KR20200050923A

KR20200050923A - 파필리오신을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20200050923A
Application number: KR1020200052379A
Authority: KR
Inventors: 김양미; 전다솜
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2020-04-29
Filing date: 2020-04-29
Publication date: 2020-05-12

Abstract

본 발명은 파필리오신을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 파필리오신은 패혈증 동물 모델에서 패혈증에 의한 생존율을 증가시키고, 간 및 신장 독성 수치, 염증성 사이토카인의 생성, 체내 패혈증 원인 세균 및 내독소를 감소시키며, 염증 세포 침윤을 억제하는 우수한 효과를 가지므로, 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료에 유용하게 활용할 수 있다.

Description

파필리오신을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물{COMPOSITION COMPRISING PAPILIOCIN FOR PREVENTING OR TREATING SEPSIS OR SEPTIC SHOCK}

본 발명은 파필리오신을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

넓은 의미로서 면역반응으로 불리는 항원 항체 반응은 인간을 포함한 무척추 동물에 있어서 생체방어의 주된 역할을 해 왔다. 그러나 곤충이나 양서류는 항원 항체반응과 같은 후천적 면역기구와는 다른 선천적 면역기구를 강화하는 것으로 자신을 보호하고 있다. 이와 같이 선천적 면역은 곤충, 양서류뿐만 아니라 사람을 포함한 척추동물에 있어서도 초기감염에 대해 중요한 방어계로서 역할을 하고 있다. 선천적 면역기구의 아주 중요한 수단은 다양한 미생물에 대해 살균, 불활성화작용을 가진 항균펩타이드를 획득한다는 것이다. 최근 들어 항생제 내성문제가 심각해지면서 이러한 항생 펩타이드를 이용한 새로운 신약 후보 물질에 관심이 늘어나고 있다. 항생 펩타이드는 세균의 막을 타겟으로 하여 항균활성을 가지므로 기존 항생제에 내성을 가진 균주에 대해서도 활성을 유지하는 특징을 가지는 것으로 보여진다. 그러므로 다양한 천연 유래한 항생 펩타이드는 내성 균주의 출연으로 위협받고 있는 기존의 항생제를 대체할 새로운 개념의 항생제 탐색에 중요한 생물자원으로 각광받고 있다. 현재까지 발견된 곤충의 항균단백질 및 펩타이드는 Boman 박사 연구팀에 의해 세크로피아나방에서 세크로핀이 최초로 보고된 이래 약 200여종이 곤충으로부터 분리되었는데 이들은 구조와 크기에 따라 크게 세크로핀류, 디펜신류, 플로린 및 글리신 아미노산을 많이 포함하고 있는 펩타이드로 나눌 수 있다. 세크로핀류는 31 - 39개의 아미노산으로 구성된 염기성 단백질로, 그 예로서 최근 본 발명자들이 발굴한, 호랑나비 유충으로부터의 분리된 항균펩타이드 파필리오신이 있다. 파필리오신은 용혈화성이 낮고 포유류세포에 대한 독성이 매우 낮으며 박테리아의 세포막을 타겟으로 하여 항균활성을 나타내며, N-말단의 양친매성 나선구조와 C-말단의 소수성 helix를 포함한 α-helix-hinge-α-helix 구조를 가지고, 다양한 병원균과 내성균주에 뛰어난 항균활성 및 항염증 활성이 있다. 특히 그람음성균에 선택적으로 우수한 항균활성을 가지며 독성이 낮다. 또한, 파필리오신의 N-말단의 helix 구조를 가지는 영역이 항균활성에 중요한 역할을 하며 두번째 잔기인 트립토판이 항균, 항염증 활성에 중요함을 규명한 바 있다.

한편, 패혈증은 세균 감염이나 외상적 충격 등으로 인체 면역시스템이 교란되어 지나칠 정도로 강한 면역 비상체제를 가동함으로써 생기는 일종의 '과다면역반응'이다. 주로 면역억제를 유도하는 치료제의 투여 및 화상 또는 내장 파열 등으로 세균이 혈관 또는 세포의 내부로 침투하여 일어나며 (Cohen J. The immunopathogenesis of sepsis. Nature. 2002; 420: 885-91.), 그람 양성 세균 및 그람 음성 세균에 의해서 유도될 수 있다. 그람 양성 패혈증의 경우 세균이 계속 생존하면서 세포 내부에서 증식하는 것과는 달리, 그람 음성 패혈증은 그람 음성 세균 또는 그의 세포벽 구성성분의 일종인 내독소가 1차의 감염소에서 혈중에 과도하게 침입하여 순환기계를 통해 전신으로 퍼짐으로써 발생하게 된다. 혈류로 침입한 내독소는 우선 내독소 접착단백질(endotoxin binding protein)과 결합한 다음, 생체내의 대식세포, 호중구, 임파구 등의 염증세포 및 혈관내피세포를 자극하여 종양괴사인자(tumor necrosis factor)를 포함하는 다양한 염증성 사이토카인을 생성한다. 그람 음성 패혈증의 임상적 발현으로는 현저한 사이토카인의 증가로 인해서 다장기장애(multiple organ dysfunction syndrome: MODS)를 일으키고 그 결과 사망을 초래하게 된다. 특히, 그람 음성 세균에 의한 패혈증(Gram-negative sepsis)은 병원의 중환자실에서의 주된 사망 원인중의 하나이며, 그 빈도가 세계적으로 계속 증가하는데 이는 침투경로의 빈도증가와 면역억제로 이어지는 치료에 기인된다. 흔히 패혈증은 패혈성 쇼크(Septic shock)로 발전하게 되는데 이는 감염을 동반하는 전신성 염증반응증후군(systemic inflammatory response syndrome)으로 정의된다 (Bone RC. The pathogenesis of sepsis. Ann. Intern. Med. 1991; 115: 457.). 패혈증 쇼크는 치사율이 45%에 이르러 중환자실에 입원한 환자들의 생명을 위협하는 가장 흔한 원인이 되기도 한다. 패혈성 쇼크 환자들은 발열, 혈압저하, 심근 억제, 탈수, 급성 신부전증 및 호흡정지 등의 증상을 동반한다. 패혈증으로 수반되는 높은 이환율 및 치사율은 대식세포 및 단핵세포로부터 전염증성 사이토카인(proinflammatory cytokines) 인자 분비를 자극하는 세균성 내독소에 의하여 부분적으로 기인하다. 그람 음성 세균 외막의 리포폴리사카리드(Lipopolysaccharide; LPS)은 대식세포를 활성화시키고 내독성 쇼크 (endotoxic shock) 도중에 상당한 양의 전염증성 사이토카인 및 일산화질소(NO) 자유 라디칼 (free radical)의 일련의 분비를 촉진시킨다. 패혈증은 발견되는 시기에 따라서 그 사망률이 23%에서 46%까지 보고되는 심각한 질환이며 많은 경제적 부담을 증가시키는 질환으로 보건정책의 난제로 알려져 있다 (Dellinger RP:Cardiovascular management of septic shock. Crit Care Med 2003; 31: 946-55; Osborn TM, Tracy JK, Dunne JR, Pasquale \M, Napolitano LM: Crit Care Med 2004; 32: 2234-40; Angus DC, Linde-Zwirble WT. Lidicker J, Clermont G, Carcillo J, Pinsky MR: Crit Care Med 2001; 29: 1303-10). 패혈증은 비 심혈관계 중환자실 사망의 가장 흔한 원인으로 미국에서는 최소한 연평균 75만 명의 새로운 환자가 발생하며, 그 중 50%가 패혈성 쇼크로 진행되고 그 절반 정도인 20만명이 사망한다 (Martin GS, Mannino DM, Eaton S, Moss M: N Engl J Med 2003; 348: 1546-54.).

의학기술의 발전에도 불구하고, 최근 다양한 항생제에 대한 내성을 갖는 병원균이 점차로 증가하는 현상과 관련하여, 패혈증의 치료가 매우 중요한 문제로 대두되고 있다. 특히 항생제 내성을 가지는 그람음성균 감염이 급증하면서 항생제만으로는 효과적인 치료를 할 수 없어 새로운 패혈증 치료제의 개발이 시급하다. 본 발명자들은 상기와 같은 요구를 충족시키기 위하여 천연의 항균펩타이드인 파필리오신이 박테리아 감염에 의한 패혈증을 치료 또는 예방할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명자들은 파필리오신(papiliocin)이 패혈증 동물 모델에서 예방 및 치료 효과가 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다

따라서, 본 발명의 목적은 파필리오신을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다

아울러, 본 발명의 목적은 파필리오신을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 파필리오신을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 파필리오신을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 파필리오신은 패혈증 동물 모델에서 패혈증에 의한 생존율을 증가시키고, 간 및 신장 독성 수치, 염증성 사이토카인의 생성, 체내 패혈증 원인 세균 및 내독소를 감소시키며, 염증 세포 침윤을 억제하는 효과가 우수하므로, 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 E. coli K1 감염에 의한 패혈증 쇼크 마우스 모델에서의 파필리오신 처리에 의한 생존율 향상 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 패혈증 쇼크 마우스 모델에서의 파필리오신 처리에 의한 간 (AST 및 ALT) 및 신장 (BUN)의 손상 개선 효과를 확인한 도이다.
도 3은 파필리오신 처리에 의한 패혈증 쇼크 마우스 모델의 혈액에서의 염증성 사이토카인 (TNF-α 및 IL-1β)의 발현량 억제 효과를 확인한 도이다.
도 4는 파필리오신 처리에 의한 패혈증 쇼크 마우스 모델의 폐에서의 염증성 사이토카인 (TNF-α 및 IL-1β)의 발현량 억제 효과를 확인한 도이다.
도 5는 파필리오신 처리에 의한 패혈증 쇼크 마우스 모델의 폐, 간 및 신장에서의 E. coli 총균수 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 파필리오신 처리에 의한 패혈증 쇼크 마우스 모델에서의 혈액 내 LPS 검출량 감소 효과를 나타낸 도이다.
도 7은 파필리오신 처리에 의한 패혈증 쇼크 마우스 모델의 폐 조직에서의 염증 세포 침윤도 변화를 확인한 도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

일 측면에서, 본 발명은 파필리오신(papiliocin)을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 파필리오신은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

일 구현예에서, 패혈증 또는 패혈증성 쇼크는 그람 음성 세균의 감염에 의해 유발될 수 있다.

일 구현예에서, 그람 음성 세균은 엔테로박터 속(Enterobacter sp.) 세균, 살모넬라 속(Salmonella sp.) 세균, 비브리오 속(Vibrio sp.) 세균, 마이코박테리움 속(Mycobacterium sp.) 세균, 시겔라 속(shigella sp.) 세균, 슈도모나스 속(Psedomonas sp.) 세균 및 대장균 속(Escherichia sp.) 세균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으며, 대장균 속 세균은 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli), 에셰리키아 알버티(Escherichia albertii), 에셰리키아 블라태(Escherichia blattae), 에셰리키아 페르구소니(Escherichia fergusonii), 에셰리키아 헤르마니(Escherichia hermannii) 및 에셰리키아 불네리스(Escherichia vulneris)로 이루어진 군으로 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 살모넬라 속 세균은 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)일 수 있으며, 슈도모나스 속 세균은 슈도모나스 에루지노사(Psedomonas aeruginosa)일 수 있고, 비브리오 속 세균은 비브리오 불니피쿠크(Vibrio vulnificus)일 수 있다.

일 구현예에서, 파필리오신은 패혈증에 의한 체내 내독소(endotoxin)를 감소시키는 것에 의하여 패혈증 또는 패혈증성 쇼크를 예방 또는 치료할 수 있다.

일 구현예에서, 파필리오신은 체내 패혈증 유발균에 대한 항균 활성을 가지는 것에 의하여 패혈증 또는 패혈증성 쇼크를 예방 또는 치료할 수 있다.

일 구현예에서, 파필리오신은 패혈증으로 인한 장기의 손상을 억제하는 것에 의하여 패혈증 또는 패혈증성 쇼크를 예방 또는 치료할 수 있다.

일 구현예에서, 파필리오신은 그람 음성 세균에 의한 패혈증 또는 패혈증성 쇼크 유발 전/동시/후에 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분으로서 파필리오신 이외에 공지된 패혈증 또는 패혈증성 쇼크 치료제를 추가로 포함할 수 있고, 공지된 다른 치료와 병용될 수 있다.

본 발명에서, 용어 "예방"이란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 본 발명의 파필리오신, 또는 약학적으로 허용가능한 이의 염, 또는 이를 포함하는 조성물의 투여로 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다. 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 대한의학협회 등에서 제시된 자료를 참조하여 본원의 조성물이 효과가 있는 질환의 정확한 기준을 알고, 개선, 향상 및 치료된 정도를 판단할 수 있을 것이다.

본 발명에서 유효성분과 결합하여 사용된 "치료학적으로 유효한 양"이란 용어는 대상 질환을 예방 또는 치료하는데 유효한 양을 의미하며, 본 발명의 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 환자의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 발병 원인, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여, 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용가능한"이란 상기 조성물에 노출되는 세포나 인간에게 독성이 없는 특성을 나타내는 것을 의미한다. 상기 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 경구형 제형, 외용제, 좌제, 멸균 주사용액 및 분무제를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제형일 수 있으며, 경구형 또는 주사 제형이 더욱 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 용어, "투여"란, 임의의 적절한 방법으로 개체 또는 환자에게 소정의 물질을 제공하는 것을 의미하며, 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 주사 제형으로 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 조성물의 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 통상적으로 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 다양한 부형제, 예컨대 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 함께 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 본 발명의 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다. 바람직한 투여방식 및 제제는 정맥 주사제, 피하 주사제, 피내주사제, 근육 주사제, 점적 주사제 등이다. 주사제는 생리식염액, 링겔액 등의 수성 용제, 식물유, 고급 지방산 에스테르(예, 올레인산에칠 등), 알코올 류(예, 에탄올, 벤질알코올, 프로필렌글리콜, 글리세린 등) 등의 비수성 용제 등을 이용하여 제조할 수 있고, 변질 방지를 위한 안정화제(예, 아스코르빈산, 아황산수소나트륨, 피로아황산나트륨, BHA, 토코페롤, EDTA 등), 유화제, pH 조절을 위한 완충제, 미생물 발육을 저지하기 위한 보존제 (예, 질산페닐수은, 치메로살, 염화벤잘코늄, 페놀, 크레솔, 벤질알코올 등) 등의 약학적 담체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 상기 패혈증 또는 패혈증성 쇼크가 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환들을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 치료제와 병행하여 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일 측면에서, 본 발명은 파필리오신을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 파필리오신은 동물에 대한 독성이 거의 없으므로, 식품 조성물로 이용이 가능하다.

본 발명의 조성물을 식품 조성물로 사용하는 경우, 상기 파필리오신을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상의 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 조성물은 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 유효성분의 혼합량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 통상의 기술분야에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 통상의 기술분야에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 본 발명의 건강기능식품은 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 개선 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.

또한, 본 발명의 조성물이 사용될 수 있는 건강식품의 종류에는 제한이 없다. 아울러 본 발명의 파필리오신을 활성성분으로 포함하는 조성물은 당업자의 선택에 따라 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조 성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림 류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 항생 펩타이드 합성

파필리오신 펩타이드는 N-(9-플루오레닐)메톡시카보닐(N-(9-fluorenyl)methoxycarbonyl; Fmoc) 합성법을 사용하여, 고체상 합성법으로 펩타이드를 합성하고 이를 정제하였다 (Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes 1798.10 (2010): 1913-1925). 그 후, 합성한 펩타이드의 농도를 UV 분광광도계를 사용하여 정량하였고, 최종적인 펩타이드의 순도를 역상 고성능 액체크로마토그래피(Reverse-phase HPLC)로 분석한 결과, >98%의 순도를 나타냈다.

펩타이드 명칭	아미노산 서열 (-NH₂)	서열번호	net charge
papiliocin	RWKIFKKIEKVGRNVRDGIIKAGPAVAVVGQAATVVK	1	+8

그 결과, 서열번호 1 아미노산 서열로 구성된 항균 펩타이드를 합성하였다 (표 1).

실시예 2. 패혈증 쇼크 마우스 모델 생존율 확인

그람 음성균에 의한 패혈증에서의 파필리오신 펩타이드의 효과를 확인하기 위하여, E. coli(Escherichia col) K1 감염에 의한 패혈증 쇼크 마우스 모델에서의 생존 능력을 평가하였다. 구체적으로, E. coli (1×10⁷CFU/mouse)를 복강 주사한 군을 대조군으로 하고 실험군은 파필리오신(papiliocin) 10mg/kg을 함께 복강 주사하였다. 각 군당 5마리의 ICR (6주령) 마우스를 이용하였다. 복강 주사 후 12시간, 15시간, 18시간, 21시간, 24시간, 27시간, 30시간, 33시간, 36시간, 39시간, 42시간, 45시간, 48시간, 72시간 및 96시간마다 생존 마리수를 확인하여 퍼센트(%)로 환산하여 표기하였다.

그 결과, E. coli만을 주사한 대조군은 27시간만에 5마리 모두 사망하였고, 파필리오신 펩타이드를 함께 주사한 실험군의 마우스들은 96시간까지 5마리 모두 100% 생존율을 보였다 (도 1). 이를 통해, 파필리오신은 E. coli K1 감염에 의한 패혈증 쇼크에 대한 치료 효과가 우수한 것을 알 수 있다.

실시예 3. 패혈증 쇼크 마우스 모델에서의 간 및 신장의 손상도 지표 확인

그람 음성균에 의한 패혈증 모델의 생체 내 간독성 (AST, ALT) 및 신장독성 (BUN)에 대한 파필리오신 펩타이드의 영향을 확인하였다. 구체적으로, 대조군은 3마리의 Balb/c (6주령) 마우스에 E. coli (1×10⁷CFU/mouse)를 복강 주사하였으며, 실험군들은 각각 3마리의 Balb/c (6주령) 마우스에 파필리오신 10mg/kg 복강 주사 1시간 후 E. coli (1×10⁷CFU/mouse) 복강 주사, E. coli (1×10⁷CFU/mouse) 및 파필리오신 10mg/kg 동시 복강 주사, 또는 E. coli (1×10⁷CFU/mouse) 복강 주사 1시간 후 파필리오신 10mg/kg 복강 주사하였다. 하룻밤 뒤, 각각의 군들에서 마우스의 혈액을 채취하고 30분 동안 상온에 방치한 후 4℃의 원심분리기에서 13000rpm로 15분간 혈청을 분리하였다. 그 후, AST를 측정하기 위해 96웰 플레이트에 기질액 10 ㎕를 첨가한 후 혈청 2㎕를 넣고 37℃에서 60분간 방치하였다. 그 후 정색시액을 10㎕를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 뒤 0.4N NaOH 용액 100㎕를 첨가하고 10분 뒤 505nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, ALT를 측정하기 위해 96웰 플레이트에 기질액 10㎕를 첨가한 뒤 혈청 2㎕를 넣어 37℃에서 30분간 방치하였다. 그 후 정색시액 10㎕를 첨가하여 실온에서 20분간 방치한 뒤 0.4N NaOH 용액 100㎕를 첨가하고 10분 뒤 505nm에서 흡광도를 측정하였다. 아울러, BUN을 측정하기 위해 96웰 플레이트에 효소액 100㎕를 첨가한 후 혈청, 표준용액 및 정제수를 각각 1㎕씩 첨가한 뒤 37℃에서 5분간 방치하였다. 그 후 정색시액 100㎕를 첨가하여 37℃에서 10분간 방치한 후 580nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, E. coli 를 주사하였을 때 그렇지 않은 마우스군에 비해 간독성 및 신장독성 수치가 현저히 증가한 반면, 파필리오신을 E. coli 처리 1시간 전, 동시 또는 1시간 후에 처리해 준 마우스군에서는 AST가 각각 76.0%, 76.9% 및 76.5%, ALT가 각각 54.5%, 71.4% 및 60.1%, 및 BUN가 각각 61.5%, 69.5% 및 67.3%로 나타나, 파필리오신 처리에 의해 패혈증 동물 모델에서의 간 및 신장 독성수치가 낮아지는 것을 알 수 있었다.

실시예 4. 패혈증 쇼크 마우스 모델에서의 혈액내 염증성 사이토카인 발현량 확인

파필리오신이 패혈증 쇼크 마우스 모델의 생체내 염증유도 사이토카인을 특이적으로 억제하는지 확인하기 위하여, 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-1β의 발현량을 확인하였다. 구체적으로, 각 군당 3마리의 Balb/c (6주령)에 E. coli (1×10⁷CFU/mouse)를 복강 주사한 대조군과, E. coli (1×10⁷CFU/mouse) 복강 주사 1시간 전, 동시 또는 1시간 후에 파필리오신 (1mg/kg)을 복강 주사한 실험군들에서 E. coli 복강 주사를 기준으로 2시간 뒤에 각각 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액을 30분간 상온에 방치한 후 4℃의 원심분리기에서 13000rpm로 15분간 혈청을 분리하였다. 면역플레이트(Immunoplate)를 1차 항체인 항-mTNF-α 항체 및 항-mIL-1β 항체로 각각 하룻밤 동안 코팅하고 워싱(washing)한 후 비 특이적인 반응의 정지를 위해 블로킹 버퍼 (2% BSA 포함 PBS)로 1시간 동안 블로킹하였다. 각각의 1차 항체로 코팅된 상기 플레이트에 원심분리하여 얻은 혈청을 10배 희석하여 100㎕씩 처리하고 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 mTNF-α와 mIL-1β를 인식하는 발색 가능한 2차 항체를 처리하고 1시간 반 후, 발색효소 (streptavidin HRP)를 붙여 30분 뒤 TMB(3,3`,5,5`-tetramethybensidine) 용액으로 발색시켰다. 10 내지 15분 후 H₂SO₄로 발색 정지시킨 뒤 배양 상등액에 녹아있는 mTNF-α 및 mIL-1β의 양을 540nm에서 ELISA 판독기 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA)로 흡광도를 측정하여 정량함으로써 확인하였다.

그 결과, 패혈증 쇼크 마우스 모델 혈액에서의 TNF-α 발현량은 파필리오신을 E. coli 처리 1시간 전, 동시 또는 1시간 후에 처리한 경우 각각 39.1%, 48.2% 및 34.5%로 감소하였으며, IL-1β 발현량은 각각 33.3%, 41.5% 및 32.7%로 감소하는 것으로 나타났다 (도 3). 이를 통해, 파필리오신이 패혈증 쇼크 마우스 모델에서 혈중 염증성 사이토카인의 생성을 억제하는 것을 알 수 있었다.

실시예 5. 패혈증 쇼크 마우스 모델 폐의 염증성 사이토카인 발현량 확인

상기 실시예 4에서와 같이 E. coli 및 파필리오신을 처리한 마우스들에서 E. coli 복강 주사를 기준으로 하룻밤 후 폐 파쇄물(Lung lysates)을 채취하여 파쇄 버퍼(lysis buffer)에 균질화하였다. 패혈증 쇼크 마우스 모델의 각 군별 상기 폐 파쇄물에서의 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-1β의 발현량을 상기 실시예 4의 방법으로 확인하였다.

그 결과, 패혈증 쇼크 마우스 모델의 폐에서의 TNF-α 발현량은 파필리오신 전처리, 동시 처리 또는 후처리시 각각 35.7%, 31.0% 및 38.3%로 현저히 감소하였으며, IL-1β 발현량은 각각 42.9%, 42.4% 및 45.2%로 감소하였다 (도 4). 이를 통해, 파필리오신이 패혈증 쇼크 마우스 모델의 폐에서 염증성 사이토카인의 생성을 현저히 억제하는 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6. 패혈증 쇼크 마우스 모델에서의 세균 생장 억제 확인

파필리오신이 패혈증 쇼크 마우스 모델의 생체 내 장기에서 세균의 생장을 억제하는지 알아보기 위하여, 각 군당 3마리의 Balb/c (6주령)을 이용하여 파필리오신 (1mg/kg)을 E. coli (1×10⁷CFU/mouse) 복강 주사 1시간 전, 동시 또는 1시간 후 복강 주사하였다. 주사 하룻밤 뒤 마우스들의 폐, 간 및 신장을 채취하여 PBS에 균질화하였다. 폐, 간 및 신장 균질물을 1:1000으로 희석하고, 각 희석액 10㎕를 LB 한천 플레이트에 도말하였다. 플레이트를 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 콜로니(colony)의 형성을 확인하였다.

그 결과, 폐에서의 총 균수가 E. coli 복강 주사 전처리, 동시 처리 또는 후처리시 각각 21.4%, 59.7% 및 5.6%로 감소하였다 (도 5). 또한, 간에서의 총 균수가 전처리, 동시 처리 또는 후처리시 각각 30.0%, 51.4% 및 14.3%로 감소하였다 (도 5). 아울러, 신장에서의 총 균수가 전처리, 동시 처리 또는 후처리시 각각 33.8%, 42.4% 및 12.1%로 감소하였다 (도 5). 이를 통해, 파필리오신이 패혈증 쇼크 마우스 모델에서 패혈증 유발 세균에 대한 항균효과가 우수함을 알 수 있었다.

실시예 7. 패혈증 쇼크 마우스 모델에서의 혈액 내 LPS 검출 확인

파필리오신이 패혈증 쇼크 마우스 모델에서 내독소인 LPS의 검출양에 영향을 주는지 확인하기 위해, Balb/c (6주령) 마우스에 아무것도 투여하지 않은 군 (Con), 파필리오신 (10mg/kg)을 투여한 군, E. coli (1×10⁷CFU/mouse)를 투여한 군, 및 파필리오신 (10mg/kg)을 투여한 뒤 1시간 뒤에 E. coli (1×10⁷CFU/mouse)를 투여한 군의 혈액에서 각각 혈장을 분리하여 내독소가 없는 PBS(endotoxin-free PBS)에서 10 배 희석하였다. 그 후, 혈장에서 LPS의 수준을 Limulus Amebocyte Lysate(LAL) 발색 종점 분석(Lonza Group Ltd, Allendale, New Jersey, USA)을 제조사의 권고에 따라 측정하였다. 백그라운드 수준의 감산 결과는 분석과 함께 제공되는 Escherichia coli endotoxin 표준과 비교하여 계산하였으며, LPS의 수준은 EU/mL로 표시하였다.

그 결과, 패혈증 쇼크 마우스 모델에서 파필리오신 전처리시 E. coli 투여에 의한 혈액내 LPS의 수준을 50.5%로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다 (도 6). 이를 통해, 파필리오신이 패혈증 동물 모델의 혈액의 내독소 농도를 현저히 감소시키는 것을 알 수 있었다.

실시예 8. 패혈증 쇼크 마우스 모델에서의 폐 침윤 염증 세포 확인

파필리오신에 의한 패혈증 쇼크 마우스 모델의 폐 조직에서의 세포 침윤도를 확인하기 위하여, Balb/c (6주령) 마우스에 복강 주사로 아무것도 투여하지 않은 군 (Con), 파필리오신 (10mg/kg)을 투여한 군, E. coli (1×10⁷CFU/mouse)를 투여한 군, 및 파필리오신 (10mg/kg)을 투여한 뒤 1시간 뒤에 E. coli (1×10⁷CFU/mouse)를 투여한 군의 폐를 투여 각각 24시간 뒤에 적출하였다. 적출한 폐로부터 조직 블록을 수집하여 12시간 동안 4% 파라포름알데하이드에 고정하고 왁스에 포매하였다. 관상절편을 왁스 제거하고, 헤마톡실린&에오신(H&E)으로 염색한 뒤, 광학현미경으로 세포침윤을 검사하여 디지털 이미지를 얻었다.

그 결과, E. coli 투여로 인해 패혈증 쇼크가 유발된 마우스에서는 폐로 침윤되는 염증 세포가 증가하였으나, 파필리오신을 전처리한 경우 폐로 침윤되는 염증 세포가 대조군만큼 감소한 것을 확인할 수 있었다 (도 7). 이를 통해, 파필리오신이 패혈증 쇼크로 인한 폐 조직의 염증 세포 침윤을 현저히 억제하는 것을 알 수 있었다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> COMPOSITION COMPRISING PAPILIOCIN FOR PREVENTING OR TREATING SEPSIS OR SEPTIC SHOCK <130> PN2004-187 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Papilio xuthus papiliocin <400> 1 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Arg Asn Val Arg 1 5 10 15 Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala 20 25 30 Ala Thr Val Val Lys 35

Claims

파필리오신(papiliocin)을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크에 의한 장기손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 패혈증 또는 패혈증성 쇼크는 그람 음성 세균인 대장균 속(Escherichia sp.) 세균 또는 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli)의 감염에 의해 유발된 것인 패혈증 또는 패혈증성 쇼크이며,
상기 파필리오신은,
(1)내독소를 감소시키는 활성 및 체내 패혈증 유발균에 대한 항균 활성을 동시에 가지며,
(2)간 및 신장 독성수치를 감소시키며,
(3)패혈증 또는 패혈증성 쇼크 유발균에 의하여 유도된 혈중 TNF-알파 또는 IL-1β의 발현량을 감소시키며,
(4)패혈증 또는 패혈증성 쇼크 유발균에 의하여 유도된 폐의 TNF-알파 또는 IL-1β의 발현량을 감소시키며,
(5)폐 조직의 염증 세포 침윤을 억제하는 것을 특징으로 하는,
패혈증 또는 패혈증성 쇼크에 의한 장기손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 파필리오신은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 패혈증 또는 패혈증성 쇼크에 의한 장기손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 장기는 간장, 신장 및 폐 중 어느 하나 이상의 장기인 것을 특징으로 하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크에 의한 장기손상의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
파필리오신(papiliocin)을 유효성분으로 포함하는 패혈증 또는 패혈증성 쇼크에 의한 장기손상의 예방 또는 개선용 식품 조성물로서, 상기 패혈증 또는 패혈증성 쇼크는 그람 음성 세균인 대장균 속(Escherichia sp.) 세균 또는 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli)의 감염에 의해 유발된 것이며,
상기 (1)파필리오신은 내독소를 감소시키는 활성 및 체내 패혈증 유발균에 대한 항균 활성을 동시에 가지며,
(2)간 및 신장 독성수치를 감소시키며,
(3)패혈증 또는 패혈증성 쇼크 유발균에 의하여 유도된 혈중 TNF-알파 또는 IL-1β의 발현량을 감소시키며,
(4)패혈증 또는 패혈증성 쇼크 유발균에 의하여 유도된 폐의 TNF-알파 또는 IL-1β의 발현량을 감소시키며,
(5)폐 조직의 염증 세포 침윤을 억제하는 것을 특징으로 하는,
패혈증 또는 패혈증성 쇼크에 의한 장기손상의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
파필리오신(papiliocin)을 유효성분으로 포함하는 장기손상을 동반한 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 패혈증 또는 패혈증성 쇼크는 그람 음성 세균인 대장균 속(Escherichia sp.) 세균 또는 에셰리키아 콜라이(Escherichia coli)의 감염에 의해 유발된 것인 패혈증 또는 패혈증성 쇼크이며,
상기 파필리오신은,
(1)내독소를 감소시키는 활성 및 체내 패혈증 유발균에 대한 항균 활성을 동시에 가지며,
(2)간 및 신장 독성수치를 감소시키며,
(3)패혈증 또는 패혈증성 쇼크 유발균에 의하여 유도된 혈중 TNF-알파 또는 IL-1β의 발현량을 감소시키며,
(4)패혈증 또는 패혈증성 쇼크 유발균에 의하여 유도된 폐의 TNF-알파 또는 IL-1β의 발현량을 감소시키며,
(5)폐 조직의 염증 세포 침윤을 억제하는 것을 특징으로 하는,
장기손상을 동반한 패혈증 또는 패혈증성 쇼크의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.