ES2255112T3 - Inhibicion de apoptosis usando inhibidores de la familia de la enzima convertidora de interleucina 1-beta (ice)/ced-3. - Google Patents
Inhibicion de apoptosis usando inhibidores de la familia de la enzima convertidora de interleucina 1-beta (ice)/ced-3.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS PROCEDIMIENTOS PARA INCREMENTAR POBLACIONES DE CELULAS HEMATOPOLETICAS Y PARA PROLONGAR LA SUPERVIVENCIA, CON EL FIN DE PROLONGAR LA VIABILIDAD DE UN ORGANO PARA SU TRASPLANTE Y CON EL FIN DE INCREMENTAR LA BIOPRODUCCION, USANDO INHIBIDORES DE LA FAMILIA (ICE)/CED-3 (ENZIMA DE CONVERSION DEL INTERLEUKINA 1 BE ). SE DAN UNOS EJEMPLOS DE COMPUESTOS UTILES EN ESTOS PROCEDIMIENTOS EN LAS PIEZAS DESCRIPTIVAS DE LA DEMANDA.
Description
Inhibición de apoptosis usando inhibidores de la
familia de la enzima convertidora de interleucina
1-\beta (ICE)/CED-3.
La presente invención se refiere en general a
muerte celular programada y específicamente a métodos para expansión
de células hematopoyéticas, para prolongar la viabilidad de un
órgano para trasplante y mantener la viabilidad de las líneas
celulares utilizadas en la bioproducción empleando inhibidores de la
familia de la enzima convertidora de interleucina 1\beta
(ICE)/CED-3.
La presente invención se refiere en general a
muerte celular programada y específicamente a métodos para la
expansión de células hematopoyéticas, para prolongar la viabilidad
de un órgano para trasplante y mantener la viabilidad de las líneas
celulares en la bioproducción empleando inhibidores de la familia de
la enzima convertidora de interleucina 1\beta
(ICE)/CED-3.
La necrosis y la apoptosis son dos procesos
básicos mediante los cuales mueren las células. En la necrosis, la
muerte celular usualmente es la consecuencia de una lesión celular.
Las células en general se expanden y se lisan, y los contenidos
celulares finalmente se derraman hacia el espacio extracelular. En
contraste, la apoptosis es una forma de muerte celular en la que se
eliminan células simples en medio de tejidos vivos. La apoptosis es
responsable de la mayor parte de la muerte celular programada en la
remodelación de tejido y de la pérdida de células que acompaña la
atrofia de los tejidos adultos tras la retirada de estímulos
endocrinos y otros estímulos de crecimiento. Además, se cree que la
apoptosis es responsable de la muerte fisiológica de las células en
el transcurso de recambio de tejido normal (es decir, homeostasis de
tejido) (Kerr, J. F., et al, 1972. Br. J. Cancer
26:239-257; Wyllie, A. H., et al. 1980.
Int. Rev. Cytol. 68:251-306).
Los mecanismos efectores de la apoptosis no se
entienden completamente, pero finalmente ocurren ciertos cambios
nucleares que parecen ser causados por la activación de nucleasas
endógenas que escinden cromatina entre los nucleosomas y reducen el
contenido de ADN intacto en células apoptóticas. Se ha identificado
una cantidad de reguladores de apoptosis. Algunos de ellos ya son
familiares, como los proto-oncogenes y los genes
oncosupresores, incluyendo c-myc,
bcl-2, p53 y ras. Se cree que los productos
proto-oncogénicos y las proteínas oncosupresoras
controlan la susceptibilidad celular a la apoptosis (Isaacs, J. T.
1994. Curr. Opin. Oncol. 6:82-89). El
C-myc puede determinar si las células se proliferan
continuamente o ingresan a la apoptosis, dependiendo de la
disponibilidad de factores de crecimiento críticos (Bisonnette, R.
P., et al. 1994. In Apoptosis II. The Molecular Basis of
Apoptosis in Disease. Cold Spring Harbor Laboratory Press). En
células cultivadas, la proliferación por lo general se observa en
presencia de c-myc y factores de crecimiento,
mientras que la apoptosis se observa cuando está presente el
c-myc pero no lo están los factores de crecimiento.
Otros oncogenes determinados (p. ej., bcl-2)
rescatan a las células de la susceptibilidad a la apoptosis.
Específicamente, los miembros de la familia del gen
bcl-2 pueden actuar para inhibir la muerte celular
programada (p. ej., bcl-2, bcl-xL,
ced-9) o promover la muerte celular (p. ej., bax,
bak, bcl-xS). A su vez, los miembros de la familia
ICE/CED-3 pueden promover la muerte celular (p. ej.,
ICE, CPP32, Ich-1, CED3).
La interleucina 1 ("IL-1")
es una proteína pro-inflamatoria e
inmunorregulatoria importante que estimula la diferenciación y
proliferación de fibroblastos, la producción de prostaglandinas,
colagenasa y fosfolipasa por parte de las células sinoviales y
condrocitos, la desgranulación de basófilos y eosinófilos y la
activación de neutrófilos. Oppenheim, J.H. et al.,
Immunology Today, 7:45-56 (1986). Como tal,
está implicada en la patogenia de enfermedades inflamatorias
crónicas y agudas, y autoinmunitarias. La IL-1 es
producida predominantemente por los monocitos de la sangre
periférica como parte de la respuesta inflamatoria. Mosely, B.S.
et al., Proc. Nat. Acad. Sci.,
84:4572-4576 (1987); Lonnemann, G. et al.,
Eur. J. Immunol., 19:1531-1536 (1989).
La IL-1\beta mamífera se
sintetiza como un polipéptido precursor de aproximadamente 31.5 kDa
(Limjuco, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
83:3972, 1986). La IL-1\beta precursora es
incapaz de unirse a los receptores de IL-1 y es
biológicamente inactiva (Mosley, et al., J. Biol.
Chem., 262:2941, 1987). La actividad biológica parece
depender del procesamiento proteolítico que provoca la conversión de
la forma 31.5 kDa precursora a la forma 17.5 kDa madura.
La maduración proteolítica de
IL-1\beta precursora humana a
IL-1\beta 17 kDa madura surge de la escisión entre
Asp^{116} y Ala^{117}. Se ha identificado una endoproteinasa en
monocitos humanos, denominada enzima convertidora de interleucina
1\beta (ICE), que es capaz de escindir el precursor de
IL-1\beta en
Asp^{116}-Ala^{117}, como también en el sitio
Asp^{27}-Gly^{28}, y de generar
IL-1\beta madura con el término amino apropiado en
Ala^{117}. Se ha descubierto que el Asp en la posición 116 es
esencial para la escisión, ya que la sustitución de Asp (Kostura,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:5227, 1989)
u otros aminoácidos (Howard, et al., J. Immunol.,
147:2964, 1991) con Ala inhibe este evento de escisión.
La especificidad de sustrato de la ICE humana se
ha definido con el uso de péptidos que abarcan el sitio de escisión
de la enzima. Dos características de los sustratos peptídicos son
esenciales para el reconocimiento catalítico por parte de la enzima.
En primer lugar, hay una fuerte preferencia por el ácido aspártico
adyacente al sitio de escisión, en el sentido que cualquier
sustitución de este residuo en el precursor de
IL-1\beta y sustratos peptídicos conduce a una
reducción sustancial en el índice de catálisis (Kostura, et
al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86:5227, 1989;
Sleath, et al., J. Biol. Chem., 265:14526,
1990; Howard, et al., J. Immunol., 147:2964,
1991). Existe un requerimiento igualmente riguroso para cuatro
aminoácidos hacia la izquierda del sitio de escisión, mientras que
la metilamina es suficiente hacia la derecha. El sustrato mínimo
para la enzima,
AC-Tyr-Val-Ala-Asp-NH-CH_{3},
es un sustrato peptídico particularmente bueno con un Vmax/Km
relativo similar a aquel del precursor de
IL-1\beta propiamente dicho (Thomberry, et
al., Nature. 356:768, 1992).
La ICE es una cisteinil proteinasa según los
siguientes criterios: (1) la diazometilcetona
AC-Tyr-Val-Ala-Asp-COCHN_{2}
es un inhibidor potente, competitivo e irreversible de la enzima,
(2) la inactivación de la enzima por parte del acetato de yodo es
competitiva con el sustrato, y (3) el Cys catalíticamente activo
reacciona selectivamente con [^{14}C] acetato de yodo más de 10
veces más veloz que otras cisteínas o ditiotreitol (Thornberry,
et al., Nature, 356:768, 1992).
La ICE está estructural y funcionalmente
relacionada con la CED-3 proteasa que funciona como
un efector de muerte celular en el ascáride C. elegans (Yuan,
et al., Cell, 75:641, 1993). La ICE y
CED-3 forman parte de una familia más grande de
proteasas (la familia ICE/CED-3) que incluye CPP32,
ICH-1, Mch-2, ICE_{rel}II,
ICE_{rel}III, Mch-3, Mch4 y Mch-5.
Todas estas enzimas son cisteína proteasas que comparten homología
significativa en sus sitios activos. También comparten la
especificidad para la escisión de sustrato en los enlaces
asp-x. Además, cada uno de los miembros de la
familia ICE/CED-3 se sintetiza como una
pro-enzima que es luego proteolíticamente activada
para formar una enzima activa.
Por lo tanto, las patologías en las que los
inhibidores de la familia ICE/ced-3 de cisteína
proteasas pueden ser útiles como agentes terapéuticos incluyen:
enfermedades infecciosas tales como meningitis y salpingitis; choque
septicémico, enfermedades respiratorias; cuadros inflamatorios tales
como artritis, colangitis, colitis, encefalitis, endocerolitis,
hepatitis, pancreatitis y lesión de reperfusión, enfermedades
isquémicas tales como infarto de miocardio, apoplejía y nefropatía
isquémica; enfermedades inmunitarias tales como hipersensibilidad;
enfermedades autoinmunitarias tales como esclerosis múltiple;
enfermedades óseas; y determinadas enfermedades
neurodegenerativas.
En varios sistemas de cultivo celular, se ha
demostrado que la inhibición de miembros de la familia
ICE/CED-3 puede inhibir eficazmente la apoptosis.
Por ejemplo, el compuesto
acetil-DEVD-aldehído inhibió la
apoptosis inducida por anti-Fas en una línea celular
de linfocitos T (Schlegel, et al., J. Biol. Chem.,
271:1841, 1996; Enari, et al., Nature,
380:723, 1996). De modo similar, el
acetil-YVAD-aldehído y la
acetil-YVAD-clorometilcetona
bloquearon la muerte de motoneuronas in vitro e in
vivo (Milligan, et al., Neuron, 15:385,
1995). A su vez, el inhibidor de la familia
ICE/CED-3
Boc-D-(bencil)clorometilcetona, como así
también el crmA previnieron la muerte celular de células epiteliales
mamarias que ocurre en ausencia de la matriz extracelular (Boudreau,
et al., Science, 267:891,
1995).
1995).
Se sabe que el control de la apoptosis puede
tener utilidad para tratar la enfermedad. Específicamente, los
inhibidores de la familia ICE/CED-3 pueden tener
efectos terapéuticos. Por ejemplo, se ha sugerido que la inhibición
de ICE puede ser útil en el tratamiento de trastornos inflamatorios
(Dolle, et al., J. Med. Chem., 37:563, 1994;
Thornberry, et al., Biochemistry, 33:3934,
1994). También se sabe que los inhibidores de los miembros de la
familia ICE/CED-3 pueden tener utilidad para tratar
enfermedades degenerativas (p. ej., la enfermedad de Alzheimer,
enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad
de Huntington), enfermedad isquémica cardíaca o del sistema nervioso
central (es decir, infarto de miocardio y apoplejía) y lesión
cerebral traumática, como así también alopecia, sida y hepatopatía
inducida por toxinas (Nicholson, Nature Biotechnology
14:297, 1996).
Se han descrito los inhibidores de péptido y
peptidilo de la ICE. No obstante, dichos inhibidores típicamente se
han caracterizados por propiedades no deseables, tales como
absorción oral deficiente, mala estabilidad y metabolismo rápido.
Plattner, J.J. y D.W. Norbeck, en Drug Discovery
Technologies, C.R Clark and W.H. Moos, Eds. (Ellis Horwood,
Chichester, Inglaterra, 1990), pp. 92-126. Estas
propiedades no deseables obstaculizaban su desarrollo en fármacos
eficaces. Los métodos de la presente invención incluyen bien el uso
de miméticos de dipéptidos conformacionalmente restringidos o un
reemplazo de indolil péptido N-sustituido. Estos
miméticos exhiben propiedades mejoradas en relación con sus
contrapartes peptídicas, por ejemplo, absorción y estabilidad
metabólica mejoradas que producen una mayor biodisponibilidad.
La presente invención se dirige a prevenir la
muerte celular programada, inhibiendo la actividad de las proteasas
de la familia de la enzima convertidora de interleucina 1\beta
(ICE)/CED-3. La presente invención provee nuevos
métodos para usar los inhibidores de ICE/CED-3. La
presente invención provee un método para usar los inhibidores de
ICE/CED-3 para expandir las subpoblaciones de
células hematopoyéticas, aumentar la supervivencia de las células,
incluyendo los granulocitos, in vitro, para uso en
transfusiones celulares, aumentar la supervivencia de distintos
órganos y aumentar la bioproducción de células in vitro.
En una primera realización, la invención provee
un método in vitro para expandir las poblaciones de células
hematopoyéticas o aumentar su supervivencia, incluyendo poner en
contacto las células con una cantidad eficaz de un reactivo que
suprime la actividad de por lo menos un miembro de la familia
ICE/CED-3, inhibiendo así la muerte celular
programada de precursores inmaduros y/o células maduras, y
expandiendo y/o aumentando la supervivencia de la población de
células. Las poblaciones celulares incluidas en el método de la
invención incluyen granulocitos, monocitos, eritrocitos, linfocitos
y plaquetas.
En otra realización, la invención provee un
método in vitro para prolongar la viabilidad de un órgano
antes y/o después de un trasplante, que comprende poner en contacto
las células de un órgano con una cantidad inhibidora eficaz de un
reactivo que suprime la actividad de uno o más miembros de la
familia ICE/CED-3, prolongando de este modo la
viabilidad del órgano en comparación con un órgano no tratado. Un
órgano para trasplante se puede tratar con dicho reactivo bien in
vivo, ex vivo o ambos. El órgano puede ser bien un órgano
intacto o células aisladas derivadas de un órgano (p. ej., células
aisladas de los islotes pancreáticos, neuronas dopaminérgicas
aisladas, sangre o células hematopoyéticas).
Incluso en otra realización, la invención provee
un método para aumentar la bioproducción in vitro que
comprende poner en contacto células hospedantes bioproductoras con
un reactivo que suprime la actividad de por lo menos un miembro de
la familia ICE/CED-3, aumentando así la
supervivencia de dichas células in vitro.
Los compuestos ilustrativos útiles como
inhibidores de ICE/CED-3 también se incluyen en la
presente. Dichos compuestos y métodos de síntesis se describen en su
totalidad en las solicitudes de patente estadounidenses
conjuntamente en trámite 08/710.621, presentada el 20/9/96 y
08/767.175, presentada el 16/12/96 y sus respectivas continuaciones
en parte.
La Figura 1 expone la actividad de los compuestos
en la Fórmula 3 para inhibir la actividad de las enzimas ICE, CPP32,
MCH2, MCH3 y MCH5.
La Figura 2 expone la actividad del Ejemplo 106
para inhibir la actividad de las ICE, CPP32, MCH2 y MCH5.
La Figura 3 muestra los resultados provenientes
de los análisis FACS que demuestran el efecto de los inhibidores de
ICE/CED-3 sobre la supervivencia de neutrófilos,
según lo medido por el contenido de ADN (% hipodiploide).
La presente invención provee métodos para la
inhibición de la muerte celular programada, o apoptosis, mediante la
inhibición de miembros de la familia ICE/CED-3. Esto
incluiría no solamente inhibidores de la actividad enzimática de
ICE/CED-3, sino también cualquier método que
prevenga específicamente la expresión de genes codificadores de la
familia ICE/CED-3. Por lo tanto, el ADN o ARN
antisentido comprendido por secuencias nucleotídicas
complementarias a los genes miembros de la familia
ICE/CED-3 y capaces de inhibir la transcripción y
traducción de proteínas relevantes, expresión de formas negativas
dominantes de las ICE/CED-3 proteasas (p. ej.,
mutantes modificados para reemplazar la cisteína del sitio activo
con otro aminoácido, como serina o alanina) o los anticuerpos que se
unen a los polipéptidos de la familia ICE/CED-3, se
encuentran dentro de la presente invención, ya que son inhibidores
de molécula pequeña, incluyendo los péptidos.
Los compuestos de la Fórmula 3 a continuación son
también útiles en los métodos de la invención:
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
en la
que:
n es 1 ó 2;
m es 1 ó 2;
A es R^{2}CO-,
R^{3}-O-CO- o
R^{4}SO_{2}-;
un grupo de la fórmula:
en la
que:
R^{1} es un átomo de hidrógeno, alquilo o
fenilalquilo;
R^{2} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilalquilo, fenilo
sustituido, (fenilo sustituido)alquilo, heteroarilo o
(heteroaril)alquilo;
R^{3} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilalquilo o (fenilo
sustituido)alquilo;
R^{4} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilalquilo, fenilo
sustituido, (fenilo sustituido)alquilo, heteroarilo o
(heteroaril)alquilo;
R^{5} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilalquilo, fenilo
sustituido, (fenilo sustituido)alquilo, heteroarilo o
(heteroaril)alquilo;
R^{6} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilalquilo o (fenilo
sustituido)alquilo;
R^{7} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilalquilo, fenilo
sustituido, (fenilo sustituido)alquilo, heteroarilo o
(heteroaril)alquilo;
R^{8} es una cadena lateral de aminoácidos
seleccionada entre el grupo que consiste en aminoácidos naturales y
sintéticos;
B es un átomo de hidrógeno, un átomo de deuterio,
alquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, fenilo,
fenilalquilo, fenilo (sustituido), fenilalquilo (sustituido),
heteroarilo, (heteroaril)alquilo o halometilo; un grupo de la
fórmula
-CH_{2}XR^{9};
en la que R^{9} es fenilo,
fenilalquilo, fenilo sustituido, (fenilo sustituido)alquilo,
heteroarilo o (heteroaril)alquilo; y X es un átomo de oxígeno
o un átomo de
azufre;
un grupo de la fórmula:
-CH_{2}-O-CO-(arilo);
un grupo de la
fórmula:
-CH_{2}-O-CO-(heteroarilo);
un grupo de la
fórmula:
-CH_{2}-O-PO(R^{10})R^{11}
en la que R^{10} y R^{11} se
seleccionan independientemente entre un grupo que consiste en
alquilo, cicloalquilo, fenilo, fenilo sustituido, fenilalquilo y
(fenilo sustituido) alquilo; y sus sales farmacéuticamente
aceptables.
Los compuestos de la Fórmula 3 pueden también
existir como solvatos e hidratos. Por lo tanto, estos compuestos se
pueden cristalizar, por ejemplo, con aguas de hidratación o uno de
una cantidad o cualquiera de sus fracciones de moléculas de
disolvente de licor madre. Los solvatos e hidratos de dichos
compuestos se incluyen dentro del alcance de la presente
invención.
Los compuestos de las Fórmulas 1 y 3 de la
presente invención se pueden sintetizar usando técnicas
convencionales. Ventajosamente, estos compuestos convenientemente se
sintetizan a partir de materiales de inicio fácilmente
disponibles.
Por lo tanto, los compuestos de Fórmula 3 se
pueden sintetizar en general combinando un núcleo tricíclico
expuesto a continuación en la Fórmula 4:
con los residuos de ácido aspártico
y glutámico modificados de Fórmulas
5a-d:
en presencia de agentes de
acoplamiento peptídicos convencionales, tales como
diciclohexilcarbodiimida
(DCC)-1-hidroxibenzotriazol (HOBt),
reactivo BOP, pyBOP, TBTU, EEDQ,
1-etil(3,3'-dimetil-1'-aminopropil)carbodiimida
(EDAC)-HOBt y similares, tal como se analiza en J.
Jones, "Amino Acid and Peptide Synthesis", Steven G. Davis ed.,
Oxford University Press, Oxford, pp. 25-41 (1992).
En la fórmula previamente expuesta, A es un grupo amino protector.
El grupo amino protector se elimina luego y la amina resultante se
combina con el grupo acilo sustituido de la Fórmula
6:
Fórmula
6
R^{C}-CO-X
o el grupo sulfonilo de Fórmula
7:
Fórmula
7
R^{4}SO_{2}-X.
En las fórmulas anteriores, R^{1} es tal como
se definió anteriormente y R^{c} es R^{2}, R^{3} -O, R^{4} o
cualquiera de las cadenas laterales que contienen R^{8}, como se
definió para el grupo A en la Fórmula 3. Desde ya, dichos restos
tendrían cualquier grupo hidroxi, carboxi o amino en la forma
protegida como para no interferir con la reacción de acoplamiento
(Fórmula 5a-d), la reacción de acilación (Fórmula 4)
o la reacción de sulfonación (Fórmula 7). X en las Formulas
anteriores representa un grupo saliente fácil para las reacciones de
acilación o sulfonación.
En el caso de que la reacción de acoplamiento se
lleve a cabo con el amino alcohol de Fórmula 5c, el resto alcohol se
debe oxidar al compuesto carbonilo correspondiente antes de la
eliminación de los grupos protectores. Los métodos preferidos para
la reacción de oxidación incluyen oxidación Swern (cloruro de
oxalilo-dimetil sulfóxido, cloruro de metilo a -78ºC
seguido de trietilamina; y oxidación Dess-Martin
(peryodinano Dess-Martin, t-butanol
y cloruro de metileno). Los grupos protectores contenidos en las
sub-estructuras de las Fórmula 5a-d
y A se eliminan por métodos conocidos en la técnica.
El núcleo tricíclico de Fórmula 3 se sintetiza
por métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, véanse D.S.
Karanewsky, patente estadounidense No. 5.504.080 expedida el 2 de
abril de 1996; J.A. Robl et al., Tetrahedron Letters,
36:1593-1596 (1995); y S. De Lombaert et al.,
Tetrahedron Letters, 35:7513-7516 (1994)
El ácido aspártico o glutámico modificado para
las Fórmulas 5a-d se puede elaborar por métodos
conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, la solicitud de
patente europea 519.748; solicitud de patente PCT No.
PCT/EP92/02472; solicitud de patente PCT No. PCT/US91/06595;
solicitud de patente PCT No. PCT/US91/02339; solicitud de patente
europea No. 623.592; solicitud de patente mundial No. WO 93/09135;
solicitud de patente PCT No. PCT/US94/08868; solicitud de patente
europea No. 623,606; solicitud de patente europea No. 618,223;
solicitud de patente europea No. 533.226; solicitud de patente
europea No. 528.487; solicitud de patente europea No. 618.233;
solicitud de patente PCT No. PCT/ EP92/02472; solicitud de patente
mundial No. WO 93/09135; solicitud de patente PCT No.
PCT/US93/03589; y solicitud de patente PCT No. PCT/US93/00481.
El grupo acilo de Fórmula 6 y los grupos
R^{4}SO_{2} correspondientes también se sintetizan por métodos
conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la patente
estadounidense No. 5.504.080, expedida el 2 de abril de 1996. Si
bien este grupo se puede elaborar una vez unido al núcleo
tricíclico, es preferible que esté intacto antes de unirse al
núcleo.
núcleo.
Una vez que las cadenas laterales de Fórmula 5 y
Fórmula 6 o Fórmula 7 están unidas al núcleo tricíclico de Fórmula
3, el experto en la técnica por lo general eliminaría cualquier
grupo protector amino, hidroxi o carboxi para aumentar la actividad
de la molécula sintetizada.
En la Fórmula 3 anterior, ocurre un grupo de
compuestos óptimos cuando n es uno, incluso más cuando B es un átomo
de hidrógeno y especialmente cuando R^{3} es un átomo de hidrógeno
o un grupo t-butilo. Dentro de este grupo de
compuestos se deben destacar aquellos en los que A es un aminoácido
natural. Este último grupo de compuestos se denominará en la
presente "compuestos 4-oxobutanoicos".
Dentro de este grupo de compuestos
4-oxobutanoicos se encuentra un grupo de compuestos
óptimos en los que R^{1} es un grupo metilo, es decir, los
compuestos N-metilindol. Una realización de este
grupo de compuestos N-metilindol ocurre cuando A es
un residuo alanina, valina, leucina, fenilalanina, glicina o
prolina. Los compuestos destacados dentro de cada uno de estos
grupos de aminoácidos naturales, compuestos de
N-metilindol ocurren cuando el
N-metilindol no está sustituido en modo alguno, es
decir, en los que X, Y y R^{2} son cada uno un átomo de hidrógeno,
y óptimamente, cuando R^{3} es un átomo de hidrógeno.
Otro grupo óptimo de compuestos
4-oxobutanoicos consiste en los compuestos de
N-bencilindol. Por ejemplo, un grupo de los
compuestos de N-bencilindol ocurre cuando A es un
residuo alanina. Destacados dentro de este grupo de compuestos de
alanina se encuentran aquellos en los que X, Y y R^{2} son cada
uno un átomo de hidrógeno, y especialmente en los que R^{3} es un
átomo de hidrógeno.
Un grupo óptimo alternativo de los compuestos
4-oxobutanoicos ocurre cuando el sustituyente N del
grupo indol es un grupo 1-butenilo. Una realización
de este grupo de compuestos de
N-(1-butenil)indol ocurre cuando A es un
residuo valina, y especialmente cuando X, Y y R^{2} son cada uno
un átomo de hidrógeno. Un grupo óptimo de este último grupo de
compuestos ocurre cuando R^{3} es un átomo de hidrógeno.
Incluso otro grupo de compuestos
4-oxobutanoicos óptimos ocurre cuando el
sustituyente N del anillo indol es un residuo de ácido
2'-acético. Un grupo ilustrativo de los
N-(compuestos de ácido acético 2') ocurre cuando A es un residuo
alanina. Una realización de este grupo particular de compuestos
alanina ocurre cuando X, Y y R^{2} son cada uno un átomo de
hidrógeno, y especialmente cuando R^{3} es un átomo de
hidrógeno.
Un grupo de compuestos
4-oxobutanoicos, cuando el grupo indol está
sustituido en el nitrógeno con ácido 3'-propiónico,
es otro ejemplo de la presente invención. Un grupo óptimo de dichos
compuestos de N-(ácido propiónico)indol ocurre cuando A es un
residuo alanina. Destacados dentro de este grupo de compuestos de
alanina se encuentran aquellos en los que X, Y y R^{2} son cada un
átomo de hidrógeno y especialmente en los que R^{3} es un átomo de
hidrógeno.
Otro grupo óptimo de compuestos de Fórmula 1
ocurre cuando n es uno, e incluso más cuando B es un grupo
monofluorometilo. Una realización de estos compuestos
monofluorometilo ocurre cuando R^{3} es un átomo de hidrógeno o un
grupo t-butilo e incluso más cuando A es un
aminoácido natural. Un ejemplo de estos compuestos en el que A es un
aminoácido natural ocurre cuando A es un residuo valina. Este último
grupo de compuestos valina se denominará en la presente
"compuestos 4-oxo-5-(ácido
fluoropentanoico)".
Un grupo óptimo de compuestos
4-oxo-5-(ácido fluoropentanoico)
ocurre cuando R^{1} es un grupo metilo, en otros términos, los
compuestos N-metilindol. Un grupo ilustrativo de
dichos compuestos N-metilindol ocurre cuando R^{2}
es un grupo metilo y X y Y son cada uno un átomo de hidrógeno, y
especialmente cuando R^{3} es un átomo de hidrógeno. Otro grupo
ilustrativo de dichos compuestos N-metilindol ocurre
cuando R^{2} es un átomo de cloro y X y Y son cada uno un átomo de
hidrógeno, y especialmente cuando R^{3} es un átomo de hidrógeno.
Un tercer grupo ilustrativo de compuestos
N-metilindol ocurre cuando R^{2} es un grupo
cloro, X es un grupo 5-fluoro y Y es un átomo de
hidrógeno, y especialmente cuando R^{3} es un átomo de
hidrógeno.
Otro grupo óptimo de compuestos
4-oxo-5-(ácido
fluoro-pentanoico) está conformado por compuestos
N-(3'-fenilprop-1-il)indol.
Un grupo destacado dentro de esta última clase de compuestos ocurre
cuando R^{2}, X y Y son cada uno un átomo de hidrógeno y
especialmente cuando R^{3} es un átomo de hidrógeno.
Un tercer grupo óptimo de compuestos
4-oxo-5-(ácido
fluoro-pentanoico) tiene un resto N-(carboximetilo o
carboximetilo protegido)indol. Una realización de este grupo
ocurre cuando R^{2}, X y Y son cada uno un átomo de hidrógeno y
especialmente en el que R^{3} es un átomo de hidrógeno y el átomo
de nitrógeno del anillo indol está sustituido con un grupo
carboximetilo.
La presente invención provee métodos in
vitro para la inhibición de la muerte celular programada o
apoptosis, por inhibición de los miembros de la familia
ICE/CED-3. La invención provee no solo usos
novedosos para inhibidores de la actividad enzimática de
ICE/CED-3, sino también cualquier método que
prevenga específicamente la expresión de genes codificadores de la
familia ICE/CED-3. Por lo tanto, el ADN o ARN
antisentido comprendido por secuencias nucleotídicas complementarias
a genes de miembros de la familia ICE/CED-3 y
capaces de inhibir la transcripción o traducción de proteínas
relevantes, expresión de formas negativas dominantes de las
ICE/CED-3 proteasas (p. ej., mutantes modificados
para reemplazar la cisteína del sitio activo con otro aminoácido,
como serina o alanina), o anticuerpos que se unen a polipéptidos de
la familia ICE/CED-3, están dentro del alcance de la
invención, como inhibidores de molécula pequeña, incluyendo péptidos
y especialmente los compuestos presentados en la
presente.
presente.
En un primer aspecto, la invención provee un
método para expandir las poblaciones de células sanguíneas y
hematopoyéticas o prolongar la supervivencia de dichas poblaciones,
incluyendo poner en contacto las células ex vivo con una
cantidad eficaz de un reactivo que suprime la actividad de uno o más
miembros de la familia ICE/CED-3, inhibiendo la
muerte celular programada de precursores inmaduros y/o células
maduras, expandiendo así la población celular y/o aumentando la
supervivencia de la población celular. El término "expansión" o
"expandir", tal como se utiliza en la presente, significa
aumentar la cantidad de células de una población celular
pre-existente. El término "supervivencia" se
refiere a mantener la viabilidad de las células, típicamente ex
vivo, no obstante, el término tiene como fin incluir también
in vivo. La supervivencia puede ocurrir entre unas pocas
horas y varios días o más.
El método incluye poner en contacto las células
deseadas ex vivo con una cantidad eficaz de un reactivo que
suprime la actividad de ICE/CED-3. El término
"poner en contacto", tal como se usa en la presente, significa
exponer las células al inhibidor o inhibidores de la familia
ICE/CED-3, de modo tal que el inhibidor o
inhibidores pueda inhibir eficazmente la actividad de
ICE/CED-3, inhibiendo de esta manera la apoptosis en
las células y permitiendo que las células proliferen y se acumulen.
El término "cantidad inhibidora eficaz" significa aquella
cantidad de inhibidor de ICE/CED-3 que bloquea
eficazmente la actividad enzimática de ICE/CED-3 en
células diana intactas. Será obvio que se pueden emplear uno o más
inhibidores de la familia ICE/CED-3 simultáneamente
en el método de la invención.
Los ejemplos de dichos reactivos se conocen en la
técnica e incluyen
Cbz-VaLAlaAsp-CH_{2}F,
Cbz-ValA-laAsp-CH_{2}OCO(2,6-diCl-C_{6}H_{4}),
Cbz-ValAlaAsp-CH_{2}F, éster
metílico,
Ac-AspValAlaAsp-CH_{2}F. Los
compuestos ilustrativos son aquellos de Fórmula 3 tal como se
describió anteriormente.
La detección de la actividad de
ICE/CED-3 se realiza por métodos convencionales,
como un ensayo enzimático para medir la fluorescencia generada por
la escisión enzimática de aminometilcumarina (AMC) conjugada con un
péptido relevante (p. ej.,
Ac-DEVD-amc). Dichos ensayos son
estándar en la técnica (Armstrong et al., J. Biol.
Chem. 271:16850, 1996);
Fernandes-Alnemri, et al., Cancer
Res., 55:6045, 1995). Además, la inhibición de la
actividad de la ICE se puede medir por un bioensayo para
IL-1\beta. La actividad de
ICE/CED-3 preferentemente se suprime mediante los
inhibidores de la familia ICE/CED-3) en por lo menos
aproximadamente 75%, y preferentemente aproximadamente 90%.
Las "células" o "población celular"
incluyen células precursoras (p. ej., células madre pluripotentes)
y/o células maduras diferenciadas. Los ejemplos de células
expandidas y/o cuya supervivencia aumenta por el método de la
invención incluyen, aunque sin limitarse a ello, granulocitos (p.
ej., neutrófilos), monocitos, eritrocitos, linfocitos y
plaquetas.
El éxito de la hematopoyesis también se puede
detectar midiendo los hematocritos, cifra de leucocitos,
incorporación de timidina tritiada al ADN de la médula ósea, peso
del bazo, cantidad de unidades formadoras de colonias eritroides o
cantidad de unidades formadoras de colonias (linajes formadores de
eritroides, granulocitos/macrófagos y megacariocitos) del bazo o la
médula ósea, por ejemplo.
Los trastornos hematopoyéticos pueden ocurrir
como consecuencia de una enfermedad primaria o como consecuencia de
la terapia para otra enfermedad. Por ejemplo, un efecto colateral
grave de la radiación o quimioterapia es la mielosupresión. La
pancitopenia se puede observar después de un trasplante de médula
ósea y la leucopenia profunda se observa a menudo en el sida. Los
pacientes con insuficiencia renal crónica que se someten a diálisis
a menudo padecen anemia. Los pacientes con sida tratados con AZT,
pacientes de cáncer tratados con platino y pacientes anémicos con
artritis reumatoidea a menudo requieren transfusiones debido a la
anemia y la leucopenia. Se sabe que los distintos factores de
crecimiento hematopoyéticos, como la eritropoyetina, los
granulocitos o factores estimulantes de colonias de granulocitos, o
las citocinas tales como la interleucina 1, estimulan la
hematopoyesis y se han utilizado para tratar estas afecciones. No
obstante, los tiempos de tratamiento están en general en el orden de
semanas, y especialmente para el caso de neutropenias, los pacientes
padecen riesgo de infecciones oportunistas. Estas terapias por lo
general son bastante costosas, ya que son proteínas producidas en
forma recombinante. Por ende, sería ventajoso poder administrar una
molécula pequeña, p. ej., un inhibidor de
ICE/CED-3, bien sola o en combinación con un factor
de crecimiento para acelerar la recuperación hematopoyética. Se sabe
que distintas citocinas, incluyendo los factores de crecimiento
hematopoyéticos, aumentan la proliferación e inhiben la apoptosis en
células diana (Koury and Bondurant, Science, 248:378,
1990; Muta and Krantz, J. Cell Physiol., 156:264,
1993). No obstante, esos agentes actúan situados más arriba del
mecanismo celular apoptótico, afectando ese mecanismo sólo
indirectamente. La presente invención provee métodos para aumentar
la expansión celular inhibiendo directamente el mecanismo
apoptótico. La terapia de combinación que comprende administrar un
factor de crecimiento hematopoyético junto con los métodos de la
presente invención es una realización preferida.
El método de la invención es útil para restaurar
la hematopoyesis normal en individuos que necesitan la
reconstitución de la médula ósea. La célula madre pluripotente tiene
la capacidad única de autorrenovación y el potencial de crecimiento
y diferenciación junto con los linajes granulocíticos, monocíticos,
eritroides, megacariocíticos y linfoides.
Como apreciará la persona con experiencia en la
técnica, las células madre se pueden dirigir a diferenciación como
una población de linaje linfoide, mieloide o eritroide por
incubación con el factor de crecimiento hematopoyético apropiado o
combinación de factores de crecimiento. En consecuencia, el método
de la invención incluye además poner en contacto las células con un
factor de crecimiento hematopoyético adecuado, además de del
inhibidor de ICE/CED-3. Tal como se emplea en la
presente, la expresión "un factor de crecimiento hematopoyético
adecuado" significa uno o más factores de crecimiento
hematopoyéticos conocidos en la técnica para dirigir una célula
madre progenitora hacia la población celular deseada de linaje
linfoide, granulocítico, monocítico, megacariocítico, mieloide o
eritroide. Distintos factores de crecimiento funcionan tanto
promoviendo la proliferación de células como inhibiendo la
apoptosis; ambas funciones promueven la acumulación de células.
Ciertos factores de crecimiento hematopoyético, incluyendo el
G-CSF, GM-CSF y eritropoyetina son
ejemplos de dichos factores de crecimiento que pueden inhibir la
muerte celular programada de sus células diana respectivas, como
también estimular la proliferación de esas células. Se ha comprobado
clínicamente que estos factores son útiles para promover la
repoblación de granulocitos (p. ej., neutrófilos), monocitos y
eritrocitos en pacientes. El G-CSF y
GM-CSF a menudo se utilizan en pacientes tras
quimioterapia o radiación, y la eritropoyetina comúnmente se utiliza
en pacientes que se someten a diálisis renal. Otros factores de
crecimiento representativos conocidos en la técnica que se pueden
utilizar para estos fines son IL-1,
IL-6, factor de células madre e
IL-3. Los expertos en la técnica conocerán otros
factores de crecimiento para estimular la proliferación de linajes
hematopoyéticos (véase, por ejemplo, Harrison's Principles of
Internal Medicine, Isselbacher, et al., eds., pp
1714-1717, McGraw Hill, 1994).
Los inhibidores de apoptosis, tales como los
inhibidores de ICE/CED-3, pueden extender la
supervivencia de los precursores de células sanguíneas en la médula
ósea como también la supervivencia de las células sanguíneas maduras
propiamente dichas. En cuanto a la extensión de la supervivencia de
células sanguíneas maduras, esto puede ser particularmente valioso
para repoblación de granulocitos después de la quimioterapia y/o
radiación (con o sin trasplante de médula ósea). Los granulocitos
maduros (específicamente los neutrófilos) duran solo 24 horas en el
torrente circulatorio después de lo cual mueren por apoptosis. Los
inhibidores de ICE/CED-3 que bloquean la apoptosis
y aumentan la supervivencia de neutrófilos aumentarían el índice al
cual un paciente normalizaría su cifra de leucocitos. La inhibición
de la apoptosis en células precursoras que finalmente dan lugar a
poblaciones de células maduras sería sinérgica con los efectos sobre
las células maduras.
La invención provee métodos para conservar la
viabilidad de los neutrófilos/granulocitos ex vivo para la
transfusión subsiguiente a receptores con necesidad de granulocitos
adicionales. La vida útil de los granulocitos eliminados de los
donantes es limitada y, por lo tanto, es difícil obtener suministros
de granulocitos funcionales para transfu-
sión.
sión.
Los reactivos de la presente invención son
"inhibidores de ICE/CED-3" en el sentido que
inhiben la actividad catalítica de los miembros de la familia
ICE/CED-3 en un modo reversible o irreversible. El
término "irreversible", tal como se utiliza en la presente,
significa la formación de un enlace covalente entre el miembro de la
familia ICE/CED-3 y el inhibidor. Es posible
convertir un inhibidor reversible en un inhibidor irreversible,
incorporando un "explosivo" irreversible en lo que de lo
contrario sería un inhibidor reversible.
La reversibilidad de la inhibición de
ICE/CED-3 es en general una función del grupo
electronegativo en la molécula. Cuando el grupo electronegativo es
una diazoalquil cetona, la inhibición de la actividad de la ICE es
irreversible y el compuesto es un inhibidor irreversible. Cuando el
grupo electronegativo es un aldehído, la inhibición de la ICE es
reversible y el inhibidor es un inhibidor reversible.
Un compuesto de la invención preferentemente
tiene un aldehído, una diazoalquil cetona, una haloalquil cetona o
una aciloximetil cetona. Tal como se emplea en la presente en
referencia a un grupo electronegativo, "alquilo" se refiere a
radicales de cadena lineal o ramificada que tienen
1-3 átomos de carbono, que pueden estar
opcionalmente sustituidos. Los grupos alquilo representativos
incluyen metilo, etilo, propilo y similares. Opcionalmente, el grupo
electronegativo es un aldehído, fluorometil (CH_{2}F) cetona o
aciloximetil cetona.
Los compuestos de la presente invención se
elaboran mediante técnicas que en general corresponden a métodos
conocidos y obvios para el experto en la técnica. Véase, p.
ej.,Kettner, et al., Arch, Biochem, Biophys.,
162:56, 1974; patentes estadounidenses Nos. 4.582.821;
4.644.055; Kettner, et al. Arch, Biochem, Biophys,
165:739, 1974; Dakin and West, J. Biol. Chem.,
78:91, 1928; Rasnick, D., Anal. Biochem.,
149:461, 1985; Revesz, L., Tetrahedron Lett.,
35:9693, 1994. Los compuestos de indolilo dipeptídicos y
tricíclicos ilustrativos se proveen en la presente.
Los compuestos que tienen un grupo saliente
electronegativo no fluoro, haloalquil cetona preferentemente se
sintetizan de acuerdo con el procedimiento de Kettner. Un péptido o
aminoácido bloqueado con N se hace reaccionar con
N-metilmorfolina y un alquil no fluoro, haloformato
para generar un anhídrido ácido peptídico. El anhídrido se hace
luego reaccionar con un diazoalcano en un disolvente inerte,
aprotónico para formar una diazometano cetona peptídica. La
diazometano cetona se hace luego reaccionar con una disolución
anhidra de HCl, HBr o Hl para producir el aminoácido o péptido
deseado de haloalquil cetona C-terminal bloqueado
con N.
Los compuestos que tienen un grupo saliente
electronegativo de fluorometilo preferentemente se sintetizan por el
procedimiento de Revesz. Se hace reaccionar un aminoácido o péptido
bloqueado con N con t-butil
(3-amino-4-hidroxi-5-fluoro)
pentanoato en presencia de un agente de acoplamiento peptídico
estándar tal como
diciclohexilcarbodiimida-hidroxi-benztriazol.
El producto resultante se oxida a la cetona correspondiente bien por
oxidación Dess-Martin o Severn. Finalmente, la
desprotección del éster t-butílico con ácido
trifluoroacético produce el ácido carboxílico correspondiente.
Los compuestos que tienen un grupo saliente
electronegativo fluoroalquil cetona se pueden extender en la
dirección del término N, eliminando el grupo bloqueante
N-terminal y acoplando el compuesto desprotegido con
otros aminoácidos protegidos. Bodanszky, The Practice of Peptide
Synthesis, Springer-Verlag, Berlin, 1984.
Alternativamente, los compuestos desprotegidos se acilan para
producir compuestos que tienen un grupo protector acetilo
N-terminal. Stewart, et al., Solid Phase
Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., ockford, III.,
1984.
En otra realización, la invención provee un
método para prolongar la viabilidad de un órgano, que comprende
poner en contacto las células de un órgano para trasplante con una
cantidad inhibidora eficaz de un reactivo que suprime la actividad
de la enzima convertidora de interleucina 1\beta
(ICE)/CED-3, prolongando de este modo la viabilidad
del órgano en comparación con un órgano no tratado. El término
"órgano" incluye órganos multicelulares intactos tales como
riñón, hígado o corazón; suspensiones celulares derivadas de órganos
multicelulares (p. ej., células de los islotes pancreáticos en
neuronas dopaminérgicas); como así también suspensiones de células
sanguíneas o células precursoras hematopoyéticas. Preferentemente,
se trata un órgano ex vivo con el fin de conservar el órgano
para el trasplante. El término "prolongar" significa que un
órgano para trasplante se conserva por tratamiento, usando el método
de la invención, en comparación con un órgano similar que no ha sido
tratado con un inhibidor de ICE/CED-3. Si bien no se
desea estar influenciados por una teoría en particular, se cree que
poner en contacto las células de un órgano para trasplante con un
inhibidor de ICE/CED-3 inhibe la muerte celular
programada, conservando así el órgano y prolongando la
viabilidad.
El método de la invención incluye el tratamiento
del receptor antes y después del trasplante con órganos bañados con
inhibidor de ICE/CED-3 o genéticamente alterados
para inhibir la apoptosis de las células orgánicas del donante y,
opcionalmente, un agente inmunosupresor.
La presente invención incluye la expansión o
supervivencia ex vivo de células hematopoyéticas, que es útil
para una variedad de usos clínicos, incluyendo la terapia génica,
aumento del trasplante de médula ósea y reemplazo de trasplante de
médula ósea. Por ende, el uso de un inhibidor del mecanismo
apoptótico, tal como un inhibidor de la familia
ICE/CED-3, para promover la expansión y/o
supervivencia ex vivo de poblaciones de granulocitos,
eritrocitos, linfocitos y o plaquetas, constituye un método útil.
Por ejemplo, se puede agregar un inhibidor o inhibidores de
ICE/CED-3) a un cultivo hístico de células aisladas
de un sujeto o transfectar las células con un vector de expresión
que contiene un polinucleótido codificador de un inhibidor operable
de ICE/CED-3, p. ej., antisentido, a dichas
células.
El método de la invención posee utilidad
terapéutica. Por ejemplo, una suspensión de células madre
hematopoyéticas pluripotentes (HSC), obtenida por métodos estándar
de la técnica, se puede tratar con el método de la invención y
utilizarse para llevar a cabo la reconstitución hematopoyética de un
receptor. Como tratamiento ex vivo,por ejemplo, las células
madre pluripotentes enriquecidas del receptor (reconstitución
autóloga) o derivadas de un individuo que no sea el receptor
(reconstitución no autóloga) se pueden expandir y utilizar en el
tratamiento o la prevención de distintas enfermedades o trastornos,
tales como anemias, malignidades, trastornos autoinmunitarios y
distintas alteraciones y deficiencias, cuyos repertorios celulares
hematopoyéticos se han reducido, como en receptores tratados con
distintos agentes quimioterapéuticos o radiológicos, o receptores
con sida. Otros usos terapéuticos de las composiciones de la
invención se conocen en la técnica. El tratamiento de las células
trasplantadas puede ser tanto ex vivo como, tras el
trasplante, in vivo.
Un ejemplo del modo en el que se puede aplicar la
invención a órganos de donantes no autólogos para receptores humanos
es el siguiente: comenzando una semana antes del trasplante, al
receptor se le puede administrar ciclofosfamida para reducir el
potencial de respuestas inmunológicas evocadas. Poco después
(1-3 días) se puede iniciar una dosis
inmunosupresora de ciclosporina o FK506 antes del trasplante para
aumentar la aceptación del injerto. Inmediatamente antes del
trasplante, al donante se le puede administrar un inhibidor de
ICE/CED-3, antes de la extirpación del órgano. Tras
la extirpación antes del trasplante, el órgano del donante se lava
abundantemente con una disolución que contiene por lo menos un
inhibidor de ICE/CED-3, p. ej., una fluoroalquil
cetona peptídica. Después del trasplante, mediante técnicas
quirúrgicas convencionales, por lo general se mantiene al paciente
bajo inmunosupresión de rutina usando ciclosporina o FK506,
ciclofosfamida y esteroides y, opcionalmente, el inhibidor o
inhibidores de ICE/ CED-3. En base a los signos y
síntomas clínicos relacionados con la respuesta inmunitaria, se
reduce la dosis de varios de los inmunosupresores.
Un agente inmunosupresor utilizado durante el
trasplante es un agente tal como Ciclosporina A (CsA), no obstante,
se pueden utilizar otros agentes que causan inmunosupresión, como
rapamicina, desoxispergualina y FK506 u otros equivalentes
funcionales de estos compuestos. La CsA preferentemente se
administra por inyección en una dosis inmunosupresora. La duración
del tratamiento con CsA puede variar de aproximadamente 2 a
aproximadamente 20 días.
Para aumentar la supervivencia del órgano antes
del trasplante, el inhibidor de la familia ICE/CED-3
se puede administrar por adición al fluido utilizado para perfundir
el órgano extirpado. Si el inhibidor de ICE/CED-3 se
administrará también al donante antes de la extirpación del órgano,
el inhibidor o inhibidores de ICE/CED-3 se
administrarán por cualquier medio adecuado, incluyendo la
administración parenteral, subcutánea, intrapulmonar e intranasal.
Las infusiones parenterales incluyen administración intramuscular,
intravenosa, intra-arterial o intraperitoneal.
Se ha de entender que se puede trasplantar
cualquier órgano de cualquier especie. El método de la invención es
útil para conservar órganos que se utilizarán para trasplantes de la
misma especie, tales como receptores humanos y otros donantes
humanos (aloinjertos y autoinjertos) o a receptores humanos de otras
especies tales como ovejas, cerdos o primates no humanos
(xenoinjertos), por ejemplo. Dichos tejidos para trasplante
incluyen, aunque sin limitarse a ello, corazón, hígado, riñón,
pulmón, páncreas, islotes pancreáticos, tejido cerebral, cornea,
hueso, intestino, piel y células hematopoyéticas El ser humano es el
receptor preferido.
Con el fin de determinar la cantidad de inhibidor
de ICE/CED-3 que se administrará al donante, p. ej.,
cerdo, y la cantidad de inhibidor de ICE/CED-3 con
que se tratará el órgano que se ha de trasplantar, se administra un
compuesto de modo tal que su concentración en la vasculatura sea por
lo menos tan alta como aquella necesaria para la inhibición de la
apoptosis en un modelo de cultivo celular. Se conoce en la técnica
una variedad de modelos de cultivos celulares (p. ej., Armstrong
et al., supra; Schlegel, et al., supra;
Boudreau, et al., supra). Al órgano del donante, y
opcionalmente al donante, se le administra un inhibidor de ICE con
el fin de reducir la apoptosis por tanto como aproximadamente 10% de
la apoptosis normal observada en el órgano del donante. Por lo
tanto, tal como se emplea en la presente, la expresión cantidad
"inhibidora de apoptosis" se refiere a aquella cantidad de
inhibidor de ICE que inhibe la actividad de la ICE y/o la apoptosis
en aproximadamente 75%, y preferentemente aproximadamente 90%.
Incluso en otra realización, la invención provee
un método para aumentar la supervivencia de las células cultivadas
in vitro para utilidades que no son un trasplante. Por
ejemplo, la inhibición de la muerte celular programada se usa para
mejorar los procesos de bioproducción. Por ejemplo, en la producción
de proteínas recombinantes, las producciones pueden estar limitadas
por la muerte celular apoptótica de células hospedantes cultivadas.
Por lo tanto, el tratamiento de células hospedantes con inhibidores
de ICE/CED-3, o el uso de células hospedantes que
expresan secuencias de ADN o ARN antisentido complementarias a
ICE/CED-3 y capaces de inhibir la transcripción o
traducción de miembros de la familia ICE/CED-3 o que
expresan genes codificadores de los inhibidores de la familia
ICE/CED-3, aumentarían la bioproducción, permitiendo
que las células sobrevivan por un tiempo más prolongado y produzcan
y/o segreguen un producto deseado por más tiempo, provocando una
producción mayor de producto. La capacidad de prevenir la muerte
celular programada puede hacer posible que las células vivan
independientemente de los factores de crecimiento normalmente
requeridos, reduciendo el costo de los complementos del medio
de
cultivo.
cultivo.
Con el fin de demostrar la utilidad en la
bioproducción, una línea celular que produce naturalmente un
producto útil (p. ej., una citocina) o una línea celular
genéticamente modificada para expresar un producto útil (p. ej.,
células COS o CHO que expresan establemente eritropoyetina humana
recombinante, hormona de crecimiento o G-CSF) se
pone en contacto con el inhibidor de ICE/CED-3
durante la fermentación. La eficacia del inhibidor de
ICE/CED-3 en la bioproducción se puede medir de
varias maneras 1) determinando el porcentaje de células apoptóticas
en el cultivo en diferentes puntos de tiempo; 2) determinando la
vida útil del cultivo con respecto a la producción del producto
deseado; 3) midiendo el rendimiento del producto por gramo de
células o por volumen de cultivo; 4) midiendo la pureza final del
producto.
Los métodos para aumentar la eficacia o
productividad total de la bioproducción son útiles porque reducen
los costos de producir un producto natural o recombinante. La
fermentación de células mamíferas se limita disminuyendo la
viabilidad celular con el tiempo. Se ha demostrado que la muerte
celular durante la fermentación es apoptótica, por lo tanto los
inhibidores de la apoptosis aumentarán la viabilidad celular durante
la bioproducción. Los medios de crecimiento utilizados para la
bioproducción a menudo son sin suero enriquecidos con factores de
crecimiento para aumentar la viabilidad celular. El enriquecimiento
con inhibidores de ICE/CED-3 de la presente
invención está diseñado para reemplazar o aumentar dichos
aditivos.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención comprenden cualquiera de los compuestos de la presente
invención, y sus sales farmacéuticamente aceptables, con cualquier
excipiente, adyuvante o vehículo farmacéuticamente aceptable (en
adelante denominados colectivamente "excipientes farmacéuticamente
aceptables"). Los excipientes, adyuvantes y vehículos
farmacéuticamente aceptables que se pueden utilizar en las
composiciones de la presente invención incluyen, aunque sin
limitarse a ello, alúmina, estearato de aluminio, lecitina,
proteínas del suero tales como albúmina de suero humana; sustancias
tampón tales como los distintos fosfatos, glicina, ácido sórbico,
sorbato de potasio, mezclas de glicérido parciales de ácidos grasos
vegetales saturados; agua, sales o electrólitos, tales como
protamina sulfato, fosfato de hidrógeno disódico, fosfato de
hidrógeno de potasio, cloruro de sodio y sales de zinc; sílice
coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias
a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio,
poliarilatos, ceras, polímeros de bloque
polietileno-polioxipropileno, grasa de lana y
polietilenglicol, y similares.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención se pueden administrar en forma oral, parenteral, por
pulverización para inhalación, tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal
o por un reservorio implantado. Se prefieren las administraciones
oral y parenteral. El término "parenteral", tal como se usa en
la presente, incluye las técnicas de inyección subcutánea,
intracutánea, intravenosa, intramuscular,
intra-articular, intrasinovial, intraesternal,
intratecal, intralesional e intracraneal o técnicas de infusión.
Las composiciones farmacéuticas pueden ser en la
forma de una preparación inyectable estéril, por ejemplo, como una
suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión
se puede formular de acuerdo con técnicas conocidas en el campo, que
utilizan agentes adecuados de dispersión o humectación (por ejemplo,
Tween 80) y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril
también puede ser una disolución o suspensión inyectable estéril en
un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por
ejemplo, una disolución en 1,3-butandiol. Entre los
vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se
encuentran manitol, agua, disolución de Ringer y disolución
isotónica de cloruro de sodio. Además, convenientemente se emplean
aceites estériles y fijos como un medio disolvente o de suspensión.
Para este fin, se puede emplear cualquier aceite fijo insípido,
incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales
como ácido oleico y sus derivados de glicérido, son útiles en la
preparación de inyectables, ya que son aceites naturales
farmacéuticamente aceptables, como aceite de oliva o aceite de
ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas. Estas
disoluciones o suspensiones oleosas también pueden contener un
dispersante o diluyente de alcohol de cadena larga.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención se pueden administrar en forma oral en cualquier forma de
dosificación oralmente aceptable que incluye, aunque sin limitarse a
ello, cápsulas, comprimidos y suspensiones y disoluciones acuosas.
En el caso de comprimidos para uso oral, los excipientes que
normalmente se utilizan incluyen lactosa y almidón de maíz.
Típicamente, también se añaden agentes lubricantes, como estearato
de magnesio. Para administración oral en forma de cápsulas, los
diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se
administran suspensiones acuosas en forma oral, el ingrediente
activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se
desea, se pueden añadir ciertos agentes edulcorantes y/o
saborizantes y/o colorantes.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención también se pueden administrar en la forma de supositorios
para administración rectal. Estas composiciones se pueden preparar
mezclando un compuesto de la presente invención con un excipiente no
irritante adecuado que es sólido a temperatura ambiente pero líquido
a temperatura rectal. Dichos materiales incluyen, aunque sin
limitarse a ello, manteca de cacao, cera de abeja y
polietilenglicoles.
La administración tópica de las composiciones
farmacéuticas de la presente invención es especialmente útil cuando
el tratamiento deseado implica áreas u órganos fácilmente accesibles
para aplicación tópica. Para aplicación tópica a la piel, la
composición farmacéutica debería formularse con un ungüento adecuado
que contenga los componentes activos suspendidos o disueltos en un
excipientes. Los excipientes para administración tópica de los
compuestos de la presente invención incluyen, aunque sin limitarse a
ello, aceite mineral, vaselina líquida, vaselina blanca, compuestos
de propilenglicol, polioxietileno, polioxipropileno, cera
emulsionante y agua. Alternativamente, la composición farmacéutica
se puede formular con una loción o crema adecuada que contenga el
compuesto activo suspendido o disuelto en un excipiente. Los
excipientes adecuados incluyen, aunque sin limitarse a ello, aceite
mineral, sorbitan monoestearato, polisorbato 60, cera de ésteres
cetílicos, alcohol de cetearilo, 2-octildodecanol,
alcohol bencílico y agua. Las composiciones farmacéuticas de la
presente invención también se pueden aplicar tópicamente a la parte
inferior del tubo digestivo por formulación de un supositorio rectal
o en una formulación en enema adecuada. Los parches transdérmicos
para aplicación tópica están también incluidos dentro de la presente
invención.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención se pueden administrar por aerosol nasal o inhalación.
Dichas composiciones se preparan de acuerdo con técnicas conocidas
en el campo de formulación farmacéutica y se pueden preparar como
disoluciones en disolución salina, empleando alcohol bencílico u
otros conservantes adecuados, promotores de absorción para aumentar
la biodisponibilidad, fluorocarbonos y/u otros agentes
solubilizantes o dispersantes conocidos en la técnica.
Los compuestos de la presente invención se pueden
utilizar en combinación bien con agentes antiinflamatorios
convencionales o con inhibidores de metaloproteasa de matriz,
inhibidores de lipoxigenasa y antagonistas de citocinas que no sean
IL-1\beta.
Cuando los compuestos de la presente invención se
administran en terapias de combinación con otros agentes, se pueden
administrar secuencial o concurrentemente al paciente.
Alternativamente, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la
invención pueden estar comprendidas por una combinación de un
compuesto de Fórmula 1 ó 3, u otros inhibidores de ICE tal como se
describe en la presente, y otro agente terapéutico o profiláctico ya
mencionado.
Los estados patológicos que se pueden tratar o
prevenir mediante las composiciones farmacéuticas de la presente
incluyen, aunque sin limitarse a ello, enfermedades inflamatorias,
enfermedades autoinmunitarias y enfermedades neurodegenerativas,
como así también la inhibición de apoptosis indeseada implicada en
lesiones isquémicas, tales como lesión isquémica al corazón (p. ej.,
infarto de miocardio), cerebro (p. ej., apoplejía) y riñón (p. ej.,
nefropatía isquémica). Como consecuencia de su capacidad para
inhibir la apoptosis, las presentes composiciones farmacéuticas son
también útiles para la repoblación de células hematopoyéticas de un
paciente tras una quimioterapia. Los métodos para administrar una
cantidad eficaz de las composiciones farmacéuticas anteriormente
mencionadas a mamíferos, también denominados pacientes en la
presente, que necesitan dicho tratamiento (es decir, aquellos que
padecen enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias,
enfermedades neurodegenerativas y para la repoblación de células
hematopoyéticas en pacientes con cáncer que se han sometido a
quimioterapia), son otro aspecto de la presente invención.
Finalmente, como otra consecuencia de su capacidad para inhibir la
apoptosis, las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden
utilizar en un método para prolongar la viabilidad de órganos que se
han de utilizar en trasplantes.
Las enfermedades inflamatorias que se pueden
tratar o prevenir incluyen, por ejemplo, choque septicémico,
septicemia y síndrome disneico agudo del adulto. Las enfermedades
autoinmunitarias diana incluyen, por ejemplo, artritis reumatoidea,
lupus eritematoso sistémico, escleroderma, tiroiditis crónica,
enfermedad de Graves, gastritis autoinmunitaria, diabetes mellitus
insulino dependiente, anemia hemolítica autoinmunitaria, neutropenia
autoinmunitaria, trombocitopenia, hepatitis activa crónica,
miastenia grave y esclerosis múltiple. Las neurodegenerativas diana
descritas en la presente invención también se pueden utilizar para
promover la cicatrización de heridas. Las enfermedades diana
asociadas con apoptosis perjudicial, en otros términos, aquellas
asociadas con lesión isquémica, incluyen infarto de miocardio,
apoplejía y nefropatía isquémica.
La expresión "cantidad eficaz" se refiere a
niveles de dosificación en el orden de aproximadamente 0,05
miligramos a aproximadamente 140 miligramos por kilogramo de peso
corporal por día para uso en el tratamiento de las afecciones
anteriormente indicadas (típicamente aproximadamente 2,5 miligramos
a aproximadamente 7 gramos por paciente por día). Por ejemplo, la
inflamación se puede tratar eficazmente por administración de
aproximadamente 0,01 a 50 miligramos del compuesto por kilogramo de
peso corporal por día (aproximadamente 0,5 miligramos a
aproximadamente 3,5 gramos por paciente por día).
La cantidad de los compuestos de Fórmula 1, 3 u
otros inhibidores de ICE/ced-3 que se puede combinar
con los materiales excipientes para producir una forma de
dosificación única variará dependiendo del hospedante tratado y del
modo de administración particular. Por ejemplo, una formulación para
administración oral a seres humanos puede contener entre 0,5
miligramos y 5 gramos de un compuesto de Fórmula 1 combinado con una
cantidad apropiada y conveniente de un excipiente farmacéuticamente
aceptable puede variar entre aproximadamente 5 y aproximadamente 95
por ciento de la composición total. Las formas unitarias de
dosificación en general contendrán entre aproximadamente 1 miligramo
y aproximadamente 500 miligramos de un compuesto activo de Fórmula
1, 3 u otros inhibidores de ICE/ced-3.
Se ha de entender, no obstante, que la
"cantidad eficaz" específica para cualquier paciente particular
dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del
compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, la salud
general, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la ruta de
administración, el índice de excreción, la combinación de fármacos y
la gravedad de la enfermedad particular del paciente que se someta a
prevención o terapia.
Si bien la presente invención se concentra en el
uso de los compuestos descritos en la presente para inhibir
ICE/CED-3 proteasas y para prevenir la apoptosis,
los compuestos de la presente invención se pueden utilizar también
como agentes inhibidores para otras cisteína proteasas.
Los compuestos de la presente invención son
también útiles como reactivos comerciales que se unen en forma
eficaz a la familia ICE/ced-3 de cisteína proteasa u
otras cisteína proteasas. Como reactivos comerciales, los compuestos
de la presente invención, y sus derivados, se pueden usar para
bloquear la proteólisis de un péptido diana o se pueden derivar para
unirse a una resina estable como un sustrato unido para aplicaciones
de cromatografía de afinidad. Éstos y otros usos que caracterizan a
los inhibidores de cisteína proteasa comercial serán obvios para la
persona con experiencia ordinaria en la técnica.
Los siguientes ejemplos tienen como fin ilustrar
la invención. Si bien son los que típicamente se podrían utilizar,
alternativamente podrán emplearse otros procedimientos conocidos por
los expertos en la técnica.
En los siguientes Ejemplos, se obtuvieron
espectros de RMN de protones a 300 MHZ; los desplazamientos químicos
se citan a campo más abajo a partir de tetrametilsilano interno.
Se llevaron a cabo ensayos enzimáticos de
fluorescencia que detectan la actividad de los compuestos de Fórmula
1, utilizando enzimas ICE y cpp32 recombinantes, esencialmente de
acuerdo con Thornberry et al. (Nature, 356:768:774
(1992)) y Nicholson et al. (Nature,
376:37-43 (1995)) respectivamente, (incorporados a
la presente por referencia) en placas de microtitulación de 96
pocillos. El sustrato para estos ensayos fue
Acetil-Tyr-Val-Ala-Asp-amino-4-metilcumarina
(AMC) para el ensayo de ICE y
Acetil-Asp-Glu-Val-Asp-amino-4-metilcumarina
para los ensayos de cpp32 y Mch5. Las reacciones enzimáticas
tuvieron lugar en tampón ICE (HEPES 25 mM, EDTA I mM, 0,1% CHAPS,
10% sacarosa, pH 7,5) que contenía DTT 2 mM a temperatura ambiente
por duplicado. Los ensayos se llevaron a cabo mezclando los
siguientes componentes:
50 \mul bien de ICE, Mch2, Mch5 o cpp32
(concentraciones de 18,8, 38, 8,1 y 0,153 nM, respectivamente) o
enzima Mch3 (1 unidad) en tampón ICE que contenía DTT bien 8,0 (ICE,
Mch2, Mch3, cpp32) o 20 (Mch5) mM;
50 \mul bien del compuesto de Fórmula 1 o
tampón ICE (control); y 100 \mul de sustrato 20 \muM.
La enzima y el compuesto de Fórmula 1 que se han
de ensayar se pre-incubaron en los pocillos de la
placa de microtitulación durante 30 minutos a temperatura ambiente
antes de la adición del sustrato para iniciar la reacción. La
formación de producto AMC fluorescente se vigiló durante una hora a
temperatura ambiente, midiendo la emisión de fluorescencia a 460 nm,
usando una longitud de onda de excitación de 360 nm. Se promedió el
cambio en fluorescencia en los pocillos duplicados (control) y se
trazaron los valores medio como una función de la concentración del
inhibidor para determinar la concentración del inhibidor que produce
50% de inhibición (IC_{50}). Los resultados se exponen en las
Tablas 1 y 4 (Figuras 1 y 4).
El compuesto de referencia para este ensayo fue
Cbz-ValAlaAsp-H y los valores se
denotan en las Tablas 1 y 4 como "Referencia".
Para la inhibición irreversible de una enzima
proteasa de la familia ICE/ced-3 con un inhibidor
irreversible competitivo; usando el modelo representado por las
siguientes fórmulas:
La formación de producto en tiempo t se puede
expresar como:
en la que E, I, EI y
E-I denotan la enzima activa, el inhibidor, el
complejo inhibidor-enzima no covalente y el aducto
inhibidor-enzima no covalente, respectivamente. El
valor K_{i} es la constante de disociación total de las etapas de
unión reversible, y k_{3} es la constante del índice irreversible.
Los valores [S] y K_{s} son la concentración de sustrato y la
constante de disociación del sustrato unido a la enzima,
respectivamente.
Las ecuaciones anteriores se utilizaron para
determinar los valores K_{i} y k_{3} de un inhibidor determinado
unido a la proteasa de la familia ICE/ced-3. Por lo
tanto, se realizó un ensayo continuo durante sesenta minutos en
distintas concentraciones del inhibidor y el sustrato. El ensayo se
formuló esencialmente del mismo modo anteriormente descrito para
generar los datos de la Tabla 1, excepto que la reacción se inició
añadiendo la enzima a la mezcla de sustrato e inhibidor. Los valores
Ki y k_{3} se obtuvieron simulando la formación de producto AMC
como una función del tiempo de acuerdo con la Ecuación 1. Los
resultados de este segundo ensayo se exponen a continuación en las
Tablas 2, 3 y 5 (Figuras 2, 3 y 5).
El compuesto de referencia para este ensayo fue
Cbz-ValAlaAsp-CH_{2}F y los
valores se denotan en las Tablas 2, 3 y 5 como
"Referencia".
A una disolución de ácido
(2S-cis)-5-amino-1,2,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carboxílico,
éster etílico (0,437 g, 1,73 mmol, preparada como se describe en
Tetrahedron Letters 36, pp. 1593-1596 (1995) y en la
patente estadounidense 5.504.080 (2 de abril de 1996)) en cloruro de
metileno (4 ml), agitando a 0ºC, se le añadieron bencil cloroformato
(0,370 ml, 2,6 mmol) y trietilamina (0,724 ml, 5,2 mmol), y la
mezcla resultante se agitó bajo nitrógeno durante 45 minutos. La
reacción se enfrió rápidamente con agua, luego se dividió entre
acetato de etilo y 5% disolución de bisulfato de potasio acuoso. La
capa acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo, luego se
lavaron las capas orgánicas combinadas con disolución saturada de
cloruro de sodio, se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron
hasta secarse. La purificación del producto bruto por cromatografía
"flash" sobre gel de sílice (gel de sílice marca S/P
60\ring{A}, malla 230-400 ASTM) eluyendo con
acetato de etilo-hexano (2:1) produjo 0,558 g (68%)
de producto bruto. La trituración con acetato de
etilo-hexano (1:4) produjo 0,480 g del compuesto del
título como un sólido blanco; p.f: 139-140ºC. TLC
(acetato de etilo-hexano, 2:1): Rf=0,6;
^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}): \delta
7,35-7,30 (m, 5H), 7,02-6,94 (m,
3H), 6,17 (d, J=5,4 Hz, 1H), 4,15 (q, J=7,1 Hz, 2H), 3,46 (dd,
J=11,0, 16,7 Hz, 1H), 3,29 (m, 1H), 3,10 (d, J=116,5, 2H), 2,35 (m,
1H), 2,16 (m, 1H), 1,23 (t, J=7,2 Hz, 3H).
A una disolución de ácido
(2S-cis)-5-benciloxicarbonilamino-1,2,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carboxílico,
éster etílico, (0,428 g, 1,05 mmol) en 1,4-dioxano
(7,5 ml) y agua (2,5 ml) se le añadió hidróxido de litio acuoso 1M
(1,6 ml, 1,6 mmol) y la mezcla resultante se agitó a temperatura
ambiente bajo nitrógeno durante 30 minutos. La mezcla de reacción se
acidificó hasta pH 3 con una disolución de cloruro de sodio y
bisulfato de potasio acuoso al 5%. La capa acuosa se extrajo dos
veces con acetato de etilo, y las capas orgánicas combinadas se
secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron hasta secarse para
producir 0,395 g (99%) del compuesto del título como un sólido
blanco fino; p.f: 188-189ºC. TLC (cloruro de
metileno-metanol-ácido acético, 9:1:1): Rf=0,55;
^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta
7,34-7,26 (m, 5H), 7,07-6,97 (m,
3H), 6,08 (d, J=5,7 Hz, 1H), 5,25 (dd, J=3,2, 9,8 Hz, 1H), 5,10 (s,
2H), 4,30 (m, 1H), 3,36 (m, 1H), 3,26 (m, 2H), 3,06 (d, J=12,0 Hz,
1H), 2,36 (m, 1H), 2,09 (m, 1H).
A una disolución de ácido
N-(benciloxicarbonil)-L-aspártico-\beta-éster(terc-butílico)
(14,65 g, 45,3 mmol, Bachem) en CH_{2}Cl_{2} (150 ml) a 0ºC
(baño de hielo), bajo una atmósfera de nitrógeno, se le añadió
hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (7,29 g, 47,6 mmol,
Aldrich) seguido de hidrocloruro de
1-etil-3-(3',3'-dimetil-1'-aminopropil)carbodiimida
(9,55 g, 49,8 mmol, Sigma). Después de agitar a 0ºC durante 15 min.,
se añadieron hidrocloruro de
N,O-dimetilhidroxilamina (5,10 g, 52,3 mmol,
Aldrich) y N-metilmorfolina (5,8 ml, 53 mmol,
Aldrich). La mezcla se dejó calentar hasta temperatura ambiente
durante 3 horas, luego se agitó a temperatura ambiente durante 16
horas. La disolución se concentró al vacío y el residuo se dividió
entre acetato de etilo-5% KHSO_{4} (200 ml cada
uno). La fase orgánica se lavó a su vez con 5% KHSO_{4},
disoluciones de bicarbonato de sodio saturado y cloruro de sodio
saturado; se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se evaporó hasta
un aceite. El aceite se cristalizó a partir de hexano para producir
el producto del título (16,10 g, 97% rendimiento) como un sólido
blanco, cristalino y esponjoso. TLC (acetato de etilo), mancha
simple (UV y PMA): Rf=0,37.
Un procedimiento similar al anterior, comenzando
con 29,3 g de \beta-éster(terc-butílico)
del ácido
N-(benciloxicarbo-
nil)-L-aspártico (escalado al doble) produjo 31,18 g (94% de rendimiento) del producto del título.
nil)-L-aspártico (escalado al doble) produjo 31,18 g (94% de rendimiento) del producto del título.
Una disolución de \beta-(éster
terc-butílico) de
N-(benciloxicarbonil)-L-(N'-metil-N'-metoxi)aspartamida
(15,50 g, 42,3 mmol) en éter anhidro (400 ml) a 0ºC (baño de hielo),
bajo una atmósfera de nitrógeno, se añadió gota a gota a una
disolución 1,0 M de LiAlH_{4} en éter (22,0 ml, 22,0 mmol,
Aldrich) a un índice tal como para mantener la temperatura de la
disolución de reacción entre 0-5ºC (tiempo de
adición 15-20 min). Después de completar la adición
del reactivo de hidruro de aluminio y litio, la mezcla se agitó a
0-5ºC durante 1 h, luego se enfrió rápidamente por
la adición gota a gota de disolución KHSO_{4} 0,3 N (100 ml). La
mezcla resultante se transfirió a un embudo separador añadiendo
suficiente disolución al 5% de KHSO_{4} (75 ml) para disolver los
sólidos. La fase orgánica concentrada se separó y los lavados
acuosos combinados se extrajeron con éter (100 ml). Los extractos de
éter combinados se lavaron con disolución de NaCl saturada, se
secaron sobre sulfato de sodio anhidro y se concentraron in vacuo
con calentamiento mínimo. TLC (acetato de etilo): mancha veteada (UV
y PMA) Rf=0,48. TLC (metanol/cloruro de metileno, 1:9) mancha
importante (UV y PMA): Rf=0,75.
El aldehído bruto se absorbió inmediatamente en
etanol acuoso (45 ml de agua/105 ml de alcohol), se dispuso en un
baño de hielo y se trató con acetato de sodio (3,82 g, 46,6 mmol) e
hidrocloruro de semicarbazida (5,20 g, 46,6 mmol, Aldrich). La
mezcla se agitó a 0ºC (baño de hielo) bajo una atmósfera de
nitrógeno durante 3 h, se dejó calentar hasta temperatura ambiente y
se agitó durante toda la noche (16 h). La mayor parte del etanol se
eliminó al vacío y el residuo se dividió entre acetato de etilo y
agua (100 ml de cada uno). La fase orgánica se lavó en secuencias
con disoluciones al 5% de KHSO_{4}, bicarbonato sódico saturado y
cloruro de sodio saturado; se secó sobre sulfato de sodio anhidro y
se evaporó hasta secarse. El producto bruto de esta reacción se
combinó con aquel de dos procedimientos similares, comenzando con
15,40 g y 4,625 g de \beta-(éster terc-butílico)
de
N-(benciloxicarbonil)-L-(N'-metil-N'-metoxi)aspartamida
(total: 35,525 g, 97 mmol) y estos productos combinados se
purificaron por cromatografía flash sobre gel de sílice, eluyendo
con acetona/cloruro de metileno (3:7), luego
metanol-acetona-cloruro de metileno
(0,5:3:7) para obtener el producto del título puro (27,73 g, 78,5%)
como una espuma incolora. TLC
(MeOH-CH_{2}Cl_{2}, 1:9): mancha simple (UV y
PMA), Rf=0,51.
A una disolución de éster
\beta-(terc-butílico) de semicarbazona del ácido
N-(benciloxicarbonil)-L-aspártico
(13,84 g, 38,0 mmol) en etanol absoluto (250 ml) se le añadió 10%
Pd/C (1,50 g, Aldrich) y la mezcla resultante se agitó bajo
atmósfera de hidrógeno (balón) hasta que la TLC (metanol/cloruro de
metileno, 1:9) indicó el consumo completo del material de inicio (60
min). Observación: Es importante seguir de cerca esta
reacción, ya que el producto se puede hiperreducir. La mezcla se
filtró a través de Celite y se evaporó hasta un aceite. El aceite se
enjuagó con cloruro de metileno (2 x 75 ml), luego con cloruro de
metileno/tolueno (1:1, 75 ml) para obtener la amina bruta como un
sólido cristalino blanco. TLC
(EtOAc-piridina-AcOH-H_{2}O;
60:20:5:10) mancha simple (UV y PMA) Rf=0,24. Observación: En
este sistema de TLC, cualquier producto hiperrreducido aparecerá
inmediatamente debajo del producto deseado, Rf=0,18 (PMA
solamente).
La amina bruta se absorbió en CH_{3}CN (60 ml)
y se trató con una disolución de ácido
p-toluensulfónico monohidratado (7,22 g, 38,0 mmol)
en acetonitrilo (60 ml). Se recogió el precipitado cristalino, se
lavó con acetonitrilo y éter y se secó al aire para producir el
compuesto del título (13,95 g, 92% rendimiento) como un sólido
cristalino blanco.
La pureza óptica de este material se controló por
conversión a la amida Mosher correspondiente [1,05 equiv cloruro de
(R)-(-)-\alpha-metoxi-\alpha-(trifluorometil)fenilacetilo,
2,1 equivalentes de i-Pr_{2}NEt en
CH_{2}Cl_{2}, temperatura ambiente, 30 min]. El producto deseado
tiene un doblete a 7,13 ppm (1H, d, J=2.4 Hz, CH=N) mientras que la
señal correspondiente para su diastereómero es a 7,07 ppm. La pureza
óptica del compuesto del título obtenida a partir del procedimiento
anterior es típicamente > 95:5.
A una disolución de ácido
(2S-cis)-5-benciloxicarbonilamino-1,2,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carboxílico
(0,375 g, 0,989 mmol) en cloruro de metileno (7 ml), agitando a 0ºC
bajo nitrógeno, se le añadió hidrato de
1-hidroxibenzotriazol (0,182 g, 1,19 mmol) e
hidrocloruro de
1-etil-3-(3',3'-dimetil-1'-aminopropil)carbodiimida
(0,284 g, 1,48 mmol). Después de 15 minutos, se añadieron
\beta-éster (terc-butílico) de semicarbazona de
ácido L-aspártico, sal de
p-toluensulfonato (0,386 g, 0,989 mmol) y
N-metilmorfolina (0,163 ml, 1,48 mmol) y la mezcla
de reacción resultante se dejó llevar hasta temperatura ambiente
dentro de 1 hora. Después de agitar durante toda la noche, la
mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó
sucesivamente con disoluciones al 5% de bisulfato de potasio y
cloruro de sodio saturado; se secó sobre sulfato de sodio y se
evaporó hasta secarse. La purificación del producto bruto por
cromatografía flash sobre gel de sílice (gel de sílice marca S/P
60\ring{A}, malla 230-400 ASTM), eluyendo con 2%
metanol-cloruro de metileno, produjo 0,463 g (79%)
del compuesto del título como una espuma blanca. TLC (cloruro de
metileno-metanol, 9:1): Rf=0,5.
^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}): \delta 8,42 (s,
1H), 7,82 (d, J=8,1 Hz, 1H), 7,32 (m, 5H), 7,07 (m, 3H), 5,94 (d,
J=6,3 Hz, 1H), 5,26 (d, J=9 Hz, 1H), 5,10 (s, 2H), 4,82 (m, 1H),
4,35 (m, 1H), 3,56 (d, J=18 Hz, 1H), 3,27 (m, 2H), 3,07 (m, 1H),
2,64 (dd, J=4,7, 15,8 Hz, 1H), 2,44 (dd, J=6,6, 15,9 Hz, 2H), 2,22
(m, 1H), 1,30 (s, 9H). Espectro de masas: m/z 593 (M+H).
A una disolución de semicarbazona de éster
terc-butílico del ácido
(2S-cis)-[5-benciloxicarbonilamino-1,2,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)amino]-4-oxo-butanoico
(0,214 g, 0,362 mmol) en cloruro de metileno (1,5 ml) se le añadió
anisol (0,5 ml, 4,34 mmol) seguido de ácido trifluoroacético (0,75
ml). Después de agitar a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante
2 horas, la mezcla de reacción se diluyó con cloruro de metileno y
se evaporó, luego se enjuagó dos veces con cloruro de metileno para
producir el compuesto del título (0,195 g). TLC (cloruro de
metileno-metanol, 95:5),
Rf=0.2. ^{1}H-RMN (300 MHz,
CDCl_{3}) \delta 9,77 (bs, 1H), 8,32 (d, J=12 Hz, 1H), 8,12 (d,
J-7,8 Hz, 1H), 7,31-7,27 (m, 5H)
7,13-7,04 (m, 3H), 6,64 (m, 1H) 5,32 (d, J=9,9 Hz,
1H), 5,12 (s, 2H), 4,86 (m, 1H), 4,41 (m, 1H), 3,56 (d, J=15 Hz,
1H), 3,25 (m, 2H), 3,10 (m, 2H), 2,64 (m, 2H), 2,28 (m, 2H).
Se trató semicarbazona del ácido
(2-cis)-[5-benciloxicarbonilamino-1,2,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,195 g, 0,36 mmol) con una disolución 3:1:1 de metanol-ácido
acético-37% formaldehído (2 ml) y la mezcla
resultante se agitó bajo nitrógeno durante 1,5 h. La mezcla de
reacción se diluyó con agua, se eliminó el metanol por evaporación,
luego el resto de la mezcla se liofilizó. La purificación del
producto bruto por cromatografía flash sobre gel de fase inversa
(gel MCI, CHP-20P, 75-150
micrómetros), eluyendo con un gradiente 10%-80%
metanol-agua, produjo 0,073 g, (42%) del compuesto
del título como un sólido blanco después de la liofilización; p.f.
101-104ºC. TLC (cloruro de
metileno-metanol-ácido acético, 97:2,5:0,5) Rf=0,45.
^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 7,45 (m,
1H), 7,30 (s, 5H), 7,07 (d, J=3,3 Hz, 1H), 7,00 (d, J=4,8 Hz, 2H),
6,12 (m, 1H), 5,17 (d, J=9,6 Hz, 1H), 5,07 (s, 2H), 4,49 (m, 1H),
4,28 (m, 1H), 3,46 (d, J=9,9 Hz, 1H), 3,30-3,12 (m,
2H), 3,04-2,99 (m, 1H), 2,83-2,76
(m, 1H), 2,46-2,33 (m, 2H), 2,03 (bs, 1H). Espectro
de masas: m/z 480 (M+H).
Se añadió paladio al 10% sobre carbono (0,180 g)
a una disolución de semicarbazona de éster
terc-butílico del ácido
(2S-cis)-[5-benciloxicarbonilamino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,308 g, 0,520 mmol) en metanol (27 ml) y la mezcla resultante se
hidrogenó usando un balón de hidrógeno (1 atm, TA) durante 18 horas.
La mezcla se filtró a través de Celite, se evaporó hasta secarse,
luego se enjuagó dos veces con tolueno para producir el compuesto
del título como un sólido blanquecino (0,215 g). TLC (cloruro de
metileno-metanol, 9:1) Rf=0,15.
^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,53 (s,
1H), 7,89 (d, J=7,6 Hz, 1H), 7,13 (m, 3H), 5,21 (dd, J=2,3, 10,14
Hz, 1H), 4,82 (m, 1H), 3,52 (m, 1H), 3,24 (dd, J=10,3, 16,3 Hz, 1H),
3,03 (m, 2H), 2,62 y 2,42 (AB, dd, J=4,2, 7,1, 15,7 Hz, 2H), 2,19
(m, 1H), 1,32 (s, 9H).
A una disolución de ácido
N-acetil aspártico, éster
\beta-terc-butílico (0,120 g,
0,517 mmol) en cloruro de metileno (1,5 ml), agitando a 0ºC bajo
nitrógeno, se le añadió hidrato de
1-hidroxibenzotriazol (0,086 g, 0,564 mmol) e
hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(0,135 g, 0,705 mmol). Después de 15 minutos, se añadió una
disolución de semicarbazona de éster terc-butílico
del ácido
(25-cis)-[5-amino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,213 g, 0,47 mmol) en cloruro de metileno (2 ml) y la reacción se
dejó llevar hasta temperatura ambiente durante 1 hora. Después de
agitar durante toda la noche, la mezcla de reacción se diluyó con
acetato de etilo y se lavó sucesivamente con disoluciones al 5% de
bisulfato de sodio y cloruro de sodio saturado; se secó (sulfato de
sodio) y evaporó hasta secarse. La purificación del producto bruto
por cromatografía flash sobre gel de sílice (gel de sílice marca S/P
60\ring{A}, malla 230-400 ASTM), eluyendo con 5%
luego 10% metanol-cloruro de metileno, produjo 0,126
g (41%) del compuesto del título como un sólido blanco. TLC (cloruro
de metileno-metanol, 9:1) Rf=0,4.
^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 9,63 (s,
1H), 8,32 (d, J=7,8 Hz, 1H), 7,82 (d, J=,6,6 Hz, 1H), 7,53 (d, J=4,8
Hz, 1H), 7,09 (m, 1H), 7,00 (m, 2H), 5,18 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 4,86
(m, 1H), 4,39 (m, 1H), 3,01 (m, 1H), 2,92 (dd, J= 4,2, 14,7 Hz, 1H)
2,68 (d, J=12,3 Hz, 1H), 2,52 (m, 2H), 2,51 (m, 2H), 2,03 (s,3H),
1,39 (s,,9H), 1,24 (s, 9H).
A una disolución de semicarbazona de éster
terc-butílico del ácido
(2S-cis)-[5-(N-acetil-(S)-aspartil-b-éster
terc-butílico)amino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,117 g,
0,178 mmol) en cloruro de metileno (1 ml) se le añadió anisol (0,5 ml), seguido de ácido trifluoroacético (1 ml). Después de agitar a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2 horas, la mezcla de reacción se diluyó con cloruro de metileno y se evaporó, luego se enjuagó dos veces con cloruro de metileno para producir el compuesto del título (0,099 g). TLC (cloruro de metileno-metanol-ácido acético, 13:6:1 ) Rf=0,2. Espectro de masas: m/z 560 (M+H).
0,178 mmol) en cloruro de metileno (1 ml) se le añadió anisol (0,5 ml), seguido de ácido trifluoroacético (1 ml). Después de agitar a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2 horas, la mezcla de reacción se diluyó con cloruro de metileno y se evaporó, luego se enjuagó dos veces con cloruro de metileno para producir el compuesto del título (0,099 g). TLC (cloruro de metileno-metanol-ácido acético, 13:6:1 ) Rf=0,2. Espectro de masas: m/z 560 (M+H).
Se trató semicarbazona del ácido
(2S-cis)-[5-(N-acetil-(S)-aspartil)amino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,097 g, 0,177 mmol) con una disolución 3:1:1 de metanol-ácido
acético-37% formaldehído (2 ml) y la mezcla
resultante se agitó bajo nitrógeno durante 1,5 h. La mezcla de
reacción se diluyó luego con agua, se eliminó el metanol por
evaporación, luego se liofilizó el resto de la mezcla. La
purificación del producto bruto por cromatografía flash sobre gel de
fase inversa (gel MCI, CHP-20P,
75-150 micrómetros), eluyendo con un gradiente
10%-80% metanol-agua, produjo 0,050 g (56%) del
compuesto del título como un sólido blanco después de la
liofilización; p.f. 160-175ºC (dec). TLC (cloruro de
metileno-metanol-ácido acético, 13:6:1) Rf=0,3.
Espectro de masas: m/z 503 (M+H).
A una disolución de semicarbazona de éster
terc-butílico del ácido
(2S-cis)-[5-amino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,197 g, 0,435 mmol) en cloruro de metileno (6 ml), agitando a 0ºC
bajo nitrógeno, se le añadió anhídrido succínico (0,057 g, 0,566
mmol), seguido de piridina (0,052 ml, 0,653 mmol). Después de agitar
a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 3 horas, la mezcla de
reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó sucesivamente con
disoluciones al 5% de bisulfato de potasio y cloruro de sodio
saturado; se secó (sulfato de sodio) y evaporó hasta secarse. La
purificación del producto bruto por cromatografía flash sobre gel de
sílice (gel de sílice marca S/P 60\ring{A}, malla
230-400 ASTM), eluyendo con 10%
metanol-cloruro de metileno, luego 80:19:1 cloruro
de metileno-metanol-ácido acético, produjo 0,216 g
(88%) del compuesto del título como un sólido blanco. TLC (cloruro
de metileno-metanol-ácido acético, 8:1:1) Rf=0,5.
Espectro de masas: m/z 557 (M-H).
A una disolución de semicarbazona de éster
terc-butílico del ácido
(2S-cis)-[5-succinilamino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-exoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,191 g, 0,342 mmol) en cloruro de metileno (1 ml) se le añadió
anisol (0,5 ml), seguido de ácido trifluoroacético (1 ml). Después
de agitar a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2 horas, la
mezcla de reacción se diluyó con cloruro de metileno y se evaporó,
luego se enjuagó dos veces con cloruro de metileno para producir el
compuesto del título (0,210 g). TLC (cloruro de
metileno-metanol-ácido acético, 8:1:1) Rf=0,4.
Espectro de masas m/z 503 (M+H).
Se trató semicarbazona de ácido
(2S-cis)-[5-succinilamino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,208 g, aproximadamente 0,342 mmol) con una disolución 3:1:1 de
metanol-ácido acético-37% formaldehído (3 ml), y la
mezcla resultante se agitó bajo nitrógeno durante 1,5 h. La mezcla
de reacción se diluyó luego con agua, se eliminó el metanol por
evaporación, luego el resto de la mezcla se liofilizó. La
purificación del producto bruto por cromatografía flash sobre gel de
fase inversa (gel MCI, CHP-20P,
75-150 micrómetros), eluyendo con un gradiente
10%-80% metanol-agua, produjo 0,064 g (42%) del
compuesto del título como un sólido blanco después de la
liofilización; p.f: 145-160ºC (dec). TLC (cloruro de
metileno-metanol-ácido acético, 8:1:1) Rf=0,45.
Espectro de masas: m/z 446 (M+H).
A una disolución de éster
N-benciloxicarbonil-(S)-aspartil-\beta-terc-butílico
(0,169 g, 0,521 mmol) en cloruro de metileno (1,5 ml), agitando a
0ºC bajo nitrógeno, se le añadió hidrato de
1-hidroxibenzotriazol (0,087 g, 0,569 mmol) e
hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(0,136 g, 0,711 mmol). Después de 15 minutos, se añadió una
disolución de semicarbazona de éster terc-butílico
del ácido
(2S-cis)-[5-amino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,217 g, 0,474 mmol) en cloruro de metileno (2 ml) y la reacción se
dejó llevar hasta temperatura ambiente dentro de 1 hora. Después de
agitar durante toda la noche, la mezcla de reacción se diluyó con
acetato de etilo y se lavó sucesivamente con disoluciones al 5% de
bisulfato de potasio y cloruro de sodio saturado; se secó (sulfato
de sodio) y se evaporó hasta secarse. La purificación del producto
bruto por cromatografía flash sobre gel de sílice (gel de sílice
marca S/P 60\ring{A}, malla 230-400 ASTM),
eluyendo con 2%, luego 5% metanol-cloruro de
metileno, produjo 0,244 g (67%) del compuesto del título como un
sólido blanquecino. TLC (cloruro de
metileno-metanol, 9:1) Rf=0,55.
^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 9,13 (s,
1H), 7,85 (d, J= 6 Hz, 1H), 7,56 (d, J= 5,7 Hz, 1H) 7,23 (m, 5H),
7,08 (m, 1H), 7,00 (m, 2H), 5,13 (m, 3H) 4,77 (m, 1H), 4,62 (m, 1H),
4,43 (m, 1H), 3,60 (d, J= 16 Hz, 1H), 3,22 (m, 2H), 2,98 (m, 1H),
2,83 (d, J= 15,3 Hz, 1H), 2,65 y 2,36 (AB, dd, J= 4,2, 7,7, 16,9 Hz,
2H), 2,42 (m,1H), 2,10 (m, 1H), 1,35 (s, 9H), 1,24 (s, 9H).
A una disolución de semicarbazona de éster
terc-butílico del ácido
(2S-cis)-[5-(N-benciloxicarbonil-(S)-aspartil-b-éster
terc-butílico)amino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxobutanoico
(0,217 g, 0,289 mmol) en cloruro de metileno (1 ml) se le añadió
anisol (0,5 ml) seguido de ácido trifluoroacético (1 ml). Después de
agitar a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 3 horas, la
mezcla de reacción se diluyó con cloruro de metileno y se evaporó,
luego se enjuagó dos veces con cloruro de metileno para producir el
compuesto del título (0,193 g). TLC (cloruro de
metileno-metanol, 9:1) Rf=0,35. Espectro de masas:
m/z 652 (M+H).
Se trató semicarbazona de ácido
(2S-cis)-[5-(N-benciloxicarbonil-(S)-aspartil)amino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino)-4-oxo-butanoico
(0,191 g, 0,29 mmol) con una disolución 3:1:1 de metanol-ácido
acético-37% formaldehído (2 ml) y la mezcla
resultante se agitó bajo nitrógeno durante 2 horas. La mezcla de
reacción se diluyó luego con agua, se eliminó el metanol por
evaporación, luego el resto de la mezcla se liofilizó. La
purificación del producto bruto por cromatografía flash sobre gel de
fase inversa (gel MCI, CHP-20P,
75-150 micrómetros), eluyendo con un gradiente
10%-80% metanol-agua, produjo 0,111 g (64%) del
compuesto del título como un sólido blanco después de la
liofilización; p.f. 140-144ºC (dec.). TLC (cloruro
de metileno-metanol, 9:1) Rf=0,4. Espectro de masas:
m/z 593 (M-H).
A una disolución de ácido dihidrocinámico (0,169
g, 0,521 mmol) en cloruro de metileno (1,5 ml), agitando a 0ºC bajo
nitrógeno, se le añadió hidrato de
1-hidroxibenzotriazol (0,088 g, 0,576 mmol) e
hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(0,127 g, 0,665 mmol). Después de 15 minutos, se añadió una
disolución de semicarbazona de éster terc-butílico
del ácido
(2S-cis)-[5-amino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,203 g, 0,443 mmol) en cloruro de metileno (2 ml), y la reacción
se dejó llevar hasta temperatura ambiente dentro de 1 hora. Después
de agitar durante toda la noche, la mezcla de reacción se diluyó con
acetato de etilo y se lavó sucesivamente con disoluciones al 5% de
bisulfato de potasio y cloruro de sodio saturado; se secó (sulfato
de sodio) y se evaporó hasta secarse. La purificación del producto
bruto por cromatografía flash sobre gel de sílice (gel de sílice
marca S/P 60\ring{A}, malla 230-400 ASTM),
eluyendo con 2, luego 5% metanol-cloruro de
metileno, produjo 0,208 g (79%) del compuesto del título como un
sólido blanquecino. TLC (cloruro de
metileno-metanol, 9:1) Rf=0.7.
^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 8,82 (s,
1H), 7,72 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 7,19 (m, 5H), 7,06 (m, 1H), 7,01 (m,
2H), 6,76 (d, J=6,3, 1H), 5,23 (d, J= 8,4 Hz, 1H0, 4,84 (m, 1H),
4,50 (m, 1H), 3,48 (m, 1H), 3,26 (m, 2H), 3,05 (m, 1H), 2,94 (m,
2H), 2,53 (m,4H), 2,28 (m, 1H), 2,06 (m, 1H), 1,29 (s, 9H). Espectro
de masas: m/z 591 (M+H).
A una disolución de semicarbazona de éster
terc-butílico del ácido
(2S-cis)-[5-dihidrocinamilamino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,189 g, 0,320 mmol) en cloruro de metileno (1 ml) se le añadió
anisol (0,5 ml) seguido de ácido trifluoroacético (1 ml). Después de
agitar a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 3 horas, la
mezcla de reacción se diluyó con cloruro de metileno y se evaporó,
luego se enjuagó dos veces con cloruro de metileno para obtener el
compuesto del título (0,183 g). TLC(cloruro de
metileno-metanol, 9:1) Rf=0,25. Espectro de masas:
m/z 535 (M+H).
Se trató semicarbazona de ácido
(2S-cis)-[5-dihidrocinamilamino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,181 g, aproximadamente 0,320 mmol) con una disolución 3:1:1 de
meta-
nol-ácido acético-37% formaldehído (2 ml) y la mezcla resultante se agitó bajo nitrógeno durante 4 horas. La mezcla de reacción se diluyó luego con agua, se eliminó el metanol por evaporación, luego el resto de la mezcla se liofilizó. La purificación del producto bruto por cromatografía flash sobre gel de fase reversa (gel MCI, CHP-20P, 75-150 micrómetros), eluyendo con un gradiente 10%-80% metanol-agua, produjo 0,075 g (47%) del compuesto del título como un sólido blanco después de la liofilización; p.f. 78-81ºC. TLC (cloruro de metileno-metanol, 9:1) Rf=0,45. ^{1}H-RMN (300 MHz, DMSO d_{6}): \delta 8,58 (m, 1H), 8,30 (d, J= 7,5 Hz, 1H), 7,24 (m, 5H), 7,08 (m, 2H), 6,99 (m, 1H), 5,04 (d, J=9,3 Hz, 1H), 4,39 (m, 1H), 4,19 (m, 1H), 3,46 (m, 1H), 3,05 (m, 2H), 2,93 (d, J= 16,8 Hz, 2H), 2,83 (m, 2H), 2,00 (d, J= 5,1 Hz, 2H). Espectro de masas: m/z 478 (M+H).
nol-ácido acético-37% formaldehído (2 ml) y la mezcla resultante se agitó bajo nitrógeno durante 4 horas. La mezcla de reacción se diluyó luego con agua, se eliminó el metanol por evaporación, luego el resto de la mezcla se liofilizó. La purificación del producto bruto por cromatografía flash sobre gel de fase reversa (gel MCI, CHP-20P, 75-150 micrómetros), eluyendo con un gradiente 10%-80% metanol-agua, produjo 0,075 g (47%) del compuesto del título como un sólido blanco después de la liofilización; p.f. 78-81ºC. TLC (cloruro de metileno-metanol, 9:1) Rf=0,45. ^{1}H-RMN (300 MHz, DMSO d_{6}): \delta 8,58 (m, 1H), 8,30 (d, J= 7,5 Hz, 1H), 7,24 (m, 5H), 7,08 (m, 2H), 6,99 (m, 1H), 5,04 (d, J=9,3 Hz, 1H), 4,39 (m, 1H), 4,19 (m, 1H), 3,46 (m, 1H), 3,05 (m, 2H), 2,93 (d, J= 16,8 Hz, 2H), 2,83 (m, 2H), 2,00 (d, J= 5,1 Hz, 2H). Espectro de masas: m/z 478 (M+H).
A una disolución de semicarbazona de éster
terc-butílico del ácido
(2S-cis)-[5-amino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,222 g, 0,490 mmol) en piridina (3 ml), a temperatura ambiente
bajo nitrógeno, se le añadió anhídrido acético (0,07 ml, 0,735
mmol). Después de agitar durante toda la noche, la mezcla de
reacción se diluyó con cloruro de metileno y se evaporó para
producir una espuma. Esto se absorbió en acetato de etilo y se lavó
sucesivamente con disoluciones al 5% de bisulfato de potasio y
cloruro de sodio saturado; se secó (sulfato de sodio) y se evaporó
hasta secarse para producir 0,130 g (53%) del compuesto del título
como un sólido blanquecino. TLC (cloruro de
metileno-metanol, 9:1) Rf=0,55.
^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}): \delta 8,75 (s,
1H), 7,75 (d, J= 8,4 Hz, 1H), 7,08 (m, 1H), 7,01 (m, 2H), 6,87 (d,
J=6,3 Hz, 1H), 5,25 (d, J= 8,1 Hz, 1H), 4,84 (m, 1H), 4,52 (m, 1H),
3,50 (m, 1H), 3,28 (m, 2H), 3,02 (m, 1H), 2,55 y 2,46 (AB, dd, J=
4,2, 7,1, 15,7 Hz, 2H), 2,36 (m, 1H), 2,18 (m, 1H), 2,02 (s, 3H),
1,31 (s, 9H).
A una disolución de semicarbazona de éster
terc-butílico del ácido
(2S-cis)-[5-acetilamino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,112 g, 0,224 mmol) en cloruro de metileno (1 ml) se le añadió
anisol (0,5 ml) seguido de ácido trifluoroacético (1 ml). Después de
agitar a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2,5 horas, la
mezcla de reacción se diluyó con cloruro de metileno y se evaporó,
luego se enjuagó dos veces con cloruro de metileno para producir el
compuesto del título (0,117 g). TLC (cloruro de
metileno-metanol, 9:1) Rf=0,15. Espectro de masas:
m/z 445 (M+H).
Se trató semicarbazona de ácido
(25-cis)-[5-acetilamino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,115 g, aproximadamente 0,224 mmol) con una disolución 3:1:1 de
metanol-ácido acético-37% formaldehído (2 ml) y la
mezcla resultante se agitó bajo nitrógeno durante 5 horas. La mezcla
de reacción se diluyó con agua, se eliminó el metanol por
evaporación, luego el resto de la mezcla se liofilizó. La
purificación del producto bruto por cromatografía flash sobre gel de
fase inversa (gel MCI, CHP-20P,
75-150 micrómetros), eluyendo con un gradiente
10%-80% metanol-agua, produjo 0,044 g (51%) del
compuesto del título como un sólido blanco después de la
liofilización; p.f. 210-215ºC (dec). TLC (cloruro de
metileno-metanol-ácido acético, 44:5:1) Rf=0,45.
Espectro de masas: m/z 388 (M+H).
A una disolución de ácido
1-naftoico (0,072 g, 0,417 mmol) en cloruro de
metileno (1,5 ml), agitando a 0ºC bajo nitrógeno, se le añadió
hidrato de 1-hidroxibenzotriazol (0,077 g, 0,501
mmol) e hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida
(0,120 g, 0,626 mmol). Después de 15 minutos, se añadió una
disolución de semicarbazona de éster terc-butílico
del ácido
(2S-cis)-[5-amino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,189 g, 0,147 mmol) en cloruro de metileno (2 ml) y la mezcla de
reacción se dejó llevar hasta temperatura ambiente dentro de 1 hora.
Después de agitar durante un total de 5 horas, la mezcla de reacción
se diluyó con acetato de etilo y se lavó sucesivamente con
disoluciones al 5% de bisulfato de potasio y cloruro de sodio
saturado, se secó (sulfato de sodio) y se evaporó hasta secarse. La
purificación del producto bruto por cromatografía flash sobre gel de
sílice (gel de sílice marca S/P 60\ring{A}, malla
230-400 ASTM), eluyendo con 5%
metanol-cloruro de metileno, produjo 0,168 g (66%)
del compuesto del título como un sólido blanquecino; p.f.
103-105ºC (dec.). TLC (cloruro de
metileno-metanol, 9:1) Rf=0,6. Espectro de masas:
m/z 613 (M+H). ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3})
\delta 9,09 (bs, 1H), 8,38 (d, J=8,4 Hz, 1H),
7,82-7,93 (m, 3H), 7,70 (d, J=6,3 Hz, 1H),
7,45-7,58 (m, 3H), 7,37 (d, J=6,6 Hz, 1H),
7,06-7,15 (m, 4H), 5,30 (d, J= 8,4 Hz, 1H),
4,80-4,85 (m, 2H), 3,57 (d, J= 3,6 Hz, 1H),
3,30-3,45 (m, 2H), 3,16 (m, 1H),
2,59-2,65 (m, 2H), 2,27-2,49 (m,
2H), 1,29 (s, 9H).
A una disolución de semicarbazona de éster
terc-butílico del ácido
(2S-cis)-[5-(1-naftoil)amino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,106 g, 0,173 mmol) en cloruro de metileno (1 ml) se le añadió
anisol (0,5 ml) seguido de ácido trifluoroacético (1 ml). Después de
agitar a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 3 horas, la
mezcla de reacción se diluyó con cloruro de metileno y se evaporó,
luego se enjuagó dos veces con cloruro de metileno para producir el
compuesto del título (0,110 g). TLC (cloruro de
metileno-metanol, 9:1) Rf=0,3.
Se trató semicarbazona de ácido
(2S-cis)-[5-(1-naftoil)amino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,110 g, aproximadamente 0,173 mmol) con una disolución 3:1:1 de
meta-
nol-ácido acético-37% formaldehído (3 ml) y la mezcla resultante se agitó bajo nitrógeno durante 5 horas. La mezcla de reacción se diluyó luego con agua, se eliminó el metanol por evaporación, luego el resto de la mezcla se liofilizó. La purificación del producto bruto por cromatografía flash sobre gel de sílice (gel de sílice marca S/P 60\ring{A}, malla 230-400 ASTM), eluyendo con un gradiente 5%-20% metanol-cloruro de metileno, produjo 0,076 g (86%) del compuesto del título como un sólido blanco; p.f. 202-203ºC (dec). TLC (cloruro de metileno-metanol-ácido acético, 20:1:1) Rf=0,3. Espectro de masas: m/z 498 (M-H). ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 9,38 (bs, 1H), 8,94 (m, 1H), 8,56 (m, 1H), 8,36 (m, 1H), 7,94-8,02 (m, 2H), 7,68 (d, J=6,9 Hz, 1H), 7,51-7,59 (m, 3H), 7,07-7,13 (m, 2H), 6,97 (m, 1H), 5,20 (d, J= 10,5, 1Hz), 4,67 (m, 1H), 4,15 (m, 1H), 3,49 (m, 1H), 2,95-3,23 (m, 2H), 2,53 (m, 1H), 2,22-2,34 (m, 2H).
nol-ácido acético-37% formaldehído (3 ml) y la mezcla resultante se agitó bajo nitrógeno durante 5 horas. La mezcla de reacción se diluyó luego con agua, se eliminó el metanol por evaporación, luego el resto de la mezcla se liofilizó. La purificación del producto bruto por cromatografía flash sobre gel de sílice (gel de sílice marca S/P 60\ring{A}, malla 230-400 ASTM), eluyendo con un gradiente 5%-20% metanol-cloruro de metileno, produjo 0,076 g (86%) del compuesto del título como un sólido blanco; p.f. 202-203ºC (dec). TLC (cloruro de metileno-metanol-ácido acético, 20:1:1) Rf=0,3. Espectro de masas: m/z 498 (M-H). ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta 9,38 (bs, 1H), 8,94 (m, 1H), 8,56 (m, 1H), 8,36 (m, 1H), 7,94-8,02 (m, 2H), 7,68 (d, J=6,9 Hz, 1H), 7,51-7,59 (m, 3H), 7,07-7,13 (m, 2H), 6,97 (m, 1H), 5,20 (d, J= 10,5, 1Hz), 4,67 (m, 1H), 4,15 (m, 1H), 3,49 (m, 1H), 2,95-3,23 (m, 2H), 2,53 (m, 1H), 2,22-2,34 (m, 2H).
A una disolución de semicarbazona de éster
terc-butílico del ácido
(2S-cis)-[5-amino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,121 g, 0,264 mmol) en cloruro de metileno (2,5 ml), agitando a
0ºC bajo nitrógeno, se le añadió trietilamina (0,055 ml, 0,396
mmol), seguida de cloruro de benzoilo (0,037 ml, 0,317 mmol).
Después de agitar a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 1
hora, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó
sucesivamente con disoluciones al 5% de bisulfato de potasio,
bicarbonato de sodio saturado y cloruro de sodio saturado; se secó
(sulfato de sodio) y se evaporó hasta secarse. La purificación del
producto bruto por cromatografía flash sobre gel de sílice (gel de
sílice marca S/P 60\ring{A}, malla 230-400 ASTM),
eluyendo con 10% hexano-acetato de etilo, 100%
acetato de etilo, luego 10% metanol-acetato de
etilo, produjo 0,073 g (49%) del compuesto del título como un sólido
blanquecino. TLC (cloruro de metileno-metanol, 9:1)
Rf=0,7. Espectro de masas: m/z 563 (M+H).
^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}): \delta 8,61
(bs, 1H), 7,83-7,86 (m, 2H),
7,47-7,53 (m,3H), 7,06-7,12 (m, 3H),
5,30 (dd, J= 2,2, 7,8 Hz, 1H), 4,89 (m, 1H), 4,72 (m, 1H), 3,60 (d,
J= 16,5 Hz, 1H), 3,36 (m, H), 3,19 (m, 1H), 2,69 (dd, J= 4,4, 11,7
Hz, 1H), 2,52 (m, 1H), 2,29 (m, 1H), 1,34 (s, 9H).
A una disolución de semicarbazona de éster
terc-butílico del ácido
(2S-cis)-[5-benzoilamino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,064 g, 0,114 mmol) en cloruro de metileno (1 ml) se le añadió
anisol (0,5 ml), seguido de ácido trifluoroacético (1 ml). Después
de agitar a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2,5 horas,
la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo y se evaporó
para producir el compuesto del título (0,070 g). TLC (cloruro de
metileno-metanol, 4:1) Rf=0,4. Espectro de masas:
m/z 507 (M+H).
Se trató semicarbazona de ácido
(2S-cis)-[5-benzoilamino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-bi]indol-2-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,070 g, aproximadamente 0,114 mmol) con una disolución 3:1:1 de
metanol-ácido acético-37% formaldehído (3 ml), y la
mezcla resultante se agitó bajo nitrógeno durante 3,5 horas. La
mezcla de reacción se diluyó luego con agua, se eliminó el metanol
por evaporación, luego se liofilizó el resto de la mezcla. La
purificación del producto bruto por cromatografía flash sobre gel de
sílice (gel de sílice marca S/P 60\ring{A}, malla
230-400 ASTM), eluyendo con 10 y 20% de
metanol-cloruro de metileno, produjo 0,042 g (82%)
del compuesto del título como un sólido blanco; p.f.
204-205ºC (dec). TLC (cloruro de
metileno-metanol, 4:1) Rf=0,4. Espectro de masas:
m/z 448 (M-H). ^{1}H-RMN (300 MHz,
DMSO-d_{6}) \delta 8,84 (m, 1H), 8,53 (m, 1H),
7,91-7,95 (m, 2H), 7,46-7,58 (m,
3H), 7,11 (m, 2H), 6,99 (t, J=7,3 Hz, 1H), 5,14 (d, 10,2 Hz, 1H),
4,62 (m, 1H), 4,23 (m, 1H), 3,48 (m, 1H), 3,12-3,18
(m, 2H), 2,99 (m, 1H), 2,58 (m, 1H), 2,12-2,46 (m,
3H).
A una disolución de ácido
(3R,S-cis)-6-amino-5-oxo-2,3,4,5,6,7,8-hexahidro-1H-azepino[3,2,1-hi]quinolina-3-carboxílico,
éster metílico (0,570 g, 2,1 mmol, preparada tal como se describe en
Tetrahderon Letters 36, pp. 1593-1596 (1995) y en la
patente estadounidense 5.504.080 (2 de abril de 1996)) en cloruro de
metileno (6 ml), agitando a 0ºC, se le añadió cloroformato de
bencilo (0,6 ml, 4,2 mmol) y trietilamina (1,2 ml, 8,4 mmol), y la
mezcla resultante se agitó bajo nitrógeno durante 30 minutos. La
reacción se enfrió rápidamente con agua, luego se dividió entre
acetato de etilo y disolución al 5% de bisulfato de potasio acuoso.
La capa acuosa se extrajo dos veces con acetato de etilo, luego las
capas orgánicas combinadas se lavaron con disolución de cloruro de
sodio saturado, se secaron (sulfato de sodio) y se evaporaron hasta
secarse. La purificación del producto bruto por cromatografía flash
sobre gel de sílice (gel de sílice marca S/P 60\ring{A}, malla
230-400 ASTM), eluyendo con acetato de
etilo-hexano (2:1), produjo 0,643 g (76%) del
compuesto del título como una espuma blanca. TLC (cloruro de
metileno-metanol, 95:5) Rf=0,8.
^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}) \delta
7,36-7,25 (m, 5H), 7,13-7,02 (m,
3H), 5,67 (d, J=7,8 Hz, 1H), 5,02 (t, J=9,15, 18,3 Hz, 2H), 4,34 (m,
1H), 3,70 (s, 3H), 3,16 (m, 1H), 2,69-2,56 (m, 5H),
2,06 (m, 1H). Espectro de masas: m/z 408 (M+H).
A una disolución de ácido
(3R,S-cis)-6-benciloxicarbonilamino-5-oxo-2,3,4,5,6,7,8-hexahidro-1H-azepino[3,2,1-hi]
quinolina-3-carboxílico, éster
metílico (0,622 g, 1,53 mmol) en 1,4-dioxano (10,5
ml) y agua (3,5 ml) se le añadió hidróxido de litio acuoso 1M (2,3
ml, 2,3 mmol), y la mezcla resultante se agitó a temperatura
ambiente bajo nitrógeno durante 1 hora. La mezcla de reacción se
acidificó hasta aproximadamente pH 2 con una disolución al 5% de
bisulfato de potasio acuoso, luego se dividió entre acetato de etilo
y disolución de cloruro de sodio saturado. La capa acuosa se extrajo
dos veces con acetato de etilo, y las capas orgánicas combinadas se
secaron (sulfato de sodio) y se evaporaron para producir 0,670 g del
compuesto del título. TLC (cloruro de
metileno-metanol-ácido acético, 32:1:1) Rf=0,35.
^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}): \delta
7,38-7,28 (m, 5H), 7,13-7,04 (m,
3H), 5,72 (d, J=8,1 Hz, 1H), 5,03 (s, 2H), 4,35 (m, 1H),
3,77-3,67(m, 5H), 3,10 (m, 1H),
2,72-2,52 (m, 5H), 2,07 (m, 1H), 1,70 (m, 1H).
A una disolución de ácido
(3R,S-cis)-6-benciloxicarbonilamino-5-oxo-2,3,4,5,6,7,8-hexahidro-1H-azepino[3,2,1-hi]
quinolina-3-carboxílico (0,604 g,
1,5 mmol) en cloruro de metileno (12 ml), agitando a 0ºC bajo
nitrógeno, se le añadió hidrato de
1-hidroxibenzotriazol (0,282 g, 1,8 mmol) e
hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(0,442 g, 3 mmol). Después de 15 minutos, se añadieron éster
\beta-terc-butílico de carbazona
de ácido L-aspártico, sal de
p-toluensulfonato (0,60 g, 1,5 mmol) y
N-metilmorfolina (0,25 ml, 3 mmol), y la mezcla se
dejó llevar hasta temperatura ambiente dentro de 1 hora. Después de
agitar una hora adicional, la mezcla de reacción se diluyó con
acetato de etilo y se lavó sucesivamente con disoluciones al 5% de
bisulfato de sodio y cloruro de sodio saturado; se secó (sulfato de
sodio) y se evaporó hasta secarse. La purificación del producto
bruto por cromatografía flash sobre gel de sílice (gel de sílice
marca S/P 60\ring{A}, malla 230-400 ASTM),
eluyendo con 10% metanol-cloruro de metileno,
produjo 0,523 g (56%) del compuesto del título como una espuma
blanca. TLC (cloruro de metileno-metanol, 9:1)
Rf=0,65. ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}): \delta
9,89 (m, 1H), 7,72 (m, 1H), 7,92 (d, J=9 Hz, 1H), 7,65 (d, J=8,1 Hz,
1H), 7,32-7,28 (m, 5H), 7,12 (s, 1H), 7,07 (d, J=5,7
Hz, 2H), 6,03 (d, J=7,5 Hz, 1H), 5,84 (d, J=8,1 Hz, 1H), 5,03 (s,
2H), 5,01 (m, 1H) 4,80 (m, 1H), 4,31 (m, 1H), 2,98 (m, 1H),
2,75-2,41 (m, 7H), 2,12 (m, 1H), 1,77 (m, 1H), 1,39
(s, 9H).
A una disolución de semicarbazona de éster
terc-butílico del ácido
(3R,S-cis)-6-benciloxicarbonilamino-5-oxo-2,3,4,5,6,7,8-hexahidro-1H-azepino[3,2,1-hi]
quinolina-3-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,200 g, 0,33 mmol) en cloruro de metileno (1 ml) se le añadió
anisol (0,5 ml, 4,62 mmol), seguido de ácido trifluoroacético (1
ml). Después de agitar a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante
1,5 h, la mezcla de reacción se diluyó con cloruro de metileno y se
evaporó, luego se azeotropó dos veces con cloruro de metileno para
producir el compuesto del título (0,248 g). TLC (cloruro de
metileno-metanol-ácido acético, 8:1:1) Rf=0,2.
Espectro de masas: m/z 549 [M-H]^{-}.
Se trató semicarbazona de ácido
(3R,S-cis)-6-benciloxicarbonilamino-5-oxo-2,3,4,5,6,7,8-hexahidro-1H-azepino[3,2,1-hi]quinolina-3-carbonil)-amino]-4-oxo-butanoico
(0,245 g, aproximadamente 0,33 mmol) con una disolución 3:1:1 de
metanol-ácido acético-37% formaldehído (3 ml) y la
mezcla resultante se agitó bajo nitrógeno durante 1,5 h. La mezcla
de reacción se diluyó con agua, se eliminó el metanol por
evaporación, luego se liofilizó el resto de la mezcla. La
purificación del producto bruto por cromatografía flash sobre gel de
fase inversa (gel MCI, CHP-20P,
75-150 micrómetros), eluyendo con un gradiente
10%-80% metanol-agua, produjo 0,090 g (60%) del
compuesto del título como un sólido blanco después de la
liofilización; p.f. 120-123ºC (dec). TLC (cloruro de
metileno-metanol-ácido acético, 32:1:1) Rf=0,45.
^{1}H-RMN (300 MHz, DMSO d_{6}): \delta 8,67
(m, 1H), 7,79 (m, 1H), 7,57 (m, 1H), 7,37-7,27 (m,
5H), 7,17-7,08 (m, 3H), 5,44 (m, 1H), 4,95 (s, 2H),
4,70 (m, 1H), 4,07 (m, 1H), 3,92 (m, 1H), 3,16 (m, 1H), 2,98 (m,
1H), 2,75-2,41 (m, 7H), 2,25 (m, 1H), 2,11 (m, 1H),
1,29 (m, 1H). Espectro de masas: m/z 492
[M-H]^{-}.
A una disolución de ácido
(2S-cis)-5-benciloxicarbonilamino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carboxílico
(0,373 g, 0,98 mmol) en cloruro de metileno (3 ml), agitando a 0ºC
bajo nitrógeno, se le añadió hidrato de
1-hidroxibenzotriazol (0,151 g, 0,98 mmol) e
hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(0,283 g, 1,47 mmol). Después de 15 minutos, se añadió ácido
3-amino-4-hidroxi-5-fluoropentanoico,
éster terc-butílico (0,204 g, 0,98 mmol, preparado
tal como se describe en Tetrahedron Letters 35, pp.
9693-9696 (1994)), y la mezcla se dejó llevar hasta
temperatura ambiente dentro de 1 hora. Después de agitar durante
toda la noche, la mezcla de reacción se diluyó con acetato de etilo
y se lavó sucesivamente con disoluciones al 5% de bisulfato de
potasio y cloruro de sodio saturado; se secó (sulfato de sodio) y se
evaporó hasta secarse. La purificación del producto bruto por
cromatografía flash sobre gel de sílice (gel de sílice marca S/P
60\ring{A}, malla 230-400 ASTM), eluyendo con 2%
metanol-cloruro de metileno, produjo 0,383 g (68%)
del compuesto del título como una espuma blanca. TLC (cloruro de
metileno-metanol, 9:1) Rf=0,6.
^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}): \delta
7,45-7,31 (m, 5H), 7,08-7,01 (m,
3H), 6,10 (m, 1H), 5,26 (m, 1H), 5,12 (s, 2H), 4,52 (m, 1H),
4,38-4,30 (m, 2H), 4,21-4,19 (m,
2H), 4,03-3,95 (m, 2H), 3,43-3,20
(m, 4H), 3,13 (m, 2H), 2,62-2,50 (m, 2H), 2,42 (m,
1H), 1,42 (s, 4H), 1,32 (s, 5H). Espectro de masas: m/z 570
(M+H).
A una disolución de éster
terc-butílico del ácido 3
{(2S-cis)-[5-benciloxicarbonilamino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]}-5-fluoro-4-hidroxi-pentanoico
(0,114 g, 0,20 mmol) en metil sulfóxido (1,3 ml) se le añadió
peryodinano Dess-Martin (0,228 g). Después de agitar
a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2 horas, se añadió una
porción adicional de peryodinano Dess-Martin (0,135
g) y 2,5 horas más tarde una tercera porción (0,10 g). La mezcla de
reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó dos veces con agua
y disolución de cloruro de sodio saturado; se secó (sulfato de
sodio) y se evaporó hasta secarse. La purificación del producto
bruto por cromatografía flash sobre gel de sílice (gel de sílice
marca S/P 60\ring{A}, malla 230-400 ASTM),
eluyendo con 1/1 acetato de etilo-hexanos,
proporcionó 0,076 g (67%) del compuesto del título como una espuma
blanca. TLC (acetato de etilo-hexanos, 1:1) Rf=0,6.
^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}): \delta 7,58 (d,
J = 8,4 Hz, 1H), 7,34-7,30 (m, 5H),
7,07-6,99 (m, 3H), 6,06 (m, 1H), 5,23 (d, J = 12,3
Hz, 1H), 5,12 (s, 2H), 4,53 (d, J = 13,2 Hz, 1H), 4,77 (d, J = 9,9
Hz, 2H), 4,32 (m, 1H), 3,44 (dd, J = 5, 8,4 Hz, 1H),
3,32-3,21 (m, 2H), 3,06 (m, 1H), 2,9 (m, 1H), 2,62
(m, 1H), 2,41 (m, 1H), 2,17 (m, 1H), 1,39 (s, 4H), 1,29 (s, 5H).
A una disolución de éster
terc-butílico del ácido
3{(2S-cis)-[5-benciloxicarbonilamino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil)-amino]}-5-fluoro-4-oxo-pentanoico
(0,063 g, 0,111 mmol) en cloruro de metileno (1,0 ml) se le añadió
anisol (0,5 ml), seguido de ácido trifluoroacético (1,0 ml). Después
de agitar a temperatura ambiente bajo nitrógeno durante 2 horas, la
mezcla de reacción se diluyó con cloruro de metileno y se evaporó,
luego se enjuagó dos veces con cloruro de metileno. El residuo bruto
se trituró con éter etílico para producir 0,030 g del producto del
título como un sólido blanco; p.f. 106-107ºC (dec).
TLC (cloruro de metileno-metanol-ácido acético,
32:1:1) Rf=0,3. ^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}):
\delta 7,61 (m, 1H), 7,32 (s, 5H), 7, 1 (d, J = 4 Hz, 1H), 7,03
(d, J = 4 Hz, 2H), 6,17 (m, 1H), 5,22 (m, 1H), 5,10 (s, 2H),
4,75-4,70 (m, 2H), 4,32 (m, 1H), 3,5 (m, 1H),
3,31-3,15 (m, 2H), 3,03 (m, 1H), 2,93 (m, 1H), 2,69
(m, 1H), 2,36 (m, 1H), 2,12 (m, 1H). Espectro de masas: m/z 512
(M+H).
A una disolución de ácido
(2S-cis)-5-benciloxicarbonilamino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carboxílico
(0,302 g, 0,797 mmol) en cloruro de metileno (5,5 ml), agitando a
0ºC bajo nitrógeno, se le añadió hidrato de
1-hidroxibenzotriazol (0,146 g, 0,96 mmol) e
hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(0,230 g, 1,2 mmol). Después de 15 minutos, se añadió ácido
aspártico, \alpha-metilo, hidrocloruro de diéster
\beta-terc-butílico (0,191 g,
0,797 mmol) seguido de N-metilmorfolina (0,13 ml,
1,2 mmol) y la mezcla se dejó alcanzar temperatura ambiente dentro
de 1 hora. Después de agitar durante toda la noche, la mezcla de
reacción se diluyó con acetato de etilo y se lavó sucesivamente con
disoluciones al 5% de bisulfato de potasio y cloruro de sodio
saturado; se secó (sulfato de sodio) y se evaporó hasta secarse. La
purificación del producto bruto por cromatografía flash sobre gel de
sílice (gel de sílice marca S/P 60\ring{A}, malla
230-400 ASTM), eluyendo con acetato de
etilo-hexano (1:1), produjo 0,350 g (78%) de ácido
N-[(2S-cis)-[5-benciloxi-carbonilamino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil]aspártico,
\alpha-metilo, diéster
\beta-terc-butílico como un sólido
blanco. TLC (cloruro de metileno-metanol, 9:1)
R_{f}=0,8. p.f.
147-148ºC(dec.).^{1}H-RMN
(300 MHz, CDCl_{3}): \delta 7,48 (d, J=7,5 Hz, 1H),
7,34-7,29 (m, 5H), 7,07 (m, 1H),
7,03-6,96 (m, 2H), 6,15 (d, J=5,7 Hz, 1H), 5,28 (d,
J=7,8 Hz 1H), 5,11 (s, 2H), 4,72 (m, 1H), 4,32 (m, 1H), 3,74 (s,
3H), 3,49 (d, J=16,5 Hz, 1H), 3,31-3,20 (m, 2H),
3,05 (m, 1H), 2,72 (ABX, dd, J=4,65, 15, 64,5 Hz, 2H), 2,43 (m, 1H),
2,15 (m, 1H), 1,30 (s, 9H).
A una disolución del producto anterior (0,330 g,
0,585 mmol) en 1,4-dioxano (4,5 ml) y agua (1,5 ml)
se le añadió hidróxido de litio acuoso 1M (0,7 ml, 0,702 mmol) y la
mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente bajo nitrógeno
durante 30 minutos. La mezcla de reacción se acidificó hasta pH 3
con una disolución de HCl 0,1N, luego se dividió entre acetato de
etilo y disolución saturada de cloruro de sodio. La capa acuosa se
extrajo dos veces con acetato de etilo, y las capas orgánicas
combinadas se secaron (sulfato de sodio) y evaporaron para producir
0,275 g (85%) de ácido
N-[(2S-cis)-[5-benciloxicarbonilamino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil]]aspártico,
éster \beta-terc-butílico como una
espuma blanca. TLC (cloruro de metileno-metanol,
9:1): R_{f}=0,25. ^{1}H-RMN (300 MHz,
CDCl_{3}): \delta 7,57 (d, J=7,8 Hz, 1H),
d7,35-7,29 (m, 5H), 7,08 (m, 1H),
7,03-6,98 (m, 2H), 6,24 (d, J=6 Hz, 1H), 5,28 (d,
J=5,1 Hz 1H), 5,11 (s, 2H), 4,73 (m, 1H), 4,35 (m, 1H), 3,48 (d,
J=16,8 Hz, 1H), 3,36-3,20 (m, 2H), 3,07 (m, 1H),
2,76 (ABX, dd, J=4,8, 18, 66 Hz, 2H), 2,40 (m, 1H), 2,19 (m, 1H),
1,33 (s, 9H).
A una disolución del producto anterior (0,262 g,
0,475 mmol) en tetrahidrofurano (3,0 ml), agitando a -10ºC bajo
nitrógeno, se le añadió N-metilmorfolina (0,114 ml,
1,05 mmol) seguida de la adición gota a gota de isobutil
cloroformato (0,107 ml, 0,81 mmol). Después de 40 minutos, la mezcla
de reacción se filtró, las sales se lavaron con THF seco y el
filtrado se enfrió hasta 0ºC. Esto se trató con una disolución
etérea recién preparada de diazometano (exceso). Después de agitar
la mezcla a 0ºC durante 30 minutos, se añadió gota a gota una mezcla
de ácido bromhídrico (48% en peso, disolución acuosa)/ácido acético
(1,3 ml, 1/1). Después de agitar durante otros 10 minutos, la mezcla
de reacción se diluyó con acetato de etilo, luego se lavó
sucesivamente con disoluciones de bicarbonato de sodio saturado y
cloruro de sodio saturado; se secó (sulfato de sodio) y se evaporó
hasta secarse. La purificación del producto bruto por cromatografía
flash sobre gel de sílice (gel de sílice marca S/P 60\ring{A},
malla 230-400 ASTM), eluyendo con acetato de
etilo-hexano (1:1), produjo 0,200 g (67%) del
compuesto del título como una espuma blanca. TLC (acetato de
etilo-hexano, 1:1): R_{f}=0,7.
^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}): \delta 7,71 (d,
J=9 Hz, 1H), d7,35-7,30 (m, 5H), 7,09 (m, 1H),
7,04-7,02 (m, 2H), 6,1 (d, J=5,4 Hz, 1H), 5,28 (d,
J=7,2 Hz 1H), 5,12 (s, 2H), 4,89 (dd, J=4,5, 15 Hz 1H), 4,35 (m,
1H), 4,16 (s, 2H), 3,50-3,21(m, 3H), 3,06 (m,
1H), 2,76 (ABX, dd, J=4,65, 18, 103 Hz, 2H), 2,37 (m, 1H), 2,15 (m,
1H), 1,27 (s, 9H). Espectro de masas: m/z 626/628
(M-H).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución de ácido
3-[(2S-cis)-[5-benciloxicarbonilamino-1,2,3,4,5,5,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil]amino]-5-bromo-4-oxo-pentanoico,
éster terc-butílico (0,069 g, 0,110 mmol) en
N,N-dimetilformamida (1,0 ml) se le añadió fluoruro
de potasio (0,029 g, 0,495 mmol), seguido de ácido difenilfosfínico
(0,029 g, 0,139 mmol). Después de agitar a temperatura ambiente bajo
nitrógeno durante 48 horas, la mezcla de reacción se diluyó con
acetato de etilo, luego se lavó sucesivamente con disolución de
bicarbonato de sodio diluida y luego con agua; se secó (sulfato de
sodio) y se evaporó hasta secarse. La purificación del producto
bruto por cromatografía flash sobre gel de sílice (gel de sílice
marca S/P 60\ring{A}, malla 230-400 ASTM),
eluyendo con acetato de etilo-hexano (1:1), produjo
0,048 g (59%) del compuesto del título como un aceite claro. TLC
(acetato de etilo-hexano, 2:1): R_{f}=0,3.
^{1}H-RMN (300 MHz, CDCl_{3}): \delta
7,89-7,80 (m, 4H), 7,52-7,30 (m,
11H), 7,06 (m, 1H), 7,01-6,96 (m, 2H), 6,45 (m, 1H),
5,21 (m, 1H), 5,13 (s, 2H), 4,96 (dd, J=8,3, 18 Hz, 1H),
4,78-4,70 (m, 2H), 4,35 (m, 1H),
3,35-3,23 (m, 3H), 3,05 (m, 1H), 2,76 (ABX, dd,
J=4,65, 18, 103 Hz, 2H), 2,43(m, 1H), 2,18 (m, 1H), 1,33 (s,
9H).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A una disolución de ácido
3-[(2S-cis)-[5-benciloxicarbonilamino-1,2,3,4,5,6,7-hexahidro-4-oxoazepino[3,2,1-hi]indol-2-carbonil]amino]-5-(difenilfosfinil)oxi-4-oxo-pentanoico,
éster terc-butílico (0,040 g, 0,054 mmol) en
cloruro de metileno (1,0 ml) se le añadió anisol (0,5 ml), seguido
de ácido trifluoroacético (1,0 ml). Después de agitar a temperatura
ambiente bajo nitrógeno durante 30 minutos, la mezcla de reacción se
diluyó con cloruro de metileno y se evaporó, luego se azeotropó dos
veces con cloruro de metileno. El residuo bruto se trituró con éter
etílico para producir 0,030 g del producto del título como un sólido
blanco; p.f. 109-111ºC (dec). TLC (cloruro de
metileno-metanol, 9:1): R_{f}=0,4.
^{1}H-RMN (300 Mhz, CDCl_{3}): \delta
7,87-7,66 (m, 4H), 7,60-7,28 (m,
11H), 7,05-6,95 (m, 3H), 6,84 (m, 1H),
5,12(s, 2H), 5,05 (m, 1H), 4,58 (m, 1H),
4,42-4,15 (m, 4H), 3,35-3,10 (m,
4H), 3,05 (m, 1H), 2,76 (m, 1H), 2,56 (m, 1H), 2,37(m, 1H),
2,13 (m, 1H), 1,93 (bs, 1H). Espectro de masas: m/z 710 (M+H).
Se extrajo sangre completa anticoagulada con
ácido, citrato y dextrosa (ACD) con una relación de 1:5 ACD a sangre
(\sim100 ml).
Usando recipientes plásticos de polipropileno, se
aíslan los neutrófilos de la siguiente manera:
se añaden 30 ml de sangre completa a tubos
centrífugos de polipropileno de 50 ml, que contienen 15 ml de 6%
dextrano (en disolución salina). Se deja sedimentar la sangre
durante aproximadamente 1 hora a temperatura ambiente.
La capa turbia festucina se recoge de la parte
superior de los cilindros en tubos cónicos de polipropileno de 50
ml. Las células sanguíneas se sedimentan por centrifugación a 240 xg
(centrifugador Sorvall a 1200 rpm) durante 12 min. a 4ºC con el
freno en el ajuste bajo.
El sobrenadante se aspira y el sedimento
combinado se resuspende en 40-50 ml de PBS frío (sin
Ca, Mg), y se centrifuga a 240 xg (centrifugador Sorvall a 1200 rpm)
durante 6 min. a 4ºC con el freno en el ajuste alto.
El sobrenadante se aspira y el sedimento se
resuspende en 12 ml de agua fría especial para cultivos celulares.
La suspensión se tituló moderadamente con una pipeta durante 30
segundos, luego se añaden 4 ml de KCl 0,6 M frío. (Llevado hasta 50
ml con PBS frío (sin Ca, Mg)) y luego se centrifuga a 300xg
(centrifugador Sorvall a 1400 rpm) durante 6 min. a 4ºC con el freno
en el ajuste alto.
Lo anterior se repite una vez.
El sobrenadante se aspiró y las células se
resuspendieron en 2,5 ml de PBS frío (sin Ca, Mg). La suspensión
celular se estratificó en 3 ml de Ficoll-Hypaque en
un tubo de polipropileno cónico de 15 ml y se centrifugó a 400 xg
(centrifugador Sorvall a 1900 rpm) durante 30 min. a 4ºC con el
freno en el ajuste bajo.
La suspensión aspirada bajó hacia el sedimento de
neutrófilos. El sedimento se resuspendió en PBS frío (sin Ca, Mg) y
se transfirió a un tubo cónico de 50 ml, se llevó hasta 50 ml con
PBS frío (sin Ca, Mg) y se centrifugó a 300 xg (centrifugador
Sorvall a 1400 rpm) durante 6 min. a 4ºC con el freno en el ajuste
alto.
Se aspiró el sobrenadante y el sedimento se
resuspendió en 50 ml de PBS frío (sin Ca, Mg) y se centrifugó a 300
xg (centrifugador Sorvall a 1400 rpm) durante 6 min. a 4ºC con el
freno en el ajuste alto.
Se aspiró el sobrenadante y el sedimento de
neutrófilos se resuspendió en 4,0 ml de PBS frío (sin Ca, Mg) sobre
hielo. Se diluyeron 10 ml de la suspensión de neutrófilos con 990 ml
de Azul Trypan (1:100) y las células se contaron usando un
hemacitómetro. Se determinaron la cantidad y viabilidad de las
células.
El medio de cultivo fue el siguiente:
(RPMI 1640; 10% FBS; Hepes 10 mM;
L-glutamina 0,2 mM; 25 U/ml penicilina; y 25 mg/ml
estreptomicina)
El mantenimiento de los neutrófilos purificados
se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: (5 x 10^{6}
células/ml en el medio de cultivo anteriormente mencionado; placas
de poliestireno de 96 pocillos con fondo redondo; 250 ml/pocillo; y
37ºC, 5% CO_{2}/95% incubadora con humidificador de aire) (Liles
et al., Blood 119 (1995) 3181-3188).
Disolución hipotónica de fluorocromo
(50 mg/ml de yoduro de propidio (catálogo Sigma
#P4170); 0,1% Triton X-100; y 0,1% citrato de
sodio).
Los neutrófilos se sedimentaron a 4ºC y se aspiró
el sobrenadante.
Los neutrófilos se resuspendieron en disolución
hipotónica de fluorocromo a una densidad de 5 x 10^{6} células/ml.
Se evaluó la fluorescencia del yoduro de propidio de los núcleos
individuales en FL2 y se midió en una escala logarítmica,
controlando los parámetros físicos en dispersión hacia adelante y
lateral para excluir residuos celulares.
Se recogieron por lo menos 10.000 eventos por
muestra, y los resultados se evaluaron en relación con una población
de neutrófilos no apoptóticos (Liles et al., Blood 119 (1995)
3181-3188).
Se extrajo sangre completa anticoagulada con
ácido, citrato y dextrosa (ACD) en una relación de 1:5 ACD a sangre
(150 ml).
Los neutrófilos se aislaron tal como se describió
anteriormente.
Se preparó zymosan opsonizado suspendiendo 125 mg
de partículas de zymosan en 25 ml de suero humano combinado(5
mg/ml) e incubando durante 20 minutos a 37ºC. Se centrifugó la
suspensión y se resuspendieron las partículas en 7 ml de PBS (18
mg/ml) y se almacenaron en hielo hasta su uso (vórtex antes de
pipetar).
Se prepararon 50 ml de una disolución 250 mM de
Lucigenin (MW 510,5) disolviendo 6,4 mg del sólido en 50 ml de
PBS-G (+ Ca, Mg). 10 ml de PBS-G (+
Ca, Mg) a los pocillos en una placa blanca de 96 pocillos.
Se añadieron 50 ml de la disolución 250 mM de
Lucigenin a los pocillos en una placa blanca de 96 pocillos.
Las preparaciones celulares se obtuvieron a
partir de cultivo celular (concentración en tiempo cero = 5,0 x
10^{6} células/ml) con PBS-G (+ Ca, Mg).
Se suspendieron 20 ml de la suspensión de
neutrófilos en los pocillos apropiados y la placa se incubó a 37ºC
durante tres minutos. Se añadieron 10 ml del zymosan opsonizado a
los pocillos.
Se leyó la placa en un luminómetro (Labsystems
Luminoskan, Needham Heights, MA) durante 14 min. a 37ºC en el modo
cinético y los resultados se registraron usando el programa
DeltaSoft.
Se utilizaron los siguientes reactivos:
anticuerpo monoclonal
anti-CD32-FITC obtenido de
Pharmingen.
Disolución lisante (10X Stock: 89,9 g NH4Cl;
10,0 g KHCO;
0,37 g EDTA tetrasódico;
se disuelve en 1 litro de dH_{2}O. Se ajusta
hasta pH 7,3. Se almacena a 4ºC en una botella bien cerrada.
Se diluye 1:10 con dH_{2}O antes del uso).
(DPBS sin calcio ni magnesio obtenido de Irivine
Scientific.
2% suero bovino fetal en DPBS almacenado a
4ºC.
50 mg/ml yoduro de propidio en DPBS estéril
filtrado y almacenado a 4ºC).
Se siguió el siguiente protocolo:
muestra de sangre de 200 ml/2,8 ml 1X disolución
de lisis en un tubo cónico de polipropileno de 15 ml. Se tapa e
invierte para mezclar.
Se deja a temperatura ambiente durante
3-5 minutos.
Se centrifuga en un aparato Sorvall a 1200 rpm
durante 5 minutos a 4ºC.
Se aspira el sobrenadante. Se resuspende el
sedimento en 200 ml/muestra 2% FBS/DPBS. Se añaden 20 ml/muestra
anti-CD32-FITC. Se incuba durante 30
minutos en hielo en la oscuridad.
Se añaden 5 ml/muestra DPBS. Se centrifuga a 1000
rpm durante 5 minutos a 4ºC. Se aspira el sobrenadante. Se
resuspende el sedimento en 1 ml/muestra 2% FBS/DPBS. Se añaden 3
ml/muestra 95% EtOH enfriado con hielo gota a gota mientras se agita
en vórtex moderadamente.
Se incuban las muestras en hielo en la oscuridad
durante 30 minutos. Se centrifuga a 1000 rpm durante 5 minutos a
4ºC.
Se resuspende cada muestra en 50 \mul 5 mg/ml
RN'asa. Se transfiere la muestra a 900 ml/muestra 50 mg/ml yoduro
de propidio en tubos de poliestireno Falcon 12 x 75 mm. Se incuba en
hielo durante 30 minutos. Se analizan las muestras por citometría de
flujo (láser argón) para fluorescencia y dispersión hacia adelante y
lateral.
La presente invención provee métodos para
aumentar la supervivencia ex vivo de
neutrófilos/granulocitos. Para establecer la capacidad de los
compuestos para conservar los granulocitos en cultivo, los
compuestos se probaron en una cantidad de ensayos in vitro.
Un modelo común a probar para efectos sobre la supervivencia de
granulocitos consiste en separar los granulocitos de sangre completa
fresca, cultivar las células a 37ºC y probar las células para su
naturaleza hipodiploide nuclear en intervalos de 24 horas (como se
describió en el Ejemplo 110). La presencia de ADN hipodiploide es
una medida de apoptosis y se determina usando una mancha de yoduro
de propidio vía citometría de flujo. Los compuesto de la presente
invención se incubaron con los granulocitos en cultivo, se midieron
sus efectos sobre la supervivencia de los granulocitos y se calculó
un IC_{50}. En la Figura 6, el inhibidor de caspasa zVADfmk,
preparado tal como se describe en Tetrahedron Letter, 35
9693-9696 (1994), tuvo un efecto débil sobre el
aumento de la supervivencia de los granulocitos a las 48 horas,
mientras que el ejemplo 106 de la presente invención tuvo un
IC_{50} < 5 mM y, por lo tanto, es un inhibidor potente de la
muerte de los granulocitos.
La aféresis (leucoféresis) de donantes de sangre
se puede realizar para obtener una población de células enriquecida
en granulocitos. Estas células se transfunden luego a un receptor
que necesita granulocitos adicionales. Este producto de aféresis
tiene una vida útil corta, y los estándares actuales (American
Association of Blood Banks, Standard for Blood Banks and Transfusion
Services, Ed. 17, 1996) exigen la conservación a
20-24ºC durante un máximo de 24 horas. Se recomienda
que la transfusión tenga lugar dentro de las 6 horas, en la medida
de lo posible.
Los compuestos ilustrativos tal como se describe
en la presente invención se pueden utilizar para prolongar el tiempo
de conservación de los productos de aféresis. Para uso en el
escenario de la aféresis, el compuesto se puede formular en un
disolvente compatible, como dimetil sulfóxido (DMSO). El compuesto
se puede almacenar en un vial y pre-añadirse a la
bolsa de aféresis o inyectarse a la línea de aféresis de un donante
durante el procedimiento de extracción. El compuesto de
concentración final eficaz podría estar en el intervalo de
1-25 \muM. El producto de leucoféresis, que
contiene el inhibidor de ICE/ced-3, se infunde luego
al receptor después de la conservación. Pueden ser posibles muchas
condiciones de conservación, por ejemplo, la conservación puede ser
a temperatura ambiente durante un máximo de una semana después de la
extracción.
Con el fin de demostrar la utilidad para acelerar
la reconstitución de células hematopoyéticas, los compuestos se
probaron en varios modelos animales. Un modelo común para destruir
las células hematopoyéticas consiste en irradiación letal o
sub-letal de ratones, en la que los ratones están
expuestos a rayos X, usualmente generados a partir de una fuente de
^{137}Cesio. En el caso de la irradiación
sub-letal, se pueden determinar distintos criterios
de valoración que miden la hematopoyesis en diferentes momentos
posteriores a la irradiación, con el fin de vigilar la recuperación.
Los compuestos de la presente invención se administran a animales
después de la irradiación sub-letal y se miden sus
efectos sobre la recuperación. Los criterios de valoración pueden
incluir: cifra de leucocitos, hematocritos, incorporación de
timidina tritiada al ADN de médula ósea, peso del bazo, cantidad de
unidades formadoras de colonias eritroides o cantidad de unidades
formadoras de colonias (linajes formadores de eritroides,
granulocitos/macrófagos y megacariocitos) del bazo o la médula ósea
del húmero o fémur. En algunos casos, los animales se pueden también
mielosuprimir por inyección de agentes quimioterapéuticos, como
carboplatino. Los compuestos que han sido eficaces en estos modelos,
si bien actúan vía mecanismos diferentes, incluyen trombopoyetina,
Photofrin, hemo, interleucina 1 y tetraclorodecaóxido, entre
otros.
Los modelos de irradiación letal también se
pueden utilizar para probar la eficacia, aunque estos modelos en
general incluyen trasplante de médula ósea para rescatar a los
animales. Estos experimentos en general se realizan en ratones,
aunque no exclusivamente. Para trasplantes singeneicos, se puede
medir entonces el tiempo para el injerto, usando los mismos
criterios de valoración ya mencionados. Los injertos de células
progenitoras humanas también se puede medir usando ratones
SCID-hu como los receptores con métodos similares a
los ya mencionados, después de establecer primero el origen humano
de las células hematopoyéticas. En estos caso, los compuestos de la
presente invención se administran a animales receptores al momento
del trasplante de la médula ósea. Las células de la médula ósea
también se pueden tratar con compuestos inhibidores de la familia
ICE/CED-3 antes del trasplante.
Claims (7)
1. Un método para expandir o aumentar la
supervivencia de una población celular humana, que comprende poner
en contacto las células, ex vivo, con una cantidad inhibidora
eficaz de un inhibidor de proteasa que suprime la actividad de por
lo menos un miembro de la familia de la enzima convertidora de la
interleucina 1\beta (ICE)/CED-3, inhibiendo la
apoptosis en la población celular, expandiendo o aumentando de este
modo la supervivencia de la población celular, en el que el
inhibidor de proteasa es un compuesto de fórmula 3:
en la
que:
n es 1 ó 2;
m es 1 ó 2;
A es R^{2}CO-,
R^{3}-O-CO- o
R^{4}SO_{2}-;
un grupo de la fórmula:
en la
que:
R^{1} es un átomo de hidrógeno, alquilo o
fenilalquilo;
R^{2} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilalquilo, fenilo
sustituido, (fenilo sustituido)alquilo, heteroarilo o
(heteroaril)alquilo;
R^{3} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilalquilo o (fenilo
sustituido)alquilo;
R^{4} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilalquilo, fenilo
sustituido, (fenilo sustituido)alquilo, heteroarilo o
(heteroaril)alquilo;
R^{5} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilalquilo, fenilo
sustituido, (fenilo sustituido)alquilo, heteroarilo o
(heteroaril)alquilo;
R^{6} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilalquilo o (fenilo
sustituido)alquilo;
R^{7} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilalquilo; fenilo
sustituido, (fenilo sustituido)alquilo, heteroarilo o
(heteroaril)alquilo;
R^{8} es una cadena lateral de aminoácidos
seleccionada entre el grupo que consiste en aminoácidos naturales y
sintéticos;
B es un átomo de hidrógeno, un átomo de deuterio,
alquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, fenilo,
fenilalquilo, fenilo sustituido, (fenilo sustituido)alquilo,
heteroarilo, (heteroaril)alquilo o halometilo;
un grupo de la fórmula:
-CH_{2}XR^{9};
en la que R^{9} es fenilo, fenilo
sustituido, fenilalquilo, (fenilo sustituido)alquilo,
heteroarilo o (heteroaril)alquilo; y X es un átomo de oxígeno
o un átomo de
azufre;
un grupo de la fórmula:
-CH_{2}-O-CO-(arilo);
un grupo de la
fórmula:
-CH_{2}-
O-CO-(heteroarilo);
un grupo de la
fórmula:
-CH_{2}-O-PO(R^{10})R^{11}
en la que R^{10} y R^{11} se
seleccionan independientemente entre un grupo que consiste en
alquilo, cicloalquilo, fenilo, fenilo sustituido, fenilalquilo y
(fenilo sustituido) alquilo; y sus sales farmacéuticamente
aceptables.
2. Un método para aumentar la bioproducción in
vitro,que comprende poner en contacto células hospedantes que
producen un producto de interés con un inhibidor de proteasa que
suprime la actividad de por lo menos un miembro de la familia
ICE/CED-3, aumentando así la supervivencia de las
células in vitro, en el que el inhibidor de proteasa es un
compuesto de fórmula 3:
en la
que:
n es 1 ó 2;
m es 1 ó 2;
A es R^{2}CO-,
R^{3}-O-CO- o
R^{4}SO_{2}-;
un grupo de la fórmula:
en la
que:
R^{1} es un átomo de hidrógeno, alquilo o
fenilalquilo;
R^{2} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilalquilo, fenilo
sustituido, (fenilo sustituido)alquilo, heteroarilo o
(heteroaril)alquilo;
R^{3} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilalquilo o (fenilo
sustituido)alquilo;
R^{4} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilalquilo, fenilo
sustituido, (fenilo sustituido)alquilo, heteroarilo o
(heteroaril)alquilo;
R^{5} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilalquilo, fenilo
sustituido, (fenilo sustituido)alquilo, heteroarilo o
(heteroaril)alquilo;
R^{6} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilalquilo o (fenilo
sustituido)alquilo;
R^{7} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilalquilo; fenilo
sustituido, (fenilo sustituido)alquilo, heteroarilo o
(heteroaril)alquilo;
R^{8} es una cadena lateral de aminoácidos
seleccionada entre el grupo que consiste en aminoácidos naturales y
sintéticos;
B es un átomo de hidrógeno, un átomo de deuterio,
alquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, fenilo,
fenilalquilo, fenilo sustituido, (fenilo sustituido)alquilo,
heteroarilo, (heteroaril)alquilo o halometilo;
un grupo de la fórmula:
-CH_{2}XR^{9};
en la que R^{9} es fenilo, fenilo
sustituido, fenilalquilo, (fenilo sustituido)alquilo,
heteroarilo o (heteroaril)alquilo; y X es un átomo de oxígeno
o azufre; un grupo de la
fórmula:
-CH_{2}-O-CO-(arilo);
un grupo de la
fórmula:
CH_{2}-O-CO-(heteroarilo);
un grupo de la
fórmula:
-CH_{2}-O-PO(R^{10})R^{11}
\newpage
en la que R^{10} y R^{11} se
seleccionan independientemente entre un grupo que consiste en
alquilo, cicloalquilo, fenilo, fenilo sustituido, fenilalquilo y
(fenilo sustituido) alquilo; y sus sales farmacéuticamente
aceptables.
3. Un inhibidor de proteasa que suprime la
actividad de por lo menos un miembro de la familia de la enzima
convertidora de la interleucina 1\beta (ICE)/CED-3
para uso en un método para expandir o aumentar la supervivencia de
una población celular humana, que comprende poner en contacto las
células con una cantidad inhibidora eficaz del inhibidor de proteasa
que inhibe la apoptosis en la población celular, expandiendo o
aumentando de este modo la supervivencia de la población celular, en
el que el inhibidor de proteasa es un compuesto de fórmula 3:
n es 1 ó
2;
m es 1 ó 2;
A es R^{2}CO-,
R^{3}-O-CO- o
R^{4}SO_{2}-;
un grupo de la fórmula:
en la
que:
R^{1} es un átomo de hidrógeno, alquilo o
fenilalquilo;
R^{2} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilalquilo, fenilo
sustituido, (fenilo sustituido)alquilo, heteroarilo o
(heteroaril)alquilo;
R^{3} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilalquilo o (fenilo
sustituido)alquilo;
R^{4} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilalquilo, fenilo
sustituido, (fenilo sustituido)alquilo, heteroarilo o
(heteroaril)alquilo;
R^{5} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilalquilo, fenilo
sustituido, (fenilo sustituido)alquilo, heteroarilo o
(heteroaril)alquilo;
R^{6} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilalquilo o (fenilo
sustituido)alquilo;
R^{7} es alquilo, cicloalquilo,
(cicloalquil)alquilo, fenilo, fenilalquilo, fenilo
sustituido, (fenilo sustituido)alquilo, heteroarilo o
(heteroaril)alquilo;
R^{8} es una cadena latera de aminoácido
seleccionada entre el grupo que consiste en aminoácidos naturales y
sintéticos;
B es un átomo de hidrógeno, un átomo de deuterio,
alquilo, cicloalquilo, (cicloalquil)alquilo, fenilo,
fenilalquilo, fenilo sustituido, (fenilo sustituido)alquilo,
heteroarilo, (heteroaril)alquilo o halometilo; un grupo de la
fórmula:
-CH_{2}XR^{9};
en la que R^{9} es fenilo, fenilo
sustituido, fenilalquilo, (fenilo sustituido)alquilo,
heteroarilo o (heteroaril)alquilo; y X es un átomo de oxígeno
o azufre; un grupo de la
fórmula:
-CH_{2}-O-CO-(arilo);
un grupo de la
fórmula:
-CH_{2}-O-CO-(heteroarilo);
un grupo de la
fórmula:
-CH_{2}-O-PO(R^{10})R^{11}
en la que R^{10} y R^{11} se
seleccionan independientemente entre un grupo que consiste en
alquilo, cicloalquilo, fenilo, fenilo sustituido, fenilalquilo y
(fenilo sustituido) alquilo; y sus sales farmacéuticamente
aceptables.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o
el inhibidor de proteasa de acuerdo con la reivindicación 3, en el
que las células son células diferenciadas.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o
el inhibidor de proteasa de acuerdo con la reivindicación 3, en el
que las células son células precursoras.
6. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o
el inhibidor de acuerdo con la reivindicación 3, en el que las
células se seleccionan entre el grupo que consiste en granulocitos,
monocitos, eritrocitos, linfocitos y plaquetas.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o
el inhibidor de proteasa de acuerdo con la reivindicación 3, en el
que el método además comprende poner en contacto las células con un
factor de crecimiento.
Applications Claiming Priority (6)
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