ES2314191T3 - Uso de inhibidores de il-18 para el tratamiento y/o prevencion de enfermedades vasculares perifericas. - Google Patents
Uso de inhibidores de il-18 para el tratamiento y/o prevencion de enfermedades vasculares perifericas. Download PDFInfo
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Abstract
El uso de un inhibidor de IL-18 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad vascular periférica de las extremidades, en el que el inhibidor de IL-18 se selecciona de un inhibidor de la caspasa-1 (ICE), un anticuerpo contra IL-18, un anticuerpo contra cualquiera de las subunidades del receptor de IL-18, y una proteína de unión a IL-18, o una isoforma, muteína, proteína condensada o derivado funcional de una proteína de unión a IL-18 que inhiba la actividad biológica de IL-18, comprendiendo la muteína una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras, comprendiendo la proteína condensada una inmunoglobulina de fusión, y estando el derivado funcional PEGilado.
Description
Uso de inhibidores de IL-18 para
el tratamiento y/o prevención de enfermedades vasculares
periféricas.
La presente invención pertenece al campo de las
enfermedades vasculares. Más en concreto, se refiere al uso de un
inhibidor de la IL-18 para el tratamiento y/o
prevención de enfermedades vasculares periféricas. La invención se
refiere también al uso de un inhibidor de la IL-18
para la prevención de la amputación.
La citoquina interleuquina 18
(IL-18) fue descrita inicialmente como un factor
inductor de interferón-\gamma
(IFN-\gamma) (Nakamura et al., 1989). Es
una señal temprana en el desarrollo de las respuestas de linfocitos
T de tipo celular auxiliar 1 (TH1). La IL-18 actúa
junto con la IL-12, IL-2, antígenos,
mitógenos y, probablemente, otros factores, para inducir la
producción de IFN-\gamma. La IL-18
también potencia la producción de GM-CSF y de
IL-2, aumenta la proliferación de linfocitos de
células T inducida por anti-CD3 e incrementa la
destrucción mediada por Fas de los linfocitos citolíticos.
La IL-18 madura es producida, a
partir de su precursor, mediante la enzima conversora de
IL-1\beta (ICE, caspasa-1).
El receptor de la IL-18 consiste
en al menos dos componente,
IL-18R-alfa e
IL-18R-beta, que cooperan en la
unión al ligando. Se han encontrado sitios de unión de alta y baja
afinidad por IL-18 en células T estimuladas con
IL-12 murinas (Yoshimoto et al., 1998), lo
cual sugiere un complejo de receptor de múltiples cadenas. Las dos
subunidades del receptor que se han identificado hasta la fecha
pertenecen ambas a la familia de receptores de IL-1
(Parnet et al., 1996; Kim et al., 2001). La
transducción de señales de IL-18 implica la
activación de NF-\kappaB (DiDonato et al.,
1997). El complejo del receptor de IL-18 consiste en
dos cadenas del receptor: una cadena de unión al ligando denominada
cadena IL-18R\alpha, y una cadena de transducción
de señales denominada cadena IL-18R\beta. La
cadena IL-18R-alfa se aisló
inicialmente como una proteína de la superficie celular que se une
a IL-18 marcada de modo radiactivo; la proteína se
purificó y su secuencia de aminoácidos reveló una coincidencia con
un receptor huérfano, previamente descrito, denominado proteína
relacionada con IL-1R (IL-1Rrp)
(Torigoe et al.,
1997).
1997).
En fechas recientes, se ha aislado una proteína
soluble que tiene una alta afinidad por IL-18 a
partir de orina humana, y se han clonado los ADNc de humano y de
ratón, así como el gen humano (Novick et al., 1999;
documento WO 99/09063). La proteína se ha denominado proteína de
unión a IL-18 (IL-18BP).
La IL-18BP no es el dominio
extracelular de uno de los receptores de IL18, sino que es una
proteína segregada que se encuentra en la circulación de forma
natural. Pertenece a una nueva familia de proteínas segregadas, que
incluye también varias proteínas codificadas por poxvirus (Novick
et al., 1999). La IL-18BP urinaria, así como
la recombinante, se une específicamente a IL-18 con
alta afinidad y modula la afinidad biológica de
IL-18.
El gen de IL-18BP se ha
localizado en el cromosoma humano 11q13, y no se ha descubierto
ningún exón que codifique un dominio transmembrana en una secuencia
genómica de 8,3 kb. Hasta el momento se han descubierto en el ser
humano cuatro variantes de corte y empalme o isoformas de la
IL-18BP generados mediante corte y empalme
alternativos del ARNm. Se han denominado IL-18BP a,
b, c y d, y todas comparten el mismo N-terminal y se
diferencian en el C-terminal (Novick et al.,
1999). Estas isoformas varían en su capacidad para unirse a la
IL-18. De las cuatro, se sabe que las isoformas
hlL-18BP a y c tienen una capacidad neutralizante
para la IL-18. La isoforma IL-18BP
humana se une a la IL-18 murina.
Los trastornos vasculares periféricos pueden ser
arteriales (oclusivos o funcionales), venosos, arteriovenosos
combinados (por ejemplo, una fístula arteriovenosa), o linfáticos.
La enfermedad arterial oclusiva incluyen la oclusión arterial
periférica y la enfermedad de Buerger, también denominada
tromboangitis obliterante. Los trastornos arteriales funcionales
pueden ser vasoespásticos (enfermedad y fenómeno de Raynaud,
acrocianosis) o vasodilatadores (eritromelalgia). Pueden aparecer
de forma secundaria a un fallo local en los vasos sanguíneos o a
trastornos en la actividad del sistema nervioso simpático, o pueden
acompañar a una enfermedad vascular orgánica. Las enfermedades
venosas incluyen la trombosis venosa y las venas varicosas, los
trastornos arteriovenosos combinados incluyen la fístula
arteriovenosa, y los trastornos linfáticos incluyen el linfedema y
el lipedema.
La oclusión arterial periférica se refiere a una
oclusión del suministro sanguíneo a las extremidades, en general
por placas ateroscleróticas (ateromas), un trombo, o un
embolismo.
La oclusión arterial periférica puede dar como
resultado una isquemia aguda o crónica. La isquemia aguda es
provocada por una placa arterioesclerótica proximal rota, por una
trombosis aguda sobre una enfermedad aterosclerótica preexistente,
por un embolismo desde el corazón, la aorta u otros vasos grandes, o
un anuerisma diseccionado. La isquemia crónica es provocada por un
agrandamiento gradual de una placa ateromatosa.
Un aumento sostenido de la homocisteína
sanguínea, que daña a las células endoteliales, predispone a una
aterosclerosis prematura de la aorta y sus ramas, las arterias
periféricas, las arterias cerebrales y, probablemente, las arterias
coronarias. Aunque los niveles de homocisteína normalmente son
elevados cuando se asocian a otros factores de riesgo, pueden
modificarse mediante la dieta y los suplementos de vitamina B.
Los síndromes clínicos de la oclusión arterial
dependen del vaso implicado, del grado de obstrucción, de lo rápido
que progrese la oclusión y de si el flujo colateral es adecuado.
La oclusión aguda tiene una historia que incluye
la aparición repentina de dolor grave, sensación de frío,
entumecimiento y palidez en una extremidad. La extremidad aparece
fría y pálida, y los pulsos están ausentes en la parte distal a la
obstrucción. Una oclusión aguda puede provocar isquemia grave,
manifestada por pérdida sensorial y motora y, en último término
(después de 6 a 8 h), induración blanda de los músculos cuando se
palpan.
En la oclusión crónica, los síntomas están
relacionados con el desarrollo insidioso de isquemia en tejidos. El
síntoma inicial es una claudicación intermitente. Los síntomas de la
claudicación son dolores, dolor constante, calambres, o una
sensación de cansancio que aparece cuando se pasea. Estos síntomas
son más comunes en la pantorrilla, pero pueden aparecer en el pie,
el muslo, la cadera o los glúteos.
En último término, el dolor isquémico puede
aparecer en reposo, comenzando desde la parte más distal de una
extremidad como un dolor grave e implacable que se agrava con la
elevación y a menudo impide dormir.
El nivel de oclusión arterial y la localización
de la claudicación intermitente se correlacionan íntimamente, por
ejemplo, la enfermedad aortoilíaca a menudo produce claudicación en
los glúteos, caderas y pantorrillas, y los pulsos femorales se
reducen o están ausentes. En la enfermedad femoropoplítea, la
claudicación se produce, de forma típica, en la pantorrilla, y
todos los pulsos por debajo de la femoral están ausentes. En
pacientes con enfermedad de vasos pequeños (por ejemplo,
tromboangitis obliterante, diabetes mellitus), los pulsos
femoropoplíteos pueden estar presentes pero los pulsos en el pie
están ausentes. La palidez del pie implicado después de 1 a 2 min
de elevación, seguido de rubor tras ponerlos en posición suspendida,
ayuda a confirmar la insuficiencia arterial. El tiempo de llenado
venoso tras ponerlos en posición suspendida después de una elevación
excede el límite normal de 15 segundos. Si los síntomas de la
claudicación aparecen con buenos pulsos distales, debe considerarse
la estenosis espinal en el diagnóstico diferencial.
Un pie gravemente isquémico es doloroso, está
frío y a menudo entumecido. En los casos crónicos, la piel puede
aparecer seca y escamosa con un deficiente crecimiento de las uñas y
el pelo. A medida que empeora la isquemia puede aparecer ulceración
(de forma típica en los dedos de los pies o el talón, a veces en la
pierna), en especial después de un traumatismo local. El edema
normalmente no se encuentra presente, a menos que el paciente haya
mantenido la pierna en posición suspendida para aliviar el dolor;
sin embargo, una pierna gravemente isquémica puede ser atrófica.
Una oclusión más extensiva puede comprometer la viabilidad del
tejido, conduciendo a la necrosis o gangrena. Una isquemica con
rubor, dolor e hinchamiento del pie tras ponerlo en posición
suspendida puede confundirse con la celulitis o la insuficiencia
venosa. Unos ensayos arteriales no invasivos pueden aclarar el
diagnóstico.
Entre las enfermedades vasculares periféricas,
la enfermedad de Buerger (tromboangitis obliterante) es una
enfermedad obliterante caracterizada por cambios inflamatorios en
arterias y venas de tamaño pequeño y mediano.
La enfermedad de Buerger aparece en fumadores,
predominantemente en hombres de 20 a 40 años. Sólo aproximadamente
5% de los casos aparecen en mujeres. La frecuencia del diagnóstico
ha disminuido de forma radical en años recientes debido a una mejor
comprensión de las características clínicas y angiográficas de esta
enfermedad frente a la arteriosclerosis obliterante.
Aunque la causa es desconocida, la enfermedad
Buerger no se ha documentado en no fumadores, lo cual implica al
consmo de cigarrillos como factor etiológico principal, quizás como
un tipo retrasado de hipersensibilidad o angitis tóxica. La
tromboangitis obliterante puede ser una reacción al tabaco en
personas con un fenotipo específico, debido a la mayor prevalencia
de HLA-A9 y HLA-B5 en personas con
la enfermedad; o un trastorno autoinmunológico con sensibilidad
mediada por células frente al colágeno humano de tipo I y III, que
son constituyentes de los vasos sanguíneos.
A diferencia de la aterosclerosis, la enfermedad
de Buerger no implica a las arterias coronaria.
La enfermedad implica a las arterias de tamaño
pequeño y mediano y, con frecuencia, a venas superficiales de las
extremidades con un patrón segmentado. En casos raros, cuando la
enfermedad está avanzada, resultan afectados vasos en otras partes
del cuerpo. El aspecto patológico es el de una panarteritis o
panflebitis no supurante con trombosis de los vasos implicados. La
proliferación de células endoteliales y la infiltración de la capa
íntima con linfocitos se produce en la lesión aguda, pero la lámina
elástica interna permanece intacta. El trombo se organiza y después
se recanaliza de forma incompleta. El medio se conserva bien pero
puede resultar infiltrado por fibroblastos. Debido a que la túnica
adventicia resulta infiltrada por fibroblastos de forma más
extensiva, las lesiones más antiguas muestran fibrosis periarterial,
lo cual también puede implicar a las venas y nervios
adyacentes.
Los síntomas y señales son aquellos de la
isquemia arterial y de la tromboflebitis superficial. La aparición
es gradual, comenzando en los vasos más distales de las extremidades
superiores e inferiores, y avanzando hasta la zona proximal,
culminando en gangrena distal. El paciente puede quejarse de
sensación de frío, entumecimiento, hormigueo o quemazón antes de
que existan pruebas objetivas de la enfermedad. El fenómeno de
Raynaud es habitual. Aparece claudicación intermitente en la
extremidad implicada (normalmente el empeine del pie o la pierna,
pero en casos raros en las manos, los brazos o los muslos). El dolor
resulta persistente con isquemia más grave, por ejemplo, en la
etapa pregangrenosa y con ulceración o gangrena. Con frecuencia, la
sobreactividad del nervio simpático se manifiesta en sensación de
frío, sudoración excesiva y cianosis de la extremidad implicada,
probablemente provocadas por el dolor grave y persistente.
La ulceración isquémica y la gangrena,
habitualmente de uno o más dedos, puede aparecer en las etapas
tempranas de la enfermedad pero no de forma aguda. Los estudios no
invasivos muestran una disminución en el flujo y presión sanguíneos
en los dedos de los pies, los pies y los dedos de las manos
afectados. La enfermedad avanza de manera proximal.
Otra enfermedad vascular periférica es la
enfermedad arterial periférica, en la que los pacientes con
enfermedad arterial periférica (PAD) de las extremidades inferiores
pueden avanzar hasta una isquemia grave que ponga en peligro a las
extremidades. Un dolor isquémico en reposo, ulceraciones que no se
curan y gangrena son indicios de que la situación es mala. Estos
pacientes tienen un alto riesgo de perder las extremidades. Son
necesarias una detección y evaluación rápidas de la isquemia grave
de extremidades, seguidas de una eficaz revascularización, para que
se salven las extremidades y se conserve la salud global.
Una isquemica crítica de las extremidades
crónica es el resultado final de la enfermedad arterial oclusiva,
de manera más habitual la aterosclerosis. Además de la
aterosclerosis en asociación con hipertensión, hipercolesterolemia,
el consumo de cigarrillos y la diabetes, otras causas menos
frecuentes de isquemia crítica de las extremidades crónica incluyen
la enfermedad de Buerger, o tromboangitis obliterante, y algunas
formas de arteritis.
El desarrollo de isquemia crítica de las
extremidades crónica normalmente requiere múltiples sitios de
obstrucción arterial que reduzcan gravemente el flujo de sangre
hacia los tejidos. Una isquemia de tejidos crítica se manifiesta de
forma clínica como dolor en reposo, heridas que no se curan (debido
a los mayores requerimientos metabólicos de la curación de heridas)
o necrosis de tejidos (gangrena).
El dolor isquémico en reposo se ha descrito de
forma clásica como un dolor quemante en la bola del pie y los dedos
de los pies que empeora durante la noche cuando el paciente está en
la cama. El dolor isquémico en reposo se localiza en el pie, en
donde el tejido se encuentra más alejado del corazón y distal a las
oclusiones arteriales. Las heridas que no se curan se encuentran
normalmente en las áreas de un traumatismo en el pie provocado por
zapatos mal ajustados o por una lesión. Se considera que una herida
no se cura, en general, cuando no responde a un ensayo de 4 a 12
semanas de terapia conservadora, tal como cambios regulares de
vendas, evitar traumatismos, tratamiento de la infección y
desbridación del tejido necrótico.
Normalmente la gangrena aparece en los dedos de
los pies. Se desarrolla cuando el suministro de sangre es tan
pequeño que se produce una necrosis espontánea en las tejidos que
peor son perfusionados.
Aunque una terapia conservadora cuidadosamente
diseñada puede beneficiar a muchos pacientes con isquemica crítica
de las extremidades, la naturaleza grave de su enfermedad puede
conducir a considerar una intervención operativa. Las
intervenciones quirúrgicas incluyen la revascularización o la
amputación. Si el paciente quiere someterse a una revascularización
y es un candidato operativo aceptable, a menudo se realiza una
arteriografía para la posterior evaluación y planificación de la
revascularización. En algunos centros se utiliza la angiografía de
resonancia magnética como alternativa o complemento de la
arteriografía para minimizar el riesgo de exposición al tinte. La
conservación de la extremidad mediante revascularización es más
barata, conduce a una mejor calidad de vida para la mayoría de los
pacientes y está asociada con una menor morbilidad y mortalidad
perioperativa que la amputación. La conservación de la extremidad
debe ser el objetivo en la mayoría de las pacientes con isquemia
crítica de las extremidades
crónica.
crónica.
La viabilidad de la revascularización se
determina mediante los descubrimientos arteriográficos, así como
por la disponibilidad de un conducto de bypass. La angioplastia o la
colocación de una endoprótesis vascular, o ambas, tiene más éxito
con lesiones pequeñas, proximales, tales como las que aparecen en
pacientes con claudicación, pero no es probable que sea el único
tratamiento necesario en el caso de una isquemia crítica de las
extremidades debido a la naturaleza de múltiples niveles de la
enfermedad arterial oclusiva. El conducto ideal del bypass es la
vena safena mayor, pero otros conductos incluyen las venas safenas
menores, las venas del brazo o un conducto prostético. En la
mayoría de las series quirúrgicas, las proporciones de patencia del
bypass a los tres años en arterias de ternero varían del 40% para
los bypass prostéticos al 85% para bypass de la vena safena. En
comparación, los estudios de terapia conservadora han demostrado una
proporción de éxito del 25% al 49% con heridas que no se curan, y
un porcentaje de mejora del 50% al 89% en el dolor isquémico en
reposo.
La amputación primaria puede resultar indicada
en ciertos pacientes, tales como los que presentan necrosis
extensiva de tejidos, infecciones que ponen en peligro la vida o
lesiones que no son susceptibles a la revascularización. La
decisión de controlar la condición del paciente con una espera
atenta y un tratamiento conservador, o de realizar la
revascularización o amputación depende de una cuidadosa evaluación
de los beneficios y riesgos asociados de la cirugía frente a un
tratamiento conservador.
De manera más importante, depende de la
interpretación del paciente de la invasividad o adecuación de las
opciones disponibles. Incluso los pacientes que no pueden andar
debido a su condición pueden considerar inapropiada la imputación,
y no todos los pacientes están motivados para realizar el trabajo
necesario de rehabilización después de la amputación. Si se toma la
decisión de amputar, el nivel de amputación debe ser el que
proporcione la mayor probabilidad de curación, al mismo tiempo que
ofrezca la máxima oportunidad al paciente para lograr una
rehabilitación funcional.
El diagnóstico de la isquemia crítica de las
extremidades crónica implica un dolor manifestado en reposo,
heridas que no se curan y gangrena. El dolor isquémico en reposo se
describe, de forma típica, como un dolor de quemazón en el empeine
o la parte distal del pie que aparece cuando el paciente se
encuentra en posición recostada pero que se alivia cuando el
paciente vuelve a una posición en la cual los pies están
suspendidos. Los parámetros hemodinámicos objetivos que apoyan el
diagnóstico de la isquemia crítica de las extremidades incluyen un
índice tobillo-braquial de 0,4 o menor, una presión
sistólica en el tobillo de 50 mm Hg o menor, o una presión
sistólica en los dedos de los pies de 30 mm Hg o menor. La
intervención puede incluir la terapia conservadora, la
revascularización o la amputación. Una grangrena progresiva, unas
heridas que se agrandan con rapidez o un dolor isquémico continuo
en reposo pueden significar un peligro para la extremidad y sugieren
la necesidad de revascularización en pacientes sin riesgos
operativos prohibitivos. A menudo se requieren implantes de bypass
debido a la naturaleza distal y de múltiples niveles del
estrechamiento arterial en la isquemia crítica de las extremidades.
Es más probable que los pacientes con diabetes tengan, en relación
con otro pacientes, una enfermedad distal menos susceptible a un
injerto de bypass. Comparado con la amputación, la
revascularización es más barata y está asociada con una mejor
morbilidad y mortalidad perioperativa. La conservación de la
extremidad debe ser el objetivo en la mayoría de las pacientes con
isquemia crítica de las extremidades.
En la actualidad, el principal tratamiento de
las enfermedades vasculares periféricas incluye un tratamiento
invasivo, tal como la angioplastia o incluso la amputación de la
extremidad. La identificación de fármacos que estimulen la
neovascularización periférica sin aumentar el avance de la placa
aterosclerótica es de gran importancia terapéutica en este campo
médico.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se basa en el descubrimiento de que
un inhibidor de IL-18 estimula la neovascularización
después de la inducción de isquemia periférica en un modelo animal
experimental. La neovascularización se produce en asociación con la
activación de la señalización de VEGF/Akt y viene acompañada de un
aumento en la movilización y diferenciación de células progenitoras
endoteliales de la médula ósea.
Basándose en estos resultados, se proporcionan
nuevas estrategias terapéuticas para tratar o prevenir las
enfermedades vasculares periféricas que requieren neo- o
revascularización.
Por tanto, la invención se refiere al uso de un
inhibidor de IL-18 según se define en las
reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
Fig. 1: muestra A) una microangiografía
representativa de la pata trasera derecha isquémica e izquierda no
isquémica, 3 y 28 días después de la oclusión de la arteria femoral
en ratones. B) Muestra la puntuación angiográfica isquémica/no
isquémica en ratones tratados con pcDNA3-mlL18BP
(IL-18BP) o plásmido vacío (control) durante 3 ó 28
días. Los valores son la media \pm MEE, n = 7 por grupo.
**p<0,01 frente a ratones control.
Fig. 2: muestra A) cambios inducidos por la
isquemia en el flujo sanguíneo de las patas traseras controlados
in vivo mediante formación de imágenes de perfusión mediante
láser Doppler en ratones tratados con pcDNA3-mIL18BP
(IL-18 BP) o plásmido vacío (control). En las
imágenes con un código de colores, la perfusión normal aparece en
rojo, y una reducción marcada en el flujo sanguíneo de la pata
trasera isquémica aparece en azul. B) Evaluación cuantitativa del
flujo sanguíneo expresada como la proporción entre el flujo
sanguíneo en la extremidad isquémica y el flujo sanguíneo en la
extremidad no isquémica. Los valores son la media \pm MEE, n = 7
por grupo. **p<0,01 frente a ratones control.
Fig. 3: muestra A) una transferencia Western
representativa del contenido en proteína VEGF en la pata no
isquémica e isquémica, 28 días después de la oclusión de la arteria
femoral. B) Evaluación cuantitativa de los niveles de proteína VEGF
expresada como la proporción entre el contenido en proteínas en la
extremidad isquémica y el contenido en proteínas en la extremidad
no isquémica. Los valores son la media \pm MEE, n = 7 por grupo.
**p<0,01 frente al control no isquémico, y \dagger p<0,05
frente al control isquémico.
Fig. 4: muestra A) una transferencia Western
representativa del contenido en proteína fosfo-Akt
en la pata no isquémica e isquémica, 28 días después de la oclusión
de la arteria femoral. B) Evaluación cuantitativa de los niveles de
proteína fosfo-Akt expresada como la proporción
entre el contenido en proteínas en la extremidad isquémica y el
contenido en proteínas en la extremidad no isquémica. Los valores
son la media \pm MEE, n = 7 por grupo. *p<0,05, **p<0,01
frente al control no isquémico, y \dagger p<0,05 frente al
control isquémico.
Fig. 5: A) Imágenes representativas de EPC
("endothelial progenitor cells", células progenitoras
endoteliales) aisladas a partir de médula ósea de ratones sin
ligadura de la arteria femoral (falsos) y de ratones tratados con
pcDNA3-mIL18BP (IL-18BP) o plásmido
vacío (control). Las EPC se caracterizaron como células adherentes
con tinción doble positiva para AcLDL-Dil y factor
de von-Willebrand (vWF). B) Cuantificación de las
células doble positivas en ratones tratados con
pcDNA3-mlL18BP o plásmido vacío. Los valores son la
media \pm MEE, n = 5 por grupo. ***p<0,001, frente a los
ratones control, y \dagger\dagger\dagger p<0,001, frente a
ratones sin ligadura de la arteria femoral (falsos).
La presente invención está basada en el
descubrimiento de que los inhibidores de IL-18
aumentan significativamente la angiogénesis postisquémica después
de isquemia en una extremidad sin afectar a la densidad de los vasos
de la extremidad no isquémica en un modelo de enfermedad murino
in vivo. Por tanto, la invención proporciona una nueva
estrategia terapéutica para tratar o prevenir las enfermedades
vasculares periféricas que requieren una mayor perfusión de los
tejidos.
Por tanto, la invención se refiere al uso de un
inhibidor de IL-18 para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad
vascular periférica.
El término "prevención" en el contexto de
esta invención se refiere no sólo a una prevención completa de un
cierto efecto, sino también a cualquier prevención, atenuación,
reducción, disminución o decrecimiento parcial o sustancial del
efecto antes o en la aparición temprana de la enfermedad.
El término "tratamiento" en el contexto de
esta invención se refiere a cualquier efecto beneficioso sobre el
avance de la enfermedad que incluye la atenuación, la reducción, la
disminución o el decrecimiento del desarrollo patológico una vez
iniciada la enfermedad.
La expresión "enfermedad vascular
periférica", tal como se emplea en la presente, se refiere a
enfermedades o trastornos que afectan a las arterias, venas y
conductos linfáticos de las extremidades. Los trastornos vasculares
periféricos pueden ser arteriales (oclusivos o funcionales),
venosos, arteriovenosos combinados (por ejemplo, una fístula
arteriovenosa), o linfáticos. La enfermedad arterial oclusiva
incluye la oclusión arterial periférica y la tromboangitis
obliterante. Los trastornos arteriales funcionales pueden ser
vasoespásticos (enfermedad y fenómeno de Raynaud, acrocianosis) o
vasodilatadores (eritromelalgia). También pueden aparecer de forma
secundaria a un fallo local en los vasos sanguíneos o a trastornos
en la actividad del sistema nervioso simpático, o pueden acompañar
a una enfermedad vascular orgánica. Las enfermedades venosas
incluyen la trombosis venosa y las venas varicosas, los trastornos
arteriovenosos combinados incluyen la fístula arteriovenosa, y los
trastornos linfáticos incluyen el linfedema y el lipedema.
La expresión "enfermedad vascular
periférica" pretende incluir todas las indicaciones médicas,
enfermedades, trastornos o síntomas descritos en los antecedentes
de la invención anteriormente.
La expresión "inhibidor de
IL-18" en el contexto de esta invención se
refiere a cualquier molécula que module la producción y/o la acción
de IL-18, de modo que la producción y/o la acción de
IL-18 se atenúe, se reduzca, o se evite o se
bloquee parcial, sustancial o completamente.
Un inhibidor de la producción puede ser
cualquier molécula que afecte negativamente a la síntesis, el
procesamiento o a la maduración de IL-18. Los
inhibidores considerados en la invención pueden ser, por ejemplo,
supresores de la expresión génica de la interleuquina
IL-18, ARNm antisentido que reducen o previenen la
transcripción del ARNm de IL-18 o que conducen a la
degradación del ARNm, proteínas que impiden el plegamiento correcto,
o que evitan parcial o sustancialmente la secreción de
IL-18, proteasas que degradan la
IL-18 tras haber sido sintetizada, inhibidores de
proteasas que rompen la pro-IL-18
que genera la IL-18 madura, tales como inhibidores
de caspasa-1, y similares.
Un inhibidor de la acción de
IL-18 puede ser, por ejemplo, un antagonista de
IL-18. Los antagonistas se pueden unir o pueden
secuestrar la molécula de IL-18 misma, con una
afinidad y una especificidad suficientes para neutralizar parcial o
sustancialmente la IL-18 o el(los)
sitio(s) de unión de IL-18
responsable(s) de la unión de IL-18 a sus
ligandos (como, por ejemplo, a sus receptores). Un antagonista
también puede inhibir la vía de señalización de
IL-18, que se activa dentro de las células tras la
unión de la IL-18 a su receptor de unión.
Los inhibidores de la acción de
IL-18 también pueden ser receptores de
IL-18 solubles o moléculas que imiten a estos
receptores, o agentes que bloquean los receptores de
IL-18, o anticuerpos contra IL-18,
tales como anticuerpos policlonales o monoclonales, o cualquier
otro agente o molécula que evite la unión de IL-18 a
sus dianas, disminuyendo o evitando, con ello, la activación de las
reacciones intra- o extracelulares mediadas por
IL-18.
En una realización preferida de la invención, la
enfermedad vascular periférica es la enfermedad arterial
periférica.
La "enfermedad arterial periférica" es un
trastorno que implica el estrechamiento de las arterias en cualquier
punto desde los brazos hasta la aorta y las arterias de las
piernas. La aparición puede ser repentina o gradual y produce, en
general, isquemia (disminución del transporte de oxígeno hacia el
área suministrada por el vaso).
Preferiblemente, según la presente invención, la
enfermedad arterial periférica implica a las extremidades
inferiores. La oclusión o enfermedad arterial periférica puede ser
crónica o aguda. La enfermedad arterial periférica está asociada
frecuentemente con una claudicación.
Por tanto, la presente invención se refiere
además al uso de un inhibidor de la IL-18 para el
tratamiento y/o prevención de la claudicación. La claudicación es
un dolor en la pierna, en particular en la pantorrilla, que aparece
y desaparece y provoca cojera. La claudicación se advierte, de forma
típica, cuando se está andando y desaparece en reposo. Por tanto,
se denomina habitualmente claudicación intermitente. La naturaleza
habitualmente intermitente del dolor de la claudicación es debida a
un suministro inadecuado temporal de oxígeno a los músculos de la
pierna. El deficiente suministro de oxígeno es el resultado de un
estrechamiento u oclusión de las arterias que suministran sangre a
la pierna. Esto limita el suministro de oxígeno a los músculos de la
pierna y se advierte, en especial, cuando el requerimiento de
oxígeno de estos músculos aumenta con el ejercicio o el paseo.
En una realización preferida de la invención, la
enfermedad vascular periférica es la tromboangitis obliterante
(enfermedad de Buerger). La "enfermedad de Buerger" es una
enfermedad obliterante caracterizada por cambios inflamatorios en
arterias y venas de pequeño y mediano tamaño que a menudo se produce
en fumadores, predominantemente en hombres de 20 a 40 años.
La enfermedad implica a las arterias de tamaño
pequeño y mediano y, con frecuencia, a venas superficiales de las
extremidades con un patrón segmentado.
En otra realización preferida, la enfermedad
vascular periférica es la isquemia periférica, en particular la
isquemia de las extremidades. La "isquemia" es una deficiencia
en el suministro de sangre, en general debido a una oclusión o un
traumatismo en los vasos sanguíneos. La "isquemia periférica"
se refiere, en particular, a la isquemia en las extremidades, es
decir, los brazos o las piernas, que conduce a una deficiencia en el
suministro de oxígeno del correspondiente tejido de la
extremidad.
En otra realización de la presente invención, la
isquemia de las extremidades es la isquemia crítica de las
extremidades. La "isquemia crítica de las extremidades" es un
estado en que el suministro de sangre a la extremidad es tan bajo
que amenaza su supervivencia. La presencia de dolor en reposo,
ulceración o gangrena indica una isquemia crítica de las
extremidades. La gangrena es el término utilizado para describir al
tejido muerto, y a menudo se produce como resultado o en
combinación con isquemia de las extremidades. Una úlcera isquémica
es provocada por un suministro inadecuado de sangre.
La isquemia crítica de las extremidades,
incluyendo gangrena o úlceras, requiere la revascularización para
evitar la amputación de la extremidad. Por tanto, la presente
invención se refiere además al uso de inhibidores de la
IL-18 para el tratamiento y/o prevención de la
gangrena y las úlceras.
La consecuencia final de una enfermedad vascular
periférica y, en particular, de la isquemia periférica puede ser la
amputación de la extremidad afectada, en particular la extremidad
inferior o pie afectado. Una revascularización conduce a la
reperfusión del tejido afectado y, por tanto, ayuda al proceso de
curación.
Por tanto, la invención se refiere además al uso
de un inhibidor de IL-18 para la fabricación de un
medicamento para la prevención de la amputación de las
extremidades, en particular de una extremidad inferior,
\hbox{pie o dedo(s) del pie.}
El inhibidor de IL-18 se
selecciona de inhibidores de la caspasa-1 (ICE),
anticuerpos dirigidos contra IL-18, anticuerpos
dirigidos contra cualquiera de las subunidades del receptor de
IL-18, inhibidores de la vía de señalización de
IL-18, antagonistas de IL-18 que
compiten con IL-18 y bloquean al receptor de
IL-18, y proteínas de unión a IL-18
o sus isoformas, muteínas, proteínas condensadas, derivados
funcionales, fracciones activas o derivados circularmente
permutados que inhiban la actividad biológica de
IL-18.
La expresión "proteínas de unión a
IL-18" se emplea en la presente como sinónimo de
"proteína de unión a IL-18" o "IL18BP".
Comprende proteínas de unión a IL-18 como se define
en el documento WO 99/09063, o en Novick et al., 1999,
incluyendo los variantes de corte y empalme y/o las isoformas de las
proteínas de unión a IL-18, como se define en Kim
et al., 2000, que se unen a IL-18. En
particular, las isoformas humanas a y c de IL-18BP
son útiles según la presente invención. Las proteínas útiles según
la presente invención puede estar glicosiladas o no glicosiladas,
pueden derivarse de fuentes naturales, tales como orina, o puede
producirse preferiblemente de modo recombinante. La expresión
recombinante puede realizarse en sistemas de expresión procariotas,
como E. coli, o en sistemas de expresión eucariotas, y
preferiblemente de mamíferos. Una línea celular que resulta
particularmente adecuada para la expresión de proteínas de mamífero
es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO).
Tal como se emplea en la presente, el término
"muteínas" se refiere a análogos de una
IL-18BP, o análogos de una IL-18BP
vírica, en los que uno o más restos aminoácidos de una
IL-18BP natural o IL-18BP vírica
está reemplazado por restos aminoácidos diferentes, o están
deleccionados, o uno o más restos aminoácidos se añaden a la
secuencia natural de una IL-18BP, o una
IL-18BP vírica, sin cambiar considerablemente la
actividad de los productos resultantes en comparación con la
IL-18BP de tipo salvaje o IL-18BP
vírica. Estas muteínas se preparan mediante síntesis conocidas y/o
mediante técnicas de mutagénesis dirigida específica de sitio, o
mediante cualquier otra técnica conocida adecuada para ello.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Las muteínas según la presente invención
incluyen proteínas codificadas por un ácido nucleico, tal como ADN
o ARN, que se hibrida con ADN o ARN, que codifica una
IL-18BP o que codifica una IL-18BP
vírica, como se describe en el documento WO 99/09063, bajo
condiciones rigurosas. La expresión "condiciones rigurosas" se
refiere a las condiciones de hibridación y posterior lavado que los
expertos en la técnica denominan convencionalmente
"rigurosas". Véase Ausubel et al., Current Protocols in
Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., \NAK\NAK6.3
y 6.4 (1987, 1992), y Sambrook et al., supra. Sin
limitación, los ejemplos de condiciones rigurosas incluyen
condiciones de lavado 12-20ºC por debajo de la Tm
calculada del híbrido bajo estudio, por ejemplo, en 2 x SSC y SDS
al 0,5% durante 5 minutos, 2 x SSC y SDS al 0,1% durante 15 minutos;
0,1 x SSC y SDS al 0,5% a 37ºC durante 30-60
minutos y, a continuación, 0,1 x SSC y SDS al 0,5% a 68ºC durante
30-60 minutos. Los expertos en la técnica
entenderán que las condiciones rigurosas también dependen de la
longitud de las secuencias de ADN, las sondas oligonucleotídicas
(tales como 10-40 bases) o las sondas
oligonucleotídicas mixtas. Si se emplean sondas mixtas, resulta
preferible utilizar cloruro de tetrametilamonio (TMAC) en lugar de
SSC. Véase Ausubel, supra.
Cualquier de estas muteínas preferiblemente
tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente duplicada de la
de una IL-18BP, o suficientemente duplicada de una
IL-18BP vírica, de manera que tenga una actividad
comparable a la IL-18BP. Una actividad de la
IL-18BP es su capacidad para unirse a
IL-18. Siempre que la muteína tenga una actividad
de unión sustancial con la IL-18 puede utilizarse en
la purificación de IL-18, tal como mediante una
cromatografía de afinidad y, por tanto, puede considerarse que tiene
una actividad sustancialmente similar a la IL-18BP.
Por tanto, puede determinarse si cualquier muteína dada tiene
sustancialmente la misma actividad que IL-18BP
mediante experimentación rutinaria que comprende someter a dicha
muteína, por ejemplo, a un ensayo de competición de "sandwich"
sencillo para determinar si se une o no a una IL-18
marcada de forma apropiada, tal como un radioinmunoensayo o un
ensayo ELISA.
Cualquiera de estas muteínas tiene una
coincidencia u homología de al menos 40% con la secuencia de una
IL-18BP o un homólogo de IL-18BP
codificado en virus, según se define en el documento WO 99/09063.
Más preferiblemente, tiene una coincidencia u homología de al menos
50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80% o, lo más preferible,
al menos 90% con éstas.
Las muteínas de polipéptidos de
IL-18BP o las muteínas de IL-18BP
víricas que pueden utilizarse según la presente invención, o el
ácido nucleico que las codifica, incluyen un conjunto finito de
secuencias sustancialmente correspondientes, como polinucleótidos o
péptidos de sustitución, que un experto en la técnica puede obtener
de manera rutinaria sin experimentación indebida, basándose en las
indicaciones y directrices presentadas en la presente.
Los cambios para las muteínas según la presente
invención son lo que se conoce como sustituciones
"conservadoras". Las sustituciones de aminoácidos
conservadoras de polipéptidos o proteínas de IL-18BP
o lL-18BP víricos pueden incluir aminoácidos
sinónimos dentro de un grupo que tengan unas propiedades
fisicoquímicas suficientemente similares de forma que la
sustitución entre miembros del grupo conservará la función biológica
de la molécula (Grantham, 1974). Está claro que las inserciones y
las deleciones de aminoácidos también se pueden realizar en las
secuencias definidas anteriormente sin alterar su función, en
particular si las inserciones o las deleciones sólo implican a unos
pocos aminoácidos, por ejemplo, menos de treinta, y preferiblemente
menos de diez, y no eliminen o desplacen a los aminoácidos que son
decisivos para una conformación funcional, por ejemplo, los restos
cisteína. Las proteínas y las muteínas producidas mediante tales
deleciones y/o inserciones entran en el ámbito de la presente
invención.
Preferiblemente, los grupos de aminoácidos
sinónimos son los definidos en la tabla 1. Más preferiblemente, los
grupos de aminoácidos sinónimos son los definidos en la tabla 2; y
lo más preferible, los grupos de aminoácidos sinónimos son los
definidos en la tabla 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos de producción de sustituciones de
aminoácidos en proteínas que pueden emplearse para obtener muteínas
de polipéptidos o proteínas de IL-18BP, o muteínas
de IL-18BP víricas, para su uso en la presente
invención incluyen cualquiera de las etapas de métodos conocidos,
tales como las presentadas en las patentes de EEUU 4.959.314,
4.588.585 y 4.737.462 de Mark et al.; 5.116.943 de Koths
et al., 4.965.195 de Namen et al.; 4.879.111 de Chong
et al.; y 5.017.691 de Lee et al.; y las proteínas
sustituidas con lisina, presentadas en la patente de EE.UU. nº
4.904.584 (Shaw et al.).
La expresión "proteínas condensadas" se
refiere a un polipéptido que comprende una IL-18BP,
o una IL-18BP vírica, o una muteína o fragmento de
éstas, condensado con otra proteína que, por ejemplo, tenga un mayor
tiempo de residencia en los fluidos corporales. Por tanto, una
IL-18BP o una IL-18BP vírica puede
estar condensada a otra proteína, polipéptido o similares, por
ejemplo, una inmunoglobulina o su fragmento.
Los "derivados funcionales", tal como se
emplean en la presente, cubren a los derivados de
IL-18BP o de IL-18BP víricas, y sus
muteínas y proteínas condensadas, que pueden prepararse a partir de
los grupos funcionales que aparecen como cadenas laterales sobre
los restos o los grupos N- o C-terminales, mediante
medios conocidos en la técnica, y se incluyen en la invención con
la condición de que sigan siendo farmacéuticamente aceptables, es
decir, no destruyan la actividad de la proteína que es
sustancialmente similar a la actividad de una
IL-18BP, o IL-18BP víricas, y que
no confieran propiedades tóxicas a las composiciones que los
contienen.
Estos derivados pueden incluir cadenas laterales
de polietilenglicol, que pueden enmascarar a los sitios antigénicos
y extender la residencia de una IL-18BP o una
IL-18BP vírica en los fluidos corporales. Otros
derivados incluyen ésteres alifáticos de los grupos carboxilo,
amidas de los grupos carboxilo mediante una reacción con amoniaco o
con aminas primarias o secundarias, derivados de
N-acilo de grupos amino libres de los restos
aminoácidos formados con restos acilo (por ejemplo, grupos
alcanoílo o aroílo carbocíclicos) o derivados de
O-acilo de grupos hidroxilo libres (por ejemplo,
los de los restos serilo o treonilo) formados con restos acilo.
Con la expresión "fracciones activas" de
una IL-18BP, o una IL-18BP vírica,
sus muteínas y proteínas condensadas, la presente invención cubre
cualquier fragmento o precursor de la cadena polipeptídica de la
molécula de proteína individual o junto con moléculas asociadas o
restos unidos a ella, por ejemplo, restos azúcar o fosfato, o
agregados de la molécula de proteína o los restos azúcar
individuales, con la condición de que dicha fracción tenga una
actividad sustancialmente similar a la de
IL-18BP.
En otra realización preferida de la invención,
el inhibidor de IL-18 es un anticuerpo dirigido
contra IL-18 o su receptor, el
IL-18R. Los anticuerpos dirigidos contra cualquiera
de la subunidades de IL-18R, denominadas
IL-18R\alpha y \beta, pueden utilizarse según la
presente invención.
Los anticuerpos según la invención pueden ser
policlonales o monoclonales, quiméricos, humanizados o, incluso,
totalmente humanos. Los anticuerpos recombinantes y sus fragmentos
se caracterizan por su unión de alta afinidad de unión a
IL-18 o IL-18R in vivo y su
baja toxicidad. Los anticuerpos que pueden utilizarse en la
invención se caracterizan por su capacidad para tratar pacientes
durante un periodo suficiente como para producir una regresión o
alivio de bueno a excelente de la afección patogénica o de cualquier
síntoma o grupo de síntomas relacionados con una afección
patogénica, y una baja toxicidad.
Los anticuerpos neutralizantes pueden generarse
con facilidad en animales, tales como conejos, cabras o ratones,
mediante una inmunización con IL-18 o
IL-18R\alpha o \beta. Los ratones inmunizados
son particularmente útiles para proporcionar fuentes de células B
para la fabricación de hibridomas, que, a su vez, se cultivan para
producir grandes cantidades de anticuerpos monoclonales
anti-IL-18.
Los anticuerpos quiméricos son moléculas de
inmunoglobulinas caracterizadas por dos o más segmentos o porciones
derivadas de especies animales diferentes. En general, la región
variable del anticuerpo quimérico se obtiene a partir de un
anticuerpo de mamífero no humano, tal como un anticuerpo monoclonal
murino, y la región constante de la inmunoglobulina se obtiene a
partir de una molécula de inmunoglobulina humana. Preferiblemente,
tanto las regiones como la combinación tienen una imnunogenicidad
baja, según se determina de manera rutinaria (Elliott et
al., 1994). Los anticuerpos humanizados son moléculas de
inmunoglobulinas creadas mediante técnicas de ingeniería genética
en las que las regiones constantes murinas son reemplazadas por sus
homólogos humanos mientras que se mantienen las regiones murinas de
unión al antígeno. El anticuerpo quimérico de
ratón-humano resultante tiene preferiblemente una
menor inmunogenicidad y una mejor farmacocinética en seres humanos
(Knight et al., 1993).
Por tanto, en otra realización preferida, el
anticuerpo contra IL-18 o IL-18R es
un anticuerpo humanizado. Los ejemplos preferidos de anticuerpos
anti-IL-18 humanizados se describen
en la solicitud de patente europea EP 0974600, por ejemplo.
En otra realización preferida, el anticuerpo es
totalmente humano. La tecnología para producir anticuerpos humanos
se describe en detalle, por ejemplo, en los documentos WOOO/76310,
WO99/53049, US 6.162.963 o AU5336100.
Un método para la preparación de anticuerpos
completamente humanos consiste en la "humanización" del sistema
inmunológico humoral de ratón, es decir en la producción de razas
de ratón capaces de producir Ig humana (xenorratones), mediante la
introducción de loci de inmunoglobulinas (Ig) humanas en ratones en
los cuales se han inactivado los genes Ig endógenos. Los loci de Ig
son complejos en términos tanto de su estructura física como de los
procesos de expresión y redisposición de los genes requeridos para
producir, en último término, una amplia respuesta inmunológica. La
diversidad de anticuerpos es principalmente generada por una
redisposición combinatoria entre diferentes genes V, D, y J
presentes en los loci de Ig. Estos loci también contienen los
elementos reguladores interespaciados, los cuales controlan la
expresión de los anticuerpos, la exclusión alélica, el cambio de
clases y la maduración de afinidad. La introducción de transgenes de
Ig humana no redispuestos en ratones ha demostrado que la
maquinaria de recombinación en ratones es compatible con genes
humanos. Además, pueden obtenerse hibridomas que segregan
hu-mAbs específicos de antígenos con diversos
isotipos mediante inmunización de xenorratones con un antígeno.
Los anticuerpos totalmente humanos y los métodos
para su preparación son conocidos en la técnica (Mendez et
al. (1997); Buggemann et al. (1991); Tomizuka et
al., (2000); patente WO 98/24893).
En una realización muy preferida de la presente
invención, el inhibidor de la IL-18 es un
IL-18BP, o sus isoformas, muteínas, proteínas
condensadas, derivados funcionales, fracciones activas o derivados
circularmente permutados. Estas isoformas, muteínas, proteínas
condensadas o derivados funcionales mantienen la actividad biológica
de IL-18BP, en la unión a IL-18, y
preferiblemente tienen esencialmente al menos una actividad similar
a IL-18BP. De manera ideal, estas proteínas tienen
una mayor actividad biológica, comparadas con
IL-18BP sin modificar. Las fracciones activas
preferidas tienen una actividad que es mejor que la actividad de
IL-18BP, o tienen otras ventajas, tales como una
mejor estabilidad o una menor toxicidad o inmunogenicidad, o son más
fáciles de producir en grandes cantidades, o más fáciles de
purificar.
Las secuencias de IL-18BP y sus
isoformas/variantes de corte y empalme pueden obtenerse en el
documento WO99/09063, o en Novick et al., 1999, así como en
Kim et al., 2000.
Los derivados funcionales de
IL-18BP pueden conjugarse con polímeros para mejorar
las propiedades de la proteína, tales como la estabilidad,
semivida, biodisponibilidad, tolerancia por el cuerpo humano, o
inmunogenicidad. Para lograr este objetivo, la
IL18-BP puede unirse, por ejemplo, a
polietilenglicol (PEG). La PEGilación se puede realizar mediante
métodos conocidos, descritos en el documento WO 92/13095, por
ejemplo.
Por tanto, en una realización de la presente
invención, los inhibidores de IL-18, e
IL-18BP están PEGilados.
En otra realización de la invención, el
inhibidor de IL-18 comprende una fusión de
inmunoglobulina, es decir, el inhibidor de IL-18 es
una proteína condensada que comprende todo o parte de una proteína
de unión a IL-18, que está condensada con toda o
una porción de una inmunoglobulina. Los métodos para fabricar
proteínas de fusión con inmunoglobulinas son bien conocidos en la
técnica, tales como los descritos en el documento WO 01/03737, por
ejemplo. Los expertos en la técnica comprenderán que la proteína de
fusión de la invención resultante mantiene la actividad biológica
de IL-18BP, en particular la unión a
IL-18. La fusión puede ser directa, o a través de
un péptido conector corto que puede ser tan corto como de 1 a 3
restos aminoácidos de longitud o más largo, por ejemplo, de 13 a 20
restos aminoácidos de longitud. Dicho conector puede ser un
tripéptido con la secuencia E-F-M
(Glu-Phe-Met), por ejemplo, o una
secuencia conectora de 13 aminoácidos que comprende
Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met
introducidos entre la secuencia de IL-18BP y la
secuencia de la inmunoglobulina. La proteína de fusión resultante
tiene unas propiedades mejoradas, tales como un tiempo de
residencia más largo en los fluidos corporales (semivida), una
actividad específica incrementada, un nivel de expresión
acrecentado o se facilita la purificación de la proteína de
fusión.
En una realización preferida, la
IL-18BP se condensa con la región constante de una
molécula de Ig. Preferiblemente, se condensa con regiones de la
cadena pesada, tales como los dominios CH2 y CH3 de la IgG1 o IgG2
humana, por ejemplo. La generación de proteínas de fusión
específicas que comprenden IL-18BP y una porción de
una inmunoglobulina se describen en el ejemplo 11 del documento WO
99/09063, por ejemplo. Otras isoformas de las moléculas de Ig
también resultan adecuadas para la generación de proteínas de fusión
según la presente invención, tales como las isoformas IgG_{2} o
IgG_{4}, u otras clases de Ig, tales como IgM o IgA, por ejemplo.
Las proteínas de fusión pueden ser monómeras o multímeras, hetero-
u homomultímeras.
En otra realización de la invención, se emplea
un inhibidor de IL-18 en combinación con una o más
moléculas diferentes activas en las afecciones clínicas de la
invención, tales como vasodilatores, bloqueantes de Ca, aspirina,
beta-bloqueantes o similares. También pueden
utilizarse antagonistas de TNF en combinación con un inhibidor de
IL-18 según la presente invención, por ejemplo. Los
antagonistas de TNF ejercen su actividad de distintos modos. En
primer lugar, los antagonistas pueden unirse o secuestrar la
molécula de TNF misma con la suficiente afinidad y especificidad
para parcial o sustancialmente neutralizar el epitopo o epitopos
responsables de la unión del TNF al receptor (en lo sucesivo
denominados "antagonistas secuestrantes"). Un antagonista
secuestrante puede ser, por ejemplo, un anticuerpo dirigido contra
TNF.
Como alternativa, los antagonistas de TNF pueden
inhibir la vía de señalización de TNF activada por el receptor de
la superficie celular después de la unión de TNF (en lo sucesivo
denominados "antagonistas de señalización"). Ambos grupos de
antagonistas son útiles, por sí solos o en juntos, en combinación
con un inhibidor de IL-18, en la terapia o
prevención de la enfermedad vascular periférica.
Los antagonistas de TNF se identifican
fácilmente y se evalúan mediante selección rutinaria para su efecto
sobre la actividad del TNF natural sobre líneas celulares
susceptibles in vitro, por ejemplo, linfocitos B humanos, en
los que el TNF produce la proliferación y la secreción de
inmunoglobulinas. El ensayo contiene una formulación de TNF en
diversas diluciones del antagonista candidato, por ejemplo, de 0,1 a
100 veces la cantidad molar de TNF utilizando en el ensayo, y
controles sin TNF o sólo con antagonista (Tucci et al.,
1992).
Los antagonistas secuestrantes son los
antagonistas de TNF preferidos para emplear según la presente
invención. Entre los antagonistas secuestrantes, los polipéptidos
que se unen a TNF con alta afinidad y que poseen baja
inmunogenicidad son los preferidos. Las moléculas del receptor de
TNF solubles y los anticuerpos neutralizantes contra TNF son
particularmente preferidos. Por ejemplo, TNF-RI y
TNF-RII solubles son útiles en la presente
invención. Las formas truncadas de estos receptores que comprenden
los dominios extracelulares de los receptores o porciones
funcionales de los mismos, son antagonistas particularmente
preferidos de acuerdo con la presente invención. Los receptores de
TNF de tipo I y de tipo II solubles truncados se describen en el
documento EP914431, por ejemplo.
Las formas truncadas de los receptores de TNF
son solubles y se han detectado en orina y suero como proteínas de
unión inhibidoras de TNF de 30 kDa y 40 kDa, que se denominan TBPI y
TBPII, respectivamente (Engelmann et al., 1990). El uso
simultáneo, secuencial o separado del inhibidor de
IL-18 con el antagonista de TNF se prefiere según
la invención.
En otra realización preferida, el
TNF-RI (TBPI) soluble y humano es el antagonista de
TNF para emplear según la invención. Las moléculas solubles
naturales y recombinantes del receptor de TNF y los métodos para su
producción, están descritos en las patentes europeas EP 308378, EP
398327 y EP 433900.
Los derivados, los fragmentos, las regiones y
las porciones biológicamente activas de las moléculas del receptor,
que se parecen funcionalmente a las moléculas del receptor, también
se pueden utilizar en la presente invención. Dicho equivalente o
derivado biológicamente activo de la molécula receptora se refiere a
la porción del polipéptido o de la secuencia que codifica la
molécula del receptor que tiene el suficiente tamaño y es capaz de
unirse a TNF con una afinidad tal, que se inhiba o se bloquee la
interacción con el receptor de TNF unido a la membrana.
El inhibidor de IL-18 se puede
emplear simultánea, secuencial o separadamente con el inhibidor de
TNF.
En otra realización preferida de la presente
invención, el inhibidor de IL-18 se usa en una
cantidad de aproximadamente 0,01 a 100 mg/kg, o de aproximadamente
1 a 10 mg/kg, o de 2 a 5 mg/kg.
El inhibidor de IL-18 según la
invención se administra preferiblemente por vía sistémica, y
preferiblemente por vía subcutánea o intramuscular. Puede
administrarse a diario o en días alternos. Las formulaciones de
liberación sostenida hacen posible administrarlos con menos
frecuencia, tal como una vez semanal, por ejemplo.
La invención se refiere además al uso de un
vector de expresión que comprende la secuencia codificadora de un
inhibidor de IL-18 para la preparación de un
medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad
vascular periférica. Por tanto, se considera una estrategia de
terapia génica para transportar el inhibidor de
IL-18 hasta el sitio en el que se requiere. Para
tratar y/o prevenir una enfermedad vascular periférica, el vector
de terapia génica que comprende la secuencia de un inhibidor de
IL-18 puede inyectarse directamente en el tejido
enfermo, por ejemplo, evitando, con ello, los problemas implicados
en la administración sistémica de vectores de terapia génica, tales
como la dilución de los vectores, el alcanzar las células o tejidos
diana, y los efectos secundarios.
El uso de un vector para inducir y/o potenciar
la producción endógena de un inhibidor de IL-18 en
una célula que normalmente es silenciosa para la expresión de un
inhibidor de IL-18, o que expresa cantidades del
inhibidor que no son suficientes, también se comtempla según la
invención. El vector puede comprender secuencias reguladoras
funcionales en las células deseadas para expresar el inhibidor o
IL-18. Tales secuencias reguladoras pueden ser, por
ejemplo, promotores o potenciadores. La secuencia reguladora
entonces puede introducirse en el locus correcto del genoma
mediante recombinación homóloga, uniendo operablemente, con ello, la
secuencia reguladora con el gen, cuya expresión se requiere inducir
o potenciar. La tecnología se denomina habitualmente activación de
genes endógenos ("Endogenous Gene Activation", EGA), y se
describe, por ejemplo, en el documento WO 91/09955.
Un experto en la técnica entenderá que también
es posible eliminar la expresión de IL-18
directamente, sin utilizar un inhibidor de IL-18,
con la misma técnica. Para hacer esto, un elemento de regulación
negativa, tal como, por ejemplo, un elemento silenciador, puede
introducirse en el locus del gen de IL-18, lo cual
conduce a una infrarregulación o prevención de la expresión de
IL-18. Un experto en la técnica entenderá que dicha
infrarregulación o silenciamiento de la expresión de
IL-18 tiene el mismo efecto que el uso de un
inhibidor de IL-18 para evitar y/o tratar la
enfermedad.
La invención se refiere además al uso de una
célula que se ha modificado genéticamente para que produzca un
inhibidor de IL-18 para la preparación de un
medicamento para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad
vascular periférica.
El inhibidor de IL-18 para ser
empleado según la presente invención puede administrarse
preferiblemente como una composición farmacéutica, opcionalmente en
combinación con una cantidad terapéuticamente eficaz de un
inhibidor de TNF u otro fármaco activo en el tratamiento o
prevención de una enfermedad vascular periférica.
La IL-18BP y sus isoformas,
mutéinas, proteínas condensadas, derivados funcionales, fracciones
activas o derivados circularmente permutados, según se describieron
anteriormente, son los principios activos preferidos de la
composiciones farmacéuticas.
La definición de "farmacéuticamente
aceptable" significa que incluye cualquier vehículo que no
interfiera con la eficacia de la actividad biológica del principio
activo y que no sea tóxico para el receptor al que se administra.
Por ejemplo, para la administración por vía parenteral, la(s)
proteína(s) activa(s) se puede(n) formular en
forma de dosificación unitaria para la inyección en vehículos, tales
como disolución salina, disolución de dextrosa, seroalbúmina y
disolución de Ringer.
Los principios activos de la composición
farmacéutica según la invención se pueden administrar a un individuo
en una variedad de formas. Las vías de administración incluyen la
vía intradérmica, transdérmica (por ejemplo, en formulación de
liberación lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa,
subcutánea, oral, intracraneal, epidural, tópica e intranasal.
Puede emplearse cualquier otra vía de administración
terapéuticamente eficaz, por ejemplo absorción a través de tejidos
epiteliales o endoteliales, o mediante una terapia génica en la que
una molécula de ADN que codifica el agente activo se administra al
paciente (por ejemplo, a través de un vector), lo cual provoca que
el agente activo se exprese y se segregue in vivo. Además,
la(s) proteína(s) según la invención se
puede(n) administrar junto con otros componentes de agentes
biológicamente activos, tales como tensioactivos, excipientes,
portadores, diluyentes y vehículos farmacéuticamente aceptables.
Para la administración parenteral (por ejemplo,
intravenosa, subcutánea, intramuscular), la(s)
proteína(s) activa(s) puede(n) formularse como
una disolución, suspensión, emulsión o polvo liofilizado, en
asociación con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable
(por ejemplo, agua, disolución salina, disolución de dextrosa) y
aditivos para mantener la isotonicidad (por ejemplo, manitol) o la
estabilidad química (por ejemplo, conservantes y tampones). La
formulación se esteriliza mediante técnicas empleadas de forma
habitual.
La biodisponibilidad de la(s)
proteína(s) activa(s) según la invención también puede
mejorarse utilizando procedimientos de conjugación que aumentan la
semivida de la molécula en el cuerpo humano, por ejemplo, uniendo
la molécula a polietilenglicol, según se describe en la solicitud de
patente PCT WO 92/13095.
Las cantidades terapéuticamente eficaces de
la(s) proteína(s) activa(s) estarán en función
de muchas variables, incluyendo el tipo de antagonista, la afinidad
del antagonista por la IL-18, cualquier actividad
citotóxica residual que muestren los antagonistas, la vía de
administración, la afección clínica del paciente (incluyendo el
deseo de mantener un nivel no tóxico de actividad
IL-18 endógena).
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es
la que cuando se administra, el inhibidor de IL-18
produce una inhibición de la actividad biológica de
IL-18. La dosificación administrada, en forma de
dosis única o múltiple, a un individuo, variará dependiendo de una
diversidad de factores, que incluyen las propiedades
farmacocinéticas del inhibidor de IL-18, la vía de
administración, el estado y las características del paciente (sexo,
edad, peso corporal, salud, altura), el grado de extensión de los
síntomas, los tratamientos simultáneos, la frecuencia del
tratamiento y el efecto deseado. El ajuste y la manipulación de los
intervalos establecidos de dosificación entran dentro de las
capacidades de los expertos en la técnica, así como los métodos
in vitro e in vivo para determinar la inhibición de
IL-18 en un individuo.
Según la invención, el inhibidor de
IL-18 se emplea en una cantidad de aproximadamente
0,001 a 100 mg/kg, o de aproximadamente 0,01 a 10 mg/kg de peso
corporal, o de aproximadamente 0,1 a 5 mg/kg de peso corporal, o de
aproximadamente 1 a 3 mg/kg de peso corporal, o de aproximadamente 2
mg/kg de peso corporal.
La vía de administración que se prefiere según
la invención es la administración por vía subcutánea. La
administración por vía intramuscular también se prefiere según la
invención. Para administrar el inhibidor de IL-18
directamente hasta el lugar de su acción también resulta preferible
administrarlo por vía tópica.
En otras realizaciones preferidas, el inhibidor
de IL-18 se administra diariamente o cada dos
días.
Las dosis diarias se proporcionan generalmente
en dosis divididas o en una forma de liberación sostenida, eficaz
para obtener los resultados deseados. La segunda administración u
otras posteriores se pueden realizar con una dosificación que sea
la misma, menor o superior a la dosis inicial o la dosis previa
administrada al individuo. Una segunda administración u otra
posterior se puede administrar durante el comienzo de la enfermedad
o antes de la misma.
Según la invención, el inhibidor de
IL-18 puede administrarse de modo profiláctico o
terapéutico a un individuo antes, de modo simultáneo o secuencial
con otros agentes o regímenes terapéuticos (por ejemplo, regímenes
de múltiples fármacos), en una cantidad terapéuticamente eficaz, en
particular con un inhibidor de TNF y/u otro agente protector
vascular. Los agentes activos que se administran simultáneamente con
otros agentes terapéuticos se pueden administrar en las mismas
composiciones o en diferentes composiciones.
La invención se refiere también a un método para
la preparación de una composición farmacéutica que comprende
mezclar una cantidad eficaz de un inhibidor de IL-18
y/o un antagonista de TNF con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Se describe un método de tratamiento de una
enfermedad vascular periférica, que comprende administrar una
cantidad farmacéuticamente eficaz de un inhibidor de
IL-18, opcionalmente en combinación con una cantidad
farmacéuticamente eficaz de un antagonista de TNF, a un paciente
que lo necesite.
Habiendo descrito a fondo esta invención, los
expertos en la técnica apreciarán que ésta puede realizarse dentro
un amplio intervalo de parámetros, concentraciones y condiciones
equivalentes, sin apartarse del espíritu y alcance de la invención
y sin experimentación indebida.
La referencia a etapas de métodos conocidas,
etapas de métodos convencionales, métodos conocidos o métodos
convencionales no supone admitir que cualquier aspecto, descripción
o realización de la presente invención se describa, indique o
sugiera en la técnica pertinente.
La anterior descripción de las realizaciones
específicas también revelará completamente la naturaleza general de
la invención que otros, aplicando el conocimiento de los expertos en
la técnica (incluyendo los contenidos de las referencias citadas en
la presente), pueden modificar y/o adaptar con facilidad para
diversas aplicaciones de estas realizaciones específicas, sin
experimentación indebida, y sin apartarse del concepto general de
la presente invención. Por tanto, estas adaptaciones y
modificaciones pretenden estar dentro del significado y gama de
equivalentes de las realizaciones descritas, basándose en las
indicaciones y directrices presentadas en la presente. Debe
entenderse que la fraseología o terminología en la presente tiene el
propósito de describir y no limitar, de forma que la terminología o
fraseología de la presente descripción debe ser interpretada por
los expertos en la técnica a la luz de las indicaciones y
directrices presentadas en la presente, en combinación con el
conocimiento de los expertos en la
técnica.
técnica.
\newpage
Ejemplo
1
Ratones macho C57BL/6J (Iffa Creddo, Lyon,
Francia) se sometieron a cirugía para inducir una isquemia
unilateral en las patas traseras. Los animales se anestesiaron
mediante inhalación de isoflurano. Se realizó la ligadura en la
arteria femoral derecha, 0,5 cm proximal a la bifurcación de las
arterias safena y poplítea. Entonces los ratones (7 animales por
grupo) se mantuvieron bajo condiciones específicas exentas de
patógenos durante 3 ó 28 días. Para estudiar el papel de
IL-18BP en la angiogénesis inducida por isquemia, un
grupo de ratones fueron inyectados con 60 \mug del plásmido de
expresión de IL-18BP murina,
pcDNA3-mlL18BP, en ambos músculos craneales
tibiales, como se ha descrito previamente (Mallat et al.,
2001). Los ratones control se inyectaron con la misma dosificación
del plásmido control vacío. Se administraron pulsos eléctricos
transcutáneos (8 pulsos eléctricos de ondas cuadradas de 200 V/cm,
20 ms de duración a 2 Hz) mediante un electropulsador
PS-15 (Genetronics) utilizando dos electrodos de
placas de acero inoxidable, colocadas de 4,2 a 5,3 mm entre sí, en
cada lado de la pierna. Se empleó esta estrategia porque
previamente había demostrado que aumenta los niveles plasmáticos de
IL-18BP, había disminuido la actividad plasmática de
IL-18, y había inhibido el desarrollo y el avance
de las placas ateroscleróticas (Mallat et al., 2001).
Se evaluó la densidad de los vasos mediante una
microangiografía de alta definición al final de periodo de
tratamiento, como se ha descrito previamente (Silvestre et
al., 2000; Silvestre et al., 2001). Brevemente, los
ratones se anestesiaron (inhalación de isoflurano) y se inyectó
medio de contraste (sulfato de bario, 1 g/ml) a través de un
catéter introducido en la aorta abdominal. Se montaron imágenes (3
por animal) adquiridas mediante un transductor de rayos X digital,
para obtener una visión completa de las patas traseras. La densidad
de los vasos se expresó como porcentaje de píxeles por imagen
ocupados por vasos en el área de cuantificación. Se delineó una
zona de cuantificación formada por el lugar de la ligadura en la
arteria femoral, la rodilla, el extremo del fémur y el límite
externo de la pata.
Se completó el análisis de microangiografía
mediante la evaluación de las densidades capilares en músculos
isquémicos y no isquémicos, como se describió previamente (Silvestre
et al., 2000; Silvestre et al., 2001). Se incubaron
secciones de tejido congeladas (7 \mum) con anticuerpo monoclonal
de rata dirigido contra CD31 (20 \mug/ml, Pharmingen) para
identificar los capilares. Se visualizó la inmunotinción utilizando
sistemas de visualización de peroxidasa de rábano y
avidina-biotina (kit elite Vectastain ABC, Vector
Laboratories). Se calcularon las densidades capilares en campos
elegidos al azar de un área definida, utilizando el programa
informático Histolab (Microvision).
Para proporcionar pruebas funcionales de los
cambios en la vascularización inducidos por isquemia, se realizaron
experimentos de formación de imágenes de perfusión de láser Doppler,
como se describió previamente (Silvestre et al., 2000;
Silvestre et al., 2001). Brevemente, el exceso de pelo de la
extremidad se eliminó mediante una crema depilatoria antes de la
formación de imágenes, y los ratones se colocaron en una placa
calefactora a 37ºC para minimizar la variación de temperatura. No
obstante, para tomar en cuenta las variables, incluyendo la
temperatura y la luz ambiental, la perfusión calculada se expresó
como una proporción entre la pata isquémica y la pata no
isquémica.
Los resultados se expresan como media \pm MEE.
Se empleó una análisis de la varianza ANOVA de una vía para
comparar cada parámetro. Entonces se realizaron comparaciones del
ensayo de la t de Bonferonni post-hoc para
identificar cuáles eran las diferencias en los grupos que eran las
responsables de una ANOVA global significativa. Se consideró un
valor de p<0,05 como estadísticamente significativo.
\vskip1.000000\baselineskip
En el día 3, las proporciones de puntuación
angiográfica para la pata isquémica/no isquémica no se vieron
afectadas en ningún grupo (fig. 1). Por contraste, en el día 28, la
puntuación angiográfica mostró un aumento de 1,6 veces en ratones
tratados con IL-18BP comparado con los controles
(p<0,01).
Los datos microangiográficos fueron confirmados
mediante análisis de la densidad capilar después de tinción con
CD31. En el día 28, la densidad capilar de la pata isquémica de los
ratones control era menor que la de la pata no isquémica (415 \pm
31 frente a 688 \pm 42 vasos/mm^{2}, p<0,01). Sin embargo, la
densidad capilar de la pata isquémica de ratones tratados con
IL-18BP fue significativamente mayor (un aumento de
1,4 veces) que en los ratones control (588 \pm 48 frente a 415
\pm 31 vasos/mm^{2}, respectivamente, p = 0,01) y no era
diferente del nivel observado en la pata no isquémica.
Las microangiografía y las medidas de densidad
capilar se asociaron con los cambios en la perfusión de sangre. Se
produjo una recuperación del flujo sanguíneo en la pata trasera en
los ratones tratados y no tratados. Sin embargo, en ratones
tratados con IL-18BP, un mayor aumento en el flujo
sanguíneo (perfusión del pie) resultó evidente en el día 28,
comparado con los animales control (1,5 veces, p<0,01, figura
2).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Se determinó la expresión de VEGF,
fosfo-Akt y eNOS (proteína de óxido nítrico sintasa
endotelial) mediante análisis Western en la pata isquémica y la
pata no isquémica, como se describió previamente (Silvestre et
al., 2000; Silvestre et al., 2001).
VEGF. En el día 3, no se observaron
cambios en el nivel de proteínas VEGF entre la pata isquémica y la
pata no isquémica en ninguno de los grupos. En el día 28, en los
ratones control, el contenido en proteínas VEGF tendía a aumentar
en la pata isquémica cuando se compara con la pata no isquémica,
pero esto no alcanzó la significancia estadística. Por contraste,
el nivel de proteínas VEGF en la pata isquémica fue drásticamente
sobrerregulado en 120% en los ratones tratados con
IL-18BP comparados con los controles (p<0,05)
(figura 3).
Fosfo-Akt. En el día 3,
el nivel de proteínas fosfo-Akt permaneció sin
cambios en las patas traseras isquémica y no isquémica cualquiera
que fuera el tratamiento. En el día 28, en los ratones control, el
contenido en proteínas fosfo-Akt aumentó en 60% en
la pata trasera isquémica frente a la pata no isquémica (p<0,01).
Este aumento en el contenido en fosfo-Akt de la
pata isquémica se dobló en los ratones tratados con
IL-18BP (aumento del 110%, p<0,05 comparado con
el aumento en la pata isquémica en los ratones control) (figura
4).
eNOS. En el día 3, el contenido en
proteínas eNOS no resultó afectado en la pata isquémica (107 \pm
8% frente a 103 \pm 24%) y la pata no isquémica (100 \pm 12%
frente a 94 + 21%) para los animales control y tratados con
IL-18BP, respectivamente. En el día 28, en los
ratones control, los niveles de eNOS aumentaron en 55% en la pata
isquémica con referencia a la pata no isquémica (155 \pm 8% frente
a 100 \pm 11%, respectivamente, p<0,05). Este aumento no se
vió afectado por el tratamiento con IL-18BP (160
\pm 12%, P = 0,61 frente al control isquémico).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Se cree que las células EPC derivan de células
progenitoras hematopoyéticas
Sca-1-positivas (Takahashi et
al., 1999). El porcentaje de células mononucleares que expresan
la proteína marcadora de EPC Sca-1 entonces se
determinó mediante citometría de flujo. Siete días después de la
isquemia se aislaron células mononucleares a partir de sangre
periférica (300 \mul) y de médula ósea de ratones tratados con el
plásmido pcDNA3 vacío o el plásmido pcDNA3-mlL18BP
(n = 5 por gropo). Se obtuvieron células de médula ósea enjuagando
las tibias y los fémures. Se aislaron células mononucleares de baja
densidad mediante una centrifugación en gradiente de densidad con
Ficoll. Las células mononucleares entonces se incubaron con
anticuerpos monoclonales conjugados con isotiocianato de
fluoresceína (FITC) contra Sca-1 (D7, BD
Pharmingen). Los anticuerpos con isotipo idéntico actuaron como
control.
Inmediatamente después del aislamiento,
5.10^{6} células mononucleares derivadas de médula ósea también
se colocaron sobre placas de cultivo de células de 35 mm revestidas
con vitronectina plasmática de rata (Sigma) y gelatina (al 0,1%) y
se mantuvieron en medio basal endotelial (EBM2, Bio whittaker).
Después de 4 días de cultivo, se retiraron las células no
adherentes, y las células adherentes se sometieron a análisis
inmunohistoquímicos.
Para detectar la captación de lipoproteína de
baja densidad marcada con
1,1'-dioctadecil-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina
(AcLDL-Dil), las células se incubaron con
AcLDL-Dil (Tebu) a 37ºC durante 1 hora. Entonces las
células se fijaron con paraformaldehído al 2%, se incubaron con un
anticuerpo de conejo policlonal primario dirigido contra el factor
de von-Willbrand (vWF) (DAKO) durante 1 hora, y con
IgG (H+L) anticonejo monoclonal marcado con FITC durante 30 min
(Coulter). Se consideró que las células con tinción dual positivas
para AcLDL-Dil y vWF eran EPC, y se contaron por
pocillo. Tres investigadores independientes evaluaron el número de
EPC por pocillo contando tres campos de alta potencia seleccionados
al azar. Los resultados entonces se expresan como porcentaje del
número total de células mononucleares.
Se cree que las células EPC derivan de células
mononucleares Sca-1-positivas
(Takahashi et al., 1999). El porcentaje de células
mononucleares Sca-1-positivas en la
sangre periférica permaneció sin cambios en los ratones tratados
con IL-18BP comparados con animales control (31,5
\pm 13% frente a 28,5 + 13%, respectivamente). De forma similar,
el número global de células mononucleares
Sca-1-positivas aisladas a partir de
médula ósea no difirió entre los ratones tratados con
IL-18BP y los animales control (4,35 \pm 0,95%
frente a 5,87 \pm 0,22%, respectivamente). Además, el tratamiento
con IL-18BP no afectó al número total de células
mononucleares de sangre periférica o de médula ósea (los datos no
se muestran).
Las EPC se aislaron y se cultivaron a partir de
células mononucleares de médula ósea y se caracterizaron como
células de tinción dual positivas para AcLDL-Dil y
vWF. El porcentaje de células con tinción doble positiva fue casi
idetectable en animales no isquémicos (<5%, n = 4). La isquemia
indujo un marcado aumento en el porcentaje de células con tinción
doble positiva para AcLDL-Dil y vWF (48 + 3%,
p<0,001 frente a animales no isquémicos). Este efecto fue aún
más expandido por el tratamiento con IL-18BP (48
\pm 3% en los controles frente a 85 \pm 2% en ratones tratados
con IL-18BP, p<0,001) (figura 5). Por tanto, el
tratamiento con IL-18BP parece estimular la
diferenciación de células mononucleares en EPC, en lugar de aumentar
el número de células progenitoras en circulación.
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Claims (16)
1. El uso de un inhibidor de
IL-18 para la fabricación de un medicamento para el
tratamiento y/o la prevención de una enfermedad vascular periférica
de las extremidades, en el que el inhibidor de IL-18
se selecciona de un inhibidor de la caspasa-1
(ICE), un anticuerpo contra IL-18, un anticuerpo
contra cualquiera de las subunidades del receptor de
IL-18, y una proteína de unión a
IL-18, o una isoforma, muteína, proteína condensada
o derivado funcional de una proteína de unión a
IL-18 que inhiba la actividad biológica de
IL-18, comprendiendo la muteína una o más
sustituciones de aminoácidos conservadoras, comprendiendo la
proteína condensada una inmunoglobulina de fusión, y estando el
derivado funcional PEGilado.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que
la enfermedad vascular periférica es la enfermedad arterial
periférica.
3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el
que la enfermedad vascular periférica es la enfermedad vascular
periférica de las extremidades inferiores.
4. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la enfermedad vascular
periférica de las extremidades viene acompañada de
claudicación.
5. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la enfermedad vascular
periférica es la enfermedad de Buerger (tromboangitis
obliterante).
6. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la enfermedad vascular
periférica es la isquemia periférica.
7. El uso según la reivindicación 6, en el que
la isquemia periférica es la isquemia crítica de las
extremidades.
8. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la enfermedad vascular
periférica de las extremidades viene acompañada de gangrena y/o
úlceras.
9. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la enfermedad vascular
periférica de las extremidades viene acompañada de amputación de
extremidades.
10. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el inhibidor de
IL-18 es un anticuerpo dirigido contra
IL-18.
11. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el inhibidor de
IL-18 es un anticuerpo dirigido contra el receptor
\alpha de IL-18.
12. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el inhibidor de
IL-18 es un anticuerpo dirigido contra el receptor
\beta de IL-18.
13. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 10 a 12, en el que el anticuerpo contra
IL-18 es un anticuerpo humanizado o humano.
14. El uso según una cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el inhibidor de
IL-18 está glicosilado en uno o más sitios.
15. El uso de un vector de expresión que
comprende la secuencia codificadora de un inhibidor de
IL-18 para la preparación de un medicamento para el
tratamiento y/o la prevención de una enfermedad vascular periférica
de las extremidades, en el que el inhibidor de IL-18
se selecciona de un anticuerpo contra IL-18, un
anticuerpo contra cualquiera de las subunidades del receptor de
IL-18, y una proteína de unión a
IL-18, o una isoforma, muteína o proteína
condensada de una proteína de unión a IL-18 que
inhiba la actividad biológica de IL-18,
comprendiendo la muteína una o más sustituciones de aminoácidos
conservadoras, y comprendiendo la proteína condensada una
inmunoglobulina de fusión.
16. El uso de un vector de expresión para
inducir y/o potenciar la producción endógena de un inhibidor de
IL-18 en una célula para la preparación de un
medicamento para el tratamiento y/o la prevención de una enfermedad
vascular periférica de las extremidades, en el que el inhibidor de
IL-18 se selecciona de un anticuerpo contra
IL-18, un anticuerpo contra cualquiera de las
subunidades del receptor de IL-18, y una proteína de
unión a IL-18, o una isoforma, muteína o proteína
condensada de una proteína de unión a IL-18 que
inhiba la actividad biológica de IL-18,
comprendiendo la muteína una o más sustituciones de aminoácidos
conservadoras, y comprendiendo la proteína condensada una
inmunoglobulina de fusión.
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