NO331882B1 - Anvendelse av IL-18 inhibitorer til a behandle eller forhindre CNS-skader - Google Patents

Abstract

Det er beskrevet en oppfinnelse som angår anvendelse av inhibitorer av IL-18 til fremstilling av et legemiddel for behandling og/eller forhindring av skade i det sentralnervøse system, særlig treumatisk hodeskade.

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår området patologiske tilstander i hjernen. Mer spesifikt angår det anvendelse av en inhibitor av IL-18 for fremstilling av medikamenter til behandling av traumatisk hjerneskade.

I 1989 ble en endotoksinindusert serumaktivitet som induserte interferon-y (IFN- y) oppnådd fra musemiltceller beskrevet (Nakamura et al., 1989). Denne serumaktiviteten funksjonerte ikke bare som et direkte induksjonsmiddel for IFN- y men heller som et samstimulerende middel sammen med IL-2 eller mitogener. Et forsøk på å rense aktiviteten fra post-endotoksin museserum ga et tilsynelatende homogent protein på 50-55 kDa. Siden andre cytokiner kan virke som samstimulerende midler for IFN- y produksjon, antydet problemet med å nøytralisere antistoffer til IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 eller TNF for å nøytralisere serumaktiviteten at det var en distinkt faktor. I 1995 demonstrerte de samme forskere at det endotoksininduserte samstimulerende middel for IFN- y produksjon var til stede i ekstrakter fra lever hos mus forbehandlet med P. acnes (Okamura et al., 1995). I denne modellen ekspanderte den hepatiske makrofagpopulasjonen (Kupffer-celler) og i disse musene ble en lav dose av bakterielt lipopolysakkarid (LPS) som i ikke-forbehandlede mus ikke er letal, letal. Faktoren kalt IFN- y-induserende faktor (IGIF) og senere betegnet interleukin-18 (IL-18) ble renset til homogenitet fra 1200 g P. acnes-behandlede muselevere. Degenererte oligonukleotider avledet fra aminosyresekvenser fra renset IL-18 ble brukt til å klone en murin IL-18 cDNA. IL-18 er et 18-19 kDa protein på 157 aminosyrer som ikke har noen klar likhet med noe peptid i databasene. Budbringer RNA for IL-18 og interleukin-12 (IL-12) blir lett detektert i Kupffer celler og aktiverte makrofager. Rekombinant IL-18 induserer IFN- y kraftigere enn IL-12, sannsynligvis gjennom en separat rute (Micallef et al., 1996). På samme måte som den endotoksininduserte serumaktivitet induserer IL-18 ikke IFN- y i seg selv, men funksjonerer primært som et samstimulerende middel med mitogener eller IL-2. IL-18 forsterker T-celleproliferasjon, tilsynelatende gjennom en IL-2-avhengig rute, og forsterker Thl cytokinproduksjon in vitro og utviser synergisme når den kombineres med IL-12 i form av forsterket IFN- y produksjon (Maliszewski et al., 1990).

Etter at den murine form var klonet ble den humane cDNA-sekvens for IL-18 rapportert i 1996 (Ushio et al., 1996).

Ved å klone IL-18 fra affiserte vev og undersøke IL-18 genekspresjon ble det funnet et tett slektskap av dette cytokinet med en autoimmunsykdom. De ikke-fete diabetiske (NOD) mus utviklet spontant autoimmun insulitis og diabetes, som kan akselereres og synkroniseres ved en enkel injeksjon av syklofosfamid. IL-18 mRNA ble demonstrert ved revers transkriptase PCR i NOD-mus pankreas under tidlige stadier av insulitis. Nivåer av IL-18 mRNA øket hurtig etter

syklofosfamidbehandling og gikk foran en heving i IFN- y mRNA, og påfølgende

diabetes. Av interesse er det at disse kinetikkene etterlikner den til IL-12-p40 mRNA, som resulterer i en tett korrelasjon av individuelle mRNA-nivåer. Kloning av IL-18 cDNA fra pankreas RNA etterfulgt av sekvensering viste identitet med IL-18 sekvensen klonet fra Kupffer-celler og in vivo pre-aktiverte makrofager. Også NOD-musemakrofager responderte til syklofosfamid med IL-18 genekspresjon mens makrofager fra Balb/c mus behandlet i parallell ikke gjorde dette. Derfor er IL-18 ekspresjon unormalt regulert i autoimmune NOD-mus og tett assosiert med utvikling av diabetes (Rothe et al., 1997). IL-18 spiller en potensiell rolle ved immunregulering eller i inflammasjon ved å forhøye den funksjonelle aktiviteten til Fas-liganden på Thl-celler (Conti et al., 1997). IL-18 ble også uttrykt i nyrebarken og kan derfor være en sekrert nevroimmunmodulator som spiller en viktig rolle ved å dirigere immunsystemet etter en stressende erfaring (Chater, 1986).

In vivo blir IL-18 dannet ved spalting av pro-IL-18 og dens endogene aktivitet synes å forklare IFN- y produksjonen i P. acnes og LPS-mediert letalitet. Modent IL-18 blir produsert fra sin forløper ved IL-ip konverterende enzym (IL-1 p konverterende enzym, ICE, caspase-1). IL-18 reseptoren består av minst to komponenter som samarbeider ved ligandbinding. Høy- og lavaffinitetsbindingsseter for IL-18 ble funnet i murin IL-12 stimulerte T-celler (Yoshimoto et al., 1998), noe som antyder et multippelt kjedereseptorkompleks. To reseptorunderenheter er blitt identifisert så langt, hvorav begge tilhører IL-1 reseptorfamilien (Parnet et al., 1996). Signaltransduksjonen til IL-18 omfatter aktivering av NF-kB (DiDonato et al., 1997).

Nylig er et oppløselig protein som har en høy affinitet for IL-18 blitt isolert fra human urin, og det humane og muse cDNA ble beskrevet (Novick et al., 1999; WO 99/09063). Proteinet er blitt betegnet IL-18 bindende protein (IL-18BP). IL-18BP er ikke det ekstracellulære domenet av én av de kjente IL-18 reseptorene men et sekrert naturlig sirkulerende protein. Det tilhører en ny familie av sekrerte proteiner. Familien inkluderer ytterligere flere Poxviruskodede proteiner som har en høy homologi til IL-18BP (Novick et al., 1999). IL-18BP er konstitutivt uttrykt i milt, tilhører immunoglobulin superfamilien og har en begrenset homologi til IL-1 type II reseptor. Dets gen ble lokalisert på det humane kromosom 1 lql3 og intet ekson som koder for et transmembrandomene ble funnet i en 8,3 kb genomisk sekvens (Novick et al., 1999).

Fire humane og to muse-isoformer av IL-18BP, som resulterer fra mRNA-spleising og funnet i forskjellige cDNA-bibliotek har blitt uttrykt, renset og vurdert for binding og nøytralisering av IL-18 biologiske aktiviteter (Kim et al., 2000). Human IL-18BP isoform a (IL-18BPa) utviste den største affinitet for IL-18 med en hurtig på-hastighet, en langsom av-hastighet, og en dissosiasjonskonstant (K(d)) på 399 pM. IL-18BPc deler Ig-domenet til IL-18BPa med unntagelse av de 29 C-terminale aminosyrer; (K(d)) av IL-18BPc er ti ganger mindre (2,94 nM). Ikke desto mindre nøytraliserer IL-18BPa og IL-18BPc IL-18 > 95 % i et molart overskudd på 2. IL-18BPb og IL-18BPd isoformer mangler et fullstendig Ig-domene og mangler evnen til å bindes til eller nøytralisere IL-18. Murin IL-18BPc og IL-18BPd isoformer som har det identiske Ig-domenet nøytraliserer også mer enn 95 % av murin IL-18 ved et molart overskudd på 2. Murint IL-18BPd som deler et felles C-terminalt motiv med humant IL-18BPa nøytraliserer imidlertid også humant IL-18. Molekylær modellering identifiserte et stort blandet elektrostatisk og hydrofobt bindingssete i Ig-domenet til IL-18BP, som kunne forklare dets høye affinitetsbinding til liganden (Kim et al., 2000).

Teknikkens stand er også tilkjennegi ort i Stoll G. et al., "Cytokines in CNS disorders: neurotoxicity versus neuroprotection". J. Neural Transm. 2000, vol.59, side 81-89, som beskriver uttrykket av cytokiner ved ulike forstyrrelser i CNS og viser hvordan cytokinene er involvert i T-cellemedierte responser. WO 9909063 Al beskriver at IL-18-bindende proteiner kan benyttes for å modulere eller blkere den biologiske aktiviteten til IL-18. WO 9946248 Al beskriver at ICE kan benyttes for å behandle bl.a. IFN-y-medierte sykdommer slik som cerebral iskemi.

Traumatisk hjerneskade (TBI) også enkelt kalt hodeskade, eller lukket hodeskade (CHI), betegner en skade i sentralnervesystemet hvor det er skade på hjernen forårsaket av et ytre slag på hodet. Det skjer for det meste ved bil- eller sykkelulykker, men kan også skje som et resultat av nesten drukning, hjerteanfall, slag og infeksjoner. Denne type av traumatisk hjerneskade ville vanligvis resultere på grunn av mangel på oksygen eller blodtilførsel til hjernen og kan derfor refereres til som en "anoksisk skade".

Lukket hodeskade skjer når det er et slag mot hodet som i et biluhell eller et fall. I dette tilfellet treffer skallen en stasjonær gjenstand og hjernen, som er innenfor skallen, snur og vris på sin akse (hjernestammen), som forårsaker lokalisert og utbredt skade. Hjernen, en myk masse omgitt av væske som tillater den å "flyte", kan også slå tilbake mot skallen og resultere i ytterligere skade.

Det kan være en periode av bevisstløshet umiddelbart etter traumet som kan vare i minutter, uker eller måneder. På grunn av vridning og tilbakeslag får den traumatisk hjerneskadede pasienten vanligvis skader eller skrammer i mange deler av hjernen. Dette blir kalt diffus skade, eller "ikke-missil skade" på hjernen. Typene av hjerneskade som skjer ved ikke-missilskader kan klassifiseres enten som primære eller sekundære.

Primær hjerneskade skjer på skadetidspunktet hovedsakelig på impaktstedet, særlig når en skallefraktur er tilstede. Store kvestelser kan være assosiert med en intracerebral blødning, eller fulgt av kortikale lacerasjoner. Diffuse aksonskader skjer som et resultat av skjærekrefter eller strekktensjoner på nevronale utspring fremstilt av rotasjonsbevegelser av hjernen i skallen. Det kan være små blødningslesjoner eller diffus skade på aksoner som bare kan oppdages mikroskopisk.

Sekundær hjerneskade skjer som et resultat av komplikasjoner som utvikles etter skadeøyeblikket. De inkluderer intrakranial blødning, traumatisk skade på ekstracerebrale arterier, intrakranial brokk, hypoksisk hjerneskade eller meningitt. En "åpen hodeskade" er et synlig angrep på hodet og kan resultere fra et kulehullsår, en ulykke eller et objekt som går gjennom skallen og inn i hjernen ("missilskade på hjernen"). Denne type hodeskade skader mest sannsynlig et spesifikt område i hjernen.

Såkalt "mild hjerneskade" kan skje uten tap av bevissthet og muligens bare en omtåket følelse eller forvirret tilstand som varer kort tid. Skjønt medisinsk pleie som gis kan være minimal, kan personer med hjerneskade uten koma oppleve symptomer og svekkelser lik de som oppleves av overlevende etter en komaskade.

Etter traumet skjer det forandringer i hjernen som krever overvåkning for å forhindre ytterligere skade. Hjernens størrelse økes ofte etter en alvorlig hodeskade. Dette kalles hjernesvelling og skjer når det er en økning i mengde av blod til hjernen. Senere i sykdommen kan vann oppsamles i hjernen og dette kalles hjerneødem. Både hjernesvelling og hjerneødem resulterer i overtrykk i hjernen kalt intrakranialt trykk ("ICP").

Koma er den forlengede periode av bevisstløshet umiddelbart etter en traumatisk hodeskade.

Det er flere nivåer av koma. Komanivåer kan måles ved en progresjon av reaksjoner hos den hodeskadede person. I akuttfasen til en hodeskade blir "Glasgow Coma Scale" brukt. Ved at pasienten bedrer seg eller stabiliseres blir "Ransho Los Amigos Scale" brukt som måler nivåer av kognitiv (forståelse og resonnement) tenking. Hjerneskade resulterer ofte i pågående svakhet, så som post-traumatisk epilepsi, pågående vegetativ tilstand, eller post-traumatisk demens.

Ryggmargsskade er en annen type av CNS-skade. Ryggmargsskader utgjør hoveddelen av sykehusinnleggelser for paraplegi og tetraplegi. Over 80 % skjer som et resultat av veiulykker. To hovedgrupper av skade er anerkjent klinisk: åpne skader og lukkede skader.

Åpne skader forårsaker direkte traumer i ryggmargen og nerverøttene. Perforerende skade kan forårsake utstrakt ødeleggelse og blødning. Lukkede skader utgjør de fleste ryggmargsskader og er vanligvis assosiert med et brudd/dislokasjon av ryggsøylen som vanligvis kan vises radiologisk. Skade på ryggmargen avhenger av utstrekningen av benskader og kan vurderes i to hovedtrinn: primær skade som er kontusjoner, nervefiberoverrivninger og blødningsnekrose, og sekundær skade som er ekstraduralt hematom, infarkt, infeksjon og ødem.

Senvirkninger av margskade inkluderer oppadstigende og nedadstigende anterograd degenerering av skadede nervefibre, post-traumatisk syringomyeli og systemiske virkninger av paraplegi, så som infeksjoner i urintraktus og bryst, trykksår og muskelatrofi.

Patologien i traumatisk hjerneskade er meget kompleks og fremdeles dårlig forstått. Forskningsanstrengelser i det siste tiår har satt oppmerksomheten på en viktig rolle av cytokiner frigjort systemisk og lokalt i det intratekale rom etter hjerneskade, og en dobbel effekt av pro-inflammatoriske cytokiner, så som TNF, IL-6 eller IL-8, ble hypotetisert basert på funn av tidsavhengige gunstige og skadelige virkninger av disse mediatorer (Morganti-Kossmann et al., 1997; Kossmann et al., 1997; Shohami et al., 1999; Scherbel et al., 1999; Whalen et al., 2000). Som beskrevet ovenfor er IL-18 et nylig oppdaget cytokin i IL-1-familien. Senere undersøkelser har vist at IL-18 er konstitutivt uttrykt i CNS hos mus, rotter og mennesker in vivo (Culhane et al., 1998; Jander og Stoll, 1998; Prinz et al., 1999; Fassbender et al., 1999; Wheeler et al., 2000) så vel som i primære kulturer av astrocytter og mikroglier, men ikke nevroner, in vitro (Conti et al., 1999). Økede IL-18 nivåer ble oppdaget i cerebrospinalvæsken (CSF) hos pasienter med inflammatoriske CNS-sykdommer, så som bakteriell meningitt og viral meningoencefalitt, men ikke i CSF hos pasienter med multippel sklerose (MS) (Fassbender et al., 1999). I kontrast til funnet med generell lav intratekal IL-18 nivåer i MS-pasienter, ble øket IL-18 mRNA-ekspresjon demonstrert i ryggmargen til Lewis-rotter med eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE), dyremodellen for MS (Jander og Stoll, 1998). Ekspresjon og funksjonell betydning av IL-18 i nevrotraume er ikke blitt undersøkt inntil nå.

Den foreliggende oppfinnelse angår den patofysiologiske rollen til IL-18 i CNS-sykdommer. Den er basert på det funn at behandling av mus med inhibitorer av IL-18, enten 1 time eller 3 dager etter eksperimentell lukket hjerneskade (CHI), resulterer i en forbedret tilheling og svekket utstrekning av hjerneskade sammenlignet med kontrolldyr. Oppfinnelsen angår derfor anvendelse av en IL-18 inhibitor til fremstilling av et legemiddel for behandling og/eller forhindring av traumatisk hjerneskade.

Anvendelse av kombinasjoner av en IL-18-inhibitor med et interferon og/eller TNF og/eller inhibitorer av inflammasjon og/eller antioksidanter er også tilveiebrakt i henhold til oppfinnelsen. Fig. 1 viser et histogram som illustrerer serumnivåene av intracerebral IL-18 (ng/ml) i hele hjernen (skravert), i den venstre hemisfære (sort) eller i den høyre hemisfære (grå) under forskjellige betingelser. Fig. 2 viser en utvikling av NSS (Neurological Severity Score) målt 1 time (h), 24 h, 72 h eller 168 h etter et traume, enten med 50 ug IL-18BP administrert i.p. 1 time etter traumet (firkanter), eller med injeksjon av bare vehikkelen (kontroll, sirkler). Fig. 3 viser ANSS målt 24 h, 72 h eller 168 h etter traumet, enten med 50 ug IL-18BP administrert i.p. ved 1 h etter traumet (firkanter), eller med injeksjon av bare vehikkelen (kontroll, sirkler). Fig. 4 viser ANSS målt 1 h, 24 h, 3 dager (d), 7 d eller 14 d etter traumet, enten med 50 (j,g IL-18BP administrert i.p. enten som en enkel dose 3 dager etter traumet (ruter) eller med en dobbelt dose ved 1 h og 3 d etter traumet (firkanter) eller injeksjon av bare vehikkelen (kontroll, triangel).

Den foreliggende oppfinnelse er basert på funnet av en statistisk signifikant gunstig virkning av en IL-18 inhibitor på restitusjon fra hjerneskade i en murin modell med lukket hjerneskade. I henhold til foreliggende oppfinnelse ble det ytterligere funnet at IL-18 oppreguleres i hjernen og cerebrospinalvæske etter traumatisk hjerneskade, noe som angir at dette proinflammatoriske cytokinet spiller en viktig rolle i patogenesen til hjerneskade.

Derfor angår oppfinnelsen anvendelse av en IL-18 inhibitor til fremstilling av et legemiddel til behandling og/eller forhindring av traumatisk hjerneskade.

Uttrykket "sentralnervøs systemskade" eller "CNS-skade" betyr her enhver skade på hjernen eller ryggmargen uten hensyn til alder ved igangsetting eller den underliggende årsak. Den underliggende årsak kan f.eks. være mekanisk eller en infeksjon. CNS-skade og dens kliniske symptomer og implikasjoner er blitt beskrevet i detalj i foreliggende beskrivelses innledning. CNS-skade inkluderer f.eks. traume eller enhver annen skade av hjernen eller ryggmargen og den kan også kalles nevrotraume.

Hjerneskade kan f.eks. inkludere eller resultere i enhver eller flere av de følgende: 1. Oppmerksomhetssvekkelse; 2. Kognitiv svekkelse; 3. Språksvekkelse; 4. Hukommelsessvekkelse; 5. Ledningslidelse; 6. Motorisk lidelse; 7. Enhver annen nevrologisk dysfunksjon.

Ryggmargsskade kan f.eks. resultere i paraplegi eller tetraplegi.

Komplikasjoner eller senvirkninger av CNS-skade kan også behandles og/eller forhindres i henhold til foreliggende oppfinnelse. Komplikasjoner og senvirkninger av hjerneskader er blitt beskrevet ovenfor i foreliggende beskrivelses innledning. De inkluderer men er ikke begrenset til koma, meningitt, post-traumatisk epilepsi, post-traumatisk demens, degenerering av nervefibre, eller post-traumatisk syringomyeli, eller blødning f.eks.

Betegnelsen "behandle" og "forhindre", skal forstås som delvis eller totalt forhindre, inhibere, svekke, forbedre eller reversere én eller flere sykdommer eller årsaker til CNS-skade, så vel som symptomer, sykdommer eller komplikasjoner som følger CNS-skade. Ved "behandling" av traumatisk hjerneskade blir stoffene i henhold til oppfinnelsen gitt etter utbruddet av sykdommen, "forhindring" angår administrering av stoffene før tegnene på sykdom kan observeres hos pasienten.

Behandling av traumatisk hjerneskade er foretrukket i henhold til foreliggende oppfinnelse. Foretrukket, for å behandle traumatisk hjerneskade, blir IL-18 inhibitoren administrert så raskt som mulig etter traumatisk hjerneskade, f.eks. innenfor første timen etter skaden. Imidlertid, som vist i eksemplene nedenfor, ble 1 IL-18 inhibitor vist å utvise sin gunstige virkning på hjerneskade til og med når den ble administrert tre dager etter at hjerneskaden skjedde. Derfor for å behandle traumatisk hjerneskade er det foretrukket å administrere IL-18 inhibitoren innen 3 dager etter skaden.

Betegnelsen "inhibitor for IL-18" i forbindelse med foreliggende oppfinnelse betegner ethvert molekyl som modulerer IL-18 produksjon og/eller virkning på en slik måte at IL-18 produksjonen og/eller virkningen blir hemmet, redusert eller delvis, hovedsakelig eller fullstendig forhindret eller blokkert. Betegnelsen "IL-18 inhibitor" er ment å omfatte inhibitorer av IL-18 produksjon så vel som inhibitorer av IL-18 virkning.

En inhibitor av produksjonen kan være ethvert molekyl som negativt påvirker syntesen, prosesseringen eller modningen av IL-18. Inhibitorene vurdert i henhold til oppfinnelsen kan f.eks. være undertrykkere av genekspresjon av interleukin IL-18, antisens-mRNA som reduserer eller forhindrer transkripsjon av IL-18 mRNA eller som fører til degradering av mRNA, proteiner svekket med hensyn på korrekt folding, eller delvis eller hovedsakelig forhindring av sekresjon av IL-18, proteaser som degraderer IL-18, når den er blitt syntetisert, inhibitorer av proteaser som spalter pro-IL-18 for å danne modent IL-18, så som inhibitorer av caspase-1 og lignende.

En inhibitor av IL-18 virkning kan f.eks. være en IL-18 antagonist. Antagonister kan enten bindes til eller sekvestere IL-18 molekylet i seg selv med tilstrekkelig affinitet og spesifisitet, til delvis eller hovedsakelig å nøytralisere IL-18 eller IL-18 bindesetene som er ansvarlig for IL-18's binding til dets ligander (så som f.eks. til dens reseptor). En antagonist kan også inhibere IL-18 signaliseringsrute, som blir aktivert i cellene ved at IL-18 bindes til sin reseptor.

Inhibitorer av IL-18 virkning kan også være oppløselige IL-18 reseptorer eller molekyler som hermer reseptorene, eller midler som blokkerer IL-18 reseptorene, eller IL-18 antistoffer, så som polyklonale eller monoklonale antistoffer, eller ethvert annet middel eller molekyl som forhindrer binding av IL-18 til dets mål, og således redusere eller forhindre trigging av de intra- eller ekstracellulære reaksjoner mediert av IL-18.

I en foretrukket utforming av foreliggende oppfinnelse er inhibitoren til IL-18 valgt fra inhibitorer av caspase-1 (ICE), antistoffer rettet mot IL-18, antistoffer rettet mot enhver av IL-18 reseptorunderenheter, inhibitorer av den IL-18 signaliserende rute, antagonister av IL-18 som konkurrerer med IL-18, eller bindes til og blokkerer IL-18 reseptoren, og IL-18 bindende proteiner, isoformer, muteiner, fusjonerte proteiner, funksjonelle derivater, aktive fraksjoner eller sirkelpermuterte derivater eller salter derav.

Betegnelsen "IL-18 bindende proteiner" er her synonymt med "IL-18BP". Den

omfatter IL-18 bindende proteiner som definert i WO 99/09063 eller i Novick et al., 1999, inkludert spleisevarianter og/eller isoformer av IL-18 bindende proteiner, som definert i Kim et al., 2000. Spesielt er humane isoformer a og c av IL-18BP nyttig i henhold til foreliggende oppfinnelse. Proteinene som er nyttige i henhold til foreliggende oppfinnelse kan være glykosylerte eller ikke-glykosylerte, de kan være avledet fra naturlige kilder, så som urin, eller de kan fortrinnsvis være produsert rekombinant. Rekombinant ekspresjon kan utføres i prokaryote ekspresjonssystemer så som E. coli eller i eukaryote og fortrinnsvis i pattedyrekspresjonssystemer. En cellelinje spesielt vel egnet for IL-18 inhibitorer i henhold til foreliggende oppfinnelse er den kinesiske hamster ovarie (CHO) celle.

Rekombinant produksjon av IL-18 inhibitoren, når den er rekombinant uttrykt i pattedyrceller eller cellelinjer, kan fortrinnsvis utføres i serumfritt cellekulturmedium.

Betegnelsen "muteiner" refererer til analoger av IL-18BP, eller analoger av en viral IL-18BP, i hvilke én eller flere av aminosyrerestene til et naturlig IL-18BP eller viralt IL-18BP er erstattet med forskjellige aminosyreresiduer, eller er fjernet, eller én eller flere aminosyreresiduer blir tilsatt til den naturlige sekvensen til en IL-18BP, eller en viral IL-18BP, uten betydelig reduksjon av aktiviteten til de resulterende produkter sammenlignet med villtype IL-18BP eller viral IL-18BP. Disse muteiner blir fremstilt ved kjente syntese- og/eller ved setestyrte mutageneseteknikker, eller enhver annen kjent teknikk egnet dertil.

Ethvert slik mutein har fortrinnsvis en sekvens av aminosyrer tilstrekkelig dupliserende med den til IL-18BP, eller tilstrekkelig dupliserende til en viral IL-18BP, slik at den har hovedsakelig lik aktivitet til IL-18BP. En aktivitet til IL-18BP er dens evne til å binde IL-18. Så lenge muteinene har hovedsakelig bindingsaktivitet til IL-18 kan de anvendes til rensing av IL-18, så som ved hjelp av affinitetskromatografi og således vurderes å ha hovedsakelig lik aktivitet til IL-18BP. Således kan det bestemmes om ethvert gitt mutein har en aktivitet hovedsakelig lik den til IL-18BP ved hjelp av rutineeksperimenter som omfatter å utsette et slikt mutein, f.eks. til et enkelt sandwich-konkurranseassay for å bestemme om det bindes eller ikke bindes til en egnet merket IL-18, så som radioimmunoassay eller ELISA-assay. Enkle funksjonelle assayer for å vurdere den biologiske aktiviteten til IL-18BP ble beskrevet i detalj i WO 99/09063, f.eks. i eksempel 2 (binding til IL-18 som vurdert ved tverrbinding) eller 5 (inhibisjon av IL-18 indusert INF-gamma-induksjon i mononukleære blodceller).

I en foretrukket utforming har ethvert slikt mutein minst 40 % identitet eller homologi med sekvensen til enten et IL-18BP eller en viralt kodet IL-18BP homolog. Mer fortrinnsvis har det minst 50 %, minst 60 %, minst 70 %, minst 80 % eller fortrinnsvis minst 90 % identitet eller homologi dertil.

Muteiner av IL-18BP polypeptider eller muteiner av viralt IL-18BP, som kan anvendes i henhold til foreliggende oppfinnelse, eller nukleinsyrer som koder derfor, inkluderer et endelig sett av hovedsakelig korresponderende sekvenser som substitusjonspeptider eller polynukleotider som rutinemessig kan oppnås av en med vanlig kunnskap på området, uten unødvendig eksperimentering, basert på læren og veiledningen presentert i denne søknaden.

Muteiner i henhold til foreliggende oppfinnelse inkluderer proteiner kodet av en nukleinsyre, så som DNA eller RNA, som hybridiseres til DNA eller RNA, som koder IL-18 inhibitoren i henhold til foreliggende oppfinnelse, under moderate eller meget stringente betingelser. Betegnelsen "stringent betingelse" refererer seg til hybridisering og påfølgende vaskingsbetingelser, som de med vanlig kunnskap på området konvensjonelt refererer til som "stringent". Se Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 og 6.4 (1987, 1992), og Sambrook et al. (Sambrook, J.C., Fritsch, E.F., og Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Uten begrensning inkluderer eksempler på stringente betingelser vaskebetingelser 12-20°C under den kalkulerte Tm til hybridet under undersøkelse i, f.eks. 2 x SSC og 0,5 % SDS i 5 min., 2 x SSC og 0,1 % SDS i 15 min.; 0,1 x SSC og 0,5 % SDS ved 37° i 30-60 min. og deretter, en 0,1 x SSC og 0,5 % SDS ved 68°C i 30-60 min. De med ordinær kunnskap på dette området forstår at stringente betingelser også avhenger av lengden av DNA-sekvensene, oligonukleotidprobene (så som 10-40 baser) eller blandede oligonukleotidprober. Hvis blandede prober blir brukt er det foretrukket å bruke tetrametylammoniumklorid (TMAC) istedenfor SSC. Se Asubel, ovenfor.

I en foretrukket utforming har ethvert slikt muten minst 40 % identitet eller homologi med sekvensen i SEKV. ID nr. 1,2 eller 3 i den vedheftede sekvensliste. Mer fortrinnsvis har minst 50 %, minst 60 %, minst 70 %, minst 80 % eller mest fortrinnsvis minst 90 % identitet eller homologi dertil.

Identitet reflekterer et slektskap mellom to eller flere polypeptidsekvenser eller to eller flere polynukleotidsekvenser, bestemt ved å sammenligne sekvensene. Generelt refererer identitet seg til en eksakt nukleotid til nukleotid samsvar eller aminosyre til aminosyresamsvar mellom henholdsvis to polynukleotider eller to polypeptidsekvenser, over lengden av sekvensene som blir sammenlignet.

For sekvenser hvor det ikke er et eksakt samsvar, kan en "prosent identitet" bestemmes. Generelt blir de to sekvensene som sammenlignes parallellsammenliknet for å gi en maksimal korrelasjon mellom sekvensene. Dette kan inkludere å sette inn "gap" i enten den ene eller begge sekvensene, for å øke graden av parallellsammenlikning. En prosent identitet kan bestemmes over hele lengden av hver av sekvensene som er sammenlignet (såkalt global opplinjering), som er spesielt egnet for sekvenser med samme eller meget lik lengde, eller over kortere definerte lengder (såkalt lokal parallellsammenlikning) som er mer egnet for sekvenser av ulik lengde.

Metoder for å sammenligne identitet og homologi mellom to eller flere sekvenser er velkjent på området. Således kan f.eks. program tilgjengelig i Wisconsin Sequence Analysis Package, versjon 9.1 (Devereux J et al., 1984), f.eks. programmene BESTFIT og GAP, anvendes til å bestemme prosent identitet mellom to polynukleotider og prosent identitet og prosent homologi mellom to polypeptidsekvenser. BESTFIT bruker den "lokale homologi" algoritmen til Smith and Waterman (1981) og finner den beste enkelte region av likhet mellom to sekvenser. Andre program for å bestemme identitet og/eller likhet mellom sekvensene er også kjent på området, f.eks. BLAST familie av programmer (Altschul S F et al., 1990, Altschul S F et al., 1997, tilgjengelig gjennom hjemmesiden til NCBI på www. ncbi. nlm. nih. gov) og FASTA (Pearson W R, 1990; Pearson 1988).

Foretrukne forandringer for muteiner i henhold til foreliggende oppfinnelse er det som er kjent som "konservative" substitusjoner. Konservative aminosyre substitusjoner av IL-18BP polypeptider eller proteiner eller viralt IL-18BP kan inkludere synonyme aminosyrer innenfor en gruppe som har tilstrekkelig like fysiokjemiske egenskaper slik at substitusjon mellom medlemmer av gruppen vil preservere den biologiske funksjon til molekylet (Grantham, 1974). Det er klart at innskudd og fjerning av aminosyrer kan også gjøres i de ovenfor definerte sekvenser uten å forandre deres funksjon, særlig hvis innskuddet eller fjerningene bare involverer noen aminosyrer, f.eks. under 30 og fortrinnsvis under 10, og verken fjerner eller forskyver aminosyrer som er kritiske for en funksjonell konformasjon, f.eks. cysteinresiduer. Proteiner og muteiner produsert ved slike fjerninger og/eller innskudd kommer innenfor området til foreliggende oppfinnelse. Fortrinnsvis er de synonyme aminosyregrupper de som er definert i tabell 1. Mer fortrinnsvis er de synonyme aminosyregrupper de som er definert i tabell 2; og mest fortrinnsvis er de synonyme aminogrupper de som er definert i tabell 3.

Eksempler på produksjon av aminosyresubstitusjoner i proteiner som kan brukes til å oppnå muteiner av IL-18BP polypeptider eller proteiner, eller muteiner av viral IL-18BP, for anvendelse i foreliggende oppfinnelse inkluderer ethvert kjent metodetrinn, så som presentert i US patent 4 959 314, 4 588 585 og 4 737 462 (Mark et al.); 5 116 943 (Koths et al.); 4 965 195 (Nåmen et al.); 4 879 111 (Chong et al.); og 5 017 691 (Lee et al.); og lysinsubstituerte proteiner presentert i US patent nr. 4 904 584 (Shaw et al.).

Betegnelsen "fusjonert protein" refererer seg til et polypeptid som omfatter et IL-18BP, eller et viralt IL-18BP, eller et mutein eller fragment derav, fusjonert med et annet protein, som f.eks. har en utstrakt residenstid i kroppsvæsker. Et IL-18BP eller et viralt IL-18BP kan således fusjoneres til et annet protein, polypeptid eller lignende, f.eks. et immunoglobulin eller et fragment derav.

"Funksjonelle derivater" dekker derivater av IL-18BP eller et viralt IL-18BP, og deres muteiner og fusjonerte proteiner som kan fremstilles fra de funksjonelle gruppene som opptrer som sidekjeder på residuene eller N- eller C-terminale grupper, med midler kjent på området, og er inkludert i oppfinnelsen så lenge som de forblir farmasøytisk akseptable, dvs. at de ikke ødelegger aktiviteten til proteinet som er hovedsakelig lik aktiviteten til IL-18BP, eller viralt IL-18BP, og ikke gir toksiske egenskaper til sammensetningene som inneholder den.

Disse derivatene kan f.eks. inkludere polyetylenglykolsidekjeder, som kan maskere antigene seter og utvide residenstiden til et IL-18BP eller et viralt IL-18BP i kroppsvæsker. Andre derivater inkluderer alifatiske estere av karboksylgruppene, amider av karboksylgruppene ved reaksjon med ammoniakk eller med primære eller sekundære aminer, N-acylderivater av frie aminogrupper på aminosyreresiduene dannet med acylrester (f.eks. alkanoyl eller karbosykliske aroylgrupper) eller O-acylderivater av frie hydroksylgrupper (f.eks. den til seryl eller treonylresiduer) dannet med acylrester.

Som "aktive fraksjoner" av et IL-18BP, eller et viralt IL-18BP, muteiner og fusjonerte proteiner dekker den foreliggende oppfinnelse ethvert fragment eller forløper av polypeptidkjeden til proteinmolekylet alene eller sammen med assosierte molekyler eller residuer bundet dertil, f.eks. sukker eller fosfatresiduer, eller aggregater av proteinmolekylet eller sukkerresiduene i seg selv, forutsatt at nevnte fraksjon har en hovedsakelig lik aktivitet til IL-18BP.

Betegnelsen "salter" refererer til både salter av karboksylgrupper og til syreaddisjonssalter av aminogrupper av IL-18 inhibitormolekyl, eller analoger derav. Salter av en karboksylgruppe kan dannes ved midler kjent på området og inkludere organiske salter, f.eks. natrium, kalsium, ammonium, jern eller sinksalter, og liknende, og salter med organiske baser er de dannet f.eks. med aminer, så som trietanolamin, arginin eller lysin, piperidin, prokain og liknende. Syreaddisjonssalter inkluderer f.eks. salter med mineralsyrer, så som f.eks. saltsyre eller svovelsyre, og salter med organiske syrer, så som f.eks. eddiksyre eller oksalsyre. Det er en selvfølge at ethvert slikt salt må bibeholde den biologiske aktiviteten til OPN relevant til den foreliggende oppfinnelse, dvs. utøve en prolifererende virkning på oligodendrocytter.

I en ytterligere foretrukket utforming av oppfinnelsen er inhibitoren til IL-18 et IL-18 antistoff. Anti-IL-18 antistoffer kan være polyklonale eller monoklonale, kimeriske, humaniserte eller til og med helt humane. Rekombinante antistoffer og fragmenter derav erkarakterisert vedhøy affinitetsbinding til IL-18 in vivo og lav toksisitet. Antistoffene som kan anvendes i oppfinnelsen er kjennetegnet ved sin evne til å behandle pasienter over en periode tilstrekkelig til å ha god til eksellent regresjon eller lettelse av den patogene tilstand, eller ethvert symptom eller gruppe av symptomer relatert til en patogen tilstand, og en lav toksisitet.

Nøytraliserende antistoffer blir lett produsert i dyr så som kaniner, geiter eller mus ved immunisering med IL-18. Immuniserte mus er spesielt nyttige for å tilveiebringe kilder av B-celler til fremstilling av hybridomer, som i sin tur blir dyrket for å produsere store mengder av anti-IL-18 monoklonale antistoffer.

Kimeriske antistoffer er immunoglobulinmolekylerkarakterisert vedto eller flere segmenter eller deler avledet fra forskjellige dyrearter. Generelt er den variable region i et kimerisk antistoff avledet fra et ikke-humant pattedyrantistoff, så som murint monoklonalt antistoff, og den konstante region i immunglobulinet er avledet fra et humant immunoglobulinmolekyl. Fortrinnsvis har begge regioner og kombinasjonen lav immunogenisitet rutinemessig bestemt (Elliott et al., 1994). Humaniserte antistoffer er immunoglobulinmolekyler dannet ved genetiske konstruksjonsteknikker i hvilke de murine konstante regioner er erstattet med humane motparter som bibeholder de murine antigenbindende regionene. Det resulterende muse-humane kimeriske antistoff har fortrinnsvis en redusert immunogenisitet og forbedret farmakokinetikk hos mennesker (Knight et al., 1993).

Således i en ytterligere foretrukket utforming er IL-18 antistoff et humanisert IL-18 antistoff. Foretrukne eksempler på humaniserte anti-IL-18 antistoffer er f.eks. beskrevet i europeisk patentsøknad EP 0 974 600.

I enda en ytterligere foretrukket utforming er IL-18 antistoffet helt humant. Teknologien for å produsere humane antistoffer er beskrevet i detalj, f.eks. i

WO 00/76310, WO 99/53049, US 6 162 963 eller AU 5 336 100. Helt humane antistoffer er fortrinnsvis rekombinante antistoffer, produsert i transgene dyr, f.eks. xenomus, som omfatter alle eller deler av funksjonelt humant lg loci.

I en meget foretrukket utforming av foreliggende oppfinnelse er inhibitoren til IL-18 et IL-18BP, eller en isoform, et mutein, et fusjonert protein, funksjonelt derivat, aktiv fraksjon eller sirkelpermutert derivat derav. Disse isoformer, muteiner, fusjonerte proteiner eller funksjonelle derivater bibeholder den biologiske aktiviteten til IL-18BP, spesielt binding til IL-18, og har fortrinnsvis essensielt minst én aktivitet lik den til IL-18BP. Ideelt har slike proteiner en biologisk aktivitet som er til og med øket sammenlignet med umodifisert IL-18BP. Foretrukne aktive fraksjoner har en aktivitet som er bedre enn aktiviteten til IL-18BP, eller som har ytterligere fordeler, så som en bedre stabilitet eller en lavere toksisitet eller immunogenisitet, eller de er lettere å produsere i store mengder eller lettere å rense. Sekvensene til IL-18BP og dens spleisevarianter/isoformer kan tas fra WO 99/09063 eller fra Novick et al., 1999, så vel som fra Kim et al., 2000.

Funksjonelle derivater av IL-18BP kan være konjugert til polymerer for å forbedre egenskapene til proteiner, så som stabiliteten, halveringstid, biotilgjengelighet, toleranse av det menneskelige legeme, eller immunogenisitet. For å nå dette mål kan de de funksjonelle derivatene omfatte minst én rest festet til én eller flere funksjonelle grupper, som opptrer som én eller flere sidekjeder på aminosyreresiduene. En slik funksjonell gruppe kan f.eks. være Polyetylenglykol (PEG). PEGylering kan utføres ved kjente metoder, beskrevet f.eks. i WO 92/13095.

Derfor er i en foretrukket utforming av foreliggende oppfinnelse inhibitorene til IL-18 og spesielt IL-18BP PEGylert.

I en ytterligere foretrukket utforming av oppfinnelsen er inhibitoren til IL-18 et fusjonert protein som omfatter alle eller en del av det IL-18 bindende protein, som er fusjonert til alle eller del av et immunoglobulin. Personen med kunnskap på området vil forstå at det resulterende fusjonsproteinet bibeholder den biologiske aktiviteten til IL-18BP, spesielt bindingen til IL-18. Fusjonen kan være direkte, eller via et kort linkerpeptid som kan være så kort som 1-3 aminosyrerester i lengde eller lenger, f.eks. 13 aminosyrerester i lengde. Nevnte linker kan være tripeptid med f.eks. sekvensen E-F-M (Glu-Phe-Met) eller en 13-aminosyrelinkersekvens som omfatter Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met innført mellom IL-18BP sekvensen og immunoglobulinsekvensen. Det resulterende fusjonsproteinet har forbedrede egenskaper, så som utvidet levetid i kroppsvæsker (halveringstid), øket spesifikk aktivitet, øket ekspresjonsnivå eller at rensingen av fusjonsproteinet er fremmet.

I en foretrukket utforming er IL-18BP fusjonert til den konstante region i et Ig-molekyl. Fortrinnsvis er det fusjonert til tungkjederegioner, så som f.eks. CH2 og CH3 domener i humant IgGl. Dannelsen av spesifikke fusjonsproteiner som omfatter IL-18BP og en del av et immunglobulin er f.eks. beskrevet i eksempel 11 i WO 99/090603. Andre isoformer av Ig-molekyler er også egnet for dannelse av fusjonsproteiner i henhold til foreliggende oppfinnelse så som f.eks. isoformer IgG2eller IgG4, eller andre Ig-klasser, så som IgM eller IgA. Fusjonsproteiner kan være monomere eller multimere, hetero- eller homomultimere.

Interferoner er hovedsakelig kjent for inhibitoriske virkninger på viral replikasjon og cellulær proliferasjon. Interferon-y spiller f.eks. en viktig rolle i å promotere immunresponser og inflammatoriske responser. Interferon-p (IFN- p, et interferon type I) er sagt å spille en anti-inflammatorisk rolle.

Oppfinnelsen angår derfor også anvendelse av en kombinasjon av en inhibitor av IL-18 og et interferon til fremstilling av et legemiddel for behandling av traumatisk hjerneskade.

Interferoner kan også være konjugert til polymere for å forbedre stabiliteten til proteinene. Et konjugat mellom Interferon- p og polyolet polyetylenglykol (PEG) er f.eks. blitt beskrevet i WO 99/55377.

I en annen foretrukket utforming av oppfinnelsen er interferonet Interferon-P (IFN-P) og mer fortrinnsvis IFN-P-la.

Inhibitoren til IL-18 produksjonen og/eller virkning er fortrinnsvis brukt samtidig, sekvensielt eller atskilt med interferon.

Tumornekrosefaktor er blitt beskrevet i litteraturen som å ha både beskyttende og toksiske virkninger ved hjerneskade (Shohami et al., 1999). I eksempel 1 nedenfor resulterte TNF-injeksjon i mus etter alvorlig hjernetraume i en signifikant reduksjon av IL-18 nivåer i hjernen, og angir således at TNF kan ha en gunstig virkning på restitusjon etter traumatisk hjerneskade. Derfor angår en foretrukket utforming av oppfinnelsen anvendelse av en inhibitor av IL-18 i kombinasjon med TNF til fremstilling av et legemiddel for behandling og/eller forhindring av hjerneskade, for samtidig, sekvensiell eller separat anvendelse.

Kombinasjonen av IL-18 inhibitorer med TNF-alfa er foretrukket i henhold til foreliggende oppfinnelse.

I en ytterligere foretrukket utforming av oppfinnelsen omfatter legemidlet videre et anti-inflammatorisk middel, så som et NSAID (ikke-stereoid anti-inflammatorisk legemiddel). I en foretrukket utforming, blir en COX-inhibitor og mest fortrinnsvis en COX-2-inhibitor brukt i kombinasjon med en IL-18 inhibitor. COX-inhibitorer er kjent på området. Spesifikke COX-2-inhibitorer er f.eks. beskrevet i WO 01/00229. De aktive komponentene kan brukes samtidig, sekvensielt eller separat.

Oksidativt stress, spesielt reaktive oksygenarter (ROS) er blitt beskrevet å spille en rolle i patofysiologien ved hjerneskade (Shohami et al., 1997).

Derfor omfatter i en foretrukket utforming av foreliggende oppfinnelse ytterligere en antioksidant, for samtidig, sekvensiell eller separat anvendelse. Mange antioksidanter er kjent på området så som vitamin A, C eller E, eller 5-aminosalisylsyre, eller superoksiddismutase.

I en ytterligere foretrukket utforming av foreliggende oppfinnelse er inhibitoren av IL-18 brukt i en mengde å ca. 0,001-100 mg/kg kroppsvekt, eller ca. 0,01-10 mg/kg kroppsvekt eller ca. 0,1-3 mg/kg kroppsvekt eller ca. 1-2 mg/kg kroppsvekt.

I enda en ytterligere utforming er inhibitoren av IL-18 brukt i en mengde på ca. 0,1-1000 ug/kg kroppsvekt, eller 1-100 ug/kg kroppsvekt eller ca. 10-50 ug/kg kroppsvekt.

Definisjonen av "farmasøytisk akseptabel" er ment å innbefatte enhver bærer som ikke interfererer med effektiviteten til den biologiske aktivitet til den aktive ingrediens og som ikke er toksisk for verten som den administreres til. F.eks. for parenteral administrasjon kan de aktive proteiner være formulert i en enhetsdoseform for injeksjon i vehikler så som saltoppløsning, dekstroseoppløsning, serumalbumin og Ringers oppløsning.

De aktive ingredienser i legemiddelet fremstilt ved anvendelsen i henhold til oppfinnelsen kan administreres til et individ på forskjellige måter. Administrasjonsrutene inkluderer intradermal, transdermal (f.eks. i formuleringer med langsom frigjøring), intramuskulært, intraperitonealt, intravenøs, subkutant, oralt, intrakranielt, epiduralt, rektalt, topisk, og intranasale ruter. Enhver annen terapeutisk effektiv administrasjonsrute kan anvendes, f.eks. absorpsjon gjennom epitelet eller endotelialt vev eller ved genterapi, hvor et DNA-molekyl som koder det aktive middel blir administrert til pasienten (f.eks. via en vektor), som forårsaker at det aktive middel uttrykkes og sekreres in vivo. I tillegg kan proteinene i henhold til oppfinnelsen administreres sammen med andre komponenter av biologisk aktive midler, så som farmasøytisk akseptable surfaktanter, eksipienter, bærere, fortynningsmidler og vehikler.

For parenteral (f.eks. intravenøs, subkutan, intramuskulær) administrering, kan de aktive proteiner formuleres som en oppløsning, suspensjon, emulsjon eller lyofilisert pulver i assosiasjon med en farmasøytisk akseptabel parenteral vehikkel, f.eks. vann, saltoppløsning, dekstroseoppløsning) og tilsetninger som opprettholder isotonisitet (f.eks. mannitol) eller kjemisk stabilitet (f.eks. preserveringsmidler og buffere). Formuleringen blir sterilisert ved vanlig brukte teknikker.

Biotilgjengeligheten til det aktive protein(er) i henhold til oppfinnelsen kan også forhøyes ved å bruke konjugasjonsfremgangsmåter som øker halveringstiden til molekylet i det menneskelige legemet, f.eks. ved å koble molekylet til polyetylenglykol som beskrevet i PCT patentsøknad WO 92/13095.

De terapeutisk effektive mengder av det aktive protein(er) vil være en funksjon av mange variabler, inkludert type antagonist, affinitet til antagonisten for IL-18, enhver restcytotoksisk aktivitet utvist av antagonisten, administrasjonsruten, pasientens kliniske tilstand (inkludert ønsket om å opprettholde et ikke-toksisk nivå av endogen IL-18 aktivitet).

En "terapeutisk effektiv mengde" er slik at når det administreres resulterer IL-18 inhibitoren i inhibisjon av den biologiske aktivitet til IL-18. Dosen administrert, som enkle eller flere doser, til et individ vil variere avhengig av et utvalg av faktorer, inkludert IL-18 inhibitor farmakokinetiske egenskaper, administrasjonsruten, pasientens tilstand og egenskaper (kjønn, alder, kroppsvekt, helse, størrelse), utstrekning av symptomer, samtidige behandlinger, behandlingsfrekvens og den ønskede effekt. Justering og manipulering av etablerte doseområder er godt innenfor evnen til de med kunnskap på området, så vel som in vitro og in vivo fremgangsmåter til å bestemme inhibisjon av IL-18 i et individ.

I henhold til oppfinnelsen blir inhibitoren av IL-18 brukt i en mengde på ca. 0,0001-100 mg/kg eller ca. 0,01-10 mg/kg kroppsvekt, eller ca. 0,1-5 mg/kg kroppsvekt eller ca. 1-3 mg/kg kroppsvekt eller ca. 1-2 mg/kg kroppsvekt. Alternativt kan IL-18 inhibitorene administreres i mengder på ca. 0,1-1000 (J.g/kg kroppsvekt eller ca. 1-100 ug/kg kroppsvekt eller ca. 10-50 ug/kg kroppsvekt.

Administrasjonsruten som er foretrukket i henhold til oppfinnelsen er administrasjon ved den subkutane rute. Intramuskulær administrasjon er ytterligere foretrukket i henhold til oppfinnelsen. For å administrere IL-18 inhibitoren direkte til virkningslokaliseringen er det også foretrukket å administrere den via den intrakraneale eller intratekale ruten. Den intrakraneale rute er spesielt foretrukket i kombinasjon med åpen hodeskade (missilskade på hjernen).

I ytterligere foretrukne utforminger blir inhibitoreu til IL-18 administrert daglig eller hver annen dag.

De daglige dosene blir vanligvis gitt i oppdelte doser eller former som opprettholder frigjøringen som er effektive til å oppnå de ønskede resultater. Annen eller påfølgende administrasjoner kan utføres med en dose som er den samme, mindre enn eller større enn den initiale eller tidligere dose administrert til individet. En annen eller påfølgende administrering kan administreres under eller før sykdommens inntredelse.

I henhold til oppfinnelsen kan IL-18 inhibitoren administreres profylaktisk eller terapeutisk til et individ før, samtidig eller sekvensielt med andre terapeutiske regimer eller midler (f.eks. multippel-legemiddelregimer), i en terapeutisk effektiv mengde, spesielt med et interferon og/eller en TNF og/eller et anti-inflammatorisk middel så som en COX-inhibitor og/eller en antioksidant. Avhengig av hjerneskaden kan samadministrering av en TNF-antagonist istedenfor TNF i seg selv også vurderes (Shohami et al., 1999). Aktive midler som blir administrert samtidig med andre terapeutiske midler kan administreres i den samme eller forskjellige sammensetning.

Oppsummert vedrører derfor foreliggende oppfinnelse anvendelse av en IL-18 inhibitor som er valgt fra antistoffer mot IL-18, kaspase-1 (ICE) -inhibitorer, og IL-18-bindende proteiner, isoformer, muteiner, fusjonerte proteiner, funksjonelle derivater eller aktive fraksjoner eller salter derav for fremstilling av et legemiddel for behandling av traumatisk hjerneskade, der IL-18-inhibitoren blir administrert i en enkelt dose 3 dager etter skade.

Alle referanser som er sitert i denne søknaden, inkludert journalartikler eller sammendrag, publiserte eller upubliserte US eller utenlandske patentsøknader, godkjente US eller utenlandske patenter eller enhver annen referanse er i sin helhet inkorporert ved referanse, inkludert alle data, tabeller, figurer og tekst presentert i de siterte referanser. I tillegg er hele innholdet av referansene sitert i de siterte referanser også fullstendig inkorporert ved referanse.

Referanse til kjente metodetrinn, konvensjonelle metodetrinn, kjente metoder eller konvensjonelle metoder er ikke på noen måte en innrømmelse av at enhver side, beskrivelse eller utforming av foreliggende oppfinnelse er beskrevet, lært eller foreslått i den relevante kjente teknikk.

Den foregående beskrivelse av de spesifikke utforminger vil fullstendig tilkjennegi den generelle natur til oppfinnelsen som andre kan, ved å anvende kunnskap som er innenfor fagområdets kunnskap (inkludert innholdet av referansene som er sitert), lett modifisere og/eller tilpasse slike spesifikke utforminger for forskjellige applikasjoner, uten unødvendig eksperimentering, uten å avvike fra den foreliggende oppfinnelses generelle idé. Derfor er slike tilpasninger og modifikasjoner ment å være innenfor området til ekvivalenter av de beskrevne utforminger, basert på den lære og styring som er presentert i denne søknaden. Det skal også forstås at ordvalget og terminologien som er benyttet i denne søknaden er for den hensikt å beskrive og ikke begrense, slik at ordvalget eller terminologien i henhold til foreliggende spesifikasjon skal tolkes av personen med kunnskap på området i lys av den lære og styring som er presentert, i kombinasjon med kunnskapen til en med ordinær dyktighet på området.

Idet oppfinnelsen nå er beskrevet skal den lettere forstås ved referanse til følgende eksempler som er tilveiebrakt for å illustrere og ikke for å begrense den foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPLER

Materialer og metoder

Traumemodell

Musene brukt i denne undersøkelsen var hannmus i alder 8-16 uker som veide 30-35 g. De ble avlet i spesifikke patogenfrie omgivelser, holdt under standard betingelser med hensyn på temperatur og lys i bur på 4-6 dyr, og gitt mat og vann ad libitum. Undersøkelsen ble utført i henhold til retningslinjene til the Institutional Animal Care Committee ved Hebrew University of Jerusalem, Israel. Eksperimentell CHI ble utført ved å bruke vektdroppanordningen tidligere utviklet (Chen et al., 1996). Kort, etter induksjon av eteranestesi ble et longitudinelt midtlinjesnitt utført, huden ble trukket tilbake og skallen eksponert. Det venstre fremre frontale området ble identifisert og en spisset teflonkon ble plassert ca. 1 mm lateralt til midtlinjen, i det midtre koronale plan. Hodet ble fiksert og en 75 g vekt ble sluppet på konusen fra en høyde på 18 cm, som resulterte i en fokal skade på venstre hemisfære. Etter traumet mottok musene understøttende oksygenering med 100 % O2ikke lenger enn 2 min. og ble deretter brakt tilbake til burene.

Vurdering av IL- 18 nivåer i musehjerne

For kvantifisering av intrakranielt IL-18 nivåer, ble mus av C57BL/6 (B6) stamme (total n=62) plassert i seks atskilte grupper: (1) "normale kontroller"; ubehandlede B6 mus (n=10). (2) "eteranestesi"; mus ble anestesert med eter i 10 min. og dekapitert etter 24 timer (n=10) eller 7 dager (n=10). (3) "skinnoperasjon"; disse mus gjennomgikk anestesi og longitudinelt skalpsnitt og ble ofret etter 24 timer (n=15) eller 7 dager. (4) "traumegruppe"; eksperimentell CHI ble utført som beskrevet ovenfor og dyrene ble dekapitert i eteranestesi etter 4 timer (n=7), 24 timer (n=7), og 7 dager (n=7) etter traumet. (5) "TNF-injeksjon"; for vurdering av en mulig rolle av TNF i regulering av intracerebral IL-18 ble musene eteranestisert, injisert intracerebroventrikulært (i.cv.) med 200 ng murin rekombinant TNF (R&D Systems, Abingdon, UK) i 10 ul sterilt fosfatbufret saltoppløsning (PBS) og ofret etter 24 timer (n=10). (6) "falsk injeksjon"; disse dyrene ble injisert i.cv. med bare vehikkel (10 ul steril PBS) og ofret etter 24 timer (n=6), som en kontrollgruppe til de TNF-injiserte dyrene. Hos alle mus ble hjernene umiddelbart fjernet etter dekapitering, hurtigfrosset i flytende nitrogen og lagret ved -70°C inntil analyse. Hjerner fra traumegruppen ble atskilt i venstre (ipsilateral) og høyre (kontralateral) hemisfære for å tillate en sammenligning av IL-18 nivåer i den skadede versus ikke-skadede hemisfære. Vevshomogenisering ble utført med en Polytron (Kinematica, Kriens, Sveits) ved å bruke en fortynning på 1:4 i iskald ekstraksjonsbuffer (w/w) som inneholdt Tris 50 mm (pH 7,2), NaCl 150 mm, Triton-X-100 1 % (Boehringer Mannheim, Rotkreutz, Sveits) og proteaseinhibitorcocktail (Boehringer Mannheim). Homogenatet ble ristet på is i 90 min. og deretter sentrifugert i 15 min. ved 3000 g og 4°C. Supernatantene ble porsjonert og lagret ved -70°C inntil analyse. Konsentrasjonene av totalprotein i hjerneekstraktet ble målt ved Bradford assay (Bio Rad Laboratories, Munchen, Tyskland) og funnet å være meget konstante hos alle mus vurdert (12,1 +2,1 mg/ml; gjennomsnitt + SD). Kvantifisering av intracerebrale cytokinnivåer ble utført ved ELISA spesifikk for murin IL-18 i henhold til fabrikkantens instruksjoner (R&D Systems, Abingdon, UK). Sensitiviteten til assayet var 5 pg/ml. For sammenligning av intracerebrale IL-18 nivåene mellom de forskjellige dyregrupper ble alle konsentrasjoner under deteksjonsgrensen på 5 pg/ml gitt en verdi på 4,9 pg/ml. Prøvene ble kjørt ufortynnet i duplikate brønner og den endelige konsentrasjonen ble beregnet fra gjennomsnittelig OD til duplikatprøvene. OD ble bestemt ved spektrofotometer

(Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA) med en ekstinksjonsbølgelengde på 405 nm.

IL- 18BP behandlingsprotokoll

Hannlige Sabra-mus fra Hebrew University stammen (n=40) ble brukt for IL-18BP undersøkelser. Anestesi og eksperimentell CHI ble utført som beskrevet ovenfor. For behandlingsprotokollen ble dyrene oppdelt i to grupper: i gruppe A ("kontrollgruppe", n=16) ble musene utsatt for eksperimentell CHI, injisert med vehikkel alene (PBS) etter 1 time og observert i 7 dager for nevrologisk vurdering (se nedenfor). I gruppe B ("undersøkelsesgruppe", n=18) ble musene injisert i.p. med 50 ug IL-18BP umiddelbart etter bestemmelse av den nevrologiske skår på t = 1 time etter CHI. Siden blod-hjerne-barrierepermeabiliteten er 5-6 ganger øket mellom 1-4 timer etter CHI, som tidligere bestemt i den samme eksperimentelle modell (Chen et al., 1996), blir IL-18BP tilgjengelig til hjernen under disse betingelser. To ytterligere grupper av mus ble behandlet i henhold til gruppene A og B (gruppe C: "kontrollgruppe"; gruppe D: "undersøkelsesgruppe"), og dekapitert etter 48 timer etterfulgt av hjernedisseksjon for evaluering av posttraumatisk ødem som beskrevet nedenfor.

Evaluering av nevrologisk svekkelse

For å vurdere posttraumatisk nevrologisk svekkelse har en Neurological Severity Score (NSS) tidligere blitt utviklet og evaluert (Ståhei et al., 2000).

Skåren består av ti individuelle kliniske oppgaver på motorisk funksjon, årvåkenhet, og fysiologisk adferd, hvorved ett poeng ble gitt for mislykket oppgave og null poeng ble gitt for å lykkes (tabell 4). En maksimal NSS på ti poeng angir alvorlig nevrologisk dysfunksjon, med mislykkethet i alle oppgaver, mens en skår på null blir oppnådd hos friske uskadde mus. NSS 1 time etter traumet reflekterer den initielle alvorligheten til skaden og er godt korrelert med klinisk resultat (Beni-Adani et al., 2001). Evaluering av oppgaveyteevne ble utført av to forskere som var blinde med hensyn på studiegruppen på tidspunktene 1 time, 24 timer, 72 timer og 7 dager etter eksperimentell CHI. ANSS beregnet som differansen mellom NSS på t=l time og NSS på ethvert senere tidspunkt, er et parameter som reflekterer graden av spontan restitusjon etter hjerneskade, som beskrevet tidligere (Chen et al., 1996).

Vurdering av hjerneødem

Utstrekning av cerebralt ødem ble evaluert ved å bestemme vevsvanninnholdet i den skadede hemisfære som tidligere beskrevet (Chen et al., 1996). Kort, mus ble

anestesert som beskrevet ovenfor 48 timer etter trauma som tilsvarer et tidspunkt på hvilket ødem fremdeles er signifikant i dette modellsystem (Chen et al., 1996). Etter dekapitering ble cerebellum og hjernestammen fjernet og et kortikalt segment på ca.

20 mg, fra et område som grenset til traumestedet og fra den kontralaterale

hemisfære fremstilt. Den høyre (ikke-skadede) hemisfære ble brukt som en intern kontroll. Vevsskivene ble veid og tørket i 24 timer på 95°C. Etter veiing av de "tørkede" snitt ble prosentinnholdet av vann i hjernen beregnet som:

% H20 = [(våtvekt - tørrvekt) x 100]/våtvekt.

Hjerneskadepasienter

Pasienter med isolert alvorlig CHI (gjennomsnittelig alder + SD: 37 + 10 år; område 24-57 år; 9 menn og 1 kvinne), lagt inn på skadeavdelingen ved universitetssykehuset Zurich inkludert i denne undersøkelsen. Alle pasientene hadde en Glasgow Coma Scale (GCS) skår < 8 etter kardiopulmonær resucitering (Teasdale og Jennett, 1974). Etter CT-skann evaluering mottok alle pasientene intraventrikulære kateter for terapeutisk CSF-drenering når det intrakranielle trykk (ICP) oversteg 15 mmHg. Ingen pasient ble behandlet med steroider. Pasienter med multippel skade som krevde intervensjoner for samtidig toraksskade, abdominalskade, bekkenskade, ryggmargskade, eller brudd i de lange ben ble ekskludert fra undersøkelsen. Det individuelle resultatet ble vurdert ved å bruke Glasgow Outcome Scale (GOS) (Jennett og Bond, 1975). Protokollen for CSF og seruminnsamling ble godkjent av det Ethics Board Committee (den etiske komité) for universitetshospitalet i Zurich.

Prøveinnsamling og IL- 18 analyser

CSF og tilpassede serumprøver fra CHI-pasienter (n=10) ble oppsamlet daglig på et fiksert tidspunkt. Kontroll CSF ble innsamlet fra pasienter som gjennomgikk diagnostisk spinalprøvetapping (n=5). Disse pasientene hadde ikke tegn på inflammatorisk CNS-sykdom, basert på normale CSF-verdier med hensyn på protein, glukose og celletall (data ikke vist). I CHI-gruppen ble prøveinnsamling tatt 10 dager etter traumet, med mindre det ventrikulære kateter ble fjernet tidligere, f.eks. i tilfelle hvor ICP forble i et normalt område (< 15 mmHg) i mer enn 24 timer. Totalt 106 tilpassede CFS og serumprøver ble innsamlet fra traumepasientene analysert i dette studiet. Alle prøvene ble øyeblikkelig sentrifugert etter innsamling, porsjonert og frosset ved -70°C inntil analyse. Kvantifisering av IL-18 nivåer i CSF og serum ble utført ved ELISA spesifikk for human IL-18 ved å bruke kommersielt tilgjengelige sett (R&D Systems, Abingdon, UK). Som for det murine assay var sensitiviteten til ELISA 5 pg/ml og den endelige IL-18 konsentrasjonen ble beregnet fra gjennomsnittelig OD bestemt i duplikatprøver på en ekstinksjonsbølgelengde på 405 nm. For sammenligning av IL-18 CSF-nivåer mellom CHI-pasienter og kontroller ble alle konsentrasjoner under deteksjonsgrensen på 5 og/ml gitt en verdi på 4,9 pg/ml.

Dataanalyse

Statistisk analyse av dataene ble utført med kommersielt tilgjengelige software (SPSS 9.0 for Windows™). Den ikke-parametriske Mann-Whitney-U-test ble brukt for å analysere data som ikke var normalfordelt, så som de nevrologiske skårene (NSS og ANSS). Den uparede Students t-test ble brukt for sammenligning av intracerebral IL-18 konsentrasjoner i de forskjellige musegrupper og for analyse av forskjeller i vanninnholdet i hjernen i IL-18BP behandlede versus vehikkelinjiserte mus. Sammenligningen av humane IL-18 nivåer, enten i daglige CSF versus tilpassede serumprøver i CHI-pasienter, eller i traume versus kontroll CSF, ble bestemt ved å bruke den generelle lineære modellen for gjentatte målinger ANOVA. En p-verdi < 0,05 ble betraktet som statistisk signifikant.

Resultater

EKSEMPEL 1: Intracerebrale IL- 18 nivåer hos mus

Som vist i fig. 1, var IL-18 detekterbar ved ELISA i hjernehomogenater fra ubehandlede ("normal") kontrollmus fra B6-stammen (n=10), med et gjennomsnittelig nivå på 27,7 + 1,7 [+ SEM] ng/ml. I de eksperimentelle grupper resulterte induksjon av eteranestesi alene eller i kombinasjon med "skinn" operasjon (dvs. eteranestesi og langsgående skalpeinsisjon) i signifikant eleverte intrakraniale IL-18 nivåer på henholdsvis 48,9 +1,1 ng/ml ("eter" gruppe, n=8) og 54,3 + 2,7 ng/ml ("skinn" gruppe, n=13), (p<0,01 versus "normal" mus, uparet Studenfs t-test; fig. 1). Differansen mellom "eter" og "skinn" behandlede dyr var ikke statistisk signifikant (p=0,16).

I traumegruppen (n=21) resulterte induksjon av CHI i eleverte IL-18 nivåer både i den skadde og den kontralaterale hemisfære innenfor 4 timer (henholdsvis 60,6 + 3,3 og 59,8 + 5,0 ng/ml) til 24 timer (henholdsvis 56,9 + 2,1 og 56,3 +3,7 ng/ml) etter traumet var imidlertid nivåene ikke signifikant høyere sammenlignet med "eter" eller "skinn" gruppene (p>0,05).

I motsetning til dette 7 dager etter CHI ble det detektert en signifikant økning av den intracerebrale IL-18 konsentrasjonen i den skadede hemisfære sammenlignet med eter-anestesert eller skinnopererte dyr (henholdsvis 67,6 + 5,1 ng/ml versus 42,2 + 0,8 og 45,2 + 0,5 ng/ml; p<0,01), mens IL-18 nivåene i den kontralaterale hemisfære ikke var signifikant hevet over disse to kontrollgrupper (63,2 + 6,0 ng/ml; p=0,06).

For å vurdere rollen til TNF som er en kritisk mediator av inflammasjon i denne traumemodellen (Shihami et al., 1999) med hensyn på regulering av intracerebrale IL-18 nivåer ble en ytterligere gruppe av B6-mus (n=10) injisert i.cv. med 200 ng murint rekombinant TNF i 10 ul steril PBS og ofret etter 24 timer. Som vist i fig. 1 resulterte "falsk" injeksjon med bare bærer (n=6) i en signifikant oppregulering av intracerebralt IL-18 innenfor 24 timer sammenlignet med ubehandlede normale B6-mus (53,6 + 3,9 versus 27,7 + 1,7 ng/ml; p<0,001).

Injeksjon av TNF induserte en signifikant demping av IL-18 nivåer i det intrakraneale rommet innen 24 timer (22,1 + 6,9 ng/ml; n=10), sammenlignet med "falsk"-injiserte kontrollgruppe 24 timer (53,6 + 3,9 ng/ml; p<0,001). IL-18 nivåene i "TNF-gruppen" var til og med lavere enn i ubehandlede normalmus (27,7 +1,7 ng/ml), skjønt i dette tilfellet var forskjellene ikke statistisk signifikante (p=0,45).

EKSEMPEL 2: Virkning av IL-18BP behandling på nevrologisk restitusjon etter traume.

For å undersøke hypotesen at inhibisjon av IL-18 kan fasilitere restitusjon i hjerneskade ble restitusjon på forskjellig tidspunkt etter en enkel injeksjon av IL-18BP sammenlignet. Det er tidligere blitt vist at den "Neurological Severity Score (NSS)" ved 1 time etter et traume reflekterer meget nøyaktig størrelsen av traumet og korrelerer med volumet av det skadede vev sett i MRI og ved histologi.

For å oppnå grupper av dyr med sammenlignbare traumer, ble mus fordelt i forskjellige behandlingsgrupper etter sine initielle NSS ble evaluert på t=l time. Som vist i fig. 2 (NSS i IL-18BP (firkanter) versus kontroll (sirkler) hadde begge grupper en lik initiell NSS (1 time) (7,69 + 0,3023 og 7,44 + 0,3627, henholdsvis kontroll og IL-18BP), noe som angir sammenlignbar alvorlighet av skaden.

Evaluering av NSS på senere tidspunkt (1-7 dager) viste at dyr behandlet intraperitonealt (i.p.) med IL-18BP utviser betydelig mindre nevrologisk skade, som vist av NSS-verdier som når signifikans 7 dager etter traumet (p=0,045).

Hastigheten av restitusjonen uttrykt som ANSS (t) = NSS (1 time) - NSS (t), ble beregnet. En høyere verdi av ANSS reflekterer raskere restitusjon og en null eller negativ ANSS reflekterer ingen restitusjon eller forverring. Fig. 3 viser ANSS-verdiene til de to gruppene. På to tidspunkter, både ved 24 timer og 7 dager nådde forskjellen mellom gjennomsnittelig ANSS-verdier signifikans.

Et annet eksperiment ble utført for å undersøke om behandling med IL-18BP, gitt tre dager etter skaden kan være effektiv. Spørsmålet om tidspunktet for behandling er kritisk og så langt har terapi vært kjent for å være effektivt når det gis over noen få timer. Siden det hadde blitt funnet at IL-18 i seg selv stiger 7 dager etter traumet, og behandling med IL-18BP gitt 1 time etter traumet fører til størst effekt også på dag 7, ble det bestemt nå å behandle musene på dag 3 etter skade. For sammenligning ble en annen gruppe behandlet ved 1 time og 3 dager med IL-18BP. Kontrollgruppen ble behandlet bare med opp løsningsmidlet (bæreren).

Resultatet av dette eksperimentet er vist i fig. 4, fra hvilken det er klart at en enkelt behandling gitt på dag 3 er så effektiv som den gitt 1 time etter CHI og igjen på dag 3.

Eksperimentet viser en dramatisk gunstig virkning av éngangs administrering av IL-18BP, enten gitt 1 time eller 3 dager etter lukket hodeskade, på restitusjon etter traumatisk hodeskade i en eksperimentell murin modell.

EKSEMPEL 3: Forhøyede IL-18 nivåer i human CSF etter hjerneskade.

IL-18 nivåer ble vurdert i daglige CSF- og serumprøver fra 10 pasienter med alvorlig CHI i opptil 10 dager etter traumet. Pasientens demografiske og kliniske data er presentert i tabell 5.

Som vist i tabell 5 var de intratekale IL-18 nivåer signifikant hevet i 9/10 CHI-pasienter, sammenlignet med kontroll CSF fra 5 pasienter uten traume eller

inflammatorisk nevrologisk sykdom (p<0,05; gjentatte målinger ANOVA). Bare én pasient (#10) hadde IL-18 CSF-nivåer som ikke var signifikant hevet sammenlignet med kontroll CSF (p=0,31). Mediannivåene og individuelle områder av IL-18 i CSF og serum er presentert i tabell 5.

Det skal noteres at maksimale IL-18 konsentrasjoner i CSF (966 ng/ml) var opptil 200 ganger høyere hos pasienter med hodeskade enn i kontroller. Intracerebral IL-18 var detekterbart ved ELISA i 90 % av alle CSF-prøvene i traumegruppen, mens bare 40 % kontroll CSF-prøver hadde detekterbare intracerebrale IL-18 nivåer (dvs. > 4,9 ng/ml). I 8/10 CHI-pasienter var de mediane IL-18 konsentrasjoner signifikant høyere i CSF enn i serum (p<0,05; gjentatte målinger ANOVA). Imidlertid, i to pasienter (# 9, 10) oversteg de mediane IL-18 nivåer i serum de tilsvarende konsentrasjoner i CSF som vist i tabell 5.

Disse resultater viser at det er signifikant hevede nivåer av IL-18 i cerebrospinalvæske hos pasienter med traumatisk hodeskade. Tilsetting av IL-18BP kan redusere disse hevede nivåer og kan således utvise sin gunstige virkning på restitusjon fra lukket hodeskade, som vist i eksempel 2 ovenfor.

REFERANSER

1. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997 2. Chater, K. F. et al., in "Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology", Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54). 3. Chen, Y., S. Constantini, V. Trembovler, M. Weinstock, and E. Shohami. 1996. An experimental model of closed head injury in mice: pathophysiology, histopathology, and cognitive deficits. J. Neurotrauma 13:557-68. 4. Conti, C.B., N.Y. Calingasan, Y. Kim, H. kim, Y. Bae, E. Gibson, and T.H. Joh. 1999. Cultures of astrocytes and microglia express interleukin-18. Mol. Brain Res. 67:46-52 5. Conti, B., J. Jahng, C. Tinti, J. H. Son, and T. H. Joh. 1997. Induction of interferon-gamma inducing factor in the adrenal cortex. J. Biol. Chem. 272:2035-2037. 6. Culhane, A.C., M.D. Hall, N.J. Rothwell, and G.N. Luheshi. 1998. Cloning of rat brain interleukin-18 cDNA. Mol. Psychiatry 3:362-6

a. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984.

7. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E and Karin, M. (1997), Nature 388, 16514-16517. 8. Elliott, M.J., Maini, R.N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H., and Woody, J.N., 1994, Lancet 344, 1125-1127. 9. Fassbender, K., O. Mielke, T. Bertsch, F. Muehlhauser, M. Hennerici, M. Kurimoto, and S. Rossol. 1999. Interferon-y-inducing factor (IL-18) and interferon-y in inflammatory CNS diseases. Neurology 53:1104-6 10. Jander, S., and G. Stoll. 1998. Differential induction of interleukin-12, interleukin-18, and interleukin-ip coverting enzyme mRNA in experimental autoimmune encephalomyelitis of the Lewis rat. J. Neuroimmunol. 91:93-9

11. Lancet 1975 Mar l;l(7905):480-4. Jennett B, Bond M.

12. Izaki, K. (1978) Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742).

13. Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinarello CA. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18. Proe Nati Acad Sei U S A 2000;97:1190-1195. 14. Kossmann, T., P.F. Ståhei, P.M. Lenzinger, H. Redl, R.W. Dubs, O. Trentz, G. Schlag, and M.C. Morganti-Kossmann. 1997. Interleukin-18 released into the cerebrospinal fluid after brain injury is associated with blood brain-barrier dysfunction and nerve growth factor production. J. Cereb. Blood Flow Metab. 17:280-9 15. Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, Scallon B, Moore MA, Vilcek J, Daddona P, et al. Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody.Mol Immunol 1993 Nov 30:16 1443-53 16. Maliszewski, C. R., T. A. Sato, T. Vanden Bos, S. Waugh, S. K. Dower, J. Slack, M. P. Beckmann, and K. H. Grabstein. 1990. Cytokine receptors and B cell functions. I. Recombinant soluble receptors specifically inhibit IL-1- and IL-4-induced B cell activities in vitro. J. Immunol. 144:3028-3033. 17. Micallef, M. J., T. Ohtsuki, K. Kohno, F. Tanabe, S. Ushio, M. Nambam T. Tanimoto, K. Torigoe, M. Fujii, M. Ikeda, S. Fukuda, and M. Kurimoto. 1996. Interferon-gamma-inducing factor enhances T helper 1 cytokine production by stimulated human T cells: synergism with interleukin-12 for interferon-gamma production. Eur-J-Immunol 26:1647-51 issn: 0014-2980. 18. Morganti-Kossmann, M.C, P.M. Lenzlinger, V. Hans, P. Ståhei, E. Csuka, E. Ammann, R. Stocker, O. Trentz, and T. Kossmann. 1997. Production of cytokines following brain injury: beneficial and deleterious for the damaged tissue. Mol. Psychiatry 2:133-6 19. Nakamura K, Okamura H, Wada M, Nagata K, Tamura T. Infect Immun 1989 Feb;57(2):590-5 20. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, and Rubinstein M

(1999). Immunity 10, 127-136. 21. Okamura H, Nagata K, Komatsu T, Tanimoto T, Nukata Y, Tanabe F, Akita K, Torigoe K, Okura T, Fukuda S, et al. Infect Immun 1995 Oct;63(10):3966-72 22. Parnet, P, Garka, K E, Bonnert, T P, Dower, S K, and Sims, J E. (1996), J. Biol. Chem. 271,3967-3970.

a. Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990

b. Pearson W R and Liplan D J, Proe Nat Acad Sei USA, 85, 2444-2448, 1988

23. Prinz, M., and U.K. Hanisch. 1999. Murine microglial cells produce and respond to interleukin-18. J. Neurochem. 72:2215-8 24. J Clin Invest 1997 Feb l;99(3):469-74 Rothe H, Jenkins NA, Copeland NG, Kolb H. 25. Scherbel, U., R. Raghupati, M. Nakamura, K.E. Saatman, J.Q. Trojanowski, E. Neugebauer, M.W. Marino, and T.K. Mclntosh. 1999. Differential acute and chronic responses of tumor necrosis factor-deficient mice to experimental brain injury. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 96:8721-6 26. Shohami, E., I. Ginis, and J.M. Hallenbeck. 1999. Dual role of tumor necrosis factor alpha in brain injury. Cytokine Growth Factor Rev. 10:119-30 27. Shohami, E; Beit-Yannai E., Horowitz M; Kohen R (1997): J. Cereb. Blood Flow Metab. 17, 1007-1019.

28. Teasdale G, Jennett B. Lancet 1974 Jul 13;2(7872):81-4

29. Ståhei PF, Shohami E, Younis FM, Kariya K, Otto VI, Lenzlinger PM, Grosjean MB, Eugster HP, Trentz O, Kossmann T, Morganti-Kossmann MC.J Cereb Blood Flow Metab 2000 Feb;20(2):369-80 30. Ushio S, Namba M, Okura T, Hattori K, Nukada Y, Akita K, Tanabe F, Konishi K, Micallef M, Fujii M, Torigoe K, Tanimoto T, Fukuda S, Ikeda M, Okamura H, Kurimoto M. J Immunol 1996 Jun 1;156(11):4274-9 31. Wheeler, R.D., A.C. Culhane, M.D. Hall, S. Pickering-Brown, N.J. Rothwell, and G.N. Luheshi. 2000. Detection of the interleukin-18 family in rat brain by RT-PCR. Mol. Brain Res. 77:290-3 32. Whalen, M.J., T.M. Carlos, P.M. Kochanek, S.R. Wisniewski, M.J. Bell, R.S. Clark, S.T. DeKosky, D.W. Marion, and P.D. Adelson. 2000. Interleukin-8 is increased in cerebrospinal fluid of children with severe head injury. Crit. Care Med. 28:929-34 33. Yoshimoto T, Takeda, K, >Tanaka, T, Ohkusu, K, Kashiwamura, S, Okamura, H, Akira, S and Nakanishi, K (1998), J. Immunol. 161, 3400-3407.

Claims (17)

1. Anvendelse av en IL-18 inhibitor som er valgt fra antistoffer mot IL-18, kaspase-1 (ICE) -inhibitorer, og IL-18-bindende proteiner, isoformer, muteiner, fusjonerte proteiner, funksjonelle derivater eller aktive fraksjoner eller salter derav for fremstilling av et legemiddel for behandling av traumatisk hjerneskade, der IL-18-inhibitoren blir administrert i en enkelt dose 3 dager etter skade.

2. Anvendelse ifølge krav 1, der den traumatiske hjerneskaden er lukket hodeskade.

3. Anvendelse ifølge krav 1, der IL-18-antistoffet er et humanisert IL-18-antistoff.

4. Anvendelse ifølge krav 1, der IL-18-antistoffet er et humant IL-18-antistoff.

5. Anvendelse ifølge krav 1, der det IL-18-bindende proteinet er glykosylert på ett eller flere steder.

6. Anvendelse ifølge krav 1, der det fusjonerte proteinet omfatter en immunoglobulin (lg) -fusjon..

7. Anvendelse ifølge krav 1, der det funksjonelle derivatet omfatter minst én enhet festet til én eller flere funksjonelle grupper, som fremkommer som én eller flere sidekjeder på aminosyrerestene.

8. Anvendelse som angitt i krav 7, der enheten er en polyetylenglykol (PEG) - enhet.

9. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der medikamentet ytterligere omfatter et interferon, for simultan, sekvensiell eller separat anvendelse.

10. Anvendelse ifølge krav 9, der interferonet er interferon-a eller interferon-B.

11. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der medikamentet ytterligere omfatter tumornekrosefaktor (TNF) for simultan, sekvensiell eller separat anvendelse.

12. Anvendelse ifølge krav 11, der TNF er TNF-alfa.

13. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der medikamentet ytterligere omfatter et anti-inflammatorisk middel for simultan, sekvensiell eller separat anvendelse..

14. Anvendelse ifølge krav 13, der det anti-inflammatoriske middelet er en COX-inhibitor, spesielt en COX-2-inhibitor.

15. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der medikamentet ytterligere omfatter en antioksidant for simultan, sekvensiell eller separat anvendelse.

16. Anvendelse ifølge ethvert av de foregående krav, der inhibitoren av IL-18 er benyttet i en mengde på omtrent 0,001-100 mg/kg kroppsvekt, eller omtrent 0,01-10 mg/kg kroppsvekt eller omtrent 0,1-5 mg/kg kroppsvekt eller omtrent 1-3 mg/kg kroppsvekt.

17. Anvendelse ifølge ethvert a de foregående krav, der IL-18-inhibitoren blir administrert subkutant.