EA005410B1 - Применение ингибиторов il-18 для лечения и/или предотвращения атеросклероза - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к применению ингибитора IL-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения атеросклероза.

Description

Настоящее изобретение относится к области заболеваний сосудов. Более конкретно, изобретение относится к применению ингибиторов ГБ-18 для лечения и/или предотвращения атеросклероза.

Уровень техники

Атеросклероз является широко распространенным и наиболее важным заболеванием сосудов, но известно множество других заболеваний сосудов. Атеросклероз, в основном, поражает крупные и средние артерии, и повреждения включают полоски жира, фиброзные бляшки и осложненные поражения. Атеросклероз представляет собой хроническое воспалительное заболевание артериальной стенки, характеризующееся прогрессивным накоплением липидов, таких как холестерин, клеток, таких как макрофаги, Т-лимфоциты или гладкомышечные клетки, и экстрацеллюлярного матрикса (1). Наиболее крупные скопления называют атеромами или бляшками, которые часто содержат кальций. Жировая ткань может разъедать стенку артерии, снижать эластичность артерии и препятствовать току крови. В итоге, вокруг бляшкообразных отложений могут образовываться тромбы, дополнительно препятствуя току крови, что может привести к полной окклюзии кровеносного сосуда. Обычно атеросклероз связан с повышенными уровнями БОБ-холестерина, Ьр(а) фибриногена и фактора VII, так же как и со сниженным уровнем НЭБ-холестерина. Факторы риска включают более старший возраст, мужской пол, курение, диабет, ожирение, высокий уровень холестерина в крови, диету, богатую жирами, и наличие индивидуального или семейного анамнеза болезни сердца. Он является главной причиной органической ишемии, такой как, например, инфаркт миокарда.

Атерома является наиболее распространенным повреждением артерий, которое далее может осложняться тромбоэмболией. Атероматозные бляшки часто сужают просвет артерий, приводя к ишемии и иногда к атрофии тканей в области с плохим кровоснабжением. Серьезные последствия включают симптом стенокардии вследствие ишемии миокарда, сердечную недостаточность вследствие ишемии или неишемических причин и гипертензию вследствие сужения почечной артерии и плохого кровоснабжения почек, которое физиологически приводит к увеличению секреции ренина.

Иногда атеросклероз и артериосклероз относят к отдельным патологическим состояниям, и, в данном случае, атеросклероз подразумевает уплотнение (склероз) или потерю эластичности артерий конкретно в результате атеромы, хотя атеросклероз представляет собой уплотнение или потерю эластичности артерий в результате любых причин.

Осложнения или последствия атеросклероза включают заболевания коронарных артерий (атеросклероз коронарных артерий), недостаточность кровоснабжения в результате обструкции (ишемия/стенокардия), острый ИМ (инфаркт миокарда, сердечный приступ), транзиторную ишемическую атаку (ΤΙΑ) или инсульт и повреждение кровеносных сосудов, мышечной ткани или органов.

Аневризмы, которые представляют собой постоянные аномальные расширения кровеносных сосудов, также являются широко распространенными последствиями атеросклероза. Атеросклеротические аневризмы брюшной аорты обычно развиваются у пожилых пациентов. Они могут разрываться в забрюшинное пространство. В атеросклеротических аневризмах обычно присутствуют резко выраженная потеря эластичной ткани и фиброз средней оболочки, в основном, в результате ишемии мышечной ткани средней оболочки аорты, сопровождающейся высвобождением макрофагальных ферментов, приводящим к фрагментации эластичных волокон.

Лекарственные средства, рекомендованные для лечения или предотвращения атеросклероза, направлены на снижение уровня липидов/холестерина в крови. В частности, широко применяется терапия, направленная на снижение БОБ-холестерина. В настоящее время наиболее широко применяются статины, специфические ингибиторы НМС СоА-редуктазы. Другие средства, снижающие уровень липидов, включают такие лекарственные средства, как холестирамин, колестипол, никотиновая кислота, гемфиброзил, пробукол, ловастатин и другие.

Другим подходом является минимизирование риска образования тромба на установившемся атероматозном повреждении. Аспирин, который представляет собой специфический ингибитор тромбоксана А2, опосредующего агрегацию тромбоцитов, или антикоагулянты могут применяться для снижения риска образования тромба.

В чрескожной «баллонной ангиопластике» применяется катетер с баллоном на конце для уплощения бляшки и увеличения тока крови после окклюзии. Технология подобна применяемой технологии для открытия артерий сердца, но она может применяться в отношении многих других артерий организма. Стеноз коронарных артерий шунтируют с помощью сегментов подкожной вены, вшитой в проксимальную часть аорты, или с помощью отсечения внутренней грудной артерии со стороны грудной стенки и создания анастомоза ее дистального конца с артерией на передней поверхности сердца.

Хирургическое удаление отложений (эндартерэктомия) может быть рекомендовано в некоторых случаях (например: эндартерэктомия сонной артерии).

Однако основной рекомендацией остается воздействие или контроль над факторами риска, подобно поддержанию диеты с низким содержанием жира, низким содержанием холестерина и низким содержанием соли и с последующими направленными на поддержание здорового состояния рекомендациями в отношении лечения и контроля за гипертонией, диабетом и другими заболеваниями, снижение массы

- 1 005410 тела и прекращение курения, так же как и регулярные физические упражнения для улучшения состояния сердца и кровообращения.

Воспалительный процесс присутствует на различных стадиях атеросклероза (1). Активация эндотелия с помощью ряда факторов, включающих небольшое касательное напряжение, модифицированные липопротеины и провоспалительные цитокины, считается первой стадией атеросклероза и находится под воспалительным контролем (1). Многие недавние исследования показали, что взаимодействия между клетками сосуда и клетками воспаления являются решающими в атерогенезе (1). В частности, ингибирование отдельных провоспалительных путей замедляет развитие атеросклероза (1).

Воспаление также играет главную роль в распаде атеросклеротической бляшки и тромбозе (2-5) и поэтому влияет на появление острых ишемических синдромов и связанную с ними летальность (6). Действительно тяжелые клинические проявления атеросклероза, включающие инфаркты сердца, мозга и любых других органов, пораженных атеросклерозом, в основном, являются результатом окклюзии просвета сосуда тромбом, образованным при взаимодействии с разрушенной атеросклеротической бляшкой (3, 4). Патологические исследования показали, что уязвимые или нестабильные бляшки, т.е. бляшки, склонные к распаду или распадающиеся, сильно отличаются по клеточному и матриксному составу по сравнению со стабильными бляшками, не склонными к распаду (7). Уязвимые бляшки богаты клетками воспаления (макрофаги и Т-лимфоциты), содержат тромбогенное липидное ядро и характеризуются тонким фиброзным верхним слоем с существенным недостатком внеклеточного матрикса (7).

Снижение синтеза коллагена, опосредованное провоспалительным цитокином ΙΡΝ-γ, и повышение активности макрофагальных металлопротеаз, разрушающих матрикс, являются причинами истончения и хрупкости фиброзного верхнего слоя (7). Разрушение хрупкого фиброзного верхнего слоя открывает высокотромбогенное липидное ядро для контакта с циркулирующей кровью и приводит к образованию окклюзивного тромба (1, 7). Поэтому полагают, что плотность клеток воспаления в определенном атеросклеротическом повреждении является хорошим показателем его нестабильности.

Клинический прогноз для пациента с атеросклерозом только частично зависит от размера повреждения (19, 20). В настоящее время широко признано, что качество (состав бляшки), скорее, чем размер повреждения, может быть даже лучшим показателем развития ишемических случаев. Действительно, тяжелые клинические проявления атеросклероза (инфаркты сердца или мозга), в основном, являются результатом окклюзии просвета сосуда тромбом, образованным на поверхности распадающейся атеросклеротической бляшки (19). Патологические исследования показали, что уязвимые или нестабильные бляшки, которые склонны к распаду или распавшиеся, богаты клетками воспаления и характеризуются существенным недостатком содержания гладкомышечных клеток и коллагена (20, 21). Более того, в подобных бляшках обнаружено увеличение апоптотической гибели клеток, ведущей к образованию высокотромбогенного липидного ядра (13, 22).

Провоспалительные цитокины участвуют в воспалении. Цитокин интерлейкин 18 (1Б-18) первоначально был описан как фактор, индуцирующий интерферон-γ (ΙΡΝ-γ) (8). Он представляет собой ранний сигнал развития ответа лимфоцитов Т-хелперов типа 1 (ТН1). 1Б-18 действует совместно с 1Б-12. 1Ь-2, антигенами, митогенами и, возможно, другими факторами, индуцируя продукцию ΙΡΝ-γ. 1Б-18 также усиливает продукцию ОМ-С8Р и 1Ь-2, усиливает пролиферацию Т-клеток, вызванную анти-СО3, и повышает Рак-опосредованную гибель естественных киллеров. Зрелая форма 1Б-18 образуется из его предшественника с помощью 1Ь-^-превращающего фермента (1СЕ, каспаза-1). Рецептор 1Ь-18 состоит по крайней мере из двух компонентов, участвующих в связывании лиганда. Высоко- и низкоаффинные сайты связывания 1Б-18 были найдены на мышиных Т-клетках, стимулированных 1Б-12 (9), предполагая существование многоцепочечного рецепторного комплекса. Две рецепторные субъединицы идентифицированы в настоящий момент, обе принадлежащие к семейству рецептора 1Ь-1 (10). Передача сигнала 1Б-18 включает активацию ΝΡ-кВ (11).

Недавно был выделен растворимый белок, обладающий высокой аффинностью к 1Ь-18, из мочи человека и были клонированы кДНК мыши и человека, так же как и ген человека (12; \УО 99/09063). Белок был назван 1Ь-18-связывающий белок (1Б-18ВР).

1Б-18ВР не является внеклеточным доменом одного из известных рецепторов 1Ь-18, а секретируемым естественно циркулирующим белком. Он принадлежит к новому семейству секретируемых белков, кроме того, включающему различные белки, кодируемые РохуЧгик (12). 1Б-18ВР постоянно экспрессируется в селезенке (12). Мочевой 1Б-18ВР, так же как и рекомбинантный, специфически связывает 1Б-18 с высокой аффинностью и модулирует биологическую аффинность 1Б-18.

Ген 1Б-18ВР расположен на хромосоме человека 11ц13, и в геномной последовательности размером

8,3 т.п.н. не было найдено экзона, кодирующего трансмембранный домен. Четыре варианта сплайсинга или изоформы 1Б-18ВР были найдены у человека и обозначены как 1Б-18ВР а, Ь, с и б, все несущие одинаковые Ν-концевые последовательности и отличающиеся С-концевыми последовательностями (12).

Четыре изоформы 1Б-18ВР человека и две мышиные изоформы, полученные в результате сплайсинга мРНК и найденные в различных библиотеках кДНК, экспрессировали, очищали и оценивали на связывание и нейтрализацию биологической активности 1Б-18 (23). Изоформа 1Б-18ВР человека (1Ь-18ВРа) проявила наи

- 2 005410 большую аффинность к ГЬ-18 с быстрой активацией (гар1б оп-га1с). медленной инактивацией (§1оте оГГ-га1е) и константой диссоциации (К(б)) 399 пМ. 1Ь-18ВРс содержит 1д-домен 1Ь-18ВРа за исключением 29 Сконцевых аминокислот; К(б) для 1Ь-18ВРс в 10 раз меньше (2,94 нМ). Тем не менее, 1Ь-18ВРа и 1Ь-18ВРс нейтрализуют ГЬ-18 >95% при двойном мольном избытке. В изоформах 1Ь-18ВРЬ и 1Б-18ВР0 отсутствует полный 1д-домен и отсутствует способность связывать или нейтрализовать 1Б-18. Мышиные изоформы 1Ь18ВРс и 1Б-18ВРТ обладающие идентичным 1д-доменом, также нейтрализуют >95% мышиного 1Б-18 при двойном мольном избытке. Однако мышиный 1Б-18ВРТ содержащий общую С-концевую последовательность с 1Ь-18ВРа человека, также нейтрализует 1Б-18 человека. Молекулярное моделирование выявило большой смешанный электростатический и гидрофобный сайт связывания на 1д-домене 1Ь-18ВР, который может являться объяснением его высокой аффинности связывания лиганда (23).

Сущность изобретения

Изобретение основано на данных, что ингибитор 1Ь-18 обладает выраженным благотворным воздействием на образование бляшки, развитие бляшки и стабильность бляшки на мышиной модели атеросклероза. Ингибитор 1Ь-18 не только предотвращает образование поражения грудной аорты, но также и индуцирует переключение на фенотип стабильной бляшки для уже сформировавшихся атеросклеротических бляшек.

Поэтому изобретение относится к применению ингибитора 1Ь-18 для получения лекарственных средств для предотвращения и/или лечения атеросклероза. Изобретение, кроме того, относится к способам лечения с генным терапевтическим подходом лечения и/или предотвращения атеросклероза.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлена гистограмма, отражающая процентное значение выживаемости эндотелиальных клеток пупочной вены человека после инкубации только с окисленными липопротеинами или инкубации вместе с комбинацией окисленных липопротеинов с антителами к 1Ь-18 или 1Ь-18ВР, соответственно.

На фиг. 2 представлен Вестерн-блот, проведенный для белковых экстрактов из атеросклеротических артерий в сравнении с контрольными артериями. В Вестерн-блоте применяли антитела против 1Ь-18ВР (ЫЬ18ВР), α-субъединицу рецептора 1Б-18 (ЫЬ-18ВРа), 1Б-18 (ЫЬ-18) и каспазу-1 (Са8разе-1 р10).

На фиг. 3 представлен агарозный гель, окрашенный бромистым этидием, показывающий результат ОТ-ПЦР-анализа мРНК 1Ь-18 и 1Ь-18ВР в клетках атеросклеротической бляшки.

На фиг. 4 представлены результаты ОТ-ПЦР для 1Ь-18ВР и 1Ь-18 в атеросклеротической бляшке по сравнению с экспрессией Ιια-актина (контроль) в симптоматических и асимптоматических бляшках.

На фиг. 5 представлена карта экспрессирующего вектора, использованного для внутримышечного электропереноса у мышей.

На фиг. 6 представлена гистограмма, отражающая площадь липидных пятен в атеросклеротических артериях. Количественный компьютерный анализ изображения липидного отложения. Данные представлены в виде средних величин со станд. ошибкой (п=19 для свободной плазмиды, п=14 для плазмиды, содержащей 1Ь-18ВР). Четырьмя звездочками отмечено р<0,0001.

На фиг. 7 представлена гистограмма, отражающая площадь поражения синуса аорты после обработки с помощью 1Ь-18ВР по сравнению с контролем (свободная плазмида). Количественный компьютерный анализ изображения площади поражения. Данные представлены в виде средних величин со станд. ошибкой (п=19 для свободной плазмиды, п=14 для плазмиды, содержащей 1Ь-18ВР). Двумя звездочками отмечено р<0,01.

На фиг. 8 представлено влияние обработки с помощью 1Ь-18ВР на содержание клеток воспаления в области поражения. Количественный компьютерный анализ изображения применяли для определения процентной величины площадей, положительных по содержанию макрофагов (черные столбики) и количества инфильтрирующих Т-лимфоцитов на мм² (серые столбики) в зонах поражений синуса аорты контрольных (п=12 для окрашивания макрофагов, п=15 для окрашивания Т-лимфоцитов) или обработанных с помощью 1Ь-18ВР мышей (п=13 для макрофагов, п=12 для Т-лимфоцитов). Данные представлены в виде средних величин со станд. ошибкой. Тремя звездочками отмечено р<0,005; и четырьмя звездочками отмечено р<0,0001.

На фиг. 9 представлено влияние обработки 1Ь-18ВР на содержание гладкомышечных клеток и коллагена в области поражения. Количественный компьютерный анализ изображения применяли для определения процентной величины площадей, положительных по содержанию гладкомышечных клеток (черные столбики), и накопления коллагена (серые столбики) в зонах поражений синуса аорты контрольных (п=6 для гладкомышечных клеток, п=11 для коллагена) или обработанных с помощью 1Ь-18ВР мышей (п=6 для гладкомышечных клеток, п=13 для коллагена). Данные представлены в виде средних величин со станд. ошибкой. Одной звездочкой отмечено р<0,05; и двумя звездочками отмечено р<0,01.

Описание изобретения

Изобретение основано на данных о повышенных уровнях циркулирующего 1Б-18 у пациентов с острыми коронарными синдромами и повышенной продукции 1Б-18 в нестабильных атеросклеротических бляшках сонной артерии, ответственных за инсульт. Кроме того, показано, что электроперенос ίη νίνο экспрессирую

- 3 005410 щей плазмидной ДНК, кодирующей 1Б-18ВР, предотвращает развитие жировых полосок в грудной аорте и замедляет прогрессию сформированных атеросклеротических бляшек в синусе аорты на хорошо изученной мышиной модели атеросклероза. Более важно, перенос плазмиды, содержащей 1Б-18ВР. индуцирует сильные изменения в составе бляшки (уменьшение содержания макрофагов, Т-клеток, гибели клеток и содержания липидов и увеличение содержания гладкомышечных клеток и коллагена), приводящие к стабильному фенотипу бляшки. Данные результаты впервые показывают важную роль ингибиторов 1Б-18 в снижении формирования бляшки/прогрессии и в стимулировании стабильности бляшки.

Изобретение также относится к применению ингибитора 1Б-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения атеросклероза.

Термин «предотвращение» в контексте данного изобретения относится не только к полному предотвращению основного последствия, но также и к любому частичному или достаточно существенному предотвращению, ослаблению, уменьшению, снижению или сокращению последствия перед или на ранней стадии начала заболевания.

Термин «лечение» в контексте данного изобретения относится к любому благоприятному воздействию на развитие заболевания, включая ослабление, уменьшение, снижение или сокращение патологического процесса после начала заболевания.

Термин «ингибитор 1Б-18» в контексте данного изобретения относится к любой молекуле, модулирующей продукцию и/или функционирование 1Б-18 таким образом, что продукция и/или функционирование ослабляются, уменьшаются или частично, существенно или полностью предотвращаются или блокируются.

Ингибитор продукции может представлять собой любую молекулу, отрицательно влияющую на синтез, процессинг или созревание 1Б-18. Ингибиторы, рассматриваемые согласно изобретению, могут являться, например, супрессорами экспрессии гена 1Ь-18, антисмысловыми мРНК, уменьшающими или предотвращающими транскрипцию мРНК 1Б-18 или приводящими к деградации мРНК, белками, нарушающими правильную укладку или частично или существенно предотвращающими созревание или секрецию 1Б-18, протеазами, разрушающими 1Б-18 сразу после его синтеза, и подобными. Ингибитор продукции может представлять собой ингибитор каспазы-1 или ингибитор 1СЕ, например, предотвращающий созревание 1Б-18.

Ингибитор функционирования 1Б-18 может представлять собой, например, антагонист 1Б-18. Антагонисты могут как связывать, так и секвестировать саму молекулу 1Б-18 с достаточной аффинностью и специфичностью для частичной или существенной нейтрализации 1Б-18 или сайтов связывания 1Ь-18, ответственных за связывание 1Б-18 с его лигандами (такими как, например, его рецепторами). Антагонист также может ингибировать путь передачи сигнала 1Б-18, активирующийся в клетках при связывании 1Ь-18/рецептор.

Ингибиторы функционирования 1Б-18 могут также представлять собой растворимые рецепторы 1Ь18 или молекулы, имитирующие рецепторы, или вещества, блокирующие рецепторы 1Б-18, антитела против 1Б-18, такие как, например, моноклональные антитела, или любое другое вещество или молекулу, предотвращающие связывание 1Б-18 со своими мишенями, таким образом ослабляя или предотвращая запуск внутри- или внеклеточных реакций, опосредованных 1Б-18.

Атеросклерозом также называют артериосклероз или уплотнение артерий. Согласно контексту настоящего изобретения термин «атеросклероз» включает в себя все заболевания или болезненные состояния артерий, обычно описываемые как атеросклероз, в ходе которых липидное вещество откладывается на сосудистой стенке, в итоге приводя к сужению и ухудшению тока крови, так же как и к разрыву и/или эрозии с формированием тромба.

Согласно настоящему изобретению атеросклероз означает как уплотнение, так и потерю эластичности артерий в результате атеромы (атеросклероз) и в результате любой другой причины (артериосклероз). Патологические факторы атеросклероза, так же как и осложнения или последствия, которые подразумевается включить в применяемый в описании изобретения термин «атеросклероз», подробно описаны выше в «уровне техники».

Прогрессирование атеросклероза включает образование атеросклеротических бляшек и их переход во все более и более нестабильные формы. Поэтому изобретение также относится к применению ингибитора 1Б-18 для получения лекарственного средства, снижающего или предупреждающего прогрессирование атеросклероза.

Окклюзия сосуда тромбом, сформировавшимся на атеросклеротической бляшке, является решающим событием для инфарктов сердца или мозга, которые находятся в числе наиболее серьезных последствий атеросклероза. Поэтому изобретение также относится к применению ингибитора ГЛ-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения тромбоза на атеросклеротической бляшке.

Стабильность бляшки оказывает влияние на преобразование атеросклеротической бляшки в неблагоприятную или уязвимую бляшку, которая склонна к инициированию тромбоза. Поэтому изобретение, кроме того, относится к применению ингибитора 1Б-18 для получения лекарственного средства для предотвращения и/или лечения нестабильности атеросклеротической бляшки.

- 4 005410

Нестабильная бляшка склонна к распаду, и распад бляшки может привести к тромбозу. Поэтому изобретение, кроме того, относится к применению ингибитора 1Ь-18 для получения лекарственного средства для предотвращения эрозии или распада атеросклеротической бляшки.

Нестабильность бляшки и тромбоз, например, могут быть результатом апоптотической гибели клеток, которая приводит к высокой прокоагулянтной активности и может являться ключевым событием, приводящим к тромбозу эрозированных или распавшихся бляшек, так же как и к эмболическим процессам (13, 14). Показано, что окисленные липопротеины (охЬПЬ) индуцируют апоптоз макрофагов и эндотелиальных клеток в культуре (15). Как показано на примерах ниже, в настоящее время установлено, что ингибитор 1Ь-18 способен значительно снижать гибель клеток, индуцированных охЬПЬ.

Согласно настоящему изобретению неожиданно было установлено, что уровни 1Ь-18 в крови были значительно повышены у пациентов с сердечной недостаточностью, страдающих от рецидивирующих явлений, таких как, например, смерть, рекуррентная ишемия, реваскуляризация, прогрессирование атеросклероза или периодически повторяющаяся госпитализация по поводу сердечной недостаточности, по сравнению с пациентами, не требующими повторной госпитализации. Данное повышение уровня Ш-18 особенно характерно для пациентов, которые умерли спустя некоторое время, по сравнению с выжившими больными. Повышенные уровни 1Ь-18 в крови наблюдались как у пациентов с ишемией, так и у пациентов без ишемии.

Поэтому изобретение также относится к применению ингибитора 1Ь-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения рецидивирующих случаев сердечной недостаточности. Рецидивирующие случаи могут представлять собой любые случаи сердечной недостаточности, такие как смерть, рекуррентная ишемия, реваскуляризация, прогрессирование атеросклероза или периодически повторяющаяся госпитализация по поводу сердечной недостаточности.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения сердечная недостаточность является ишемической, т.е. результатом ишемии миокарда.

Согласно другому предпочтительному воплощению сердечная недостаточность является неишемической, например, в результате системной гипертензии, порока клапана сердца или заболевания легких, приводящих к правой и затем застойной сердечной недостаточности.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения ингибитор 1Ь-18 выбран из группы, включающей 1СЕ-ингибиторы, антитела против 1Ь-18, антитела против любой из субъединиц рецептора 1Ь-18, ингибиторы передачи сигнала от рецептора 1Ь-18, антагонисты 1Ь-18, которые конкурируют с 1Ь-18 и блокируют рецептор 1Ь-18, и белки, связывающие 1Ь-18, изоформы, мутеины, гибридные белки, функциональные производные, активные фракции или их производные с круговой перестановкой, обладающие такой же активностью.

Применяемый здесь термин «мутеины» относится к аналогам 1Ь-18ВР или аналогам вирусного 1Ь18ВР, в котором один или несколько аминокислотных остатков нативного 1Ь-18ВР или вирусного 1Ь18ВР замещены различными аминокислотными остатками или отсутствуют или один или несколько аминокислотных остатков добавлены к нативной последовательности 1Ь-18ВР или вирусному 1Ь-18ВР без значительного изменения активности полученных продуктов по сравнению с исходным типом 1Ь18ВР или вирусным Ю-18ВР. Данные мутеины получают с помощью известных способов синтеза и/или сайт-специфического мутагенеза или любых известных способов, пригодных для применения в настоящем изобретении.

Любой подобный мутеин предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, достаточно повторяющую последовательность 1Ь-18ВР или достаточно повторяющую вирусный 1Ь-18ВР, такой, чтобы обладать в значительной степени сходной активностью с 1Ь-18ВР. Одним проявлением активности 1Ь-18ВР является его способность связывания 1Ь-18. Насколько мутеин обладает достаточной связывающей активностью по отношению к 1Ь-18ВР, настолько он может применяться для очистки 1Ь-18, например, с помощью аффинной хроматографии и, таким образом, можно считать, обладает достаточно схожей активностью с 1Ь-18ВР. Таким образом, можно определить у любого данного мутеина наличие достаточно схожей активности с 1Ь-18ВР посредством обычного экспериментирования, подвергая подобный мутеин, например, простому конкурентному сэндвич-анализу для установления способности связывания соответствующим образом меченного 1Ь-18, например радиоиммуноанализу или анализу ЕЫ8А.

Мутеиновые полипептиды 1Ь-18ВР или мутеины вирусных 1Ь-18ВР, которые могут применяться согласно настоящему изобретению, или кодирующая их нуклеиновая кислота включают ограниченный набор значительно совпадающих последовательностей как замещающих пептидов или полинуклеотидов, которые могут быть просто получены специалистом в данной области без большого количества экспериментов, основываясь на принципах и руководстве, представленных в описании изобретения.

Предпочтительные модификации мутеинов согласно настоящему изобретению представляют собой замены, известные как «консервативные». Консервативные аминокислотные заместители полипептидов 1Ь-18ВР, или белков, или вирусных 1Ь-18ВР могут включать синонимичные аминокислоты в пределах группы, обладающей достаточно схожими физико-химическими свойствами, так что при замещении одного члена группы другим будет сохраняться биологическая функция молекулы (16). Понятно, что также

- 5 005410 можно осуществить вставки и делеции аминокислот в вышеуказанных последовательностях без изменения их функции, особенно если вставки или делеции содержат только небольшое количество аминокислот, например менее тридцати и предпочтительно менее десяти, и без удаления или перемещения аминокислот, являющихся решающими в функциональной структуре, например остатков цистеина. Белки и мутеины, полученные с помощью подобных делеций и/или вставок, входят в объем настоящего изобретения.

Предпочтительно синонимичные аминокислотные группы представляют собой указанные в табл. 1. Более предпочтительно синонимичные аминокислотные группы указаны в табл. 2; и наиболее предпочтительные синонимичные аминокислотные группы указаны в табл. 3.

Таблица 1 Предпочтительные группы синонимичных аминокислот

Аминокислота Синонимичная группа

Зег	Зег,	ТЬг,	С1у,	Азп
Агд	Агд,	61п,	Ьуз,	С1и,	Ηί3
Ьеи	11е,	РЬе,	Туг,	МеЬ,	Уа1, Ьеи
Рго	С1у,	А1а,	ТЬг,	Рго
ТЬг	Рго,	Зег,	А1а,	С1у,	Низ, С1п,	ТЬг
А1а	С1у,	ТЬг,	Рго,	А1а
Уа1	МеЬ,	Туг,	РЬе,	11е,	Ьеи, Уа1
<31у	А1а,	ТЬг,	Рго,	Зег,	С1у
11е	МеЬ,	Туг,	РЬе,	Уа1,	Ьеи, 11е
РЬе	Тгр,	МеЬ,	Туг,	11е,	Уа1, Ьеи,	РЬе
Туг	Тгр,	Мер,	РЬе,	11е,	Уа1, Ьеи,	Туг

Суз 8ег, ТЬг, Суз

ΗΪ3 С1и, Ьуз, С1п, ТЬг, Агд, Ηίβ

О1п С1и, Ьуз, Азп, Ηί3, ТЬг, Агд, С1п

Азп С1п, Азр, Зег, Азп

Ьуз С1и, С1п, НЬз, Агд, Ьуз

Азр 51и, Азп, Азр

С1и Азр, Ьуз, Азп, С1п, ΗΪ3, Агд, С1и

МеЬ РЬе, Не, Уа1, Ьеи, МеЬ

Тгр Тгр

Таблица 2

Более предпочтительные группы синонимичных аминокислот

Аминокислота	Синонимичная группа
Зег	Зег
Агд	ΗΪ3,	Ьуз,	Агд
Ьеи	Ьеи,	11е,	РЬе,	. МеЬ
Рго	А1а,	Рго
ТЬг	ТЬг
А1а	Рго,	А1а
Уа1	Уа1,	Ме£,	11е
С1у	С1у
Не	11е,	МеЬ,	РЬе,	, Уа1,
РЬе	МеЬ,	Туг,	11е,	, Ьеи,
Туг	РЬе,	Туг
Суз	Суз,	Зег
Ηίδ	ΗΪ3,	С1п,	Агд
С1п	С1и,	С1п,	ΗΪ5
Азп	Азр,	Азп
Ьуз	Ьуз,	Агд
Азр	Авр,	Азп
С1и	С1и,	С1п
МеС	МеЬ,	РЬе,	11е,	Уа1,
Тгр	Тгр

- 6 005410

Таблица 3

Наиболее предпочтительные группы синонимичных аминокислот

Примеры проведения замещений аминокислот в белках, которые могут применяться для получения мутеиновых полипептидов, или белков 1Б-18ВР, или мутеиновых вирусных 1Б-18ВР для применения согласно настоящему изобретению, включают любые известные стадии способов, таких как представленные в патентах США 4959314, 4588585 и 4737462 Магк е! а1.; 5116943 Κοίΐικ е! а1.; 4965195 Ыатеп е! а1.; 4879111 Сйопд е! а1.; и 5017691 Ьее е! а1.; и белки, замещенные по лизину, представленные в патенте США № 4904584 (8йате е! а1.).

Термин «гибридный белок» относится к полипептиду, содержащему Ш-18ВР, или вирусный Ш18ВР, или их мутеин, слитые с другим белком, который, например, обладает продолжительным периодом пребывания в жидких средах организма. Ш-18ВР и вирусный Ш-18ВР могут подобным образом быть присоединены к другому белку, полипептиду или подобному, например иммуноглобулину или его фрагменту.

Применяемый термин «функциональные производные» включает производные Ш-18ВР или вирусного 1Б-18ВР и их мутеинов и гибридных белков, которые могут быть получены из функциональных групп, которые располагаются в виде боковых цепей на остатках или Ν-, или С-концевых групп с помощью известных в данной области способов и включены в изобретение, пока они остаются фармацевтически приемлемыми, т.е. они не нарушают активности белка, которая достаточно схожа с активностью Ш18ВР или вирусных Ш-18ВР, и не придают токсических свойств содержащей их композиции. Данные производные могут, например, включать полиэтиленгликольные боковые цепи, которые могут маскировать антигенные сайты и увеличивать пребывание Ш-18ВР или вирусного Ш-18ВР в жидких средах организма. Другие производные включают алифатические сложные эфиры карбоксильных групп, амиды карбоксильных групп, полученные взаимодействием аммиака с первичными или вторичными аминами, Ν-ацильные производные свободных аминогрупп аминокислотных остатков, полученные с помощью ацильных групп (например, алканоил или карбоциклические ароильные группы), или О-ацильные производные свободных гидроксильных групп (например, гидроксильные группы остатков серина или треонила), полученные с помощью ацильных групп.

Под термином «активные фракции» 1Б-18ВР или вирусного Ш-18ВР, мутеинов и гибридных белков настоящее изобретение подразумевает любой фрагмент или предшественники полипептидной цепи белковой молекулы отдельно или вместе со связанными молекулами или остатками, присоединенными к ним, например остатками сахаров или фосфатными остатками, или агрегатами самой белковой молекулы или остатков сахаров, обеспечивая, чтобы указанная фракция обладала достаточно схожей активностью с Ш-18ВР.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения ингибитор Ш-18 представляет собой антитело против Ш-18. Антитела против Ш-18 могут быть поликлональными или моноклональными, химерными, гуманизированными или даже полностью человеческими. Рекомбинантные антитела или их фрагменты характеризуются высокой аффинностью связывания с Ш-18 ίη νίνο и низкой токсичностью. Антитела, которые могут применяться согласно изобретению, характеризуются по их способности лечения пациентов в течение периода, достаточного для достижения от хорошей до превосходной степени

- 7 005410 регрессии или ослабления патогенного состояния или любого симптома или группы симптомов, связанных с патогенным состоянием, и низкой токсичностью.

Нейтрализующие антитела легко получают от животных, таких как кролики, коза или мыши, путем иммунизации с помощью 1Ь-18. Иммунизированные мыши являются особенно пригодными для обеспечения источников В-клеток для получения гибридом, которые по очереди культивируют для получения больших количеств моноклональных антител против 1Ь-18.

Химерные антитела представляют собой молекулы иммуноглобулина, характеризующиеся двумя или несколькими сегментами или частями, полученными от различных видов животных. Обычно вариабельную область химерного антитела получают из антитела млекопитающего, не человека, такого как мышиное моноклональное антитело, и константную область иммуноглобулина получают из молекулы иммуноглобулина человека. Предпочтительно обе области и комбинация обладают низкой иммуногенностью, что определяется обычным образом (24). Гуманизированные антитела представляют собой молекулы иммуноглобулина, созданные с помощью генно-инженерных технологий, в которых константная область мыши замещена эквивалентной областью человека, при этом сохраняя антигенсвязывающие регионы мыши. Полученное химерное антитело мышь-человек предпочтительно обладает пониженной иммуногенностью и улучшенными фармакокинетическими свойствами у человека (25).

Таким образом, согласно другому предпочтительному воплощению антитело против 1Б-18 представляет собой гуманизированное антитело против 1Б-18. Предпочтительные примеры гуманизированных антител против 1Б-18 описаны, например, в заявке на выдачу европейского патента ЕР 0974600.

Согласно еще другому предпочтительному воплощению антитело против 1Ь-18 является полностью человеческим. Технология получения антител человека описана подробно, например, в XVО 00/76310, ХУО 99/53049, И8 6162963 или ЛИ 5336100. Полностью человеческие антитела являются предпочтительно рекомбинантными антителами, продуцируемыми трансгенными животными, например химерными мышами, содержащими полностью или части функциональных локусов 1д человека.

Согласно очень предпочтительному воплощению настоящего изобретения ингибитор 1Ь-18 представляет собой 1Ь-18ВР или его изоформу, мутеин, гибридный белок, функциональное производное, активную фракцию или производное с круговой перестановкой. Данные изоформы, мутеины, гибридные белки или функциональные производные сохраняют биологическую активность 1Ь-18ВР, особенно связывания с 1Ь-18, и предпочтительно обладают, по крайней мере, существенной активностью, сходной с 1Ь-18ВР. Идеально, подобные белки обладают биологической активностью, которая даже повышена по сравнению с неизмененным 1Ь-18ВР. Предпочтительные активные фракции обладают активностью более высокой, чем активность 1Ь-18ВР, или имеющей дополнительные преимущества, подобные более высокой стабильности или более низкой токсичности или иммуногенности, или их легче получить в большом количестве или легче очистить.

Последовательности 1Ь-18ВР и его вариантов/изоформ сплайсинга могут быть взяты из νθ 99/09063 или из (12), так же как и из (23).

Функциональные производные 1Ь-18ВР могут быть присоединены к полимерам для улучшения свойств белка, таких как стабильность, полупериод существования, биодоступность, толерантность в отношении организма человека или иммуногенность. Для выполнения данной цели 1Ь-18ВР может быть присоединен, например, к полиэтиленгликолю (РЕО). Присоединение РЕО может проводиться с помощью известных способов, описанных, например, в νθ 92/13095.

Поэтому согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения 1Ь-18ВР присоединен к РЕО.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения ингибитор 1Ь-18 представляет собой гибридный белок, содержащий целиком 1Ь-18-связывающий белок или его часть, которая присоединена к целому иммуноглобулину или его части. Специалисту в данной области будет понятно, что полученный гибридный белок сохраняет биологическую активность 1Ь-18ВР, в частности, связывания с 1Ь-

18. Слияние может быть прямым или посредством короткого линкерного белка, который может быть коротким длиной от 1 до 3 аминокислотных остатков или длиннее, например длиной 13 аминокислотных остатков. Указанный линкер может быть трипептидом с последовательностью, например, Е-Р-М (О1иР11с-Мс1) или с линкерной последовательностью в 13 аминокислот, включающей О1и-Рйе-О1у-А1а-О1уЕеи-Уа1-Ееи-О1у-О1у-О1п-Рйе-Ме1, встроенной между последовательностью 1Ь-18ВР и последовательностью иммуноглобулина. Полученный гибридный белок обладает улучшенными свойствами, такими как увеличенный период пребывания в жидких средах организма (полупериод существования), повышенная специфическая активность, повышенный уровень экспрессии или облегчение очистки гибридного белка.

Согласно предпочтительному воплощению 1Ь-18ВР присоединяют к константной области молекулы 1д. Предпочтительно, проводят присоединение к области тяжелых цепей, например, подобно СН₂ и СН₃-доменам 1дО1 человека. Получение специфических гибридных белков, содержащих 1Ь-18ВР и часть иммуноглобулина, например, описаны в примере 11 VР 99/09063. Другие изоформы молекулы 1д также пригодны для получения гибридных белков согласно настоящему изобретению, такие как изоформы 1дО₂ или 1дО₄, или другие классы 1д, например, подобно 1дМ или 1дА. Гибридные белки могут быть мономерными или мультимерными, гетеро- или гомомультимерными.

- 8 005410

Интерфероны преимущественно известны по эффектам ингибирования вирусной репликации и клеточной пролиферации. Интерферон-γ, например, играет важную роль в развитии иммунного и воспалительного ответов. Указывают, что интерферон-β (ΙΕΝ-β, интерферон типа I) играет противовоспалительную роль.

Изобретение также относится к применению комбинации ингибитора 1Б-18 и интерферона для получения лекарственного средства для лечения атеросклероза.

Интерфероны также могут быть присоединены к полимерам для улучшения стабильности белков. Конъюгат интерферона-β и полиола полиэтиленгликоля (РЕС), например, описан в νΟ 99/55377.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения интерферон представляет собой интерферон-β (ΙΕΝ-β) и, более предпочтительно, ΙΕΝ-β 1а.

Ингибитор продукции и/или функции 1Б-18 предпочтительно применяют одновременно, последовательно или отдельно с интерфероном.

Согласно еще другому воплощению изобретения ингибитор 1Ь-18 применяют в сочетании с антагонистом ΤΝΕ. Антагонисты Т№ проявляют свою активность различными путями. Первый: антагонисты могут связывать или секвестировать саму молекулу ΤΝΕ с достаточной аффинностью и специфичностью для частичной или значительной нейтрализации эпитопа ΤΝΕ или эпитопов, ответственных за связывание с рецептором ΤΝΕ (здесь и далее называемые «секвестирующие антагонисты»). Секвестирующие антагонисты могут, например, быть антителом против ΤΝΕ.

Альтернативно, антагонисты ΤΝΕ могут ингибировать путь передачи сигнала ΤΝΕ, активирующийся с помощью рецептора на поверхности клетки после связывания ΤΝΕ (здесь и далее называемые «сигнальные антагонисты»). Обе группы антагонистов являются приемлемыми как по отдельности, так и вместе, в сочетании с ингибитором 1Ь-18 при лечении атеросклероза.

Антагонисты ΤΝΕ легко распознаются и оцениваются с помощью обычного отбора кандидатов по их влиянию на активность нативного ΤΝΕ на чувствительных клеточных линиях ίη νίίτο, например Вклетках человека, в которых ΤΝΕ вызывает пролиферацию и секрецию иммуноглобулинов. Анализ включает состав ΤΝΕ при различных разведениях кандидата-антагониста, например, от 0,1 до 100кратного мольного количества ΤΝΕ, применяемого для анализа, и контроли с отсутствием ΤΝΕ или только антагонистом (26).

Секвестирующими антагонистами являются предпочтительные антагонисты ΤΝΕ, применяемые согласно настоящему изобретению. Среди секвестирующих антагонистов предпочтительными являются такие полипептиды, которые связывают ΤΝΕ с высокой аффинностью и обладают низкой иммуногенностью. Растворимые молекулы рецептора ΤΝΕ и нейтрализующие антитела против ΤΝΕ являются особенно предпочтительными. Например, растворимый ΤΝΕ-ΚΙ и ΤΝΕ-ΚΙΙ являются пригодными согласно настоящему изобретению. Усеченные формы данных рецепторов, включающие внеклеточные домены рецепторов или их функциональные части, представляют собой особенно предпочтительные антагонисты согласно настоящему изобретению. Усеченные растворимые рецепторы ΤΝΕ типа Ι и ΤΝΕ типа ΙΙ, например, описаны в ЕР914431.

Усеченные формы рецепторов ΤΝΕ растворимы и определяемы в моче и сыворотке как 30 кДа и 40 кДа ингибиторные белки, связывающие ΤΝΕ, которые обозначаются ΤΒΡΙ и ΤΒΡΙΙ, соответственно (27). Согласно изобретению предпочтительно одновременное, последовательное или отдельное применение ингибитора ТИ-18 с антагонистом ΤΝΕ и/или интерфероном.

Согласно изобретению ΤΒΡΙ и ΤΒΡΙΙ являются предпочтительными антагонистами ΤΝΕ, применяемыми в сочетании с ингибитором ΙΕ-18. Производные, фрагменты, области и биологически активные участки молекулы рецепторов функционально имеют сходство с молекулами рецепторов и также могут применяться в настоящем изобретении. Подобный биологически активный эквивалент или производное молекулы рецептора относится к участку полипептида или последовательности, кодирующей молекулу рецептора, который имеет существенный размер и способен связывать ΤΝΕ с такой аффинностью, что взаимодействие с мембраносвязанным рецептором ΤΝΕ ингибируется или блокируется.

Согласно дополнительному предпочтительному воплощению растворимый ΤΝΕ-ΚΙ (ΤΒΡΙ) человека представляет собой антагонист ΤΝΕ, применяемый согласно изобретению. Нативные и рекомбинантные молекулы растворимого рецептора ΤΝΕ и способы их получения описаны в европейских патентах ЕР 308378, ЕР 398 327 и ЕР 433900.

Ингибитор ГБ-18 может применяться одновременно, последовательно или отдельно от ингибитора ΤΝΕ. Преимущественно применяется комбинация антитела против ТБ-18 или антисыворотка и растворимый рецептор ΤΝΕ, обладающий ингибирующей активностью по отношению к ΤΝΕ.

Согласно другому предпочтительному воплощению изобретения лекарственное средство дополнительно включает ингибитор СОХ, предпочтительно ингибитор СОХ-2. Ингибиторы СОХ известны в данной области. Конкретные ингибиторы СОХ-2 описаны, например, в νθ 01/00229.

Ингибиторы тромбоксана, в частности тромбоксана А2, в настоящее время широко применяются для лечения атеросклероза. Следовательно, согласно другому предпочтительному воплощению изобретения лекарственное средство дополнительно включает ингибитор тромбоксана, и в частности ингибитор

- 9 005410 тромбоксана А2, для одновременного, последовательного или отдельного применения. Согласно изобретению особенно предпочтительным является применение аспирина в сочетании с ингибитором ГБ-18.

Одной из причин атеросклероза становится наличие высокой концентрации липидов в крови. Следовательно, согласно другому предпочтительному воплощению лекарственное средство дополнительно включает агент, снижающий уровень липидов, для одновременного, последовательного или отдельного применения. Любой агент, снижающий уровень липидов, известный в данной области, может применяться согласно изобретению, такой как следующие агенты, снижающие уровень липидов, включающие лекарственные средства, такие как холестирамин, колестипол, никотиновая кислота, гемфиброзил, пробукол и другие. Особенно предпочтительными являются ингибиторы НМО СоА-редуктазы и предпочтительно так называемые статины. Многие статины являются известными в данной области, такие как симвастатин или ловастатин.

Для улучшения предотвращения и/или лечения атеросклероза предпочтительное воплощение изобретения относится к применению ингибитора ГБ-18 в сочетании с диетой с низким содержанием жира, и/или холестерина, и/или соли.

Согласно предпочтительному воплощению настоящего изобретения ингибитор ГБ-18 применяют в дозе приблизительно от 0,0001 до 10 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,01 до 5 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,1 до 3 мг/кг массы тела, или приблизительно от 1 до 2 мг/кг массы тела. Согласно еще одному предпочтительному воплощению ингибитор ГБ-18 применяют в дозе приблизительно от 0,1 до 1000 мкг/кг массы тела, или от 1 до 100 мкг/кг массы тела, или от 10 до 50 мкг/кг массы тела.

Изобретение, кроме того, относится к применению экспрессирующего вектора, содержащего последовательность, кодирующую ингибитор ГБ-18, для получения лекарственного средства для предотвращения и/или лечения атеросклероза. Таким образом, для лечения и/или предотвращения заболевания применяются подходы генной терапии. Преимущественно, экспрессия ингибитора ГБ-18 далее будет проходить ίη δίΐιι. таким образом эффективно блокируя ГБ-18 непосредственно в ткани(ях) или клетках, подверженных этому заболеванию.

Как подробно изложено в примерах ниже, показано, что эффективная экспрессия ГБ-18ВР может быть представлена на мышиной модели заболевания после электропереноса экспрессирующего вектора, содержащего последовательность, кодирующую ГБ-18ВР.

Следовательно, согласно предпочтительному воплощению экспрессирующий вектор вводят с помощью электропереноса, предпочтительно внутримышечно.

Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенной продукции ингибитора ГБ-18 в клетке, обычно не экспрессирующей ингибитор ГБ-18 или в которой количество экспрессируемого ингибитора не существенно, также рассматривается согласно изобретению. Вектор может содержать регуляторные последовательности, функционирующие в клетках, в которых желательна экспрессия ингибитора 1Ь-

18. Подобные регуляторные последовательности могут, например, содержать промоторы или энхансеры. Регуляторная последовательность далее может быть встроена в правильный локус генома путем гомологичной рекомбинации, таким образом реально связывая регуляторную последовательность с геном, экспрессию которого необходимо индуцировать или усилить. Технологию обычно относят к «эндогенной активации гена» (БОА), и она описана, например, в \УО 91/09955.

Специалисту в данной области будет понятно, что также возможно прекратить экспрессию ГБ-18, применяя такие же способы, т.е. с помощью встраивания отрицательно регулирующего элемента, например сайленсера, в локус гена ГБ-18, таким образом, приводя к отрицательной регуляции или прекращению экспрессии ГБ-18. Специалисту в данной области будет понятно, что подобная отрицательная регуляция или подавление экспрессии ГБ-18 имеет такой же эффект, что и применение ингибитора ГБ-18 для предотвращения и/или лечения заболевания.

Изобретение, кроме того, относится к применению клетки, генетически модифицированной, для продукции ингибитора ГБ-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения атеросклероза.

Изобретение, кроме того, относится к фармацевтическим композициям, особенно пригодным для предотвращения и/или лечения атеросклероза, которые включают терапевтически эффективное количество ингибитора ГБ-18 и терапевтически эффективное количество интерферона. В качестве ингибитора ГБ-18 композиция может включать ингибиторы каспазы-1, антитела против ГБ-18, антитела против любой из субъединиц рецептора ГБ-18, ингибиторы пути передачи сигнала ГБ-18, антагонисты ГБ-18, конкурирующие с ГБ-18 и блокирующие рецептор ГБ-18, и белки, связывающие ГБ-18, их изоформы, мутеины, гибридные белки, функциональные производные, активные фракции или производные с круговой перестановкой, обладающие такой же активностью.

ГБ-18ВР и их изоформы, мутеины, гибридные белки, функциональные производные, активные фракции и производные с круговой перестановкой, описанные выше, являются предпочтительными активными составляющими фармацевтических композиций.

Интерферон, входящий в фармацевтическую композицию, предпочтительно представляет собой ГБЫ-β.

- 10 005410

Согласно еще другому предпочтительному воплощению фармацевтическая композиция включает терапевтически эффективное количество ингибитора 1Ь-18, необязательно интерферон и антагонист ΤΝΡ. Антагонисты ΤΝΡ могут являться антителами, нейтрализующими активность ΤΝΡ или растворимыми усеченными фрагментами рецептора ΤΝΡ, также обозначаемыми ΤΡΒΙ и ΤΡΒΙΙ. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может дополнительно содержать один или несколько ингибиторов СОХ, предпочтительно ингибиторы СОХ-2. Фармацевтическая композиция согласно изобретению может дополнительно содержать ингибитор тромбоксана, такой как аспирин, и/или вещество, снижающее уровень липидов, такое как статин.

Определение «фармацевтически приемлемый» означает включение любого носителя, который не препятствует эффективности биологической активности активного компонента и не является токсичным по отношению к хозяину, которому он вводится. Например, для парентерального введения активные белки могут быть сформированы в стандартную дозированную форму для инъекций вместе с носителями, такими как солевой раствор, раствор декстрозы, сывороточный альбумин и раствор Рингера.

Активные компоненты фармацевтической композиции согласно изобретению могут вводиться индивидуально различными путями. Пути введения включают внутрикожный, чрескожный (например, при медленно высвобождающихся составах), внутримышечный, внутрибрюшинный, внутривенный, подкожный, пероральный, эпидуральный, местный и интраназальный путь. Может применяться любой другой терапевтически эффективный путь введения, например абсорбция через эпителиальные или эндотелиальные ткани или путем генной терапии, при котором молекула ДНК, кодирующая активный компонент, вводится пациенту (например, с помощью вектора), что приводит к экспрессии активного компонента и секреции ίη νΐνο. Кроме того, белок (белки) согласно изобретению могут вводиться вместе с другими компонентами биологически активных препаратов, такими как фармацевтически приемлемые сурфактанты, эксципиенты, наполнители, разбавители и носители.

Для парентерального введения (например, внутривенного, подкожного, внутримышечного) активный белок (белки) может быть представлен в форме раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизованного порошка в сочетании с фармацевтически приемлемым парентеральным носителем (например, водой, солевым раствором, раствором декстрозы) и добавками, поддерживающими изотоничность (например, маннитом) или химическую стабильность (например, консервантами или буферами). Форму стерилизуют с помощью обычно применяемых способов.

Биодоступность активного белка (белков) согласно изобретению также можно улучшить с помощью способов присоединения, которые увеличивают полупериод существования молекулы в организме человека, например присоединением молекулы к полиэтиленгликолю, как описано в РСТ-заявке на выдачу патента \¥О 92/13095.

Терапевтически эффективное количество активного белка (белков) может быть функцией многих переменных, включая тип антагониста, аффинность антагониста к 1Б-18. какую-либо остаточную цитотоксическую активность, проявляемую антагонистом, путь введения, клиническое состояние пациента (включая желательность поддержания нетоксичного уровня активности эндогенного 1Ь-18).

«Терапевтически эффективное количество» является таким, что при введении ингибитора 1Ь-18 наблюдается ингибирование биологической активности 1Ь-18. Вводимая доза в виде одной или многократной дозы пациенту будет изменяться в зависимости от ряда факторов, включающих фармакокинетические свойства ингибитора 1Б-18. путь введения, состояние пациента и характеристики (пол, возраст, масса тела, состояние здоровья, размер), выраженность симптомов, сопутствующая терапия, частота лечения и желаемый эффект. Подбор и манипулирование установленными границами дозирования входят в компетенцию специалиста в данной области, так же как и способами определения ίη νίίτο и ίη νΐνο ингибирования 1Ь-18 у пациента.

Согласно изобретению ингибитор 1Ь-18 применяют в количестве приблизительно от 0,0001 до 10 мг/кг, или приблизительно от 0,01 до 5 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,1 до 3 мг/кг массы тела, или приблизительно от 1 до 2 мг/кг массы тела. Другое предпочтительное количество ингибиторов 1Ь-18 составляет приблизительно от 0,1 до 1000 мкг/кг массы тела, или приблизительно от 1 до 100 мкг/кг массы тела, или от 10 до 50 мкг/кг массы тела.

Путь введения, являющийся предпочтительным согласно изобретению, представляет собой введение подкожным путем. Внутримышечное введение является другим предпочтительным путем согласно изобретению.

Согласно другим предпочтительным воплощениям ингибитор 1Ь-18 вводится ежедневно или через день.

Суточные дозы обычно даются в разделенных дозах или в форме с замедленным высвобождением для достижения желаемых результатов. Вторые или последующие введения могут проводиться в такой же дозированной форме в меньшей или большей дозе по сравнению с начальной или предыдущей дозой, вводимой пациенту. Второе или последующее введение может проводиться в ходе или перед началом заболевания.

Согласно изобретению ингибитор 1Ь-18 может вводиться профилактически или терапевтически пациенту перед, одновременно или последовательно с другими терапевтическими схемами или препарата

- 11 005410 ми (например, схема, включающая несколько лекарств) в терапевтически эффективном количестве. Активные вещества, вводимые одновременно с другими терапевтическими препаратами, могут вводиться в одной или различных композициях.

Изобретение, кроме того, относится к способу лечения и/или предотвращения атеросклероза, включающему введение нуждающемуся в этом хозяину эффективного ингибирующего количества ингибитора Ш-18.

Изобретение, кроме того, относится к способу предотвращения и/или лечения атеросклероза, включающему введение нуждающемуся в этом хозяину экспрессирующего вектора, содержащего последовательность, кодирующую ингибитор 1Б-18.

Согласно предпочтительному воплощению изобретения экспрессирующий вектор вводят системно и более предпочтительно с помощью внутримышечных инъекций.

Изобретение, кроме того, относится к применению ΣΗ-18 как диагностического маркера плохого клинического прогноза сердечной недостаточности. Плохой клинический прогноз включает любое ухудшение состояния пациента, подобно рецидивным явлениям или даже смерти, последующей за первым инфарктом миокарда.

Предпочтительно ΣΗ-18 применяют как диагностический маркер рецидивирующих случаев после первого проявления сердечной недостаточности. Рецидивирующие случаи включают, но не ограничиваются, смерть, рекуррентную ишемию, реваскуляризацию, прогрессию атеросклероза или периодически повторяющуюся госпитализацию по поводу сердечной недостаточности.

Только что описанное изобретение будет более легко понятно с помощью ссылки на последующие примеры, которые представлены для иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

Примеры

Материалы и методы

Образцы

Собирали 41 атеросклеротическую бляшку человека, удаленные у 36 пациентов, подвергшихся эндартерэктомии сонной артерии. Для контроля 2 сонные артерии и 3 внутренние грудные артерии, не пораженные атеросклерозом (2 с минимальными фибромышечными уплотнениями), получали путем аутопсии или в ходе операции коронарного шунтирования. Их быстро погружали в жидкий азот и хранили при -80°С. Бляшки, которые применяли для экстракции белка и РНК, быстро промывали, погружали в жидкий азот перед помещением на хранение при -80°С. Для иммуногистохимических исследований бляшки помещали на 2 ч в свежеприготовленный 4% параформальдегид, далее переносили в 30% раствор сахароза-РВ8 перед быстрым замораживанием в оптимальной среде обработки ткани до температуры резания (О.С.Т. Сошроипб, М11е§ 1пс, Ωίαβοοδίίοδ Όίνίδίοη) с помощью жидкого азота и хранили при 80°С для криостатного секционирования. Несколько срезов от 8 до 10 мкм получали из каждого образца для гистологического анализа и иммуногистохимического исследования.

Классификация пациентов

Для изучения возможной связи между экспрессией 1Ь-18/1Ь-18ВР и признаками нестабильности бляшки авторы собирали клинические данные ίη ргокресШе и слепым способом у 23 следующих друг за другом пациентов (из 36), подвергшихся процедуре эндартерэктомии между апрелем и маем 2000. Наличие или отсутствие изъязвления внутри бляшки при макроскопическом исследовании систематически отмечалось хирургом, проводившим процедуру эндартерэктомии. Это давало возможность авторам классифицировать бляшки как изъявленные или неизъязвленные бляшки. Кроме того, пациентов систематизировали согласно клиническим симптомам на две отдельные группы. Пациентов, у которых присутствовали клинические симптомы ишемического нарушения мозгового кровообращения, относящиеся к стенозу сонной артерии, классифицировали как симптоматических. Эндартерэктомию проводили спустя

2-66 дней (17,6±5,3 дней) после появления клинических симптомов у данных пациентов. Пациентов, которые никогда не испытывали симптомы ишемического нарушения мозгового кровообращения в области сонной артерии, классифицировали как асимптоматических. Асимптоматический стеноз сонной артерии определяли на основе систематической клинической оценки пациентов с заболеванием сердца или периферических сосудов и его тяжесть устанавливали с помощью повторной Допплер-эхографии действительно опытным эхографистом. Даже если асимптоматические пациенты никогда не имели ишемического эпизода в области стеноза сонной артерии, эндартерэктомия сонной артерии была показана полезной данным пациентам, как показано исследователями асимптоматического атеросклероза сонной артерии (АСА8) (28).

Вестерн-блот-анализ

Белки экстрагировали из 12 атеросклеротических бляшек и 5 контрольных нормальных артерий. Замороженные образцы растирали в присутствии жидкого азота. Порошкообразные массы ресуспендировали в ледяном лизирующем буфере [20 ммоль/л Трис-НС1, рН 7,5, 5 ммоль/л ЕСТА, 150 ммоль/л ЫаС1, 20 ммоль/л глицерофосфата, 10 ммоль/л №1Р. 1 ммоль/л ортованадата натрия, 1% Тритон Х-100, 0,1% Тетееп 20, 1 мкг/мл апротинина, 1 ммоль/л РМ8Е, 0,5 ммоль/л Ν-тозил-Ь-фенилаланинхлорметилкетона (ТРСК), 0,5 ммоль/л ^а)-п-тозил-Ь-лизинхлорметилкетона (ТЬСК)] в соотношении 0,3 мл/10 мг по мас

- 12 005410 се. Экстракты инкубировали на льду в течение 15 мин и далее центрифугировали (12000 д, 15 мин, 4°С). Детергентрастворимые супернатантные фракции сохраняли и концентрации белка в образцах определяли с помощью белкового анализа Вю-Каб.

Для проведения Вестерн-блоттинга для 1С-18 и 1Ь-18К белковые экстракты кипятили в течение 5 мин и наносили на 7,5 или 15% 8Ό 8-полиакриламидный гель. Для 1Б-18ВР гЫЬ-18, выделенный из Е. СоИ (8егопо РЬагтасеибса1 КекеагсЬ 1п8Йи1е, Сепеуа) соединяли с АГП1де1 15 (Вюгаб) на 1 мг/мл смолы согласно протоколу производителей. Белковый экстракт (60 мкг) инкубировали в течение ночи при 4°С с мешалкой вместе с 20 мкл смолы, доведенной до 500 мкл РВ8 0,05% Тетееп. Для удаления любого неспецифического связывания смолу центрифугировали и промывали 10 мМ Трис рН 8, 140 мМ №1С1. 0,5% Тритон-Х-100 (Е1цка), 0,5% дезоксихлоратом, затем 50 мМ Трис рН 8, 200 мМ ЫаС1, 0,05% ТХ100, 0,05% попбе! Р40 (Р1ика), 2 мМ СНАР8 (ВоеЬппдег, МаппЬет), с последующей последней промывкой 50 мМ Трис рН 8. Далее смолу центрифугировали, ресуспендировали в буфере для образцов в приведенных условиях, кипятили в течение 5 мин и, наконец, наносили на 10% 8И8-полиакриламидный гель ΝιΤΑΟΕ (1пуИгодеп).

Образцы электрофоретически переносили из полиакриламидных гелей на нитроцеллюлозу. Нитроцеллюлозные мембраны пропитывали в течение 2 ч при комнатной температуре в ТВ8Т [50 ммоль/л Трис-НС1 (рН 7,5), 250 ммоль/л №1С1 и 0,1% солевой раствор Тетееп], содержащем 5% безлипидного сухого молока. Далее мембраны инкубировали с козьими поликлональными антителами против 1Б-18 и 1Б18К (α-цепь) человека (1 мкг/мл) (К&И 8у§!ет5), мышиными моноклональными антителами против 1Б18ВР человека (МаЬ 657,27 5 мкг/мл) (СогЬах е! а1., 2000), кроличьими поликлональными антителами против каспазы-1 человека (1 мкг/мл) (А-19, 8ап1а Сгих). Специфичность МаЬ 657,27 анализировали на полоске мембраны путем конкурентного анализа с помощью 200-молярного избытка гЫЕ-18РВ-6Ы5 (выделенного из клеток яичника китайского хомячка, 8егопо РЬагтасеи!1са1 КекеагсЬ 1п8111и1е), совместно инкубированного с МаЬ 657,27 в концентрации 5 мкг/мл в течение 1 ч. Последующую инкубацию с НКР, связанным с соответствующими антителами, хемилюминесцентными веществами (ЕСТ, ХУеЧегп Ь1о!бпд; АтегкЬат Согр) проводили для обнаружения положительных полос согласно инструкциям производителей и полосы визуализировали после экспозиции с фотопленкой НурегГш1т ЕСТ (АтешЬат Согр).

Иммуногистохимия

Замороженные срезы 6 атеросклеротических бляшек инкубировали с нормальной лошадиной сывороткой 1:10 или нормальной козьей сывороткой 1:10 в течение 30 мин при комнатной температуре, однократно промывали РВ8, далее инкубировали либо с первыми мышиными моноклональными антителами против СЭ68 для распознавания макрофагов (ОАКО-СП68, КР1), либо с первыми мышиными моноклональными антителами против α-актина гладкомышечной ткани человека (1А4, ИАКО) для распознавания гладкомышечных клеток. Для распознавания 1Б-18 и рецептора 1Б-18 в атеросклеротических бляшках применяли специфические козьи поликлональные антитела (Κ&Ό 8у51еш5) в разведении 5 мкг/мл. 1Б-18ВР определяли с помощью специфических моноклональных антител против рекомбинантной изоформы 1Б-18ВР человека (Н20) (СогЬах е! а1., 2000). После промывания в РВ8 стекла инкубируют со следующими вторыми связанными с биотином антителами: связанные с биотином лошадиные 1дО против иммуноглобулина мыши (Уес!ог ЕаЬога!опе§, 1пс) в разведении 1:200 для определения мест присоединения антител против СИ68, α-актина гладкомышечных клеток и 1Б-18ВР и связанные с биотином лошадиные 1дО против иммуноглобулина козы (Уес!ог) в разведении 1:200 для определения антител против 1Б-18 и рецептора 1Б-18. Иммуноокрашивание визуализировали с помощью авидин-биотиновой НКР системы визуализации (УесШЧаш АВС кН РК-6100 Уес!ог). Для отрицательных контролей параллельные срезы выдерживали с подходящими по изотипу посторонними антителами взамен первых антител.

Выделение РНК

Суммарную РНК экстрагировали из 29 атеросклеротических бляшек в кислом гуанидинтиоцианатном растворе и экстрагировали фенолом и хлороформом согласно способу С1ютсхуп5к| апб 8ассЫ (29). Выделенную РНК растворяли в воде и концентрацию измеряли поглощением при 260 нм. Степень деградации РНК оценивали с помощью электрофореза на 1% агарозных гелях. кДНК синтезировали из 1 мкг суммарной РНК, применяя систему обратной транскрипции Рготеда согласно протоколу производителей.

Полуколичественная и проводимая в режиме реального времени ПЦР 1Б-18 и 1Б-18ВР человека из атеросклеротических бляшек человека

Полуколичественные реакции ПЦР проводили в полном объеме 50 мкл в присутствии 1ЕД ДНКполимеразы АшрНТац (Регкш Е1тег, КосЕе, И.8.А.), 2,5 мМ бЭТР (АтешЬат, И.8.А.) и 50 пмоль прямых и обратных ПЦР-праймеров. Реакционные смеси инкубировали в РТС-200 РеШег ЕГГес! ТЬегта1 Сус1ег (М1 КекеагсЬ, И.8.А.) при следующих условиях: денатурация 1 мин при 94°С, отжиг в течение 1 мин при 55°С и элонгация в течение 1 мин при 72°С. Для убеждения наличия соответствующего количества ПЦРпродуктов в течение линейной стадии ПЦР-реакции 1Б-18ВР, 1Б-18 и β-актин анализировали после 25, 28 и 31 цикла. Устанавливали оптимальное количество циклов для 1Б-18ВР, 1Б-18 и β-актина до насыщения

- 13 005410 полос (31, 28 и 25 соответственно). ПЦР-праймеры подбирали на основе описанных последовательностей (ΑΡ110799, Ό49950, Х00351), являющихся следующими: [Б-18, обратная 5'СССТСАСТАСАСТСАССТАА-3'; прямая 5'-СССТАСАССТАТСССТСТАА-3'; ГБ-18ВР, прямая 5'АССТСТСТАССТССАСТСАА-3'; об-ратная 5'-ССАССААСАТАССААСТСТС-3'; β-ак-тин, обратная 5'ССАССАССААТСАТСТТСАТСТТС-3'; прямая 5'-ССТСАССАТССАТСАТСАТАТССС-3'. Для исключения амплификации возможной геномной ДНК, присутствующей в образцах, реакции ПЦР проводили в отсутствие матрицы кДНК. ПЦР-продукты (10 мкл) анализировали на 1% агарозных гелях, проводя электрофорез в 1-кратном буфере ТАЕ. Размер ПЦР-продуктов определяли сравнением с последовательно расположенными в виде лестницы окрашенными полосами в 1 т.п.н. на гелях. (С1Ьсо). Относительную количественную оценку полос, окрашенных бромистым этидием, проводили под воздействием УФ-света с помощью Кобак Эщйа1 8с1енсек апа1уйса1 койгате и отмечали как соотношение искомого гена (ЫБ18ВР, ЫБ-18) к контрольно-диспетчерскому гену (Ηβ-актин).

Праймеры 8УВК Сгееп Кеа1 Т1ше РСК для ГБ-18, 1Б-18ВР и САРЭН (контрольный контрольнодиспетчерский ген) подбирали с помощью Рпшет Ехргекк кой^ате йот РЕ ВюкукГешк согласно опубликованным последовательностям (АР110799, Ό49950, ΝΜ 002046), являющимся следующими: ГБ-18, обратная 5'-САСССССТТТАССАСССА-3'; прямая 5'-СААССААТТСТСТСССАСТСС-3'; ГБ-18ВР, обратная 5'ААССАСССТТСАСССТТСС-3'; прямая 5'-ТСССАТСТСТСТССТСАТТТАСТС-3'; САРОН, обратная 5'САТСССАТТТССАТТСАТСАСА-3'; прямая 5'-ССАСССАТСССАААТТСС-3'; интрон-САРЭН, обратная 5'ССТАСТСССАССССТТТСАТТ-3'; прямая 5'-СТСТССТСССАСТССТССАТТТС-3'. Оценивали специфичность и оптимальную концентрацию праймера. Возможное загрязнение геномной ДНК исключали с помощью проведения ПЦР-реакций со специфическими праймерами интрон-САРЭН. Отсутствие неспецифической амплификации устанавливали по анализу ПЦР-продуктов с помощью электрофореза в 3,5% агарозном геле. ПЦР 8УВК Сгееп Кеа1 Т1ше проводили с применением 5 мкл/лунка ОТ-продуктов (0,5 нг суммарной РНК), 25 мкл/лунку 8УВК Сгееп РСК шак1ег ш1х (РЕ ВюкукГеш, СА, И8А) с урацил-Νгликозилазой АшрЕгаке (υΝ^ (0,5 Ед/лунка) и 20 мкл праймеров (300 нМ). ПЦР проводили при 50°С в течение 2 мин (для инкубации с АшрЕгаке υNС для удаления всего урацила, встроенного в кДНК), 95°С в течение 10 мин (для активации АшрйТац Со1б) и далее прохождение 40 циклов при 95°С в течение 15 с, 60°С в течение 1 мин на АВ1 РШ8М 7700 ЭеГесйоп кукГеш. Обратно транскрибированные образцы кДНК таким образом амплифицировали и определяли значения их С.Ч (порогового значения циклов). Все СГ-величины нормализовали по отношению к контрольно-диспетчерскому гену САРЭН. Отдельные специфические полосы ДНК для ГБ-18, 1Б-18ВР и САРЭН получали с помощью гель-электрофореза.

Принцип определения в режиме реального времени с помощью «8УВК Сгееп РСК шакГет ш1х» основан на непосредственном определении ПЦР-продуктов с помощью измерения увеличения флуоресценции в результате связывания красителя 8УВК Сгееп с двойной цепью ДНК.

Статистический анализ

Данные представлены в виде средних величин ± станд. ошибка. Уровни ГБ-18 сравнивали между группами с помощью теста Манна-Уитни. Значение р 0,05 рассматривали как статистически значимое.

Пример 1. Предотвращение ингибиторами ГБ-18 гибели эндотелиальных клеток, индуцированной окисленными липопротеинами (охБЭБ).

Культивированные эндотелиальные клетки пупочной вены человека (НυVЕС) инкубировали в течение 16 ч вместе с охБЭБ в присутствии или в отсутствие ГБ-18-связывающего белка или антител против ГБ-18. Как представлено на фиг. 1, 83% НυVЕС погибают после инкубации с охБЭБ. Совместная инкубация с ГБ-18ВР или антителами против ГБ-18 почти полностью предохраняет клетки от гибели. При применении ГБ-18ВР не было отмечено гибели. При применении антител против ГБ-18 89% клеток выжили.

Данный эксперимент ясно показывает защитный эффект двух различных ингибиторов ГБ-18, направленный против гибели клеток в результате апоптоза в атеросклеротической бляшке.

Пример 2. Экспрессия белка ГБ-18 и его эндогенного ингибитора ГБ-18ВР в атеросклеротических бляшках.

Вестерн-блоттинг проводили для белковых экстрактов, полученных из 12 атеросклеротических сонных артерий и 5 нормальных контролей. Белок ГБ-18, включая активную форму, высоко экспрессировался во всех атеросклеротических бляшках, несмотря на обнаружение небольшой экспрессии или ее отсутствие в нормальных артериях (фиг. 2). Линии 1-4 содержат образцы из атеросклеротических бляшек, линии 5-7 - из нормальных артерий. Интересно, определение активной формы ГБ-18, возможно, коррелирует с экспрессией активной формы каспазы-1, которая участвует в процессинге ГБ-18 (фиг. 2 четвертый ряд). Значительная экспрессия белка рецептора ГБ-18 (α-цепь) также обнаружена во всех атеросклеротических бляшках по сравнению с очень низким уровнем экспрессии в нормальных артериях (фиг. 2 второй ряд). Кроме того, большинство атеросклеротических бляшек экспрессирует ГБ-18ВР, хотя уровень экспрессии гетерогенный (фиг. 2 первый ряд).

- 14 005410

Пример 3. Клеточная локализация белка 1Б-18 и его эндогенного ингибитора 1Б-18ВР в атеросклеротических бляшках.

Для установления клеточной локализации 1Б-18 и 1Б-18ВР проводили иммуногистохимические исследования на 6 атеросклеротических бляшках сонных артерий. Как представлено на фиг. 2, 1Б-18. в основном, экспрессируется в макрофагах, данные клетки, возможно, являются главным источником 1Б-18 в бляшке (не показано). Данные области также богаты СП3-положительными лимфоцитами. Однако не видно, что Т-лимфоциты непосредственно участвуют в продуцировании 1Б-18. 1Б-18 также экспрессируется в некоторых гладкомышечных клетках интимы и в редких эндотелиальных клетках. Напротив, значительную экспрессию 1Б-18ВР обнаружили в эндотелиальных клетках бляшки микрососудов и в их поверхности со стороны просвета, хотя экспрессию во всех сосудах не обнаружили. Относительно низкую и более гетерогенную экспрессию 1Б-18ВР также обнаружили, в основном, экстрацеллюлярно в некоторых богатых макрофагами областях.

Пример 4. Экспрессия транскриптов мРНК 1Б-18 и 1Б-18ВР в атеросклеротических бляшках и взаимосвязь с нестабильностью бляшки.

Для установления наличия экспрессии мРНК 1Б-18 и 1Б-18ВР в атеросклеротических бляшках сонной артерии человека проводили полуколичественную ОТ-ПЦР на 6 атеросклеротических бляшках (фиг.

3). мРНК 1Б-18 и 1Б-18ВР обнаружили во всех атеросклеротических бляшках, хотя количество мРНК 1Ь18 и 1Б-18ВР было гетерогенным. Поэтому для точного количественного определения уровней экспрессии мРНК 1Б-18 и 1Б-18ВР дополнительно анализировали 23 атеросклеротические бляшки с помощью метода 8УВК Огееи Кеа1-Т1те РСК. (фиг. 4). Бляшки характеризовали с помощью клинических и патологических признаков как симптоматические (нестабильные) или асимптоматические (стабильные) бляшки, содержащие макроскопически определяемые изъязвления или не содержащие. Клинические характеристики пациентов суммированы в табл. 4. Процентное значение уменьшения диаметра сонной артерии (60-95%) и факторы риска, включающие возраст, диабет, гиперхолестеринемию, гипертензию и курение, не отличались для двух групп.

Таблица 4

Характеристики пациентов

	Асимптоматические пациенты (п=9)	Симптоматические пациенты1 (п=14)
Возраст	66,9±4,0	70,2±3,9
Пол	Мужской (8)	Мужской (9)
Гипертензия2	8	9
Г иперхолестеринемия3	4	8
Диабет	3	1
Курение в настоящее время	7	8
Заболевание коронарных артерий	5	4

¹ Представлены пациенты с транзиторным или преходящим ишемическим нарушением мозгового кровообращения за 2-66 дней до эднартерэктомии.

² Количество пациентов с клинически выраженной гипертензией перед началом лечения антигипертензивными препаратами.

³ Количество пациентов с клинически выраженной гиперхолестеринемией перед началом лечения препаратами, снижающими уровень липидов.

Обнаружили, что количество 1Б-18 подвержено положительной регуляции в симптоматических по сравнению с асимптоматическими бляшками (2,03±0,5 против 0,67±0,17? соответственно, фиг. 4А). Статистический анализ показал, что данное увеличение продукции 1Б-18, наблюдаемое в симптоматических бляшках, является высокозначимым (р<0,0074), в то время как сниженное количество 1Б-18ВР, обнаруживаемое в симптоматических бляшках по сравнению с асимптоматическими, не является значимым (4,64±0,98 против 2,5±0,92 соответственно, фиг. 4В). Другими словами, хотя обе симптоматическая и асимптоматическая группы обнаруживают положительную корреляцию между мРНК 1Б-18 и 1Б-18ВР, углы наклона значительно отличаются между двумя группами (симптоматическая группа: угол наклона 1,16 [0,19-2,14], г²=0,36 против асимптоматической группы: угол наклона 4,79 [2,39-7,20], г²=0,76; р<0,05). Поэтому предполагается, что относительное увеличение экспрессии 1Б-18ВР в симптоматической группе не является достаточным для компенсации увеличения экспрессии 1Б-18. Более того, при рассмотрении наличия изъязвления как признака нестабильности бляшки статистический анализ допол

- 15 005410 нительно проводили для бляшек без изъязвлений или с изъязвлением внутри бляшки и показали существенную положительную регуляцию 1Ь-18 для бляшек с наличием изъязвлений (р<0,018) (фиг. 4С).

Полученные данные показывают, что увеличение экспрессии 1Ь-18, наблюдаемое в атеросклеротических бляшках, коррелирует с нестабильностью бляшки.

Пример 5. Регуляция 1Ь-18ВР развития и стабильности атеросклеротического поражения на модели заболевания ίη νίνο.

Методы

Характеристика пациентов

Образцы плазмы получали от пациентов с острым ишемическим коронарным синдромом (нестабильная стенокардия и инфаркт миокарда) менее чем 7 дней спустя после появления симптомов. Нестабильную стенокардию устанавливали по ассоциации типичной загрудинной боли вместе с либо ишемическими изменениями на электрокардиограмме, либо присутствием заболевания коронарных артерий. Инфаркт миокарда диагностировали на основании типичных ишемических изменений на электрокардиограмме, ассоциированных со значительным повышением ферментов миокарда (креатинфосфокиназы и тропонина I) в крови. Пациенты без ишемии были набраны в это же кардиологическое отделение и совсем не проявляли признаков ишемии. Уровни 1Ь-18 человека в плазме определяли с помощью коммерчески доступного набора (МВЬ, 1арап).

Внутримышечный электроперенос ίη νίνο мышам плазмиды, экспрессирующей 1Ь-18ВР мышей самцов С57ВЬ/6 ароЕ КО 14-недельного возраста получали с 3-недельным интервалом 3 инъекции плазмиды, экспрессирующей 1Ь-18ВР, реОНА3-1Ь18ВР. Контрольные мыши (п=19) получали инъекции контрольной пустой плазмиды. кДНК изоформы 61Ь-18ВР, выделенную, как описано (номер доступа # 09ΖΟΜ9) (23), субклонировали по сайтам ΕοοΡ1/Νο11 в экспрессирующий вектор клеток млекопитающих ροΌΝΑ3 под контролем цитомегаловирусного промотора (ΙηνίΐΓο^βη). Конструкция, обозначенная 334.у 11. представлена на фиг. 5. Контрольная плазмида представляла собой подобную конструкцию, лишенную терапевтической кДНК. Плазмиду, экспрессирующую 1Ь-18ВР, или контрольную плазмиду (60 мкг) вводили инъекционно в обе большеберцовые краниальные мышцы мыши под анестезией, как описано ранее (13). Кратко, чрескожные электрические импульсы (8 электрических сигналов прямоугольной формы 200 В/см, продолжительностью 20 мс при 2 Гц) посылали с помощью электроимпульсатора Р8-15 (ΟοηβΐΓοηίοδ, ΓΓαηοβ), применяя два плоских электрода из нержавеющей стали, расположенных друг от друга на 4,2-5,3 мм на каждой стороне ноги.

ЕЫ8А ш1Ь-18ВР

Плашки покрывали в течение ночи г-ш1Ь-18ВРб-аффинными кроличьими поликлональными антителами (5 мкг/лунку). Растворимый ш1Ь-18ВР определяли с помощью связанных с биотином кроличьих поликлональных антител (0,3 мкг/мл), направленных против г-ш1Ь-18ВР Е. 0?ο1ί (Рерго1ес) с последующим добавлением пероксидазы ехШпзбш (1/1000) (81дта). Связывание кроличьих поликлональных антител оценивали с помощью Вестерн-блота для определения специфичности ш1Ь-18ВР. Рекомбинантный т1Ь-18ВРб, продуцируемый клетками НЕК 293, применяли в качестве стандарта. Чувствительность ЕЫ8А составила 5 нг/мл.

Анализ мышей

Криостатные срезы (8 мкм) получали из синуса аорты и применяли для определения липидных отложений с помощью Οίΐ красного, определения коллагена с помощью 8тиз красного и для иммуногистохимического анализа, как описано ранее (13). Срезы выдерживали со специфическими первыми антителами: против макрофагов мыши, клон МОМА2 ^^ουΓ^), против α-актина, конъюгированные с щелочной фосфатазой, для гладкомышечных клеток и против ί.Ό3 для Т-лимфоцитов (ΟηΚο), как описано ранее (13). Определение гибели клеток проводили с помощью метода ΤυΝΕΕ (13). СЭ3-положительные клетки подсчитывали микроскопически слепым способом. Атеросклеротические бляшки в синусе аорты и областях, окрашивающихся положительно на наличие макрофагов, гладкомышечных клеток, коллагена или ΤυΝΕΕ, измеряли с помощью количественного компьютерного анализа изображения (N815000, Μί^ονίδίοη), как описано ранее (13). Инкубированием с неиммунными подходящими по изотипу иммуноглобулинами оценивали специфичность иммуноокрашивания. Специфичность ТОКЕЬ оценивали с помощью опущения фермента терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы. Грудные аорты, располагающиеся от левой подключичной артерии до почечных артерий, фиксировали с помощью 10% буферного раствора формалина и окрашивали на отложение липидов с помощью Οίΐ красного. Далее их разрезали в продольном направлении и процентное количество липидных отложений вычисляли с помощью количественного компьютерного анализа изображения (N815000, ΜκΓονίδίοη).

Результаты

В ходе настоящего исследования проверяли гипотезу о том, что регуляция 1Г-18/1Г-18ВР играет решающую роль как в атерогенезе, так и в стабильности бляшки. Определяли уровни ΙΚ-18 в плазме пациентов с острыми коронарными синдромами (30 мужчин, 18 женщин, средний возраст 66,2 ±1,8 лет, из которых 14 имеют нестабильную стенокардию и 34 имеют инфаркт миокарда) и у контрольных пациентов без ишемии, находящихся в том же кардиологическом отделении (10 мужчин, 3 женщины, средний

- 16 005410 возраст 60,0 ±5,2 лет). Уровни 1Б-18 в плазме были значительно повышены у пациентов с острыми коронарными синдромами по сравнению с контролем (146,9±17,1 против 73,0±12,2 пг/мл, соответственно, р<0,05) в отличие от уровней циркулирующих 1Б-18ВР, которые были немного повышенными (20,1±2,7 против 7,5±2,5 нг/мл, соответственно, р=0,06). Кроме того, уровни 1Б-18 коррелировали с тяжестью заболевания, так как наиболее повышенные уровни были найдены у пациентов с тяжелым ишемическим нарушением сердечной деятельности и клиническими признаками отека легких (224,03±39,1 пг/мл, р<0,001 при сравнении с контролем). Данные результаты, полученные для пациентов с острым коронарным заболеванием, вместе с предыдущими наблюдениями, что 1Б-18 повышен в атеросклеротических бляшках пациентов с инсультами [Ма11а!, 2001], отводят возможную важную роль регуляции 1Ь-18/1Ь18ВР в атеросклеротическом процессе.

Поэтому авторы проверили данную гипотезу с применением мышей кпоскои! (КО) ароЕ, у которых спонтанно образуются атеросклеротические поражения, подобные человеческим. 14 14-недельных мышей самцов получали добавление 1Б-18ВР путем внутримышечного электропереноса ίη νί\Ό экспрессирующей плазмидной ДНК, кодирующей мышиный 1Ь-18ВРб, при этом 19 подходящих по возрасту контрольных мышей получали пустую плазмиду. Электроперенос плазмиды повторяли каждые 3 недели и мышей забивали в 23-недельном возрасте после 9 недель обработки. Уровни мышиного 1Б-18ВР в плазме были ниже, чем пороговое определяемое значение (5 нг/мл) у мышей ароЕ КО, получавших пустую плазмиду. Однако отдельная инъекция плазмиды, содержащей 1Б-18ВР, приводила к высоким уровням 1Б-18ВР в крови с максимумом спустя 2 дня после инъекции (323,5±100,9 нг/мл) и 127,4±35,4 нг/мл спустя 2 недели. После 9 недель обработки плазмидой, содержащей 1Б-18ВР, или пустой плазмидой сывороточные уровни общего холестерина (489,4±34,6 против 480,8±36,3 мг/дл, соответственно) и липопротеинов высокой плотности (52,3±9,4 против 48,8±5,1 мг/дл, соответственно) не отличались между двумя группами. Умеренное, но достоверное увеличение массы животных получали в обрабатываемой 1Б-18ВР группе по сравнению с контрольной группой (31,8±0,9 против 28,6±0,8 г, соответственно, р<0,05).

Результат влияния добавления 1Б-18ВР на атеросклероз оценивали в двух различных локализациях: нисходящей грудной аорте и синусе аорты. Грудная аорта была выбрана для определения роли 1Б-18ВР в образовании жировых полосок (атерогенез), поскольку атеросклеротические поражения грудной аорты всегда отсутствуют в возрасте 14 недель (данные не представлены), когда начинали перенос 1Б-18ВР. Синус аорты, где атеросклеротические поражения уже присутствуют в возрасте 14 недель (данные не представлены), оценивали в отношении развития сформированной бляшки и состава, важного определяющего фактора стабильности бляшки. Обработка с помощью 1Б-18ВР мышей ароЕ КО достоверно влияет на развитие атеросклеротического поражения и развития. Оценка грудной аорты показала заметное уменьшение липидного отложения у мышей, обрабатываемых плазмидой 1Б-18ВР, по сравнению с пустой плазмидой (фиг. 6). Количественный компьютерный анализ изображения показал 69% уменьшение размера атеросклеротических поражений (р<0,0001) (фиг. 6), указывая на решающую содействующую роль 1Б-18 в атерогенезе. Кроме того, обработка с помощью плазмиды, включающей 1Б-18ВР, только в течение 9 недель достоверно ограничила развитие сформированной бляшки в синусе аорты (24% уменьшение размера бляшки, р=0,01) по сравнению с обработкой пустой плазмидой (фиг. 7).

Более важно, что состав сформированного поражения, важный определяющий фактор стабильности бляшки, оказался сильно подвержен влиянию обработки 1Б-18ВР. Атеросклеротические поражения мышей, обрабатываемых с помощью плазмиды, включающей 1Б-18ВР, проявили очень значительное 50% уменьшение инфильтрации макрофагами (р<0,0001) (фиг. 8), содержание менее 67% Т-лимфоцитов (р<0,005) (фиг. 8) и показали 2-кратное увеличение накопления гладкомышечных клеток (р<0,05) (фиг.

9). Кроме того, данные важные изменения в клеточном составе поражения были ассоциированы с достоверным 85% увеличением содержания коллагена (р<0,0005), что установили с помощью окрашивания 8шик красным, и со снижением общего содержания липидов.

Поэтому обработка с помощью 1Б-18ВР значительно ослабляет воспалительный процесс в пределах атеросклеротического поражения и индуцирует признаки процесса восстановления стабильности атеросклеротических бляшек. Более того, заметное уменьшение воспалительного компонента в поражениях у мышей, обработанных с помощью 1Б-18ВР. было ассоциировано с существенным снижением гибели клеток в бляшках (2,9±0,9% у обработанных 1Б-18ВР мышей против 10,5±3,6% в контроле, р<0,05), следовательно, ограничивая рост и тромбогенность бесклеточного липидного ядра [Ма11а!, 1999].

Выводы

Применяя хорошо изученную мышиную модель атеросклероза, подобного человеческому, представленные выше результаты ясно установили несомненную и решающую роль регуляции 1Б-18 и 1Ь18ВР в образовании атеросклеротической бляшки, развитии и стабильности. Несмотря на предотвращение начальной стадии образования поражения в грудной аорте, ингибирование активности 1Б-18 с помощью добавления 1Б-18ВР также сильно влияет на состав сформированного поражения в синусе аорты, индуцируя переключение на стабильный фенотип бляшки.

Клинический прогноз пациента с атеросклерозом только частично зависит от размера поражений. В настоящее время широко признано, что качество (состав бляшки) поражения может являться даже лучшим показателем развития ишемических явлений, чем ее размер. Действительно, тяжелые клинические

- 17 005410 проявления атеросклероза (инфаркты сердца и мозга) являются, в основном, результатом окклюзии просвета сосуда тромбом, образовавшимся при взаимодействии с распадающейся атеросклеротической бляшкой (19). Патологические исследования показали, что уязвимые или нестабильные бляшки, которые склонны к распаду или распавшиеся, богаты клетками воспаления и обнаруживают существенный недостаток содержания гладкомышечных клеток и коллагена (20, 21). Более того, в подобных бляшках показано значительное увеличение апоптотической гибели клеток, приводящее к образованию высоко тромбогенного липидного ядра (13, 22). Замечательно, что все данные признаки повышения нестабильности бляшки заметно ослаблялись у мышей, обработанных ГБ-18ВР, указывая, что передача сигнала ГЬ-18 является основным определяющим фактором нестабильности бляшки.

Значимость результатов, полученных на мышах ароЕ КО, для заболевания человека усиливается обнаружением авторами повышенных уровней циркулирующего ГЬ-18 у пациентов с острыми коронарными синдромами и повышенной продукции ГЬ-18 в нестабильных атеросклеротических бляшках сонной артерии, ответственных за инсульт. Данные находки в совокупности определили ингибиторы активности ГЬ-18 как новый важный терапевтический способ предотвращения и лечения развития атеросклеротических бляшек и ограничения осложнений бляшек.

Пример 6. Повышенные уровни ГЬ-18 коррелируют с рецидивирующими явлениями у пациентов с сердечной недостаточностью.

Уровни ГЬ-18 определяли в сыворотке крови пациентов с помощью ЕЬГ8А со специфическими антителами против ГЬ-18.

В целом, обследовали 56 ишемических или неишемических пациентов с признаками сердечной недостаточности или без нее.

У пациентов, скончавшихся позже, уровни ГЬ-18 составили 216,0±41,5 пг/мл против 112,2±12,2 пг/мл у пациентов без летального исхода (р=0,0018).

У пациентов с любым рецидивирующим случаем, таким как смерть, рекуррентная ишемия, реваскуляризация, прогрессия атеросклероза или периодически повторяющаяся госпитализация по поводу сердечной недостаточности, определяли следующие уровни ГЬ-18: 165,8±23,8 против 107,7±14,6 у пациентов с отсутствием любого рецидивного случая (р=0,03).

Данные результаты показывают, что уровни ГЬ-18 достоверно повышены у пациентов, имеющих плохой клинический прогноз, подобный рецидивирующим случаям или даже смерти.

В образцах крови 16 неишемических пациентов с признаками сердечной недостаточности или без нее определяли уровень ГЬ-18. У пациентов, которые позже скончались, уровень составил 199,0±34,8 пг/мл против 95,3±20,4 пг/мл у выживших пациентов (р=0,09).

Пациенты с любым рецидивируюшим случаем: 146,6±34,4 пг/мл ГЬ-18 против 95,4±23,9 пг/мл у пациентов с отсутствием любого рецидивирующего случая (р=0,03). Хотя различие в уровнях ГЬ-18 не достигало статистически значимой величины вследствие небольшого количества пациентов, можно увидеть ясную тенденцию к повышению уровня ГЬ-18.

У ишемических пациентов уровень ГЬ-18 составил 214,2±45,9 пг/мл для скончавшихся пациентов против 118,4±12,8 пг/мл для выживших пациентов (р=0,007).

162,8±24,7 пг/мл ГЬ-18 определяли у пациентов, имеющих любой рецидивирующий случай, против 116,2±16,0 у пациентов с отсутствием любых рецидивирующих случаев.

Ссылки

1. Вокк В. А!йегокс1егок1к - ап тПатшаЮгу бйеаке. N. Епд1. I. Меб. 1999; 340:115-126.

2. Уап бег \Уа1 А.С., Вескег А.Е., уап бег Ьоок С.М., Пак Р.К. 8бе оГ трта1 гцрШге ог егокюп оГ биотЬокеб согопагу а!йегокс1егобс р1ациек ίκ с11агас1епхеб Ьу ап тПаттаЮгу ргосекк птекресбуе оГ 1Не боттап! р1ас.|ие тогрйо1о§у. С1гси1а!юп 1994; 89:36-44.

3. Еик!ег V., Ваб1топ Ь., Ваб1топ Ы, СйекеЬго ЬН. Тке раШодепекй оГ согопагу аИегу бйеаке апб 1йе аси1е согопагу купбготек (1). N. Епд1. I. Меб. 1992; 326:242-250.

4. Еик!ег V., Ваб1топ Ь., Ваб1топ Ы, СйекеЬго ЬН. Тке раШодепекй оГ согопагу аИегу бйеаке апб 1ке аси1е согопагу купбготек (2). N. Епд1. I. Меб. 1992; 326:310-318.

5. Ьее В.Т., Ь1ЬЬу Р. Тке цпк!аЬ1е а!кегота. Айегюкс1ег. ТкготЬ. Vаκс. Вю1. 1997; 17:1859-1867.

6. В1бкег Р.М., Сикктап М., МатрГег М.Ь, Тгасу В.Р., Неппекепк С.Н. ГпЛаттабоп, акртп, апб 1ке пкк оГ сагбюуакси1аг бйеаке т аррагепбу кеайку теп. N. Епд1. 1. Меб. 1997; 336:973-979.

7. Ь1ЬЬу Р. Мо1еси1аг Ьакек оГ 1йе асн1е согопагу купбготек. Сйси1а!юп 1995; 91:2844-2850.

8. Накатта, К., Окатига, Н., №1да1а, К. апб Татига, Т. (1989). ГпГеск Гттип. 57, 590-595.

9. УокЫтоЮ, Т., Такеба, К., Тапака, Т., Оккики, К., КакЫчатнга, 8., Окатига, Н., Акта, 8. апб №кашкЫ, К. (1998). к Гттипо1. 161, 3400-3407.

10. Рате!, Р., Сагка, К.Е., Воппей, Т.Р., Ьочег, 8.К., апб 81тк, ТЕ. (1996). I. Вю1. Скет. 271, 39673970.

11. П1Попа!о, кА., Науака\га, М., Во1к\уагГ, П.М., 2апб1, Е. апб Капп, М. (1997). ХаНне 388, 1651416517.

12. ^утк, Ό., К1т, 8.-Н., капШххк С., Вехшкоу, Ь., Пшаге11о, С., апб ВиЬтк!ет, М. (1999). Гттипку 10, 127-136.

- 18 005410

13. Ма11а! Ζ., Ниде1 В., Ойап 1., Ьсзссйс 6., Егеузз1пе! 1.М., Тебдш А. 8йеб тетйгапе т1сгорагйс1ез \\Цй ргосоади1ап! ро!епйа1 ίη йитап а!йегозс1его!1с р1ас.|иез. А го1е !ог арор!оз1з ίη р1ас.|ие 1йготЬодешсйу. С1гси1а!юп 1999; 99:348-353.

14. Тпсо! О., Ма11а! Ζ., Неутез С., Ве1тт 1., Ьезесйе 6., Тебдш А. Ке1айоп Вс1\\'ссп Епбо1йейа1 Се11 АрорЮ818 апб В1ооб Иоте ОйссЬоп ίη Нитап А!йегозс1его!ю Р1ас.|ис. С1гси1айоп 2000; ίη ргсзз.

15. О1тте1ег 8., Наепбе1ег 1., 6а11е 1., Ζе^йе^ А.М. Ох1б|/еб 1о\\-бепзйу 11рорго(с1п шбисез арор!оз1з о! йитап епбо1йеНа1 сс11з Ьу асйуа!юп о! СРР32-11ке рго1еазез. А тесйашзйс с1ие Ю 1йе 'гезропзе Ю щ)игу' йуро!йез1з. С1гси1а!юп 1997; 95:1760-3.

16. 6гап1йат, 8с1епсе, Уо1. 185, рр. 862-864 (1974).

17. О1тте1ег 8., Наепбе1ег 1., 6а11е 1., Ζе^йе^ А.М. Ох1б|/еб 1о\\-бепзйу 11рорго(с1п шбисез арор!оз1з о! йитап спбо1йс11а1 сс11з Ьу асйуайоп о! СРР32-йке рго1еазез. А тесйашзйс с1ие 1о 1йе 'гезропзе 1о тщгу' йуро!йез1з. С1гси1а!юп 1997; 95:1760-3.

18. М1г Ь.М., Вигеаи М.Е., 6ей1 1., Капдага К., Коиу Ό., СаШаиб ЙМ., ОсПегс Р., Вгапе11ес Ό., 8сй\хаг1х В., 8сйегтап Ό. Н1дй е!йс1епсу депе !гапз!ег ш!о ькс1с1а1 тизс1е тсб1а1сб Ьу е1сс!г1с ри1зез. Ргос. Ыаб. Асаб. 8сг И8А 1999; 96:4262-7.

19. Ьее, К.Т. & ЫЬЬу, Р. Тйе ипз!аЬ1е аШегота. Аг1ег1озс1ег. ТйготЬ. Уазс. Вю1. 17, 1859-1867 (1997).

20. Оау1сз, М.1. Тйе сотрозйюп о! согопагу-айегу р1ас|иез |ебйопа1; соттеп!]. N. Епд1. 1. Меб. 336, 1312-1314 (1997).

21. У1гтат, К., Ко1обд1е, Ε.Ό., Вигке, А.Р., ЕагЬ, А. & 8сйетаг12, 8.М. Ьеззопз !гот зиббеп согопагу беа!й: а сотргейепзгуе тогрйо1одюа1 с1аззШсайоп зсйете !ог а!йегозс1егойс 1езюпз. Аг1ег1озс1ег. ТйготЬ. Уазс. Вю1. 20, 1262-1275. (2000).

22. Ко1обд1е, Ε.Ό. е! а1. ЬосаН/аОоп о! арор!ойс тасгорйадез а! !йе зйе о! р1ас|1.1е гир!иге ίη зиббеп согопагу беа!й [1п Ргосезз Сйайоп]. Ат. 1. Ра!йо1. 157, 1259-1268 (2000).

23. К1т, 8.Н. е! а1. 8!гис!ига1 гес.|шгетеп1з о! з1х па!ига11у оссшгшд 1зо!огтз о! 1йе 1Й-18 Ьшбшд рго!еш !о шй1Ьй Ш-18. Ргос. №!1. Асаб. 8сг И8А 97, 1190-1195 (2000).

24. ЕШо!!, М.1., Машу Κ.Ν., Ее1бтапп, М., Ьопд-Еох, А., Сйаг1ез, Р., Ву1, Н., апб \Уообу, ΙΝ., 1994, Ьапсе! 344, 1125-1127.

25. Кшдй! О.М., Тппй Н., Ье 1., 81еде1 8., 8йеа1у Ό., МсЭопоидй М., 8са11оп В., Мооге М.А., У11сек 1., Эаббопа Р., е! а1. Сопзйисйоп апб ίηίΐίη1 сйагасЮпхаЬоп о! а тоизе-йитап сЫтепс ап!1-Т№ апйЬобу. Мо1. 1ттипо1 1993, Νυν. 30:16 1443-53.

26. Тисс1, А., 1атез, Н., СЫсйерогйсйе, К., Воппе!оу, 1.У., Оауег, 1.М., апб Ζι.ι6Κγ. К.Н., 1992, 1. 1ттипо1. 148,2778-2784.

27. Епде1тапп, Н., Ό. Шуюк, апб Ό. ^айасй. 1990. Т\хо !итог песгоз1з !ас!ог-Ьшбтд рго!етз рипйеб !гот йитап игте. Еу1бепсе !ог 1ттипо1од1са1 сгозз-гсасйуйу \уйй се11 зигТасе !итог песгоз1з !ас!ог гесер!огз. 1. Вю1. Сйет. 265:1531-1536.

28. Мооге \У.8., Вате!! Н.к, ВееЬе Н.6., е! а1. бшбейпез !ог сагойб епбаг1егес!оту. А тиЙ1б1зс1рйпагу сопзепзиз з!а!етеп! !гот 1йе Аб. Нос. СоттШес, Атепсап Неай Аззотайоп. Сиси1айоп 1995; 91:56679.

29. Сйотсхупзк! Р., 8ассй1 Ν. 8шд1е-з!ер те!йоб о! ΡΝΛ 1зо1а!юп Ьу ас1б диашбшт 1йюсуапа!ерйепо1-сй1ого!огт ехйасйоп. Апа1. Вюсйет. 1987; 162:156-9.

Claims (45)

1. Применение ингибитора 1Й-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения атеросклероза, где ингибитор 1Й-18 выбран из группы, состоящей из 1СЕ-ингибиторов, антител против 1Й-18, антител против любой из субъединиц рецептора 1Й-18, ингибиторов передачи сигнала от рецептора 1Й-18, антагонистов 1Й-18, которые конкурируют с 1Й-18 и блокируют рецептор 1Й-18, и белков, связывающих 1Й-18, их изоформ, мутеинов, гибридных белков, функциональных производных, активных фракций или производных с круговой перестановкой.

2. Применение ингибитора 1Й-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения тромбоза атеросклеротической бляшки, где ингибитор 1Й-18 выбран из группы, состоящей из 1СЕ-ингибиторов, антител против 1Й-18, антител против любой из субъединиц рецептора 1Й-18, ингибиторов передачи сигнала от рецептора 1Й-18, антагонистов 1Й-18, которые конкурируют с 1Й-18 и блокируют рецептор 1Й-18, и белков, связывающих 1Й-18, их изоформ, мутеинов, гибридных белков, функциональных производных, активных фракций или производных с круговой перестановкой.

3. Применение ингибитора 1Й-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения изъязвления атеросклеротической бляшки, где ингибитор 1Й-18 выбран из группы, состоящей из 1СЕ-ингибиторов, антител против 1Й-18, антител против любой из субъединиц рецептора 1Й-18, ингибиторов передачи сигнала от рецептора 1Й-18, антагонистов 1Й-18, которые конкурируют с 1Й-18 и блокируют рецептор 1Й-18, и белков, связывающих 1Й-18, их изоформ, мутеинов, гибридных белков, функциональных производных, активных фракций или производных с круговой перестановкой.

- 19 005410

4. Применение ингибитора 1Ь-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения дестабилизации атеросклеротической бляшки, где ингибитор 1Ь-18 выбран из группы, состоящей из 1СЕ-ингибиторов, антител против 1Ь-18, антител против любой из субъединиц рецептора 1Ь-18, ингибиторов передачи сигнала от рецептора 1Ь-18, антагонистов 1Ь-18, которые конкурируют с 1Ь-18 и блокируют рецептор 1Ь-18, и белков, связывающих 1Ь-18, их изоформ, мутеинов, гибридных белков, функциональных производных, активных фракций или производных с круговой перестановкой.

5. Применение ингибитора 1Ь-18 для получения лекарственного средства для предотвращения и/или лечения ишемических синдромов в результате дестабилизации бляшки, где ингибитор 1Ь-18 выбран из группы, состоящей из 1СЕ-ингибиторов, антител против 1Ь-18, антител против любой из субъединиц рецептора 1Ь-18, ингибиторов передачи сигнала от рецептора 1Ь-18, антагонистов 1Ь-18, которые конкурируют с 1Ь-18 и блокируют рецептор 1Ь-18. и белков, связывающих 1Ь-18, их изоформ, мутеинов, гибридных белков, функциональных производных, активных фракций или производных с круговой перестановкой.

6. Применение ингибитора 1Ь-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения распада атеросклеротической бляшки, где ингибитор 1Ь-18 выбран из группы, состоящей из 1СЕ-ингибиторов, антител против 1Ь-18, антител против любой из субъединиц рецептора 1Ь-18, ингибиторов передачи сигнала от рецептора 1Ь-18, антагонистов 1Ь-18, которые конкурируют с 1Ь-18 и блокируют рецептор 1Ь-18, и белков, связывающих 1Ь-18, их изоформ, мутеинов, гибридных белков, функциональных производных, активных фракций или производных с круговой перестановкой.

7. Применение ингибитора 1Ь-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения рецидивирующих случаев сердечной недостаточности, где ингибитор 1Ь-18 выбран из группы, состоящей из 1СЕ-ингибиторов, антител против 1Ь-18, антител против любой из субъединиц рецептора 1Ь-18, ингибиторов передачи сигнала от рецептора 1Ь-18, антагонистов 1Ь-18, которые конкурируют с 1Ь18 и блокируют рецептор 1Ь-18, и белков, связывающих 1Ь-18, их изоформ, мутеинов, гибридных белков, функциональных производных, активных фракций или производных с круговой перестановкой.

8. Применение по п.7, отличающееся тем, что сердечная недостаточность имеет ишемический характер.

9. Применение по п.7, отличающееся тем, что сердечная недостаточность имеет неишемический характер.

10. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что ингибитор Ш-18 представляет собой антитело против 1Ь-18.

11. Применение по п.10, отличающееся тем, что антитело представляет собой гуманизированное антитело.

12. Применение по п.10, отличающееся тем, что антитело представляет собой антитело человека.

13. Применение по любому из пп.1-9, отличающееся тем, что ингибитор 1Ь-18 представляет собой 1Ь-18ВР или его изоформу, мутеин, производное или фрагмент.

14. Применение по п.13, отличающееся тем, что белок, связывающий Ш-18, связан с РЕС.

15. Применение по п.13, отличающееся тем, что ингибитор 1Ь-18 представляет собой гибридный белок, содержащий полностью 1Ь-18-связывающий белок или его часть, присоединенный к целому иммуноглобулину или его части, и гибридный белок связывается с 1Ь-18.

16. Применение по п.15, отличающееся тем, что гибридный белок содержит целиком или часть константной области иммуноглобулина.

17. Применение по п.16, отличающееся тем, что иммуноглобулин относится к изотипу 1дС1 или 1§С2.

18. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что лекарственное средство дополнительно содержит интерферон для одновременного, последовательного или отдельного применения.

19. Применение по п.18, отличающееся тем, что интерферон представляет собой интерферон-β.

20. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что лекарственное средство дополнительно содержит антагонист фактора некроза опухоли (ΤΝΕ) для одновременного, последовательного или отдельного применения.

21. Применение по п.20, отличающееся тем, что антагонист ΤΝΕ представляет собой ΤΒΡΙ и/или ΤΒΡΙΙ.

22. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что лекарственное средство дополнительно содержит ингибитор СОХ для одновременного, последовательного или отдельного применения.

23. Применение по п.22, отличающееся тем, что ингибитор СОХ представляет собой ингибитор СОХ-2.

24. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что лекарственное средство дополнительно содержит ингибитор тромбоксана для одновременного, последовательного или отдельного применения.

- 20 005410

25. Применение по п.24, отличающееся тем, что ингибитор тромбоксана представляет собой аспирин.

26. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что лекарственное средство дополнительно содержит вещество, снижающее уровень липидов, для одновременного, последовательного или отдельного применения.

27. Применение по п.26, отличающееся тем, что вещество, снижающее уровень липидов, представляет собой ингибитор НМС СоА.

28. Применение по п.27, отличающееся тем, что ингибитор НМС СоА представляет собой статин.

29. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что лекарственное средство применяют в сочетании с диетой со сниженным содержанием жира, и/или холестерина, и/или соли.

30. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что ингибитор ЕС-18 применяют в количестве приблизительно от 0,0001 до 10 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,01 до 5 мг/кг массы тела, или приблизительно от 0,1 до 3 мг/кг массы тела, или приблизительно от 1 до 2 мг/кг массы тела.

31. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что ингибитор ΙΕ-18 применяют в количестве приблизительно от 0,1 до 1000 мкг/кг массы тела, или приблизительно от 1 до 100 мкг/кг массы тела, или от 10 до 50 мкг/кг массы тела.

32. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что ингибитор ΙΕ-18 вводят подкожно.

33. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что ингибитор ЕС-18 вводят внутримышечно.

34. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что ингибитор ΙΕ-18 вводят ежедневно.

35. Применение по любому из предшествующих пунктов, отличающееся тем, что ингибитор ΙΕ-18 вводят через день.

36. Применение экспрессирующего вектора, содержащего последовательность, кодирующую ингибитор ΙΕ-18, для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения атеросклероза, где ингибитор ΙΕ-18 выбран из группы, состоящей из IСЕ-ингибиторов, антител против ΙΕ-18, антител против любой из субъединиц рецептора ΙΕ-18, ингибиторов передачи сигнала от рецептора ΙΕ-18, антагонистов ΙΕ-18, которые конкурируют с ΙΕ-18 и блокируют рецептор ΙΕ-18, и белков, связывающих ΙΕ18, их изоформ, мутеинов, гибридных белков, функциональных производных, активных фракций или производных с круговой перестановкой.

37. Применение по п.36, отличающееся тем, что экспрессирующий вектор вводят путем электропереноса.

38. Применение по п.36 или 37, отличающееся тем, что экспрессирующий вектор вводят системно.

39. Применение по любому из пп.36-38, отличающееся тем, что экспрессирующий вектор вводят внутримышечно.

40. Применение вектора для индукции и/или усиления эндогенной продукции ингибитора ΙΕ-18 в клетке для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения атеросклероза, где ингибитор ЛС-18 выбран из группы, состоящей из [СЕ-ингибиторов, антител против СС-18, антител против любой из субъединиц рецептора ΙΕ-18, ингибиторов передачи сигнала от рецептора СС-18, антагонистов СС-18, которые конкурируют с НС-18 и блокируют рецептор НС-18, и белков, связывающих НС-18, их изоформ, мутеинов, гибридных белков, функциональных производных, активных фракций или производных с круговой перестановкой.

41. Применение генетически модифицированной клетки для продуцирования ингибитора ΙΕ-18 для получения лекарственного средства для лечения и/или предотвращения атеросклероза, где ингибитор ΙΕ18 выбран из группы, состоящей из IСЕ-ингибиторов, антител против ΙΕ-18, антител против любой из субъединиц рецептора ΙΕ-18, ингибиторов передачи сигнала от рецептора БС-18/ антагонистов ΙΕ-18, которые конкурируют с БС-18 и блокируют рецептор ΙΕ-18, и белков, связывающих ΙΕ-18, их изоформ, мутеинов, гибридных белков, функциональных производных, активных фракций или производных с круговой перестановкой.

42. Способ лечения и/или предотвращения атеросклероза, включающий введение нуждающемуся в этом организму-хозяину эффективного ингибирующего количества ингибитора ΙΕ-18, где ингибитор ΙΕ18 выбран из группы, состоящей из IСЕ-ингибиторов, антител против ΙΕ-18, антител против любой из субъединиц рецептора ΙΕ-18, ингибиторов передачи сигнала от рецептора ΙΕ-18, антагонистов ΙΕ-18, которые конкурируют с БС-18 и блокируют рецептор ΙΕ-18, и белков, связывающих ΙΕ-18, их изоформ, мутеинов, гибридных белков, функциональных производных, активных фракций или производных с круговой перестановкой.

43. Способ предотвращения и/или лечения атеросклероза, включающий введение нуждающемуся в этом организму-хозяину экспрессирующего вектора, содержащего последовательность, кодирующую ингибитор ΙΕ-18, где ингибитор БС-18 выбран из группы, состоящей из IСЕ-ингибиторов, антител против

- 21 005410

10-18, антител против любой из субъединиц рецептора Ю-18, ингибиторов передачи сигнала от рецептора Ю-18, антагонистов Ю-18, которые конкурируют с Ю-18 и блокируют рецептор Ю-18, и белков, связывающих Ю-18, их изоформ, мутеинов, гибридных белков, функциональных производных, активных фракций или производных с круговой перестановкой.

44. Способ по п.43, отличающийся тем, что экспрессирующий вектор вводят системно.

45. Способ по п.43 или 44, отличающийся тем, что экспрессирующий вектор вводят путем внутримышечной инъекции.

Список последовательностей <110> Αρρϋεό кезеагсЬ 5уз1етз анз но1<Нлд Ν.ν.

<120> Применение ингибиторов 11.-18 для лечения и/или предотвращения атеросклероза

<130> 443 НО <140> <141> РСТ/ЕР01/04843 2001-04-30 <150> <151> ЕР 00109606.4 2000-05-05 <160> 14 <170> РаГепЫп уегзтоп 3.1 <210> <211> <212> <213> 1 20 ДНК Ното зартепз <220> <221> <222> <22 3> обратный праймер П.-18 (1)..(20)

<400> 1 дсдгсасХас астсадсЬаа 20

<210> <211> <212> <213> 2 20 ДНК Ното зарзепз <220> <221> <222> <22 3> прямой праймер 11--18 (1)..(20)