5) і через 7 днів провели неврологічне обсте- години (п::7), 24 години (п--7) і 7 днів (п--7) після ження (дивись нижче). У групі В («група дослі- травми. (5) «група ін'єкції ТМЕ»; для оцінки можли- дження», п-18), мишам вводили внутрішньочере- вої ролі ТМЕ в регуляції інтрацеребрального 1І--18, винно 50мкг І--18В8Р відразу ж після огляду по миші зазнавали ефірної анестезії, інтрацеребро- неврологічній шкалі при часі 1-1 година після СНІ. вентрикулярно (і.с.м.) вводили 200нг мишачого Оскільки проникність гематоенцефалічного бар'є- рекомбінантного ТМЕ (8 БЗузіетв5, Аріпдаоп, ОК) ра підвищується в 5-6 разів між 1 і 4 годинами піс- в 10 мкл стерильного фосфатно-буферного соля- ля СНІ, як раніше було визначено в такій же екс- ного розчину (РВ5), і мишей умертвляли через 24 периментальній моделі (Спеп еї аї!., 1996), при цих години (п-10). (б) «група псевдоін'єкції»; даним умовах І--18В8Р мав доступ в головний мозок. Дві тваринам вводили і.с.у. тільки розчинник (10 мкл додаткові групи мишей лікували так само, як групи стерильного РВ5) і їх умертвляли через 24 години А і В (група С: «контрольна група»; група 0: «група (п-6), як контрольну групу для тварин, яким вво- дослідження», відповідно), і їх обезголовлювали дили ТМЕ. У всіх мишей після обезголовлювання через 48 годин, після цього проводили розкриття негайно видаляли головний мозок, який вмить головного мозку для оцінки посттравматичного заморожували в рідкому азоті і зберігали при -707С набряку, як описано нижче. до проведення аналізу. Головний мозок з групи Оцінка неврологічних порушень травми був розділений на ліву (іпсилатеральну) і Для оцінки посттравматичних неврологічних праву (контралатеральну) півкулю з метою прове- порушень була розроблена і затверджена шкала дення порівняння рівнів ІІ-18 в пошкодженій і не- Меишгоїодіса! Земепу Зсоге (М55) (егапеї єї аї., пошкодженій півкулі. Гомогенізацію тканин прово- 2000). дили за допомогою Роїуїгоп (Кіпетаїйіса, Кгіеп5, Шкала складається з 10 індивідуальних клініч- зЗмйгепапа), використовуючи розведення 14 в них завдань на моторну функцію, швидкість реак- крижаному екстракційному буфері (мас/мас), що ції і фізіологічну поведінку, де один бал привлас- містить 50 мМ Тріс (рН 7,2), 150 мМ масі, 1905 нюється за невиконання завдання і нуль балів за

Тиюоп-Х-100 (Воепіпдег Маппіиеїт, ВоїКкгецз, успішне виконання (Таблиця 4). Максимум М55 в

Зумїгепапа) і суміш інгібіторів протеаз (Воепгіпдег 10 балів свідчить про тяжку неврологічну дисфун-

Мапппеїт). Гомогенат струшували на льоду протя- кцію, з невиконанням всіх завдань, тоді як нуль гом 90 хвилин і потім центрифугували протягом 15 балів досягається здоровими мишами без пошко- хвилин при 3000 х 49 і 4"С. Потім надосадову ріди- джень. МЗ5 через 1 годину після травми відобра- ну ділили на рівні частини і зберігали при -707С до жає початкову тяжкість пошкодження і високо ко- проведення аналізу. Концентрацію загального біл- релює з клінічним результатом (Вепі-Адапі еї аї., ка в екстрактах головного мозку вимірювали мето- 2001). Оцінку проходження завдань проводили дом Вгайтога (Віо Кай Іаброгайюгіе5, Мипіси, двоє дослідників, які не знали групи дослідження,

Сегтапу) і виявили, що вона була постійною у всіх через 1 годину, 24 години, 72 години і 7 днів після оцінюваних мишей (12,132,1 мг/мл; сереїНежх50). експериментальної СШ. А М55, що розраховуєть-

Визначення кількісних рівнів інтрацеребральних ся як різниця між М55 при ї-їЇ година і М55 в будь- цитокінів проводили методом ЕГІЗА, специфічним якій більш пізній часовій точці, є параметром, який для мишачого 1-18, відповідно до інструкцій виро- відображає міру спонтанного відновлення після бника (К80 Зузіет5, АБріпддоп, ШК). Чутливість пошкодження головного мозку, як описано раніше аналізу становила 5 пг/мл. Для порівняння рівнів (Спеп ега!., 1996).

Таблиця 4

Шкала Меигоіодіса! Земепіу зсоге (М55) для мишей з пошкодженням голови ня/не виконання протягом З хвилин ральній стороні дити по прямій гучний плеск в долоні шньому середовищі

Ел пр вінііньннай ННШСННЙ

Балансування на перекладині ня Ол протягом як мінімум 10 секунд чці мм протягом як мінімум 10 секунд н Те ж завдання, підвищеної складності, на балці, ши-

Оцінка набряку мозку дження. Індивідуальний вихід оцінювали, викорис-

Вираженість набряку мозку оцінювали шляхом товуючи шкалу Сіаздомж Оцісоте Зсаіє (205) визначення вмісту води в тканинах пошкодженої (Чеппей апа Вопа, 1975). Протокол дослідження півкулі, як описано раніше (Спеп еї аї!., 1996). Ко- зразків СМР і сироватки був затверджений Епіс5 ротко, мишей піддавали анестезії, як описано ви- Воага Соттіцеє, Опімегейу Нозріаї, 2 игісп. ще через 48 годин після травми, що відповідало Збір зразків і аналіз 1-18 часовій точці, в якій набряк все ще залишається Зразки СМР і відповідні зразки сироватки у па- істотним в даній модельній системі (Спеп еї аї., цієнтів з СНІ (п-10) одержували щодня в один фік- 1996). Після обезголовлювання видаляли мозочок сований час. Контрольну СМР одержували від і стовбур мозку і одержували сегмент кори голов- пацієнтів, які піддавалися діагностичній спинномо- ного мозку вагою «20 мг з ділянки, що межує з міс- зковій нункції (п-5). Дані пацієнти не мали ознак цем пошкодження, і з контралатеральної півкулі. запальних захворювань ЦНС, на основі нормаль-

Праву (непошкоджену) півкулю використали як них рівнів в СМР білка, глюкози і кількостей клітин внутрішній контроль. Зрізи тканини зважували і (дані не представлені). У групі СНІ відбирання зра- висушували протягом 24 годин при 95"7С. Після зків здійснювали протягом 10 днів після травми, зважування «сухих» зрізів розраховували процен- крім тих випадків, коли вентрикулярний катетер тний вміст води в головному мозку, як видаляли раніше, наприклад, у випадках, коли ІСР доНгО - (волога маса-суха маса)х10Фдуволога залишалося в нормальних межах (-« 15 мм рт. ст.) маса протягом більше 24 годин. Всього 106 відповідних

Пацієнти з пошкодженням головного мозку зразків СМР і сироватки було одержано у пацієнтів

У дане дослідження були включені 10 пацієн- з травмами, що беруть участь в даному дослі- тів з ізольованою тяжкою СНІ (середній вік - 50: дженні. Всі зразки центрифугували відразу ж після 37 ж 10 років; діапазон 24-57 років; 9 чоловіків і 1 одержання, ділили на рівні частини і заморожува- жінка), доставлені в травматологічне відділення ли при -70"С до проведення аналізу. Кількісне ви-

Опімегейу Нозрйа! 2игісп. Всі пацієнти мали оцінку значення рівнів І--18 в СМР і сироватці проводили по шкалі коми Глазго (505) « 8 після серцево- методом ЕГІЗА, специфічним для людського ІІ--18, легеневої реанімації (Теазааіе апа Уеппей, 1974). застосовуючи комерційно доступні набори (КО

Після КТ-дослідження, всім пацієнтам були вста- зузіетв5, Аріпддоп, ШОК). Як і для аналізу у мишей, новлені інтравентрикулярні катетери для терапев- чутливість ЕГІЗА становила 5 пг/мл, і остаточну тичного дренування цереброспінальної рідини концентрацію 1-18 розраховували на основі сере- (С5Р) при підвищенні внутрішньочерепного тиску дньої оптичної щільності, що визначається в пар- (ІСР) вище за 15 мм рт. ст. Жоден з пацієнтів не них зразках при гасінні довжини хвилі 405 нм. Для одержував лікування стероїдами. Пацієнтів з мно- порівняння рівнів Ї/-13 в СМР між пацієнтами з жинними пошкодженнями, які вимагали втручань з СНІ ї групою контролю, всі концентрації нижче за приводу супутніх пошкоджень грудної клітини, че- межу визначення 5 пг/мл були оцінені як 4,9 пг/мл. ревної порожнини, порожнини таза, спинного моз- Аналіз даних ку або переломів довгих кісток, виключали з дослі-

Статистичний аналіз даних проводили за до- 24 годин (22,1 ж 6,9 нг/мл; п--10) в порівнянні з кон- помогою комерційно доступного програмного за- трольною групою з «псевдо» ін'єкцією через 24 безпечення (5РБЗ5 9,0 для УМіпаохмув "М). Непараме- години (53,6 ж 3,9 нг/мл; р« 0,001). Рівні 1/-18 в тричний критерій Мапп-ЖМ/нпіпеу-0 застосовували «групі ТМЕ» були навіть нижчими, ніж у нелікова- для аналізу даних, що не мають нормального роз- них нормальних мишей (27,7 51,7 нг/мл), хоча в поділу, таких як оцінка по неврологічних шкалах цьому випадку різниця не була статистично досто- (ме і А М55). Непарний і-критерій Ст'юдента за- вірною (р-0,45). стосовували для порівняння інтрацеребральних Приклад 2 концентрацій І/-18 в різних групах мишей і для Ефект від лікування І/-18ВР на неврологічне аналізу різниці у вмісті води в головному мозку у відновлення після травми мишей, лікованих І--18ВР в порівнянні з мишами, З метою вивчити гіпотезу, що інгібування 1-18 яким вводили розчинник. Порівняння рівнів 1-18 у може полегшувати відновлення при пошкодженні людей, як в щоденній СМР в порівнянні з відповід- головного мозку, порівнювали відновлення в різні ними зразками сироватки у пацієнтів з СШ, так і часові точки після однієї ін'єкції І-18ВР. Раніше

СМР при травмі в порівнянні з групою контролю, було показано, що оцінка по шкалі Меигоіодісаї проводили, застосовуючи загальну лінійну модель зЗемегіу Зсоге (М55) через 1 годину після травми для повторних вимірювань АМОМА. Статистично найбільш точно відображає вираженість травми і значущим був прийнятий р-критерій « 0,05. корелює з об'ємом пошкоджених тканин, що видно

Результати при МРТ і при гістологічному дослідженні.

Приклад 1 З метою одержання груп тварин з порівнянною

Інтрацеребральні рівні І--18 м мишей травмою, миші були розподілені на різні групи лі-

Як показано на Ффіг.1, І1/-18 визначався мето- кування після початкової оцінки по шкалі МЗ5 при дом ЕГІЗА в гомогенатах головного мозку у нелі- Ї-І година. Як показано на Фіг.2 (М55 в групі 1-- кованих («нормальних») контрольних мишей лінії 18ВР (квадрати) проти Контролю (кола), обидві

Вб (п-10), із середнім рівнем 27,7 ж 1,7 (-5ЕМІ групи мали схожий початковий рівень М55 (1 год.) нг/мл. В експериментальних групах, стимуляція (7,69 ж 0,3023 і 7,44 ж0,3627 контроль і І--18ВР тільки ефірною анестезією або в поєднанні з «по- відповідно), свідчачи про порівнянну тяжкість пош- милковою» операцією (наприклад, ефірна анесте- кодження. зія і подовжній розріз скальпа) приводили до істот- Оцінка по М55 в більш пізній час (1-7 днів) ви- ного підвищення рівня інтракраніального 1-18 до явила, що тварини, ліковані І/-18ВР. внутрішньо- 48,9 41,1 нг/мл («ефірна» група, п-8) і 54,3 52,7 черевинно (і.р.) мають відносно менше неврологі- нг/мл («псевдо» група, п--13), відповідно (р«0,01 в чне пошкодження, що виходить з оцінки по шкалі порівнянні з «нормальними» мишами, непарний 1- МО5, що досягло достовірності на 7 день після критерій Ст'юдента; Фіг.1). Різниця між тваринами травми (р-0,045). з впливом «ефіру» і «псевдо»-оперованими не Розраховували рівень відновлення, виражений була статистично достовірною (р-:0,16). як А МЗ5() - МЗ5(1 год.) -МЗ5(). Більший рівень Д

У групі травми (п-21) індукція СНІ приводила М5З5 відображає краще відновлення, а нульовий до підвищення рівня 1-18 як в пошкодженій, так і в або негативний М55 відображає відсутність відно- контралатеральній півкулі всередині 4 годин (60,6 влення або погіршення. фіг.3З відображає значення 3,31 59,8 хз 5,0 нг/мл, відповідно) - 24 годин (56,9 А М55 в двох групах. У двох часових точках, обид- 52,11 56,3 з 3,7 нг/мл, відповідно) після травми, ві через 24. години і 7 днів, різниця між середніми однак рівні не були достовірно вищими в порів- значеннями А М55 досягла достовірності. нянні з групами «ефіру» і «помилковою» (р»0,05). Проводили інший експеримент для вивчення,

На відміну від цього, через 7 днів після СНІ ви- чи може бути ефективним лікування І--18ВР, що значили істотне підвищення концентрації інтраце- проводиться на 3-й день після пошкодження. Про- ребрального 1-18 в пошкодженій півкулі в порів- блема часу лікування є критичною, і поки було нянні з тваринами, що зазнали ефірної анестезії показано, що терапія буде ефективною при її по- або псевдооперації (67,6 25,1 нг/мл проти 42,2 ж чатку протягом декількох годин. Після того як було 0,81і45,2 з 0,5 нг/мл відповідно; реО,01), в той час виявлено, що 1-18 сам по собі зростає на 7-й день як рівні І--18 в контралатеральній півкулі не були після травми, і лікування І-18ВР, що дається че- істотно підвищені в порівнянні з даними двома рез 1 годину після травми, дає найбільший ефект контрольними групами (63,2 2 6,0 нг/мл; р-0,06). також на 7 день, було вирішено спробувати ліку-

З метою оцінки ролі ТМЕ, ключового медіатора вати мишей на 3 день після пошкодження. Для запалення в даній моделі травми (Зпопаті еї аї., порівняння, іншу груну лікували І/-188Р через 1 1999), відносно регуляції інтрацеребральних рівнів годину і на З день після пошкодження. Контрольну

І--18 додатковій групі мишей лінії Вб (п-10) було груну обробляли тільки розчинником (носієм). введено і.с.р. 200 нг мишачого рекомбінантного Результати даного експерименту подані на

ТМЕ в 10 мкл стерильного РВ5Б, і їх умертвили че- Фіг.4, з якої стає ясним, що однократне лікування, рез 24 години. Як показано на Фіг.1, «псевдо» ін'є- що проводиться на З день, є таким же ефектив- кція тільки розчинника (п-б) приводила до досто- ним, як і таке, що проводиться через 1 годину піс- вірного підвищення інтрацеребрального 1-18 ля СНІ і знову на З день. протягом 24 годин, в порівнянні з нелікованими Даний експеримент продемонстрував разючий нормальними мишами лінії Вб (53,6 ж 3,9 проти корисний ефект однократного введення 1І--188Р, 27,7 31,7 нг/мл; ре-0,001). що проводиться через 1 годину або З дні після

Введення ТМЕ індукувало істотне зменшення закритого пошкодження голови, на відновлення рівнів І--18:в інтракраніальному відділі протягом після травматичного пошкодження голови в експе- щоденних зразках СМР і сироватки від 10 пацієнтів риментальній моделі на мишах. з тяжкою СНІ протягом 10 днів після травми. Де-

Приклад З мографічні і клінічні дані пацієнтів представлені в

Підвищені рівні І--18 в СМР людей після пош- Таблиці 5. кодження головного мозку Рівні І--18 визначали в

Таблиця 5

Демографічні і клінічні дані пацієнтів з тяжкою СНІ?

Ме пацієнта стать Ос5 со днє Ідіапазоні" середнє Ідіапазоніє 776 | зв | 8 | 1 | ща494Мог2г901 | 167026 78 | зм | З | з | 6989-3293 | 19580171 7779. 374 | З | 4 | ЦБ з7Ір3-75|. | 5732598 ДМ (Контрольна СМР (пе5). 77711111 11111149 4978 | 77777771

СНІ, закрита травма голови

Ь5С5, Сіаздом Оцісоте 5соге (шкала коми Глазго) (Теазда|е апа деппей, 1974). «505 - Сбіаздом Оцісоте 5соге через З місяці після пошкодження; - відсутність симптомів, 4 - помірна втрата працездатності, З - тяжка втрата працездатності, 2 - пе- рсистуючий вегетативний стан, 1 - смерть (Чеппей апа Вопа, 1975).

ЗОМР - спинномозкова рідина. ерівні І--18 нижче за межу визначення 5 пг/мл були розцінені як рівень 4,9пг/мл.

Як показано в Таблиці 5, підоболонкові рівні 1. Айб5спці 5.Р. еї аї, У Мої Віої, 215, 403-410,

І--18 були достовірно підвищені у 9/10 пацієнтів в 1990, Аїївспиі 5.РЕ. єї аї, Мисієїс Асіаз Вез., 25:389- порівнянні з контрольною СМР від 5 пацієнтів без 3402,1997. травми або запального неврологічного захворю- 2. Спаїег, К. Р. еї аї., іп "5Біхін Іпіегпайопаї! вання (р«0,05; повторні вимірювання АМОМА). Зутровійт оп Асііпотусеїйа|ез Віоіоду", АКадетіаї

Тільки у одного пацієнта (Ме10) рівень 1ІІ--18 не був Каїдо, Видарезі, Нипдагу (1986), рр. 45-54. достовірно підвищеним при порівнянні з контроль- 3. Спеп, М., 5. Сопвіапіїпі, М. Ттетроміег, М. ною СМР (р-0,31). Середні рівні і індивідуальні Му/єіпвіоск, апа Е. 5попаті. 1996. Ап ехрептепіа! коливання 1-18 в СМР і сироватці представлені в тоавеї| ої сіозей Неай іпіигу іп тісе: рашторНузіоіоду,

Таблиці 5. пПіворашо!оду, апа содпійме аейсії5. У. Мешгоїгата

Примітно, що максимальні концентрації 1--18 в 13:557-68.

СМР (966 нг/мл) були більш ніж в 200 разів вище у 4. Сопії, СВ., М.У. Саііпдазап, У. Кіт, Н. Кіт, У. пацієнтів з пошкодженням голови, ніж в контроль- Ває, Е. бірзоп, апа Т.Н. доп. 1999. Сийигев5 ої ній групі. Інтрацеребральний рівень 1-18 визнача- азігосуїез апа тісгодіїа ехргез5 іпіепПецйкКкіп-18. Мої. вся методом ЕГІЗА у 9095 всіх зразків СМР в групі Вгаїп Нез. 67:46-52. з травмою, в той час як тільки 4095 контрольних 5. Сопії, В., У. МУ. Ччаппа, С Тіпії, У. Н. 5оп, апа зразків СМР мали інтрацеребральні рівні І--18, що Т. Н. доп. 1997. Іпаисіоп ої іпепегоп-датта визначаються (тобто 24,9 нг/мл). У 8/10 пацієнтів з іпдисіпд Тасіог іп (пе айдгепаї! сопех. 9. ВіоЇ. Спет.

СНІ середні концентрації І--18 були достовірно 272:2035-2037. вище в СМР, ніж в сироватці (р«е0,05; повторні ви- б. СиНапе, А.С, М.О. НаїІ, М.У. Воїймеїї, апа мірювання АМОМА). Однак, у двох пацієнтів (Ме 9, С.М. І певні. 1998. СіІопіпу ої гаї бгаїп іпЇепешкіп-18 10) середні рівні І--18 в сироватці були вище від- СОМА. Мої. Рзуспіаггу 3:362-6. повідних концентрацій в СМР, як показано в Таб- а. Оемегеих у. еї аї., Мисієїс Асіаз ВНев, 12,387- лиці 5. 395,1984.

Дані результати показують, що рівні 1-18 в 7. Віропа, 9.А., НауаКама, М., Воїпуа!ї, О.М., спинномозковій рідині пацієнтів з травматичним 7апаї, Е. апа Каїїп, М. (1997), Машге 388,16514- пошкодженням голови істотно підвищені. Додання 16517.

І/-18ВР може знизити ці підвищені рівні і внаслідок 8. БІО, М.9., Маїпі, А.М., Реідтапп, М., Гопд- цього може надавати корисний ефект на віднов- Еох, А., Спапев, Р., ВІі)Ї, Н., апа Муосау, 9.М., 1994, лення після закритого пошкодження голови, як Ї апсеї 344,1125-1127. показано в Прикладі 2 вище. 9. Рабб5репає!, К., ОО. МієїКе, Т. Вепвсп, РЕ.

Джерела інформації Миепінаизег, М. Неппегісі, М. Кигітоїю, апа 5.

Воз550ї. 1999. Іпіепегоп-у-іпаисіпду Тасіог (ІІ -18) апа 21. ОКатига Н., Мадата К., Котаї5зи Т., іпгепегоп-у іп ійаттаїйогу СМ5 аізеазе5. Мецигоїоду Тапітоїо Т., МиКаїа У., Тапабе Р., АКіїа К., Тогідоє 53:1104-6. К.,, ОкКига Т., РиКида 5., еї аї. ІптТесї Іттип 1995 10. Чапаег, 5., апа сх. 5іоїЇ. 1998. Оібегепйаї Ос63(10):3966-72. іпаисіопо ої 0 іпіейеиКкіп-12, іпіепецйКіп-18, апа 22. Ратеї, Р., Сагка, К.Е., Воппепі, ТР., Юомег, іптепПеикіп-їу сомепйіпд 0 епгуте ТЕМА (іп 5.К., апа 5бітв, У.Е. (1996), 9. ВіоЇ. Спет. 271, 3967- ехрегітепіа! ашоїттипе епсернаітуеїйів ої Ше 3970.

Ї ем/ів гаї. У. Меигоїттипо). 91:93-9. а. Реагзоп МУ.А., Меїйоаз іп Епгутоіоду, 183, 11. І апсеї 1975 Маг 1;(7905):480-4. Уеппей В., 63-99, 1990.

Вопа мМ. Б. Реаггоп М/.А. апа Гіртап 0.., Ргос Маї Асай 12. Ігакі, К. (1978) Урп. 9. Васієгіо!. 33:729-742). Зсі ОБА, 85,2444-2448,1988. 13. Кіт 5.Н., Еїбепвієїп М., Негпіком Ї., 23. Ріїпл, М., апа О.К. Напізсп. 1999. Мигіпе

Рапіцагі б., Моміск О., Кибіпвівїіп М., Оіпагейо С А. тісгодіїа! сеї ргодисе апа гезропа (ю іпіепецйкКіп-18.

Зігисішга! гедцігетепів ої віх пайштгайу оссигіпд У. Мешоснет. 72:2215-8. івоТогт5 ої Ше 11-18 Бріпаїпу ргоїеїп ю іппіріїє 1-18. 24. у) Сіїп Іпмеві 1997 Рер. Г99(3):469-74 Воїшйе

Ргос Маї! Асай 5сі ОБА 2000; 97:1190-1195. Н., УЧепкіпз М.А., Сореїапа М.с.,КоївН. 14. Коззтапп, Т., Р.Р. еіапеї, Р.М. Геплііпдег, 25. Зепептеї, О., А. НКадпираїйні, М. МаКатига,

Н. Веді, АМ/. Бибзв, 0. Тгепіг, сх. спад, апа М.С. К.Е. Заайтап, 9.0). ТгоіапожеКкі, Е. Меидебанцег",

Могдапіі-Коззтапп. 1997. ІпіепешКіп-8 геІєазеай іп М.М. Маїіпо, апа 1999. Оінегепіа! асше апа спгопіс

Ше сегергозріпа! Яшіа акег Ббгаїп іпіигу їз аззосіасей гезропзе5 ої Штог песговзів Тасіог-дейсіепі тісе юЮ м ріоса бБгаїп-ратієг дувїшпсійоп апа пегуе дгоУли ехрегітепіаї! ргаїп іп)игу. Ргос. Маї). Асад. сі. ОБА

Тасіог ргодисіоп. 9. Сегер. Віоой Ріом/ Меїар. 96:8721-6. 17:280-9. 26. Зпопаті, Е., І. Схїіпіз, апа 9.М. НаПепреск. 15. Кпідні О.М., Тип Н., Ге у., Зіведеї! 5., Зпеаїу 1999. Юпмаї гоїє ої шШтог песговів Тасюг аїІрна іп бгаїп

О., Меропоцдп М., зсаПоп В., Мооге М.А., Міїсек У., іп)шу. Суюкіпе Сгоумп Расіог Нем. 10:119-30.

Оаддаопа Р., ек аі. Сопвігосйоп апа -іпінаї! 27. Зпопаті, Е; Вей-Маппаї Е., Ногом/ї2 М; спагасіегігайоп ої а тоизе-питап спітегіс апіі-тМЕ Копеп ВА (1997): у. Сегер. Віосой Ріом/Меїарб. апійроду. Мої Іттипої 1993 Мом 30:16 1443-53. 17,1007-1019. 16. МаїївгемуєКкі, С. А., Т. А. Заю, Т. Мапаєп 28. Теаздааіе сх, Уеппей В. Гапсеї 1974 дм

Во5, 5. ММацди, 5. К. ЮОомег, у. 5іаск, М. Р. 13:2(7872):81-4.

ВесКтапп, апа К. Н. Старвзівєїп. 1990. Суюкіпе 29. мапнеї Р.РЕ., Зпопаті Е., Хошпіз Е.М., Капуа гесеріог: апа В сеї! псійопв. І. Несотрбіпапі воЇШшріє К., Око М.І., І епгІїпдег Р.М., Схговієап М.В., Ендзіег гесеріог: зресіїсайну іппірії 1 -1- апа І -4-іпдисеа В НР., Тгтепі2 О., Коззтапп Т., Могдапіі-Коззтапп сеї! асіїмійев іп міго. 9. Іттипої!. 144:3028-3033. М.С. 9уУ. Сегер. Віоой Біомж/ Меїар. 2000 Реб; 17.Місанеї М. 9., т. ОпіБиКі, К. Коппо, БК. 29(2):369-80.

Тапаре, 5. ОвбНіо, М. Матра, Т. Тапітою, К. 30. О5піо 5., Матра М., ОКига Т., Найогі К.,

Тогпідоє, М. ції, М. ІКеда, 5. Рикида, апа м. МиКада У.5 АКіїа К., Тапаре Р., Копівпі К., МісаїІеї

Кигітоїю. 1996. Іпіепегоп-датта-іпдисіпд Тастог М., Еції М., Тогідое К., Тапітоїо Т., РикКида 5., еппапсе5 Т ПпПеірег 1 суюКіпе ргодисіоп Бу Ікеда М., Окатиган., Кигітою М. ) Іттипо!ї 1996 зітшиагеа питап Т сеїІв: зупегдізт м/йй іпіегіецикіп- Упп 1; 156(11):4274-9. 12 юг іпіепегоп-датта ргодисіоп. Еиг-9О-Іттипої 31. М/пееєїег, А.О., А.С. Сцінапе, М.О. Наї!, 5. 26:1647-51 ізвп: 0014-2980. Ріскегіпд-Вгомуп, М.О. НоїйнжеїЇ, апа (с5.М. І ипезвні. 18. Могдапі-Коззтапп, М.С, Р.М. І епліІїпдег, М. 2000. Оеїесіоп ої (Ше іпіепеиКіп-18 ГТатіу іп гаї

Напв, Р. 5іанеї, Е. Сзика, Е. Аттапп, В. 5іаскег, Бгаіп Бу АТ-РСК. Мої. Вгаїп Кев. 77:290-3.

О. Тгепі7, апа т. Козб5тапп. 1997. Ргодисіоп ої 32. МНаієп, М.У., Т.М. Сапов, Р.М. Коспапек, суїокіпез ТоПоУлпо Ббгаійп іпішгу: Бепеїїсіа! апа 5.А. М/ізпіємуекі, М.9У. ВеїЇ, А.5. Сіак, 2000. деїІегегіои5 ог Ше аатадей їіз5це. Мої. Рзуспіайу ІпсепПецйКкіп-8 ів іпстеазей іп сегергозріпа! йЯшїй ої 2:133-6. спійгеп йно земеге пеай іп)игу. Сиї. Саге Меа. 19. Макатига К., Окатига Н., У/ада М., Мадага 28:929-34.

К., Татига Т. Іптесі Іттип 1989 Реб; 57(2):590-5. 33. Мо5пітоїо Т., Такеда, К., Тапака, Т., 20.Моміск, 0., Кіт, 5.-Н., Бапшаглі, с, Вегпіком, Опкизи, К., Казпіжатига, 5., ОКатига, Н., АкКіга, 5.

Г., ОіпагейПо, С, апа Вибіпвієїп, М. (1999). Іттипку апа МакКкапівпі, К. (1998), 9У. Іттипої. 161, 3400- 10, 127-136. 3407.

4. Й і 83 роті ЩЕ | п раханізий молок « З ес жк н МА зіха півкуля я Ї . пкт" ри СОЯ праву лівкуля є І -Т

Х І я Х з ФО...

Ж е Ж зх Шк «ЩІ жи! ж

КЗ р Ко 3 і) 4 хв и ж МОЗ я З : 5 е-Щ ши:

З ж Х 5 й й Я се а о

З і ий А й Б це щу заїод ба сод тд зі ЕЕ ЩЕ

КУ ОБ го МЕДКИА У в щу Час після закритої травма голови

Е Н бе ТАК ГО К А - Гб ; ій ЖІ В о ча те . . 22 з ш ш Фіг з ій 2 ї 5 ЗУ фіг. 3 0-2 да А Я М в Ай сво в 00005 паніні ги З ЕВ ! питні ще Нв Зк на Кк Пн кю фр дтттнннн - Х шт пе я о лююжні

Я І Тит шт ОО ніде Дхі лою,

Ен ! . Ї тт рення

Фі фронт Т ; і рот

Кеди тенет нн й Міга жд Ов їх авїх І я і Й Я я 7 нн

Я 2 й поко: 5 - т г 4 ев кОВтрать, тт ку й

ЕМ я -

І.

З б ітод 2агод Тв гад З дНів

Фіг.

Комп'ютерна верстка Д. Шеверун Підписне Тираж 26 прим.

Міністерство освіти і науки України

Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна

ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601