PT105330A - Proteína antimicrobiana - Google Patents

Abstract

OS INVENTORES PROPORCIONAM UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM POLIPÉPTIDO ANTIMICROBIANO COMPREENDENDO BLAD OU UMA SUA VARIANTE ACTIVA PARA UTILIZAÇÃO NUM MÉTODO DE TRATAMENTO DO CORPO HUMANO OU ANIMAL POR TERAPIA OU PROFILAXIA, TAL COMO PARA UTILIZAÇÃO NUM MÉTODO DE TRATAMENTO OU PREVENÇÃO DE UMA INFECÇÃO NUM, OU DE UM, INDIVÍDUO POR UM MICROORGANISMO. É IGUALMENTE PROPORCIONADA A UTILIZAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO UM POLIPÉPTIDO ANTIMICROBIANO COMPREENDENDO BLAD OU UMA SUA VARIANTE ACTIVA PARA MATAR, OU INIBIR O CRESCIMENTO DE, UM MICROORGANISMO QUE É PATOGÉNICO PARA UM SER HUMANO OU UM ANIMAL NUM LOCAL QUE NÃO É NO, OU DO, CORPO HUMANO OU ANIMAL.

Description

1 dESCRlÇlo antimicrobiana"

Campo; da íhvçnold .11. .invênçid: relere-se: ao çampO: dos agentea antimicrQhiahop, i espeçialmente ao doa que têm como alvo pat ogê nio® humano® /anima,i® .,

Introdução 1 r & eçgea bantarlanal :â,s feaodáúêaa: eMb* de longe*· os agentes eti©lógicos mai® comuns de ínfódção: humana., Mai s de um terço da população mund:i,a:| esti.. provavelmente infectada por patogenias bacfcerianos, e Ocorrem dói® milhões de fatiai, idades por ano devidas a infaoçõe®: bectetida&d,: De acordo com: o Centre: for Disease COntrOl ÍCDC) e a World Seal th Organ i zat í on (WHO} ,r as iiífecçoes biaetariara®: qui se seguem estio incluídas, na listagem das doenças infeooiosas actxialmente mai a comuns em todo o mundo: Cólera: esta ê Uma doença que se transmite principalmente através de água de beber contaminada e defi.cientes condições sanitárias. É endémica, no· subcontinente Indiano, na Rússia*:: e na África subsariana, Ê. uma infecção aguda do intestino com a bactéria Vibrio cholerae. 0 sintoma principal ê uma diarreia profusa. Entre: 5% o 10% das pessoas infectadas com a doença irão desenvolver sintomas graves, que: incluem vómitos e Cãibras nas pernas. Ma sua forma grave, a cólera pode causar a morte: por desidratação... São reportados anualmente à WHO 200 000 casos estimados.

Meningite: frequentemente conhecida como meningite espinhal, esta c uma infecção da medula espinhal. É usualmente o resultado de uma infecção virai ou bacteriana. Ã meningite: bacteriana 6 ma is grave do que a mfâhinglte: viril e podo causar danos cerebrai s, per da. de audição: ç dificuldades: de

aprendizagem., podé ser causada.,. por dxempio,· por Raumçphijys in:flueh.oae: tipo: b, Meiasaria msnihgit.idfs ou st.repidodddu:S pneumonias. Ocorrem anualmente 1,2 milhões de casos estimados de meningite baoceríuna, ma is de um décimo deles fatais.. Os sintomas incluem eefaleia grave, febre, náuseas, vómitos, letargia, delírio, fotofobia e uma rigidez do pescoço.

Pneumonia;: esta tem muitas causas possíveis, mas usual mente é uma infecção bacteriana por Streptococcus ou Mycoplasma. Estas bactérias podem viver no corpo humano sem causar infecção durante anos, e apenas se declararem quando outra doença baixou a imunidade ã doença . G 5'trept.ococcus pneumonias causa pneumonia; pneumocóci. ca, o tipo ma is comum, que é ma is grave do que a pneumonia por My'copiasma. O S. pneumonias é responsável por mais de 100 000 hospitalizações devidas a pneumonia anualmente, assim como por 6 milhões de casos de ocite média e mais de |0 000 casos de doenças ínvâsivâs como a meningite,

Shigellose: esta infecção causa 600 000 mortes estimadas mundial mente em çâda ano. Ê mais comum em países em desenvolvimento cçm fracab: condições sanitárias. As bactérias Shigella causara disenteria; bacilar, ou shigellose. Os sintomas incluem diarreia Com sangue nas fezes, vómitos e dor abdominal

Faríngite: Estrepr.oeócica: esta é causada por bactérias BPPSpiQpPOOuCc Ocorrem. todOS: OS. ancas vãríqS milhões de casos de faringite estreptoçóeiça.. Gs sintomas, incluem garganta infi:am®de> febre, dor dé cabeça, fadiga e náuseas.

Tuberculose:: esta cansa; quase 2; milhões cio mortes todos os anos,, e a WHO estima que perto de 1 milhar de milhões de pessoas estarão infectadas: entre 2©0Ó c 202 0 se nãó forem adopfudos. procedimentos: preventivos mais eficazes. As: bactérias da tuberculose: (τϋ íe.g. Mycobactcii urn t uberdUloçis}' são muito f requer; temer te encontradas nos pulmões, onde podem causar dor no peito e uma, tosse que trás expectoração com .sangue · Outros sintomas incluem fadiga,, perdia de peso, per d a d&: apetite, arrepias, febre e suores nocturnos..

Tifõide: a febre Çíióids é causada pela bactéria Malmmneàla typMit e causa :<tU0 000 mortes estimadas anualmente,; de 12-11 milhões de caaoa:,: Transmite-se usualmente atraria dos alimentos ou água· infectadoB. Os sintomas Incluem: uma febre súbita ê; mábtida, dor da cabeça: grave, náuseasper da de apetite grava:/ obstipação e por vetas diarreia. dg numeros precisos de casos são, contudo·difíceis de determinar:,: especial mente porque muitas destas: doenças sab endémicas a países em desenvolvimento, onde muiCas pessoas .não têm- acesso a cuidados médiçosi modernos. ivpr oximadsmense metade de todas ag: mortes causadas por doenças infecciogas anualmente podem ser1 arribuldas a: semende três doenças:; tu&eP cu los e, malária S #11¾. donjuntamente, estas doenças 'Cáusám mais de 300 milhões: de: doenças m mai:S: de 5 milhões de: mortas· m cada ano. A era moderna da ut/iliraçâo: de antibióticos: começou no sácuio âezainove &. início.· do século· vinte., com a. Identil;ioação do ingrediente sotivo: paníei.lína, produzido por Peníoálllum· natMtum·' que tinliá. uma potente actividade aptimibPóblahts* Coo tudo, antariormenta: a: IdSS,. a sua venda não era controlada e a sua utilltsçáo: excessiva e descone rolada. conduziu ã. emergência de: bactérias resistentes. A resistência aos antibióticos tornou-se um importante problema, e epidemias de infecções estarilocõaícas resistentes começaram: a emergir nos liOSpltai.S: & inicio do século vinte testemunhou também o desenvolvimento de. antibióticos tais como sul f onamida s, est reptomí cina, neomicina, cloranf eriícol, cef a 1 ospor inas e tet racic1inas. Mui tos destes compostos são ainda presentemente utilizados apesar de todos terem enfrentado o desafio do de serrvol vimento de resistência e alguns terem enfrentado problemas de toxicidade. Por exemplo, a estreptomíqina pode causar danos nos rins e surdez e o cloranfenicol pode causar sérios efeitos secundários (e.g. desordens sanguíneas: graves, incluindo anemia e leucemia)

Maís investigação decorreu durante: a década de 1960, que conduz ixi ao dc s e nvo 1 v i me n t o da segunda geração de antibióticos. Entre estes estava a meticílina, um derivado semi - sintético da penicilina produzido espec:i f í carnentc para ultrapassar o problema da resistência à penicilina. A meticílina foi saudada como um avanço importante na luta contra a resistência bacfceriana ã penicilina, mãS/ 4 infelismente, não foi esse o caso, e existem hoje bactérias que são resistentes à met íciiína. A ampíciiina i também um derivado da penicilina - Foi desenvolvida para alargar a gama de infecções que a penicilina podia tratar e ho je substituiu a penicil ina em grande, extensão. É frequentemente a primeira escolha no tratamento de toda uma gama de infecções., incluindo infecções do fcracto respiratório e urinário, A amoxieilina é outro derivado da penicilina amplamente utilizado. Como a amp.iciii.na, tem uma gama alargada de actividades. A genfamieiná está na mesma família de antibióticos que a estreptomicina ío fármaco antituberculoso descoberto em 1943) , Está geralmente reservada para infecções graves, uma vez que pode ter graves efeitos secundários tóxicos nos ouvidos e nos rins. P.ecenteraente, foi desenvolvida pelos 1 abor a t ór i os farmacêuticos uma nova família de antibióticos denominados quinolonas, também referidos como fluoroquinoionas. Para além dê; serem eficazes contra uma ampla gama de bactérias, estes antibióticos podem atingir uma elevada concen t.r a ção na corrente Sanguinea; quando tomados oralmente. Isto significa que muito ma is ínfeçções que outrora podiam requerer um internamento hospítaíar podem agora ser tratadas em casa. As fluoróquinoionas são: apenas utiiizadas em pacientes que; estão gpavemêntê; doentes a/çu. quando são· aecossiríos longos' tratamentos com anfibíótióps. (semanag: a meSieiSi ,

Apesar do d;e:S:euvoivÍment.o destaS compostos de segunda geração, a .incessante emergência de resistlneia.. continua a ser um problema..., Tipi caménf ea resistência· segne-se á ufeiiiração, e especiaimenie á ubilreação disseminába ou má utilização de um. f ármaco;, que; irá eventuaImante conducir à· suá; perda de eficácia para o tratamêhbo: de doença® .humanas. a: utilização continua de agentes anfimicrobíands aumenta a pressio' de; saieçção que; favorece; a; emergência , a multiplicação: a; disseminação de estirpes reslstentes, A atilíraolo inapropriada e: descontrolada de agentes antimiexObianos; contribui. para isto, incluindo: a sobre^preecríçâc,; á administração de doses; sub-óptimas, a duração insuficiente de tratamentos, os erros de diagnóstico que Conduzem. 1 escolha errada do fármaco, e a utilização (e, especificamente, sobre- utilizarão’) da produtos antibactériáhõs domésticos nos taras> as cotias, et. o* quase 30 ande a As razões para aé sa O: ciaras e sad a capacidade dasi morte dos aqent.es

Btii alguns^ casos, a resistência surge rapidamente ίφ.,·$* & resistência do Staphyloco-c&us auraus a oxalina desenvolveu^sê em apêuas alguns anos) , mas em outros pode demorar mais tempo |é.,gd o Entarococcus faeci uns demorou desenvolver resistência a vancomicina), diferenças nas molduras temporais não provavelmente muitifactoriais , Contudo, badtéllas para contornar a acção de antlmicrobianos impediu claramente a capacidade de tratar pacientes. individuais e controlar grandes surtos de doenças inieooiósas.. Por exemple, a WHQ estima que existem quase; meio milMd de novos casos de tuberculose multirreslsteiite (TB-MR) pôr ano, o que constitui cerca de: 5% de nove mi 1 liões de novos OasdiS de TB de todos OS tipos,

Algumas estirpes de 5 i: a phyl ococcus auraus resistente a metlcilina (MRSA) têm uma facilidade particular para transmissão nosocomial. Em algops: hospitais nos EUA, mais de 70% dos lo auraus isolados de pacientes são MRSA, e. estas estirpes são frequentemente resistentes a todos os fãrmaeos licenciados excepto a vancomicina, a linezolida, a daptomícina e a tigeciclina. Recentemente, estirpes de S. aureus c.omp 1 etament.e resistentes â vancomieina foram também i soladas de pacientes nos Estados tinidos complicando ainda mais á terapia., O MSEA: tornou- se altamente endémico em muitos hospitais, e uma voz introduzido num hospital, este organismo c muito difícil de erradicar.

Os problemas com a erradicação verificam-se igualmente para estirpes resistentes a vancomicina de E. fsm&Èim (VRE;|, que são frequentemente resistentes a todos os outros, fármacus clinicamente: aprovados, A resistência à vancomicina em enterococos c frequentemente mediada por plasmídeos e pode resultar de vários determinantes de resistência únicos. A combinação de resistência a penicilina © glicopéptidos em B. faecium causa infecções que não podem ser tratadas eficazmente. Felizmente, a maioria dos VRE causa colonização e hio infecçlo. Quando ocorre infeeção, esta pode não ser tratável com antibióticos. A resistência a quinolonas pode evoluir rapidamente, mesmo durante o decorrer de um tratamento.

Presentemente, algumas 'bactérias atingiram o estatuto de "súperbactérias", doma 0 StãpfotfX&pPPPttB aureus resistente a msticilina, os enterococas reaiaténtes^ a vancomicina, e BfcPeptQúocau& pneumpmíM resistente a quinolona. Para estes patogénios existem poutÓP ou nembuns antibióticos disponíveis para terapia. Mas, surpreender temente:, apenas: algumas poucas piasses de novos antibióticos foram introeiusidas nos últimos 4S anos, e todos· desde incluindo a combinação de est reptogramI nas; gu irupris t ir a/dál f opr istina (Svnercid) , a oxatoiiáinona llnUtólida, e o: .lipopéptidd daptornic.ina.

Existe uma bresberte nêbeSSrdáde: de novos antibióticos para tratar dtençaé: induzidas ptr: patogénios baoterí anos, parti cu iarmente devido a questllo da rêsistênuia antimicrobíaria. Cíomo· previamente mençiónâdo, o'..ritos patogénios estão a desenvolver resistência: a antibióticos potentes Utilizados para tratamento * :i alarmante o facto de a resistência fregúbUtemente USO estar restrita: a um único agente: mas poder envolver resistência a múltiplos antibíç ticos. Continue. actUSimente a. pesquisa de novos e ma is eficaz ee farmacos, espeiciaimente de an: ifoiót icos de espectro direocionado para contornai' os mecanismos de mu Itir resistência... O ritmo desta pesquisa, contudo, dimírruiu notaveimente, pois é lioje muito ma is dif icil para as companiiías farmacêuticas· Obter aprovação para novos fármacos. Em adiçao, os custos envolvidos o o desfasamento temporal entre: a identi£luãplO: de um novo antibiótico: no 'laboratório e á; aprovação para: o: produgir industrlslmerto são tão grandes que levaram algumas: companhias a abandonar· c ottrp 1 e t amente o mitoado,

Infecçôes fúngicas A incidência de iófeuçóes fúngioaiS: autpntou nas últimas tris: décadas: era consequência , em parte:/ dO: número acrescido de pacientes com: um Sistema.: imunitário di s f une i on a 1. Isto 6 um resultado directo: de: grandes avanços na mediciíia ern anos rio entes·,, psrbíoularmenbe; na terapia db canoro, resultando num número acreçoldó: de pacientes ÍmunOssUprimidQS. Várias outras razões foram propostas para ú aumento de infecções fúngicãs,: incluindo nutri pão par.en.teri cá e cateteres venosos centrais,: tratamento com antibióticos de largo espectro, gravidez, pacientes com diabetes descontrolada, beneficiários de transplante de órgãos sólidos, pacientes com SIDA., pacientes de cancro em qu imioterap i a. citotóxica, pacientes com queimaduras ou neutropenia e patologias ga s t ro intestinais.

As ma is graves das infecções fúngicas são as infecções fúngicas invasivas (IFI} (e. g. infecção da corrente sanguínea) que estão associadas a elevada mortalidade. As espécies de Candida são os ma is frequentes agentes causadores das IFI com uma taxa média, de mortalidade de 30%. & Candida aIbicans é responsável por cerca de 50% dos casos de infecçâo invasiva por Candida, ma s tem havido um incremento constante nas frequências relativas de espécies de CawãÀda que não a albicans, nomeadamenfce de Candida glabra ta, Candida. parapsilosis, Candida tropícalís e Candida krusei. As espécies de Aspergi1 laa slo os fungos invasivos mais vulgarmente isolados, com: ρredomínância da espécie Aspergi 11us fumigatus. Dáí como ao íafeopões: por Candida, a aspergilose invasiva está usualmente associada ço®. pacientes crlt iioamen te· doentes:, mas a Sus taxa de mortalidade e: múitb iSúperíbr apesar de dependente da inf.ecção .individual espeiclflça. icOnsiderada.: e. g. B5% ou maio para doençai disaieminada.. ou nc siistems nervoso central, e. 6 0% paria doença pui I mona r difusa: ... A prevaiência .e a taxa déi mortial idade das. IFI aumentaram ao longo das passadas três: décadas, ®:s dados nos EUA mostrara que em 3 980 este grupo de doenças^ ibi responsável por #ili mortes e foi a i.oa maio proeminente: causa de infecçâo fatiai:, 1® 1997, o ruosmo leOnlunio de dadciS mostrou que o número de; mortos: tinha aumentado para Í1:?Ô: é: para. a sétima mais: prevalecouté causa de iiifOiCiÇiiO^ terminal.. Dados recentes mostram que a Candida se: tornoú mais prevalecente do que a Epcherichia dõ.li e espécies de Wdpuãbmcmâs e e hoje a quarta mais comum infsocão fatal. noa EllA,

As IFI por Candida estãiOi também, a aumentar no cenário nosocomíal, e prevêeav-se novos; íncr eme ritos pois os factoreS; da risco destas infecções eontínúario a aumentar. As espécies de: Candida são responsáveis por 8 a 10% de todas as IFI: hõSDCoraiais e ocorrem a urna. taxa, de 6' a 23 ihlecções pçf ;i:#0 000 pessoas anualraente nos 80¾¾. M principal: preocupação com a eandidiase invasiva é mm íSõmbbtõ; a pua. alagada taxa, de mortalidade, mas também a excessiva; extéupão: do internamento hospitalar de pacienr.es infectados·, dé 3 a lâ dias, pie origina um -custo: global estimãdg: atribuível a çandldemia de; cerca, de 1 milhar de milhões; de dolarés por abo nos; EDS, dm estudo recentemente publicado: sobre à; população' Portuguesa; mostrou que há. uma incidência de; fungémla. noso:oçmi,al de: %,;j por 10 01 admissões hospitalaras, ccm uma taxa de; mortalidade; de 3 9,3%. De acordo com outro epcubõ; recente publicadç: sobre.; a inoidênçia das lEi na Europa, este numero: parece estar msié próximo das- incidências çnC;ont:radas hÇutrçs, países: eurõpçua, mas ê consideravelmente; interior que; é: encontrado população dos eda . Outro relatório recente:: mostrou que na Escócia a incidência de çandidemía ç de 4,8 casos por 100 000 habitantes por ano;,

Desde o final da década de 1.950, o padrão de cuidados para o tratamento de infecção fúngica potencialmente letal tem sido â anfotericina B. Este composto tem como alvo, e liga-se a, esceróis na membrana celular f tingi ca para enviar poros iõnicos, resultando na perda fie potencial de membrana e subsequente colapso. Embora; permaneça o agente, fungicida de ma is amplo espectro dlsponivei , a sua elevada toxicidade e a necessidade de admi nis tração: pa.rentériea limitaram a sua utilização.

Os anos da década d® 1990 testemunharam as introduções de formulações lipidicas dõ anfotericina B·, assim; como dos triazol.es, f luconazole e itraconazo 1 c . Os tr.iazo.les actuarn afectando a síntese de er.gostcrol através da inibição de lanosterol-14a.-desmetila.se dependente de CYB-45Q, que interfere com o crescimento celular,, eventualmente conduz indo a mor.ee. celular.: Embora, estes agentes exibam claras vantagens em. relação à: anfotericina B„ ficaram limitados pela formulação,: pelo espectro de activida.de: e/ou pelo desenvolvimento de resistência.

Desde 2 0 0 0, novos agentes antifúngicos foram de sexrvol vidos para ultrapassar as fortes limitações doo fãrmacos preexistentes, tais como t riasoles de espectro alargado ivbfieanázole e posaconazole) e .equinadándlpas: :(ca:SpõdTOgilJa:,í micafúngipa: e aniúulafungína) * ã©: equift©©án:d.ira© Inibem a, ©rntese de β-ι, iíobcglncáná©:,: conduzindo a dé::e®;Sfcatoidi:aapig da parede celular fungicá, lis©; celular e morte celular >, &Io acllva©;,. ir vitpcp contra espécie© de Caxiciiáa e .âapeppil 1 as, ma© não centra ama ampla gaíia de outros fungos pátofinicos. emergentes., iesmo; entre ©st©;© notou agente:© ©;xist©m: ainda limitaçoe© como ©:f©;.i,t©©: adueruoa: do fá;máco: {papselalmente para. 0 toriconatolel ? inteiraçgêe-p iármaoc^ farmacOi associadas com. o© triapol©©,. ©: falo©: de: ppeparáçbss: ait/ernatita© íe. g., faltam. preparagdas intratenosa©: para. o popaoonaooie; e faltam· preparâçcea orai©: para ©qúlnocandinasi*

Os antifúngicos actuslmerfn disponiveis sàc igualmente ineficiente:© para. .a erradicação profiláctica. de colonização por CãndidU: albidans. :33e; faoto;, esta levedura exibe a capacidada de Crescimento em biofiime., que apresenta uma tclerduoia:: intrinseca acrescida, a. anti.fúngicos: com©: os: azoies, os pplienos © a S-flUoroclto©rua·* úor esta razão, a candídíase estl frequen temente asSOCiada Com dispositivos: médicos permanentes ía. pt, implantes: dentais., cate.cere.s, válvulas cardíacas, enxertos de derivação vasci.il ar, lentes oculares, articulações artificieis e anestomoses (shuní-.s) do sistema nervoSc central) , que: podem: ao tu ar como substratos para o crescimento do; biofiime. Num estudo multicentrado de pacientes: consecutivos; com candidemia, verificou-se que a taxa de mortalidade para pacientes com candidemia relacionada dom oatefares era: d©: 4l%. Portanto, apesar do desenvolvimento dÇ: novo© antifúngicos, a taxa de mortalidade da infecção fúngica nosocomial permanece i na c e i t a ve .1 me n t e elevada.: AdicionaImente, existe também uma lista crescente de novos e emergentes patogéníos fúngicos, incluindo espécies que não a a 1 bi ceais dc Candida e espécies que nâo a fumigatus de AspergiUus, que são geralraente mais difíceis de diagnosticar e tratar, o que as torna responsâ veis por taxas de mortalidade: superiores.

Está entre os ofoj ectivos da presente invenção tentar obter uma solução para estes problemas, e espeei fícamente, por exemplo, prορoreionar um agente antímicrobíano alternativo com aatividade potente e de largo espectro contra patogénios humanos./animal, enquanto possuindo baixa toxicidade.

Sumário da Invenção

Os inventores verificaram surpr: eendent emente gue o polipéptido Blad de Lupinus apresenta potente actividade antimicrobiana contra um grande número de diversos organismos bacterianos e fúngicos que sao patogénícos para seres humanos OU: animais. Os inventores verificaram igiaalmente gue o poi ipépt ido Blad não é tóxico para an ima is, o que torna portanto o Biad um excelente composto para utilização como a n 11 má. c:ro.b i an o contra patogénios humanos e animais numa gama de cenários.

Assim, os inventores proporcionam. uma composição eompreendendo um polipéptido a nt i mí c rob i an o compreendendo Blad OU; uma sua variante aetiva, para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia ou profilaxia. Os; ihúeíuiores proporcionara igualmente a referida çompoaiçáo para utilirapã© hum método de tratamento ou prevenção de uma infeççio mim,: ou âé um, indivíduo;, por um microorganismo. Em, sonoret inações preferidas a. composição compreende ainda um transpoit. ador ou diloente: e/ou um ageufe quelant e farmacéutidamente aCélt/IveiS^ Preferivelmente, a composição á; utilizada no raferid© metodg em que o índividu© tem: um sistema: Imunifári©' :©©mp;r©méfid© dh está critioámente doente:.

Os inventdrdS: proporcionam igusimeuta: a utilização, de uma; e©mp©sifã© ©empreendendo· um polipéptido .ant í microbiano ©©mpteendeud©1 Blad Ou uma. sua variante aotiva para matar», ou inibir ©. crescimento de, um microorganismo gue ê patogénico para úmt ser humáno ou ura animal nutiv local que nao está no, ou não # m corpo humano ou animal. Preferivelmente,: a referida composição i; utilizada para desinfectai, em: relação a um microorganismo patogénico para sores humanos ou animais, um artigo gue; vai ser ingeri d©: por, ou colocado dire et ame nb©; sobre: ou no inteiior, de um ser humano ou animal, ou uma superficie: disso necessitada, preferivelmente em que © referido artigo é um prcdutO' alimentar ou um. dispositivo cu 11 instrumento médicos ou em que a referida superfície está locaiízada no interior de um ambiente onde:; (a) vai ter lugar um exame, um diagnóstico ou um tratamento médicos; (b) Uai ser preparado ou de outro; modo manipulado, ou armazenado: um produto alimentar; (c) uai ter lugar uma la:magemape:SS:oa.l. e/ou hig 1 eni zaça.o; e/ou (d) esta Situada uma pessoa, dom risco particular de li) contrair· urna infecçao por um miCroorganismO;.; ei ou (ii) ser incapaz de depurar uma infecção miçtobi.ara. sem Intcrvençâo midloa..

Em concretizações preferidas; destas composição: compreende, ainda um: agente:: queiante ut liíz.ações

Cl

Em concretizações preferidas 0: mi croorgani smo é uma bactéria ou um fungo, preferivelmente em que: ~ a baçtiria o uma espécie, patogéniea dc um dos seguintes géneros·.: Psendomonas, Listeria, Bacillus, Staphylococcus e Salmoncllci', ou - o fungo é uma espécie pafcogénica de um dos seguintes géneros : Candida, Aspergi 11 u&, AI í\ernaria, Fusari um,

Cryptococcus e Trichos^ororit preferive 1 mente em que o fungo pode causar infecçao fúngica ifivasiva, pr e f e r i ve 1 uient e C. albicans, A, fumi ga t us ou AI te ma ria alterna ta .

Os inventores proporcionara igualmente: - um método de tratamento de. um ser humano ou animal compreendendo a administração, a um indivíduo disso necessitado, de uma composição compreendendo; uma quantidade terapé:Ut:lCsméut:e eficaz: de um polipépcído ant imicrõbiano compreender,do Blad. ou. uma. sua. variante açtiva; - um mitodo; dc prevenção ou tratamento: do uma. infeoçao: por um microorganism© compreendendo a ádministraçio, ia, um indivíduo disso: neceesitado:, de: uma composição compreendendo: uma quantidade;: terapeufeioamente eficaz de uma pcl ipéptido ântl:ml:C:rsbiano; compreendendo Blad ou uma sua variante activa; e iam método para matara ©1 Inibir 0 orestimanto de,, um mteroorganlsríuo que ê pâtogêniGO: para ui® aer humano ou um animal num local que não é no, ou dó*· Oorpd humano ou. animal:? O referido método compreendondo a administração ao referido: local, de uma composição eomgnêeBdendo uma quantidade eíioar de um: polipéptido antimlcrobiano compreendendo Blad ou uma.: SUá: variante estiva.«

Breve Descrição dos Desenhos A invenção será descrita com referência aos desenhos anexos, em que: a Figura 1 most ra Curvas de morte no tempo para Lis teria monocytogenes e Paeudomonas &mmginr>sm a Figura 2 mostra halos de inibição para Staphylococcus aureus, Bacillus xubtilix, P. aerugimmaSi a L. momdcytbgpm&m a Figura 3A mostra uma curva de morte no tempo para €> albícans; as Flgurãã: 33 © 4 mostram curvas de crescimento para C. Mlbéemm as Figuras d a. ... __________________________ ^ ____; ____ Cl alMbmíMr Cryptoeoccud :b&d£ortmMM ê $b Èimigdbdsí 8 eolectivárnênte mostram: halds dê inibição | .Mçtvuea a Figura S: mostra. curvas ide; morte: no tempo para L. ffiohoOirtogehes, P- aeruginosa e C. albicans; a Figura.: 1Θ mostra a sequência de codifioaçád do ptêçursor de l-eongiutiua de Lupinus albw® {BlQ IP HO; Da e a Figura: 11 mostra o fragmento interno da sequência de codificação dp precursor de (3-Conglutina que cOpresponde a Blad mm £$ ·

Descrição Detalhada da Invenção

Blad

Blad i"banda de biiplmis allms doce”) foi o nome dado a um piOduto de clivagem: estável e intermediário:: da H-conglutina, a principal proteína de reserva presente em sementes do género

LupiMim, Foi caracterisado como um polipéptido de 20 kD, composto por 173 resíduos de aminoaeido, e codificado por um fragmento interno (519 micleótidos, depositado no GenBank com o número de acesso ABB13526) do gene que codifica o precursor de β - congi u t. ina de Lupinus (1791 nuc.ieó ti dos, publicado no GenBank, com o número de acesso AhS91865} . Quando são utilizados iniciadores que. codificam sequências terminais de Blad para amplificar uma sequència do AL')N genómico de Lupinus, obtém-·se um produto de -620 ph, indicando a presença de um intráo no fragmento gén ico que codifica Blad. O Blad de ocorrência natural é o principal componente de um glico-oligómero de 210 kD que se acumula exc1usivamente (após intensiva proteõlise limitada de β-conglutina) nos cotiiédones de espécies de Lupinus, entre os 4e 12 ° dias após o início da germinação. Enquanto o referido ôligómero é glioosilado, o Blad de ocorrência natural não e glieosilado. O gl.ico-oligómero contendo Blad é composto por vários polipéptidos, sendo que os princ.ipais exibem massas moIe.ouIares de 14 , 17, 20, 32, 3 6., 48: e 50 k.D. G polipéptido de 20 kD, o Blad, é de longe o mais abundante: polipéptido no interior do oligómerò e parece ser o único com actividade de. leetina. 0 Blad de. ocorrência natural constitui aproximadamente 80% da proteína total cor.iiedonar em plantulas de 8 dias de idade. A sequência de codificação do precursor de β-conglutina de L. ai bus iSÊQ ID NO: 1) é dada na Figura 10. A sequência de CQdificâçaó da snbunidade progenitora: de |-conglutina está localizada nos resíduos 70 a 1668. A subunidade progenitora de β-conglut ina codificada, de 533 resíduos de arninoáçidô ID NO:2} e:

MGKMRVRFPTLfDÚLGI VFSiTOe XG1 RRSE

REQEQEQGSPStRRRQEGYÍglÍfÍEl:IEÍREEREÍElÍÍÍÍP.SYS:RRQ®fllF:ÍlQRFQT L·YKNRNGK:IRRL·ERFDQRlNR¾EiíL·®YRIi¾E¾EKlNYDI¾PKHSDâpYidJ¥¥L·ii:GR¾l‘lT

QΩSYF:SGFSRNTL·EΆTFNYKIEEϊ;QRI:ϊ;L·iNED¾EIEEQRRGQEQSDSDECWIW¥S:KKQ;I 0:ΚύΤΕΗΑθΒ830ΕΟΚΡΕΟ3^ΡΕΥ?ύΕΕΐΙΕΡ:ΐΥ;@Ι|ΕΥΜΕΥΕ:ΙΤΡΟΕΝΡ@Υ^θΡ|Ι:ΕύΤΥΐΥΐ;Ν EGADL· D FH YNS ΚΆΙ Yú WVDEGEGNYEDY® I RDpGRQQDEQEEKEEE YlRYS ARDS EGDIFP iknqqqsyfamgqpqqq^qqqbekegrrgrrgeslpf Q fragmento: interno da, :ieqU:êmb.i.â; de codif itâdi:© do precursor de l-congiutlna que; corresponde; $.· llad. (SEQ I:B NQrlI é dado na Figura ϋ:, 0 polipiptíldo Blad. íRBÉ ID NO; 4) o,:

ItQRHPYHF:SSQRFQTB¾MII(3KIR¥L·:ERFDαRTMSBIlL·¾ifI.ΪYE:FQSKPNTL·XLPKHS β^ΟΥνύΥΥΕΝΟΒΑΤίΦΧ^ΙίΒΟΒΗΟΑΥΚΕΕΥαΒπΕΕΧΡ^Ιί'ϊ’ΒΥΒΙίΗΡΒΟΝΟΚΕΕΛΑ/ΚΒΑΐΡΙ NN PQ Y F YD B Y PBBTKbQQEYBBG FSRHTL E AT FMT É &. invenfi© :fs.f:.ere-de a uma compdbidlb oompresUdêndP: um pollpêptlá© ant irai c rob i ano compreendendo Blad ou Uma sud variante actim, Refere-sa portanto M uma ..cdmpodrpao compreendendo; um po lípéptido: anfelmitrobren© incluindo d; sequência poiipeptidioa; de GlQ ID ÍQY4 CU uma. sua variante activa:, Em. concreti cações alternativas:, a tempos iç:ã.Q: cónsiSÁà essenodalmcnRa; num· pollpÉptldO': auC,imI:Crçp:i:anQ: compusendendo BI a ci ou :uffia: sua varrântíâ setivâ. e/ou o polipéptido ântimíorofoiano: consiste esseuoiiaimentíe em Ria d. ou uma sua variante: setivâ·, Em ©atras Conorsfe.isiâôdeS^ o polipéptido antimieroMauca compreendendç íou donslstird:©. ess:en:0::ia;|meuue. em) Blâd OU: uma sua varrâUtíS astivâ:, pode ser utilizado na forma, isolada.,.

Uma vârianPêí activa de Blâd é uma variante de Blad que retêm a capacidade de actttar corno asPimicrebiano: {i. e. tem activida.de antimlcrotolsna - veja-se adiante: para uma deseric^ao do nível desta actividade e; como medi · 1 a) . "Uma variante activa de Blad" inclui no seu âmbito um fragmento de SEQ ID NO: 4 . Em concretisaçòes pref eridas::, ê seleoc.ior.iado um fragmento de SEQ ID NO:4 que tem pelo menos 10% do comprimento de SEQ ID NO: 4, preferive3.men te pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 30%5 preferivelmente pelo menos 40%, preferívelmente pelo menos 50%.,. preferivelmente: pelo menos; #0%.,: preferivelmente pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, preferivelmente pelo menos 90% e o ma is preferivelmente pelo menos 95% do comprimento de SEQ ID N0:4. O Blad ou uma sua variante têm geralmonte um comprimento: de pelo menos 10 resíduos de aminoácído, tal como pelo merros 20, 25, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120, 140, 160 ou 173 resíduos de âminoscid©, "Uma variante activa de Blad" inclui tambérn no seu âmbito uma sequência polipept ídica que. tem homologia com SEQ ID NO: 4, tal como pelo. mendc 4Q| de identidade,, prèfefivelmençe: pelo menos: #01,: preferível mente pelo menos: 7#%':, preferivelmente· pelo menos 80%, pref erivelmente. peI:o menos 8S%, preferivelmente pelo: menos 90%, preferivelmente: pelo: menos: 95%, preferivelmente: pelo menos 97%, e o ma is pr e f e r i ve 1 men t e pelo menos 99% de identidade, por exemplo ao longo da totalidade da sequência ou ao longo de uma região de pelo menos 20, pre f e r1veIment e pe i o menos 3 0, pre feri veImente pelo menos 40, preferivelmente peio menos 50, preferiveImente pelo menos 60, preferivelmente peio menos 80, preferivelmente pelo menos 100, preferivelmente: pelo menos 120, preferivelmente: pelo menos 140, e o ma is preferive iment e pelo menos 160 ou ma is resíduos de aminoãcído contíguos. Os métodos para medir a homologia. de proteínas são bem conhecidos na especialidade e os peritos na especialidade entenderão que rio presente contexto, a, homologia é calculada com base na identidade de aminoãcidos (por vezes referida como "homologia rígida·'} * A variante activa áe Blad homóloga: difere tipicamente da sequincí a polipeptí dí ca de SSQ ID NO: 4 por subst i 1ij iç ão, Inser ção ou deleçãó , pôr exemplo de 1, 2, 3, 4, 5 a 8 ou ma is substituições, delações: OU inserções. As substituições são preferivelmente bonservatlvâs1 , ou seja, um aminoácido pode ser substituído: por um aminoacído similar, onde aminoãcidos .símllarep: partilham um dos peguíntep grupos: resíduos aromãtiçOS f F/:Í/W'/Y), resíduos aiifáticos não polares (G/A/:p/i:/lr/f'| , ãlíf ãtícop: polares: na O carregados íC/S/T/M/N/Q) e alifátiçOS polares carregados íD/E/K/R). Os subgrupos prefé:fÍddS OOftpreendem: ÇS/A/EU I/I./V; C/S/T/M; N/Q; D/E; e R/R. ilm, polipiptído antimiorobiahò compreeuderido llad ou uma sua varieiite ac t í va (como descri to acima) pode consistir em Blad ou uma sua var iante activa com qualquer número de resíduos: de aminoácido adicionados ao terminal N e/ ou ao terminal, δ desde que: o polípéptido retenha, a actividade antimíerobiana, (novamente, veja-se adiante para uma descrição do nível desta actividade: e de como. medi-la) . Preferivelmente, nio maís de, 300 resíduos de aminoácido são adicionados a cada uma ou a ambas, as extremidades de Blad ou uma sua variante activa, ma is preferi v e 1 me n t e não ma is de 200 resíduos de aminoácido, preferivelmente não, ma is de 150 resíduos de amincacído, preferivelmente não mais de 1,00 resídnos di ãmíPó:â.eido, preferivelmente não ma is de 80, 60 ou 40 ridíduos: dê êminoãcído, o ma is pre £ eriveIment e não mãís de 20 rêêídnoo di: áminoãcido^ dm pdlipépt ido antimiçrefeiãno compreendendo (ou eoniíêtird© essencialmente em) ;Slad: Ou uma sua variante activa :(çdmd diedríto acima) pode ser ufeilidado na invenção na forma de: uma, proteína puri ficada removida de uma fonte vegetai > animal ou microbíanã) e/ ou de uma proteína redombinante. Á. produção de uma forma recombinante permite a prdduçid de variantes activaa de Blad.

Os métodos de purificação de Blad de ocorrência natural eatld Já: deSóritos na especialidade (e. g. Ramos et ai. (1.9 9 7) Blauta: 201 [1): 26-34 e; Monteiro et a j . 12010) PLoS ONE Eli):: #814::2) , líma idnté ádequndã: de Blad de ocorrência natural é uma planta: do gênero Euplnus,, tal como Lupinus albus, preferivelmente um ootiléd one: da referida planta prefer 1:veimen.te coibido entre cere a de 4 e cerca; d e 14 dia apõs o início da germinaçãot. nu ris çreferiv e Iment.e cc >lhído 6 12 dias após o inicio da germ; .naçí 50 {tal. como 8 di as apôs

Início da gêrmÍBãdioj - Estão divulgados na especia11dade métodos para: a: exiracção: da proteína total, que conduz a um extra evo bru.t©: oetpreenderdd Blad, e para a purificação de uma proteína deste extracto que: conduz a um extraoto parçialmente purificado, :ê-:.g. ç©;ffipre.eudêsd©: O glico··oligómero contendo Blad que compreende: Blad..

Bar a isolar o Blad propriamente; difo:, pode então utilizar-se Í;B;i'-'ÍI)p:E .e/iii#: pref etiVilmenbe: de fase: inversa (EF}:~RBBE numa. cpianá C ·· 3 8 .

Uma maneira alternativa de obter um; ixttábbo parciálmente. purif içado compreendendo g :g:Í::iéo^elipfimdre: :çpe compreende Blad Consiste; em; utâlicar a açtiVidaâe de ligação a quitína do Blad. d glioo^'Ol:í:g:Omer.o ligasse de uma maneira; :mvi,to ferta a uma coluna, de quitína OomO'. parte de uma 'purificação por cromatcgrafia de êfrríâadê.: gpm guitlna, s;endo: elnido com, ;Hdl 1:,05 If. Os detaldeã de. um exemplo deste mitódo de purificação aãc como se digne;;:: doti.lédanéa de t remoces com dito dias de idade: foram colhidos' © hogiiog-ettdioad.os: em água MillívQ pius, {pH ajustado paii 8,05, οοηΡοηΡΡ Ca.c.l2 10 mM e MgCis X Qi mMi ® hpmogehato foi filtrado através^ da gaze © aentrifugad© a; $$01 0' durante: i h i: 4.ό£ό X peleté foi subsequentemente suspensa Sil Pimpão TriS-HSi SQíD mM, pH; 7,5, contendo Nadi a 10% ip/v)XEsTA 10 mM: e: SdiX 10 mM, agitou-se durante 5 b a 4ed, e Oantrifugau-se a 30 000 g durante; l h a 4°c. A fraçção: total: d© globullna, contida no sobrenadante, foi precipitada com sulfato de amónio (561 g/1) , deixada em agitação no frio durante 1 .h e foi cent ri fugada a 30 0 0 0 g durante 30 min a 4°C. A pelete obt ida foi dissolvida em tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, dessálinisadá em colunas PD-10 egui1ibradas com o mesmo tampão e passada através de uma coluna de cromatograf ia de afinidade com quitina pre-equilibrada com o mesmo tampão. Ã coluna foi lavada com tampão Tris-HCl 5 0 mM, pH 7,5, e as proteínas ligadas foram aluídas com KC1 0,05 N. As fracções eluídas foram imediatamente neutralizadas com Tris 2 M e as fracções dS píco foram reunidas, liofílizadas e analisadas por SDS-EAgi

Para. a preparação da coluna de qui tina, obteve- se qnitina bruta da. ligfSS; © processou -se eomcl se segue: lavou - se a amostra dã; quitina extensívsmente Com agua Milli-Q Plus, seguida d©: HCl 0:,:05 KM lavou- se então com carbonato de sódio a 1% [p/v|: e depois com ebanol, ate a absorvância da lavagem ser inferior a 0,05·, A quitípa foi então empacotada numa ponta de pipeta e equi 1 ,íbrada com: tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5,

Os métodos de produção: de proteínas recombinantes são foem conhecidos na especialidade. Esses métodos, como aqui aplicados, irão envolver a inserção do pôlinaeleotido que codifica um; polipiptido compreendendo Blad, ou uma: suã variante activá, num Vector de expressão adeqnado - permitindo a justaposiçlp do referido poli n uc1cot i do com um ou mais promotores (e.g. um promotor indutível, tal como T7lac) e Com outros polinucleótidos ou genes de interesse a introdução do vector de expressão numa célula ou organismo adequados (o, q. Escherichia coli), a expressão do polipéptido na célula ou organismo transi ormados e a remoção. do polipéptido recombinante expresso dessa célula ou organismo. Para auxiliar nesta, purificação, o vector de expressão pode ser construído dê; maneira a que o po1inuc1eótido adieionaImente codifique, por exemplo, um marcador terminal que possa auxiliar a purificação: e. g., um marcador de resíduos de histidina para purificação por afinidade. Uma vez purificado o polipéptido recombinante, o marcador de purificação pode ser removido do polipéptido, e.g., por clivaqem proteolítica.

Numa composição c omp r e e nd endo um polipéptido a n t i. má. c:ro.b i an o compreéndéndo (ou consistindo essenc ial mente em) Biad ou uma sua variante activa, o referido polipéptido esta pre f e r ive1ment e numa forma pare i a1ment e purificada, ma is preferivelmente numa forma purificada. 0 referido polipéptido está parcialmente purificado quando está presente num ambiente á que faltam um ou mai s outros pol ipépt. idos com os quais esta Uátufalmént© associado e/ou está representado por pelo menos cspça de 1:|% da proteína cotai presente. O referido pblIpÉpfído é purificado quando está presente num ambiente: a que faltam todos, ou a maioria, dos outros po1ipépcidos com os quais está nâturál mente associado. Por exemplo, Blad purificado siunifica que o Blad representa pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca. de 60%, pelo menos cerca de 70%, pelo m&uds cefcá: d© 71%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menOS cèrdá de 30%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca d© 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99:% dá prôtexná total numa composição.

Numa Composi ção: compreendendo um polipépt ido antimicrobiano compreendendo: (ou consistindo: essenc: ialmente éíTil Blãd Ou uma sua variante activa,: o conteúdo da proteína de búpinbá podo consistir essenc ialmente;: no gl ico - ol igõrne r.o Contendo Biad que compreendo um pol ipéptido que compreende (ou consdCto: essencialmente em) Blad ou uma sua variante activa.

Uma composição compreendendo um polipéptido an ti microbiano compreendendo (ou consistindo ess cn cia l.rncn t e em) Blad pode: também ser uma formulação compreendendo outro (s} composto(s| adicionado (s) â composição pelo perito. Em concretizaçde® preferidas, esta formulação ê uma formulação farmacêutica compreendendo um polipéptido ant ími crobi ano compreendendo1 lou consistindo essencialmente em) Blad e um tfantpdffãdor ou díluente farmaceuticamente aceitável. ΆΙψθθ microbiaàPã A invençió pefaferae' a út 1X1JapaO· de; fílad como composto antimícrobíano, ir$\, para inibir o crescimento de, ou matar, microorgsni smos que gab: psfcogéni oos para seres humanos du animais. Estes miOfO:o:rgan.ismos inpluem., em particular, bactérias e fungos. Estes roicroorganismos patogénieõe elo capases de; causar umá doença iiifecçiosa cu qualquer outro problema de saúde íevfjú imtoxioaçid alimentar, alerfiaj em seres humanos e/ou animais, e podem afecfcâr ou ihfestar, por exemplo, os olhos, a pele, queimaduras, ler idas, O tracto respiratório superior, os pulmóes, O tracto: gastreintestinal, o tracto geníto-urinário, os ride, o fígado, O sistema nervoso e/ou p: sistema cardiovascular (e.g. a: corrente sangtiinea) . Estas: mloroorganiembò patogén icos podem ser :i n e ren temente patogênious ou podem ser1 oportunistas ii .e, não causam, doença num. liospade.lrc, saudavei mas podem fata-lO' ;num Uospedel.ro dom um: :sistema: imunitário cQmpromet:ido;} , Estes mioroorganismos papogenlsos podem:' adioiousXmaute ou alternativamente causar profeiemas de saúde:: libertando compostos que são tóxicos para seres: humanoa ou animais.. Q Blsd pode:: Ser utllitddd como an.t. imi cr obi ano contra patôgeníos bacteriauds: tanto Gramapositivos eomo Oram- negât.ívos. Os alvos haçisrtarOO' parb.içrl.ãrment.e preferidos incluem, espedles patogenicas de Pseuàomonas, tais como

p. aeruginosá, P:spuâpmemas oFyzihâbitaris e PseudomonãM pièeoglóesí cidá imais pref eriveImanta P. Marugiiiosa} , espécies patoglnitae de . listaria, tais corno A, monocytogcncs a Ai ateria àya&oyli {maia preferivelmente A. monapydpgeries') , espécies: patoglnicaa de Saci2lus tais como Bi spbtllis,·. Bácillug appbbãbPé e Bacillus capeus: (mais preférivaimant© B>: edpt:2:1:.1 ai, espécies patogiiioas de BtãpbylocGdciipy: tais pomo '&> auieúa (incluindo MÉapMyl&PpbpMS' aabeus resistente a meticilina: [MRSA] ) , MtaphyipppgpUB psaudíntermedíus,

Spapby ípooocus evi dermidís, stapbylppoacP® sappQpMytípps', BàMpbyípppgpXi&· lugdune&sis, BtãphyippúpGUB· ucMeifetíi: e MÉapkylgpgápp& asprae {mais preferívelmente S. aureasl ,. eapicles: pafcogiufous de. Balmpnmlla, tais como subespÉpies de Jalmonella: arfceri.da tais como Salmoimllã arizoaac. BabímbéllM cÈml&paespis, Salmonella embpbbbMip, s&lmabplla pêbãtyphí. li, sadmpmallM paratypbi A, êalm&BBlãa. typM, Ba 2 morei 2a typhimimium, Salmonella dublin, Sãlmonella typhisuis e Salmonella brandenburg írnais pref erivelmente S. enteritidis ou 8. typhi} e espécies patogénicas de Campylobacter tais como Campylobacter g&guni e Campylobacter coli {mais preferivelmente C. jejuni) . Em concretizações preferidas o Blad é utilizado contra patogenios que podem causar inflamação generalizada e sepsia (e.g. P. ae.rugi.nosa) , Cólera (e.g. V. odciera©), Meningite (e.g. L, monocytogenes, Haemophílus influensae tipo b, Neísseria meningi tid.is, ou ôtreptococcus pneurnoniae) , Pneumonia (e.g. S. pneumonias, agalactiaa ou S. aureus), Shigellose {e.g,

Shigella d'ysenteriae, faringite es trept. ocóc íca (e flexneri ou 9-

Shígelia boydii , Shigella sonnei), is pyogan&s) ,

Tuberculose (e.g. Mycobncteráim: 11 i bercu1 osis, Mycohacterium fomrÍMí Mycoba c t eri u m africanum, Mycoba ct eri um canett.i e ]MyCObacbmriu&t microt.i) , Tifóide (S. typhi) , ou intoxicação alimentar {e.g,: espécies patogénicas de um dos seguintes gêneros:: Tis teria, Mkmpbylmôocaum e Salmonella) .. 0 Blad pode ser utilizado como a n t i mí c .rob 1 a η o contra patogênios fúngicos tanto uni c e1ulares (leveduras} como multiceiuiares ililamentosos, bolores). Os alvos fúngi cos particularmenite preferidos incluem espécies patogénicas de Csadídátais como; :C. aIbicans, Candida glabrata, Candida lusi taneaa, Candida parapsiãbsiSyr Candída tropical is, Candida. km sei e Candida •dnbliniehmis, espécies patogénicas de Alternaria, tais: como A. alPernaba e Alternaria molesta, espécies patogénicas de; Aspar gíblim',· tais como A. fuiv.igatus, Aspci:gij 1 us niger, Ãsp&bglllus ÊlayUB o Aspergíllus clavatus, espécies patogénicas de FubardUM., tais como Fusaríum solaní, Fusariuíp oxysporum, Mparium v&nbicíliioíâms > e Fusaríum prQldê&napiM:,. espécies patoginiçãs: de: Cnyptococcus, tais como Fnypt&bObpps naoÊmtmaris,: Crypbpdocpus laurexiti i, Cryptococcus alMddê e; C:ryp t ococc us gatbijL, O espécies patogénicas de Tnicbosporon, paie comp Tríbbopponmi ovoides, Trichosporon iMiim., Tti cbúspopçn asahil,· Tr i chosporon mucoidcs,

Tricbosporon aspergidas, e; Tri chosporon cutaneum (todos previamente considêrados sob o nome: genérico de TrielmapoPcM b&âgelii}, e Trdchosporon dermatís, Txichosporon dohacnsc e Trichosporon loubi&Pí, Em concretizações preferidas o Blad é utilizadO: contra patogênios que possam causar infecção fúngica invasivã; (IFI) , que ê usualmente definida como uma inf ecção fingida gistêiiica., gené;fa.l:id.aaa' e viaeerái.. que. í fpequêniemente. grave e/ou potindlalmênte; letal iam;: .esferaste eom; ddéndss fúngicas supg:&&íbi:a.is, Xocaiíst benignas:* auto-limit .antes) .. Op fungos causadores de IFI par treularmente: preferidos incluem espédies patogeaioaS de Camãiâaf

Aspergillus ou dizernaria como acima.: definido, preferivelmente; C. al&icãn&f Λ preferivelmente .CT, fumígaCuS ou M·* altar nata, alMcans ou A.. fumi§mtws:>: maia

Dg peritos serão; capazes de ideaii.ficar, por métodos de rotinauma concentrada© adequada para utilizar um pol ipépt ido antimicrobiano compreendendo '1 eu conpiPirUde1 :e;asenela.iment.e em) Blad (ou. uma. sua. 'variante ao tive): como· anfimlcrbbiaaç: em qualquer cenário particular., 'Preferivelmente,· por exemplo, utiliza-.3.0: o· Blad numa· eeneenfração .de pelo menos· l. ug/ml*; pelo menos: 5; pg/ml,* pelo menós 10 ug/ml, pelo; menos 2 0 pg/mi,. pai© menoP S# pg/ml, ou. pelo menos fÕ:.§.: pg / mi, e até 50 õ pg/ml* até êU:;Q: pg/ml, atê: 1 mg/ml, ate 2,5 mg/ml,· até S mg/ml ou ate 1.0 mg/ml . Pref êrlveimenie a ©eneeniraçã;© de BI a d geXecciohada está entre 10 pg/ml © 5 mg/ml, ma.is preferivelmente entre 50 pg/ml e 2,5 mg/ml, mais preferivelmente entre 100 pg/ml ê 1 mg/mi,, m ainda ma is preferiveimente entre 100 pg/mi e |00 pg/ml (tal oomo cerca de 250; pg/ml) . Os inventores proporcionaram: evidências (vejam-se os Exemplos 4 e 5) de que õ Blad não e tóxico para o hospedeiro até pelo menos 400 ug/ml.

Os inventores verificaram, surpreendentemente que uma combinação de Biad com um agente quelante; (e.g. EDTA) produz um. efeito antimicrobiano sinérgico. Portanto, preferivelmente, c utilizado; um agente quelante para melhorar a aotividade ant ímicrobiana de um polipéptido compreendendo (ou consistindo essencialmente em) Blad (ou uma sua variante activa) , e a utilização de um tal agente quelante pode diminuir a concentração do referido polipéptido antimícrobiano necessária para se conseguir um nível particular de actividade anti microbiana. Um agente quelante (também conhecido como quelante, qaelador ou agente sequestrante) é qualquer composto que se liga a um ião metálico para formar um complexo não covalente e reduz a adtividade: do ião. Os agentes quelantes adequados Incluem: pol iaminocarbox i 1 a tos tais; ©oítí© BBXÁ. (ácido et i lenodictmínot et ra -acét ico; e EGTA (acido etilsnogllool- bis (β·· aminoetiléter) -N, N, Ν' ,N' tetra-acético) , Preferivelmente, utiliza-se EDTA como agente quelant e, pre feri ve1men te numa concentração de pelo menos 10 ug/ml, pelo menos 50 ug/ml, ou pelo menos 100 pg/mi, e até 500 ug/ml, até 1 mg/ml, até 5 mg/mi, até 10 mg/mi, ou até 20 mg/ml. Preferivelmente, utiliza-se EDTA numa coneenti~ação entre 0,1 mg/ml e 1 mg/ml.

Veriti cações O polipéptido ant imi crobíano compreendendo (ou consistindo e s.senc ialment e em) Blad (ou uma sua variante activa) pode ser utilizado para inibir o crescimento de um mieroorganismo patogénico para seres humanos/animais (o que significa que tem actividade microbistãtica) e/ou para matar o referido microorganisrno (o que significa que f.ern actívidade mi crobi c ida) . O perito se.rá capaz de identificar uma dose e/ou concentração adequadas parã: obter uma inibição de crescimento ou morte particu 1 armente desejadas do mieroorgarri smo.

Preferivelmente, quando utilizado como agente mi crobis tático, o pol ipépt. ido an t i mi c r ob i a no reduz a taxa de crescimento em maré; preferivelmente: em 50%, ma is preferivelmente é® /1 mais pref erivelmente em 90%, ma is preferivelmente em. SS#, mais pref (erivelmente em 3 S %, mais preferivelmente em J#%, e ainda, maia preferivelmente em J#, 3# em: comparação com. COndiçoes equivalentes onde õ polipéptido antimi crobi and não está: presente:. Mal s preferivelmente: o poli pep tido snr.imiçrobi.am®: previne: qualquer crescimento: do mioroorgan i smo,

Preferivelmente:,: quando utilizado como .agente: miçpobicida, o pol:ip:ip:t.i.do antimicrobiano mata 1D:%: da população dos microorgaufsmos, mais preferivelmente 50% da referida população, maia preferivelmente 7 5% da. referida: população., mais preferivelmente 9|% da referida pqpuiáçÉ®* mais p r c f e r i v e 1 me n t e 35% da referida população,: mais preferivelmente 98% da referida população, maiã preferivelmente 99% da referida população, e ainda mais preferivelmente 99,9% ia. referida população em comparação com Condições equivalentes1 onde. o polipéptido antimicrobiano não está presente. Mais preferivelmente o polipéptido antímlcrobiano mata toda a população do microorganismo.

Quando utilizado para prevenir ou tratar uma infecção: num ou de um ser humano ou animal, o polipéptido antimi erob.ia.no é preferivelmente utilizado numa guant idade terapeuticamente eficaz, ou seja, uma quantidade que proporciona um nível de inibição do crescimento e/ou morte de um mioroorqanismo tal que se atinge um nível cliricamente detectávei de prevenção ou. supressão da infecção. Preferivelmente, a quantidade terapeuticamente eficaz do polipéptido antimicrobiano: não é tóxica para o indivíduo humano ou animal. Pretende-se que a referida quanf. idade t erapeuti camenfce eficaz do polipépt ido ant.imiorobiano seja terapeuticamente eficaz quando administrada como parte de uma composição compreendendo o polipéptido antímicrobiano,

Os inventores verificaram surpreender! temente que, em concentrações similares (em massa) , o Blad é ap r o.x ima d arnen fc e tão potente como a anfoterí cina B e. mai s potente do que o fluCoUazolé contra C. a Ibí aans e A. fuinigatus (era termos de âctívidade fungicida e tungist ática):... Este ê; um resultado surpreendente dada (í) a muito maior massa molecular do Blad em: comparação bom: moléculas orgânicas reiativamente pequenas de ãnfotoriolna B e fludOnatole e. (ii) a. natureza não toxica e edivel do: Blad para sefes immanos e outros animais..

Ptílíoaípdfis e métodos mêdia&M

Os inventores proporcionam: uma composição: compreendendo um polipéptIdo antímicrobiano compreendendo Blad ou uma sua variante aotíva para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia ou profilaxia. Para esta fim proporcionam; também um método de tratamento de um ser humano οη animal: compreendendo a administração a um indivíduo disso neoossitadQ:: do uma composição compreendendo uma quantidade tetapauéíbaménte: efíoaz de um pol ipépt ido antimlorobiano' çdmpréendanda: Blad ou. uma sua variante ao ti να.

Os inventores proporcionam também uma composição compreendendo: um polipèptido antimícrobiano compreendendo Blad OU uma: sua varíaxite: ãbtiva para utilização num método de prevenção ou tratamento de uma infecção num, ou de um,: indivíduo humano: ou animal por ora mlcroorganísmo, Pará, este fim proporcionam também x * una método do prevenção ou tratamento: de- umá. inf ecçâo por um microorganismb compreendexxdo a: administração a um indivíduo disso necessitado de. urna Composição. compreendendo ama quem idade t.erapeutíoame.nte: ©ficar pe: um: polipippido antimi cr oblato: compreendendo B:l,a,d; ou uraa sua variante activa.; e: - a ut.il.isaç|.ò de uraa composiçl:© c orapr e e náendo ura pólipêpfiâo antimíciObiano compre andendo: Slad ou uraa. sua variante e· activa no. fabrico de: ura medicamento para prevenção1 ou tratamento de uraa infeccio num;,,: ou de um, indivíduo humano ou animal, por um microorgánismo., A referida ÇoraposâçlO pode ser administrada por injecção {tal como intradirmiçá,: subcutânea, intramuscular,: intravenosa, íntra-dseea e intraperitonéalj, entrega transdérmíca de párteiçuiáS:,, por inalação, topicamente, oralmente cu por via. transmnddea ítal como nasal, sublingual, vaginal ou reotalíl , preferivelmente·, a referida: composição: compreende um transportador ou dilnente farraaçenteicamehte aceitáveis. Urna tal odrapoeiçlb farmacêutica pode ser formulada na forma, de uraa preparaçtd: farmacêutica· O:0nvenOÍ0na.Í, isto pode ser real irado ut ii:l:tand0: químicas e 'metodoioigias: padrão de formulação f armacêuticãque estão disponiveiS: aos peritos na especialidade:, Por' exemplo·,: um polipéptido: antr microbiano compreendendo: Biad (ou,, uma sua variante, activa.,) pode ser combinado Cdm um ou mars transportadores ou dilustres íarmesutreámsrte' aceitaveia para.· proporcionar uma. preparação liquida, dubsteãncias .auxiliares^, tais eçmp: agentes mo.l te antes ou. emulísionantes, subs;teãnoiaa taimponantes do pá e. similares, podem também estar' presentes1». transportadores:,, diluenies d substâncias auxiliares: são geralmente agente:®.. farmaceu ticos: que podem. ser administrados sem toxicidade indevida e que, por si set não irão induzir uma resposta imunitária no indivíduo que recebe a composição. Qs transportadores farmaceuticamente aceitáveis incluem, fnas naC: se lhes limitam, líquidos tais c:omo água, solução salina, polietilenoglicol, ácido hialurónico, glicerol 0. etano1. Sais. iâ^Íiasifêuiisamente aceitáveis; podem também set incluídos., por exemplo, sais de ácidos inorgânicos tais como cioridratos, bromídfatdá * los fatos * sulfatos,: e similares; e os sais dá: ácidos otgâuicos tais ccmo acetatos, propionatos, malonatos;, benzoatos·,· a similares, irefere-se tamisem, embora nao seijá necessário',· que a preparação: contenha um tfanspdrtãdor farmáoeubleamente aceitável que: sirva como estãbíiiránte particulármente vantajoso para uma composição compreehdehdO: um polipeptido como 0: Biad, Os exemplos de transportadores adequados que também actuam como áistáteí iisentes para poiipiptidos incluem., sem limitação, graus farmacêuticos de dextrpse, sacarose, lactose, trealose, manltol:; sorbitol, inositol, dex.tr ano, e similares, Outros t ransporí; adores adequados incluem., novamente sem limitação, amido, celulose* fosfates de sódio ou cálcio, ácido cítrico, ácido tartârico:, glicina, po 1 ieti 1 enog 1 ícóis de elevado peso molecular (PE©) * e suas combinações;·.:

Uma vez formulada, a composição pode ser entregue: a um indivíduo in vivo utilizando uma variedade; de vias e técnicas çonheoidas, Por exemplo , as preparações liquidas podem ser proporcionadas na forma de uma solução, stispensão ou emulsão injectáveís e administradas por via parenterica* por injecçâo .subcutânea, intradérmitís, intramuscular, intravenosa, intra-óssea ou i.ntraperi.toUáãl, utilísando uma agulha e seringa convencionais, ou utilizando um sistema de injecção por jacto liquido. As preparações líquidas podem: também ser administradas topicamente: aos olhos, â pele;, ao cabelo ou a tecido mucoso (c. g. nasal:* sublingual, vaginal ou rectal) , ou proporcionadas na, forma, de pulverização fina mente dividida adequada para adminístriçio: respiratória ou pulmonar. Outros modos: de: administração: incluem: administração: oral, em supositórios: * e tienicaa de entrega c r a n s d ά r m .i. c a activa ou pasalva:.: $m çoncretirapões preferidas. o polipéptido antimícrchiado é formuladq: numa; composição adequada na forma de uma loção: tópica,: um Creme: parã: á:S mãos:, uma solução de gotas •oculares * um; champô: ou um oo;ndl.ç,ionador. O indivíduo necessitado do: pollpépt ido antimi crobiano pode ser qualquer indivíduo humano ou animal. Em concretizações preferidas; o polipéptido aurimiorobíanG: pode; ser utilizado para prevenir a idfdcçiO: em, indivídaoB com: risco particular de- cpntpiárr uma. inifêdçid por um mi/croorgapiaiid η/οηί para tratar uma.· ipÊacgãa em indíviduos cota risco particular 4a serem iacaparéB' dê depurar1 Uíia ínfeoçâo microbiana sem intervenção medida., tais como Os j o vens (tais como um índividuo ccro. idade inferior a 16 anos, tal como um indivíduo com idade inferior a S anos, 3 anos, 2 anos, 1 ano, 6 meses ou 1 mês), os idosos (tais como um indivíduo com idade superior a 70 anos, cai como um indivíduo com idade superior a 80 anos ou S0 anos) , os que tem um sistema imunitário comprometido (tais como os que têm umã imunode£ieiêneia primária, os que têm umâ imunodeficiência adquirida {e.g. os que têm SIDA) e os que têm um sistema imunitário suprimido, como em resultado de um tratamento como quimi oterapia ou regimes com fármacos irmmossupres sores), os que estão eritieamente doentes, ou os que possam ter uma exposição part icularmente elevada a microorganismos patogénieos Ce.gr. profissionais médicos) .

Outlãs utilizações e métodos antimicrobianos

Os inventores pr opor c i onam igualmente a utilização de uma compôs içi©^ c o rnp r e e nd e ndo um polipéptido ant. í mi o rofo i ano compreende:;do 31 ad ou uma sua variante; aotiva, para matar, ou Inibir o crescimento de, um miCrOórganísmÇ que e patogéníco pariá um ser humano ou um animal num local que: nào está ηο!, ou niç é; do corpo humano ou animal. Para esta fim prppofoldUSm também um ma v. ode para matar ou inibir o Çirsise.i®:eu:tdi ide! uiffi tiíiGiroorgâiíisaio que. é patogéníco par*, um ser humanei OU Um aniffiâi num local que não está no, OU não & do corpo humano ou animal.,: o referido método· compreendendo a; adffiinint^içáb. no risfeirido local de. uma composição compreendendo' uma quantidade: eficas de um polipéptido antiíníqrobiauo eompreendendb Bilad: ou uma sua var iante activá., A referida· quantidade eti.ç.ad e uma quantidade que propor;c.1.ona um nível de inibição do ΟΕοηο.Ιαρηρο e/ou morto de um mícroorgani.smo tal que é atingido ura nível detectâve.l de. prevenção ou. supressão de colonização: microbiana. Preferivelmente., a quant idade eficaz do polipéptido antimi.crobíano não é toxica para o indivíduo humano ou animal. Pretende·· se que a referida quant idade eficaz do. polipêptido ant í microbiano sega; êifioani quando, a dmi n í s t r ad a domo parte: de uma composição çompreandeudoi o pol;ipêpf.âdQ antimidrob i ano.

Nestas concretizações entende-se que o polipéptido antimúcrobiano é utilizado coito desinfectante para prevenir o crescimento de, e/ou matar, um microorganismo patogénico num artigo que vai ser ingerido, ou colocado directamente sopre, ou no interior de, um ser humane.) ou animal, ou uma superfície disso necessitada (e. g. uma superfície que pode, directa ou indi rect amente, entrar em contacto com um ser humano ou. animal) de; modo que é reduz ido o risco de: (i) um ser humano ou animal ficar infectado com o referido microorganismo patogéníco; ou (ii) um ser humano ou animal entrar era contacto com uma toxina libertada por um microorganismo patogcnico.

Ern concreti zações preferidas, o polipéptido antímicrobiano é utilizado no interior ou sobre um produto alimentar para jDrevenir o crescimento de um microorgani smo patogéníco para seres humamos/animais sobre, ou no interior desse produto alimentar ou para matar um mi c r o o r gan i s mo patogéní co para seres humanos/animai s; já presente sobre, ou no interior desse produto alimentar. Desta maneira o polipéptido antímicrdbiaho pode ser utilizado para reduzir o r i SCO: de um Ser humánc ou animal ficar infectado com um mi c r o o r gan i s mo pafogini.cõ, ou de Utn: Sér1 humano ou animal ingerir uma toxina libertada: por' um; míoroorganismo patogéní co, em resultado da ingéStáo desse: produto alimentar.. Nestas concretizações pret ére partícula utente que o referido microorgani smo pafoilnícd seja capaz de causar intdxíeáçlo1 alimentar (&>g:. ilrectamente ou por via. de uma. totôna libartada} , fôr produto alimentar entendaiso qualquer substancia: liquida ou sólida destinada ao consumo por razoes nutricionais cu per prazer. A composição compreendendo o: polrpiptidO: antimiorobíano pode: por exemplo ser misturada, com outros componentes do produto alimentar durante: á preparação do: produto alimentar ou pode,: por exemplo, ser aplicada sobre a superfície do produto alimentar (por exemplo: n$, forma de um fíime líquido: cu uma pulverização) . Qs produCoS alimentares particulares: considerados: nestas concretizações' incluem agua, refrigerantes: tais demo sumos de fruta:, bebidas alooõlípsS:,: carne crua, carne: de aves. cozinhada,: oede;, leite,, natas,: felado, queijo, vegetais crus e fruta, alimentos. processados /particularmente relevantes para s:>g. £. tu otalers.e, espécies pategéniças de .SLaghyímmmews, espécies gabogénieaS: de SáXm&mêXlM e éepécies pafÇiÉnieás de Cámp^i0>&a%0M ,: e frutos: secos: # alimentos amiláceos: como pão::»: arfcz: e: batatas (parfleularmente relevante: para espécies patoliaipaa de Aspergillus)· t. :im concretizações preferidas.' alternativas c polipéptido antimidrobiend é utilizado: rç: interior ou sobre. um dispdsitiro ou insftumçntó médico - qualquer dispositivo caldeadQ sopre ou no interior do corpo para. pasMoar uma funglo de diagnosf iro, terapêutica ou cirúrgica *· tal como tecido cOrporai artificial,: marca-passos tpaoeaiatersl, probeees endo vascular esj (sfeúts) suportes (soaifoidsl, válvulas , termómetros>. seringas, agulhas hipodérmirasequipamento de mouitoritáfló:,: ventiladoras, desfibrilhadçres cardíacos, máquinas coração-": pulrnào, unidades de EEG 0: ld©:, disposltivOiS: de ultrassons*: brocas , cerras, canivetes ,: bisturis , escalpelos, tesouras,, grampos e suturas, e similares. Desta maneira. o polipéptido antimicrobianD pode; ser utilizado para preveni): a ínfeeção de um corpo que entra em Córítacto com um: dispositivo ou .instrumento durante um prooeidímento médico.

Im concrer.icações preferidas: alternativas o polipéptido: antimicrobia.no é utilizado na superfície que disso necessita (e. g. uma .superfície que pode;, direeta ou i n d i rect ame n t e, ficar em contacto cora um ser humano ou. animal} . Ά superfície na qual o polipéptido antimicrobian.o pode ser aplicado pode estar localizada no interior de um ambiente onde: (a) vai teu: lugar um exame, um diagnóntie© ou um tratamento médicos; (b) vai ser preparado ou de outro modo manipulado ou armazenado um produto alimentar; (c) vai ter lugar uma lavagem pessoal e/ou higienizaçâo; e/ou: (d) está situada uma pessoa em risco particular de (í) contrair, uma Infecció por um. miorçcrgahliSmc:;' é/du :(:i.i) ser incapaz, dé depurar uma infecçá© microbiana; sem intervenção medica ; :(é exemples destas pessoas estão: 'desofiCcs acima') .

Os ejeraplos destas superfícies incluem qualquer uma no inferi cr d© uma: instalação industrial alimentar e prafelelras/teãn num supermercado; de produtos alimentares. Ά. superfície na guaí © polipéptido antimicrobi.ano pode ser ãplicpdor pode ser um chão ou uma parede; de um edifício (ou um seu compartimento); ou uma superfície de um artigo no interior dç referido compareimendO ou edifício. Gs edifícios; partícuiaree considerados incluem hospitais e outros edifícios de: serriços de sâude, ©sedias e outtos centros de cuidados para crianças, edifícios dei cuidados para idosos, restaurantes e outros locais de alimentação, locais de preparação, p.roçes sãment©· e/ou armazenagem, de produtos alimentares (e.g. merçados, mercearias,, supermercados, e fábricas da indústria alimentar),: o residincias privadas. As dependinolus particulares consideradas incluem todas aquelas no interior de uma instala çaO de cuidados de saúde, especial mente saias de operação, departamentos d© urgência e emergência, unidades de cuidados intensívOS: e enfermarias, assim com© cozinhas, casas de banho;, sanitários, restaurantes e unidades; de prepara ção/p roces sarnento de produtos: al imamares .

Erempios

Kos Epemplos seguintes: BLAD significa; o g 1 i co - o 1 igomero contendo Blad de Qcorriinola natural: compreendendo' o polípêptido Blad de 20 kD, purificado segundo Ramos st ai. (1997) Planta fiflíí,) : 26:-34:: Çégam-S©: as partes. tplânt material and.. growÇE Ç©rdí::fciσ.ns,' e "Purification of prot:eán:S,, da:: seççãç: de Materiais. e Mltodos desse documento..

PeÊiníçdéS: 'Mi.c ~ doncent ração inibidoria Mínima:: a menor :Ooncent:na;çl:0 do1 um antimieroMano que inibe o Crescimento visível de um mi c roorganí smo * MFC/MBC - Gonesutração Fungici.da'/.BáC:t.:e:r.ícida: Mínima: (ou Conosntraçl©; Letal Mínima): ΐ a menor concentração de um agente ant iraiorobiano .nso© ©síria para matar 09)1% d© .inócuío ínioíai apes 24 h num. cenário normal irado de condições

Curvas de morte no tempo - Determinação da "morte" de pm isolado cio longo do tempo eieccuada por' tp oii mals agente:®·· ant.imicrobianoB sob oo:Miçbeç ebntroládis; é eenhéoidP domo o^ método de morte ;no: tempo, fi um mÉtçdo: baseado: nim caldo onde· a tara. de mcbté.: de; um inoculo: flrade1 ê determinada por amostragem da: controlo1 (organismo: , sem fármaco; e tubos çp .frascos contendo: ageíitS: anti microbiano, em determinador Intervalos de bempcç a determinação da contagem de.; colerlas sobreviventes: (ofu/ml) êrpandlndo: cada amostra sobre ama placa do agar,

Eremplo 1 Activldade bacterloida de BLAD-,. MIC e MBC de BLAD para várias espécies bacterianas (utilizando meib ÉS Mue11er-Hinton)*

Bspicle iactérl.an:a 1!C tpi/íiii F BC (pg/ml) PsewÉmmQtt&s ruginpsa 32-256 128-256 Listeria nmmeeyteg&nms 8 > 512 Bãdí J .,1 p;s sub til is 4 > .612 StapbyiõcoGtms aureus 8 > 512 Salmonella iLypbiimmium 64 128

Curvas de morte no tempo para BLAD com (A) Lis ter ia monocytogenes e (B) Pseudomonas aeruginosa: veja-se a Figura 1.

Contra L, m ο η o cy togene s e P. aeruginosa o BLAD é bacteriostático a 100 ug/mi e hacteric.ida a 200 pg/ml.

Dados de halos de inibição para BLAD contra (A) Staphylo cocous auretís, (B) Bacillus Subtilís, (C) Pseudomonas aeruginosa, e (D) Listeria monoeytogenem veja-se a Figura 2. 0 crescimento de todas as espécies bacterianas testadas em PCA foi inibido de forma crescente com quantidades crescentes de BLAD nos discos de tratamento, a partir de 20 pg (discos inferiores à direita) até 100 p.g (discos inferiores à esquerda; e adi 200 (ig (disdos superiores) íincubação cie 24 h - d© ©feito©: foram observado© para vário© dias):.:

Exemplo 2 * ,&©Oibid:ad:©.ciungjòlda de MIC' e MFC de BLAD para espécies de Candida (utilizando Meio RPMI)

Espécie de Cándi:da MIC (ug/ml) MFC (pgfitill

Can di da aMmPMiM 1.6,- 3.2 256 Candí da duMini mtsis 32-64 256 Candidà glMbfafa 1-2 512 C&ndídd lusitániae 32-64 :» 512 Cairdidà. paMapMr'IdMás. 3:2 6 :5:1.2 Cãnáíâa, MdpibaMp 16-32: S 512 MIC e MFC de BLAD para espécies de Candída (utilizando meio PDB a: pH 7,5)

Espêod© de Candi da. MIC (uf/ml) M:FC (pg/isi) Cand ida. àlhi cana 2-4 4-8 Candída ãiMlfniensis 2-4 8 Candida glabrata 2 16-64 Candída lu.sita.neae 2-4 8-32 Candida parapsclbmis 2-4 64 Candída trepicai is 4 4-16 MIC e MFC de BI>AD para vários fungos fi1amento sos (utilizando meio RPMI)

Eepéeie fingipa MIC· Cpg/m il) MFC 1 ípg/ml) Alternaria .sp, m ;C >12 Aspergii1us fumigatus ò * B ll:2 Aspergi 11us niger Botrytis cinerea 32-64 128 > £ 512 >12 >

Col 1 et: otri ch um a cu tu t um 64

Colletctríchim gloesporioides 64 Fusa ri um oxysporum 64 » 512 > 512 » 512 0,25 - 1,0 uy/ml . MB MIC para CfyptgdúCpiiS neofonnans medida a

Curva de morte no tempo (A) e curva de crescimento (B) para BLAD com Candida albicans em meio PDB: veja-se a Figura 3.

Contra C, albicans o BLAD é f ungi st á t ieo a 10 pg/ml e fungicida a 100 pg/ml.

Curva de oresdimento para BLAD com Candida albicans em meio BDB pH 7 t ve j a ·· se a Figura 4 .

Contra C. albimms o BLAD e a anf otericina B são fungistáticos a 10 pg/ml. Á. 100 pg/ml o f .Luconasole meramente retarda o crescimento.

Dados de halos de inibição para (A e B) BLAD e (C) anfotericina B ou fluconazole contra Candida albicans: veja-se a Figura §. O cres cimento de C. albicans em Ãgar de Dextrose de Batata {PDã.) p®:: 7>S foi inibido cora quanfcidades crescentes de ®ii&D nos discos de tratamento, de. 20 pg (A, disco inferior) afi 10 pg (®, disco inferior): até 100 pg ÍB, disco superior) e ati 200 pg (A,: discó; superior) (incubação de 3 dias) . Esta compara-se tiuito :favdpave.lmsn.ts: com a inibição conseguida com 20 pg de .anf éter fcina: :B (C, disco superior) e 25 pg de flpçeUszol© '(C,: diadd inlarior): ;r:

Dados de halos de inibi fio para BLAD contra Cryptococcus neoformmw em (A) PDA O ÍMt PDA pH 7,5 (incubação de 3 dias) ; vcja-se a Figura 6, Ó crescimento de £í, neobormans foi inibido: em ambos os maios, com cpant idades crescentes de BÍLM3 nos discos de tratamento,; embora c©m: maior ©f iode ia. em; PIA:·- l - di scos superiores pg, discos inferiores 10 pg:;: II - discos superiores â esquerda, ii# pg, di scos superiores: ã direits 20 Ui:/ disco inferior 1Ú® ug.

Dados de halos de inibiçlo para BLAD Contra Aspergilius fumigatys em (A) meio de Mueller-Hínton (rule M44-A), (B) pda ou (C.) PDA; pH 7,i: {incubação de: & dias;}:;' veja-se a Figura 72. o painel da esquerda mostra placas: observadas· de cima:·,; o painel: da direita mostra, piabas observadas de baixo. 0 dreací mento· de A, fumÁ^Êtms foi inibido em todos os meios, dom quantidades crescentes de.: blad mos discos: do tratamento* embora com maior m.Bica,cia em PDA: pfí 7,f S; >: I - discos superiores: 2íDÁ pg, distOS: inferiores l.Q: pgΙΪ: ~ discos: superiores â esquerda 50 pg, discos superiores à direita 20 pg, disco inferior 10 Q ug>

Dados de íialdg de inibição para {A e B) BLAD e (C) anfotericina B ou fluconazole contra Aspergillus fumiga bus em PDA. pH 7,5 (incubação de δ dias) ; vagâ-Çe: a Fi gura 8·.. O crescimento do A- fumigatus· em BDA; pH 7,8 foi inibido com. quantidades crescentes de· BLAD nos discos. de crasstenCO:, de. 20 μα |A:, disco: inferior) até 50 pg (B, disco· .inferior) até 1.00 pg ói:,: disco Superior) e. até 200 pg (A*· disco superior) . Isto compara-se muito favoravelmente com a inibição· conseguida com. 10 mg de anfoCerieina· B (C, diso© suporior) e 100 mg de fluconazole (CÇ disco inferior)1Observaram-ne: resultados muito semel. barbes pera Tri chosporon cutanmm (dados não mostrados},

Exemplo 3 ~ Efeito slnérgico de EDTA com Blad em relação a actividade bactericlda/fungicida contra patogénios humanos.

Curvas de morte no tempo para BLAD e/ou EDTA com (A) Lis teria xnanocytogMm&r ÍB) Pseudomonas aeruginosa e (C) Candida albicansi ve j a ·· se a Figura 9 .

Contra L. monccytogenes nem BLAD a 10 pg/ml nem EDTA. a 0,1 mg/ml inibem o crescimento mas uma combinação dos dois é bacteristátiea. Contra P. a&migÊnosM o BLAD a 50 pg/ml ou o EDTA a 1 mg/ml inibem o crescimento (i.e, ambos são bacteri os ta ticos) mas u.ma eômbinaçio dos dois e baotericrida. Contra C. aM&áffans o BLAD a 10 pg/ml ou o EDTA a 0,1 mg/ml inibem o crescimento (i.e. ambos são fungistáticos) mas uma combinação dos dois é fungicida.

Exemplo 4 - Estudo de toxicidade dirmicá de BLAD em porquinhos-da-índia„

Estudo eorfiderdisl realizado: na Faculdade de Medicina Veterinária,. 'Universidade. Técnica de Li sfooa, em: nome: do

Instituto Superior de Agronomia: (1.8 de Julho, 2006 - 1 de

Agosto, 2 006) utllirando o OÊCD- Guideline for test ing of Chemicals, No. 40.2^ Acute Dermal 'ioxieitlA 0 estudo foi conduzido dé acordo com as boas praticas laboratoriais e respeito pelos animais. A toxicidade dormida aguda de BLAD foi avaliada: após exposição: a uma dosé: única eia: porquinhos- da-índia, que: são amplamente aceites Como: animaic adequados para estudos de toxicidade dármica. <3 BLAD foi apliçado na pele glabra em dois grupos dC 10 animais*' com dosagens de 20:0 ug/ml e 400 ug/ml, respectivamefife. Após a exposição:* mantiveram-se: os animais Sob observação durante uti período de IS dias, durante o qual se registaram: a massa ecrporal, a: ímtrbidabe e a mortalidade..

Materiais e Métodos - 1:,: Materiais

Item de testei: O BLAD foi fornecido a 5 mg/ml (líquido Cpaoe: amare lado * 0-4*C) e armazenado a --80°C. .Animais : por quí nhos - da ·· índí a albinos; est í rpe: Dunk in Hart. i ey (UsdPoc: DH) de Har: lan Ibérica, Barcelona.

Numero dé: animais utilizados: .3 0;

Peso corporal: 400-449 g; idade: 6 semanas.

Aloj amenr.o: os animai s foram colocados individualmente em caixas de polietileno com aparas de madeira esterilizadas (Lignocel).

Condi çÕ€;s ambientais: a) Fotoperíodo: ciclos de luz/escuridão de 12 h em 12 h. b) Ambiente cont rolado: uma tempex'atura média de 1S/22 °C e humidade média de 60%. 'Adaptação: os animais fdráít mantidos, sob as condições' ambientais do teste 'durante sete dias antes: do inibi© do teste'.

Alimente:!' Glebai. Diet 201,4Dieta ie.: ianutenção· para loedoras: fornecida por Harlan Ibérica., Bíareeiouat ifUS a d libitura. 2. Métodos

Administração: raparam^se os animais 48: h antes do teste e apenas animais que tinham a pele isenta de lesões foram cons i dera dos no estudo. Aplicou-se uma alíquota de 1 ml {a 200 pg/ml ou 400 pg/mlj na pele rapada de cada animal.

Desenho do estudo: os 30 animais do estudo foram divididos em quatro grupos, dois grupos de dez animais cada um e dois grupos com cinco animais cada um. Um grupo de dez animais foi exposto a BLAD a 200 pg/ml (grupo de teste .i.) e oi.itro grupo de; dez animais foi exposto a BLAD a 400 pg/ml (grupo de t este 2) . Os dois; grupos de cindo an ima is serviram como controlos; um grupo foi exposto a água (aiíquota de 1 ml) enquanto outro grupo hlo foi submetido a qualquer administração: mas foi manuseado eOmo todos OS outros grupos.

Verificações;. após a expôs iOÍ:p:,: Pá animais foram obserrados diariamente durante li diad para (registar quaisquer sinais de: morbidade ou mesmo· morbo> ®m sermo#: da, morbidada foi· dada particular atenção ao ponsifel. ísargimeuto: ie.: lesões ta peie no locai de exposição m possiréiS: sinais de: boxicidads ge:rai:. tale como alterações em 'padrões ÕS c(õmp:0:ftamentÕ: normal. Q; pe-iSo corporal foi individual,mente-: aval lado antes da SXpdSlçlo· e na final, do período de teSte*: iesuitados - Com nenhuma concentração de BLAD houve sinais fS: quaisquer alterações físicas na área da admiiiistraçáo dérmíca. ou alterações nos comportamentos de bebida/âlimentação ou geral. KFió ocorreram reaeçoes adversas ou morte após â admiilistrâÇÉG de BLAD. Q aumento da massa corporal, foi similar em todos os grupos (e. foi consistente com o auíMUto esperado para animais em desenvolvimento com esta .idade "jovem)·,. Gçu:bÍnso.es; ~ o BbAlí em cõncentraçdaç até 400 ug/ml (e possivelmente superiores) ||o apresenta toxicidade dêrmica.

Exemplo G - Estudo de toxicidade oral: de BEAD em ratos albinos.

Estudo confidencial. realizado na Baduldáde de Medicina veterinária, Universidade Técnica de ΒίρΡο#.:, eia nome do .Instituid: Superior :de Agronomia, ntiliaa:ni:0: o GECU Guideiine for feéafcing' of ebsffiícals, No. 4:01 Acuiei Õrál Toxicity. O estudd foi conduzida de a.c:Çrdd: com aç boas práticas Isbdraidrla.is e respeito^ pel os animais, É toxicidade oral aguda de BLAD foi avaliada após eapOaiglO a urna dose única em ratos, que são amplamente aceites como· animais adequados para estudos de toxicidade oráI, § BÍAD fói administrado por gavagem em dois grupos de 1:0 animai# cada um:, com dosagens de 200 iig/ml e 40 0 ug/ml, respectiyamenteApós a exposição, os animais foram mantidos sob observação durante um período cie 15 dias, durante o qual se registaram a massa corporal, a morbídade e a mortalidade. Após o período de mbsereação os animais foram submetidos a eutanásia e necropsia.

Materiais e Métodos -I. Materiais

Item de teste: o BLAD foi fornecido a I mg/ml (líquido opaco amarelado, 0-4':C) e armazenado a -80CC.

Animais: Rattxxs norvegicus, estirpe: listar Hannover, adquirida pelo biotério da Faculdade de Medicina Veterinária de Lisboa a Harlan ibérica, Barcelona. Número de animais utilizados: 30; Bésd corporal; 2 50-300 g; idade; 10 semanas.

Aloj amento: os animais foram colocados ilidi vidual mente em caixas de polietileno com aparas de madeira est eri1i zadas (Lignoeel).

Condições ambientais: a) fõtoperíodoí ciclos de lut/esodrídão: de 12 h em 12 h. bj Ambiente controlado:; uma temperatura media de li/22o::C e humidade média: de 60%.

Adaptação: os animais foram, mantidos sob ao condições: ambientais do teste durante sete dias antes dd início do beste.

Alimentò Global Da et 2:0i4:f Dleba· ds flãnu tenção para ibadores fornecida por Harlan Ibérica, Barcelona/ Égua ad MM. atum>: 2 , ilhodds

Administração: aplicOU:uma a.l íquota de 1: ml (a 200 pg/mi; ou 40D: ug/mil em cada; animal por intubação orai iíoro^esoflgioei , vulgarmeritc conhecida por gavagem. A administração foi realizada com uma sonda metálica apropriada para a espécie: de animal utilizada. Os animais foram submetidos a jejum durante 18 h antes da adruí ni s tração m alimentados 3 h. após a administração..

Desenho do estudo: os 30 arrimais do estudo foram divididos. em quatro grupos, dóis grupos de des animais cada um éi dois grupos com cinco animais cada um. Urn grupo de dez animais foi exposto a BLAD a 200 pg/ml {grupo de teste 1) e outro grupo de dez animais foi exposto a BLAD a 4 00 ug/ml (grupo de teste 2). Os dois grupos de cinco animais serviram como canitoiõs? um' grupo foi. exposto· & igua· (alíquota de % mi): enquanto 0: outro grupo não foi. submstidp a qualquer* administração: maS: foi manuseado comó; todos ós· outros: grupos., ¥eri'f ioaçdeS: : após a administração: os ãuiiãis· foram observados diariamente· durante: lã dias. para. registar" quaisquer sinais de morbidade ou mesmo morte.. Q: peso corporal foi individual mente avaliado antes dã exposição e. no final do período de teStt:.: -Após o^ período de observação os: animais foram submetidos a eutanásia (por asfixia numa atmosfera

posL saturada com. dióxido de carbono) para: subsequente exame mortew.

Resultados -

Em nenhuma concentração de BLAD houve sinais de quaisquer alterações físicas ou alterações nos comport ament os de bebida/álimentaçaõ ou geral. Mão ocorreram reacções adversas ou morte: ãpõis a admi n i s t r aça o de BL.AD, 0 aumento de massa corporal: foi similar em todos os grupos (e foi consistente com o aumento: esperado para: animais em desenvolvimento com esta idade jovem), A ;! e. c r óp s i a / ob s e. rva ç ão mac r o s cõp i c a dos órgãos da cavidade torácica e ãbdçminal r eva1ou ausência de alterações.

Conclusões - o :lbAS; em CQncfentrãções até 4 0 0 μα/ml (e possivelmente superioras;} não apresenta toxicidade ora 1.

DE; SEQUÊNCIAS <11Q> Bidfecúçldgia das Plantas, 3.R. <120> Irdteíná ant imi crob:i an.a <'lá'0> 4 í 170> Patentln versiçn 3.5 <2l0> 1 <2 Ί1> 1791

<.T1.2> ADN <2 Ί 3 > Lupinus a 1 bus <4 00 > 1 gatggcgatg aatgaacact gcgtttgctg fcaatcaaata tgggfcaagafc gagagtgagg gfcâfcfeeefcca tggeagtgte aattggtatt categagaggc ctgaggaaag agaacaagag agtagaággg aagagagaga gcaagagcaá eãgagfeggtt atgagaggag acaataccat saagaafiaae aacaaggfctc tccctcatac agctctcaaa gãtrcíeataac tctttaGaaa gsrtítgatga aaatcgagtg caacctaata rtfcecáacgt tagtgfctggt actãggaãta gcttatggag aaaaagatgt gcfeaaagagt gagtggcaac ctaggagaca acgacotcaa gagcagggtt ctccctcata cccaGgcãgg gagaggagtg agcagaggga agagagagag teaegfcâgac âããggaâGeç tfcafccactte aataggaatg gcaaaatccg tgtgctGgag 60 120 180 240 300 360 420 480 3 9 sggtfcfcgace

C a â t C 3 ci cL a C gtactcaatg éfefegagtatg gatgacaacc fctttafcgatt aggaagaeí®. gggaatgagg gacgaggggg esat:Gt:tcat gagcegáfe&i caagttcagg ttgcçácact fcatgaaetgg gaagaagtga ggt:feà:fe;egaá. gctgatgaaa gatagageag esaaa eeaas agfcgagaagg actaagctgt ataaaactaa aaagasiceáa: gfca&GGgtgii gtagagGcag gçga:fegg:fee;tei agaagcttag: tatatcaatc tíágaggcêac afcgagcaaga

Ggatagtgafc eaggaaaaga atfccaaaçaa atfctgaatat ataactcaaa taggfeafcteg taâggfcatag 1 tt-^catcaa asçaga^aa fcgaatgagct aaeagtsGfca: agggaaggcg ttfcaaaagst: agttggaccfc cagacttgag cattctccct aacca.cgaca cagâatççea agtagtcaag gagtact.aaa

Gtteaafcaet atatgaggaa agfetteaagg caaaccctct gtxafcgggãac ctcfeetcaec ggccatafeat agateáâçaa tgetagafcta ÈgçijtégitGa tttcctegea cacattccct ctfetgeaaat fcggaagaagg áctatcatgt ttgtaçtaat aatctccaaa aaaçaPGifeg' gfcaaaeieicítsg gefcggaitéaâ. ctcgcaafcac gaccaagaat cgttafcgaaf caaa.ggcgtg aaaeagateeé gattctggec ttctatgaaa tatataaaaa gfcagtcgfcgg cgacaacaag tcagaaggtg aatGtfccgct ggttctaaag ggttctgcfcg ggtcagcctc ggttcatctc aagagctcat aatgttaata actaccgcat atgctgacta atagaagaca cttcatafcafe :eea:fcça»eaa cctacttcag ggciaagagca: áaaáattgáe ;eet;Scaae:tfc: fceagfcgeágá: ttaacgaggg ttgatgaagg áàgageaaga acatttttgt tgcttggatt acaatgtgat aagatattga aacaacaaca ttccatttfcg agtgagctac aaaaaaaaaa tg:ttgagfc;te cg%eg:fcegÈfe; agGatataae: ccttaacecg tGetggetac feggátifcçagc .gatfcatfcifcta gagcgaccaa saaseaegéit gaga age aafc Èagáaaceefc agGtfctgttg agaaggaaafc agagaaagag aafctccagca tggcafecaafc. aaggcagtta gagattaatc acaacaacaa agcacttttt fcgagagaata a 540 SOO 660 720 780: 840 900 pi 1020 1080 1:1:40 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1791 <210 > 2 <211> 533

<212> PRT <213 > Lupinus albuy < 4 0 0 > 2

Vai Leu Vai Leu Gly 15

Met Gly Lys Met Arg Vai Arg Phe Pro Thr Leu 1 5 10

Ile Vai Phe Leu Met Ala Vai Ser lie Gly 20 25

Ile Ala: Tyr Gly Glu Lys 30 40

Asp Vai Leu Lys Ser His Glu Arg Pro Glu Glu Arg Glu Gin Glu Glu 35 40 45

Trp Gin Pro Arg Arg Gin Arg Pro Gin Ser .Arg Arg Gin Glu Arg Glu 50 55 " 60

Gin Glu Gin Glu Gin Gly Ser Pro Ser Tyr Pro Arg Arg Gin Ser Gly 65 70 75 80

Tyr Glu Arg Arg Gin Tyr His Glu Arg Ser Glu Gin Arg Glu Glu Arg 85 90 95

Glu Gin Glu Gin Gin Gin Gly Ser Piro Ser Tyr Ser Arg Arg Gin Arg 100 105 110

Asn Pro Tyr His Phe Ser Ser Gin Arg P6e Gin Thr Iieu Tyr Lys Asn 115 120 125

Arg Asn Gly Lys IIe Arg Vai Leu Glu Arg Phe Asp Gin Arg Thr Asn 130 135 140

Arg Leu Glu Asn Leu Gin Asn Tyr Arg Ile Vai Glu Phe Gin Ser Lys 145 150 155 160

Pro Asn Thr Leu Ile Leu Pro Lys Sis Ser Asp Ala Asp Tyr Vai Leu 165 170 175

Vai Vai Leu Asn Gly Arg Ala Thr Ile Thr Ile Vai Asn Pro Asp Arg 180 185 190

Arg Gin Ala Tyr Asn Leu Glu Tyr Gly Asp Ala Leu Arg Ile Pro Ala 195 200 205

Gly Ser Thr Ser Tyr Ile Leu Asn Pro Asp Asp Asn Gin Lys Leu Arg 210 215 220

Vai Vai Lys Leu Ala Ile Pro Ile Asn Asn Pro Gly Tyr Phe Tyr Asp 225 230 235 240

Phe Tyr Pro Ser Ser Thr Lys Asp Gin245

Gin Ser Tyr Phe Ser Gly Phe 250 255

Ser Arg Asn Thr Leu Glu Ala Thr Phe Asa Thr Arg Tyr Glu Glu Ils 260 265 270 4%

Gin Arg lie 1:1 e Leu Gly As» Glu Asp Glu Gin Glu Tyr Glit Glu Gin 275 2&0 285

Arg 4rg Gly Gin Glu Gin Ser Asp Glu Asp Glu Gly Vai Ile Vai Ils 290 295 300

Vai Ser Lys Ly:s Gin :í!e Gin Lys. Leu Thx· Lys Kis Ala. Gin Ser Sex· 305 310 315 320

Se* Gly Lys Asp Lys Pro Se*: Asp Ser Gly Pro Phe Asn Leu Arg Se* 325 330 33|

Asn Glu Pro Ile Tyr' Ser Asn Lys Tyr Gly Asn Phe Tyr Glu Ile Thr 340 345 350

Pro Asp Arg Asn pró: Gin Vai Gin Ml :3f0:

Leu Asn Ile Ser Leu Thr Tyr 3:6:5

Ile Lys ile Asn Glu Gly Ala· Leu Leu Leu Pro· HLs Tyr" Asni Ser Lys 370 375 380

Ala Ile fyr Vai Vai Vai Vai Asp Glu Gly Glu Gly Asn Tyr Glu Leu 385 390 395 400

Vai Gly Ile Arg Asp Gin Gin Arg Gin Gin Asp Glu Gin Glu Glu Lys 405 410; 415

Glu Glu Glu Vai Ile Arg Tyr Ser Ala Arg Leu Ser Glu Gly Asp Ile 420 425 430

Phe Vai Ilé Pro Ala Gly Tyr Pro Ile Ser Ile Asn Ala Ser Ser Asn 435 440 445

Leu Arg Leu Leu Gly Phe Gly Ile Asn Ala Asp Glu Asn Gin Arg Asn 450 455 46:0

Phe Leu Ala Gly Ser Lys Asp Asn Vai Ile Arg Gin Leu Asp Arg Ala 465 470 475 480

Vai Asn Glu Leu Thr phe Pro Gly Ser Ala Glu Asp Ile Glu Arg Leu mS 490: 496

Ile Lys Asn Gin Gin Gin Ser Tyr Phe Ala Asn Gly Gin Pro Gin Gin 500 505 510 42

Gin Gin Gin Gin Gin Ser Gin Lys Gin Gly Arg Arg Gly Arg Arg Gly 515 520 525

Ser Ser Leu Pro Phe 530 < 210 > 3 <211 > 51:9

<212> ÃDM <213 > Lupinms albuM <4Q(1> 3 cgtagacaaa ggaaccsffca Èssetteagc· hereaAhgah tccaaactct fefeaeaaaaafc aggaatggoa aaatcegogh gctegagagg gaaccaatag acttgagaat etécaaaaet açegcahfegfc; rgag-fcfcççaa tcaaáaccta aeacfcefccat tctcoctaaa cactctgatg ctgachaegfc: eotegfctgfca ctca&tggta gagecacaat cacgatagtia aaffisefcgafca. gaagacaagc afcataaecth gagtatggcg atgctctcag aatcccagct ggefcehhhhh cstatatcct fcaaeccggat gacaaccaga agcttagagt agteaaggÈé: geaStaehea téaacasrçG tggctacttt fcafcgâtttct atccatcgag tactaaagac tóaaéaatógt ãçhréagfcgg: cfcrgsgfhagg asesertrag1 aggegagefch caafcactegfc tatgaagaga tacaaaggat hahhfcteaggg aatgaggat <210> 4 <211 > 173

< 212 > PRT <213 > Lupinua nlbus <4 00 > 4

Arg Arg Gin Arg Asn Pro Tyr His Phe Ser Ser Gin Arg Phe Gin Thr 1 ’ 5 10 15

Leu Tyr Lys Asn Arg Asn Gly Lys Ile Arg Vai Leu Glu Arg Phe Asp 20 25 30 .....

Gin Arg Thr Asn Arg Leu Glu Asn Leu, Gin Asn Tyr Arg Ile Vai Glu 35 40 45

Phe Gin Ser' Lys Pro Asn Thr Leu Ile Leu pra Lys His Ser Asp Ala 50 55 50

Asp Tyr Vai Leu Vai Vai Leu Asn Gly Arg Ala Thr Ile Thr lie Vai 55 70 7 5 80 m 120 .180 240 300 36:0 420 480 519

Asn Pro Asp Arg Arg Gin Ala Tyr Asn Leu Glu Tyr Gly Asp Ala Leu 85 90 S5

Arg lie Pro Ala Gly Ser Thr Ser Tyr Ile Leu Asn Pro Asp Asp Asn 100 105 110

Gin Lys Leu Arg Vai Vai Lys Leu Ala Ile Pro Ile Asn Asn Pro Gly 115 120 125

Tyr Phe Tyr Asp Phe Tyr Pro Ser Ser Thr Lys Asp Gin Gin Ser Tyr 130 135 140

Phe Ser Gly Phe Ser Arg Asn Thr Leu Glu Ala Thr Phe Asn Thr Arg 145 150 155 160

Tyr Glu Glu Ile Gin Arg Ile ile Léu Gly Asn Glu Asp 165 170 iií sboa, 2 010 · 10 -12

Claims (12)

1. REÍVINDI CAÇOES 1. Composição caracteri zada por compreender um pol ipépt i do ant imi c r ob i ano c omp r e enden do Blad ou uma sua variante activa para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia ou profilaxia. 2. C ?ompo sição de aco i rdo com a reivindicação 1 caracteri z.= tda por se destinai a utilização num método de tratamento ou prevenção de .ima infecção num, ou de i. im, indivíduo, por um microorganismo.
2. 3 . Composição de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 ©araeterizada por adicionalmente compreender Uíf transportador ou diluente farmaceut.icamenf.e aceitáveis.
3. 4. Composição reivindicações I compreender um agente 5. Composição rsivindiçaçiep 1 a caracterizada por comprometi do ou esta de acordo com 3 caracteri zada queXante. de acordo com 4 para utilização indivíduo ter um criticamente doente qualque.r uma das por adieianalmente qualquer uma. das no referido método sistema imunitário
4. 6. Utilização caracterizada por se utilizar uma composição cQtpreende;sdo: um pol ipeptido ant í m:i c rofo lano compreendendo Blad ou. uma sua variante a ativa para matar, ou inibir o crescimento de, um microorganísrno que ê patogénico para um ser humano ou um animal, num local que não c no, ou d©,: corpo humano ou arrimai.
5. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6 carácterizada por a referida composição ser utilizada para desinfectar, ern relação a um rnicroorganisrno patogénico para seres humanos ou animais, um artigo que vai ser ingerido, ou colocado directamente sobre, ou no interior de, um ser humano ou animal;, ou uma superfície que; disso necessita.
6. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 7 caracterizada por o referido artigo ser um: produto alimentai ou. um inatrumento ou dispositivo médicos. fU Útilizaçao de acordo ca a reivindicação 7 caracterfjada. por a. referida superfiçis estar Iççaliiada no interior de ura ambiente onde; |a) va.i ter lugar um: exame, um diagnóstico: ou ura tratamento médicos: ; |bi vai' ser preparado ou de outro modo manipulado· ou armazenado ura; produto alimentar^ (cl Vai· ter lugar uma lavagem pessoal s/ou hi g i enísagac; e/ou (d) esta. situada, uma. pessoa, em risco particular de [il contrair' uma infecçã;© por ura. mi.crooriaui:agto.; .e/ou fii ) ser incapaz de deputar unia inf eGÇio: raicrobi ar:a sem intervenção midioá:»: 10*: IItil inação de acordo cora; qu:ãiqme.r uma das· .reivindicardes 6. a 3 caracteriçada per a referida, composição adicionalraente. compreender um agente guelante-
7. 11, Composição de acordo cora, gaãiqaer uma das reáviudioaçdes 2 a S* ou utilização de. acordo com qualquer uma da s reivindicações & a IÕ, caracteriradas por o microorganismo ser uma bactéria ou um fungo:,
8. 13, Composição ou utilização de acordo com a reivindicação 11 e a r a c t e r í z a d a s por a bactéria ser uma espécie patogéniea de um dos seguintes géneros: Pseudomonas, Listeria, Bacillus, Staphylococcus e Salmoxiella.
9. 13. Composição ou utilização de acordo com a reivindicação 11 oaracterizadas; por o: fungo; ser uma espécie patogénica de um doa seguintes géneros: Candida, Aspergi 11us, Alternaria, Fusaríum, Cryptoeoccus e Triehosporon.
10. 14. Composição ou utilização; de acordo com a reivindicação 13 c a rac t e r i z ada s por o fungo poder causar infecção fúngica, invasiva, preferivelmente Candida alhicans, Aspergi i 1 us fumigapns ou Aiternaria ml terna ta,
11. 15. Método de. tratamento de um ser humano ou animal oara.ot.erizado por compreender a administração a. um indivíduo 3/3 disso necessitado de uma composição compreendendo uma quantidade t erapeuticamente eficaz de um polipéptido antimicrobiano compreendendo Blad ou uma sua variante activa.
12. 16. Método de prevenção ou tratamento de uma infeccão por um microorganismo caracterizado per compreender a administração a um. indi vldao: dissd necessitado de uma composição compreendendo uma quantidade terapeuticamenfcé; eficaz de um polipéptid©: antimicrotiiand: compreendendo Blad ou uma sua varianté: activa:.: 1/.. Método para matar, ou inibir o crés cimento: de:, um mi oro organismo que é patogénico: para um eer Úumano: ou um animal num .local que nao é no, ou do;, corpo humano Ou animal, earaetéplzadO' por o: referido: mi todo compreender a admí ni st:r açiip ao referido local de uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um polipiptido antímicrobiâuD compreendendo: Blad ou uma sua: variante activa. Li sfooa, 2 01X- õ1~21