KR101526307B1 - 항염증성 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항염증성 약학 조성물, 특히 CD93의 수용성 단편(sCD93)에 대한 특이적인 항체를 유효성분으로 포함하는 항염증성 약학 조성물을 개시한다.

염증, CD93, 항체

Description

항염증성 약학 조성물{Anti-inflammatory Pharmaceutical Composition}

본 발명은 CD93의 수용성 단편(sCD93)에 대한 특이적 항체를 유효성분으로 포함하는 항염증성 조성물에 관한 것이다.

인간 CD93(C1qRp, AA4.1(mouse))은 염색체 20번, p11.21에 위치한 제1형(type 1) 막통과 당단백질이다(Malhotra, R.et al., 1993. Immunology 78: 341-348; Nepomuceno, R. R. et al., 1997. Immunity 6: 119-129; Steinberger, P. et al., 2002. Biol. 71: 133-140).

또한 이 단백질은 B 세포 발달에 있어서 세포-세포간 결합(interaction)과 식세포작용(phagocytosis)에 관련되어진 것으로 보고되고 있다(Petrenko, O. et al., 1999. Immunity 10: 691-700; Norsworthy, P. J. et al., 2004. J. Immunol. 172: 3406-3414; Nepomuceno, R. R. et al., 1997. Immunity 6: 119-129; McGreal, E. P. et al., 2002. J. Immunol. 168: 5222-5232).

CD93은 총 652개 아미노산으로 구성되어지며, 리더서열, c-형 탄수화물 인식 도메인(c-type carbohydrate-recognition domain), 5개의 EGF 유사 도메인(EGF-like domain), 뮤신 도메인, 하나의 막통과 도메인, 47개 아미노산의 세포내 도메인(intracellular domain)을 포함하고 있다(Nepomuceno R. R. et al., 1997. Immunity 6:119-129; Park, M. et al., 2003. J. Cell Physiol. 196: 512-522; Nepomuceno, R. R. et al., J. Immunol. 162:3583).

CD93은 또한 조혈모세포(haematopoietic stem cell), NK 세포, 혈소판, 신경교세포(microglia) 그리고 표피세포(endothelial cell) 등에서 발현되어진다(Nepomuceno, R. R. et al., 1997. Immunity 6:119; Nepomuceno, R. R. et al., 1998. J. Immunol. 160:1929; Danet G. H. et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99:10441-5; Lovik G. et al., J Immunol 2000; 30:3355-62; Fonseca M. I. et al., J Leukoc Biol 2001; 70:793-800; Webster, S. D. et al., 2000. J. Leukocyte Biol. 67:109).

또 다른 연구결과에서는 조직 대식세포(tissue macrophage)에서는 발현되지 않으며, 혈관내피세포(vascular endothelial cell)에서 많이 발현되어진다고 보고하고 있다(Petrenko, O. et al., 1999. Immunity 10:691; Dean, Y. D. et al., J. Immunol. 31:1370; Fonseca, M. I. et al., 2001. J. Leukocyte Biol. 70:793.).

CD93은 원래 항-CD93 항체를 이용한 결과에서 C1q-매개 식세포 작용 촉진(C1q-mediated enhancement of phagocytosis)에 관여한다고 하여 C1q에 대한 리셉터로서의 가능성이 제기되어 왔으나 연이은 실험에서 C1q와 직접 결합하지 않는 것으로 여러 그룹에서 보고되었다(Nepomuceno, R. R. et al. 1999. J. Immunol. 162:3583; McGreal, E. P. et al., 2002. J. Immunol. 168:5222; Steinberger, P. et al., 2002. J. Leukocyte Biol. 71:133).

CD93 녹아웃 마우스 실험에서는 CD93의 부재에 의해 사멸 세포의 제거 기능에 문제가 생기는 것으로 밝혀졌고, 생체외(in vitro) 실험에서는 그런 기능 이상이 보여지지 않는 상반된 결과가 도출되었다(Guan, E. et al., 1994. J. Immunol. 152: 4005-4016; Norsworthy, P. J. et al., 2004. J. Immunol. 172: 3406-3414; Norsworthy, P. J. et al., 2004. J. Immunol. 172: 3406-3414).

이러한 식세포 기능은 면역반응에서 초기 중요한 역할을 담당하고 있으며, 사멸된 세포들의 제거에 중요한 역할을 하고 있다(Brown, E. J. (1995) Phagocytosis. Bioessays 17, 109-117).

이런 기능들에 대한 실마리를 푸는 최근 연구 결과에서, CD93이 TNF-a, LPS등의 염증 상태에서 엑토도메인(ectodomain)이 잘려지는 현상이 일어난다는 보고가 있었다(Park, M. et al., 2003. J. Cell Physiol. 196: 512-522.; Suzanne S. Bohlson et al., 2005. J. immunol. 175: 1239-1247)

본 발명은 CD93 단백질의 수용성 단편인 sCD93이 염증 반응을 촉진하고 그 항체가 염증 반응을 억제함을 확인함으로써 완성된 것이다.

본 발명의 목적은 항염증성 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적이나 구체적인 양태 등은 이하에서 제시될 것이다.

본 발명은 sCD93에 대한 특이적인 항체를 유효성분으로 포함하는 항염증성 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명자들은 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이 sCD93을 인간 유래 단구 세포인 THP-1 세포에 처리하였을 때, 미토젠-활성화 단백질 키나제(mitogen-activated protein kinases, MAPK)의 활성화가 매개되어 THP-1 세포가 마크로파지로 분화하고 식세포 작용이 유도되며, 또 TNF-α, IL-1β, IL-6 등 염증성 사이토카인의 분비가 증가하고, 기질금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)의 분비가 촉진되는 등 염증 반응이 유도되는 것을 확인할 수 있었다.

상기에서 MAPK는 세균성 지질 다당류 등 염증 유발 물질에 의하여 활성화되어 염증성 사이토카인의 분비 등을 촉진하는 것으로 알려져 있으며, MMP는 염증 반응이 유도되는 과정에서 그 분비가 촉진되는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 이러한 sCD93의 염증 반응 유도 효과에 착안하여 그것의 항체를 THP-1 세포에 처리하였을 때 활성화된 단핵세포나 대식세포에 의해 일차적으로 생성되는 것으로 알려진 사이토카인인 TNF-α가 감소하는 것도 확인할 수 있었다.

본 발명은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로서, 본 발명의 항염증성 약학적 조성물은 sCD93에 대한 특이적인 항체를 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

본 명세서에서, "sCD93"은 전장의 CD93 단백질에서 떨어져 나온 CD93 단백질의 수용성 단편을 의미하며 그것의 아미노산 서열과 염기서열은 <도 1B> 및 <서열번호 1 및 2>에 개시되어 있다. 본 명세서에서 표적 단백질은 특별히 다른 언급이 없는 한 sCD93을 의미한다. 전장의 CD93 단백질의 서열은 <도 1A> 및 <서열번호 3>에 개시되어 있으며, 위 단백질 유전자의 염기서열은 <서열번호 4>에 개시되어 있다.

또한 본 명세서에서, "항염증성"의 의미는 염증이나 염증성 질환의 예방, 개선, 치료, 및 발병 지연을 포함하는 의미이다.

또한 본 명세서에서, 상기 "염증성 질환"이란 외부의 물리·화학적 자극 또는 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 각종 알레르기 유발 물질 등 외부 감염원의 감염에 대한 국부적 또는 전신적 생체 방어 반응으로 특정되는 어떠한 상태로서 정의될 있다. 이러한 반응은 각종 염증 매개 인자와 면역세포와 관련된 효소(예컨대 iNOS, COX-2 등) 활성화, 염증 매개 물질의 분비(예컨대, NO, TNF-α, IL-6, IL-1β, PGE₂의 분비), 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등의 일련의 복합적인 생리적 반응을 수반하며, 홍반, 통증, 부종, 발열, 신체의 특정 기능의 저하 또는 상실 등의 증상에 의해 외적으로 나타난다. 상기 염증성 질환은 급성, 만성, 궤양성, 알레르기성 또는 괴사성을 띨 수 있으므로, 어떠한 질환이 상기와 같은 염증성 질환의 정의에 포함되는 한 그것이 급성이든지, 만성이든지, 궤양성이든지, 알레르기성이든지 또는 괴사성이든지를 불문한다. 구체적으로 상기 염증성 질환에는 천식, 알레르기성 및 비-알레르기성 비염, 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염 또는 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 통증, 편두통, 두통, 허리 통증, 섬유 근육통, 근막 질환, 바이러스 감염(예컨대, C형 감염), 박테리아 감염, 곰팡이 감염, 화상, 외과적 또는 치과적 수술에 의한 상처, 프로스타글라딘 E 과다 증후군, 아테롬성 동맥 경화증, 통풍, 관절염, 류머티즘성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 습진, 다발성 경화증 등이 포함될 것이다.

또한 본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 약학적으로 허용되는 담체 등과 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다. 상기 "약학적으로 허용되는"의 의미에 대해서는 아래에서 설명될 것이다.

또한 본 명세서에서, "특이적 결합"의 의미는 항체가 그 표적 단백질인 sCD93과 항원-항체 결합체를 형성하고, 다른 단백질과는 실질적으로 그러한 결합체를 형성하지 않는 경우를 의미한다. 여기서 "실질적으로"란 정도는 낮지만 비특이적인 결합체는 형성될 수 있다는 것을 의미한다. 상기 "특이적 결합"의 의미는 달리 표현할 경우 그 결합이 단백질의 특정 구조 즉 항원의 결정 부위인 에피토프에 의해서 결정되는 결합이라고 표현될 수도 있다.

본 명세서에서, "에피토프"란, 표적 단백질인 sCD93에서 항원성 또는 면역원성을 갖는 부분의 아미노산 영역(항원 결정기)을 가리킨다. 에피토프는 통상 적어 도 적어도 10개 아미노산을 포함할 것이다. 이러한 에피토프는 당업계의 공지·관용된 에피토프 해석법 예컨대, 파지 제시(phage display)법, 역면역유전학(reverse immunogenetics) 등에 의해서 동정될 수 있다.

본 명세서에서, "항체"는 표적 단백질인 sCD93에 특이적으로 결합하는 것이면 모든 형태의 것을 포함하는 의미이다. 따라서 모노클로날항체, 폴리클로날항체, 다중특이적 항체(즉 두 개 이상의 항원 또는 두 개 이상의 에피토프에 대해 결합 특이성을 갖는 항체로서 예컨대 이특이적 항체 등을 말함), 인간화 항체, 인간 항체를 포함하는 것 이외에, 표적 단백질인 sCD93에에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 단편, 재조합 항체, 화학적으로 수식된 항체를 포함한다.

상기에서 인간화 항체는 인간 면역글로불린의 상보성 결정 영역(CDR)이 마우스, 토끼, 쥐, 영장류 등 비인간 종의 CDR로 대체된 항체로서 면역 거부 반응을 최소화한 항체를 말하는데, 이러한 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상세한 것은 문헌 [Riechmann L. et al., Nature, 332; 323-327, 1988], 문헌[Nakatani T. et al., Protein Engineering, 7; 435-443, 1994], 문헌[Jones et al., Nature, 321 :522-525 (1986)], 문헌[Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)] 등을 참조할 수 있다.

또한 상기에서 인간 항체는 내인성 면역글로불린을 생산할 수 있는 유전자를 파괴시킨 마우스 등의 동물에 인간 면역글로불린 유전자를 도입시키고, 그 동물에 특정 항원을 면역시켜 얻어지는 항체를 말한다. 구체적인 것은 문헌[Jakobovits et al., Proc, Natl. Acad, Sci. USA, 90: 2551 (1993)], 문헌[Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993)], 문헌[Bruggermann et al., Year in Immuno., 7: 33 (1993)], 문헌[Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Bio., 222: 581-597 (1991)] 등을 참조할 수 있다.

또한 상기에서 항체의 단편의 예로서는 Fab, F(ab'), F(ab')₂, scFv(중쇄나 경쇄의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 항체), Fv 단편, Fab/c(1개의 Fab와 완전한 Fc를 가지는 항체), 선형 항체(Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)), 항체를 단백질 절단 효소 예컨대, 파파인, 펩신으로 처리하여 얻어진 항체 단편, 단편에 대한 유전자를 후술하는 바와 같이 유전자 재조합 방법으로 숙주세포에 도입·발현시켜 얻어지는 항체 단편을 포함하는 의미이다. 상기 항체의 글로불린 유형도 표적 단백질인 sCD93에에 특이적으로 결합하는 것이면 특별히 한정되지 않는데, 그 글로불린 유형은 IgG, IgM, IgA, IgE, IgY 및 IgD 중 어느 하나일 수 있다.

한편 폴리클로날 항체는, 조류(예를 들면, 닭 등), 포유 동물(예를 들면, 토끼, 염소, 말, 양, 쥐, 비인간 영장류(원숭이, 침팬지, 고릴라) 등)에 표적 단백질인 sCD93을 면역시킴으로써 제조할 수 있다. 통상 최종 면역일부터 6 내지 60일 후에 효소 면역 측정법(EIA 및 ELISA), 방사 면역 측정법(RIA) 등으로 항체가를 측정하고, 최대 항체가를 나타낼 때에 채혈하는 과정을 밟게 될 것이다. 항체는 면역된 동물의 혈액으로부터 당업계의 공지·관용된 방법 예컨대 이온교환크로마토그래피, 친화도-크로마토그래피 등의 방법을 사용하여 정제할 수 있다.

모노클로날 항체는 표적 단백질인 sCD93에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주에 의해서 얻어질 수 있다. 이러한 하이브리도마 세포주를 생산하기 위한 방법으로서, 예컨대 동물(예컨대, 마우스)을 표적 단백질인 sCD93로 면역시키고, 그 면역시킨 동물로부터 비장 세포를 채취하고, 그 비장 세포를 골수종 세포주에 융합시키고, 그에 따라 하이브리도마 세포를 생성하고, 그리고 목적으로 하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 동정하는 방법을 들 수 있다. 그러한 세포주로부터 모노클로날 항체의 분리·회수는 당업계의 공지·관용기술에 의해서 가능하다.

이러한 모노클로날 항체의 제조에 대해서 보다 자세히 설명하면 아래와 같다.

먼저 모노클로날 항체를 얻기 위해서는 면역원인 표적 단백질인 sCD93를 포유동물, 예를 들면 랫드, 마우스, 토끼, 원숭이, 염소, 비인간 영장류(원숭이, 침팬지, 고릴라) 등에 투여할 필요가 있다. 면역원의 1회 투여량은 당업자가 면역 동물의 종류, 투여 경로 등을 고려하여 그의 통상의 능력 범위 내에서 적절하게 결정할 수 있다. 통상은 동물 1 마리당 약 50 내지 200 ㎍일 것이다. 투여는 통상 면역원을 PBS(phospate-buffered saline)나 생리 식염수 등으로 적당량 희석·현탁시키고 통상의 어쥬번트를 혼합하고 유화한 후에 피하, 복강 내에 주입함으로써 행해질 수 있다. 이러한 투여는 처음의 투여 후 수일에서 수주 간 간격으로, 바람직하게는 1 내지 4주간 간격으로 2 내지 10회, 바람직하게는 3 내지 4회에 걸쳐 이루어질 것이다. 면역원의 투여를 계속하면서 ELISA 방법 등에 의해서 면역 동물의 혈청 중 항체가를 측정하여 항체가가 정점(plateau)에 도달했을 때는, 최종적으로 면역원을 정맥 내 또는 복강 내에 투여하고, 그 최종 투여일로부터 2 내지 5일 후에 항체 생산 세포를 채취한다. 항체 생산 세포로는 비장 세포, 림프절 세포, 말초혈 세포 등을 들 수 있지만, 비장 세포 또는 림프절 세포가 바람직하다.

항체 생산 세포를 채취한 후에는 투여된 면역원 즉 본 발명의 표적 단백질인 sCD93에 특이적인 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제조한다. 이러한 하이브리도마는 당업계의 공지·관용 기술에 의해서 생산하고 동정하는 것이 가능하다. 통상은 항체 생산 세포, 바람직하게는 비장 세포를 면역된 동물로부터 채취하고, 그 비장 세포를 골수종 세포주에 융합시켜 하이브리도마 세포를 제조하며, 면역원에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 동정하는 단계를 거치게 될 것이다. 항체 생산 세포와 융합되는데 사용되는 골수종 세포주는 마우스 등의 동물로부터 유래한 세포주를 사용할 수 있는데, 이러한 세포주는 상업적으로 입수 가능하다. 바람직한 골수종 세포주는 면역 동물과 동종계의 동물에서 유래하고, 항생제 등에 대한 약제 선택성을 지니며, 비장 세포와 융합되지 아니한 상태로는 히포크산틴, 아미노푸테린 및 티민을 포함하는 HAT 선택 배지에서 생존할 수 없고 비장 세포와 융합한 상태에서만 생존할 수 있는 특성을 지니는 것이 바람직하다. 골수종 세포주의 구체적인 예로서는 BALB/c 마우스 유래의 HGPRT(hypoxantine guanine phosporibosyl-transferase) 결손 세포주인 P3X63(ATCC TIB9) 등을 들 수 있다.

항체 생산 세포인 비장 세포와 골수종 세포주의 융합은 혈청을 포함하지 않 는 DMEM, RPMI-1640 배지 등의 동물 세포 배양용 배지 중에서 항체 생산 세포와 골수종 세포주를 적정한 비율(약 1:1 내지 20:1의 비율)로 혼합하고, 세포 융합 촉진제의 존재하에서 융합 반응을 수행함으로써 이루어지게 된다. 세포 융합 촉진제로서 평균 분자량 1500 내지 4000 달톤의 폴리에틸렌글리콜 등을 약 10 내지 80 ％의 농도로 사용할 수 있다. 또한 경우에 따라서는 융합 효율을 높이기 위해서, 디메틸술폭시드 등의 보조제를 병용할 수도 있다. 또한 시판되고 있는 세포 융합 장치를 이용하여 융합시킬 수도 있다.

세포 융합 처리 후, 목적으로 하는 하이브리도마를 선별하여야 한다. 통상 세포 현탁액을 우태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지 등으로 적당히 희석한 후, 마이크로타이터 플레이트 상에 세포를 웰당 200만개 정도로 분주하고, 각 웰에 선택 배지를 첨가하고, 이후 동일한 선택 배지로 적절히 교환하여 줌으로써 신선한 배지를 공급하며 배양한다. 배양 온도는 통상 20 내지 40 ℃이다. 골수종 세포주가 HGPRT 결손주 또는 티미딘 키나제 결손주인 경우에는 히포크산틴·아미노프테린·티미딘을 포함하는 선택 배지(HAT 배지)를 이용함으로써, 항체 생산 세포와 골수종 세포주의 하이브리도마만을 선택적으로 배양하고 증식시킬 수 있다. 그러면 선택 배지에서 배양 개시 후 약 14일 전후에서 생육되는 세포를 하이브리도마로서 얻을 수 있다. 이어서, 증식된 하이브리도마의 상등 배양물에서 목적으로 하는 항체의 존재 여부를 스크리닝한다. 이러한 하이브리도마의 스크리닝은 당업계의 공지·관용 기술에 따라 이루어질 수 있다. 그러한 기술로서 예컨대, 효소 면역 측정법(EIA: Enzyme Immuno Assay 및 ELISA), 방사 면역 측정법 등을 들 수 있다. 융합 세포의 클로닝은 한계 희석법(limiting dilution method) 등에 의해 이루어질 수 있다.

클로닝된 하이브리도마는 10% 우태아 혈청 함유 RPMI-1640 배지, DMEM 배지, 무혈청 배지 등 동물 세포 배양 배지에서 통상의 배양 조건(예를 들면, 37 ℃, 5 ％ CO2 농도)에서 배양하면 된다. 배양 기간은 2 내지 10일 정도이다. 모노클로날 항체는 그 상등 배양물로부터 수득할 수 있다.

모노클로날 항체는 당업계의 공지·관용 기술을 사용하여 회수할 수 있다. 그러한 당업계의 공지·관용 기술로서는 황산암모늄 염석법, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등의 방법 또는 이들을 조합한 방법 등을 들 수 있다.

본 발명의 모노클로날 항체의 생산에는 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하여 적당한 벡터에 삽입시키고 이를 적당한 숙주세포에 도입·발현시켜 수득하는 유전자 재조합 기술을 이용할 수도 있다(Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem., 192, 767-775, 1990).

구체적으로 본 발명의 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 본 발명의 항체의 가변 영역(V 영역)을 암호화하는 mRNA을 수득한다. 그 mRNA의 수득은 당업계의 공지·관용된 방법, 예를 들어 구아니딘 초원심분리법(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry., Vol 18, 5294-5299, 1979), AGPC법(Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem., 162, 156-159) 등을 사용하여 전체 RNA를 수득하고 그 전체 mRNA로부터 mRNA Purification Kit(Pharmacia 사) 등을 사용하여 목적하는 mRNA를 수득함으로써 이루어진다. 대안적으로는 QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia사 제품) 을 이용함으로써, mRNA를 직접 수득할 수도 있다.

수득된 mRNA로부터 역전사 효소를 이용하여 항체 가변 영역의 cDNA를 합성한다. 필요하다면 cDNA 합성·증폭에 RACE PCR 방법 등을 적용할 수도 있다. 이렇게 얻어진 가변 영역을 암호화하는 cDNA를 항체의 불변 영역(C 영역)을 암호화하는 DNA를 함유하는 발현 벡터에 삽입한다. 이러한 발현 벡터는 본 발명의 표적 단백질인 sCD93의 DNA 재조합 생산 방법과 관련하여 후술하는 바와 같이 프로모터, 인핸서, 복제 개시점, 폴리아데닐화 시그널, 리보솜 결합 부위 등 조절서열을 포함할 수 있다. 이 발현벡터가 숙주 세포에 형질전환되면 항체의 생산이 가능하게 된다. 항체 유전자의 발현은 항체 중쇄(H쇄) 또는 경쇄(L쇄)를 암호화하는 DNA를 각각 발현벡터에 재조합하여 숙주세포를 동시 형질전환시켜도 무방하며, 또는 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA를 단일의 발현벡터에 삽입하여 숙주세포를 형질전환시켜도 무방하다(WO 94/11523호 공보).

한편, 본 발명의 항체를 얻기 위하여 사용한 면역원으로서의 본 발명의 표적 단백질인 sCD93 당 업계의 공지·관용된 DNA 재조합 기술에 의하여 얻을 수 있다. 통상적으로는, 본 발명의 표적 단백질인 sCD93의 cDNA를 제작하고 그 cDNA를 발현 벡터에 삽입하고, 그 발현 벡터를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 형질전환시키고 그 형질전환된 숙주 세포를 적당한 배지에서 배양하고, 그 배양액 또는 세포로부터 얻게 될 것이다. 상기 cDNA는 GenBank 등의 유전자/단백질 테이터베이스가 제공하는 유전자 서열 또는 본 명세서가 제공하는 서열에 기초하여 당업자의 통상의 능력 범위 내에서 제작 가능하다.

이러한 cDNA의 제조에는 포스포아미다이트법 등을 이용하는 DNA 합성 장치, RT-PCR 법, cDNA 라이브러리로부터 목적하는 cDNA를 얻기 위한 혼성화 방법 등이 사용될 수 있고, 필요에 따라서는 PCR 방법 등에 의해서 목적하는 cDNA를 증폭할 수도 있다.

상기에서 발현벡터는 생명공학 회사 예컨대 노바겐(Novagen) 사, 다까라슈죠 사, 키아겐(Qiagen)사, 스트라타진(Stratagene) 사, 프로메가(Promega) 사, 로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnositics) 사, 인비트로겐(Invitrogen) 사, 제네틱스 인스티튜트(Genetics Institute)사 등으로부터 상업적으로 입수 가능하다.

이러한 발현 벡터에는 본 발명의 표적 단백질인 sCD93을 코딩하는 DNA 이외에 조절 엘리멘트, 예를 들면 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 시그널, 리보솜, 결합 부위, 복제 개시점, 터미네이터, 선택 마커, 단리·정제를 용이하게 하기 위한 표지 펩티드 서열(예컨대 히스티딘 반복 서열을 암호화하는 염기서열) 등이 포함될 수 있다.

숙주 세포는 세균 등의 원핵 세포(예를 들면 대장균, 고초균), 및 효모(예를 들면 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)), 곤충 세포(예를 들면 Sf 세포), 포유 동물 세포(예를 들면 COS, CHO, BHK) 등의 진핵 세포를 사용할 수 있다.

숙주 세포 또는 그 배양물로부터 본 발명의 표적 단백질의 정제에는 한외 여과, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피(표지 펩티드가 결합된 경우), HPLC, 소수성 크로마토그래피, 등전점 크로마토그래피 등의 방법이나 이들을 조합하는 방법이 사용될 수 있다.

DNA 재조합 기술에 의한 본 발명의 표적 단백질의 생산에 대해서는 본 명세서의 기재 내용 이외에 "Samrook 등, Molecular Cloning A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, US(1989)", "Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Jon Willey & Sons, US(1993)" 및 "Sambrook, J. ＆ Russel, D. 저, Molecular Cloning, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001년 1월 15일 발행의 제1권 7.42 내지 7.45, 제2권 8.9 내지 8.17" 등의 문헌을 참조할 수 있다. 이 문헌들은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.

본 발명의 항체를 생산하기 위한 면역원으로서의 본 발명의 표적 단백질은 그 단편(sCD93의 단편)이나 전장의 단백질(CD93 자체)이 사용될 수도 있다. 단편이나 전장의 단백질을 사용하여 얻어지는 항체도 본 발명의 표적 단백질에 특이적으로 결합하는 능력을 보유할 가능성이 있기 때문이다.

다른 측면에 있어서, 본 발명은 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 CD93 유전자의 발현을 억제할 수 있는 siRNA, shRNA 및 shRNA의 발현벡터로부터 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 것을 유효성분으로 포함하는 항염증성 약학적 조성물에 관한 것이다.

아래의 실시예는 CD93 유전자에 대한 siRNA를 THP-1에 처리하였을 때, 염증 유발 물질인 LPS(lipopolysaccharide) 처리시 증가하는 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6 발현량을 감소시킴을 보여준다.

특정 유전자에 대한 짧은 이중 가닥의 RNA인 siRNA(small interfering RNA) 나 shRNA(short haripin RNA)가 세포 내로 도입될 경우 리보뉴클레아제인 다이서(dicer)에 의해 프로세싱되어 RISC(RNA induced gene sciencing complex)에 결합함으로써 RNAi(RNA inhibition)를 유도하는 것으로 알려져 있다(Nature 391, 806-811, 1998; Genes Dev. 15, 485-490, 2001; Nature 411, 494-498, 2001; Science 287, 2494-2497, 2000; Cell 101, 25-33, 2000). 이러한 RNAi에는 헬리카제와 엔도뉴클레아제가 관여하여, 헬리카제에 의해 siRNA의 이중 가닥의 RNA가 풀려지고 이 중 안티센스는 표적 유전자의 mRNA에 결합하는데, 이 결합된 부위는 엔도뉴클레아제에 의해서 가수분해되게 된다(Cell 101, 25-33, 2000; Science 296, 1265-1269, 2002; J. Biol. Chem. 2003 Feb 28:278(9):7108-18).

본 명세서에서, "siRNA"는 그 표적 유전자의 RNA에 대해서 RNAi 현상을 유도할 수 있는 10 내지 40 염기쌍을 갖는 이중 가닥 RNA, 바람직하게는 15 내지 30의 염기쌍을 갖는 이중 가닥 RNA, 더 바람직하게는 20 내지 22 염기쌍을 갖는 이중 가닥의 RAN를 의미한다. 이러한 siRNA는 블런트(blunt) 말단을 갖거나 돌출(overhang) 말단을 가질 수 있으며, 돌출 말단을 가질 경우 그것은 3'말단과 '5말단 모두에서 가능하다. 바람직하게는 3'말단이 돌출된 경우이다. 돌출된 말단의 염기수는 1 내지 5, 바람직하게는 2 내지 3 염기일 수 있다.

또한 본 명세서에서, "shRNA"는 2 내지 10 염기의 루프(loop) 영역을 갖는 헤어핀 구조의 이중 가닥 RNA를 말한다. 이러한 루프 영역의 염기는 당업계에 공지된 것들을 사용할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. US A 99(8): 5515-5520, 2002; Nature Biotechnology 20: 505-508, 2002; Nature Biotechnology 20 : 500-505, 2002; Nat Cell Biol. 5:489-490, 2003; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(9):6047-6052, 2002). shRNA의 이중 가닥 부분은 상기 siRNA와 동일하게 구성할 수 있으므로 siRNA와 관련한 설명이 그대로 적용된다.

또한 본 명세서에서 "shRNA의 발현벡터"는 shRNA의 코딩 서열을 포함함으로써 세포 내에서 shRNA를 발현시킬 수 있는 벡터를 의미한다. 상기 shRNA 코딩 서열은 CD93 유전자의 일부 서열과 루프 영역을 구성하는 스페이서(spacer) 서열 및 그 CD93 유전자의 일부 서열에 상보적인 서열로 구성되는데, shRNA 코딩 서열은 사용될 발현벡터에 따라 RNA이거나 DNA일 수 있으며 발현벡터의 조절 서열(예컨대 프로모터, 폴리아네닐화 시그널 등)에 작동 가능하게 연결되게 된다. 발현벡터는 플라스미드 유래의 발현벡터이거나 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 플라스미드 유래 발현벡터는 프로메가(Promega) 사(Cat Nos. C8750, C8760, C8770, C8780, C8790, C7800 등), 진스크립트(Genscript) 사((Cat.Nos. SD1201, SD1202, SD1207) 등 생명공학회사에서 시판하는 것을 구입하여 사용하거나 자체 제작하여 사용할 수 있다. 렌티바이러스 벡터의 이용에 대해서 국제특허 제WO2004/065549호의 개시 내용을 참조할 수 있다.

한편 본 발명의 약학적 조성물은 sCD93에 대한 항체나 siRNA, shRNA 등을 포함하는 외에 통상적으로 제약상 허용되는 담체를 포함할 것이다. 여기서 "제약상 허용되는"는 의미는 유효성분의 활성을 억제하지 않으면서 적용(처방) 대상이 적응가능한 이상의 독성(충분히 낮은 독성)을 지니지 않는다 의미이다. 이러한 담체의 예로는 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올, 폴리알콜(예, 만니톨, 솔비톨 ), 염화나트륨 등을 들 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 그 저장 수명을 연장하거나 유효성을 보존하기 위하여 보존제, 항산화제, 습윤제, 유화제, 완충제, 비이온계 계면활성제 등을 포함할 수도 있다. 이러한 보존제, 항산화제, 습윤제 등으로서 적당한 것은 당업계에 공지되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 다양한 형태로 제형화될 수 있는데, 예컨대 액상 용액, 현탁액, 시럽, 정제, 환제 등으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 경구적으로 또는 비경구적으로 투여될 수 있는데, 통상은 항체를 유효성분으로 포함하는 바이오의약품과 마찬가지로 정맥내, 피하, 복강내, 근육내 주사에 의하여 투여될 것이다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 그 조성물의 유효성분의 함유량, 질병의 중증 정도, 환자의 체중, 약물 형태, 투여 경로, 투여 기간에 따라 의학적 전문인에 의해 결정될 것인데, 통상은 1일 0.01㎍/kg 내지 100mg/kg 범위 내에서 결정될 것이다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 sCD93에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 항염증성 약학적 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명의 조성물은 염증성 질환의 예방, 치료 등에 유용하게 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> sCD93 단백질의 준비

<실시예 1-1> pYW600의 제작

<1> oriP의 삽입

우선 oriP를 클로닝하기 위해, pMEP4(Invitrogen, USA)를 주형으로 정방향 프라이머(5'-gtagatctgcaggaaaaggacaagc-3'; 서열번호 27) 및 역방향 프라이머(5'-cgagatctggttgacttccctaatgt-3'; 서열번호 28)를 이용하여 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 30 사이클의 조건으로 PCR 반응을 수행한 후, 2187 bp 크기의 PCR 산물을 PCR 정제 키트(Promega, USA)를 이용하여 정제하였다. 그런 다음, 상기 PCR 산물을 BglII 효소(Invitrogen, USA)로 절단한 뒤, 절단 산물을 다시 정제하였다. 상기 정제된 절단 단편을 pcDNA3.1(Invitrogen, USA)의 CMV 프로모터 상부에 존재하는 BglII 인식부위에 BglII 효소(Invitrogen, USA)를 이용하여 선형화한 벡터에 삽입한 후, 대장균에 형질전환시켜 형질전환체를 수득하였다(pcDNA3.1-oriP). 상기 형질전환체로부터 플라스미드를 통상의 방법으로 추출한 후, 염기서열 분석을 통해 oriP가 제대로 삽입되었는지 확인하였다.

<2> 인간 항체 Fc를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 삽입

상기에서 제조한 oriP가 삽입된 pcDNA3.1 벡터에 인간 항체 Fc를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하기 위해, pLCN-MoH 벡터(대한민국 등록특허 제450266호)를 주형으로,'Bam HI-SfiI-human immunoglobulin Fc N-terminal sequence'로 구성된 정방향 프라이머(5'-cgg gat cc g gcc gtg ggg gcc gac aaa a ct cac aca tgc c-3': 서열번호 29)와 'XbaI-stop codon-human immunoglobulin Fc C-terminal sequence'로 구성된 역방향 프라이머(5'-cgagtc tca ttt acc cgg aga cag gga-3': 서열번호 30)를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다(94℃, 4분 처리 후, 95℃, 30초, 60℃, 30초, 72℃, 1분 과정을 30회 반복한 후 72℃, 10분간 연장).

이어, PCR 산물을 PCR 정제 키트(Promega, USA)를 이용하여 정제하였다. 상기 정제된 PCR 산물을 제한효소 BamHI 및 XbaI으로 절단한 후, 역시 BamHI 및 XbaI으로 절단한 상기에서 제조한 oriP가 삽입된 pcDNA3.1 벡터(pcDNA3.1-oriP)에 삽입하여, pcDNA3.1-oriP-Fc를 제조하였다. 이후, 상기와 같이 제조된 재조합 플라스미드로 대장균(DH5α)을 형질전환시키고, 형질전환체를 분리한 다음, 플라스미드를 수득하여, Fc를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제대로 삽입되었는지 확인하였다. 이로써 pYW600이 완성되었다.

<3> sCD93_Fc의 발현 정제

sCD93_Fc을 동물세포인 HEK293E 세포에서 발현/정제하기 위하여 sCD93_Fc를 발현시킬 수 있는 발현벡터를 제작하였다.

human IgG1 Fc 단편을 포함하고 있는 자체 제작된 상기 pYW600을 SfiI 으로 절단한 다음, PCR을 통해 얻어진 CD93 단편을 SfiI 으로 절단한후 삽입하였다. CD93 단편을 증폭하기 위하여 CD93 plasmid(Kugi 분양, hMU003993,Kugi No. IRAT-49-A06)를 template로 이용하였고, 정방향 primer로 5'-CAGGGGGCCGTGGGGGCCACGGGAGCTGACACGGAGGC-3'(서열번호 31)를, 역방향 primer로 5'-TAGCGGCCGACGCGGCCAAGTCCACACAGTCCAGCTGAC-3'(서열번호 32)를 사용하였다. CD93 PCR시 template는 100ng을, 각각의 primer는 10 pmol, Pfu DNA polymerase(2.5 unit/ul) 0.5 ul, 전체 50 ul를 반응하였다. CD93의 PCR 반응 조건은 다음과 같다. 초기 변성 과정으로 94℃에서 2분간 처리한 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분간 30회 반복하였고, 72℃에서 10분간 연장반응을 수행하였다. PCR product는 SfiI으로 짤라 CMV I.E Enhancer/Promoter와 Leader sequence가 앞에 있고 CD93 gene이 들어간 후, 6X His tag, Fc, Myc, 8X His tag이 순차적으로 만들어지는 pYK 602 벡터로 삽입하여 pYK-CD93_Fc 벡터를 만들었다.

상기 제작된 pCD93_Fc 20㎍과 Polyethylenimine(PEI, Polysciences) 40㎍을 섞어 150mm 디시(dish)에 미리 키워둔 HEK293E 세포에 도입하였다. 배양액을 총 8일동안 2일마다 수거하여 필터링한 다음 ProteinA sepharose(Amersham)를 이용하여 정제하였다. 정제한 시료를 Coomassie protein assay reagent(PIERCE)로 정량하여 SDS-PAGE gel에 걸어 그 사이즈를 확인하였다(도 2). 환원된 상태(Reduced; R)에서 sCD93_Fc는 70kDa 정도였고 환원되지 않은 상태(Non-reduced; N)에서는 140~150kDa 정도였다.

<실시예 2> sCD93 단백질의 THP-1 세포의 대식세포로의 분화 유도 효과 실험

사람 유래의 급성 단핵구성 백혈병(Acute monocytic leukemia) 세포인 THP-1 세포는 PMA 등의 화학물질에 의하여 부착(adherence), 퍼짐(spreading), 성숙 과정을 거치며 대식세포(macrophage)로 분화한다. 본 실험에서는 sCD93이 THP-1 세포의 대식세포로의 분화 유도 효과를 실험하였다.

먼저 5x10³ THP-1 세포(ATCC로부터 구입)를 96 well plate 에 옮겼다. 각각의 음성대조군에 PBS, Fc(5㎍/ml), normal human IgG(hIgG, 5㎍/ml)를 첨가하고, 양성대조군에는 PMA(Sigma, 0.1㎍/ml)를 처리하였으며, 실험군에는 sCD93_Fc 5, 1, 0.2, 0.04㎍/ml 농도로 처리하였다. 처리후 30분간 37℃ 배양실에 놓아둔 다음 다시 꺼내어, 붙은 세포가 떨어지지 않게 tapping으로 붙지 않은 세포들을 제거하였다. PBS로 2번 더 세척한 다음 광학현미경(Leika)으로 사진을 찍었다(도 3A). 붙지 않은 세포들이 담겨진 배양상등액으로 hematocytometer(Marienfeld,Germany)를 이용, 그 숫자를 계산하였다. 처음 넣어준 세포수에서 붙지않은 세포수를 뺀 나머지를 백분율로 나타내었다. THP-1 세포는 음성대조군에서는 붙지 않으나 sCD93_Fc를 처리한 실험군에서는 농도-의존적으로 부착 정도(%)가 높아짐을 관찰할 수 있었다(도 3B).

그 다음으로 상기와 동일한 방식으로 THP-1 세포에서 sCD93_Fc의 분화(differenciation) 효과를 알아보았다. 음성대조군으로 PBS(-), hIgG 5㎍/ml을 처리하고, 양성대조군은 PMA 0.1㎍/ml을 처리하였다. 실험군에는 sCD93_Fc를 5㎍/ml 농도로 처리하여 각각을 3일동안 배양하여 광학현미경으로 사진을 촬영하였다. 음성대조군은 분화하지 않았으며, sCD93_Fc를 넣어준 THP-1 세포는 PMA와 유사하게 macrophage-like 세포로 분화하였다(도 3C).

이러한 THP-1 세포의 분화에 따른 monocyte 세포인 THP-1 세포가 실제로 대식세포(macrophage)로 분화하는지를 알아보기 위해 이미 알려진 macrophage 및 dendritic cell, 그리고 neutrophil 분화 marker인 CD14, CD1a 및 CD64의 RNA level 발현량을 측정하기 위해 Real-time PCR을 수행하였다. THP-1 세포에 음성대조군으로 PBS(-), hIgG 5㎍/ml을 처리하고, 양성대조군은 PMA 0.1㎍/ml을 처리하였다. 또한 실험군으로는 sCD93_Fc 5㎍/ml을 처리하고 24시간이 경과한후 LPS에 의한 감수성을 알아보기 위해 LPS를 처리하였다. 처리후 다시 24시간이 경과한후, RNA를 분리정제하였다(Qiagen RNA miniprep kiT). 정제된 RNA 1㎍을 reverse transcription (iScript cDNA synthesis kit, Bio-Rad)하여 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA에 대해 아래 <표 1>의 프라이머, iG SYBR Green supermix(Bio-Rad) 및 CFX-96 Real-time system(Bio-Rad)을 이용 정량-PCR을 수행하였다. 그 결과, sCD93처리에 의해 THP-1 cell이 macrophage 분화함을 알수 있었고, LPS 처리에 의해 분화 마커인 CD14의 RNA level이 더욱 높아짐을 알수 있었다(도 3D).

프라이머 서열

분화 마커	정방향	역방향
CD14-New	GCCTAGACCTCAGCCACAACTC (서열번호 5)	CCAGCCCAGCGAACGACAG (서열번호 6)
CD64-New	GGGTCAGCGTGTTCCAAGAGG (서열번호 7)	GCACCTGTATTCACCACTGTCATTG (서열번호 8)
CD1a-New	ACT CAT ACC TGG GAC AGC AAT (서열번호 9)	CTG CAA TTC ATG GGC GTA TCT (서열번호 10)

<실시예 3> sCD93 단백질의 미토젠-활성화 단백질 키나제(MAPK)의 활성 유도 효과 실험

이러한 THP-1 세포의 분화가 분자적으로 어떻게 일어나는지를 알아보기 위해, MAPK(mitogen-activated protein kinases) signaling pathway를 중심으로 알아보았다. THP-1 세포에 음성대조군으로 PBS(-), Fc 5㎍/ml, hIgG 5㎍/ml을 처리하고, 양성대조군은 PMA 0.1㎍/ml을 처리하였다. 실험군은 sCD93_Fc를 5, 1, 0.2, 0.04㎍/ml 농도로 처리하였다. 처리후 30분간 37℃ 배양실에 놓아둔다음 다시 꺼내어, lysis buffer로 용해 시킨후 westernblot을 실시하였다. 1차 항체(Cell siganaling)로 phospho-Erk 1/2(Cell signaling)와 phospho-p38(Cell Signaling) 그리고 정량을 위해 total-p38(Cell signaling)을 각각 블롯팅하였다. phospho-Erk 1/2와 phospho-p38의 양이 sCD93_Fc처리에 의해 농도-의존적으로 증가함을 알수 있었다(도 4A). 또한 시간적 변화에 따른 phospho-Erk 1/2 양을 관찰하기 위해 상기와 동일한 방법으로 sCD93_Fc 5㎍/ml 을 0, 10, 30, 60, 180min 간 각각 처리하여 westernblot을 실시하였다. 양성대조군으로 PMA 0.1㎍/ml 과 LPS 1㎍/ml을 각각 동일한 방법으로 처리하여 westernblot을 실시하였다. sCD93_Fc 처리에 의해 10min 경과후부터 phospho-Erk 1/2 양이 증가하기 시작하여 30min에서 가장 많이 증가하였고 60min부터 약간 감소하는 경향을 보여주었다(도 4B).

이러한 THP-1 세포의 분화와 MAPK signaling 의 변화에 따른 사이토카인의 변화를 알아보기 위해, 여러 가지 잘 알려진 pro-inflammatory 사이토카인들의 발현 변화를 RNA 수준에서 알아보았다. THP-1 세포에 음성대조군으로 PBS(-), hIgG 5㎍/ml을 처리하고, 양성대조군은 PMA 0.1㎍/ml을 처리하였고, 또한 실험군으로는 sCD93_Fc을 처리하였다. 24시간이 경과한후, LPS에 의한 감수성을 알아보기 위해 LPS를 처리하였다. LPS 처리후 다시 24시간이 경과한후, RNA를 분리정제하였다(Qiagen RNA miniprep kiT). 정제된 RNA 1㎍을 reverse transcription (iScript cDNA synthesis kit, Bio-Rad) 하여 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA에 대해 아래 <표 2>의 프라이머 서열, iG SYBR Green supermix(Bio-Rad)와 CFX-96 Real-time system(Bio-Rad)을 이용하여 정량-PCR을 수행하였다. sCD93_Fc 처리에 의해 pro-inflammatory cytokine 인 TNF-a, IL-1b, IL-6 등이 RNA 수준에서 약간 증가하였고, LPS를 추가 처리함으로써 현저히 더 증가함을 알수 있었다 (도 4C).

프라이머 서열

사이토카인	정방향	역방향
IL-6	TGG CTG AAA AAG ATG GAT GCT (서열번호 11)	TCT GGC TTG TTC CTC ACT ACT (서열번호 12)
IL-12	TGT ACC AGG TGG AGT TCA AGA (서열번호 13)	GGA GGA TTT TTG TGG CAC AGT (서열번호 14)
iNOS	ATC TTG CCT GGG GTC CAT TAT (서열번호 15)	CCT GGC CAG ATG TTC CTC TAT (서열번호 16)
CXCL11	CCT GGG GTA AAA GCA GTG AAA (서열번호 17)	TTG CTT GCT TCG ATT TGG GAT (서열번호 18)
CLEC4A	TTG GCA AGA CAG TGA GAA GGA (서열번호 19)	AAT GTC GCT GAC CTT CTG GAT (서열번호 20)
SPHK-1	CTG TAG GAA GAG TGG GTT CCA (서열번호 21)	GTG CCA GGA CTA GCA CAA AG (서열번호 22)
IL-1β	ACA GCT GGA GAG TGT AGA TCC (서열번호 23)	TTT TCT GCT TGA GAG GTG CTG (서열번호 24)
TNF-α	TAG CCC ATG TTG TAG CAA ACC (서열번호 25)	AGA GGA CCT GGG AGT AGA TGA (서열번호 26)

다음으로 이러한 THP-1 세포의 분화와 MAPK signaling 의 변화에 따라 염증성 사이토카인 중 TNF-α의 발현이 어떻게 변화하는지를 단백질 수준에서 측정하였다. THP-1 세포에 음성대조군으로 PBS(-), hIgG 5㎍/ml을 처리하고, 양성대조군은 PMA 0.1㎍/ml을 처리하였고, 또한 실험군으로는 sCD93_Fc을 처리하였다. 24시간이 경과한후, LPS에 의한 감수성을 알아보기 위해 LPS를 처리하였다. LPS 처리후 다시 24시간이 경과한후, Quantikine TNF-α assay kit (R&D system)을 이용하여 배양상등액에 포함된 TNF-α 양을 측정하였다. sCD93_Fc 만 처리한 실험군에서 TNF-α의 양이 조금 증가하였으며, sCD93_Fc와 LPS를 처리한 실험군에서는 LPS만 처리한 실험군에 비해 비교적 높게 TNF-α가 측정됨을 알수 있었다. 이는 sCD93_Fcdp 의해 THP-1 세포가 macrophage로 분화하여 TLR signaling 에 대한 감수성(susceptibility)이 증가 되었음을 보여주는 것이다(도 4D).

<실시예 4> sCD93 단백질의 기질금속단백질분해효소(MMP)의 발현 유도 효과 실험

그 다음으로 sCD93_Fc 처리에 의한 THP-1 세포의 기질금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)발현에 대한 영향을 알아보았다. THP-1 세포에 음성대조군으로 hIgG 5㎍/ml을 처리하고, 양성대조군은 PMA 0.1㎍/ml을 처리하였다. 실험군으로는 sCD93_Fc 를 5, 1, 0.2 ㎍/ml 농도로 처리하였다. 처리한후 24시간이 경과한후 Gelatin Zymography assay법을 이용하여 배양상등액에 포함된 MMP-9(92kDa)과 MMP-2(72kDa)의 발현 변화를 관찰하였다. Gelatin(Sigma) 최종 농도가 2mg/ml 이 되도록 8% SDS-PAGE gel을 만든 다음 24시간 동안 배양한 상등액을 걸어 Coomassie blue로 염색한 다음, destaining용액으로 약하게 탈색한 후 gel을 사진촬영하였다. MMP-9의 양이 sCD93_Fc 처리에 의해 농도-의존적으로 증가함을 알 수있었다(도 5).

<실시예 5> sCD93 단백질의 식세포 작용 유도 효과 실험

이러한 THP-1 세포의 macrophage-like 세포로의 분화에 따른 식세포작용(phagocytosis)효과를 알아보기 위해 mRFP 를 발현하고 있는 박테리아 (E. coli) 를 이용하여 식세포작용을 측정하였다. THP-1 세포에 sCD93_Fc 5㎍/ml를 처리하고 3일간 배양한 후 미리 키워놓은 RFP(적색 형광 단백질) 발현 벡터로 형질전환된 E. coli를 분화한 THP-1 세포에 넣어주었다. 다시, 12시간이 경과한 후 형광현미경으로 박테리아가 분화한 THP-1 세포에 의해 phagocytosis된 것을 확인하였으며(도 6A), 이 세포들을 cell dissociation buffer(EDTA buffer)로 분리하여 FACS(Coolter) 분석을 실시하였다(도 6B). sCD93_Fc 처리에 의해 분화된 세포들의 식세포작용이 음성대조군 hIgG 처리에 의한 것 보다 훨씬 증가하여 형광이 나타남을 알수 있었다.

<실시예 6> CD93 단백질 항체의 TNF-α 생성 저해 효과 실험

이러한 sCD93_Fc의 염증 효과와 macrophage 분화 효과에 대해 이에 대한 항체의 항염증제로서의 개발 가능성을 알아보기위해 CD93에 대한 항체 처리에 의해 이러한 효과들이 억제되는지 알아보았다(도 7). THP-1 세포에 음성대조군으로 PBS(-), hIgG 5㎍/ml을 처리하고, 양성대조군은 PMA 0.1㎍/ml을 처리하였고, 또한 실험군으로는 sCD93_Fc 5㎍/ml와 anti-CD93 polyclonal antibody(R&D system) 10㎍/ml을 처리하였다. 24시간이 경과한후, LPS 1㎍/ml에 의한 감수성을 알아보기 위해 LPS를 처리하였다. LPS 처리후 다시 24시간이 경과한후, Quantikine TNF-α assay kit (R&D system)을 이용하여 배양상등액에 포함된 TNF-α 양을 측정하였다. <도 4B>에서와 비슷하게, sCD93_Fc 만 처리한 실험군에서 TNF-α의 양이 조금 증가하였으며, sCD93_Fc와 LPS를 처리한 실험군에서는 LPS만 처리한 실험군에 비해 비교적 높게 TNF-α가 측정됨을 알수 있었다. 그러나 항-CD93 항체 처리에 의해 이러한 TNF-α의 증가가 50-60%이상 저해됨을 알 수 있었다.

<실시예 7> siRNA 를 이용한 여러 pro - inflammatory 사이토카인 발현 변화 실험

THP-1 cell에서 CD93에 대한 siRNA 저해기법을 이용 CD93을 knockdown시켰을때의 여러 가지 cytokine들의 변화량을 real-time PCR을 이용하여 실험하였다. 먼저, THP-1 cell 2x105 (배지: 10%FBS(Hyclone사) + RPMI1640 (Hyclone사))을 24 well에 넣어둔 다음, Lipofectamin RNAiMax (Invitrogen) 1ul와 CD93 siRNA (siCD93)(Bioneer사) 10pmole을 섞은다음 10분간 방치한 후 미리 넣어둔 THP-1 cell에 transfection 하였다. 음성대조군으로는 Negative control siRNA (Bioneer사) 를 사용하였고, 양성대조군으로는 full-length CD93 (CD93_Full) 유전자(Kugi 분양, hMU003993,Kugi No. IRAT-49-A06)를 이용하여 동일한 방법으로 transfection하였다. 12시간 동안 CO2 incubator에 보관한후, LPS를 처리하였으며 , 이후 추가로 24시간을 더 배양하였다. 이후, 상기 <실시예 3>에서 설명한 바와 같은 방법으로 TNFa 와 IL-6에 대해 real-time PCR을 수행하였다. 그 결과, siCD93 처리에 의해 두 pro-inflammatory cytokine의 양이 줄어 들었으며, LPS에 의해 증가된 양또한 감소하였다. 이와는 반대로, CD93을 과발현한 CD93_Full처리군은 오히려 TNFa나 IL-6의 양을 증가시켰으며, LPS처리에 의해 더욱더 증가하는 양상을 보여주었다(도 8).

도 1은 전장의 CD93 단백질의 아미노산 서열(도 1A)과 sCD93 단백질의 아미노산 서열(도 1B)을 나타낸 것이다.

도 2는 HEK293E 세포에서 sCD93_Fc를 발현·정제한 후의 전기영동 사진이다. 여기서 N은 환원되지 아니한 상태의 단백질이고, R은 환원된 상태의 단백질이다.

도 3은 sCD93 단백질의 THP-1 세포의 대식세포로의 분화 유도 효과를 보여주는 결과이다. 도 3A는 THP-1 세포가 디쉬(dish) 표면에 부착된 정도를 보여주는 사진이고, 도 3B는 THP-1 세포의 부착율을 나타낸 그래프이고, 도 3C는 THP-1 세포가 대식세포로 분화한 정도를 보여주는 사진이며, 도 3D는 대식세포 분화 표지의 발현 정도를 보여주는 그래프이다.

도 4는 sCD93 단백질의 MAPK signaling 활성화 효과를 보여주는 결과이다. 도 4A는 phospho-Erk 1/2, phospho-p38 및 전체 p38을 웨스턴 블럿으로 정량화한 전기영동 사진이고, 도 4B는 phospho-Erk 1/2이 sCD93 단백질 처리 후의 시간에 따라 정량화한 전기영동 사진이며, 도 4C는 sCD93 단백질 처리 후 사이토카인 등의 발현량을 RNA 수준에서 측정한 결과이며, 도 4D는 sCD93 단백질 처리 후 사이토카인 중 TNF-α의 발현량을 단백질 수준에서 측정한 결과이다.

도 5는 sCD93 단백질이 기질금속단백질프로테아제(MMP)의 발현에 미치는 영향을 보여주는 전기영동 사진이다.

도 6은 sCD93 단백질의 식세포 작용의 유도 효과를 보여주는 결과이다.

도 7은 CD93 단백질 항체의 TNF-α 생성 저해 효과를 보여주는 결과이다.

도 8은 CD93 유전자에 대한 siRNA의 TNF-α 및 IL-6의 생성 저해 효과를 보여주는 결과이다.

<110> Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Anti-inflammatory Pharmaceutical Composition <160> 32 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 324 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Gly Ala Asp Thr Glu Ala Val Val Cys Val Gly Thr Ala Cys Tyr 1 5 10 15 Thr Ala His Ser Gly Lys Leu Ser Ala Ala Glu Ala Gln Asn His Cys 20 25 30 Asn Gln Asn Gly Gly Asn Leu Ala Thr Val Lys Ser Lys Glu Glu Ala 35 40 45 Gln His Val Gln Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu Arg Arg Glu Ala Ala 50 55 60 Leu Thr Ala Arg Met Ser Lys Phe Trp Ile Gly Leu Gln Arg Glu Lys 65 70 75 80 Gly Lys Cys Leu Asp Pro Ser Leu Pro Leu Lys Gly Phe Ser Trp Val 85 90 95 Gly Gly Gly Glu Asp Thr Pro Tyr Ser Asn Trp His Lys Glu Leu Arg 100 105 110 Asn Ser Cys Ile Ser Lys Arg Cys Val Ser Leu Leu Leu Asp Leu Ser 115 120 125 Gln Pro Leu Leu Pro Ser Arg Leu Pro Lys Trp Ser Glu Gly Pro Cys 130 135 140 Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ser Asn Ile Glu Gly Phe Val Cys Lys 145 150 155 160 Phe Ser Phe Lys Gly Met Cys Arg Pro Leu Ala Leu Gly Gly Pro Gly 165 170 175 Gln Val Thr Tyr Thr Thr Pro Phe Gln Thr Thr Ser Ser Ser Leu Glu 180 185 190 Ala Val Pro Phe Ala Ser Ala Ala Asn Val Ala Cys Gly Glu Gly Asp 195 200 205 Lys Asp Glu Thr Gln Ser His Tyr Phe Leu Cys Lys Glu Lys Ala Pro 210 215 220 Asp Val Phe Asp Trp Gly Ser Ser Gly Pro Leu Cys Val Ser Pro Lys 225 230 235 240 Tyr Gly Cys Asn Phe Asn Asn Gly Gly Cys His Gln Asp Cys Phe Glu 245 250 255 Gly Gly Asp Gly Ser Phe Leu Cys Gly Cys Arg Pro Gly Phe Arg Leu 260 265 270 Leu Asp Asp Leu Val Thr Cys Ala Ser Arg Asn Pro Cys Ser Ser Ser 275 280 285 Pro Cys Arg Gly Gly Ala Thr Cys Val Leu Gly Pro His Gly Lys Asn 290 295 300 Tyr Thr Cys Arg Cys Pro Gln Gly Tyr Gln Leu Asp Ser Ser Gln Leu 305 310 315 320 Asp Cys Val Asp <210> 2 <211> 972 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 acgggagctg acacggaggc ggtggtctgc gtggggaccg cctgctacac ggcccactcg 60 ggcaagctga gcgctgccga ggcccagaac cactgcaacc agaacggggg caacctggcc 120 actgtgaaga gcaaggagga ggcccagcac gtccagcgag tactggccca gctcctgagg 180 cgggaggcag ccctgacggc gaggatgagc aagttctgga ttgggctcca gcgagagaag 240 ggcaagtgcc tggaccctag tctgccgctg aagggcttca gctgggtggg cgggggggag 300 gacacgcctt actctaactg gcacaaggag ctccggaact cgtgcatctc caagcgctgt 360 gtgtctctgc tgctggacct gtcccagccg ctccttccca gccgcctccc caagtggtct 420 gagggcccct gtgggagccc aggctccccc ggaagtaaca ttgagggctt cgtgtgcaag 480 ttcagcttca aaggcatgtg ccggcctctg gccctggggg gcccaggtca ggtgacctac 540 accaccccct tccagaccac cagttcctcc ttggaggctg tgccctttgc ctctgcggcc 600 aatgtagcct gtggggaagg tgacaaggac gagactcaga gtcattattt cctgtgcaag 660 gagaaggccc ccgatgtgtt cgactggggc agctcgggcc ccctctgtgt cagccccaag 720 tatggctgca acttcaacaa tgggggctgc caccaggact gctttgaagg gggggatggc 780 tccttcctct gcggctgccg accaggattc cggctgctgg atgacctggt gacctgtgcc 840 tctcgaaacc cttgcagctc cagcccatgt cgtggggggg ccacgtgcgc cctgggaccc 900 catgggaaaa actacacgtg ccgctgcccc caagggtacc agctggactc gagtcagctg 960 gactgtgtgg ac 972 <210> 3 <211> 652 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Thr Ser Met Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr 1 5 10 15 Gln Pro Gly Ala Gly Thr Gly Ala Asp Thr Glu Ala Val Val Cys Val 20 25 30 Gly Thr Ala Cys Tyr Thr Ala His Ser Gly Lys Leu Ser Ala Ala Glu 35 40 45 Ala Gln Asn His Cys Asn Gln Asn Gly Gly Asn Leu Ala Thr Val Lys 50 55 60 Ser Lys Glu Glu Ala Gln His Val Gln Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu 65 70 75 80 Arg Arg Glu Ala Ala Leu Thr Ala Arg Met Ser Lys Phe Trp Ile Gly 85 90 95 Leu Gln Arg Glu Lys Gly Lys Cys Leu Asp Pro Ser Leu Pro Leu Lys 100 105 110 Gly Phe Ser Trp Val Gly Gly Gly Glu Asp Thr Pro Tyr Ser Asn Trp 115 120 125 His Lys Glu Leu Arg Asn Ser Cys Ile Ser Lys Arg Cys Val Ser Leu 130 135 140 Leu Leu Asp Leu Ser Gln Pro Leu Leu Pro Ser Arg Leu Pro Lys Trp 145 150 155 160 Ser Glu Gly Pro Cys Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ser Asn Ile Glu 165 170 175 Gly Phe Val Cys Lys Phe Ser Phe Lys Gly Met Cys Arg Pro Leu Ala 180 185 190 Leu Gly Gly Pro Gly Gln Val Thr Tyr Thr Thr Pro Phe Gln Thr Thr 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Glu Ala Val Pro Phe Ala Ser Ala Ala Asn Val Ala 210 215 220 Cys Gly Glu Gly Asp Lys Asp Glu Thr Gln Ser His Tyr Phe Leu Cys 225 230 235 240 Lys Glu Lys Ala Pro Asp Val Phe Asp Trp Gly Ser Ser Gly Pro Leu 245 250 255 Cys Val Ser Pro Lys Tyr Gly Cys Asn Phe Asn Asn Gly Gly Cys His 260 265 270 Gln Asp Cys Phe Glu Gly Gly Asp Gly Ser Phe Leu Cys Gly Cys Arg 275 280 285 Pro Gly Phe Arg Leu Leu Asp Asp Leu Val Thr Cys Ala Ser Arg Asn 290 295 300 Pro Cys Ser Ser Ser Pro Cys Arg Gly Gly Ala Thr Cys Ala Leu Gly 305 310 315 320 Pro His Gly Lys Asn Tyr Thr Cys Arg Cys Pro Gln Gly Tyr Gln Leu 325 330 335 Asp Ser Ser Gln Leu Asp Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Gln Asp Ser 340 345 350 Pro Cys Ala Gln Glu Cys Val Asn Thr Pro Gly Gly Phe Arg Cys Glu 355 360 365 Cys Trp Val Gly Tyr Glu Pro Gly Gly Pro Gly Glu Gly Ala Cys Gln 370 375 380 Asp Val Asp Glu Cys Ala Leu Gly Arg Ser Pro Cys Ala Gln Gly Cys 385 390 395 400 Thr Asn Thr Asp Gly Ser Phe His Cys Ser Cys Glu Glu Gly Tyr Val 405 410 415 Leu Ala Gly Glu Asp Gly Thr Gln Cys Gln Asp Val Asp Glu Cys Val 420 425 430 Gly Pro Gly Gly Pro Leu Cys Asp Ser Leu Cys Phe Asn Thr Gln Gly 435 440 445 Ser Phe His Cys Gly Cys Leu Pro Gly Trp Val Leu Ala Pro Asn Gly 450 455 460 Val Ser Cys Thr Met Gly Pro Val Ser Leu Gly Pro Pro Ser Gly Pro 465 470 475 480 Pro Asp Glu Glu Asp Lys Gly Glu Lys Glu Gly Ser Thr Val Pro Arg 485 490 495 Ala Ala Thr Ala Ser Pro Thr Arg Gly Pro Glu Gly Thr Pro Lys Ala 500 505 510 Thr Pro Thr Thr Ser Arg Pro Ser Leu Ser Ser Asp Ala Pro Ile Thr 515 520 525 Ser Ala Pro Leu Lys Met Leu Ala Pro Ser Gly Ser Ser Gly Val Trp 530 535 540 Arg Glu Pro Ser Ile His His Ala Thr Ala Ala Ser Gly Pro Gln Glu 545 550 555 560 Pro Ala Gly Gly Asp Ser Ser Val Ala Thr Gln Asn Asn Asp Gly Thr 565 570 575 Asp Gly Gln Lys Leu Leu Leu Phe Tyr Ile Leu Gly Thr Val Val Ala 580 585 590 Ile Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ala Leu Gly Leu Leu Val Tyr Arg Lys 595 600 605 Arg Arg Ala Lys Arg Glu Glu Lys Lys Glu Lys Lys Pro Gln Asn Ala 610 615 620 Ala Asp Ser Tyr Ser Trp Val Pro Glu Arg Ala Glu Ser Arg Ala Met 625 630 635 640 Glu Asn Gln Tyr Ser Pro Thr Pro Gly Thr Asp Cys 645 650 <210> 4 <211> 3337 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ctgcgccgga gtggctgcag ctcacccctc agctcccctt ggggcccagc tgggagccga 60 gatagaagct cctgtcgccg ctgggcttct cgcctcccgc agagggccac acagagaccg 120 ggatggccac ctccatgggc ctgctgctgc tgctgctgct gctcctgacc cagcccgggg 180 cggggacggg agctgacacg gaggcggtgg tctgcgtggg gaccgcctgc tacacggccc 240 actcgggcaa gctgagcgct gccgaggccc agaaccactg caaccagaac gggggcaacc 300 tggccactgt gaagagcaag gaggaggccc agcacgtcca gcgagtactg gcccagctcc 360 tgaggcggga ggcagccctg acggcgagga tgagcaagtt ctggattggg ctccagcgag 420 agaagggcaa gtgcctggac cctagtctgc cgctgaaggg cttcagctgg gtgggcgggg 480 gggaggacac gccttactct aactggcaca aggagctccg gaactcgtgc atctccaagc 540 gctgtgtgtc tctgctgctg gacctgtccc agccgctcct tcccagccgc ctccccaagt 600 ggtctgaggg cccctgtggg agcccaggct cccccggaag taacattgag ggcttcgtgt 660 gcaagttcag cttcaaaggc atgtgccggc ctctggccct ggggggccca ggtcaggtga 720 cctacaccac ccccttccag accaccagtt cctccttgga ggctgtgccc tttgcctctg 780 cggccaatgt agcctgtggg gaaggtgaca aggacgagac tcagagtcat tatttcctgt 840 gcaaggagaa ggcccccgat gtgttcgact ggggcagctc gggccccctc tgtgtcagcc 900 ccaagtatgg ctgcaacttc aacaatgggg gctgccacca ggactgcttt gaaggggggg 960 atggctcctt cctctgcggc tgccgaccag gattccggct gctggatgac ctggtgacct 1020 gtgcctctcg aaacccttgc agctccagcc catgtcgtgg gggggccacg tgcgccctgg 1080 gaccccatgg gaaaaactac acgtgccgct gcccccaagg gtaccagctg gactcgagtc 1140 agctggactg tgtggacgtg gatgaatgcc aggactcccc ctgtgcccag gagtgtgtca 1200 acacccctgg gggcttccgc tgcgaatgct gggttggcta tgagccgggc ggtcctggag 1260 agggggcctg tcaggatgtg gatgagtgtg ctctgggtcg ctcgccttgc gcccagggct 1320 gcaccaacac agatggctca tttcactgct cctgtgagga gggctacgtc ctggccgggg 1380 aggacgggac tcagtgccag gacgtggatg agtgtgtggg cccggggggc cccctctgcg 1440 acagcttgtg cttcaacaca caagggtcct tccactgtgg ctgcctgcca ggctgggtgc 1500 tggccccaaa tggggtctct tgcaccatgg ggcctgtgtc tctgggacca ccatctgggc 1560 cccccgatga ggaggacaaa ggagagaaag aagggagcac cgtgccccgc gctgcaacag 1620 ccagtcccac aaggggcccc gagggcaccc ccaaggctac acccaccaca agtagacctt 1680 cgctgtcatc tgacgccccc atcacatctg ccccactcaa gatgctggcc cccagtgggt 1740 cctcaggcgt ctggagggag cccagcatcc atcacgccac agctgcctct ggcccccagg 1800 agcctgcagg tggggactcc tccgtggcca cacaaaacaa cgatggcact gacgggcaaa 1860 agctgctttt attctacatc ctaggcaccg tggtggccat cctactcctg ctggccctgg 1920 ctctggggct actggtctat cgcaagcgga gagcgaagag ggaggagaag aaggagaaga 1980 agccccagaa tgcggcagac agttactcct gggttccaga gcgagctgag agcagggcca 2040 tggagaacca gtacagtccg acacctggga cagactgctg aaagtgaggt ggccctagag 2100 acactagagt caccagccac catcctcaga gctttgaact ccccattcca aaggggcacc 2160 cacatttttt tgaaagactg gactggaatc ttagcaaaca attgtaagtc tcctccttaa 2220 aggccccttg gaacatgcag gtattttcta cgggtgtttg atgttcctga agtggaagct 2280 gtgtgttggc gtgccacggt ggggatttcg tgactctata atgattgtta ctccccctcc 2340 cttttcaaat tccaatgtga ccaattccgg atcagggtgt gaggaggctg gggctaaggg 2400 gctcccctga atatcttctc tgctcacttc caccatctaa gaggaaaagg tgagttgctc 2460 atgctgatta ggattgaaat gatttgtttc tcttcctagg atgaaaacta aatcaattaa 2520 ttattcaatt aggtaagaag atctggtttt ttggtcaaag ggaacatgtt cggactggaa 2580 acatttcttt acatttgcat tcctccattt cgccagcaca agtcttgcta aatgtgatac 2640 tgttgacatc ctccagaatg gccagaagtg caattaacct cttaggtggc aaggaggcag 2700 gaagtgcctc tttagttctt acatttctaa tagccttggg tttatttgca aaggaagctt 2760 gaaaaatatg agaaaagttg cttgaagtgc attacaggtg tttgtgaagt cacataatct 2820 acggggctag ggcgagagag gccagggatt tgttcacaga tacttgaatt aattcatcca 2880 aatgtactga ggttaccaca cacttgacta cggatgtgat caacactaac aaggaaacaa 2940 attcaaggac aacctgtctt tgagccaggg caggcctcag acaccctgcc tgtggccccg 3000 cctccacttc atcctgcccg gaatgccagt gctccgagct cagacagagg aagccctgca 3060 gaaagttcca tcaggctgtt tcctaaagga tgtgtgaacg ggagatgatg cactgtgttt 3120 tgaaagttgt cattttaaag cattttagca cagttcatag tccacagttg atgcagcatc 3180 ctgagatttt aaatcctgaa gtgtgggtgg cgcacacacc aagtagggag ctagtcaggc 3240 agtttgctta aggaactttt gttctctgtc tcttttcctt aaaattgggg gtaaggaggg 3300 aaggaagagg gaaagagatg actaactaaa atcattt 3337 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 5 gcctagacct cagccacaac tc 22 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer <400> 6 ccagcccagc gaacgacag 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 7 gggtcagcgt gttccaagag g 21 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer <400> 8 gcacctgtat tcaccactgt cattg 25 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 9 actcatacct gggacagcaa t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer <400> 10 ctgcaattca tgggcgtatc t 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 11 tggctgaaaa agatggatgc t 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer <400> 12 tctggcttgt tcctcactac t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 13 tgtaccaggt ggagttcaag a 21 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer <400> 14 ggaggatttt tgtggcacag t 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 15 atcttgcctg gggtccatta t 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer <400> 16 cctggccaga tgttcctcta t 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 17 cctggggtaa aagcagtgaa a 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer <400> 18 ttgcttgctt cgatttggga t 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 19 ttggcaagac agtgagaagg a 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer <400> 20 aatgtcgctg accttctgga t 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 21 ctgtaggaag agtgggttcc a 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer <400> 22 gtgccaggac tagcacaaag 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 23 acagctggag agtgtagatc c 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer <400> 24 ttttctgctt gagaggtgct g 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 25 tagcccatgt tgtagcaaac c 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer <400> 26 agaggacctg ggagtagatg a 21 <210> 27 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 27 gtagatctgc aggaaaagga caagc 25 <210> 28 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer <400> 28 cgagatctgg ttgacttccc taatgt 26 <210> 29 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 29 cgggatccgg ccgtgggggc cgacaaaact cacacatgcc 40 <210> 30 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer <400> 30 cgagtctcat ttacccggag acaggga 27 <210> 31 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 31 cagggggccg tgggggccac gggagctgac acggaggc 38 <210> 32 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reward primer <400> 32 tagcggccga cgcggccaag tccacacagt ccagctgac 39

Claims (22)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 CD93(C1qRp, AA4.1) 수용성 단편인 sCD93에 대한 특이적인 항체를 유효성분으로 함유하는 항염증성 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서,

   상기 항체는 모노클로날항체, 폴리클로날항체, 다중특이적 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 단편, 재조합 항체 및 화학적으로 수식된 항체로 구성된 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 항염증성 약학적 조성물.
3. 제1항에 있어서,

   상기 항체는 인간화 항체 또는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 항염증성 약학적 조성물.
4. 제2항에 있어서,

   상기 항체의 단편은 Fab, F(ab')₂, scFv, Fv, Fab/c, 항체를 단백질 절단 효 소로 절단시켜 얻어진 항체 또는 유전자 재조합 기술에 의하여 얻어진 항체인 것을 특징으로 하는 항염증성 약학적 조성물.
5. 삭제
6. 제2항에 있어서,

   상기 모노클로날 항체는, 인간을 제외한 포유동물에, sCD93 단백질, 그 단편 및 전장의 CD93 단백질로 구성된 군에서 선택된 면역원을 면역시키고 항체 생산 세포를 채취하는 단계, 그 항체 생산 세포를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 제조하는 단계, 및 그 하이브리도마로부터 상기 모노클로날 항체를 얻는 단계를 포함하는 모노클로날 항체의 생산 방법에 의하여 얻어진 것을 특징으로 하는 항염증성 약학적 조성물.
7. 제6항에 있어서,

   상기 항체 생산 세포는 비장 세포, 림프절 세포 및 말초혈 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 항염증성 약학적 조성물.
8. 삭제
9. 삭제
10. 제2항에 있어서,

    상기 폴리클로날 항체는 인간을 제외한 포유동물에, sCD93 단백질, 그 단편 및 전장의 CD93 단백질로 구성된 군에서 선택된 면역원을 면역시키고, 그 동물로부터 채혈하고, 그 혈액으로부터 sCD93 단백질에 특이적인 항체를 분리하는 폴리클로날 항체의 생산 방법에 의하여 얻어진 것을 특징으로 하는 항염증성 약학적 조성물.
11. 삭제
12. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항염증성 약학적 조성물을 비인간 포유동물에 경구적으로 또는 비경구적으로 투여하는 단계를 포함하는 염증의 치료 또는 예방 방법.
13. 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 CD93 유전자의 발현을 억제할 수 있는 siRNA 또는 shRNA인 것을 유효성분으로 포함하는 항염증성 약학적 조성물.
14. 제13항에 있어서,

    상기 siRNA는 10 내지 40 염기쌍을 갖는 이중 가닥을 포함하는 것을 특징으로 하는 항염증성 약학적 조성물.
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16. 제13항에 있어서,

    상기 siRNA는 3' 말단에서 염기수 1 내지 5의 돌출 부위를 가지는 것을 특징으로 하는 항염증성 약학적 조성물.
17. 제13항에 있어서,

    상기 shRNA는 10 내지 40 염기쌍을 갖는 이중 가닥을 포함하는 것을 특징으로 하는 항염증성 약학적 조성물.
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19. 제13항에 있어서,

    상기 shRNA는 그 루프 영역이 2 내지 10 염기로 이루어진 것을 특징으로 하는 항염증성 약학적 조성물.
20. 제13항에 있어서,

    상기 shRNA 발현벡터는 플라스미드 유래 발현벡터 또는 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 항염증성 약학적 조성물.
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