SK288413B6 - Použitie proteínu viažuceho IL-18 - Google Patents

Abstract

Použitie proteínu viažuceho IL-18 (IL-18BP) na výrobu lieku na liečenie traumatického poškodenia mozgu, pričom proteín viažuci IL-18 inhibítor sa podáva v jedinej dávke 3 dni po poranení.

Description

Vynález sa týka oblasti patologických stavov mozgu. Konkrétnejšie sa týka použitia inhibítora IL-18 na liečenie a/alebo prevenciu poškodenia centrálneho nervového systému (CNS), zvlášť traumatického poškodenia mozgu.

Doterajší stav techniky

V roku 1989 bola opísaná endotoxínom vyvolaná aktivita séra, ktorú indukoval interferón-γ (IFhP-γ) získaný z buniek sleziny myší (Nakamura a spol., 1989). Táto aktivita séra nepôsobila ako priamy podnet pre IFN-γ, ale skôr ako spoločný stimulant spolu s IL-2 alebo mitogénmi. Pokus získať a vyčistiť túto účinnú látku z post-endotoxínového séra myší poskytol podľa všetkého homogénnu 50 až 55 kDa bielkovinu. Pretože iné cytokíny môžu pôsobiť ako spolustimulanty na tvorbu IFN-γ, neschopnosť neutralizujúcich protilátok pre IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 alebo TNF neutralizovať aktivitu séra bola navrhnutá ako rozlišujúci faktor. V roku 1995 tí istí vedci demonštrovali, že endotoxínom vyvolaný spolustimulant na tvorbu IFN-γ bol prítomný v extraktoch pečene myší po predchádzajúcom pôsobení s P. acnes (Okamura a spol., 1995). V tomto modeli sa zväčšila populácia hepatických makrofágov (Kupfferove bunky) a u týchto myší sa stala smrteľnou nízka dávka bakteriálneho lipopolysacharidu (LPS), ktorá pre myši bez predkondiciovania nie je smrteľná. Faktor pomenovaný ako IFN-y-indukujúci faktor (IGIF) a neskôr označený ako interleukín-18 (IL-18) bol vyčistený ako homogénna látka z 1200 gramov myších pečení po pôsobení P. acnes. Degenerované oligonukleotidy získané z aminokyselinových sekvencií čisteného IL-18 sa použili na klonovanie myšej IL-18 cDNA. IL-18 je 18 až 19 kDa bielkovina zo 157 aminokyselín, ktorá nemá žiadnu viditeľnú podobnosť na niektorý peptid v databázach. Mediátorové RNA pre IL-18 a interleukín-12 (IL-12) sa ľahko detegujú v Kupfferovych bunky a aktivovaných makrofágoch. Rekombinantný IL-18 indukuje IFN-gama silnejšie než IL-12, zrejme pomocou samostatného mechanizmu (Micallef a spol., 1996). Podobne ako endotoxínom vyvolaná aktivita séra, IL-18 neindukuje IFN-γ sám, ale pôsobí primárne ako spolustimulant s mitogénmi alebo IL-2. IL-18 zosilňuje proliferáciu T buniek, zrejme pomocou od IL-2 závislého mechanizmu, a zosilňuje tvorbu Thl cytokínu in vitro a vykazuje synergizmus v spojení s IL-12 v zmysle zvýšenej tvorby IFN-γ (Maliszewski a spol., 1990).

Po naklonovaní myšej formy bola opísaná sekvencia ľudskej cDNA pre IL-18 v roku 1996 (Ushio a spol., 1996).

Pomocou klonovania IL-18 z upravených tkanív a štúdiom IL-18 génovej expresie sa zistila tesná asociácia tohto cytokínu s autoimunitnou chorobou. U neobéznych diabetických (NOD) myší sa spontánne vyvíja autoimunitná inzulitída a diabetes, ktoré môžu byť urýchlené a synchronizované pomocou jedinej injekcie cyklofosfamidu. Pomocou reverznej transkriptázy PCR bola v pankrease NOD myší počas skorých štádií inzulitídy preukázaná IL-18 mRNA. Hladiny IL-18 mRNA narástli rýchlo po cyklofosfamidovom pôsobení a predchádzali vzrastu IFN-γ mRNA a následne diabetes. Je zaujímavé, že tieto kinetiky sledujú kinetiku IL-12-p40 mRNA, čo vedie k tesnej korelácii jednotlivých hladín mRNA. Klonovanie IL-18 cDNA z pankreasovej RNA nasledované sekvenovaním ukázalo zhodu s IL-18 sekvenciou klonovanou z Kupfferovych buniek a in vivo predaktivovaných makrofágov. NOD myšie makrofágy tiež poskytli odozvu na cyklofosfamid s IL-18 génovou expresiou, kým makrofágy z Balb/c myší spracované paralelne odozvu neposkytli. Preto je IL-18 expresia abnormálne regulovaná u autoimunitných NOD myší a tesne spojená s vývojom diabetes (Rothe a spol., 1997).

IL-18 hrá silnú úlohu v imunoregulácii alebo pri zápaloch zosilnením funkčnej aktivity Fas ligandu na Thl bunky (Conti a spol., 1997). IL-18 sa tiež exprimuje v kôre nadobličiek, a preto môže byť vylučovaným neuroimunomodulátorom, ktorý hrá dôležitú úlohu v zosúladení imunitného systému po stresujúcej situácii (Chater, 1986).

In vivo sa IL-18 tvorí pomocou štiepenia pro-IL-18 a jeho endogénna aktivita sa prejaví ako IFN-7 tvorba v P. acnes a LPS-sprostredkovaná letalita. Zrelý IL-18 sa tvorí zo svojho prekurzora pomocou IL-Ιβ konvertujúceho enzýmu (IL-lbeta- konvertujúci enzým, ICE, caspáza-1).

IL-18 receptor pozostáva najmenej z dvoch zložiek spolupôsobiacich pri viazaní ligandu. Našli sa miesta viazania s vysokou a nízkou afinitou pre IL-18 u myších IL-12 stimulovaných T buniek (Yoshimoto a spol., 1998), čo poukazuje na viacnásobný receptorový komplex. Doteraz boli identifikované dve receptorové subjednotky, obe patriace do IL-1 receptorovej rodiny (Parnet a spol., 1996). Signálna transdukcia IL-18 zahrnuje aktiváciu NF-kB (DiDonato a spol., 1997).

Nedávno bola z ľudského moču izolovaná rozpustná bielkovina, ktorá má vysokú afinitu pre IL-18, a bola opísaná ľudská a myšia cDNA (Novick a spol., 1999; WO 99/09063). Táto bielkovina bola označená ako IL-18 viažuca bielkovina (IL-18BP).

IL-18BP nie je extracelulárna doména jedného zo známych IL-18 receptorov, aleje to vylučovaná prirodzene cirkulujúca bielkovina. Patrí do novej rodiny vylučovaných bielkovín. Táto rodina ďalej zahrnuje via2 ceré Poxvírus-kódované bielkoviny, ktoré majú vysokú homológiu ku IL-18BP (Novick a spol., 1999). IL-18BP je konštitutívne exprimovaný v slezine, patrí do imunoglobulínovej superrodiny a má obmedzenú homológiu k IL-1 typ II receptoru. Jeho gén bol lokalizovaný na ľudskom chromozóme 11 q 13 a nezistil sa žiaden exón kódujúci transmembránovú doménu v 8,3 kb genomickej sekvencií (Novick a spol., 1999).

Štyri ľudské a dve myšie izoformy IL-18BP pochádzajúce z mRNA štiepenia a nachádzajúce sa v rôznych cDNA knižniciach boli exprimované, čistené a ohodnotené z hľadiska viazania a neutralizácie IL-18 biologických aktivít (Kim a spol., 2000). Ľudská IL-18BP izoforma a (IL-18BPa) vykazovala najväčšiu afinitu pre IL-18 s rýchlym nástupom a pomalým doznievaním a s disociačnou konštantou (K(d)) 399 pmol/1. IL-18BPc zdieľa Ig doménu IL-18BPa s výnimkou 29 C-terminálnych aminokyselín; K(d) IL-18BPc je 10-krát menšia (2,94 nmol/1). Napriek tomu, IL-18BPa a IL-18BPc neutralizujú IL-18 > 95 % pri molovom prebytku dva. IL-18BPb a IL-18BPd izoformy nemajú úplnú Ig doménu a nemajú schopnosť viazať alebo neutralizovať IL-18. Myšie IL-18BPc a IL-18BPd izoformy, ktoré majú identickú Ig doménu, tiež neutralizujú > 95 % myšieho IL-18 pri molovom prebytku dva. Avšak myší IL-18BPd, ktorý zdieľa spoločný C-terminálny motív s ľudským IL-18BPa, tiež neutralizuje ľudský IL-18. Molekulové modelovanie identifikovalo veľké zmiešané elektrostatické a hydrofobické miesto viazania v Ig doméne IL-18BP, ktoré doložilo jeho vysokú afinitu viazania na ligand (Kim a spol., 2000).

Traumatické poškodenie mozgu (TBI), tiež jednoducho nazývané poranenie hlavy alebo uzavreté poranenie hlavy (CHI), znamená poranenie centrálneho nervového systému, pri ktorom poškodenie mozgu je od externého úderu do hlavy. Najčastejšie sa to stane počas automobilovej alebo cyklistickej nehody, ale môže sa tiež vyskytnúť ako výsledok topenia sa, infarktu, mŕtvice a infekcie. Tento typ traumatického poškodenia mozgu bude obvykle dôsledkom nedostatku kyslíka alebo zásobovania mozgu krvou, a preto môže byť označené ako anoxické poškodenie.

Vnútorné poranenie hlavy sa vyskytuje pri údere do hlavy, ako napríklad pri nehode s motorovým vozidlom alebo pri páde. V tomto prípade lebka predstavuje stacionárny objekt a mozog, ktorý je vnútri lebky, sa otáča a krúti na svojej osi (mozgový kmeň), čo spôsobí lokalizované alebo rozsiahle poškodenie. Teda mozog, mäkká hmota obkolesená tekutinou, ktorá mu dovoľuje plávať, môže naraziť proti lebke, čo spôsobí ďalšie poškodenie.

Bezprostredne po úraze môže nastať perióda bezvedomia, ktorá môže trvať minúty, týždne alebo mesiace. V dôsledku krútenia a nárazu, traumatický poškodený mozog pacienta obvykle získa poškodenie alebo podliatiny mnohých častí mozgu. Toto sa nazýva difúzne poškodenie alebo nestrelné poranenie mozgu. Typy mozgových poškodení vyskytujúce sa pri nestrelnom poškodení môžu byť klasifikované ako buď primárne, alebo sekundárne.

Primárne mozgové poškodenie sa prejavuje v čase poranenia, hlavne na mieste nárazu, zvlášť, ak dochádza k fraktúre lebky. Veľká pomliaždenina môže byť spojená s intracerebrálnou hemoragiou alebo môže byť sprevádzaná kortikálnymi laceráciami. Difúzne axonálne poškodenia sa vyskytujú ako výsledok šmykového a ťahového napätia neurónových výbežkov spôsobených rotačnými pohybmi mozgu v lebke. Môžu sa vyskytnúť malé hemoragické lézie alebo difúzne poškodenie axónov, ktoré môžu byť detegované len mikroskopicky.

Sekundárne mozgové poškodenie sa vyskytuje ako výsledok komplikácií vyvíjajúcich sa po momente poranenia. Zahrnuje intrakraniálnu hemoragiu, traumatické poškodenie extracerebrálnych artérií, intrakraniálnu herniáciu, hypoxické mozgové poškodenie alebo meningitídu.

Otvorené poranenie hlavy je viditeľné poškodenie hlavy a môže byť výsledkom strelného poranenia, nehody alebo prechodom nejakého objektu cez lebku do mozgu (strelné poranenie mozgu). Tento typ poranenia hlavy pravdepodobnejšie poškodí špecifickú oblasť mozgu.

Takzvané mierne poškodenia mozgu sa môžu vyskytnúť bez straty vedomia a môže sa vyskytnúť len pocit omámenia alebo stav zmätenosti trvajúci krátky čas. Hoci poskytovaná medicínska starostlivosť môže byť minimálna, osoby s poškodením mozgu bez kómy môžu pociťovať symptómy a zhoršenie stavu podobné tým, ktorými trpí ten, kto prežil poranenie s kómou.

Ako odozva na úraz sa v mozgu vyskytujú zmeny, ktoré vyžadujú monitorovanie, aby sa zabránilo ďalšiemu poškodeniu. Po ťažkom poranení hlavy sa veľkosť mozgu často zväčší. Toto sa nazýva opuch mozgu a vyskytuje sa vtedy, keď dochádza k rastu množstva krvi v mozgu. Neskôr sa pri chorobe môže voda zadržať v mozgu, čo sa nazýva mozgový edém. Aj opuch mozgu aj edém mozgu má za následok v nadmerný tlak v mozgu nazývaný intrakraniálny tlak (ICP).

Kóma je dlhodobé bezvedomie priamo nasledujúce po traumatickom poranení hlavy.

Existujú viaceré hladiny kómy. Hladiny kómy môžu byť merané pomocou postupu schopnosti odozvy (reakcie) osoby s poranením hlavy. V akútnej fáze poranenia hlavy sa používa Glasgowská stupnica kómy. Pri zlepšení stavu pacienta alebo pri jeho stabilizácii sa používa Rancho Los Amigos stupnica, pri ktorej sa merajú hladiny kognitívneho (porozumenie a pochopenie) myslenia.

Poškodenie mozgu často spôsobuje trvalú debilitu, ako napríklad posttraumatická epilepsia, trvalý vegetatívny stav alebo posttraumatická demencia.

Poranenie miechy je ďalší typ CNS poranenia. Poškodenie miechy spôsobuje väčšinu prijatí na hospitalizáciu pre paraplegiu a tetraplegiu. Viac ako 80 % výskytu je dôsledkom cestných nehôd. Klinicky sa rozoznávajú dve hlavné skupiny poranení: otvorené poškodenie a uzavreté poškodenie.

Otvorené poškodenie spôsobuje priamy úraz miechy a nervových koreňov. Perforačné poškodenie môže spôsobiť extenzívne roztrhnutie a hemoragiu. Uzavreté poškodenie spôsobuje väčšinu spinálnych poškodení a sú obvykle spojené so zlomeninami/dislokáciami spinálneho stĺpca, čo je obvykle preukázateľné rádiologický. Poškodenie miechy závisí od rozsahu poškodenia kosti a môže byť uvažované v dvoch hlavných stupňoch: primárne poškodenie, čo sú pomliaždeniny, prerušenia nervových vlákien a hemoragická nekróza; a sekundárne poškodenie, čo sú extradurálny hematóm, infarkt, infekcia a edém.

Neskoré efekty poškodenia miechy zahrnujú: stúpajúcu a klesajúcu anterográdnu degeneráciu poškodených nervových vlákien, posttraumatickú syringomyéliu a systemické efekty paraplegie, ako napríklad infekcie urinárneho traktu a hrudníka, poruchy tlaku a degenerácia svalov.

Patológia traumatického poškodenia mozgu je veľmi zložitá a ešte slabo pochopená. Výskumné úsilie v poslednej dekáde osvetlilo dôležitú úlohu cytokínov uvoľnených systemicky a lokálne v intratekálnom kompartmente po poškodení mozgu a bola urobená hypotéza duálneho efektu prozápalových cytokínov, ako napríklad TNF, IL-6 alebo IL-8, na základe zistení časovozávislých priaznivých a škodlivých účinkov týchto mediátorov (Morganti-Kossmann a spol., 1997; Kossmann a spol., 1997; Shohami a spol., 1999, Scherbel a spol., 1999; Whalen a spol., 2000). Ako je opísané, nedávno objavený cytokín IL-1 rodiny je IL-18. Nedávne štúdie demonštrovali, že IL-18 je konštitutívne exprimovaný v CNS myší, potkanov a ľudí in vivo (Culhane a spol., 1998; Jander a Stoll, 1998; Prinz a spol., 1999; Fassbender a spol., 1999; Wheeler a spol., 2000), ako aj v primárnych kultúrach astrocytov a mikroglia, ale nie neurónov, in vitro (Conti a spol., 1999). Zvýšené IL-18 hladiny boli detegované v cerebrospinálnej tekutine (CSF) pacientov so zápalovými CNS chorobami, ako napríklad bakteriálna meningitída a vírusová meningoencefalitída, ale nie v CSF pacientov s roztrúsenou sklerózou (MS) (Fassbender a spol., 1999). Oproti zisteniu všeobecne nízkej intratekálnej IL-18 hladiny u MS pacientov, zvýšená IL-18 mRNA expresia bola demonštrovaná v mieche Lewis potkanov s experimentálnou autoimunitnou encefalomyelitídou (EAE), čo je zvierací model pre MS (Jander a Stoll, 1998). Expresia a funkčný význam IL-18 pri neuroúrazoch doteraz neboli preskúmané.

Odkazy

1. Altschul S F a spol., J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F a spol., Nucleic Acids Res., 25: 389-3402, 1997

2. Chater, K. F. a spol., in Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), str. 45-54).

3. Chen, Y., S. Constantini, V. Trembovler, M. Weinstock, and E. Shohami. 1996. An experimental model of closed head injury in mice: pathophysiology, histopathology, and cognitive deficits. J. Neurotrauma 13: 557-68

4. Conti, C.B., N.Y. Calingasan, Y. Kim, H. kim, Y. Bae, E. Gibson, and T. H. Joh. 1999. Cultures of astrocytes and microglia express interleukin-18. Mol. Brain Res. 67: 46-52

5. Conti, B., J. W. Jahng, C. Tinti, J. H. Son, and T. H. Joh. 1997. Induction of interferon-gamma inducing factor in the adrenal cortex. J. Biol. Chem. 272: 2035-2037.

6. Culhane, A.C, M.D. Halí, N.J. Rothwell, and G.N. Luheshi. 1998. Cloning of rat brain interleukin-18 cDNA. Mol. Psychiatry 3: 362-6

a. Devereux J a spol., Nucleic Acids Res, 12, 387-395,1984.

7. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E and Karin, M. (1997), Náture 388, 16514-16517.

8. Elliott, M. J., Maini, R. N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H., and Woody, J.N., 1994, Lancet 344, 1125-1127.

9. Fassbender, K., O. Mielke, T. Bertsch, F. Muehlhauser, M. Hennerici, M. Kurimoto, and S. Rossol.

1999. Interferon-y-inducing factor (IL-18) and interferon-γ in inflammatory CNS diseases. Neurology 53: 1104-6

10. Jander, S., and G. Stoll. 1998. Differential induction of interleukin-12, interleukin-18, and interleukin1β coverting enzýme mRNA in experimental autoimmune encephalomyelitis of the Lewis rat. J. Neuroimmunol. 91: 93-9

11. Lancet 1975 Mar 1 ; 1(7905):480-4. Jennett B, Bond M.

12. Izaki, K. (1978) Jpn. J. Bacteriol. 33: 729-742).

13. Kim SH, Eisenstein M, Rezníkov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinarello C A. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97: 1190-1195.

14. Kossmann, T., P.F. Stahel, P. M. Lenzlinger, H. Redl, R.W. Dubs, O. Trentz, G. Schlag, and M. C. Morganti-Kossmann. 1997. lnterleukin-8 released into the cerebrospinal fluid after brain injury is asso4 ciated with blood brain- barrier dysfunction and nerve growth factor production. J. Cereb. Blood Flow Metab. 17: 280-9

15. Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, Scallon B, Moore MA, Vilcek J, Daddona P, a spol., Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody.Mol Immunol 1993 Nov 30: 16 1443-53

16. Maliszewski, C. R., T. A. Sato, T. Vanden Bos, S. Waugh, S. K. Dower, J. Slack, M. P. Beckmann, and K. H. Grabstein. 1990. Cytokine receptors and B celí functions. I. Recombinant soluble receptors specifically inhibit IL-1- and IL-4-induced B celí activities in vitro. J. Immunol. 144: 3028-3033.

17. Micallef, M. J., T. Ohtsuki, K. Kohno, F. Tanabe, S. Ushio, M. Namba, T. Tanimoto, K. Torigoe, M. Fujii, M. Ikeda, S. Fukuda, and M. Kurimoto. 1996. Interferon-gamma-inducing factor enhances T helper 1 cytokine production by stimulated human T cells: synergism with interleukin-12 for interferongamma production. Eur-J-Immunol 26:1647-51 issn: 0014-2980.

18. Morganti-Kossmann, M.C., P. M. Lenzlinger, V. Hans, P. Stahel, E. Csuka, E. Ammann, R. Stocker, O. Trentz, and T. Kossmann. 1997. Production of cytokines following brain injury: beneficial and deleterious for the damaged tissue. Mol. Psychiatry 2: 133-6

19. Nakamura K, Okamura H, Wada M, Nagata K, Tamura T. Infect Immun 1989 Feb;57(2): 590-5

20. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Rezníkov, L, Dinarello, C, and Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136.

21. Okamura H, Nagata K, Komatsu T, Tanimoto T, Nukata Y, Tanabe F, Akí ta K, Torigoe K, Okura T, Fukuda S, a spol., Infect Immun 1995 Oct;63(10): 3966-72

22. Parnet, P, Garka, K E, Bonnert, T P, Dower, S K, and Sims, J E. (1996), J. Biol. Chem. 271, 3967-3970.

a. Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990

b. Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444- 2448,1988

23. Prinz, M., and U. K. Hanisch. 1999. Murine microglial celíš produce and respond to interleukin-18. J. Neurochem. 72: 2215-8

24. J Clin Invest 1997 Feb 1 ;99(3): 469-74 Rothe H, Jenkins NA, Copeland NG, Kôlb H.

25. Scherbel, U., R. Raghupathi, M. Nakamura, K. E. Saatman, J. Q. Trojanowski, E. Neugebauer, M. W. Marino, and T. K. Mclntosh. 1999. Differential acute and chronic responses of tumor necrosis factordeficient mice to experimental brain injury. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 8721-6

26. Shohami, E., I. Ginis, and J. M. Hallenbeck. 1999. Dual role of tumor necrosis factor alpha in brain injury. Cytokine Growth Factor Rev. 10: 119-30

27. Shohami, E; Beit-Yannai E., Horowitz M; Kohen R (1997): J. Cereb. Blood FlowMetab. 17, 1007-1019.

28. Teasdale G, Jennett B. Lancet 1974 Jul 13;2(7872): 81-4

29. Stahel PF, Shohami E, Younis FM, Kariya K, Otto VI, Lenzlinger PM, Grosjean MB, Eugster HP, Trentz O, Kossmann T, Morganti-Kossmann MC. J Cereb Blood Flow Metab 2000 Feb;20(2): 369-80

30. Ushio S, Namba M, Okura T, Hattori K, Nukada Y, Akita K, Tanabe F, Konishi K, Micallef M, Fujii M, Torigoe K, Tanimoto T, Fukuda S, Ikeda M, Okamura H, Kurimoto M. J Immunol 1996 Jun 1;156(11): 4274-9

31. Wheeler, R. D., A .C. Culhane, M.D. Halí, S. Pickering-Brown, N. J. Rothwell, and G. N. Luheshi.

2000. Detection of the interleukin-18 family in rat brain by RT-PCR. Mol. Brain Res. 77: 290-3

32. Whalen, M J., T. M. Carlos, P. M. Kochanek, S. R. Wisniewski, M. J. Bell, R. S. Clark, S. T. DeKosky, D. W. Marion, and P.D. Adelson. 2000. lnterleukin-8 is increased in cerebrospinal fluid of children with severe head injury. Crit. Čare Med. 28: 929-34

33. Yoshimoto T, Takeda, K, Tanaka, T, Ohkusu, K, Kashiwamura, S, Okamu-ra, H, Akira, S and Nakanishi, K (1998), J. Immunol. 161, 3400-3407.

Podstata vynálezu

Tento vynález sa týka patofyziologickej úlohy IL-18 v CNS chorobách. Je založený na zistení, že liečenie myší s inhibítormi IL-18 buď jednu hodinu, alebo tri dni po experimentálnom uzavretom poranení hlavy (CHI), vedie k zlepšenej obnove a oslabenému rozsahu poškodenia mozgu v porovnaní s kontrolnými zvieratami.

Podstatou vynálezu je teda použitie IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu poranenia centrálneho nervového systému (CNS), a zvlášť traumatického poškodenia mozgu.

Použitie kombinácií IL-18 inhibítora s interferónom a/alebo TNF, a/alebo inhibítorom zápalu, a/alebo antioxidantmi sa tiež poskytuje podľa tohto vynálezu. Aby sa použili génové terapeutické prístupy dodávania IL-18 inhibítora do chorobných tkanív alebo buniek, týkajú sa ďalšie aspekty vynálezu použitia molekúl nukleových kyselín obsahujúcich kódujúcu sekvenciu IL-18 inhibítora na liečenie a/alebo prevenciu CNS pora5 nemá. Vynález sa tiež týka použitia buniek geneticky upravených na expresiu IL-18 inhibítorov na prevenciu a/alebo liečenie CNS poranení.

Tento vynález je založený na zistení štatisticky významného priaznivého účinku IL-18 inhibítora na obnovu poškodeného mozgu v modeli na myšiach uzavretého poranenia hlavy. V zhode s týmto vynálezom sa ďalej zistilo, že IL-18 je v mozgu a cerebrospinálnej tekutine po traumatickom poškodení mozgu nadregulovaný, čo poukazuje na to, že tento prozápalový cytokín hrá dôležitú úlohu v patogenéze poškodenia mozgu.

Preto sa vynález týka použitia IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu poranení centrálneho nervového systému (CNS).

Vynález sa ďalej týka použitia IL-18 inhibítora na výrobu lieku na liečenie a/alebo prevenciu komplikácií a neskorých účinkov CNS poranení.

CNS poranením môže byť traumatické poškodenie mozgu alebo uzavreté poranenie hlavy alebo poranenie miechy.

Poškodenie mozgu môže mať vaskulárny pôvod.

V kontexte tohto vynálezu sa výraz poranenie centrálneho nervového systému alebo CNS poranenie týka akéhokoľvek poranenia mozgu alebo miechy, bez ohľadu na dobu nástupu alebo na jeho príčinu. Táto príčina môže napríklad byť mechanická alebo to môže byť infekcia. CNS poranenie a jeho klinické symptómy a implikácie boli opísané podrobne v časti Doterajší stav techniky. CNS poranenie zahrnuje napríklad úraz alebo akékoľvek iné poškodenie mozgu alebo miechy a môže tiež byť nazývané neurotrauma.

Poškodenie mozgu môže napríklad zahrnovať alebo spôsobiť jednu poruchu alebo viaceré z nasledujúcich porúch: 1. zhoršenie pozornosti; 2. zhoršenie spoznávania; 3. zhoršenie reči; 4. zhoršenie pamäti; 5. porucha chovania; 6. motorické poruchy; 7. akékoľvek iné neurologické dysfunkcie.

Poranenie miechy môže napríklad spôsobiť paraplegiu alebo tetraplegiu.

Komplikácie alebo neskoré účinky CNS poranenia môže tiež byť liečené a/alebo im môže byť predchádzané v zhode s týmto vynálezom. Komplikácie a neskoré účinky poškodení mozgu boli opísané v časti Doterajší stav techniky. Zahrnujú, ale nie sú na ne obmedzené, napríklad kómu, meningitídu, post-traumatickú epilepsiu, posttraumatickú demenciu, degeneráciu nervových vlákien alebo posttraumatickú syringomyéliu alebo hemoragiu.

Tento vynález sa tiež týka použitia IL-18 inhibítorov na prípravu lieku na liečenie a/alebo prevenciu akéhokoľvek poranenia mozgu, ktoré má vaskulárny pôvod, ako napríklad hypoxické poškodenie mozgu cerebrálnym infarktom, ischémiou, cerebrovaskulárnou príhodou alebo mŕtvicou.

Pojmy liečenie a prevencia, ako sa používajú v tomto dokumente, treba chápať ako čiastočnú alebo úplnú prevenciu, inhibovanie, zoslabenie, zmiernenie alebo zvrátenie jedného symptómu alebo viacerých symptómov alebo príčiny (príčin) CNS poranenia, ako aj symptómov, chorôb alebo komplikácií sprevádzajúcich CNS poranenie. Pri liečení CNS poranenia sa látky podľa tohto vynálezu podávajú po nástupe choroby, prevencia sa týka podávania týchto látok predtým, ako sú zaznamenané u pacienta znaky choroby.

Liečenie CNS poranenia je výhodne v zhode s týmto vynálezom. Výhodne sa na liečenie CNS poranenia IL-18 inhibítor podáva čo najskôr po CNS poranení, napríklad v prvej hodine po poranení. Avšak, ako je uvedené v príkladoch nižšie, ukázalo sa, že IL-18 inhibítor vykazuje svoje priaznivé účinky na poškodenie mozgu aj vtedy, keď sa podáva tri dni po poškodení mozgu. Preto je na liečenie CNS poranenia výhodné podávať IL-18 inhibítor počas troch dní od poranenia.

Pojem inhibítor IL-18 v kontexte tohto vynálezu znamená akékoľvek molekuly modulujúce IL-18 tvorbu a/alebo pôsobenie takým spôsobom, že IL-18 tvorba a/alebo pôsobenie je zoslabené, znížené alebo je mu čiastočne, podstatne alebo úplne zabránené, alebo je zablokované. Pojem IL-18 inhibítor je uvažovaný tak, že zahrnuje inhibítory IL-18 tvorby, ako aj inhibítory IL-18 pôsobenia.

Inhibítorom tvorby môže byť akákoľvek molekula negatívne pôsobiaca na syntézu, spracovanie alebo dozrievanie IL-18. Inhibítory uvažované podľa tohto vynálezu môžu byť napríklad supresory génovej expresie interleukínu IL-18, látky pôsobiace proti mRNA, čím znižujú alebo bránia transkripcii IL-18 mRNA alebo vedú k degradácii mRNA, zhoršeniu správneho skladania bielkovín, alebo k čiastočnej alebo podstatnej prevencii vylučovania IL-18, proteázy degradujúce IL-18, hneď, ako bol syntetizovaný, inhibítory proteáz štiepiacich pro-IL-18, pričom sa tvorí zrelý IL-18, ako napríklad inhibítory caspázy-1 a podobne.

Inhibítorom IL-18 pôsobenia môže byť napríklad IL-18 antagonistická látka. Antagonistické látky môžu buď viazať alebo sekvestrovať IL-18 molekulu samotnú s dostatočnou afinitou a špecificitou na čiastočnú alebo podstatnú neutralizáciu IL-18 alebo IL-18 väzbového miesta (miest) zodpovedného za IL-18 viazanie na jeho ligandy (ako napríklad na jeho receptory). Antagonistická látka môže tiež inhibovať IL-18 signálny mechanizmus, ktorý je aktivovaný v bunke po IL-18 viazaní na jeho receptor.

Inhibítorom IL-18 pôsobenia môžu tiež byť rozpustné IL-18 receptory alebo molekuly napodobňujúce receptory, alebo činidlá blokujúce IL-18 receptory, alebo IL-18 protilátky, ako napríklad polyklonálne alebo monoklonálne protilátky, alebo akékoľvek iné činidlo alebo molekula brániaca viazaniu IL-18 na jeho ciele, čím sa zmenšuje alebo bráni spustenie intra- alebo extracelulárnych reakcií sprostredkovaných pomocou IL-18.

Vo výhodnom uskutočnení tohto vynálezu je inhibítor IL-18 vybraný z inhibítorov caspáza-1 (ICE), protilátok namierených proti IL-18, protilátok namierených proti akejkoľvek z IL-18 receptorových subjednotiek, inhibítorov IL-18 signálneho mechanizmu, antagonistických látok IL-18, ktoré konkurujú IL-18 alebo sa naň viažu a blokujú IL-18 receptor, a na IL-18 viažucich sa bielkovín, ich izoforiem, muteínov, kondenzovaných bielkovín, funkčných derivátov, aktívnych frakcií alebo cirkulačné permutovaných derivátov alebo solí.

Pojem IL-18 viažuce bielkoviny sa používa v tomto dokumente synonymne s IL18BP. Zahrnuje na IL-18 sa viažuce bielkoviny, ako sú definované vo WO 99/09063 alebo v Novick a spol., 1999 vrátane zviazaných variantov a/alebo izoforiem IL-18 viažucich bielkovín, ako sú definované v Kim a spol., 2000. Zvlášť ľudské izoformy a a c IL-18BP sú užitočné v zhode s týmto vynálezom. Bielkoviny užitočné podľa tohto vynálezu môžu byť glykozylované alebo neglykozylované, môžu byť získané z prírodných zdrojov, ako napríklad z moču, alebo môžu výhodne byť vyrábané rekombinačne. Rekombinačná expresia môže byť uskutočnená v prokaryotických systémoch expresie, ako napríklad E. coli, alebo v eukaryotických systémoch expresie a výhodne v systémoch expresie cicavcov. Bunkovým kmeňom zvlášť vhodným pre IL-18 inhibítory podľa tohto vynálezu sú bunky vaječníkov čínskeho škrečka (CHO).

Rekombinantná výroba IL-18 inhibítorov, ak sa rekombinačne exprimujú v bunkách alebo bunkových kmeňoch cicavcov, môže výhodne byť uskutočnená v bezsérovom bunkovom kultivačnom prostredí.

V tomto dokumente sa pojem muteíny používa tak, že znamená analógy IL-18BP alebo analógy vírusového IL-18BP, v ktorom jeden aminokyselinový zvyšok alebo viaceré z aminokyselinových zvyškov prírodného IL-18BP alebo vírusového IL-18BP sú nahradené rôznymi aminokyselinovými zvyškami, alebo sú odstránené, alebo jeden alebo viaceré aminokyselinové zvyšky sú pridané k prirodzenej sekvencii IL-18BP, aminokyselinový zvyšok alebo vírusovej IL-18BP, bez významného zmenšenia aktivity výsledných produktov v porovnaní s neupraveným typom IL-18BP alebo vírusovým IL-18BP. Tieto muteíny sa pripravujú pomocou známych syntéz a/alebo pomocou miestne namierených techník mutagenézy, alebo akýchkoľvek iných známych na to vhodných techník.

Akýkoľvek takýto muteín má výhodne sekvenciu aminokyselín dostatočne kopírujúcu sekvenciu IL-18BP alebo dostatočne kopírujúcu vírusový IL-18BP tak, aby mal v podstate podobnú aktivitu ako IL-18BP. Jednou aktivitou IL-18BP je jeho schopnosť viazania IL-18. Pretože muteín má výraznú aktivitu viazania sa na IL-18, môže byť použitý na čistenie IL-18, ako napríklad pomocou afinitnej chromatografie, a teda môže byť uvažované, že má v podstate podobnú aktivitu na IL-18BP. Teda pomocou bežných experimentov zahrnujúcich podrobenie takéhoto muteínu napríklad jednoduchej sendvičovej konkurenčnej skúške, čím sa určí, či sa viaže alebo nie na vhodne označený IL-18, ako napríklad rádioimunoskúška alebo ELISA skúška, môže byť určené, či akýkoľvek daný muteín má aktivitu v podstate podobnú na IL-18BP. Jednoduché funkčné skúšky na vyhodnotenie biologickej aktivity IL-18BP boli opísané podrobne vo WO 99/09063, napríklad v príkladoch 2 (viazanie na IL-18 podľa hodnotenia pomocou zosieťovania) alebo 5 (inhibícia IL-18 vyvolaná INF-gama indukciou v monojadrových bunkách krvi).

Vo výhodnom uskutočnení má akýkoľvek takýto muteín najmenej 40 % zhodu alebo homológiu so sekvenciou buď IL-18BP alebo vírusovokódovaného IL-18BP homológu. Výhodnejšie má najmenej 50 %, najmenej 60 %, najmenej 70 %, najmenej 80 % alebo najvýhodnejšie najmenej 90 % zhodu alebo homológiu.

Muteíny IL-18BP polypeptidov alebo muteíny vírusových IL-18BP, ktoré môžu byť použité v zhode s týmto vynálezom, alebo ich kódujúce nukleové kyseliny, zahrnujú konečnú sadu v podstate zodpovedajúcich sekvencii ako substituované peptidy alebo polynukleotidy, ktoré môžu byť rutinne získané odborníkmi v tejto oblasti bez nadmerných experimentov na základe vysvetlení a návodu uvedeného v tomto dokumente.

Muteíny v zhode s týmto vynálezom zahrnujú bielkoviny kódované nukleovými kyselinami, ako napríklad DNA alebo RNA, ktoré hybridizujú na DNA alebo RNA, ktoré kódujú IL-18 inhibítor v zhode s týmto vynálezom, za mierne alebo vysoko prísnych podmienok. Pojem prísne podmienky označuje hybridizáciu a následné podmienky premývania, ktoré odborník v tejto oblasti konvenčné označuje ako prísne. Pozri Ausubel a spol., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., §§6.3 a 6.4 (1987, 1992), a Sambrook a spol. (Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., a Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Príklady prísnych podmienok zahrnujú bez obmedzenia podmienky premývania 12 až 20 °C pod vypočítanou Tm študovaného hybridu, napríklad, 2 x SSC a 0,5 % SDS počas 5 minút, 2 x SSC a 0,1 % SDS počas 15 minút; 0,1 x SSC a 0,5 % SDS pri 37 °C počas 30 až 60 minút a potom 0,1 x SSC a 0,5 % SDS pri 68 °C počas 30 až 60 minút. Odborník v tejto oblasti rozumie, že prísnosť podmienok tiež závisí od dĺžky DNA sekvencii, oligonukleotidových sond (ako napríklad 10 až 40 báz) alebo zmiešaných oligonukleotidových sond. Ak sa používajú zmiešané sondy, je výhodné použiť tetrametylamóniumchlorid (TMAC) namiesto SSC. Pozri Ausubel, supra.

Vo výhodnom uskutočnení má akýkoľvek takýto muteín najmenej 40 % zhodu alebo homológiu so sekvenciou SEQ ID NO: 1, 2 alebo 3 pripojeného zoznamu sekvencii. Výhodnejšie má najmenej 50 %, najmenej 60 %, najmenej 70 %, najmenej 80 % alebo najvýhodnejšie najmenej 90 % zhodu alebo homológiu.

Zhoda odráža vzťah medzi dvoma alebo viacerými polypeptidovými sekvenciami alebo dvoma alebo viacerými polynukleotidovými sekvenciami, určený pomocou porovnania sekvencií. Všeobecne zhoda označuje presný súhlas nukleotid k nukleotidu alebo aminokyselina k aminokyseline dvoch polynukleotidových alebo dvoch polypeptidových sekvencií pri porovnávaní pozdĺž sekvencií.

Pre sekvencie, kde neexistuje presná zhoda, sa môže určiť % zhody. Všeobecne sa dve porovnávané sekvencie zarovnajú tak, aby poskytli maximálnu koreláciu medzi sekvenciami. Toto môže zahrnovať vloženie medzier buď do jednej, alebo do oboch sekvencií, čím sa zvýši stupeň zarovnania. % zhody môže byť určené pre celú dĺžku každej porovnávanej sekvencie (takzvané globálne zarovnanie), čo je zvlášť vhodné pre sekvencie rovnakej alebo veľmi podobnej dĺžky, alebo pre kratšie, definované dĺžky (takzvané lokálne zarovnanie), čo je vhodnejšie pre sekvencie nerovnakej dĺžky.

Metódy porovnávania zhody a homológie dvoch alebo viacerých sekvencií sú v tomto odbore známe. Napríklad môžu byť použité programy dostupné vo Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1 (Devereux J a spol., 1984), napríklad programy BESTFIT a GAP, na určenie % zhody medzi dvoma polynukleotidmi a % zhody a % homológie medzi dvoma polypeptidovými sekvenciami. BESTFIT používa algoritmus lokálnej homológie Smitha a Watermana (1981) a nachádza najlepšiu samostatnú oblasť podobnosti medzi dvoma sekvenciami. Iné programy na určenie zhody a/alebo podobnosti medzi sekvenciami sú tiež známe v tomto odbore, napríklad rodina programov BLAST (Altschul S.F, a spol., 1990, Altschul S. F. a spol., 1997, dostupná cez domovskú stránku NCBI na wwwj3chkglnLQÍÍLgoy) a FASTA (Pearson W R, 1990; Pearson 1988).

Výhodné zmeny pre muteíny v zhode s týmto vynálezom sú tie, čo sú známe ako konzervatívne substitúcie. Konzervatívne aminokyselinové substitúcie IL-18BP polypeptidov alebo bielkovín alebo vírusových IL-18BP môžu zahrnovať synonymné aminokyseliny zo skupiny, ktoré majú dostatočne podobné fyzikálnochemické vlastnosti, takže substitúcia medzi členmi skupiny bude zachovávať biologickú funkciu molekuly (Grantham, 1974). Je jasné, že vloženie a odstránenie aminokyselín môže tiež byť urobené v definovaných sekvenciách bez zmeny ich fnnkcie, zvlášť ak vloženie alebo odstránenie zahrnuje len niekoľko aminokyselín, napríklad pod tridsať, a výhodne pod desať, a neodstraňuje alebo nenahrádza aminokyseliny, ktoré sú kritické pre fimkčnú konformáciu, napríklad cysteínové zvyšky. Bielkoviny a muteíny tvorené pomocou takýchto odstránení a/alebo vložení vchádzajú do rozsahu tohto vynálezu.

Výhodne synonymné aminokyselinové skupiny sú tie, čo sú definované v tabuľke 1. Výhodnejšie synonymné aminokyselinové skupiny sú tie, čo sú definované v tabuľke 2; a najvýhodnejšie synonymné aminokyselinové skupiny sú definované v tabuľke 3.

Tabuľka 1

Aminokyselina	Synonymná skupina
Ser	Ser, Thr, Gly, Asn
Arg	Arg, Gin, Lys, Glu, His
Leu	íle, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Pro	Gly, Ala, Thr, Pro
Thr	Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
Ala	Gly, Thr, Pro, Ala
Val	Met, Tyr, Phe, íle, Leu, Val
Gly	Ala, Thr, Pro, Ser, Gly
íle	Met, Tyr, Phe, Val, Leu, íle
Phe	Trp, Met, Tyr, íle, Val, Leu, Phe
Tyr	Trp, Met, Phe, íle, Val, Leu, Tyr
Cys	Ser, Thr, Cys
His	Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Gin	Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gin
Asn	Gin, Asp, Ser, Asn
Lys	Glu, Gin, His, Arg, Lys
Asp	Glu, Asn, Asp
Glu	Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, Glu
Met	Phe, íle, Val, Leu, Met
Trp	Trp

Tabuľka 2

Výhodnejšie skupiny Aminokyselina Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly íle Phe Tyr Cys His Gin Asn Lys Asp Glu Met Trp synonymných aminokyselín

Synonymná skupina

Ser

His, Lys, Arg Leu, íle, Phe, Met Ala, Pro Thr

Pro,Ala Val, Met, íle Gly íle, Met, Phe, Val, Leu Met, Tyr, íle, Leu, Phe Phe, Tyr

Cys, Ser His, Gin, Arg Glu, Gin, His Asp, Asn Lys, Arg Asp, Asn Glu, Gin

Met, Phe, íle, Val, Leu Trp

Tabuľka 3

Najvýhodnejšie skupiny synonymných aminokyselín

Aminokyselina	Synonymná skupina
Ser	Ser
Arg	Arg
Leu	Leu, íle, Met
Pro	Pro
Thr	Thr
Ala	Ala
Val	Val
Gly	Gly
íle	íle, Met, Leu
Phe	Phe
Tyr	Tyr
Cys	Cys, Ser
His	His
Gin	Gin
Asn	Asn
Lys	Lys
Asp	Asp
Glu	Glu
Met	Met, íle, Leu
Trp	Met

Príklady tvorby aminokyselinových substitúcií v bielkovinách, ktoré môžu byť použité na získanie muteínov IL-18BP polypeptidov alebo bielkovín, alebo vírusových muteínov IL-18BP, na použitie v tomto vynáleze zahrnujú akékoľvek známe kroky metód, ako napríklad uvedené v US patentoch 4 959 314, 4 588 585 a 4 737 462, od Mark a spol.; 5 116 943 od Koths a spoť, 4,965,195 od Namen a spoť; 4 879 111 od Chong a spol.; a 5 017 691 od Lee a spol.; a lyzínom substituované bielkoviny uvedené v US patente č. 4 904 584 (Shaw a spol.).

Pojem kondenzovaná bielkovina označuje polypeptid, ktorý zahrnuje IL-18BP alebo vírusový IL-18BP, alebo muteín alebo jeho fragment, kondenzovaný s inou bielkovinou, ktorá má napríklad predĺžený čas pobytu v telesných tekutinách. IL-18BP alebo vírusový IL-18BP môže teda byť kondenzovaný na inú bielkovinu, polypeptid alebo podobne, napríklad imunoglobulín alebo jeho fragment.

Funkčné deriváty, ako sa používajú v tomto dokumente, pokrývajú deriváty IL-18BP alebo vírusových IL-18BP a ich muteíny a kondenzované bielkoviny, ktoré môžu byť pripravené z funkčných skupín, ktoré sa vyskytujú ako bočné reťazce na zvyškoch alebo N- alebo C-terminálne skupiny, pomocou prostriedkov známych v tomto odbore a sú zahrnuté vo vynáleze, ak zostávajú farmaceutický prijateľné, t. j. nenarušujú aktivitu bielkoviny, ktorá je v podstate podobná ako aktivita IL-18BP alebo vírusových IL-18BP, a neudeľujú toxické vlastnosti zlúčeninám, ktoré ju obsahujú.

Tieto deriváty môžu napríklad zahrnovať polyetylénglykolové bočné reťazce, ktoré môžu maskovať antigénové miesta a predĺžiť pobyt IL-18BP alebo vírusovej IL-18BP v telesných tekutinách. Iné deriváty zahrnujú alifatické estery karboxylových skupín, amidy karboxylových skupín reakciou s amoniakom alebo s primárnymi alebo sekundárnymi amínmi, N-acyl deriváty voľných aminoskupín aminokyselinových zvyškov tvorené s acylovými skupinami (napríklad alkanoylové alebo karbocyklické aroylové skupiny) alebo O-acyl deriváty voľných hydroxylových skupín (napríklad takýchto skupín zo serylového alebo treonylového zvyšku) tvorené s acylovými skupinami.

Ako aktívne frakcie IL-18BP alebo vírusového IL-18BP, muteínov a kondenzovaných bielkovín, tento vynález pokrýva akékoľvek fragmenty alebo prekurzory polypeptidového reťazca bielkovinovej molekuly samotnej alebo spolu so spojenými molekulami alebo zvyškami, na ktoré je naviazaná, napríklad cukrové alebo fosfátové zvyšky, alebo agregáty bielkovinovej molekuly alebo cukrových zvyškov navzájom, za predpokladu, že táto frakcia má v podstate podobnú aktivitu ako IL-18BP.

Pojem soli v tomto dokumente označuje aj soli karboxylových skupín aj kyslé adičné soli aminoskupín IL-18 inhibítorovej molekuly alebo jej analógov. Soli karboxylovej skupiny môžu byť tvorené pomocou prostriedkov známych v tomto odbore a zahrnujú anorganické soli, napríklad sodné, vápenaté, amónne, železité alebo zinočnaté soli a podobne, a soli s organickými zásadami, ako sú soli tvorené napríklad s amínmi, ako napríklad trietanolamín, arginín alebo lyzín, piperidín, prokaín a podobne. Kyslé adičné soli zahrnujú napríklad soli s minerálnymi kyselinami, ako sú napríklad kyselina chlorovodíková alebo kyselina sírová, a soli s organickými kyselinami, ako sú napríklad kyselina octová alebo kyselina šťaveľová. Samozrejme, akékoľvek takéto soli si musia zachovať biologickú aktivitu OPN relevantnú pre tento vynález, t. j. vykazujú proliferatívny účinok na oligodendrocyty.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu inhibítorom IL-18 je IL-18 protilátka. Anti-IL-18 protilátky môžu byť polyklonálne alebo monoklonálne, chimerické, humanizované alebo aj úplne ľudské. Rekombinantné protilátky a ich fragmenty sú charakterizované vysokou afinitou viazania sa na IL-18 in vivo a nízkou toxicitou. Protilátky, ktoré môžu byť použité v tomto vynáleze, sú charakterizované schopnosťou liečiť pacientov počas doby dostatočnej na dosiahnutie dobrej až vynikajúcej regresie alebo zmiernenia patogenického stavu alebo akéhokoľvek symptómu alebo skupiny symptómov spojených s patogenickým stavom, a nízkou toxicitou.

Neutralizujúce protilátky sa ľahko získajú od zvierat, ako napríklad králiky, kozy alebo myši, pomocou imunizácie s IL-18. Imunizované myši sú zvlášť užitočné na poskytovanie zdrojov B buniek na výrobu hybridómov, ktoré zas sú kultivované tak, aby produkovali veľké množstvá anti-IL-18 monoklonálnych protilátok.

Chimerické protilátky sú imunoglobulínové molekuly charakterizované dvoma alebo viacerými segmentmi alebo časťami získanými z rôznych zvieracích látok. Všeobecne, premenná oblasť chimerickej protilátky sa získa z nie ľudskej protilátky cicavca, ako napríklad myšacia monoklonálna protilátka, a imunoglobulínová konštantná oblasť sa získa z ľudskej imunoglobulínovej molekuly. Výhodne majú obe oblasti a ich kombinácia nízku imunogenicitu podľa rutinného určenia (Elliott a spol., 1994). Humanizované protilátky sú imunoglobulínové molekuly tvorené pomocou techník génového inžinierstva, v ktorých sú myšacie konštantné oblasti nahradené ľudskými náprotivkami, pri zachovaní myšací antigén viažucich oblastí. Výsledná myšacia-ľudská chimérická protilátka má výhodne zníženú imunogenicitu a zlepšenú farmakokinetiku u ľudí (Knight a spol., 1993).

V ďalšom výhodnom uskutočnení je IL-18 protilátkou humanizovaná IL-18 protilátka. Výhodné príklady humanizovaných anti-IL-18 protilátok sú opísané napríklad v európskej patentovej prihláške EP 0 974 600.

V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení je IL-18 protilátka úplne ľudská. Technológia výroby ľudských protilátok je opísaná podrobne napríklad vo WO00/76310, WO99/53049, US 6,162,963 alebo AU5336100. Úplne ľudské protilátky sú výhodne rekombinantné protilátky, vyrábané pomocou transgénových zvierat, napríklad xenomyší, zahrnujúce celé funkčné ľudské Ig lokusy alebo ich časti.

Vo vysoko výhodnom uskutočnení tohto vynálezu inhibítorom IL-18 je IL-18BP alebo jeho izoforma, muteín, kondenzovaná bielkovina, funkčný derivát, aktívna frakcia alebo cirkulačné permutované deriváty. Tieto izoformy, muteíny, kondenzované bielkoviny alebo funkčné deriváty si zachovávajú biologickú aktivitu IL-18BP, zvlášť viazanie na IL-18, a výhodne majú v podstate najmenej takú aktivitu ako IL-18BP. Ideálne takéto bielkoviny majú biologickú aktivitu, ktorá je ešte zvýšená v porovnaní s nemodifikovaným IL-18BP. Výhodné aktívne frakcie majú aktivitu, ktorá je lepšia než aktivita IL-18BP, alebo ktoré majú ďalšie výhody, ako napríklad lepšia stabilita alebo nižšia toxicita alebo imunogenicita, alebo sa ľahšie vyrábajú vo veľkých množstvách, alebo sa ľahšie čistia.

Sekvencie IL-18BP a jeho zviazané varianty/izoformy môžu byť vybraté z WO 99/09063 alebo z Novick a spol., 1999, ako aj z Kim a spol., 2000.

Funkčné deriváty IL-18BP môžu byť konjugované na polyméry s cieľom zlepšiť vlastnosti bielkoviny, ako napríklad stabilita, polčas života, biodostupnosť, tolerancia ľudským telom alebo imunogenicita. Aby sa dosiahol tento cieľ, funkčný derivát môže zahrnovať najmenej jednu skupinu naviazanú na jednu funkčnú skupinu alebo viaceré funkčné skupiny, ktoré sa vyskytujú ako jeden bočný reťazec alebo viaceré bočné reťazce na aminokyselinových zvyškoch. Takéto funkčné skupiny môžu napríklad byť polyetylénglykol (PEG). PEGylácia môže byť uskutočnená pomocou známych metód, ktoré sú opísané napríklad vo WO 92/13095.

Preto vo výhodnom uskutočnení tohto vynálezu je inhibítor IL-18 a zvlášť IL-18BP PEGylovaný.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu je inhibítorom IL-18 kondenzovaná bielkovina obsahujúca celú IL-18 viazaciu bielkovinu alebo časť, ktorá je kondenzovaná na celý imunoglobulín alebo na jeho časť. Odborník v tomto odbore pochopí, že výsledná konjugovaná bielkovina si zachováva biologickú aktivitu IL-18BP, zvlášť viazanie na IL-18. Konjugovanie môže byť priame alebo cez krátky spojovací peptid, ktorý môže mať dĺžku 1 až 3 aminokyselinové zvyšky alebo môže byť dlhší, napríklad 13 aminokyselinových zvyškov. Táto spojovacia skupina môže byť tripeptid sekvencie E-F-M (Glu-Phe-Met) alebo 13-aminokyselinová spojovacia sekvencia obsahujúca Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met zavedená medzi IL-18BP sekvencie a imunoglobulínovú sekvenciu. Výsledná konjugovaná bielkovina má zlepšené vlastnosti, napríklad predĺžený čas pobytu v telesných tekutinách (polčas), zvýšenú špecifickú aktivitu, zvýšenú hladinu expresie, alebo je uľahčené čistenie konjugovanej bielkoviny.

Vo výhodnom uskutočnení je IL-18BP kondenzovaný na konštantnú oblasť Ig molekuly. Výhodne je kondenzovaný na oblasti ťažkých reťazcov, napríklad CH2 a CH3 domény ľudského lgGl. Generovanie špecifickej konjugovanej bielkoviny obsahujúcej IL-18BP a podielu imunoglobulínu sú opísané napríklad v príklade 11 WO 99/09063. Iné izoformy Ig molekúl sú tiež vhodné na generovanie konjugovanej bielkoviny podľa tohto vynálezu, napríklad izoformy lgG2 alebo lgG₄, alebo iné Ig triedy, napríklad IgM alebo IgA. Konjugovaná bielkovina môže byť monomérická alebo multimérická, hetero- alebo homomultimérická.

Interferóny sú hlavne známe pre inhibičné účinky na vírusovú replikáciu a celulárnu proliferáciu. Interferóny hrá napríklad dôležitú úlohu pri podpore imunitnej a zápalovej odozvy. Je známe, že interferón β (IFN-β, interferón typu I) hrá protizápalovú úlohu.

Vynález sa preto tiež týka použitia kombinácie inhibítora IL-18 a interferónu na výrobu lieku na liečenie CNS poranení.

Interferóny môžu tiež byť konjugované na polyméry s cieľom zlepšiť stabilitu bielkoviny. Konjugát medzi interferónom p a polyolom polyetylénglykol (PEG) bol opísaný napríklad vo WO99/55377.

V inom výhodnom uskutočnení vynálezu je interferónom interferón-β (IFN-β) a výhodnejšie IFN-β la.

Inhibítor IL-18 tvorby a/alebo pôsobenia sa výhodne používa simultánne, sekvenčne alebo oddelene s interferónom.

Faktor nekrotizujúci tumory bol opísaný v literatúre ako faktor, ktorý má aj ochranné aj toxické účinky pri poškodení mozgu (Shohami a spol., 1999). V príklade 1 nižšie, TNF injekcia myši nasledujúca po ťažkom mozgovom úraze viedla k významnému poklesu IL-18 hladiny v mozgu, čo poukazuje, že TNF môže mať priaznivé účinky na obnovu po traumatickom poškodení mozgu. Preto sa výhodné uskutočnenie vynálezu týka použitia inhibítora IL-18 v kombinácii s TNF na prípravu lieku na liečenie a/alebo prevenciu poškodenia mozgu, na simultánne, sekvenčné alebo oddelené použitie.

Kombinácia IL-18 inhibítorov s TNF alfa je výhodná v zhode s týmto vynálezom.

V ďalšom výhodnom uskutočnení vynálezu liek ďalej zahrnuje protizápalové činidlo, napríklad NSAID (nesteroidné protizápalové liečivo). Vo výhodnom uskutočnení sa používa COX-inhibítor, a najvýhodnejšie COX-2 inhibítor, v kombinácii s IL-18 inhibítorom. COX-inhibítory sú známe v tomto odbore. Špecifické COX-2 inhibítory sú opísané napríklad vo WO 01/00229. Aktívne zložky môžu byť použité simultánne, sekvenčne alebo oddelene.

Oxidačný stres, zvlášť reaktívne kyslíkaté látky (ROS), boli opísané ako látky, ktoré hrajú úlohu v patofyziológii poškodenia mozgu (Shohami a spol., 1997).

Preto vo výhodnom uskutočnení tohto vynálezu liek ďalej zahrnuje antioxidant, na simultánne, sekvenčné alebo oddelené použitie. Mnohé antioxidanty sú známe v tomto odbore, napríklad vitamíny A, C alebo E, alebo kyselina 5-aminosalicylová, alebo superoxid-dismutáza.

V ďalšom výhodnom uskutočnení tohto vynálezu sa používa inhibítor IL-18 v množstve asi 0,001 až 100 mg/kg telesnej hmotnosti alebo asi 0,01 až 10 mg/kg telesnej hmotnosti alebo asi 0,1 až 3 mg/kg telesnej hmotnosti, alebo asi 1 až 2 mg/kg telesnej hmotnosti.

V ešte ďalšom výhodnom uskutočnení sa používa inhibítor IL-18 v množstve asi 0,1 až 1000 pg/kg telesnej hmotnosti alebo 1 až 100 pg/kg telesnej hmotnosti alebo asi 10 až 50 pg/kg telesnej hmotnosti.

Molekula nukleovej kyseliny, ktorá zahrnuje kódujúcu sekvenciou IL-18 inhibítora, muteínu, funkčného derivátu alebo ich aktívnej frakcie, môže byť použitá na prípravu lieku na prevenciu a/alebo liečenie CNS poranení.

Výhodne molekula nukleovej kyseliny ďalej zahrnuje sekvenciu vektora expresie, napríklad na použitie génovej terapie pri podávaní IL-18 inhibítora podľa tohto vynálezu.

Molekula nukleovej kyseliny môže byť podávaná aj intramuskulárne.

Na liečenie a/alebo prevenciu CNS poranenia vektor génovej terapie obsahujúci sekvenciu inhibítora tvorby a/alebo pôsobenia IL-18 môže byť injektovaný napríklad priamo do chorého tkaniva, čím sa zabráni problémom zahrnutým pri systemickom podávaní vektorov génovej terapie, ako je napríklad zriedenie vektorov, dosiahnutie a zacielenie cieľovej bunky alebo tkaniva, a vedľajšie účinky.

Použitie vektora na indukovanie a/alebo zvýšenie endogénnej tvorby inhibítora IL-18 v bunke normálne tichej z hľadiska expresie IL-18 inhibítora, alebo ktorý exprimuje množstvá inhibítora, ktoré nie sú dostatočné, sú tiež vhodné na liečenie a/alebo prevenciu CNS poranenia. Tento vektor môže zahrnovať regulačné prvky funkčné v bunkách požadované na expresiu inhibítora alebo IL-18. Takéto regulačné sekvencie alebo prvky môžu byť napríklad promotórmi alebo zosilňovačmi. Regulačná sekvencia môže potom byť zavedená do pravého lokusu genómu pomocou homologickej rekombinácie, čím sa operačne viaže na regulačnú sekvenciu s génom, u ktorého sa vyžaduje vyvolanie alebo zvýšenie expresie. Táto technológia sa obvykle označuje ako endogénna génová aktivácia (EGA) a je opísaná napríklad vo WO 91/09955.

Odborník v tomto odbore porozumie, že je tiež možné zastaviť IL-18 expresiu priamo, bez použitia inhibítorov IL-18, rovnakou technikou. Na to sa môže zaviesť negatívne riadiaci prvok, ako napríklad umlčujúci prvok, do génového lokusu IL-18, čo vedie k spomaleniu alebo prevencii IL-18 expresie. Odborník v tomto odbore pochopí, že takéto spomalenie alebo stíšenie IL-18 expresie má rovnaký účinok ako použitie IL-18 inhibítora s cieľom zabrániť a/alebo liečiť chorobu.

Farmaceutické prípravky zvlášť užitočné na prevenciu a/alebo liečenie zápalových CNS poranení môžu zahrnovať terapeuticky účinné množstvo inhibítora IL-18 a/alebo terapeuticky účinné množstvo interferónu, a/alebo farmaceutický účinné množstvo TNF, a/alebo farmaceutický účinné množstvo protizápalového činidla, a/alebo farmaceutický účinné množstvo antioxidatívneho činidla.

Ako inhibítor IL-18, prípravok zahrnuje proteín viažuci IL-18.

Vhodnými sa zdajú byť aj inhibítor caspázy-1, protilátky proti IL-18, protilátky proti akejkoľvek IL-18 receptorovej subjednotke, inhibítory IL-18 signálneho mechanizmu, antagonistické látky IL-18, ktoré konkurujú IL-18 a blokujú IL-18 receptor, ich izoformy, muteíny, kondenzované bielkoviny, funkčné deriváty, aktívne frakcie alebo cirkulačné permutované deriváty, ktoré majú rovnakú aktivitu.

IL-18BP a jeho izoformy, muteíny, kondenzované bielkoviny, funkčné deriváty, aktívne frakcie alebo cirkulačné permutované deriváty, ako sú opísané, sú výhodné aktívne zložky farmaceutických prípravkov.

Interferónom zahrnutým vo farmaceutickom prípravku je výhodne IFN-beta alebo IFN-alfa.

Farmaceutický prípravok môže zahrnovať terapeuticky účinné množstvá TNF alfa. Farmaceutický prípravok podľa tohto vynálezu môže ďalej zahrnovať jeden COX-inhibítor alebo viaceré COX-inhibítory.

Definícia farmaceutický prijateľný je uvažovaná tak, že zahrnuje akýkoľvek nosič, ktorý neinterferuje s účinnosťou biologickej aktivity aktívnej zložky a nie je toxický pre hostiteľa, ktorému sa podáva. Napríklad na parenterálne podávanie môže byť aktívna bielkovina)-y) upravená v jednotkovej dávkovej forme pre injekciu vo vehikule, ako je napríklad soľný roztok, dextrózový roztok, sérový albumín a Ringerov roztok.

Aktívne zložky farmaceutického prípravku podľa tohto vynálezu môžu byť podávané jednotlivcovi rôznymi spôsobmi. Cesty podávania zahrnujú intradermálnu, transdermálnu (napríklad v prípravkoch s pomalým uvoľňovaním), intramuskulárnu, intraperitoneálnu, intravenóznu, subkutánnu, orálnu, intrakraniálnu, epidurálnu, rektálnu, topikálnu a intranazálnu cestu. Môžu byť použité akékoľvek iné terapeuticky účinné spôsoby podávania, napríklad absorpcia cez epitelové alebo endotelové tkanivá alebo pomocou génovej terapie, kde sa DNA molekula kódujúca aktívne činidlo podáva pacientovi (napríklad pomocou vektora), čo spôsobuje, že aktívne činidlo je exprimované a vylučované in vivo. Okrem toho, bielkovina)-y) podľa tohto vynálezu môže byť podávaná spolu s inými zložkami biologicky aktívnych činidiel, ako sú napríklad farmaceutický prijateľné povrchovo aktívne látky, excipienty, nosiče, zrieďovadlá a vehikulá.

Na parenterálne podávanie (napríklad intravenózne, subkutánne, intramuskulárne) môže byť aktívna bielkovina(-y) upravená ako roztok, suspenzia, emulzia alebo lyofilizovaný prášok v spojení s farmaceutický prijateľným parenterálnym vehikulom (napríklad voda, soľný roztok, dextrózový roztok) a aditívami, ktoré udržujú izotonicitu (napríklad manitol) alebo chemickú stabilitu (napríklad konzervačné látky a pufre). Prípravok sa sterilizuje pomocou bežne používaných techník.

Biologická dostupnosť aktívnej bielkoviny (bielkovín) podľa tohto vynálezu môže tiež byť zlepšená použitím konjugačných procedúr, ktoré zvyšujú polčas molekuly v ľudskom tele, napríklad naviazaním molekuly na polyetylénglykol, ako je opísané v PCT patentovej prihláške WO 92/13095.

Terapeuticky účinné množstvá aktívnej bielkoviny (bielkovín) budú funkciou mnohých premenných vrátane typu antagonistickej látky, afinity antagonistickej látky k IL-18, reziduálnej cytotoxickej aktivity vykazovanej antagonistickými látkami, spôsobu podávania, klinického stavu pacienta (vrátane požiadavky udržovania netoxickej hladiny endogénnej IL-18 aktivity).

Terapeuticky účinné množstvo je také množstvo, ktoré pri podávaní IL-18 inhibítora spôsobí inhibíciu biologickej aktivity IL-18. Dávka podávaná ako jediná alebo ako viacnásobné dávky jedincovi sa bude meniť v závislosti od viacerých faktorov vrátane farmakokinetických vlastností IL-18 inhibítora, cesty podávania, pacientovho stavu a charakteristiky (pohlavie, vek, telesná hmotnosť, zdravie, veľkosť), rozsahu symptómov, konkurenčných liečení, frekvencie liečenia a požadovaného účinku. Nastavenie a úpravu použitých dávkových rozsahov môže urobiť odborník v tomto odbore, ako aj in vitro a in vivo spôsobmi určenia inhibície IL-18 u jedinca.

Inhibítor IL-18 možno používať v množstve asi 0,0001 až 100 mg/kg alebo asi 0,01 až 10 mg/kg alebo telesnej hmotnosti, alebo asi 0,1 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti, alebo asi 1 až 3 mg/kg telesnej hmotnosti, alebo asi 1 až 2 mg/kg telesnej hmotnosti. Alternatívne sa IL-18 inhibítor môže podávať v množstvách asi 0,1 až 1000 pg/kg telesnej hmotnosti alebo asi 1 až 100 pg/kg telesnej hmotnosti, alebo asi 10 až 50 pg/kg telesnej hmotnosti.

Spôsobom podávania je podávanie subkutánnou cestou. Intramuskulárne podávanie je ďalšie výhodné podávanie podľa tohto vynálezu. S cieľom podávať IL-18 inhibítor priamo na miesto jeho pôsobenia je tiež výhodné podávať ho intrakraniálnou alebo intratekálnou cestou. Intrakraniálna cesta je zvlášť výhodná v kombinácii s otvoreným poranením hlavy (strelné poranenie mozgu).

Inhibítor IL-18 sa môže podávať denne alebo každý druhý deň.

Denné dávky sú obvykle podávané v rozdelených dávkach alebo vo forme s trvalým uvoľňovaním účinnej látky na získanie požadovaných výsledkov. Druhé alebo následné podávanie môže byť uskutočnené s dávkou, ktorá je rovnaká, menšia alebo väčšia než počiatočná alebo predchádzajúca dávka podávaná danému jedincovi. Druhé alebo nasledujúce podávanie môže byť podávané počas choroby alebo pred nástupom choroby.

IL-18 inhibítor môže byť podávaný profylaktický alebo terapeuticky jedincovi pred, simultánne alebo sekvenčne s inými terapeutickými režimami alebo činidlami (napríklad režimy s viacerými liečivami), v terapeuticky účinnom množstve, zvlášť s interferónom a/alebo TNF, a/alebo iným protizápalovým činidlom, napríklad COX inhibítor a/alebo nejaký antioxidant. V závislosti od poškodenia mozgu môže tiež byť uvažované spoločné podávanie TNF-antagonistickej látky namiesto TNF samotného (Shohami a spol., 1999). Aktívne činidlá, ktoré sú podávané simultánne s inými terapeutickými činidlami, môžu byť podávané v rovnakom prípravku alebo v iných prípravkoch.

Vynález sa ďalej týka farmaceutických prípravkov, ktoré obsahujú zmiešané účinné množstvo IL-18 inhibítora a/alebo interferónu, a/alebo TNF antagonistickej látky, a/alebo COX inhibítora s farmaceutický prijateľným nosičom.

Všetky odkazy citované v tomto dokumente vrátane článkov v časopisoch alebo abstraktov, publikovaných alebo nepublikovaných, US alebo zahraničných patentových prihlášok, vydaných US alebo zahraničných patentov alebo akékoľvek iné odkazy, sú celkovo začlenené ako odkaz v tomto dokumente vrátane všetkých údajov, tabuliek, obrázkov a textov uvedených v citovaných odkazoch. Okrem toho, celkový obsah odkazov citovaných v odkazoch citovaných v tomto dokumente je tu tiež úplne začlenený pomocou odkazu.

Odkazy na známe kroky metód, konvenčné kroky metód, známe metódy alebo konvenčné metódy nie sú žiadnym spôsobom potvrdením toho, že nejaký aspekt, opis alebo uskutočnenie tohto vynálezu je už opísaný, uvažovaný alebo navrhovaný v doterajšom stave tohto odboru.

Predchádzajúci opis špecifických uskutočnení teda úplne ukazuje všeobecnú povahu vynálezu, ktorá inak môže byť aplikovaním znalostí odborníka v tejto oblasti (vrátane obsahu odkazov citovaných v tomto dokumente) ľahko modifikovaná a/alebo adaptovaná na rôzne aplikácie takýchto špecifických uskutočnení, bez nadmerných experimentov, bez odstúpenia od všeobecného konceptu tohto vynálezu. Preto sú takéto adaptácie a modifikácie zamýšľané ako zahrnuté v rozsahu ekvivalentov opísaných uskutočnení na základe vysvetlení a návodov uvedených v tomto dokumente. Treba rozumieť, že frazeológia alebo terminológia v tomto dokumente je použitá na účely opisu a nie obmedzenia, tak že terminológia alebo frazeológia tejto prihlášky sa má interpretovať odborníkom v tejto oblasti vo svetle vysvetlení a návodov uvedených v tomto dokumente, v kombinácii so znalosťami odborníka v tomto odbore.

Keď už je vynález opísaný, bude ho ľahšie pochopiť pomocou nasledujúcich príkladov, ktoré sú poskytnuté ako ilustrácia a nie sú zamýšľané ako obmedzenie tohto vynálezu.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 ukazuje histogram zobrazujúci sérové hladiny intracerebrálneho IL-18 (ng/ml) v celom mozgu (šrafované), v ľavej hemisfére (čierne) alebo v pravej hemisfére (sivé) za rôznych podmienok.

Obrázok 2 ukazuje vývoj NSS (skóre neurologickej závažnosti) merané 1 hodinu (h), 24 h, 72 h alebo 168 h po úraze, buď s 50 pg IL-18BP podávané i. p. 1 hodinu po úraze (štvorčeky) alebo s injekciou len vehikula (kontrolná skupina, krúžky).

Obrázok 3 ukazuje ANSS merané 24 h, 72 h alebo 168 h po úraze, buď s 50 pg IL-18BP podávané i. p. 1 hodinu po úraze (štvorčeky) alebo s injekciou len vehikula (kontrolná skupina, krúžky).

Obrázok 4 ukazuje ANSS merané 1 h, 24 h, 3 dni (d), 7 d alebo 14 d po úraze, buď s 50 pg IL-18BP podávané i. p. buď ako jediná dávka 3 d po úraze (kosoštvorčeky), alebo ako dvojitá dávka 1 h a 3 d po úraze (štvorčeky), alebo s injekciou len vehikula (kontrolná skupina, trojuholníčky).

Príklady uskutočnenia vynálezu

Materiály a metódy

Model úrazu

Myši použité v tejto štúdii boli samce veku 8 až 16 týždňov vážiace 30 až 35 g. Narodili sa v špecifickom bezpatogénovom prostredí, chovali sa za štandardných podmienok teploty a svetla v klietkach po 4 až 6 zvieratách, kŕmili sa potravou a vodou ad libitum. Štúdia bola uskutočnená podľa smerníc Institutional Animal Čare Committee Hebrejskej Univerzity Jeruzalem, Izrael. Experimentálny CHI bol uskutočnený použitím vopred vyvinutého zariadenia s padajúcim závažím (Chen a spol. 1996). Stručne povedané, po vyvolaní éterovej anestézie sa uskutočnil pozdĺžny rez stredovou čiarou, koža bola odtiahnutá a odkryla sa lebka. Vyhľadala sa ľavá predná čelná plocha a teflónový špicatý kužeľ sa umiestnil asi 1 mm bokom od stredovej línie v stredovo-koronárnej rovine. Hlava bola zafixovaná a na kužeľ sa nechalo padnúť 75 g závažie z výšky 18 cm, čo spôsobilo ložiskové poranenie v ľavej hemisfére. Po úraze myši dostali podporné okysličenie 100 % O₂ počas menej než 2 minút, a potom sa preniesli späť do ich klietok.

Vyhodnotenie IL-18 hladín v mozgu myší

Na kvantifikáciu intrakraniálnych IL-18 hladín boli myši kmeňa C57BL/6 (B6) (celkovo n = 62) rozdelené do šiestich samostatných skupín: (1) normálna kontrolná vzorka; neliečené B6 myši (n = 10). (2) éterová anestézia; myši boli anestetizované éterom počas 10 minút a dekapitované po 24 hodinách (n = 10) alebo 7 dňoch (n = 10). (3); simulovaná operácia; tieto myši podstúpili anestéziu a pozdĺžnu incíziu skalpu a boli usmrtené po 24 hodinách (n = 15) alebo 7 dňoch. (4); skupina s úrazom; experimentálny CHI bol uskutočnený tak, ako je opísané a zvieratá boli dakapitované za éterovej anestézie po 4 hodinách (n = 7), 24 hodinách (n = 7) a 7 dňoch (n = 7) po úraze. (5) TNF injekcia; na vyhodnotenie možnej úlohy TNF v regulácii intracerebrálneho IL-18 boli myši anestetizované éterom, podala sa im injekcia intracerebroventrikulárne (i. c. v.) 200 ng myšieho rekombinantného TNF (R&D Systems, Abingdon, UK) v 10 μΐ sterilného fosfátom pufrovaného soľného roztoku (PBS) a boli usmrtené po 24 hodinách (n = 10). (6); simulovaná injekcia; tieto zvieratá dostali injekciu i. c. v. len s vehikulom (10 pl sterilného PBS) a boli usmrtené po 24 hodinách (n = 6) ako kontrolná skupina pre zvieratá s TNF-injekciou. U všetkých myší sa ihneď po dekapitácii odstránil mozog, prudko sa zmrazil v kvapalnom dusíku a uložil sa pri -70 °C až do analýzy. Mozgy zo skupiny po úraze boli rozdelené na ľavú (ipsilaterálnu) a pravú (kontralaterálnu) hemisféru s cieľom umožniť porovnanie IL-18 hladiny v poranenej oproti neporanenej hemisfére. Homogenizácia tkaniva bola uskutočnená zariadením Polytron (Kinematica, Kriens, Švajčiarsko) použitím zriedenia 1 : 4 v ľadovostudenom extrakčnom pufri (hmotnostne) obsahujúcom Tris 50 mmol/l (pH 7,2), NaCl 150 mmol/l, Triton-X-100 1 % (Boehringer Mannheim, Rotkreuz, Švajčiarsko), a proteázový inhibítorový koktail (Boehringer Mannheim). Homogenát sa trepal na ľade počas 90 minút, potom sa centrifugoval počas 15 minút pri 3000 g a 4 °C. Supernatanty boli rozdelené na alikvóty a uskladnené pri -70 °C do analýzy. Koncentrácie celkovej bielkoviny v mozgových extraktoch boli merané pomocou Bradfordovej skúšky (Bio Rad Laboratories, Mníchov, Nemecko) a zistilo sa, že sú veľmi konštantné u všetkých hodnotených myší (12,1 ±2,1 mg/ml; priemer + SD). Kvantifikácia intracerebrálnej cytokínovej hladiny bola uskutočnená pomocou ELISA testu špecifického pre myší IL-18, podľa návodu výrobcu (R&D Systems, Abingdon, UK). Citlivosť skúšky bola 5 pg/ml. Na porovnanie intracerebrálnych IL-18 hladín medzi rôznymi skupinami zvierat boli všetky koncentrácie pod detekčný limit 5 pg/ml priradené hodnote 4,9 pg/ml. Vzorky boli analyzované nezdedené v kalíškoch s dvoma opakovaniami a konečná koncentrácia bola vypočítaná z priemernej OD duplikovaných vzoriek. OD boli určené pomocou spektrofotometra (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA) pri vlnovej dĺžke absorpcie 405 nm.

Postup IL-18BP liečenia

Samce Sabra myší z kmeňa z Hebrejskej Univerzity (n = 40) sa použili na IL-18BP štúdie. Anestézia a experimentálny CHI boli uskutočnené tak, ako je opísané. Pre postup skúmania boli zvieratá rozdelené na dve skupiny: v skupina A (kontrolná skupina, n = 16), myši boli podrobené experimentálnemu CHI, dostali injekciu samotného vehikula (PBS) po jednej hodine a pozorovali sa počas 7 dní z hľadiska neurologického vyhodnotenia (pozri nižšie). V skupine B (študovaná skupina, n = 18) myši dostali injekciu i. p. s 50 pg IL-18BP ihneď po určení neurologického skóre pri t = 1 hodina po CHI. Pretože permeabilita hematoencefalic14 kej bariéry je 5- až 6krát zvýšená medzi 1 až 4 hodinami po CHI, ako bolo skôr určené v rovnakom experimentálnom modeli (Chen a spol. 1996), IL-18BP za týchto podmienok môže vstúpiť do mozgu. Podľa skupín A a B boli spracované dve dodatočné skupiny myší (skupina C: kontrolná skupina; skupina D: študovaná skupina) a dekapitované po 48 hodinách, po čom nasledovala pitva mozgu na ohodnotenie posttraumatického edému, ako je opísané nižšie.

Vyhodnotenie neurologického poškodenia

Na vyhodnotenie posttraumatického neurologického poškodenia bolo skôr vyvinuté a validované skóre neurologickej závažnosti (NSS) (Stahel a spoť, 2000).

Toto skóre pozostáva z 10 samostatných klinických úloh na motorické funkcie, pohotovosť a fyziologické správanie sa, kde jeden bod sa dáva pri neúspechu úlohy a nula bodov pri úspešnej úlohe (tabuľka 4). Maximálne NSS 10 bodov indikuje ťažkú neurologickú dysfunkciu s neúspechom všetkých úloh, zatiaľ čo skóre nula sa dosiahne zdravými neporanenými myšami. NSS po 1 hodine po úraze odráža počiatočný rozsah poranenia a je vysoko korelovaný s klinickým výsledkom (Beni-Adani a spol. 2001). Vyhodnotenie vykonania úloh bolo uskutočnené dvoma výskumníkmi, ktorí nevedeli o zadelení v študovaných skupinách, v časových bodoch 1 hodina, 24 hodín, 72 hodín a 7 dni po experimentálnom CHI. ANSS vypočítaný ako rozdiel medzi NSS pri t = 1 hodina a NSS v niektorom neskoršom časovom bode je parameter, ktorý odráža stupeň spontánnej obnovy nasledujúcej po poškodení mozgu, ako je opísané (Chen a spol. 1996).

Tabuľka 4: Skóre neurologickej závažnosti (NSS) pre myši s poranením hlavy.

-t-1-;-

Úloha	Opis	Body pre úspech/neús.
Východ z kruhu	Schopnosť a iniciatíva vychádzať z kruhu 30 cm priemeru v priebehu 3 minút.	0/1
Mono/Hemiparéza	Paréza hornej a/alebo dolnej končatiny kontralaterálnej strany.	0/1
Priame chodenie	Pohotovosť, iniciatíva a motorická schopnosť chodiť priamo.	0/1
Reflex plašenia	Vrodený reflex; Myš bude skákať ako odozva na hlasné tlesknutie rúk.	0/1
Hľadanie	Fyziologické správanie ako znak „záujmu“ o prostredie.	0/1
Rovnováha na nosníku	Schopnosť udržať rovnováhu na nosníku 7 mm širokom počas najmenej 10 sekúnd.	0/1
Rovnováha na okrúhlej tyčke	Schopnosť udržať rovnováhu na okrúhlej tyčke 5 mm priemeru počas najmenej 10 s	0/1
Chodenie po nosníku: 3 cm	Schopnosť prejsť 30 cm dlhý nosník 3 cm šírky.	0/1
Chodenie po nosníku: 2 cm	Rovnaká úloha, zvýšená obtiažnosť na 2 cm širokom nosníku.	0/1
Chodenie po nosníku: 1 cm	To isté, zvýšená obtiažnosť na 1 cm širokom nosníku.	0/1
Maximálne skóre		10

Vyhodnotenie edému mozgu

Rozsah cerebrálneho edému sa hodnotil pomocou určenia obsahu vody v tkanive v poranenej hemisfére, ako je skôr opísané (Chen a spol. 1996). Stručne povedané, myši boli anestetizované, ako je opísané, po 48 hodinách po úraze, čo zodpovedá časovému bodu, pri ktorom je edém ešte významný v tomto modeli systému (Chen a spol. 1996). Po dekapitácii sa odstránil malý mozog a mozgový kmeň a pripravil sa kortikálny segment asi 20 mg z oblasti hraničiacej s miestom úrazu a z jeho kontralaterálnej hemisféry. Pravá (neporanená) hemisféra bola použitá ako interná kontrolná vzorka. Tkanivové plátky boli zvážené a vysušené počas 24 hodín pri 95 °C. Po vážení vysušených plátkov sa percento obsahu vody v mozgu vypočítalo ako:

% H₂O = [(vlhká hmotnosť - suchá hmotnosť) x 100]/vlhká hmotnosť

Poškodenie mozgu pacientov

Desať pacientov s izolovaným ťažkým CHI (stredný vek ± SD: 37 ± 10 rokov; rozsah 24 až 57 rokov; 9 mužov a jedna žena) prijatých na Úrazovú divíziu Univerzitnej nemocnice Zurich bolo zahrnutých do tejto štúdie. Všetci pacienti mali na Glasgowskej stupnici kómy (GCS) skóre < 8 po kardiopulmonálnej resuscitácii (Teasdale a Jennett, 1974). Po CT vyhodnotení všetci pacienti dostali intraventrikulárne katétre na terapeutickú CSF drenáž, keď intrakraniálny tlak (ICP) presiahol 15 mm Hg. Žiaden pacient nebol liečený steroidmi. Pacienti s mnohonásobným poškodením vyžadujúci intervencie pre súbežné torakálne, abdominálne, panvové, spinálne poranenia alebo zlomeninu dlhých kostí boli vylúčení zo štúdie. Individuálny výsledok bol ohodnotený použitím Glasgowskej stupnice následkov (GOS) (Jennett a Bond, 1975). Postup pre CSF a odber séra bol schválený Etickou komisiou Univerzitnej nemocnice Zurich.

Odber vzoriek a IL-18 analýza

CSF a zodpovedajúce vzorky séra CHI pacientov (n = 10) boli odoberané denne v jednom pevnom časovom bode. Kontrolné CSF boli odoberané pacientom, ktorí podstúpili diagnostickú chrbticovú punkciu (n = = 5). Títo pacienti nemali znaky zápalovej CNS choroby, na základe normálnych CSF hodnôt bielkovín, glukózy a počty buniek (údaje nie sú uvedené). V CHI skupine bol odber vzoriek uskutočnený počas 10 dní po úraze, ak ventrikulárny katéter nebol odstránený skôr, napríklad v prípadoch, kde ICP zostal v normálnom rozsahu (< 15 mm Hg) počas viac než 24 hodín. Celkovo sa odobralo v tejto štúdii 106 zodpovedajúcich vzoriek CSF a séra u pacientov s úrazom. Všetky vzorky boli ihneď po odobratí centrifugované, rozdelené na alikvóty a zmrazené pri -70 °C až do analýzy. Kvantifikácia IL-18 hladín v CSF a sére bola uskutočnená pomocou ELISA testu špecifického pre ľudský IL-18 použitím komerčne dostupných kitov (R&D Systems, Abingdon, UK). Tak ako pri myšej skúške, citlivosť ELISA testu bola 5 pg/ml a konečná IL-18 koncentrácia bol vypočítaná z priemerného OD určeného z dvojíc opakovaných vzoriek pri vlnovej dĺžke absorpcie 405 nm. Na porovnanie IL-18 CSF hladín medzi CHI pacientmi a kontrolnými pacientmi, všetky koncentrácie pod detekčný limit 5 pg/ml boli priradené hodnote 4,9 pg/ml.

Analýza údajov

Štatistická analýza údajov bola vykonaná na komerčne dostupnom softvéri (SPSS 9.0 pre Windows™). Neparametrický Mann-Whitney-U test bol použitý na analýzu údajov, ktoré neboli normálne rozdelené, napríklad neurologické skóre (NSS a ANSS). Nepárový Študentov t-test bol použitý na porovnanie intracerebrálnych IL-18 koncentrácií v rôznych skupinách myší a na analýzu rozdielov obsahu vody v mozgu u IL-18BP liečených myší oproti myšiam s injekciou vehikula. Porovnanie ľudských IL-18 hladín, buď u denných CSF oproti zodpovedajúcim vzorkám séra u CHI pacientov, alebo u pacientov s úrazom oproti, kontrolnej skupine CSF, bolo urobené použitím všeobecného lineárneho modelu na opakované merania ANOVA. Za štatisticky významnú sa považovala p-hodnota < 0,05.

Výsledky

Príklad 1

Intracerebrálne IL-18 hladiny u myší

Ako je uvedené na obrázku 1, IL-18 bol detekovateľný pomocou ELISA testu v homogenátoch mozgu neliečených (normálnych) kontrolných myší B6 kmeňa (n = 10) s priemernou hladinou 27,7 ± 1,7 [± SEM] ng/ml. V experimentálnych skupinách, indukcia samotnou éterovou anestéziou alebo v kombinácii so simulovanou operáciou (t. j. éterovou anestéziou a pozdĺžnym prerezaním skalpu) viedla k významne zvýšeným intrakraniálnym IL-18 hladinám 48,9 ±1,1 ng/ml (éterová skupina, n = 8) a 54,3 + 2,7 ng/ml (simulovaná skupina, n = 13), (p < 0,01 oproti normálnym myšiam, nepárový Študentov f-test; obrázok 1). Rozdiel medzi éterovo a simulovane liečenými zvieratami bol štatisticky nevýznamný (p = 0,16).

V skupine s úrazom (n = 21) vyvolanie CHI viedlo k zvýšeným IL-18 hladinám aj v poranenej aj v kontralaterálnej hemisfére počas 4 hodín (60,6 + 3,3 a 59,8 + 5,0 ng/ml) až 24 hodín (56,9 ±2,1 a 56,3 + 3,7 ng/ml) po úraze, avšak hladiny boli nevýznamné vyššie v porovnaní s éterovou alebo simulovanou skupinou (p > 0,05).

Oproti tomu po 7 dňoch po CHI boli detegované významne zvýšené intracerebrálne IL-18 koncentrácie v poranenej hemisfére v porovnaní s éterovoanestetizovanými alebo simulovaneoperovanými zvieratami (67,6 +5,1 ng/ml oproti 42,2 + 0,8 a 45,2 + 0,5 ng/ml; p < 0,01), kým IL-18 hladiny v kontralaterálnej hemisfére boli nevýznamné zvýšené nad hladiny dvoch kontrolných skupín (63,2 + 6,0 ng/ml; p = 0,06).

Aby sa vyhodnotila úloha TNF, rozhodujúceho mediátora zápalu v tomto modeli úrazu (Shohami a spol. 1999), s ohľadom na reguláciu intracerebrálnych IL-18 hladín, bolo ďalšej skupine B6 myší (n = 10) injektované i.c.v. 200 ng myšieho rekombinantného TNF v 10 μΐ sterilného PBS a boli usmrtené po 24 hodinách. Ako je uvedené na obrázku 1, simulovaná injekcia len vehikula (n = 6) viedla k významnému nárastu intracerebrálneho IL-18 v priebehu 24 hodín v porovnaní s neliečenými normálnymi B6 myšami (53,6 + 3,9 oproti 27,7+1,7 ng/ml; p < 0,001).

Injekcia TNF vyvolala významné utlmenie IL-18 hladiny v intrakraniálnom kompartmente v priebehu 24 hodín (22,1 + 6,9 ng/ml; n = 10) v porovnaní s kontrolnou skupinou po simulovanej injekcii v priebehu 24 hodín (53,6 ± 3,9 ng/ml; p < 0,001). Hladiny IL-18 v TNF skupine boli dokonca nižšie než u neliečených normálnych myší (27,7 + 1,7 ng/ml), hoci v tomto prípade rozdiel bol štatisticky nevýznamný (p = 0,45).

Príklad 2

Účinok IL-18BP liečenia na neurologické zotavenie po úraze

Aby sa preskúmala hypotéza, že inhibícia IL-18 môže uľahčiť zotavenie poškodenia mozgu, porovnalo sa zotavenie v rôznych časových bodoch po jedinej injekcii IL-18BP. Už skôr bolo ukázané, že skóre neurologickej závažnosti (NSS) po 1 hodine po úraze odráža najpresnejšie veľkosť úrazu a koreluje s objemom poraneného tkaniva, ako je vidno na MRI a v histológii.

Aby sa získala skupina zvierat s porovnateľným úrazom, boli myši priradené do rôzne liečených skupín po vyhodnotení ich počiatočného NSS po t = 1 hodina. Ako je uvedené na obrázku 2 (NSS u IL-18BP (štvorčeky) oproti, kontrolnej skupine (krúžky), obe skupiny mali podobné počiatočné NSS (1 hodina) (7,69 ± 0,3023 a 7,44 ± 0,3627 kontrolná skupina a IL-18BP), čo poukazuje porovnateľný rozsah poranenia.

Vyhodnotenie NSS v neskorších časoch (1 až 7 dni) ukázalo, že zvieratá liečené intraperitoneálne (i. p.) s IL-18BP vykazujú významne menšie neurologické poškodenie, ako je evidentné podľa NSS hodnôt, ktoré dosiahli štatistickú významnosť po 7 dňoch po úraze (p = 0,045).

Vypočítala sa rýchlosť zotavenia vyjadrená ako ANSS (t) = NSS (1 hodina) - NSS (t). Vyššia hodnota ANSS odráža väčšie zotavenie a nula alebo negatívne ANSS odráža žiadne zotavenie alebo zhoršenie. Obrázok 3 znázorňuje ANSS hodnoty týchto dvoch skupín. V dvoch časových bodoch, aj po 24 hodinách aj po 7 dňoch, rozdiel medzi priemernými ANSS hodnotami dosahoval štatistickú významnosť.

Uskutočnil sa ďalší experiment na preskúmanie toho, či liečenie s IL-18BP podávané po 3 dňoch po poranení môže byť účinné. Problém časovania liečenia je kritický a pri doterajšej terapii sa uvádza, že je účinná vtedy, keď sa podáva po niekoľko málo hodinách. Pretože sa zistilo, že IL-18 samotný stúpa počas 7 dní po úraze a liečenie s IL-18BP podané 1 hodinu po úraze vedie k najväčšiemu účinku tiež po dni 7, teraz bolo zvolené liečenie myší v deň 3 po poranení. Na porovnanie boli ďalšie skupiny liečené po 1 hodine a po 3 dňoch s IL-18BP. Kontrolná skupina bola liečená len s rozpúšťadlom (vehikulom).

Výsledky tohto experimentu sú zobrazené na obrázku 4, z ktorého je jasné, že jediné liečenie podané v deň 3 je také účinné ako liečenie podané jednu hodinu po CHI a znova po 3 dňoch.

Tento experiment demonštruje dramatický priaznivý účinok jednorazového podávania IL-18BP, buď daného 1 h, alebo 3 dni po uzavretom poranení hlavy, na zotavenie z traumatického poranenia hlavy v experimentálnom modeli na myšiach.

Príklad 3

Zvýšenie IL-18 hladiny v ľudskej CSF po poškodení mozgu

IL-18 hladiny boli hodnotené denne vo vzorkách CSF a séra od 10 pacientov s ťažkým CHI počas 10 dní po úraze. Demografické a klinické údaje pacientov sú uvedené v tabuľke 5.

Tabuľka 5: Demografické a klinické údaje pacientov s ťažkým CHľ

Pacient č.	Vek (roky)/- pohlavie	GCSb	GOS6	IL-18 v CSFd (pg/ml) medián rozsah]6	IL-18 v sé medián	re (pg/ml) rozsah]6
1	48/m	3	1	283	[78-966]	57,5	[12-66]
2	31/m	7	4	228,4	[22-745]	19,7	[4,9-108]
3	26/m	5	3	208,5	[20-392]	37,2	[14-163]
4	57/m	5	4	72,6	[30-286]	48,9	[14-104]
5	24/m	4	5	32,6	[4,9-155]	17	[4,9-58]
6	36/m	8	1	49,4	[10-290]	16,7	[12-67]
7	38/f	3	4	17,9	[11-100]	13	[4,9-46]
8	35/m	3	3	69,8	[4,9-329]	19,8	[7-77]
9	37/m	3	4	37	[23-75]	57,3	[25-98]
10	41/m	7	5	4,9	[4,9-169]	26,2	[15-38]
Kontrolné CDF (n = 5)			4,9	[4,9-7,8]

^a CHI, uzavreté poranenie hlavy ^bGCS, Glasgowská stupnica kómy (Teasdale a Jennett, 1974).

^c GOS = Glasgowská stupnica následkov po 3 mesiacoch po poranení; 5 = asymptomatické, 4 = mierna neschopnosť, 3 = ťažká neschopnosť, 2 = pretrvávajúci vegetatívny stav, 1 = smrť (Jennett a Bond, 1975). ^d CSF = cerebrospinálna tekutina.

⁶ IF-18 hladiny pod detekčnou medzou 5 pg/ml boli priradené hodnote 4,9 pg/ml.

Ako je uvedené v tabuľke 5, intratekálne IF-18 hladiny boli významne zvýšené u 9/10 CHI pacientov, v porovnaní s kontrolnou CSF od 5 pacientov bez úrazu alebo zápalovej neurologickej choroby (p < 0,05; opakované merania ANOVA). Len jeden pacient (č. 10) mal IL-18 CSF hladiny, ktoré boli nevýznamné zvýšené v porovnaní s kontrolnou CSF (p = 0,31). Medián hladiny a individuálne rozsahy IL-18 v CSF a sére sú uvedené v tabuľke 5.

Je pozoruhodné, že maximálne IL-18 koncentrácie v CSF (966 ng/ml) boli do 200-krát vyššie u pacientov s poranením hlavy, než u kontrolnej skupiny. Intracerebrálny IL-18 bol detekovateľný pomocou ELISA testu u 90 % všetkých CSF vzoriek v skupine s úrazom, kým len 40 % kontrolných CSF vzoriek malo detekovateľné intracerebrálne IL-18 hladiny (t. j. > 4,9 ng/ml). U 8/10 CHI pacientov medián IL-18 koncentrácií bol významne vyšší v CSF než v sére (p < 0,05; opakované merania ANOVA). Avšak u dvoch pacientov (č. 9, 10) medián IL-18 hladiny v sére presahoval zodpovedajúce koncentrácie v CSF, ako je uvedené v tabuľke 5.

Tieto výsledky ukazujú, že existujú významne zvýšené hladiny IL-18 v cerebrospinálnej tekutine pacientov s traumatickým poranením hlavy. Dodanie IL-18BP môže znížiť tieto zvýšené hladiny a môže teda vykázať priaznivý účinok na zotavenie z uzavretého poranenia hlavy, ako je uvedené v príklade 2 vyššie.

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (11)

1. Použitie proteínu viažuceho IL-18 na výrobu lieku na liečenie traumatického poškodenia mozgu, pričom proteín viažuci IL-18 sa podáva v jedinej dávke 3 dní po poranení.

2. Použitie podľa nároku 1, kde proteín viažuci IL-18 je glykozylovaný na jednom mieste alebo viacerých miestach.

3. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde liek ďalej zahrnuje interferón.

4. Použitie podľa nároku 3, kde uvedeným interferónom je interferón-α alebo interferón-β.

5. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde liek ďalej zahrnuje faktor nekrotizujúci tumory - TNF.

6. Použitie podľa nároku 5, kde uvedeným TNF je TNF alfa.

7. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde liek ďalej zahrnuje protizápalové činidlo.

8. Použitie podľa nároku 8, kde protizápalovým činidlom je COX-inhibítor, zvlášť COX-2 inhibítor.

9. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde liek ďalej zahrnuje antioxidant.

10. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde účinné množstvo inhibítora IL-18 je 0,001 až 100 mg/kg telesnej hmotnosti, alebo 0,01 až

10 mg/kg telesnej hmotnosti alebo 0,1 až 5 mg/kg telesnej hmotnosti alebo 1 až 3 mg/kg telesnej hmotnosti.

11. Použitie podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde IL-18 inhibítor je vo forme na subkutánne podanie.

3 výkresy