HRP20030842B1 - UPOTREBA IL-18 INHIBITORA ZA LIJEČENJE I PREVENCIJU OZLJEDA CNS-a - Google Patents

Abstract

Ovaj izum odnosi se na uporabu inhibitora IL-18 za priređivanje medikamenta za tretiranje i/ili prevenciju ozljeda središnjeg živčanog sustava, poglavito traumatske ozljede glave.

Description

Područje izuma

Izum je iz područja farmakologije.

On je iz područja patološkog stanja mozga. Specifičnije, on se odnosi na uporabu inhibitora IL-18 za tretiranje i/ili prevenciju ozljeda središnjeg živčanog sustava (CNS), konkretno traumatske ozljede mozga.

Stanje tehnike

Godine 1989. opisana je endotoksinom izazvana serumska aktivnost koja je inducirala interferonγ (IFNγ) dobiven iz stanica mišje slezene (Nakamura et al., 1989). Ova serumska aktivnost nije djelovala kao izravno pobuđivač IFNγ već kao ko-stimulator zajedno s IL2 ili mitogenima. Pokušaj da se pročisti aktivnost od post-endotoksinskog mišjeg seruma dao je gotovo homogeni 50-55 kDa protein. Budući da drugi citokini djeluju kao ko-stimulansi za proizvodnju IFNγ, neuspjeh da neutralizirajuća antitijela za IL1, 5IL4, IL5, IL6 ili TNF neutraliziraju serumsku aktivnost je ukazao na to da je to odvojeni čimbenik. Godine 1995., isti su znanstvenici pokazali da se endotoksinom izazvani ko-stimulans za proizvodnju IFNγ nalazi u ekstraktima jetre miševa koji se prethodno kondicionirani s P. acnes (Okamura et al., 1995). U tom modelu, populacija hepatičkih makrofaga (Kupfferove stanice) se širi i u ovih miševa, niska doza bakterijskih lipopolisaharida (LPS), koja u prekondicioniranih miševa nije letalna, postaje letalna. Čimbenik koji je nazvan IFNγinducirajući čimbenik (IGIF) i koji je kasnije dobio oznaku interleukin18 (IL18), pročišćen je do homogenosti iz 1200 grama P. acnes-tretirane mišje jetre. Degenerirani oligonukleotidi koji su izvedeni iz aminokisleinske sekvencije pročišćenog IL18 korišteni su za kloniranje mišjeg IL18 cDNA. IL18 je 1819 kDa protein od 157 aminokiselina, koji je pokazuje očigledne sličnosti s nekim polipeptidom u bazi podataka. Glasničke RNA za IL18 i interleukin12 (IL12) se lako detektiraju u Kupfferovim stanicama i aktiviranim makrofagima. Rekombinantni IL18 izaziva IFNgama jače nego s IL12, vjerojatno drugim odvojenim putem (Micallef et al., 1996). Slično kas s endotoksinom-izazvanom serumskom aktivnošću, IL18 ne izaziva IFNγ sam već funkcionira primarno kao ko-stimulans s mitogenima ili IL2. IL18 pojačava T-staničnu proliferaciju, vjerojatno putem IL2-ovisnog puta, te pojačava Th1 proizvodnju citokina in vitro te pokazuje sinergizam kada se kombinira s IL12 u svezi pojačane proizvodnje IFNγ (Maliszewski et al., 1990).

Nakon što je kloniran mišji oblik, humana cDNA sekvencija za IL18 je objelodanjena 1996. (Ushio et al., 1996).

Kloniranjem IL18 iz zahvaćenih tkiva i proučavanjem IL18 ekspresije gena, nađena je bliska veza ovog citokina s autoimunom bolešću. Dijabetički (NOD) miševi spontano razvijaju autoimuni inzulitis i dijabetes, što se može ubrzati i sinkronizirati s jednom injekcijom ciklofosfamida. IL18 mRNA nađena je reverznom transkriptazom PCR u NOD mišjoj gušterači tijekom ranog stupnja inzulitisa. Razine IL18 mRNA povećane su brzo nakon ciklofosfamidnog tretmana i prethode porastu IFNγ mRNA, te kasnijem dijabetesu. Zanimljivo, ova kinetika podsjeća na onu IL12-p40 mRNA, što rezultira bliskim koreliranjem pojedinačnih mRNA razina. Kloniranje IL18 cDNA iz gušterače RNA te sekvenciranje pokazalo je identičnost s IL18 sekvencijom koja je klonirana iz Kupfferovih stanica te in vivo prwaktiviranih makrofaga. Također NOD mišji makrofagi odgovaraju na ciklofosfamid s IL18 ekspresijom gena dok makrofagi iz Balb/c miševa koji su tretirani paralelno to ne pokazuju. Dakle, IL18 ekspresija je nenormalno regulirana u autoimunih NOD miševa i blisko je povezana s razvojem šećerne bolesti (Rothe et al., 1997).

IL18 ima značajnu ulogu u imunološkom reguliranju ili upali povećavanjem funkcionalne aktivnosti Fas liganda na Th1 stanice (Conti et al., 1997). IL18 ima također ekspresiju u nadbubrežnoj kori pa prema tome može biti izlučeni neuro-imunomodulator, koji ima značajnu ulogu u orkestriranju imunološkog sustava nakon doživljenog stresa (Chater, 1986).

In vivo, IL18 nastaje cijepanjem proIL18, pa se njegova endogena aktivnost čini se može pripisati IFNγ proizvodnji u P. acnes te LPS-upravljanoj letalnosti. Zreli IL-18 nastaje iz svojih prekursora pomoću IL-1β konvertirajućeg enzima (IL-1beta-konvertirajući enzim, ICE, caspase-1).

IL-18 receptor sastoji se od barem dvije komponente, koje zajednički sudjeluju u vezanju liganda. Vezujuća mjesta s visokim i niskim afinitetom za IL-18 nađena su u mišjim IL-12 stimuliranim T stanicama (Yoshimoto et al., 1998), što ukazuje na višestruki lančani receptorski kompleks. Dosad su identificirane dvije receptorske podjedinice, a obje pripadaju IL-1 receptorskoj familiji (Parnet et al., 1996). Prijenos signala IL-18 uključuje aktiviranje NF-κB (DiDonato et al., 1997).

Nedavno je iz humanog urina izdvojen topljivi protein koji ima visoki afinitet za IL-18, te su opisane humane i mišje cDNA (Novick et al., 1999; WO 99/09063). Protein je označen kao IL-18 vezujući protein (IL-18BP).

IL-18BP nije ekstracelularna domena jednog od poznatih IL18 receptora, već izlučeni, prirodno cirkulirajući protein. Familija nadalje obuhvaća nekoliko Poxvirus-kodiranih proteina koji imaju visoku homologiju prema IL-18BP (Novick et al., 1999). IL-18BP ima konstitutivnu ekspresiju u slezeni, pripada imunoglobulinskoj superfamiliji, te ima ograničenu homologiju za IL-1 receptor tipa II. Njegov gen je lokaliziran na humanom kromosomu 11q13, te nijedan ekson koji kodira transmembransku domenu nije nađen u 8.3 kb genomskoj sekvenciji (Novick et al., 1999).

Četiri humane i dvije mišje izoforme IL-18BP, koje nastaju mRNA cijepanjem i koje su u različitim cDNA bibliotekama su ekspresirane, pročišćene te imaju ispitane za vezanje i neutralizaciju IL-18 bioloških aktivnosti (Kim et al., 2000). Humana IL-18BP iizoforma α (IL-18BPα) pokazuje najveći afinitet za IL-18 s brzim vezanjem, sporim otpuštanjem, te konstantom disocijacije (K(d)) od 399 pM. IL-18BPc dijeli Ig domenu IL-18BPα osim za 29 C-terminalne aminokiseline; K(d) IL-18BPc je deset puta manji (2,94 nM). Štoviše, IL-18BPα i IL-18BPc neutraliziraju IL-18 >95% uz molarni suvišak dva. IL-18BPβ i IL-18BPd izoforme nemaju potpunu Ig domenu i nemaju sposobnost da veži ili neutraliziraju IL-18. Mišje IL-18BPc i IL-18BPd izoforme koje posjeduju identičnu Ig domenu, također neutraliziraju >95% miškeg IL-18 uz molarni suvišak dva. Međutim, mišji IL-18BPd, koji dijeli zajednički C-terminalni motiv s humanim IL-18BPa, također neutralizira humani IL-18. Molekularno modeliranje identificira miješana elektrostatska i hidrofobna vezujuća mjesta u Ig domeni IL-18BP, što bi se moglo pripisati njegovu velikom afinitetu prema ligandu (Kim et al., 2000).

Traumatska ozljeda mozga (TBI), ili jednostavno ozljeda mozga ili zatvorena ozljeda mozga (CHI), odnosi se na ozljedu središnjeg živčanog sustava pri čemu je ozljeda mozga izazvana vanjskim udarcem u glavu. Do je dolazi većinom u automobilskim nesrečama ili nesrećama biciklista, ali do nje može doći kao rezultat pada, srčanog napada, udara i infekcija. Ovaj tip traumatskih ozljeda obično je rezultat nedostatka kisika ili opskrbe mozga kisikom, pa se može nazvati “anoksičnom ozljedom”.

Zatvorene ozljede glave događaju se kada postoji udarac u glavu, kao što je nesreća u vožnji motora ili pad. U tom slučaju, lubanja udara o nepomični objekt te se mozak, koji je unutar lubanje, obrće i zakreće oko svoje osi (moždana osnovica), što izaziva lokalizirano ili prošireno oštećenje. Mozak, koji je meko tkivo koje je okruženo tekućinom u kojoj “pluta”, može se odbiti od lubanje, što može dovesti do daljnjeg oštećenja.

Može postojati vrijeme nesvijesti neposredno nakon traume, što može trajati minutama, tjednima ili mjesecima. Zbog zakretanja ili odbijanja, traumatizirani mozak bolesnika obično prima oštećenje ili za mnoge dijelove mozga. To se naziva difuzno oštećenje ili “neprostrijelna” ozljeda mozga. Tipovi ozljeda mozga zbog “neprostrijelnih” ozljeda mogu se klasificirati kao primarne i sekundarne.

Primarno oštećenje mozga događa se u vrijeme ozljede, većinom na mjestu udara, poglavito kada je prisutna fraktura lubanje. Velike kontuzije mogu biti povezane s intracerebralnom hemoragijom ili može biti praćeno kortikalnim ulceracijama. Difuzne aksonske ozljede javljaju se kao rezultat vlačnih i naponskih sila neuronskih procesa koji su rezultat rotacijskim kretanjem mozga unutar lubanje. Mogu postojati malene hemoragijske ozljede ili difuzno oštećenje aksona, što se može mikroskopski detektirati.

Sekundarno oštećenje mozga rezultat je komplikacija koje se razvijaju u mogu nakon trenutka ozljede. To može uključivati intrakranijalnu hemoragiju, traumatsko oštećenje izvanmoždanih arterija, intrakranijalnu hernijaciju, hipoksično oštećenje mozga ili meningitis.

“Otvorena ozljeda glave” je vidljivo oštećenje glave što može biti rezultat ozljede vatrenim oružjem, nesreće ili prolaska tijela kroz lubanju u mozak (“prostrijelna ozljeda mozga”). Ovaj tip ozljede najčešće oštećuje specifično područje mozga.

Tzv. “blaga ozljeda mozga” može nastupiti bez gubitka svijesti te eventualno samo s osjećajem omamljenosti ili stanjem zbunjenosti koje traje kratko vrijeme. Premda zdravstvena njega koja s primjenjuje može biti malena, osobe s ozljedom mozga bez kome mogu doživjeti simptome i oštećenja koja su slična onima koja dožive osobe u komi.

Kao odgovor na traumu, dolazi do promjena u mozgu, što zahtijeva praćenje da se spriječe daljnja oštećenja. Veličina mozga se često povećava kao odgovor na ozbiljnu ozljedu mozga. To se naziva bubrenjem mozga i događa se kada postoji povećanje količine krvi u mozgu. Kasnije se tijekom bolesti u mozgu može skupiti voda, što se naziva edem mozga. I bubrenje mozga i moždani edem rezultiraju povećanim tlakom u mozgu što se naziva intrakranijalnim tlakom (ICP).

Koma je produženo vrijeme nesvijesti neposredno nakon traumatske ozljede mozga.

Postoji nekoliko razina kome. Razina kome može se mjeriti pomoću progresije odgovora osobe s ozljedom mozga. U akutnoj fazi ozljede glave koristi se “Glazgow” skala kome. Nakon što se poboljša ili stabilizira stanje, koristi se “Rancho Los Amigos” skala kojom se mjere razine koginitivnog (razumijevanje i rasuđivanje) razmišljanja.

Ozljeda mozga često rezultira perzistentnom maloumnošću, kao što je post-traumatska epilepsija, perzistentno vegetativno stanje ili post-traumatska maloumnost.

Ozljeda kralježnice je drugi tip CNS ozljeda. Ozljede kralježnice pripadaju većini bolničkih slučajeva za paraplegiju i tetraplegiju. Preko 80% rezultat je prometnih nesreća. Postoje dvije glavne skupine prema kliničkoj podjeli: otvorene ozljede i zatvorene ozljede.

Otvorene ozljede izazivaju izravnu traumu kralježnice i korijena živaca. Perforirajuće ozljede mogu izazvati ekstenzivno pucanje i hemoragiju. zatvorene ozljede pripadaju većini ozljeda kralježnice i obično su povezane s frakturom/dislokacijom kralježnice, što se može pokazati radiološki. Oštećenje kralježnice ovisi o dosegu koštanog oštećenja i može se podijeliti u dva stupnja: primarno oštećenje, što su kontuzije, kidanje živčanih vlakana i hemoragijska nekroza, te sekundarno oštećenje, što su ekstraduralni hematom, infarkt, infekcija i edem.

Kasni učinci oštećenja kore obuhvaćaju: uzlaznu i silaznu anterogradnu degeneraciju oštećenih živčanih vlakana, post-traumatsku siringomijeliju, te sistemske učinke paraplegije, kao što su infekcije mokraćnog sustava i infekcije grudnog koša.

Patologija traumatske ozljede mozga je vrlo složena i još uvijek o njoj malo znamo. Napori u istraživanju tijekom posljednjeg desetljeća rasvijetlili su značajnu ulogu citokina koji se otpuštaju sistemski ili lokalno unutar intratekalnog prostora nakon ozljede mozga, te je pretpostavljen dvojaki učinak post-upalnih citokina, kao što su TNF, IL-6 ili IL-8, temeljem nalaza vremenski ovisnih blagotvornih i nepovoljnih učinaka ovih medijatora (Morganti-Kossmann et al., 1997; Kossmann et al., 1997; Shohami et al., 1999, Scherbel et al., 1999; Whalen et al., 2000). kao što je prije opisano, nedavno otkriveni citokin IL-1 familije je IL-18. Novija istraživanja pokazala su da postoji konstitutivna ekspresija IL-18 u CNS miševa, štakora i ljudi in vivo (Culhane et al., 1998; Jander and Stoll, 1998; Prinz et al., 1999; Fassbender et al., 1999; Wheeler et al., 2000), kao i u primarnim kulturama astrocita i mikroglija, ali ne i neurona in vitro (Conti et al., 1999). Povećane razine IL-18 nađene su u likvoru (CSF) bolesnika s upalnim bolestima središnjeg živčanog sustava, kao što su bakterijski meningitis i virusni meningoencefalitis, ali ne u likvoru bolesnika s multiplom sklerozom (MS) (Fassbender et al., 1999). Nasuprot nalazu općenito niskih intratekalnih razina IL-18 u MS bolesnika, povećana ekspresija IL-18 mRNA je uočena u kralježnici Lewisovih štakora s eksperimentalnim autoimunim encefalomijelitisom (EAE), što je životinjski model za MS (Jander and Stoll, 1998). Ekspresija i funkcionalni značaj IL-18 pri neurološkoj traumi još nisu istraženi.

Sažetak izuma

Ovaj izum odnosi se na patofiziološku ulogu IL-18 tijekom bolesti središnjeg živčanog sustava (CNS). On se zasniva na izumu da tretiranje miševa s inhibitorima IL-18, bilo jedan sat ili tri dana nakon eksperimentalne zatvorene ozljede glave (CHI), rezultira poboljšanim oporavkom i smanjuje doseg oštećenja mozga u odnosu na kontrolne životinje. Izum se dakle odnosi na uporabu IL-18 inhibitora za proizvodnju medikamenta za tretiranje i/ili prevenciju ozljeda središnjeg živčanog sustava (CNS), te poglavito traumatske ozljede mozga.

Uporaba kombinacija IL-18 inhibitora s interferonom i/ili TNF i/ili inhibitorima upale i/ili antioksidantima također je unutar dosega ovog izuma. da bi se primijenio genski terapijski pristup da se unese IL-18 inhibitor oboljelim tkivima ili stanicama, daljnji aspekti ovog izuma odnose se na uporabu molekula nukleinske kiseline koje sadrže kodirajuću sekvenciju IL-18 inhibitora za tretiranje i/ili prevenciju ozljede CNS. Izum se također odnosi na uporabu stanica koje su genetski promijenjene da se izvrši ekspresija IL-18 inhibitora za prevenciju i/ili tretiranje ozljede CNS.

Sažeti opis crteža

Slika 1 daje histogram na kojem su prikazane razine intracerebralnog IL-18 (ng/ml) u serumu u cijelom mozgu (šrafirano), u lijevoj hemisferi (crno) ili u desnoj hemisferi (sivo) u različitim uvjetima.

Slika 2 prikazuje razvoj NSS (indeks neurološke uznapredovalosti) mjeren 1 sat (h), 24h, 72h ili 168h nakon traume, bilo s 50 μg IL-18BP koji je primijenjen i.p. 1 h nakon traume (kvadratići), ili s injekcijom isključivo nosača (kontrole, kružići).

Slika 3 prikazuje ΔNSS koji je mjeren 24h, 72h ili 168h nakon traume, bilo s 50 μg IL-18BP koji je primijenjen i.p. 1h nakon traume (kvadratići), ili s injekcijom isključivo nosača (kontrole, kružići).

Slika 4 prikazuje ΔNSS koji je mjeren 1h, 24h, 3 dana (d), 7d ili 14d nakon traume, bilo s 50 μg IL-18BP koji je primijenjen i.p. bilo kao jednostruka doza 3d nakon traume (romboidi), ili s dvostrukom dozom 1h i 3d nakon traume (kvadratići) ili injekcijom isključivo nosača (kontrole, trokutići).

Opis izuma

Ovaj izum temelji se na nalazu statistički značajnog blagotvornog učinka IL-18 inhibitora na oporavak od ozljede mozga u mišjem modelu zatvorene ozljede mozga. Sukladno ovom izumu, također je nađeno da je IL-18 doreguliran u mozgu i likvoru nakon traumatske ozljede mozga, što ukazuje da ovaj protuupalni citokin ima značajnu ulogu u patogenezi ozljede mozga.

Dakle, ovaj izum odnosi se na uporabu IL-18 inhibitora u proizvodnji medikamenta za tretiranje i/ili prevenciju ozljeda središnjeg živčanog sustava (CNS).

Izum se također odnosi na uporabu IL-18 inhibitora u proizvodnji medikamenta za tretiranje i/ili prevenciju komplikacija i kasnih učinaka ozljeda CNS.

U poželjnim realizacijama izuma, ozljeda CNS je traumatska ozljeda mozga ili zatvorena ozljeda mozga.

U sljedećoj poželjnoj realizaciji, ozljeda CNS je ozljeda kralježnice.

U sljedećoj od daljnjih poželjnih realizacija ovog izuma, ozljeda mozga je vaskularnoj porijekla.

U kontekstu ovog izuma, izraz “ozljeda središnjeg živčanog sustava” ili “ozljeda CNS” odnosi se na bilo kakvu ozljedu mozga ili kralježnice, bez obzira na starost pojave ili na njen uzrok. Uzrok može biti mehanički ili neka infekcija. Ozljeda CNS i njeni klinički simptomi te implikacije su detaljno opisani u “Stanju tehnike”. Ozljeda CNS obuhvaća npr. traumu ili neko drugo oštećenje mozga ili kralježnice, te se također naziva neurološka trauma.

Ozljeda mozga može primjerice obuhvaćati ili biti rezultat jednog ili više sljedećih uzroka: 1. oštećenje pozornosti; 2. kognitivno oštećenje; 3. oštećenje govora; 4. oštećenje pamćenja; 5. poremećaj vodljivosti; 6. motorički poremećaj; 6. bilo koja druga neurološka disfunkcija.

Ozljeda kralježnice može biti primjerice rezultat paraplegije ili tetraplegije.

Komplikacije ili kasni učinci ozljede CNS mogu također biti tretirani i/ili spriječeni sukladno ovom izumu. Komplikacije i kasni učinci ozljeda mozga su prije opisani u “Stanju tehnike”. Oni obuhvaćaju, ali nisu ograničeni na komu, meningitis, post-traumatsku epilepsiju, post-traumatsku maloumnost, degeneriranje živčanih vlakana ili primjerice na post-traumatsku siringomijeliju ili hemoragiju.

Ovaj izum odnosi se na uporabu IL-18 inhibitora za priređivanje medikamenta za tretiranje i/ili prevenciju bilo kakve ozljede mozga koja je vaskularnog porijekla, kao što je hipoksično oštećenje mozga s cerebralnim infarktom, ishemija, cerebrovaskularni ispad ili udar.

Pojmovi “tretiranje” i “prevencija”, kako se ovdje rabe, podrazumijevaju djelomičnu ili cjelovitu prevenciju, inhibiranje, prigušenje, uklanjanje ili obrat jednog ili više simptoma ili uzroka ozljede CNS, kao i simptoma, bolesti ili komplikacija koje prate ozljedu CNS. Kada se “tretira” ozljeda CNS, tvar sukladno ovom izumu se daje nakon pojave bolesti, dok se “prevencija” odnosi na primjenu tvari prije pojave znakova bolesti u bolesnika.

Tretiranje CNS ozljeda je poželjno, sukladno ovom izumu. Poželjno, da bismo tretirali CNS ozljedu, primjenjuje se IL-18 inhibitor što je ranije moguće nakon ozljede središnjeg živčanog sustava, npr. unutar prvog sata nakon CNS ozljede. Međutim, kao što je pokazano u primjerima niže, određeni IL-18 inhibitor se pokazao kao blagotvornog učinka na ozljedu mozga čak i kad je primijenjen tri dana nakon što se desila ozljeda mozga. Dakle, da bismo tretirali ozljedu CNS-a, poželjno je primijeniti IL-18 inhibitor unutar tri dana od ozljede.

Pojam “inhibitor IL-18” u kontekstu ovog izuma, odnosi se na bilo koju molekulu koja modulira proizvodnju i/ili djelovanje IL-18 na takav način da je proizvodnja i/ili djelovanje IL-18 prigušeno, smanjeno te djelomično, većinom ili u potpunosti spriječeno ili blokirano. Pojam “IL-18 inhibitor” označuje inhibitore IL-18 proizvodnje, kao i inhibitore IL-18 djelovanja.

Inhibitor proizvodnje može biti bilo koja molekula koja negativno djeluje na sintezu, obradu ili sazrijevanju IL-18. Inhibitori sukladno ovom izumu mogu biti, primjerice, supresori ekspresije gena interleukina IL-18, protivsmislena mRNAs koja smanjuje ili sprječava transkripciju IL-18 mRNA ili vodi degradiranju mRNA, proteini koji onemogućuju točno savijanje, te djelomično ili potpuno sprječavaju izlučivanje IL-18, proteaze koje degradiraju IL-18, nakon što je sintetiziran, inhibitori proteaza koji cijepaju pro-IL-18 da bi se generirao zreli IL-18, kao što su inhibitori kaspase-1, i slično.

Inhibitor djelovanja IL-18 može primjerice biti IL-18 antagonist. Antagonisti se mogu ili vezati za IL-18 molekulu ili je razgrađivati s dovoljnim afinitetom i specifičnošću da djelomično ili potpuno neutraliziraju IL-18 ili IL-18 vezujuća mjesta koja su odgovorna za vezanje IL-18 za njegove ligande (primjerice za njegove receptore). Antagonist može također inhibirati IL-18 signalni put, koji je aktiviran unutar stanica nakon vezanja IL-18 za njegov receptor.

Inhibitori djelovanja IL-18 mogu također biti topljivi IL-18 receptori ili molekule koje podsjećaju na receptore, ili sredstva koja receptore IL-18 ili IL-18 antitijela, kao što su poliklonska ili monoklonska antitijela, ili neko sredstvo ili molekula koja sprječava vezanje IL-18 za njegove mete, čime se otklanja ili sprječava pokretanje unutar- ili izvanstaničnih reakcija koje su upravljane s IL-18.

U poželjnoj realizaciji ovog izuma, inhibitor IL-18 odabran je između inhibitora caspase-1 (ICE), antitijela koja su usmjerena protiv IL-18, antitijela koja su usmjerena protiv bilo koje od IL-18 receptorskih podjedinica, inhibitora IL-18 signalnog puta, antagonista IL-18 koji kompetiraju s IL-18 ili se vežu za nj, te blokiraju IL-18 receptor, te IL-18 vezujućih proteina, izoformi, muteina, sjedinjenih proteina, funkcionalnih derivata, aktivnih frakcija ili cirkularno permutiranih derivata, te njihovih soli.

Pojam “IL-18 vezujući protein” se ovdje koristi kao sinonim za “IL18BP”. On obuhvaća IL-18 vezujuće proteine kao što je definirano u WO 99/09063 ili u Novick et al., 1999, uključujući ‘splice’ inačice i/ili izoforme IL-18 vezujućih proteina, kao što je definirano u Kim et al., 2000. Konkretno, humane izoforme a i c od IL-18BP su korisne sukladno s ovim izumom. Proteini koji su korisni sukladno ovom izumu mogu biti glikozilirani ili ne-glikolizirani, oni mogu biti izvedeni iz prirodnih izvora, kao što su urin, ili oni mogu poželjno biti rpoizvedeni rekombinantno. Rekombinantna ekspresija može se izvršiti u prokariotskim ekspresijskim sustavima kao što su E. coli, ili u eukariotskim ekspresijskim sustavima, poželjno onima sisavaca. Stanična linija koja je konkretno dobro prilagođena za IL-18 inhibitore ovog izuma je jajna stanica kineskog zamorca (CHO).

Rekombinantna proizvodnja IL-18 inhibitora, s rekombinantnom ekspresijom u stanicama ili staničnim linijama sisavaca, može se poželjno izvršiti u staničnom mediju kulture bez seruma.

Kako se ovdje rabi, pojam “muteini” odnosi se na analoge IL-18BP, ili analoge virusnog IL-18BP, u kojima je jedna ili više aminokisleinskih rezdiua prirodnog IL-18BP ili virusnog IL-18BP zamijenjeno s različitim aminokiselinskim rezdiuama, ili je uklonjeno, ili je jedna ili više aminokisleinskih rezidua dodano prirodnoj sekvenciji IL-18BP, ili virusnom IL-18BP, bez značajnog smanjenja aktivnosti nastalih produkata u usporedbi s divljim tipom IL-18BP ili virusnog IL-18BP. Ovi muteini su priređeni pomoću poznate sinteze i/ili pomoću tehnika mjesto-usmjerene mutageneze, ili bilo kojom drugom pogodnom tehnikom.

Bilo koji takav mutein poželjno ima sekvenciju aminokiselina koja je dovoljno duplicirajuća onoj IL-18BP, ili dovoljno duplicirajuća virusnom IL-18BP, tako da ima suštinski sličnu aktivnost onoj IL-18BP. Aktivnost IL-18BP je njegova sposobnost da veže IL18. Sve dok mutein ima suštinski aktivnost vezanja kao IL18, on s emože koristiti u pročišćavanju IL18, kao što je pomoću afinitetne kromatografije, te se prema tome može smatrati suštinski slične aktivnosti kao IL-18BP. Dakle, može se odrediti ima li bilo koji dani mutein aktivnost koja je slična onoj za IL-18BP pomoću rutinskog eksperimentiranja što uključuje podvrgavanje takvog muteina, npr. “sendvič” kompeticijskoj analizi da se odredi da li se veže za odgovarajuće obilježeni IL18, kao što je radioimunološka ili ELISA analiza. Jednostavne funkcionalne analize za procjenu biološke aktivnosti IL-18BP opisane su iscrpno u WO 99/09063, npr. u primjerima 2 (vezanje za IL-18 što je procijenjeno križnim vezanjem) ili 5 (inhibiranje IL-18 izazvane INF-gama indukcije u mononuklearnim krvnim stanicama).

U poželjnoj realizaciji, bilo koji takav mutein ima bar 40% identičnosti ili homologije sa sekvencijom bilo IL18BP ili virusno-kodiranog IL18BP homologa. Poželjnije, on ima bar 50%, bar 60%, bar 70%, bar 80% ili, najpoželjnije, bar 90% identičnosti ili homologije.

Muteini IL-18BP polipeptida ili muteini virusnih IL-18BP, koji se mogu koristiti sukladno ovom izumu, ili nukleinske kiseline koje ih kodiraju, obuhvaćaju konačan skup suštinski korespondirajućih sekvencija kao što su supstitucijski peptidi ili polinukleotidi koji se mogu rutinski dobiti standardnim znanjem tehnike, bez nepotrebnog eksperimentiranja, temeljem znanja i vodiča koji su ovdje navedeni.

Muteini sukladno ovom izumu obuhvaćaju proteine koji su kodirani nukleinskom kiselinom, kao što su DNA ili RNA, koji hibridiziraju na DNA ili RNA, koji kodiraju IL-18 inhibitor, sukladno ovom izumu, u umjerenim ili vrlo strogim uvjetima. pojam “strogi uvjeti” odnosi se na hibridiziranje i naknadne uvjete ispiranja, što oni koji koji poznaju ovo područje nazivaju “strogim”. Vidi Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, dolje, Interscience, N.Y., §§6.3 i 6.4 (1987, 1992), te Sambrook et al.(Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., i Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Bez ograničenja, primjeri strogih uvjeta obuhvaćaju uvjete ispiranja 1220°C ispod izračunate Tm hibrida koji se ispituju, npr. 2×SSC i 0,5% SDS tijekom 5 minuta, 2×SSC i 0,1% SDS tijekom 15 minuta; 0,1×SSC i 0,5% SDS na 37°C tijekom 3060 minuta i zatim, 0,1×SSC i 0,5% SDS na 68°C tijekom 3060 minuta. Oni koji poznaju ovo područje znaju da strogost uvjeta ovisi o duljini sekvencija DNA, oligonukleotidnih sondi (kao što je 1040 baza) ili mješovitih oligonukleotidnih sondi. Ako se koriste mješovite sonde, poželjno je koristiti tetrametil amonijev klorid (TMAC) umjesto SSC. Vidi Ausubel, dolje.

U poželjnoj realizaciji, svaki takav mutein ima bar 40% identičnosti ili homologije sa sekvencijom sa sekv. ident. br 1, 2 ili 3 u priloženom ispisu sekvencija. Poželjnije, ona ima bar 50%, bar 60%, te bar 70%, bar 80% ili, najpoželjnije, bar 90% identičnosti ili homologije.

Identičnost odražava odnos između dviju ili više polipeptidnih sekvencija ili dviju ili više polinukleotidnih sekvencija, što je određeno uspoređivanjem sekvencija. Općenito, identičnost se odnosi na egzaktni nukleotid prema nukleotidu ili aminokiselina prema aminokiselini korespondenciju dviju polinukleotida ili dviju polipeptidnih sekvencija, cijelom duljinom sekvencija koje se uspoređuju.

Za sekvencije koje se ne odlikuju točnom korespondencijom, može se odrediti “postotak identičnosti”. Općenito, dvije sekvencije koje se uspoređuju se poravnavaju tako da se postigne maksimalna korelacija između sekvencija. To može uključivati ubacivanje “praznina” u bilo jednu ili obje sekvencije, da se poveća stupanj sukladnosti. Postotak identičnosti može se odrediti punom duljinom svake sekvencije koja se uspoređuje (tzv. globalno usklađivanje), što je osobito pogodno za sekvencije koje su identične ili vrlo slične duljine, ili kraćim, definiranim duljinama (tzv. lokalno usklađivanje), što je pogodnije za sekvencije nejednake duljine.

Metode za uspoređivanje identiteta i homologije dviju ili više sekvencija su dobro poznate u tehnici. Prema tome, programi koji su raspoloživi u Wisconsin Sequence Analysis Package, inačica 9.1 (Devereux J et al., 1984), primjerice programi BESTFIT i GAP, mogu se koristiti da se odredi postotak identičnosti između dviju polinukleotida i postotak identičnosti i postotak homologije između dviju polipeptidnih sekvencija. BESTFIT koristi algoritam “lokalne homologije”, Smith i Waterman (1981), te pronalazi najbolje pojedinačno područje sličnosti između dviju sekvencija. Drugi programi za određivanje identičnosti i/ili sličnosti između sekvencija su također poznati u tehnici, primjerice BLAST hamilija programa (Altschul S F et al, 1990, Altschul S F et al, 1997, dostupno putem matične stranice NCBI na www.ncbi.nlm.nih.gov) i FASTA (Pearson W R, 1990; Pearson 1988).

Poželjne promjene za muteine sukladno ovom izumu su one koje su poznate kao “konzervativne” supstitucije. Konzervativne aminokiselinske supstitucije IL-18BP polipeptida ili proteina ili virusnih IL-18BP, mogu obuhvaćati sinonimne aminokiseline unutar skupine koja ima dovoljno slična fizičkokemijska svojstva da se supstitucijom između članova skupinu zadržava biološka funkcija molekule (Grantham, 1974). Jasno je da se ubacivanja ili uklanjanja aminokiselina može načiniti u gore navedenim sekvencijama bez promjene njihove funkcije, osobito ako ubacivanje ili uklanjanje aminokisleina može obuhvaćati samo nekoliko aminokiselina, npr. manje od trideset, te poželjno manje od deset, te da se uklanjaju ili zamjenjuju aminokiseline koje su kritične za funkcionalnu konformaciju, npr. cisteinske rezidue. Proteini i muteini koji nastaju takvim uklanjanjem i/ili ubacivanjem unutar su razmatranja ovog izuma.

Poželjno, skupine sinonimnih aminokiselina su one koje su navedene u tablici 1. Poželjnije, skupine sinonimnih aminokiselina su one navedene u tablici 2, dok su najpoželjnije skupine aminokiselina one koje su navedene u tablici 3.

Tablica 1

Poželjne skupine sinonimnih aminokiselina

Aminokiselina Sinonimna skupina

Ser Ser, Thr, Gly, Asn

Arg Arg, Gln, Lys, Glu, His

Leu Ile, Phe, Tyr, Met, Val, Leu

Pro Gly, Ala, Thr, Pro

Thr Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gln, Thr

Ala Gly, Thr, Pro, Ala

Val Met, Tyr, Phe, Ile, Leu, Val

Gly Ala, Thr, Pro, Ser, Gly

Ile Met, Tyr, Phe, Val, Leu, Ile

Phe Trp, Met, Tyr, Ile, Val, Leu, Phe

Tyr Trp, Met, Phe, Ile, Val, Leu, Tyr

Cys Ser, Thr, Cys

His Glu, Lys, Gln, Thr, Arg, His

Gln Glu, Lys, Asn, His, Thr, Arg, Gln

Asn Gln, Asp, Ser, Asn

Lys Glu, Gln, His, Arg, Lys

Asp Glu, Asn, Asp

Glu Asp, Lys, Asn, Gln, His, Arg, Glu

Met Phe, Ile, Val, Leu, Met

Trp Trp

Tablica 2

Poželjnije skupine sinonimnih aminokiselina

Aminokiselina Sinonimna skupina

Ser Ser

Arg His, Lys, Arg

Leu Leu, Ile, Phe, Met

Pro Ala, Pro

Thr Thr

Ala Pro, Ala

Val Val, Met, Ile

Gly Gly

Ile Ile, Met, Phe, Val, Leu

Phe Met, Tyr, Ile, Leu, Phe

Tyr Phe, Tyr

Cys Cys, Ser

His His, Gln, Arg

Gln Glu, Gln, His

Asn Asp, Asn

Lys Lys, Arg

Asp Asp, Asn

Glu Glu, Gln

Met Met, Phe, Ile, Val, Leu

Trp Trp

Tablica 3

Najpoželjnije skupine sinonimnih aminokiselina

Aminokiselina Sinonimna skupina

Ser Ser

Arg Arg

Leu Leu, Ile, Met

Pro Pro

Thr Thr

Ala Ala

Val Val

Gly Gly

Ile Ile, Met, Leu

Phe Phe

Tyr Tyr

Cys Cys, Ser

His His

Gln Gln

Asn Asn

Lys Lys

Asp Asp

Glu Glu

Met Met, Ile, Leu

Trp Met

Primjeri proizvodnje aminokiselinskih supstitucija u proteinima koje se mogu koristiti za dobivanje muteina IL-18BP polipeptida ili proteina, ili muteina virusnih IL-18BP, za uporabu u ovom izumu uključuju bilo koje poznate metodske stupnjeve, kao što su oni u američkim patentnim prijavama 4,959,314, 4,588,585 i 4,737,462, od Mark et al; 5,116,943 od Koths et al., 4,965,195 od Namen et al; 4,879,111 od Chong et al; te 5,017,691 od Lee et al; dok su lizinom supstituirani proteini prikazani u američkoj patentnoj prijavi br. 4,904,584 (Shaw et al).

Pojam “sjedinjeni protein” odnosi se na polipeptid koji sadrži IL-18BP ili virusni IL-18BP, ili njegov mutein ili fragment, koji je sjedinjen s drugim proteinom, koji npr. ima produženo vrijeme zadržavanja u tjelesnim tekućinama. IL-18BP ili virusni IL-18BP, može dakle biti sjedinjen s drugim proteinom, polipeptidom ili slično, npr. imunoglobulinom ili njegovim fragmentom.

"Funkcionalni derivati" kako se ovdje rabe pokrivaju derivate IL-18BPs ili virusnog IL-18BP, te njihove muteine i sjedinjene proteine, koji se mogu prirediti iz funkcionalnih skupina koje se nalaze na bočnim lancima rezidua ili N ili Cterminalnih skupina, na način koji je poznat u tehnici, te su obuhvaćeni ovim izumom sve dok su farmaceutski prihvatljivi, tj. ne uništavaju aktivnost proteina koja je slična aktivnosti IL-18BP ili virusnog IL-18BPs, te ne unose svojstva toksičnosti u smjese koje ih sadrže.

Ovi derivati mogu, primjerice, uključivati polietilenglikolne bočne lance, koji mogu maskirati antigena mjesta i produžiti vrijeme zadržavanja IL-18BP ili virusnog IL-18BP u tjelesnim tekućinama. Ostali derivati uključuju alifatske estere karboksilnih skupina, amide kaboksilnih skupina reakcijom s amonijakom ili primarnim ili sekundarnim aminima, Nacil derivate slobodnih aminokiselinskih rezidua koje nastaju s acilnim specijama (npr. alkanoilne ili karbocikličke aroilne skupine) ili Oacil derivate slobodnih hidroksilnih skupina (primjeric eone serilnih ili treonilnih rezidua) koje nastaju s acilnim specijama.

Kao “aktivne frakcije” IL-18BP ili virusnog IL-18BP, muteina i sjedinjenih proteina, ovaj izum pokriva bilo koji fragment ili prekursore polipeptidskog lanca proteinske molekule same ili zajedno s pridruženim molekulama ili reziduama za koje su vezani, npr. šećerim ili fosfatnim reziduama, ili agregatima proteinskih molekula ili samih šećernih rezidua, omogućuju da navedena frakcija ima suštinski aktivnost koja je slična onoj IL-18BP.

Pojam “soli” odnosi se na soli karboksilnih kiselina i na adicijske soli amino skupina IL-18 inhibitorske molekule ili njenih analoga. Soli karboksilne skupine mogu nastati na način koji je poznat u tehnici i obuhvaća anorganske soli, primjerice natrijeve, kalcijeve, amonijeve, željezne ili cinkove soli, te soli organskih baza kao što su one koje nastaju, primjerice, s aminima, kao što je trietanolamin, arginin ili lizin, piperidin, prokain i slično. Kisele adicijske soli obuhvaćaju, primjerice, soli mineralnih kiselina, kao što su primjerice klorovodična kiselina ili sumporna kiselina, te soli organskih kiselina, primjerice octene ili oksalne kiseline. Naravno, bilo koja takva sol mora zadržati biološku aktivnost na OPN što je relevantno za ovaj izum, tj. iskazati proliferacijski učinak na oligodendrocite.

U drugoj poželjnoj realizaciji ovog izuma, inhibitor IL-18 je IL-18 antitijelo. Anti-IL-18 antitijela mogu biti poliklonska ili monoklonska, kimerna, humanizirana ili u cijelosti humana. Rekombinantna antitijela i njeni fragmenti karakterizirani su niskim afinitetom vezanja za IL-18 in vivo te niskom toksičnošću. Antitijela koja se mogu koristiti u ovom izumu su karakterizirana njihovom sposobnošću da tretiraju bolesnike tijekom perioda koji je dovoljno dug da se dobije dobra regresija ili povlačenje patogenog stanja ili nekog simptoma ili skupine simptoma koji su povezani s patogenim stanjem, te niskom toksičnošću.

Neutralizirajuća antitijela lako rastu u životinja kao što su kunići, koza ili miševi imuniziranjem s IL-18. Imunizirani miševi su osobito korisni da se dobiju izvori B stanica za proizvodnju hibridoma, koji se opet uzgajaju da se dobiju velike količine anti-IL-18 monoklonskih antitijela.

Kimerna antitijela su imunoglobulinske molekule koje su karakterizirane s dva ili više segmenata ili dijelova koji su izvedeni iz različitih životinjskih vrsta. Općenito, promjenjivo područje kimernog antitijela izvedeno je iz ne-humanog antitijela sisavaca, kao što je mišje monoklonsko antitijelo, te imunoglobulinskog nepromjenjivog područja koje je izvedeno iz humane imunoglobulinske molekule. Poželjno, oba područja i kombinacija imaju slabu imunogenost što je rutinski utvrđeno (Elliott et al., 1994). Humanizirana antitijela su imunoglobulinske molekule koje su dobivene tehnikama genetskog inženjeringa pri čemu se mišja konstantna područja zamjenjuju s humanim odgovarajućim dijelovima pri čemu se zadržavaju mišja antigenska vezujuća područja. Nastalo mišje humano kimerno antitijelo poželjno ima smanjenu imunogenost i poboljšanu farmakokinetiku u ljudi (Knight et al., 1993).

Dakle, u sljedećoj poželjnoj realizaciji, IL-18 antitijelo je humanizirano IL-18 antitijelo. Poželjni primjeri humaniziranih anti-IL-18 antitijela su primjerice opisani u europskoj patentnoj prijavi EP 0 974 600.

U drugoj poželjnoj realizaciji, IL-18 antitijelo je u potpunosti humano. tehnologija proizvodnje humanih antitijela opisana je iscrpno u WO00/76310, WO99/53049, US 6,162,963 ili AU5336100. Potpuno humana antitijela su poželjno rekombinantna antitijela, koja nastaju u transgenim životinjama, npr. ksenomiševima, gdje su sačuvana djelomično ili potpuno funkcionalna humana Ig mjesta.

U osobito poželjnoj realizaciji ovog izuma, inhibitor IL-18 je IL-18BP, ili njegova izoforma, mutein, sjedinjeni protein, funkcionalni derivat, aktivna frakcija ili cirkularno permutirani derivat. Ove izoforme, muteini, sjedinjeni proteini ili funkcionalni derivati zadržavaju biološku aktivnost IL-18BP, konkretno vezanje za IL-18, te poželjno imaju aktivnost koja je bar slična onoj za IL-18BP. Idealno, ti proteini imaju biološku aktivnost koja je čak povećana u usporedbi s nemodificiranim IL-18BP. Poželjne aktivne frakcije imaju aktivnost koja je bolja od aktivnosti IL-18BP, ili neke druge prednosti, kao što je bolja stabilnost ili manja toksičnost ili imunogenost, ili se mogu lakše proizvesti u većim količinama, ili ih je lakše pročistiti.

Sekvencije IL-18BP i njene ‘splice’ inačice/izoforme mogu biti one uzete iz WO 99/09063 ili iz Novick et al., 1999, kao i iz Kim et al., 2000.

Funkcionalni derivati IL-18BP mogu biti konjugirani za polimere da se poboljšaju svojstva proteina, kao što je stabilnost, poluživot, poluživot, biološka raspoloživost, tolerancija humanog tijela, ili imunogenost. da se postigne taj cilj, funkcionalni derivati mogu sadržavati bar jednu speciju koja je vezana za jednu ili funkcionalnih skupina, koje se nalaze kao jedan ili više bolnih lanaca na aminokisleinskim reziduama. Takva funkcionalna skupina može biti npr. politilenglikol (PEG). PEGiliranje se može izvršiti poznatim metodama, koje su opisane primjerice u WO 92/13095.

Dakle, u poželjnoj realizaciji ovog izuma, inhibitori IL-18, te konkretno IL-18BP je PEGiliran.

U sljedećoj poželjnoj realizaciji ovog izuma, inhibitor IL-18 je sjedinjeni protein koji sadrži cijeli ili dio IL-18 vezujućeg proteina, koji je sjedinjen s cijelim ili s dijelom imunoglobulina. osoba koja poznaje ovo područje zna da nastali sjedinjeni protein zadržava biološku aktivnost IL-18BP, konkretno vezanje za IL-18.

Sjedinjavanje može biti izravno, ili putem kratkog veznog peptida koji može biti dugačak samo 1 do 3 aminokiselinskih rezidua ili duže, primjerice duljine 13 aminokisleinskih rezidua. Navedeni veznik moiže biti tripetid, primjerice sekvencije E-F-M (Glu-Phe-Met), ili 13-aminokiselinska vezna sekvencija koja sadrži Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met koji je postavljen između IL-18BP sekvencije i imunoglobulinske sekvencije. Nastali sjedinjeni protein ima poboljšana svojstva, kao što je produženo vrijeme zadržavanja u tjelesnim tekućinama (poluživot), povećana specifična aktivnost, povećana razina ekspresije ili je olakšano pročišćavanje sjedinjenog proteina.

U poželjnoj realizaciji, IL-18BP je sjedinjen s konstantnim područjem Ig molekule. Poželjno, sjedinjen je s teškolančanim područjem, kao što su primjerice CH2 i CH3 domene humanog IgG1. Generiranje specifičnih sjedinjenih proteina koji sadrže IL-18BP i dio imunoglobulina opisano je primjerice u primjeru 11 u WO 99/09063. Druge izoforme Ig molekula su također pogodne za generiranje sjedinjenih proteina sukladno ovom izumu, kao što su izoforme IgG2 ili IgG4, ili druge Ig klase, primjerice poput IgM ili IgA. Sjedinjeni proteini mogu biti monomerni ili multimerni, hetero- ili homomultimerni.

Interferoni su dominantno poznati glede inhibitorskih učinaka na virusno repliciranje i staničnu proliferaciju. Interferon-γ, primjerice, ima značajnu ulogu u promaknuću imunoloških i upalnih odgovora. Interferon β (IFN-β, interferon tipa I), ima protivupalnu ulogu.

Izum se dakle odnosi na uporabu kombinacije inhibitora IL-18 i interferona u proizvodnji medikamenta za tretiranje ozljede CNS.

Interferoni mogu biti konjugirani za polimere da bi se poboljšala stabilnost proteina. Konjugat između interferona β i poliol polietilenglikola (PEG) opisani je primjerice u WO99/55377.

U sljedećoj poželjnoj realizaciji ovog izuma, interferon je interferon-β (IFN-β), te poželjnije IFN-β 1a.

Inhibitor proizvodnje i/ili djelovanja IL-18 poželjno se koristi istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno s interferonom.

Za faktor tumorske nekroze je u literaturi opisano da ima zaštitne i toksične učinke pri ozljedi mozga (Shohami et al., 1999). U primjeru 1, niže, TNF injekcija kmiševima koji imaju izbviljnu traumu mozga rezultirala je značajnim smanjenjem razine IL-18 u mozgu, što pokazuje da TNF može imati blagotvoran učinak na oporavak traumatske ozljede mozga. dakle, poželjna realizacija ovog izuma odnosi se na uporabu inhibitora IL-18 u kombinaciji s TNF za priređivanje medikamenta za tretiranje i/ili prevenciju ozljede mozga, za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu uporabu.

Kombiniranje IL-18 inhibitora s TNF alfa je poželjno sukladno ovom izumu.

U sljedećoj poželjnoj realizaciji ovog izuma, medikament također sadrži protivupalno sredstvo, kao što je NSAID (nesteropidni protivupalni lijek). U poželjnoj realizaciji, COX-inhibitor, te najpoželjnije COX-2 inhibitor, koristi s eu kombinaciji s IL-18 inhibitor. COX-inhibitori su poznati u tehnici. Specifični COX-2 inhibitori opisani su primjerice u WO 01/00229. Aktivne komponente mogu se koristiti istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno.

Oksidacijski stres, konkretno reaktivne specije kisika (ROS), opisano je da imaju ulogu u patofiziologiji oštećenja mozga (Shohami et al., 1997).

Dakle, u poželjnoj realizaciji ovog izuma, medikament također sadrži antioksidans, za istovremenu, sekvencijalnu ili odvojenu uporabu. Mnogi antioksidansi su poznati u tehnici, kao što su vitamini A, C ili E, ili 5-aminosalicilna kiselina ili superoksid dismutaza.

U sljedećoj poželjnoj realizaciji ovog izuma, inhibitor IL-18 koristi se u količini od oko 0,001 do 100 mg/kg tjelesne težine, ili od oko 0,01 do 10 mg/kg tjelesne težine ili od oko 0,1 do 3 mg/kg tjelesne težine ili od oko 1 do 2 mg/kg tjelesne težine.

U sljedećoj poželjnoj realizaciji, inhibitor IL-18 koristi se u količini od oko 0,1 do 1000 μg/kg tjelesne težine ili od oko 1 do 100 μg/kg tjelesne težine ili od oko 10 do 50 μg/kg tjelesne težine.

Izum se nadalje odnosi na uporabu molekule nukleinske kiseline koja sadrži kodirajuću sekvenciju IL-18 inhibitora, mutein, funkcionalni derivat ili njegovu aktivnu frakciju, za priređivanje medikamenta za prevenciju i/ili tretiranje ozljede CNS.

Poželjno, molekula nukleinske kiseline također sadrži sekvenciju ekspresijskog vektora, npr. da se koristi genska terapija za primjenu IL-18 inhibitora ovog izuma.

Poželjno, molekula nukleinske kiseline se primjenjuje intramuskularno.

Da bi se tretirala i/ili spriječila ozljeda CNS, vektor genske terapije koji sadrži sekvenciju inhibitora proizvodnje i/ili djelovanja IL-18 može se injicirati izravno u oboljelo tkivo, primjerice da se izbjegnu problemi koji su uključeni u sistemsku primjenu vektora genske terapije, dosizanja i pogađanja ciljanih stanica i tkiva, te sporednih učinaka.

Upotreba vektora za izazivanje i/ili pojačanje endogene proizvodnje inhibitora IL-18 u stanici koja je normalno nijema za ekspresiju IL-18 inhibitora, ili koja vrši ekspresiju količina inhibitora koje nisu dovoljne, također se smatra da je unutar ovog izuma za tretiranje i/ili prevenciju ozljeda CNS. vektor može sadržavati regulacijske elemente koji su funkcionalni u stanici koji mogu vršiti ekspresiju inhibitora ili IL-18. takve regulacijske sekvencije ili elementi mogu primjerice biti promotori ili pojačivači. Regulacijska sekvencija može se zatim unijeti u pravi lokus genoma pomoću homologne rekombinacije, tako da se operativno povežu regulacijska sekvencija s genom, a njegovu ekspresiju treba izazvati ili pojačati. Ova tehnologija se obično naziva “endogeno aktiviranje gena” (EGA), te je primjerice opisano u WO 91/09955.

Osoba koja poznaje ovo područje zna da je također moguće prigušiti IL-18 ekspresiju izravno, bez korištenja inhibitora IL-18, istom tehnikom. Da se to učini, negativni regulacijski element, kao što je npr. nijemi element, može se unijeti u genski lokus IL-18, što vodi do podreguliranja ili prevencije IL-18 ekspresije. osoba koja poznaje ovo područje zna da takvo podreguliranje ili prigušenje IL-18 ekspresije ima isti učinak kao upotreba IL-18 inhibitora da bi se spriječila i/ili tretirala bolest.

Izum se nadalje odnosi na uporabu stanice koja može biti genetski modificirana da se dobije inhibitor IL-18 za proizvodnju medikamenta za tretiranje i/ili prevenciju ozljeda CNS.

Ovaj izum se nadalje odnosi na farmaceutske smjese, koje su osobito korisne za prevenciju i/ili tretiranje upalnih ozljeda CNS, koje sadrže terapijski učinkovitu količinu inhibitora IL-18 i/li terapinski učinkovitu količinu interferona i/ili farmaceutski učinkovitu količinu TNF i/ili farmaceutski učinkovitu količinu protivupalnog sredstva i/ili farmaceutski učinkovitu koiličinu antioksidacijskog sredstva.

Kao inhibitor IL-18, smjesa može sadržavati inhibitore kaspase-1, antitijela protiv IL-18, antitijela protiv bilo koje IL-18 receptorske podjedinice, inhibitore IL-18 signalnog puta, antagoniste IL-18 koji kompetiraju s IL-18 i blokiraju IL-18 receptor, te IL-18 vezujuće proteine, izoforme, muteine, sjedinjene proteine, funkcionalne derivate, aktivne frakcije ili njegove cirkularno permutirane derivate koji su identične aktivnosti.

Interferon koji se nalazi u farmaceutskoj smjesi je poželjno IFN-beta ili IFN-alfa.

U sljedećoj poželjnoj realizaciji, farmaceutska smjesa sadrži terapijski učinkovite količine TNF alfa. Farmaceutska smjesa sukladno ovom izumu može također sadržavati jedan ili više COX-inhibitora.

Definicija “farmaceutski prihvatljiv” obuhvaća bilo koji nosač, koji ne interferira s učinkovitošću biološke aktivnosti aktivnog sastojka te koji nije otrovan za domaćina kojem se primjenjuje. Primjerice, aktivni proteini mogu biti formulirani kao jedinični dozirajući oblik za injiciranje u nosačima kao što je fiziološka otopina, otopina dekstroze, serumski albumin i Ringerova otopina.

Aktivni sastojci sukladno ovom izumu mogu se primijeniti nekoj osobi na mnogo načina. Putevi primjene uključuju intradermalni, transdermalni (npr. formulacije sa sporim otpuštanjem), intramuskularni, intraperitonealni, supkutani, oralni, intrakranijalni, epiduralni, rektalni, topički i intranazalni put. Može se koristiti bilo koji drugi terapijski učinkovit put primjene, primjerice apsorpcija kroz epitelna ili edotelna tkiva ili pomoću genske terapije pri čemu se DNA molekula koja kodira aktivno sredstvo primjenjuje bolesniku (npr. pomoću vektora), što izaziva ekspresiju aktivnog sredstva i njegovo izlučivanje in vivo. Nadalje, proteini se sukladno ovom izumu mogu primijeniti zajedno s drugim komponentama biološki aktivnih sredstava kao što su površinski aktivne farmaceutski prihvatljive tvari, ekscipijenti, nosači i razrjeđivači.

Za parenteralnu (npr. intravensku, supkutanu, intramuskularnu) primjenu, aktivni proteini mogu biti formulirani kao otopina, suspenzija, emulzija ili liofilizirani prah u sprezi s farmaceutski prihvatljivim matičnim nosačem (npr. voda, fiziološka otopina, otopina dekstroze) ili aditivima koji jamče izotoničnost (npr. manitol) ili kemijsku stabilnost (npr. konzervansi i puferi). Formulacija je sterilizirana standardno korištenim tehnikama.

Biološka raspoloživost aktivnih proteina sukladno ovom izumu može se usmjeriti korištenjem postupaka konjugiranja koji produžuju poluživot molekule u ljudskom tijelu, primjerice vezanjem molekule za polietilenglikol, kao što je opisano u PCT patentnoj prijavi WO 92/13095.

Terapijski učinkovita količina aktivnih prteina bit će funkcija mnogo promjenjivica, uključujući tip antagonsita, afinitet antagonista za IL-18, bilo kakvoj rezidualnoj citotoksičnoj aktivnosti koju pokazuju antagonisti, načinu primjene, kliničkom stanju bolesnika (uključujući poželjnost zadržavanja netoksične razine aktivnosti endogenog IL-18).

“Terapijski učinkovita količina” je ona količina koja nakon primjene dovodi da IL-18 inhibitor vrši inhibiranje biološke aktivnosti IL-18. Primijenjena doza, kao jednostruka ili višestruka doza, za pojedinca ovisi o mnogim čimbenicima, uključujući farmakinetička svojstva IL-18 inhibitora, način primjene, stanje bolesnika i njegova svojstva (spol, starost, tjelesna težina, stanje zdravlja, veličina), opseg simptoma, konkurentne tretmane, frekvenciju tretmana i željeni učinak. Određivanje i rukovanje utvrđenom dozom je unutar sposobnosti osobe koja poznaje ovo područje, kao i in vitro i in vivo metoda za određivanje inhibiranja IL-18 u neke osobe.

Sukladno ovom izumu, inhibitor IL-18 koristi se u količini od oko 0,0001 do 100 mg/kg ili oko 0,01 do 10 mg/kg tjelesne težine, ili oko 0,1 do 5 mg/kg tjelesne težine ili oko 1 do 3 mg/kg tjelesne težine ili oko 1 do 2 mg/kg tjelesne težine. Alternativno, IL-18 inhibitori mogu se primijeniti u količinama od oko 0,1 do 1000 μg/kg tjelesne težine ili od oko 1 do 100 μg/kg tjelesne težine ili od oko 10 do 50 μg/kg tjelesne težine.

Način primjene, koji je preferiran sukladno ovom izumu, je supkutana primjena. Instramuskularna primjena je dalje preferirana sukladno ovom izumu. da bismo primijenili IL-18 inhibitor izravno na mjesto njegova djelovanja, također je poželjno primijeniti ga intrakranijalnim ili intratekalnim putem. Intrakranijalni put primjene je osobito poželjan u kombinaciji s otvorenom ozljedom glave (prostrijelna ozljeda mozga).

U drugim poželjnim realizacijama, inhibitor IL-18 primjenjuje se dnevno ili svaki drugi dan.

Dnevne doze se obično daju kao podijeljene doze ili kao oblik s produženim otpuštanjem da bi se dobili željeni rezultati. Druga primjena ili kasnije primjene mogu se izvršiti s doziranjem koje je identično, manje ili veće od početne ili prethodne doze koja je primijenjena određenoj osobi. Druga primjena ili kasnije primjene mogu se izvršiti tijekom pojave bolesti ili prije pojave bolesti.

Sukladno ovom izumu, IL-18 inhibitor može se primijeniti profilaktički ili terapijski prije, istovremeno ili nakon drugih terapijskih režima i sredstava (npr. režim više lijekova), u terapijski učinkovitoj količini, konkretno s interferonom i/ili TNF i/ili drugim protivupalnim sredstvom, kao što je COX inhibitor i/ili antioksidans. Ovisno o oštećenju mozga, ko-primjena TNF-antagonista umjesto samog TNF može se također primijeniti (Shohami et al., 1999). Aktivna sredstva koja se primjenjuju s drugim terapijskim sredstvima mogu se primijeniti u istim ili različitim smjesama.

Ovaj izum odnosi se na metodu za priređivanje farmaceutske smjese koja obuhvaća miješanje učinkovite količine IL-18 inhibitora i/ili interferona i/ili TNF antagonista i/ili COX inhibitora s farmaceutski prihvatljivim nosačem.

Izum se nadalje odnosi na metodu tretiranja ozljede CNS, što obuhvaća primjenu farmaceutski učinkovite količine IL-18 inhibitora bolesniku kojemu je to potrebno.

Sve reference koje su ovdje citirane, uključujući časopise ili sažetke, publicirane ili nepublicirane američke ili strane patentne prijave, prijavljene američke ili strane patente ili bilo koje druge reference, su u cijelosti ovdje uključeni kao referenca, uključujući sve podatke, tablice, slike i tekst koji se nalazi u citiranim referencama. Nadalje, cjelokupni sadržaj referenci koje su citirane u ovdje citiranih referencama je također uključen referencom.

Reference na poznate metode, standardne metodske stupnjeve, poznate metode ili standardne metode ni na koji način nije dopuštenje da je neki aspekt, opis ili realizacija ovog izuma opisan, zamišljen ili sugeriran u relevantnoj tehnici.

Sljedeći opis specifičnih realizacija će u potpunosti rasvijetliti opću prirodu izuma tako da drugi mogu, primjenom znanja koje je unutar tehničkog znanja (uključujući sadržaja referenci koje su ovdje navedene), lako modificirati i/ili prilagoditi za različite primjene takve specifične realizacije, nez nepotrebnog eksperimentiranja, bez udaljavanja od opće koncepcije ovog izuma. dakle, takve prilagobe i modifikacije su predviđene da budu unutar značenja raspona ekvivalenata prikazanih realizacija, temeljem učenja i vodiča koji su ovdje navedeni. Podrazumijeva se da je frazeologija ili terminologija koja je ovdje dana samo u svrhu opisa a ne ograničenja, tako da frazeologiju ili terminologiju koja je ovdje korištena valja interpretirati od strane osobe s iskustvom u svjetlu učenja i vodiča koji su ovdje navedeni, u kombinaciji sa znanjem osobe s prosječnim tehničkim znanjem.

Pošto smo sada opisali izum, on će se bolje razumjeti sukladno referencama na sljedeće primjeri koji su ovdje dani kao ilustracija i ni na koji način ne ograničuju ovaj izum.

Primjeri

Materijali i metode

Model traume

Miševi koji su korišteni za ovo istraživanje bili su mužjaci starosti 8-16 tjedana i težine 30-35 g. Oni su rasli u specifičnom okruženju bez patogenih organizama, držani su u standardnim uvjetima temperature i svjetla u kavezima s 4-6 životinja, te su hranjeni hranom i vodom ad libitum. Istraživanje je provedeno sukladno naputcima od strane Institutional Animal Care Committee pri Hebrew University of Jerusalem, Izrael. Eksperimentalni CHI izvršen je pomoću uređaja s ispuštenim utegom koji je prethodno razvijen (Chen et al. 1996). Ukratko, nakon eterske anestezije, izvršena je srednja uzdužna incizija, koža je uklonjena i otvorena je lubanja. Identificirano je prednje anteriorno frontalno područje i srednju koronalnu ravninu postavljen je teflonski stožac ~1mm lateralno prema od središnje linije. Glava je učvršćena i uteg težine 75 g ispušten je na stožac s visine 18 cm, što je rezultiralo fokalnim oštećenjem lijeve hemisfere. Nakon traume, miševi su podvrgnuti oksigeniranju sa 100% O2 ne duže od 2 minute, a zatim su vraćeni natrag u svoje kaveze.

Procjena razine IL-18 u mišjem mozgu

Za kvantificiranje intrakranijalne razine IL-18, miševi C57BL/6 (B6) soja (ukupno n=62) raspoređeni su u šest odvojenih skupina: (1) ”normalne kontrole”; netretirani B6 miševi (n=10). (2) ”eterom anestezirani”; miševi su anestezirani eterom tijekom 10 minuta i usmrćeni nakon 24 h (n=10) ili 7 dana (n=10). (3) ”sham operacija”; ovi miševi su podvrgnuti anesteziji i uzdužnoj inciziji lubanje te su žrtvovani nakon 24 h (n=15) ili 7 dana. (4) ”traumska skupina”; eksperimentalni CHI je proveden kao što je prije opisano, te su životinje usmrćene u terskoj anesteziji nakon 4 h (n=7), 24 h (n=7), te 7 dana (n=7) poslije traume. (5) ”TNF injekcija”; za procjenu moguće uloge TNF u reguliranju intracerebralnog IL-18, miševi su anestezirani eterom, injicirani intra-cerebralno-ventrikularno (i.c.v.) s 200 ng mišjeg rekombinantnog TNF (R&D Systems, Abingdon, UK) u 10 μl sterilne fosfatno-puferirane fiziološke otopine (PBS) te su žrtvovani nakon 24 h (n=10). (6) ”mock injekcija”; ove životinje su injicirane i.c.v. samo s nosačem (10 μl sterilni PBS) te su žrtvovane nakon 24 h (n=6), kao kontrolna skupina za TNF-injicirane životinje. U svih miševa, mozak je odmah uklonjen nakon usmrćivanja, duboko zamrznut u tekućem dušiku i pohranjen na–70oC do analize. Bozak traumske skupine je podijeljen na lijevu (ipsilateralnu) i desnu (kontralateralnu) hemisferu, da bi se omogućilo uspoređivanje razina IL-18 između hemisfere s ozljedom i bez nje. Homogeniziranje tkiva je izvršeno s Polytron (Kinematica, Kriens, Switzerland) korištenjem razrijeđenja od 1:4 u ledeno hladnom ekstrakcijskom puferu (W/W) koji sadrži Tris 50 mM (pH 7,2), NaCl 150 mM, Triton-X-100 1% (Boehringer Mannheim, Rotkreuz, Switzerland), te koktel proteaznog inhibitora (Boehringer Mannheim). Homogenat je potresivan na ledu tijekom 90 min i centrifugiran 15 min na 3000 g i 4°C. Iz supernatanta je odvojen alikvot i zamrznut na–70oC do analize. Koncentracije ukupnih proteina u ekstraktu mozga mjerene su Bradford analizom (Bio Rad Laboratories, Munich, Germany) i nađeno je da su vrlo konstantne u svih ispitanih miševa (12,1±2,1 mg/ml; prosjek±SD). Kvantificiranje razina citokina u mozgu izvršeno je pomoću ELISA specifične na mišji IL-18, sukladno uputama proizvođača (R&D Systems, Abingdon, UK). Osjetljivost analize bila je 5 pg/ml. Za uspoređivanje razina IL-18 u mozgu između različitih skupina životinja, svim koncentracijama koje su bile niže od granice detekcije od 5 pg/ml dodijeljena je vrijednost od 4,9 pg/ml. Svi uzorci su analizirani nerazrijeđeni u duplikatu i konačna koncentracija je izračunata kao prosjek OD uzoraka u duplikatu. OD je određena spektrofotometrijski (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA) uz ekstinkcijsku valnu duljinu od 405 nm.

Protokol tretiranja s IL-18BP

Muški Sabra miševi soja Hebrew University (n=40) korišteni su za IL-18BP istraživanja. Anestezija i eksperimentalni CHI su načinjeni kao što je gore opisano.

Za protokol tretmana, životinje su podijeljene u dvije skupine: u skupini A (”kontrolna skupina”, n=16), miševi su podvrgnuti eksperimentalnom CHI, injicirani su samo nosačem (PBS) nakon jedan sat, te su praćeni 7 dana za neurološku procjenu (vidi niže). U skupini B (”ispitivana skupina”, n=18), miševi su injicirani i.p. s 50 μg IL-18BP neposredno nakon određivanja neurološkog indeksa za t=1h nakon CHI. Budući da je propusnost barijere krv-mozak povećana 5-6 puta između 1-4 h nakon CHI, kao što je prethodno određeno u istom eksperimentalnom modelu (Chen et al. 1996), IL-18BP je dostupan mozgu u ovim uvjetima. Dvije dodatne skupine miševa su tretirane sukladno skupinama A i C (skupina C: ”kontrolna skupina”; group D: ”ispitivana skupina”) te su žrtvovane nakon 48 h, nakon čega je izvršena disekcija mozga za procjenu posttraumatskog edema, kao što je niže opisano.

Procjena neurološkog oštećenja

Za procjenu posttraumskog neurološkog oštećenja, prethodno je razvijen i ispitan indeks neurološkog statusa (NSS) (Stahel et al., 2000).

Ovaj indeks sastoji se od 10 pojedinačnih kliničkih zadaća u svezi s motoralertnošću, te fiziološkim ponašanjem, pri čemu se jedan bod daje za izostanak, a nula bodova za uspješnost (tablica 4). Maksimalni NSS od 10 bodova označuje uznapredovalnu neurološku disfunkciju, uz izostanak svih funkcija, dok indeks nula odgovara potpuno zdravim, neozlijeđenim miševima NSS za vrijeme 1 sat nakon traume odražava početni doseg ozljede i u visokoj je korelaciji s kliničkim stanjem (Beni-Adani et al. 2001). Procjena uspješnosti je izvršena pomoću dva ispitivača koji su bili slijepi na ispitivanu skupinu u vremenskim intervalima 1 h, 24 h, 72 h, te 7 dana nakon eksperimentalnog CHI. ΔNSS, izračunat kao razlika između NSS za t=1 h i NSS u kasnijoj vremenskoj točki, je parametar koji odražava stupanj spontanog oporavka nakon ozljede mozga, kao što je prije opisano (Chen et al. 1996).

Tablica 4: Indeks neurološkog statusa (NSS) za miševe s ozljedom glave.

[image]

Procjena edema mozga

Opseg moždanog edema procijenjen je određivanjem sadržaja vode u tkivu u ozlijeđenog hemisferi, kao što je prethodno opisano (Chen et al. 1996). Ukratko, miševi su anestezirani kao što je prije opisano 48h nakon traume, što odgovara vremenskoj točki u kojoj je edem još uvijek značajan model sustava (Chen et al. 1996). Nakon usmrćenja, cerebellum i mali mozak su uklonjeni i priređen je segment kore ~20 mg, iz područja koje granični s mjestom traume i iz kontralateralne hemisfere. Desna (neozlijeđena) hemisfera korištena je kao interna kontrola. Odsječci tkiva su izvagani i sušeni tijekom 24h na 95oC. nakon vaganja “suhih” dijelova, udio vode u mozgu je izračunat na sljedeći način:

%H2O = [(težina vlažnog uzorka – težina suhog uzorka) × 100] / težina vlažnog uzorka.

Bolesnici s ozljedom mozga

Deset bolesnika s uznapredovalim CHI (prosječna starost ± SD: 37 ± 10 godina; raspon 24-57 godina; 9 muškaraca i jedna žena), koji su pristupili na Trauma Division of the University Hospital Zurich, uključeni su u ovom istraživanje. Svi bolesnici imali su Glasgow indeks skale kome (GCS) ≤ 8 nakon kardijalno-pulmonalne resuscitacije (Teasdale i Jennett, 1974). nakon što je načinjen CT sken, svi bolesnici primili su intraventrikularni kateter za terapijsku drenažu CSF kada je intrakranijalni tlak (ICP) premašio 15 mm Hg. Nijedan bolesnik nije tretiran steroidima. Bolesnici s višestrukim ozljedama zahtijevali su intervencije za konkomitantne torakalne, abdominalne, zdjelične ozljede, ozljede kralježnice ili frakture dugačkih kostiju, bili su isključeni iz istraživanja. Pojedinačni status procijenjen je Glasgow skalom dosega (GOS) (Jennett i Bond, 1975). Protokol za sakupljanje CSF i seruma potvrđen je kod Ethics Board Committee pri University Hospital, Zurich.

Sakupljanje uzoraka i analiza IL-18

CSF i odgovarajući serumski uzorci CHI bolesnika (n=10) sakupljani su dnevno u određenim vremenskim točkama. Kontrolni CSF sakupljen je od bolesnika koji su podvrgnuti dijagnostičkom spinalnom kateteru (n=5). Ovi bolesnici nisu imali znakove upalne CNS bolesti, temeljem normalnih CSF vrijednosti proteina, glukoze i staničnog broja (podaci nisu prikazani). U CHI skupini, skupljanje uzorka je izvršeno 10 dana nakon traume, osim ako ventrikularni kateter nije uklonjen ranije, npr. u slučajevima kada je ICP ostao u normalnom rasponu (≤ 15 mmHg) više od 24 sata. Sakupljeno je ukupno 106 sparenih uzoraka CSF i seruma u traumatiziranih bolesnika koji su obrađeni ovim istraživanjem. Svi uzorci su odmah centrifugirani nakon sakupljanja, alikvot je odvojen i zamrznut na -70oC do analize. Kvantificiranje razina IL-18 u CSF i serumu izvršena je pomoću ELISA specifične na humani IL-18 korištenjem komercijalno dostupnog pribora (R&D Systems, Abingdon, UK). Kao i u slučaju mišje analize, osjetljivost ELISA bila je 5 pg/ml, a konačna koncentracija IL-18 izračunata je iz prosječnog OD koji je određen u duplikatnim uzorcima uz valnu duljinu ekstinkcije 405 nm. Da bi se usporedile razine IL-18 CSF između CHI bolesnika i kontrola, svim koncentracijama ispod granice detekcije od 5 pg/ml dodijeljena je vrijednost 4,9 pg/ml.

Analiza podataka

Statistička analiza izvršena je pomoću komercijalno dostupnog softvera (SPSS 9.0 za Windows™). Za analizu podataka koji nisu normalno raspodijeljeni, kao što su neurološki indeksi (NSS i ΔNSS), korišten je neparametrijski Mann-Whitney-ev U-test. Nespareni Studentov t-test korišten je za uspoređivanje intracerebralnih koncentracija IL-18 za različite skupine miševa te za analizu razlika sadržava vode u mozgu za IL-18BP-tretirane miševe u odnosu na miševe koji su injicirani s nosačem. Uspoređivanje humanih razina IL-18, bilo za dnevni CSF u odnosu na odgovarajuće uzorke seruma u CHI bolesnika, ili pri traumi u odnosu na kontrolni CSF, izvršeno je korištenjem općeg linearnog modela za ponovljene mjere ANOVA. p-vrijednost < 0,05 uzeta je kao statistički značajna.

Rezultati

Primjer 1:

razine intracerebralnog IL-18 u miševa

Kao što je pokazano na slici 1, IL-18 je detektiran pomoću ELISA u moždanim homogenatima netretiranih (”normalnih”) kontrolnih miševa B6 soja (n=10), s prosječnom razinom 27,7±1,7 [± SEM] ng/ml. U kontrolnim skupinama, izazivanje eterske anestezije same ili u kombinaciji sa ”sham” operacijom (tj. eterska anestezija i uzdužna incizija lubanje) rezultirala je značajno povišenim intrakranijalnim razinama IL-18 od 48,9±1,1 ng/ml (”eterska” skupina, n=8) i 54,3±2,7 ng/ml (”sham” skupina, n=13) (p<0,01 vs. ”normalni” miševi, nespareni Studentov t-test; slika 1). razlika između “eterskih” i “sham”-tretiranih životinja nije bila statistički značajna (p=0,16).

U skupini s traumom (n=21), izazivanje CHI rezultiralo je povišenim razinama IL-18 u ozlijeđenoj i kontralateralnoj hemisferi unutar 4h (60,6±3,3, odnosno 59,8±5,0 ng/ml) do 24h (56,9±2,1, odnosno 56,3±3,7 ng/ml) nakon traume, međutim, razine nisu značajno više u odnosu na etersku ili “simuliranu” skupinu (p>0,05).

Za razliku od toga, 7 dana nakon CHI, detektirano je značajno povišenje intracerebralne koncentracije IL-18 u ozlijeđenoj hemisferi, u odnosu na eter-anestezirane ili simulirano-operirane životinje (67,6±5,1 ng/ml vs. 42,2±0,8, odnosno 45,2±0,5 ng/ml; p<0,01), dok razine IL-18 u kontralateralnoj hemisferi nisu bile značajno povišene iznad onih za ove dvije kontrolne skupine (63,2±6,0 ng/ml; p=0,06).

Da bismo procijenili ulogu TNF, glavnog medijatora upale u ovom modelu traume (Shohami et al. 1999), u svezi s reguliranjem razine intracerebralnog IL-18, daljnja skupina B6 miševa (n=10) injicirana je i.c.v. s 200 ng mišjeg rekombinantnog TNF u 10 μl sterilog PBS te je žrtvovana nakon 24h. Kao što je prikazano na slici 1, ”mock” injekcija samo s nosačem (n=6) rezultirala je značajnim doreguliranjem intracerebralnog IL-18 unutar 24h, u odnosu na netretirane normalne B6 miševe (53,6±3,9 vs. 27,7±1,7 ng/ml; p<0,001).

Injekcija TNF izazvala je značajno smanjenje razina IL-18 u intrakranijalnom prostoru unutar 24h (22,1±6,9 ng/ml; n=10), u odnosu na “mock”-injiciranu kontrolnu skupinu za 24h (53,6±3,9 ng/ml; p<0,001). Razine IL-18 u “TNF skupini” bile su čak niže od onih u netretiranih normalnih miševa (27,7±1,7 ng/ml), premda u ovom slučaju ta razlika nije statistički značajna (p=0,45).

Primjer 2:

Učinak IL-18BP tretmana na neurološki oporavak nakon traume

Da bismo istražili hipotezu kako inhibiranje IL-18 može olakšati oporavak pri ozljedi mozga, uspoređene su različite vremenske točke nakon jedne injekcije IL-18BP. Prethodno je pokazano da indeks neurološke uznapredovalosti (NSS) 1 sat nakon ozljede odražava najtočnije raspon traume i korelira s volumenom oštećenog tkiva što se može vidjeti iz MRI i histološki.

Da bismo dobili skupine životinja s usporedivom traumom, miševi su dodijeljeni različitim tretiranim skupinama i njihov početni NSS je određen za t=1h. Kao što je pokazano na slici 2 (NSS u IL-18BP (kvadrati) vs. kontrolni (kružići)), obje skupine imale su slični početni NSS(1h) (7,69±0,3023 i 7,44±0,3627 za kontrole, odnosno IL-18BP) što ukazuje na usporedivu uznapredovalost ozljede.

Ispitivanje NSS u kasnijim vremenima (1-7 dana) pokazuje da životinje koje su tretirane intraperitonealno (i.p.) s IL-18BP pokazuju razmjerno slabije neurološko oštećenje, što je očito prema NSS vrijednostima, koje dosiže značajnost nakon 7 dana nakon traume (p=0,045).

Izračunata je brzina oporavka, izražena kao ΔNSS (t) = NSS (1h) – NSS (t). Veća vrijednost ΔNSS odražava bolji oporavak dok vrijednost nula ili negativna vrijednost ΔNSS odražavaju činjenicu da nema oporavka ili je došlo do pogoršanja. Slika 3 prikazuje vrijednosti ΔNSS dviju skupina. Za dvije vrijednosti vremena, za 24h i za 7d, razlika između prosječnih ΔNSS vrijednosti dosegla je značajnost.

Sljedeći eksperiment je izvršen da se ispita može li biti učinkovit tretman s IL-18BP, koji je dan 3 dana nakon ozljede. Vrijeme kada se počinje tretmanom je kritično, jer je do sada bilo pokazano da je terapija učinkovita ako se daje unutar nekoliko sati. Budući da je nađeno da sam IL-18 raste 7d nakon traume, a tretman s IL-18BP koji je dan 1 sat nakon traume dovodi do najvećeg učinka također na 7. dan, odlučeno je da se tretiraju miševi 3 dana nakon ozljede. Za usporedbu, druga skupina je tretirana nakon 1 sat i nakon 3 dana nakon ozljede. za usporedbu, druga skupina je tretirana s IL-18BP nakon 1 sat i nakon 3 dana. Kontrolna skupina tretirana je samo otapalom (nosač).

Rezultati ovog eksperimenta prikazani su na slici 4, iz koje je jasno da je tretman koji je dan nakon 3 dana jednako učinkovit kao onaj koji je dan jedan sat nakon CHI i opet nakon 3 dana.

Ovaj eksperiment pokazuje dramatični pozitivan učinak nakon jednokratne primjene IL-18BP, koja je učinjena bilo nakon 1 h ili 3 dana nakon zatvorene ozljede glave, na oporavak od traumatske ozljede glave u eksperimentalnom mišjem modelu.

Primjer 3:

Povišene razine IL-18 u humanom likvoru nakon ozljede mozga

Razine IL-18 su određene u dnevnom likvoru i u uzorcima seruma 10 bolesnika s uznapredovalim CHI sve do 10 dana nakon traume. Demografski i klinički podaci bolesnika prikazani su u tablici 5.

Tablica 5: Demografski i klinički podaci o bolesnicima s uznapredovalim CHIa

[image]

aCHI, zatvorena ozljeda glave

bGCS, Glasgow indeks kome (Teasdale i Jennett, 1974).

cGOS = Glasgow indeks posljedica 3 mjeseca nakon ozljede; 5 = asimptomatski, 4 = umjereno oštećenje, 3 = znatno oštećenje, 2 = perzistentno vegetativno stanje, 1 = smrt (Jennett i Bond, 1975).

dCSF = likvor.

eIL-18 razine ispod granice detektiranja od 5 pg/ml su označene kao vrijednosti od 4,9 pg/ml.

Kao što je prikazano u tablici 5, razine intratekalnog IL-18 bile su značajno povišene u 9/10 CHI bolesnika, u odnosu na kontrolni likvor 5 bolesnika bez traume ili upalne neurološke bolesti (p<0,05; ponovljene mjere ANOVA). Samo jedan bolesnik (#10) imao je IL-18 razine likvora koje nisu bile značajno povišene u odnosu na kontrolni likvor (p=0,31). Razine medijana i pojedinačni rasponi IL-18 u likvoru i serumu prikazani su u tablici 5.

Valja naglasiti, najveće koncentracije IL-18 u CSF (966 ng/ml) bile su do 200 puta veće u bolesnika s traumatskom ozljedom glave nego u kontrola. Intracerebralni IL-18 detektiran je pomoću ELISA u 90% svih uzoraka CSF u traumatskoj skupini, dok je svega 40% kontrolnih uzoraka CSF imalo detektibilne razine IL-18 (tj. > 4,9 ng/ml). U 8/10 CHI bolesnika, medijan koncentracija IL-18 bio je značajno viši u CSF nego u serumu (p<0,05; ponovljene mjere ANOVA). Međutim, u dva bolesnika (#9,10) medijan razina IL-18 u serumu premašuje odgovarajuće koncentracije u likvoru, kao što je pokazano u tablici 5.

Ovi rezultati pokazuju da su razine IL-18 u likvoru bolesnika s traumatskom ozljedom glave značajno povišene. Dodatkom IL-18BP mogu se značajno smanjiti ove povišene razine, što može imati pozitivan učinak na oporavak od zatvorene ozljede glave, kao što je prikazano o gore navedenom primjeru 2.

Claims (14)

1. Uporaba IL-18 inhibitora pri čemu IL-18 inhibitor je IL-18 vezujući protein (IL-18 BP) naznačena time da je za proizvodnju lijeka za liječenje traumatske ozljede mozga (zatvorene ozljede glave), pri čemu se IL-18 BP daje u jednoj dozi 3 dana nakon ozljede.

2. Uporaba prema zahtjevu 1, naznačena time da je IL-18 vezujući protein glikoziliran na jednom ili više mjesta.

3. Uporaba prema zahtjevu 1, naznačena time da je IL-1 8 BP sjedinjen na cijeli ili na dio imunoglobulina (Ig).

4. Uporaba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time da medikament također sadrži interferon.

5. Uporaba prema zahtjevu 4, naznačena time da interferon je interferon-α ili interferon-β.

6. Uporaba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time da medikament također sadrži faktor tumorske nekroze (TNF).

7. Uporaba prema zahtjevu 6, naznačena time da TNF je TNF alfa.

8. Uporaba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time da medikament također sadrži protiv upalno sredstvo.

9. Uporaba prema zahtjevu 8, naznačena time da protiv upalno sredstvo je COX-inhibitor, naročito COX-2 inhibitor.

10. Uporaba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time da medikament također sadrži antioksidans.

11. Uporaba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time da se inhibitor IL-18 koristi u količini od oko 0.001 do 100 mg/kg tjelesne težine, ili oko 0.01 to 10 mg/kg tjelesne težine ili oko 0.1 do 5 mg/kg tjelesne težine ili oko 1 do 3 mg/kg tjelesne težine.

12. Uporaba prema bilo kojem od prethodnih zahtjeva, naznačena time da se IL-18 inhibitor primjenjuje potkožno. Reference 1. Altschul S F et al, J Mol Biol, 215, 403-410, 1990, Altschul S F et al, Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997 2. Chater, K. F. et al., in "Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology", Akademiai Kaido, Budapest, Hungary (1986), pp. 45-54). 3. Chen, Y., S. Constantini, V. Trembovler, M. Weinstock, and E. Shohami. 1996. An experimental model of closed head injury in mice: pathophysiology, histopathology, and cognitive deficits. J. Neurotrauma 13:557-68 4. Conti, C.B., N.Y. Calingasan, Y. Kim, H. kim, Y. Bae, E. Gibson, and T.H. Joh. 1999. Cultures of astrocytes and microglia express interleukin-18. Mol. Brain Res. 67:46-52 5. Conti, B., J. W. Jahng, C. Tinti, J. H. Son, and T. H. Joh. 1997. Induction of interferon-gamma inducing factor in the adrenal cortex. J. Biol. Chem. 272:2035-2037. 6. Culhane, A.C, M.D. Hall, N.J. Rothwell, and G.N. Luheshi. 1998. Cloning of rat brain interleukin-18 cDNA. Mol. Psychiatry 3:362-6 a. Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984. 7. DiDonato, J A, Hayakawa, M, Rothwarf, D M, Zandi, E and Karin, M. (1997), Nature 388, 16514-16517. 8. Elliott, M.J., Maini, R.N., Feldmann, M., Long-Fox, A., Charles, P., Bijl, H., and Woody, J.N., 1994, Lancet 344, 1125-1127. 9. Fassbender, K., O. Mielke, T. Bertsch, F. Muehlhauser, M. Hennerici, M. Kurimoto, and S. Rossol. 1999. Interferon-γ-inducing factor (IL-18) and interferon-γ in inflammatory CNS diseases. Neurology 53:1104-6 10. Jander, S., and G. Stoll. 1998. Differential induction of interleukin-12, interleukin-18, and interleukin-1β coverting enzyme mRNA in experimental autoimmune encephalomyelitis of the Lewis rat. J. Neuroimmunol. 91:93-9 11. Lancet 1975 Mar 1;1(7905):480-4. Jennett B, Bond M. 12. Izaki, K. (1978) Jpn. J. Bacteriol. 33:729-742).

13. Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinarello CA. Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97:1190-1195.

14. Kossmann, T., P.F. Stahel, P.M. Lenzlinger, H. Redl, R.W. Dubs, O. Trentz, G. Schlag, and M.C. Morganti-Kossmann. 1997. Interleukin-8 released into the cerebrospinal fluid after brain injury is associated with blood brain-barrier dysfunction and nerve growth factor production. J. Cereb. Blood Flow Metab. 17:280-9 15. Knight DM, Trinh H, Le J, Siegel S, Shealy D, McDonough M, Scallon B, Moore MA, Vilcek J, Daddona P, et al. Construction and initial characterization of a mouse-human chimeric anti-TNF antibody.Mol Immunol 1993 Nov 30:16 1443-53 16. Maliszewski, C. R., T. A. Sato, T. Vanden Bos, S. Waugh, S. K. Dower, J. Slack, M. P. Beckmann, and K. H. Grabstein. 1990. Cytokine receptors and B cell functions. I. Recombinant soluble receptors specifically inhibit IL-1- and IL-4-induced B cell activities in vitro. J. Immunol. 144:3028-3033. 17. Micallef, M. J., T. Ohtsuki, K. Kohno, F. Tanabe, S. Ushio, M. Namba, T. Tanimoto, K. Torigoe, M. Fujii, M. Ikeda, S. Fukuda, and M. Kurimoto. 1996. Interferon-gamma-inducing factor enhances T helper 1 cytokine production by stimulated human T cells: synergism with interleukin-12 for interferon-gamma production. Eur-J-Immunol 26:1647-51 issn: 0014-2980. 18. Morganti-Kossmann, M.C., P.M. Lenzlinger, V. Hans, P. Stahel, E. Csuka, E. Ammann, R. Stocker, O. Trentz, and T. Kossmann. 1997. Production of cytokines following brain injury: beneficial and deleterious for the damaged tissue. Mol. Psychiatry 2:133-6 19. Nakamura K, Okamura H, Wada M, Nagata K, Tamura T. Infect Immun 1989 Feb;57(2):590-5 20. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, and Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136. 21. Okamura H, Nagata K, Komatsu T, Tanimoto T, Nukata Y, Tanabe F, Akita K, Torigoe K, Okura T, Fukuda S, et al. Infect Immun 1995 Oct;63(10):3966-72 22. Parnet, P, Garka, K E, Bonnert, T P, Dower, S K, and Sims, J E. (1996), J. Biol. Chem. 271, 3967-3970. a. Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990 b. Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448,1988 23. Prinz, M., and U.K. Hanisch. 1999. Murine microglial cells produce and respond to interleukin-18. J. Neurochem. 72:2215-8 24. J Clin Invest 1997 Feb 1;99(3):469-74 Rothe H, Jenkins NA, Copeland NG, Kolb H. 25. Scherbel, U., R. Raghupathi, M. Nakamura, K.E. Saatman, J.Q. Trojanowski, E. Neugebauer, M.W. Marino, and T.K. McIntosh. 1999. Differential acute and chronic responses of tumor necrosis factor-deficient mice to experimental brain injury. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8721-6 26. Shohami, E., I. Ginis, and J.M. Hallenbeck. 1999. Dual role of tumor necrosis factor alpha in brain injury. Cytokine Growth Factor Rev. 10:119-30 27. Shohami, E; Beit-Yannai E., Horowitz M; Kohen R (1997): J. Cereb. Blood Flow Metab. 17, 1007-1019. 28. Teasdale G, Jennett B. Lancet 1974 Jul 13;2(7872):81-4 29. Stahel PF, Shohami E, Younis FM, Kariya K, Otto VI, Lenzlinger PM, Grosjean MB, Eugster HP, Trentz O, Kossmann T, Morganti-Kossmann MC.J Cereb Blood Flow Metab 2000 Feb;20(2):369-80 30. Ushio S, Namba M, Okura T, Hattori K, Nukada Y, Akita K, Tanabe F, Konishi K, Micallef M, Fujii M, Torigoe K, Tanimoto T, Fukuda S, Ikeda M, Okamura H, Kurimoto M. J Immunol 1996 Jun 1;156(11):4274-9 31. Wheeler, R.D., A.C. Culhane, M.D. Hall, S. Pickering-Brown, N.J. Rothwell, and G.N. Luheshi. 2000. Detection of the interleukin-18 family in rat brain by RT-PCR. Mol. Brain Res. 77:290-3 32. Whalen, M.J., T.M. Carlos, P.M. Kochanek, S.R. Wisniewski, M.J. Bell, R.S. Clark, S.T. DeKosky, D.W. Marion, and P.D. Adelson. 2000. Interleukin-8 is increased in cerebrospinal fluid of children with severe head injury. Crit. Care Med. 28:929-34 Yoshimoto T, Takeda, K, Tanaka, T, Ohkusu, K, Kashiwamura, S, Okamura, H, Akira, S and Nakanishi, K (1998), J. Immunol. 161, 3400-3407.