CN106488929B

CN106488929B - 新型cath2衍生物

Info

Publication number: CN106488929B
Application number: CN201580036371.8A
Authority: CN
Inventors: 亨德里克·彼得·哈赫斯曼; 阿尔贝特·范·戴克; 埃德温·约翰内斯·阿德里亚努斯·费尔德赫伊曾
Original assignee: Universiteit Utrecht Holding BV
Current assignee: Universiteit Utrecht Holding BV
Priority date: 2014-05-09
Filing date: 2015-05-08
Publication date: 2021-08-24
Anticipated expiration: 2035-05-08
Also published as: AU2015256729B2; US20230382961A1; JP2017518976A; JP2020109109A; US20210246177A1; AU2015256729A1; US20170145065A1; CA3207425A1; CA2948455A1; CN106488929A; JP6676544B2; US11603391B2; AU2019283922A1; CA2948455C; RU2016144509A3; US10829524B2; EP3140315A1; RU2726124C2; MX2016014633A; RU2016144509A

Abstract

本发明提供了作为抗菌肽的一种的CATH2或CMAP27的新的衍生物。这些衍生物包括CATH2的N‑末端截短的肽、环肽、D‑氨基酸变体，以及它们的截短衍生物、反向和逆反CATH2衍生物。这些衍生物在疫苗中作为抗感染剂，并且特别是对于卵内施加是有用的。此外，对于以上衍生物，并且还对于已经已知的C‑末端截短的衍生物，已描述了对于预防性治疗特别有利的新的免疫激活功能。

Description

新型CATH2衍生物

技术领域

本发明涉及抗生素和免疫刺激物质(immune stimulating substances)的领域，具体地，涉及具有这类活性的肽，更特定的来源于CMAP27的肽，也称为CATH2。

背景技术

CATH2或CMAP27是抗微生物肽种类中的成员。到目前为止，在过去数十年里已从多个来源分离并测序了多种类型的抗微生物肽(关于所选择的综述，参见：Otvos Jr.,L.Cell.Mol.Life Sci.2002,59:1138；Otvos,Jr.,L.J.Peptide Sci.2000,6:497；Tan,Y.-T.等人,Mol.Med.Today 2000,6:309；Scott,M.G.和Hancock,R.E.W.,Crit.Rev.Immunol.2000,20:407；Hancock,R.E.W.和Chapple,D.S.Antimicrob.AgentsChemother.1999,43:1317；Hetru,C.等人,In:Molecular Mechanisms of ImmuneResponses in Insects；Brey,P.和Hultmark,D.主编,Chapman和Hall,London,1998,pp.40-66；Hancock,R.E.W.等人,Adv.Microb.Physiol.1995 37:135；Vaara,M.Microbiol.Rev.1992,395)。在哺乳动物和鸟类中，目前发现的大部分抗微生物肽属于抗菌肽(cathelicidin)和防御素(defensin)超家族。已发现抗菌肽广泛分布于不同物种，即在哺乳动物、鸟类、鱼类和爬行动物中，这表明了它们的进化重要性，但是在不同物种之间它们的功能谱显著不同。抗菌肽家族的抗微生物肽在基因组中作为前多肽原(prepropeptide)编码，并且通过蛋白酶解以形成12至97个氨基酸的生物学活性肽(Ramanathan,B.等人,2002,Microbes Infect.4:361-372)。基于释放的C末端肽的典型的一级和二级结构，释放的C末端肽可以分为4大类，即1)α-螺旋肽，是直链肽，当与模拟生物膜的环境接触时，采取两亲结构(LL-37，Agerberth,B.,等人,PNAS 1995,92:195；SMAP-29,Anderson,R.C.,等人,Antimicrob.Agents Chemother.2004,48:673)；2)β-发卡肽，是短环肽，由一个或两个分子内二硫键形成(波地金(protegrins)，Kokryakov,V.N.,等人,FEBSLett.1993,327:231；十二肽,Romeo,D.,等人,J.Biol.Chem.1988,263:9573)；3)富含色氨酸的肽(吲哚力西丁(indolicidin))(吲哚力西丁(Indolicidin)，Selsted,M.E.,等人,J.Biol.Chem.1992,267:4292)，以及4)富含脯氨酸/精氨酸的肽(bactenecins，Gennaro,R.,等人,Infect.Immun.1989,57:3142；PR39,Agerberth,B.,等人,Eur.J.Biochem.1991,202:849)。

大部分抗菌肽对一些革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、真菌、原生动物和包膜病毒显示出广泛的活性。(Zaiou,M.和Gallo,R.L.,2002,J.Mol.Med.80:549-561)。Van Dijk等人(2005,Vet.Immunol.Immunopath.106:321-327)在小鸡(chicken)中发现了抗菌肽家族的新型蛋白质。它属于1类(α-螺旋)肽并且命名为CMAP27，也被称为CATH-2。和抗菌肽家族的其它成员一样，CMAP27作为前多肽原编码(154个氨基酸)，并在蛋白水解处理后，释放出已表现出有效广谱抗菌活性的C末端肽。称为CMAP27或CATH2的该C末端肽的氨基酸序列为RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARFG。

同时，已经合成了CMAP27的多种衍生物，并且早期研究表明(参见WO 2010/093245)C-末端截短的CMAP27衍生物不仅维持了CMAP27对革兰氏(-)细菌的抗生素性质，而且它们还对革兰氏(+)细菌(如金黄色葡萄球菌(S.aureus)和炭疽芽胞杆菌(B.anthracis))具有抗生素作用。尽管这些已能良好作用，但是仍需要CMAP27的其它活性衍生物。

发明内容

本发明人现发现了CMAP27的其它衍生物。在一种实施方式中，本发明包含新型N-末端截短的CMAP27-衍生物，而在另一实施方式中，本发明包含新型反向(Inverso)和逆反(Retroinverso)CMAP27-衍生物。

另外，本发明包含用于禽类，优选小鸡的卵内疫苗接种的方法，该方法包括给予(给药，administrate)CMAP27衍生物，其中所述CMAP27衍生物选自以下各项的组：C-末端截短的CMAP27衍生物、N-末端截短的CMAP27衍生物、D-氨基酸CMAP27-衍生物、环状CMAP27-衍生物、反向和逆反CMAP27-衍生物。

本发明的一部分是通过向动物或人提供CMAP27衍生物，用于激活动物或人的免疫应答的方法，其中所述CMAP27衍生物选自C-末端截短的CMAP27衍生物、N-末端截短的CMAP27衍生物、D-氨基酸CMAP27-衍生物、环状CMAP27-衍生物、反向和逆反CMAP27-衍生物。优选地，在所述方法中，免疫应答的激活选自以下各项：通过增加DNA吸收(摄取，uptake)的增强的Toll-样受体激活、内毒素中和、通过免疫细胞的细胞因子/趋化因子产生的刺激、直接趋化作用、增强的吞噬作用和免疫细胞增殖和分化的刺激。

本发明的其它部分是包含CMAP27衍生物的免疫组合物，所述CMAP27衍生物选自以下各项：N-末端截短的CMAP27-衍生物、反向和逆反CMAP27-衍生物。

CMAP27衍生物用于制备用于传染病疗法的药剂或者用于制备疫苗的使用也包含在本发明中，所述CMAP27衍生物选自以下各项：N-末端截短的CMAP27-衍生物、反向和逆反CMAP27-衍生物，具体地，其中所述使用是作为抗生素或者增加用该化合物处理的动物重量的使用。

另外，本发明的一部分还在于通过用CMAP27衍生物卵内疫苗接种所述禽类种的卵来增加所述禽类体重的方法，其中所述CMAP27衍生物选自以下各项：C-末端截短的CMAP27衍生物、N-末端截短的CMAP27衍生物、D-氨基酸CMAP27-衍生物、环状CMAP27-衍生物、反向和逆反CMAP27-衍生物。

附图说明

图1-皮下注射10⁶CFU禽致病性肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritis)pt13a后，在p.i.2天时，小鸡外周血白细胞的分类计数(differential counts)和总计数。A)总计数。B)分类计数。

图2-皮下注射10⁶CFU禽致病性肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritis)pt13a后的死亡率。A)感染后的7天期间，肽处理鸟类(birds)和未经处理的鸟类的存活曲线。B)相对于未经处理的感染的鸟类(+对照)，降低的死亡率(％)。

图3-皮下注射10⁶CFU禽致病性肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritis)pt13a后p.i.7天时确定的病变计分(病变评分，lesion score)。使用评分系统分别评价左右胸部气囊(肺泡，thoracic air sacs)(呼吸道)、肝脏和心脏(全身感染)：0＝无病变，1＝轻度病变，2＝中度病变和3＝严重病变。将平均病变计分(men leasion score)(MLS)计算为每只鸡的病变计分的总和。A)沙门氏菌病阳性鸟类(MLS>1)的百分比，以及相对于未处理的感染的鸟类，沙门氏菌病阳性鸟类的减少。B)相对于未处理的感染的鸟类的平均病变计分。

图4-气管内注射10⁶CFU禽致病性大肠杆菌(E.coli)506后，在p.i.2天时，小鸡外周血白细胞的分类技术和总计数。A)总计数。B)分类计数。

图5-气管内注射10⁶CFU的禽致病性大肠杆菌(E.coli)506后的死亡率。A)感染后的7天期间，肽处理和未经处理的鸟类的存活曲线。B)相对于未经处理的感染的鸟类，死亡率(％)的降低。

图6-气管内注射10⁶CFU禽致病性大肠杆菌(E.coli)506后，在p.i.7天时确定的病变记分。使用评分系统分别评价左右胸部气囊(呼吸道)、肝脏和心脏(全身感染)：0＝无病变，1＝轻度病变，2＝中度病变和3＝严重病变。将平均病变记分(MLS)计算为每只鸟类的病变记分的总和。A)大肠杆菌病阳性鸟类(MLS>1)的百分比，以及相对于未经处理的感染的鸟类，大肠杆菌病阳性鸟类的减少。B)相对于未经处理的感染的鸟类的平均病变记分。

图7-气管内注射10⁶CFU禽致病性大肠杆菌(E.coli)506后7天时的胸部气囊(thoracic air sac)计数。

图8-孵化时(D0)(图8A)以及孵化后7天(D7)(图8B)时评价的罗斯(Ross)308肉鸡的体重。在胚胎期18天用1mg/kg肽或媒介物(载体，vehicle)注射鸟类。

图9-CMAP27来源的肽对禽致病性大肠杆菌(E.coli)O78(APEC O78)野外分离株(field isolate)的体外抗菌活性。A)50％Mueller Hinton肉汤中，使用菌落计数测试肽(5μM)对APEC O78(2×10⁶CFU/ml)的抗菌活性。B)含有10％胎牛血清(FCS)的DMEM中，使用菌落计数测试肽(5μM)对APEC O78(3×10⁵CFU/ml)的抗菌活性。C)在存在或不存在5μM肽的情况下，在DMEM/10％FCS中，与活的或热杀死的(heat killed)APEC O78(3×10⁵CFU/ml)、在37℃培育2h后，J774.A1细胞的TNFα产生(ELISA)。数据表示为3次独立实验的平均值±SEM。

图10-HD11细胞中通过CMAP27来源的肽的趋化因子的诱导。将HD11细胞接种到96孔组织培养处理的板(2×10⁵个细胞/ml)中的RPMI-1640/10％FCS中，并在37℃(5％CO₂)与添加了肽(20μM)的培养基孵育4h(空心柱)或24h(实心柱)。通过实时PCR确定白介素-1β、IL-8(CXCLi2)、单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)和RANTES(CCLi4)的转录水平。显著性水平：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。数据表示为3-4次独立实验的平均值±SEM。

图11-HD11细胞中CMAP27来源的肽对脂多糖-引起的白介素-1诱导和一氧化氮产生的中和。将HD11细胞接种到96孔组织培养处理的板(2×10⁵个细胞/mL)中的RPMI-1640/10％FCS中。在37℃(5％CO₂)下，将最终浓度50ng/ml的LPS，与或不与20μM的肽预孵育30分钟，将其应用于细胞并孵育4h和24h。A)通过实时PCR确定白介素-1的转录水平(仅4h)。B)采集上清液用于使用Griess测定的一氧化氮产生测定(仅孵育24h)。显著性水平：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。数据表示为3-4次独立实验的平均值±SEM。

图12-色氨酸对苯丙氨酸残基的取代增加了CMAP27衍生的肽体外LPS中和能力。将HD11细胞接种到96孔组织培养处理的板(2×10⁵个细胞/mL)中的RPMI-1640/10％FCS中。在37℃(5％CO₂)，将最终浓度50ng/ml的LPS与或不与20μM的肽预孵育30分钟，将其应用于细胞并孵育4h或24h。A)通过实时PCR确定白介素-1的转录水平(仅4h)。B)采集上清液，使用Griess测试，用于测定一氧化氮产生(仅孵育24h)。显著性水平：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。数据表示为3-4次独立实验的平均值±SEM。

图13-CMAP27来源的肽增强DNA吸收和DNA-引起的活化。A)在存在和不存在CMAP27来的源肽(5μM)的情况下，将HD11细胞用2.5nM Alexa-Fluor 488标记的ODN-2006刺激4h，然后通过流式细胞术分析DNA吸收。B)收集在这些相同条件下刺激更长时间(17h)的HD11细胞的上清液并使用Griess测试，用于测定一氧化氮产生。数据表示为3-4次独立实验的平均值±SEM。

具体实施方式

本文所使用的“CMAP27”或者“CATH2”定义为具有氨基酸序列RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARFG的蛋白，但是C-末端酰胺化形式的RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARF-NH₂(还命名为CMAP1-26-NH2)也包含在该定义中。这表明CMAP1-26-NH2是所述肽的活性形式，这是因为已知C末端甘氨酸残基的酰胺化增加了官能性(功能性，functionality)(Shinnar,A.E.等人,2003,Bioorg.Chem.31:425-436；Tomasinsig,I.和Zanetti,M,2005,Curr.Prot.Pept.Sci.6:23-34)。

如本文所使用的术语“肽”表示通过肽键连接的氨基酸序列，其中所述氨基酸是20种组成肽的天然氨基酸之一，并且其中一种或多种氨基酸可以是L-构型或D-构型，或者对于异亮氨酸和苏氨酸，是D-同分异构构型(allo cofiguration)(仅在一个手性中心反向)。根据本发明的肽可以是直链的，即其中所述序列的第一个和最后一个氨基酸分别具有游离NH₂-或COOH-基团，或者分别是N-末端(乙酰化)和/或C-末端(酰胺化)修饰的。

“C-末端截短的CMAP27-衍生物”在本文中限定为已在WO2010/093245中描述的那些截短的肽，特别是所述文件的表1中列出的作为CMAP26-NH2、CMAP26、CMAP26(P14→G)、CMAP26(P14→L)、CMAP1-21、CMAP1-15、CMAP1-15(F2→L)、CMAP1-15(F5→L)、CMAP1-15(F12→L)、CMAP1-15(3xF→L)、CMAP1-15(F2→W)、CMAP1-15(F5→W)、CMAP1-15(F12→W)、CMAP1-15(F2→W；F5→W；F12→W)、CMAP1-13、CMAP1-12、CMAP1-11和CMAP1-10所列的肽，以及它们的乙酰化和/或酰胺化衍生物。进一步优选的是CMAP1-21(F2→W)、CMAP1-21(F5→W)、CMAP1-21(F12→W)、CMAP1-21(F2、5→W)、CMAP1-21(F5、12→W)、CMAP1-21(F2、12→W)、CMAP1-21(F2、5、12→W)、CMAP1-21(F2→Y)、CMAP1-21(F5→Y)、CMAP1-21(F12→Y)、CMAP1-21(F2、5→Y)、CMAP1-21(F5、12→Y)、CMAP1-21(F2、12→Y)、CMAP1-21(F2、5、12→Y)、CMAP1-21(F2→W；F5→Y)、CMAP1-21(F2→Y；F5→W)、CMAP1-21(F5→W；F12→Y)、CMAP1-21(F5→Y；F12→W)、CMAP1-21(F2→W；F12→Y)、CMAP1-21(F2→Y；F12→W)、CMAP1-21(F2→W；F5→Y；F12→Y)、CMAP1-21(F2→Y；F5→W；F12→Y)和CMAP1-21(F2→Y；F12→Y；F12→W)。以上鉴别的CMAP蛋白还可以表示为CATH2肽。那么，CMAP1-21将是CATH2(1-21)。

“N-末端截短的CMAP27衍生物”是在CMAP27的N末端氨基酸(精氨酸)截短的CMAP-27衍生物。具体地，提及的是选自由以下各项组成组中的衍生物：以下项的N-末端截短的变体：CMAP1-21、CMAP4-21、CMAP5-21、CMAP6-21、CMAP7-21、CMAP8-21、CMAP9-21、CMAP10-21、CMAP11-21、CMAP4-21(F5→W)、CMAP4-21(F5→Y)、CMAP4-21(F12→W)、CMAP4-21(F12→Y)、CMAP4-21(F5、F12→W)、CMAP4-21(F5、F12→Y)、CMAP4-21(F5→W、F12→Y)、CMAP4-21(F5→Y、F12→W)、CMAP7-21(F12→W)、CMAP7-21(F12→Y)、CMAP10-21(F12→W)和CMAP10-21(F12→Y)。

“D-氨基酸CMAP27-衍生物”或“D-氨基酸CATH2-衍生物”是含有至少一个D构型氨基酸的如本文所定义的CMAP-27/CATH2衍生物(包括以上定义的C-和N-末端截短的CMAP27-衍生物)。这些D-氨基酸CMAP27/CATH2衍生物的具体种类为仅由D氨基酸组成的肽(即其中无L氨基酸存在)。该具体种类在本文中定义为仅D(D-only)CMAP27-衍生物。而且包含一个或多个，或者作为另外一种选择，全部的D氨基酸的CMAP27/CATH2本身也包含在该定义内。

优选的D-氨基酸CMAP27-衍生物为以下完整的D-氨基酸CATH2-衍生物(其中所有氨基酸处于D-形式)。

“环状CMAP27-衍生物”或“环状CAH2-衍生物”是CMAP27/CATH2衍生物，其中至少两个不相邻的氨基酸连接以形成环状结构。尽管原则上可以使用任何化学连接结构(bindingconstruction)，如在任何上述CMAP27衍生物中用半胱氨酸替换两个不相邻的氨基酸(其中这些半胱氨酸形成S-S桥)，但是优选的连接系统(binding system)使用Bpg(Fmoc-L-双高炔丙基甘氨酸)和叠氮树脂之间的连接，其中Bpg连接至内部精氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸或色氨酸残基，并且叠氮树脂连接至C末端谷氨酸残基。具体地，这些环状衍生物为：

“反向”和“逆反”或者，分别地，“I”-CMAP27和“RI”-CMAP27-衍生物(“I”-CATH2和“RI”-CATH2衍生物)是相对于上述CMAP27-衍生物具有反向序列的肽，这意味着氨基酸以反向顺序彼此连接。那么，CMAP27/CATH2的I和RI等价物为GFRASGQITITVKPRFRRIKRLFRGFR，并且这些I或RI-CMAP27-衍生物的其它优选实例为：

当然，可以在它们的N末端对I和RI-CMAP27衍生物乙酰化或者在它们的C末端酰胺化。当反向CMAP27衍生物含有一个或多个D氨基酸时，将它们称为“逆反”或者“RI”。如果反向衍生物仅含有L-氨基酸，则将其称为“反向”或者“I”。

本发明的肽可以通过合成产生，或者适用时，可以通过常规方法重组产生。在以下实验部分中详细地公开了CMAP27-来源的抗生素肽的具体实施方式。优选地，通常通过已知的化学合成技术，如，例如由Merrifield所公开的那些(J.Am.Chem.Soc.(1963)85:2149-2154)制备本发明的肽或肽衍生物。它们可以通过色谱法，如反相HPLC分离自反应混合物。

可替代地，可以通过重组DNA技术，经由在宿主微生物或细胞内克隆和表达具有编码上述肽之一的核酸序列的DNA片段产生本发明所述的肽。可以通过合成制备核酸编码序列，或者核酸编码序列可以通过定点突变来源于已有的核酸序列(例如，编码野生型CATH2的序列)。然后，可以在适合的表达载体中克隆这些核酸序列，并转化或转染到适合的宿主细胞中，如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、乳酸杆菌(Lactobacillus)、链霉菌(Streptomyces)、哺乳动物细胞(如CHO、HEK或COS-1细胞)、酵母(例如，酵母菌(Saccharomyces)、裂褶菌(Schizophyllum))、昆虫细胞或病毒表达系统，如杆状病毒系统，或者植物细胞。本领域技术人员具有构建核酸序列并提供使其表达的方法的技术的知识。

具体地，可以有利地使用植物细胞来表达本发明所述的肽，这是因为在这种情况下，所述肽可以直接口服给予于人或动物，即无需进一步纯化。

随后，肽可以分离自宿主细胞的培养物。这可以通过在本领域中可用的常规蛋白质纯化和分离技术来实现。这些技术可以，例如涉及免疫吸附或色谱法。还可能在合成期间提供具有标签(如组氨酸标签)的肽，这使其快速结合并纯化，并且在此之后，通过酶除去所述标签以获得活性肽。

可替代地，可以在无细胞体系中产生肽，如Invitrogen的Expressway^TM无细胞体系。

在以下文献中描述了可以在肽的制备中应用的方法的一些更广泛的总结：W.F.Anderson,Nature 392Supp.,4月30日1998,p.25-30；PharmaceuticalBiotechnology,Ed.D.J.A.Crommelin和R.D.Sindelar,Harwood Academic出版社,1997,p.53-70,167-180,123-152,8-20；Protein Synthesis:Methods and Protocols,Ed.R.Martin,Humana出版社,1998,p.1-442；Solid-Phase Peptide Synthesis,Ed.G.B.Fields,Academic出版社,1997,p.1-780；Amino Acid and Peptide Synthesis,Oxford University出版社,1997,p.1-89。

本领域技术人员可以容易地制备如本文所公开的新型肽。

可以单独使用或者以多聚体的形式组合使用本发明的CMAP27-或CATH2-衍生物。本发明的肽的适合组合包括通过间隔子(间隔基，spacer)彼此顺序连接的本发明的肽的串联体(concatemer)，例如，处于肽二聚体、肽三聚体等形式，其中随后比对了单独的肽。可以将单个肽或拟肽链(peptidomimetic chain)连接至生物相容性蛋白，如人血清白蛋白、人源化抗体、脂质体、胶束(micelle)、合成聚合物、纳米颗粒和噬菌体。可替代地，可以将本发明的单个组合的肽的多聚体制备成树枝状聚合物或团簇聚合物的形式，其中将三个或以上的肽连接至一个共同的中心。

可以通过在珠(bead)的表面上暴露本发明的肽来形成处于多聚体形式的其它组合。然后，所述珠可以起到肽的载体的作用，并且可以类似地起到可检测标记的作用。例如，可以通过肽链N-末端的生物素化，并随后与链霉亲和素复合(complexation)来制备多聚体。由于链霉亲和素能够以高亲合力连接4个生物素分子或缀合物，因此通过该方法可以形成非常稳定的四聚体肽复合物。多聚体可以由相同的或不同的根据本发明的肽或拟肽组成。然而，优选地，本发明的多聚体由两种或更多种肽或拟肽组成，其中每个组分构成了一组总的杀生物活性(靶向、抗微生物活性、清除)。

本发明的药物组合物包含治疗有效量的一种或多种本发明的CMAP27衍生物。一旦配制，可以在治疗细菌感染的方法中将本发明的药物组合物直接给予受试者，方法包括向对其有需要的受试者给予治疗有效量的本发明的组合物。另外，可以在调节免疫系统的方法中使用本发明的药物组合物。

组合物的直接递送通常将伴随着局部给予或其它形式的给予：口服给予、肠胃外给予、皮下给予、舌下给予、病灶内给予、腹膜内给予、静脉给予或肌内给予、肺部给予，或者递送至组织的胞间隙。

一个具体设想的给予方法是卵内提供CMAP-27衍生物。“卵内给予”表示给予至禽类物种(aivan species)的卵内，优选地，孵化的第四个四分之一期(quarter)内的卵。也就是说，对于小鸡的卵，优选地在孵化的约第15至第19天进行给予，并且更优选地，在孵化的约第18天进行。对于火鸡的卵，优选地在孵化的约第21至第26天进行给予，并且更优选地，在孵化的约第25天进行。可以通过任何方法进行这种给予，方法导致将一种或多种CMAP-27衍生物通过壳体引入到卵中。优选的给予方法是通过注射。可以通过使用任一种熟知的卵注射装置进行注射，如配备有约18至22号针头的常规皮下注射器，或如美国专利号4,681,063、4,040,388、4,469,047和4,593,646中所述的高速自动卵注射系统。

药物组合物还可以包括适合的药学上可接受的载体或稀释剂，并且可以处于胶囊、片剂、锭剂、糖衣剂、丸剂、滴剂、栓剂、粉剂、喷雾剂、疫苗、软膏剂、糊剂、乳膏剂、吸入剂、贴片、气溶胶等形式。作为药学上可接受的载体，可以使用最适合于特定剂量形式并且与肽或肽缀合物相容的任何溶剂、稀释剂或其它液体媒介物、分散或混悬助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、包封剂、固体粘结剂或润滑剂。

因此，药物组合物可以含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”还包括用于给予治疗剂，如抗体或多肽、基因及其它治疗剂的载体。该术语是指本身不引起对接受所述组合物的个体产生有害的抗体并且可以无过度毒性地给予的任何药物载体。适合的载体可以是大的、缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合物氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒。这些载体对于本领域技术人员是熟知的。

通过已知的方法制备了肽的盐或功能等价形式，其通常涉及肽与药学上可接受的酸混合以形成酸加成盐(acid addition salt)或者与药学上可接受的碱混合以形成碱加成盐。在考虑化合物具体预期使用后，本领域技术人员可以容易决定酸或碱是否是药学上可接受的。例如，并非所有对于离体应用可用的酸和碱都可以用于治疗组合物。根据预期使用，药学上可接受的酸包括有机和无机酸，如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、乙醇酸(glycolicacid)、草酸、丙酮酸、丁二酸、马来酸、丙二酸、肉桂酸、硫酸、氢氯酸、氢溴酸、硝酸、高氯酸、磷酸和硫氰酸，它们与肽和功能等价物的游离氨基形成铵盐。与肽和功能等价形式的游离羧基形成羧酸盐的药学上可接受的碱包括乙胺、甲胺、二甲胺、三乙胺、异丙胺、二异丙胺及其它单、二和三烷基胺以及芳基胺。此外、还涵盖了药学上可接受的溶剂化物。

在本文中可以使用药学上可接受的盐，例如，无机酸盐，如氢氯酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；以及有机酸盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。药学上可接受的赋形剂的深入讨论在雷明顿药物科学(Mack Pub.Co.,N.J.1991)中是可得的。

可以通过先前表明的途径单独给予或与药学上可接受的载体或稀释剂组合给予本发明所述的衍生物，并且这种给予可以以单剂量或多剂量进行。更具体地，可以以多种不同的剂量形式给予活性化合物，即它们可以与处于以下形式的多种药学上可接受的惰性载体组合：片剂、胶囊、锭剂(lozenge)、糖锭剂(troche)、硬糖剂、粉剂、喷雾剂、乳膏剂、油膏剂、栓剂、胶状剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、水悬浮剂、可注射溶液、酏剂、糖浆剂等。这些载体包括固体稀释剂或填充剂、无菌水媒介和多种无毒有机溶剂等。此外，可以对口服药物组合物适当增甜和/或调味。一般地，所述活性化合物以按重量计约5.0％至约70％范围的浓度水平存在于这些剂量形式中。

对于口服给予，含有多种赋形剂(如微晶纤维素、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二钙和甘氨酸)的片剂可以与以下多种崩解剂一起使用，如淀粉(并且优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、海藻酸和特定复合硅酸盐以及造粒粘合剂，如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。另外，对于压片目的，润滑剂，如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石通常是非常有用的。类似类型的固体组合物还可以在胶囊中用作填充剂；就此而言，优选的材料还包括乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇。当对于口服给予，水悬浮剂和/或酏剂是所期望的时，可以将所述活性化合物与多种增甜剂或调味剂、着色剂或染料，并且根据需要，与乳化剂和/或助悬剂，以及连同该类稀释剂，如水、乙醇、丙二醇、甘油及其多种类似组合一起混合。

对于肠胃外给予，可以使用在芝麻或花生油中或者在丙二醇水溶液中的活性化合物的溶液。如有必要，所述水溶液应适当缓冲(优选地，pH大于8)，并且所述液体稀释剂首先使其等渗。这些水溶液适合于静脉注射目的。所述油溶液适合于关节内、肌内和皮下注射目的。通过本领域技术人员所知的标准药物技术，所有这些溶液在无菌条件下的制备是易于实现的。

另外，还可能局部给予本发明所述的活性化合物，并且根据标准药物实践，这可以通过乳膏剂、胶状剂、凝胶剂、糊剂、贴片、软膏剂等实现。

对于除人以外的动物(如牛或家畜)的给予，可以将所述活性化合物在动物饲料中给予，或者作为兽用顿服药组合物(drench composition)口服给予。

还可以将所述活性化合物以脂质体递送系统，如小单层脂质体、大单层脂质体和多层脂质体形式给予。可以由多种(磷酸)脂质，如胆固醇、十八胺或磷脂酰胆碱形成脂质体。

活性化合物还可以与作为可靶标药物载体的可溶性聚合物连接。这些聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺苯(polyhydroxypropylmethacrylamide phenyl)、聚羟乙基天冬酰胺苯酚(polyhydroxyethylaspartamide-phenol)，或被棕榈酰基残基取代的聚苯醚-聚赖氨酸。此外，活性化合物可以连接至用于实现药物控制释放的可生物降解的聚合物类型，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸和聚乙醇酸的共聚物、聚-ε-己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联的或两亲性嵌段共聚物。对于治疗性疗法，可以如上所述产生肽或肽-缀合物并应用于对其有需要的受试者。可以通过任何适合的途径将肽或肽-缀合物给予于受试者，优选地，以适合于该途径的药物组合物的形式和对预期治疗有效的剂量。

本发明的药物组合物可以含有其它活性剂，如常规抗生素(如，例如，万古霉素、链霉素、四环素、青霉素)或其它抗微生物化合物，如抗真菌剂，例如，伊曲康唑或咪康唑。还可以加入减轻其它感染症状，如发烧或皮疹的化合物(例如，水杨酸)。

技术人员通过，例如使用动物模型可以容易确定治疗人或动物受试者体内细菌感染所需的肽或肽-缀合物的治疗有效的剂量。

如本文所使用的术语“治疗有效量”是指减少或防止细菌生长和定殖(colonization)或者表现出可检测的治疗或预防作用的治疗剂(即根据本发明的肽或肽-缀合物)的量。该作用可以通过，例如培养活组织检查样品并测定细菌活性，或者通过评价细菌感染的发展或严重性的任何其它适合的方法来检测。对于受试者准确的有效量将取决于受试者的个头(size)和健康情况、病情的性质和程度以及选择用于给予的治疗剂或治疗剂组合。因此，提前指定确切有效量是无用的。然而，可以通过常规实验确定特定情况的有效量，并且该有效量在临床医师或实验人员的判断范围内。具体地，本发明所述的组合物可以用于降低或预防细菌感染和/或相伴的生物或身体表现，如发烧减轻。允许临床医师建立初始剂量的方法在本领域中是已知的。决定给予的剂量必须是安全且有效的。

出于本发明的目的，在要给予的个体中，有效剂量将为约0.01μg/kg至50mg/kg，优选地，0.5μg/kg至约10mg/kg的肽或肽-缀合物。技术人员可以容易地确定实现本文所述的药物组合物的治疗作用的剂量。对于卵内施加(卵内应用，in ovo application)，可以使用相同的剂量，但是要相对于胚胎重量重新计算。

在另一替代实施方式中，可以从插入受试者体内的控释(controlled release)或缓释基质给予本发明所述的肽或肽-缀合物或组合物。

还可以有利地以经粘膜剂量形式给予本发明的化合物。该给予途径是无创的，并且因此对于要治疗的受试者和提供治疗的人来说是较轻松的；同时，与口服给予相比，它可以导致化合物生物利用率的改善，特别是如果化合物在消化系统液中不稳定，或者如果化合物过大而不能被肠有效吸收。经粘膜给予是可能的，例如，通过鼻部、口腔、舌下、齿龈或阴道剂型(dosage form)。可以通过已知技术制备这些剂型；可以将它们配制表示为滴鼻剂或喷雾剂、插入剂、薄膜、贴片、凝胶剂、软膏剂或片剂。优选地，用于粘膜剂型的赋形剂包括提供用于粘膜粘附的一种或多种物质，从而延长剂型与吸收位点的接触时间并借此可能增加吸收程度。

在其它实施方式中，使用定量雾化吸入器(metered dose inhaler)、喷雾器、气溶胶喷雾或干粉吸入器，通过肺部途径给予所述化合物。可以通过已知的方法和技术制备适当的制剂。在一些情况下，透皮、直肠或眼部给予也可以是可行的。

可以有利地使用先进药物递送或靶标方法来更有效地递送本发明的化合物。例如，如果选择非肠胃外给予途径，适当的剂型可以含有生物利用率增强剂，其可以是增加化合物的利用率的任何物质或物质的混合物。这可以，例如通过保护化合物不被降解，如通过酶抑制剂或抗氧化剂来实现。更优选地，增强剂通过增加吸收屏障(通常为粘膜)的渗透性来增加化合物的生物利用率。渗透增强剂可以通过多种机制起作用；一些增加粘膜的流动性，而其它打开或加宽了粘膜细胞之间的缝隙连接。并且，其它降低了覆盖粘膜细胞层的粘液的粘度。其中，优选的生物利用率增强剂为两亲物质，如胆酸衍生物、磷脂、胆固醇及其衍生物、乙醇、脂肪酸、油酸、脂肪酸衍生物、EDTA、卡波姆、聚卡波非(polycarbophil)和壳聚糖。

本发明所述的CMAP27-衍生物可以用于的适应症为革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌二者引起的细菌感染，如大肠杆菌(E.coli)、根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurum)、欧文氏杆菌(Erwinia carotovora)、草生欧文氏菌(E.herbicola)、菊欧文氏菌(E.chrysanthemi)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、土拉热弗朗西斯氏菌(Francisellatularensis)、化脓隐秘杆菌(Archanobacterium pyogenes)、副鸡禽杆菌(Avibacteriumparagallinarum)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、博德特氏杆菌(Bordetelle spp.)、短螺菌(Brachyspira spp.)、布鲁氏菌属(Brucella spp.)、弯曲菌(Campylobacter spp.)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、败毒梭菌(Clostridium septicum)、化脓棒状杆菌(Corynebacterium pyogenes)、伯氏立克次氏体(Coxiella burnetii)、肠球菌(Enterococcus spp.)、睡眠嗜血菌(Haemophilussomnus)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、溶血曼海姆菌(Mannheimia haemolytica)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鸟结核分枝杆菌(Mycobacterium avium)、鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)、鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、鼻气管鸟杆菌(Ornithobacterium rhinotracheale)、铜绿巴斯德杆菌(pasteurella aeruginosa)、多杀巴斯德氏菌(Pastuerella multocida)、肺炎球菌(Pneumococcus spp.)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、鸭瘟里莫氏菌(Riemerella anatipestifer)、沙门氏菌(Salmonella spp.)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)、链球菌(Streptococcusspp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、酿脓葡萄球菌(Staphylococcuspyrogene)、化脓隐秘杆菌(Truperella pygoenes)、霍乱弧菌(Vibria cholerae)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、莫拉氏菌属(Moraxella)、淋病奈瑟菌(Neisseriaghonnorhoea)、气杆菌(Aerobacter)、疏螺旋体(Borellia)。除细菌感染外，还可以使用本发明所述的肽治疗其它感染，如病毒、真菌、酵母和寄生虫感染。

本发明的化合物的作用不仅通过它们的抗生素作用提供，而且还通过它们的免疫调节作用提供。此外，新发现的免疫激活作用(参见下文)提供了本发明化合物的其它优势。

除了用于治疗感染的治疗性用途之外，还可能在可以用于清洁表面和/或设备的杀菌组合物中使用本发明的抗生素肽。另一个应用领域在于包装，其中肽可以连接至或包埋在用于包装食品的包装材料或通过微生物容易降解的其它材料中。本发明的CMAP27衍生物具体可用于包装，这是因为在接触或摄入时，它们是无毒的。

CMAP27衍生物在兽医应用，特别是禽类中的应用是特别有用的。肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)感染可以导致幼鸡(young chicken)大量死亡和发病。具体地，在孵化后的前两周，当它们的获得性免疫系统未充分发育时，幼鸡是高度敏感的。改善幼鸡健康状况的可能策略在于促进它们的天然免疫系统以弥补逐渐消失的母体保护和适应性免疫成熟之间的间隙。小鸡抗菌肽-2(CATH2或CMAP27)衍生物的体外免疫调节特性表明本发明的化合物可以用于促进幼鸟类的先天免疫应答。这可以通过小鸡胚胎的卵内疫苗接种或者通过幼鸡的疫苗接种来实现。令人惊讶地，这种卵内疫苗接种还具有在禽类，优选地(肉鸡)小鸡的生长发育期间，由抗生素治疗已知的作用，即与未治疗动物相比，体重增加。因此，这种一次卵内疫苗接种可以替代动物生长期间的抗生素使用。

在这些及其它兽医应用中，包含CATH2或CMAP27衍生物的组合物还包含兽医可用的载体。这种兽医学上可接受的载体可以包括溶剂、分散媒介、涂料、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗真菌剂、等渗剂、吸附迟延剂等。稀释剂可以包括水、盐水、葡萄糖、乙醇、甘油等。其中，等渗剂可以包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。其中，稳定剂包括白蛋白。

适合在本发明方法中使用的佐剂包括(但不限于)：矿物凝胶，例如，氢氧化铝；表面活性物质，如溶血卵磷脂；糖苷，例如，皂苷衍生物，如Quil A或GPI-0100(美国专利号5,977,081)；阳离子表面活性剂，如DDA、普卢兰尼克多元醇类；聚阴离子；非离子嵌段聚合物，例如，普卢兰尼克(Pluronic)F-127(B.A.S.F.,USA)；肽；矿物油，例如，Montanide ISA-50(Seppic,Paris,France)、卡巴浦尔、爱菲金(Amphigen)(Hydronics,Omaha,Nebr.USA)、铝胶(Superfos Biosector,Frederikssund,Denmark)、油乳剂(emulsion)，例如，矿物油的乳剂，如BayolF/Arlacel A和水，或植物油的乳剂、水和乳化剂，如卵磷脂；明矾、胆固醇、rmLT、细胞因子及其组合。还可以将免疫原成分引入到脂质体中，或缀合至多糖和/或其它聚合物以用于疫苗制剂中的使用。可以包含在用于本发明方法中使用的产品中的其它物质包括(但不限于)一种或多种防腐剂，如乙二胺四乙酸(EDTA)的二钠或四钠盐、硫柳汞等。增强免疫系统对抗原的应答的免疫刺激剂也可以包含在产品中。适合的免疫刺激剂的实例包括细胞因子，如IL-12或IL-2，或刺激性分子，如胞壁酰二肽、氨基喹诺酮、脂多糖等。

已发现如上定义的N-末端截短的CMAP-27衍生物仍保持抗菌作用，并且N-末端截短的CMAP-27衍生物还维持了它们的免疫调节作用。通过N-末端截短的CMAP-27衍生物中和LPS-引起的促炎细胞因子(IL-1β)转录的能力，表现出了这种免疫调节作用。然而，还发现所有CMAP-27衍生物，包括如上所述的N-末端截短的衍生物表现出了免疫激活活性，这将它们与已知的(N-末端截短)CMAP27衍生物相区分。这些免疫激活作用可以包括多种机制，其包括通过增加的DNA吸收的增强的Toll-样受体激活、通过免疫细胞产生的细胞因子/趋化因子的刺激、直接趋化作用、增强的吞噬作用和免疫细胞增殖和分化的刺激，并且它们与先前公开的肽衍生物的免疫调节和抗生素作用不同。

本发明的一部分在于对于化合物来说，当在疫苗接种，特别是卵内疫苗接种中使用时，这些免疫激活作用，特别是对免疫细胞增殖和分化的作用是巨大的优势。

实施例

实施例1-卵内给予的CMAP-27衍生物肽的效力

将DCATH2肽(CMAP1-26的完全D-氨基酸类似物)悬浮在胆固醇/PBS制剂中。在胚胎期18天时，用100μl含有DCATH2的混悬液在羊膜液中注射罗斯308蛋，然后放回到孵蛋箱中孵化(胚胎期约21天时)。用胆固醇/PBS制剂在羊膜液中注射两个对照组。基于22g的胚胎重，计算1mg/kg体重的肽剂量。孵化后，将鸟类转移至每个处理4栏(n＝40只/组)。孵化后3天，除阴性对照外，以5×10⁶CFU/鸟的剂量，对所有的鸟类皮下接种禽致病性肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)pt13a株。激发(攻毒，challenge)2天后，每组处死12只鸟类，并采集样品用于血液和器官分析。采集血液样品以确定总白细胞计数和白细胞分化。在7天激发期内，每天记录死亡率。在感染7天后的激发期结束时，处死所有剩余的鸟类并检查左侧和右侧胸部气囊(肺泡，thoracic air sacs)、肝脏和心脏用于病变评分。

注射后2天获得的血涂片分析显示，与未感染的鸟类相比，用本发明的化合物处理的肉仔鸡(broiler chick)的外周血白细胞总数显著升高(图1A)。在未经处理的感染的鸟类中未出现这种增加。吉姆沙染色的血涂片中白细胞的手工计数显示，与未感染的鸟类相比，DCATH2处理的鸟类中外周血异嗜白细胞的绝对数显著更高(图1B)。异嗜白细胞数量不受感染状态影响。异嗜白细胞是哺乳动物嗜中性白细胞的禽类对应物，并且已表明在小鸟类中，异嗜白细胞在防止细菌感染中起关键作用。

在7天期间，确定了沙门氏菌病的发展以及沙门氏菌(Salmonella)-相关病变的严重程度。一旦肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis)激发，对于未经处理的感染的鸟类，死亡率逐渐增加至高达35％。对于DCATH2处理的鸟类，观察到多至p.i.3天的迟延(图2A)。7天(p.i.)时，对于DCATH2处理的鸟类，死亡率降低了50％(图2B)。

未经处理的感染组中，沙门氏菌病阳性鸟类(即平均病变记分>1的鸟类)的百分比为约85％；在DCATH2处理组中，这降低了53％(图3A)。另外，DCATH2-处理的鸟类中，沙门氏菌病阳性鸟类中病变的严重程度降低了69％(图3B)。

总之，在p.i.7天时，用1mg/kg DCATH2肽卵内处理使沙门氏菌属(Salmonella)-引起的死亡率降低了50％，在存活的鸟类中，沙门氏菌病阳性鸟类的数目减少了53％，并且病变严重程度降低了69％。通过增强的异嗜白细胞募集和造血作用，可以部分解释DCATH2处理的鸟类中对沙门氏菌属(Salmonella)激发敏感性的降低。

实施例2-卵内给予肽之后，防止大肠杆菌(E.coli)感染。

将DCATH2肽悬浮在胆固醇/PBS制剂中。在胚胎期18天时，用100μl含有DCATH2的混悬液在羊膜液中注射罗斯308蛋，然后放回到孵蛋箱中孵化(胚胎期约21天时)。用胆固醇/PBS制剂在羊膜液中注射两个对照组。基于22g的胚胎重，计算1mg/kg体重的DCATH2肽剂量。孵化后，将鸟转移至每个处理的隔离单元(n＝54只/组)。孵化后3天，除阴性对照外，以1×10⁶CFU/只鸟的剂量，对所有的鸟气管内接种禽致病性大肠杆菌(Escherichia coli)506株(UU株)。激发后2天，每组处死13只鸟，并将其用于采集血液和器官分析的样品。采集血液样品以确定总白细胞计数和白细胞分化。在7天激发期内，每天记录死亡率。在感染后7天的激发期结束时，处死所有剩余的鸟类并检查左侧和右侧胸部气囊、肝脏和心脏用于病变评分。

在7天的时期内，确定大肠杆菌病的发展。p.i.2天时，与未经处理的未感染的鸟类相比，DCATH2卵内处理的鸟表现出显著较高的外周血白细胞和异嗜白细胞的绝对数(图4)。如果与未处理、未感染的动物相比，在DCATH2处理的鸟中，发现单核细胞和淋巴细胞的绝对数无差异。

大肠杆菌(E.coli)激发导致未经处理的感染的鸟类中死亡率逐渐增加至高达27％(图5A)。p.i.7天时，对于DCATH2卵内处理的鸟类，死亡率降低了30％(图5b)。

未经处理的感染组中，大肠杆菌病阳性鸟类的百分比为65％；在DCATH2处理的鸟类中，这减少了52％(图6A)。在CATH2处理的鸟类中，大肠杆菌病-相关病变的严重程度降低了64％(图6B)。此外，通过DCATH2的卵内处理，大肠杆菌(E.coli)的气囊定殖(colonization)也降低了93％(图7)。

总之，在p.i.7天时，用1mg/kg DCATH2肽卵内处理使(呼吸道)大肠杆菌(E.coli)-引起的死亡率降低了30％，在存活的鸟中，大肠杆菌病阳性鸟的数目减少了52％，并且病变严重程度降低了64％，大肠杆菌(E.coli)的气囊定殖降低了93％。通过增强的异嗜白细胞募集和造血作用，可以部分解释DCATH2处理的鸟中对大肠杆菌(E.coli)激发敏感性的降低。

实施例3-通过卵内处理小鸡导致体重增加

将DCATH2肽和截短类似物D-CMAP(1-21)和D-CMAP(4-21)悬浮在胆固醇/PBS制剂中。在胚胎期18天时，用100μl含有肽的混悬液注射在罗斯308蛋的羊膜液中，然后放回到孵蛋箱中孵化(胚胎期约21天时)。用胆固醇/PBS制剂在羊膜液中注射两个对照组。基于22g的胚胎重，计算1mg/kg体重剂量的肽。孵化后，将所有的鸟分别称重(D0)并转移到每个处理的隔离单元(n＝120只/组)。鸟无限制喂食并在孵化后第7天(D7)，评估每只鸟的体重。

在胚胎期18天时的肽处理不影响孵化率(表1)。

胚胎发育18天时的卵内肽处理不显著影响孵化时幼仔鸡的体重(D0，图8A)。然而，在孵化后7天，与媒介物(medium)处理的鸟类相比，用1mg/kg肽DCATH2、D-CMAP(1-21)或D-CMAP(4-21)卵内处理的鸟表现出显著更大的体重(图8B)。

表1.效力实验III。在胚胎发育18天的胚胎中，用1mg/kg肽或媒介物注射的罗斯308蛋的孵化率。

卵内处理	孵化率
		媒介物	98％
1mg/kg DCATH2	97％
		1mg/kg D-C(1-21)	95％
1mg/kg D-C(4-21)	94％

实施例4-CMAP27衍生的肽的体外抗菌活性

将用于证明DCATH2肽的卵内效力的禽致病性大肠杆菌(Escherichia coli)O78(APEC O78)野外分离株(field isolate)用于检验CMAP27衍生的肽的体外抗菌活性。将在37℃，Mueller-Hinton肉汤(MHB)中生长过夜的培养物在50％Mueller-Hinton肉汤中稀释至2×10⁶CFU/ml的浓度，并在96孔聚丙烯微孔板中以1:1的比值与肽(最终浓度1.25至40μM)混合。孵育3h后，将样品在培养基中顺次稀释，并涂布到胰蛋白胨大豆琼脂培养基上，并在孵育24h后计数。所有测试的肽对APEC O78野外分离株表现出抗菌活性，其最小抑菌浓度在5至14μM的范围内(图9A)。

为了测试肽是否能够在更困难的条件(例如，在存在盐和血清蛋白的情况下)下抑制细菌，将APEC O78与肽在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中孵育。简要地，通过以下估计细菌存活率：将在存在或不存在5μM肽的情况下，在DMEM/10％FCS中，在37℃下将3×10⁵CFU/ml APEC O78孵育2h，然后制备连续的稀释物，涂布到琼脂培养基上并在37℃孵育24h后对集落计数来估计细菌存活率。与MHB培养基中的测试相反，在含有10％胎牛血清的DMEM中测试的肽中，仅CMAP1-26-NH₂、CMAP1-21-NH₂和CMAP4-21-NH₂显著抑制细菌生长(图9B)，对CMAP1-26-NH2来说，低于100个细胞/毫升的检测限。

使用J774.A1细胞(鼠巨噬细胞系)检验通过活的或者热杀死的APEC O78引起的肽-介导的巨噬细胞活化抑制。出于此目的，将在含有10％FCS的DMEM中培养的J774.A1细胞(150,000个细胞/孔)，在37℃，2h期间，暴露于具有或不具有5μM肽的3×10⁵CFU/ml APECO78，然后收集上清液并用于确定TNFα产生(ELISA)。在这些条件下，在不存在肽的情况下，活的和热杀死的(70℃，30分钟)细菌均强烈引起通过J774.A1细胞的TNFα产生(图9C)。肽CMAP1-26-NH₂和CMAP1-21-NH₂显著抑制通过活的和热杀的细菌引起的TNFα产生。

此外，CMAP1-21-NH₂的N末端截短导致逐渐丧失了由热杀死的细菌引起的抑制TNFα的产生，并且导致完全丧失了通过活的细菌引起的抑制TNFα的产生。在这些条件下，缺乏抗菌活性的肽，例如CMAP7-21-NH₂还在某种程度上抑制通过热杀死的细菌引起的TNFα产生。

总之，CMAP27衍生的肽表现出体外抗菌活性，包括在具有相对高的盐和血清蛋白的条件下。对于肽CMAP1-21-NH₂的进一步的N末端截短，直接抗菌活性快速丧失。此外，抗菌活性的这种丧失与肽抑制通过活的细菌产生的TNFα产生的能力相关。

实施例5-在HD11细胞中的趋化因子的诱导。

将HD11细胞(小鸡巨噬细胞系)接种到96孔组织培养处理的板(2×10⁵个细胞/mL)中的RPMI-1640/10％FCS中，并在37℃(5％CO₂)与添加肽(20μM)的培养基孵育4h或24h。通过实时PCR确定白介素-1β、-8(CXCLi2)、单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)和RANTES(CCLi4)的转录水平。

发现CMAP1-26-NH₂在HD11细胞中引起趋化因子CXCLi2/IL-8、MCP-3和CCLi4/RANTES的转录，而不引起促炎细胞因子IL-1β的转录(图10)。在HD11细胞中，检验截短类似物引起趋化因子转录的能力。CMAP1-21-NH₂多至15个氨基酸残基的N末端截短类似物(即CMAP7-21-NH2)维持了引起CXCLi2和MCP-3转录的能力。需要延长刺激(24h)来引起CCLi4的表达。

总之，在HD11细胞中，通过CMAP-衍生的肽对趋化因子表达的选择性诱导表明这些肽对单核细胞/巨噬细胞具有间接趋化作用，并且表明体内这些肽可以以这种方式参与免疫细胞的招募和活化。

作为阳性对照，使用了LL-37，人抗菌肽(参见，例如，Durr,U.H.等人,2006,Biochim.Biophys.Acta 1758:1408-1425；Zuijderduijn,S.等人,2006,J.AllergyClin.Immunol.117:1328-1335)。

实施例6-CMAP27衍生的肽的体外抗炎活性

将HD11细胞接种于96孔组织培养处理的板(2×10⁵个细胞/mL)中的RPMI-1640/10％FCS中。在37℃(5％CO₂)，将最终浓度50ng/mL的明尼苏达沙门氏菌(Salmonellaminnesota)LPS，与或不与20μM肽预孵育30分钟，应用于细胞并孵育4h和24h。A)通过实时PCR确定白介素-1的转录水平(仅4h)。B)采集上清液，使用Griess测试用于测定一氧化氮产生(仅孵育24h)。

在HD11细胞中，CMAP1-26-NH₂肽(90.8％)和截短类似物CMAP1-21-NH2(93.5％)和CMAP4-21-NH₂(80.5％)阻断了LPS-引起的IL-1β表达(图11A)。肽CMAP1-26-NH₂和CMAP1-21-NH₂分别将LPS-诱导的(50ng/mL)NO产生阻断96.2％和78.9％，而CMAP4-21-NH₂将NO产生中和了51％(图11B)。

截短类似物中色氨酸残基对苯丙氨酸的取代显著增加了它们阻断HD11细胞中LPS-引起的IL-1β表达的能力(图12A)，从而将肽CMAP4-21-NH₂介导的抑制从80.5％调节至95.1％。此外，而肽CMAP7-21-NH₂和CMAP10-21-NH₂缺乏LPS-中和活性，它们的Phe/Trp取代的类似物强烈抑制LPS-诱导的通过HD11细胞的促炎细胞因子产生，分别抑制86.3％和71.9％。另外，在截短的CMAP27衍生的肽中，色氨酸对苯丙氨酸的取代似乎增加了C(1-21)和C(4-21)抑制LPS-引起的NO产生的能力(图12B)。

总之，CMAP27衍生的肽能够中和脂多糖-引起的促炎介质的产生，如IL-1和一氧化氮，并且以这种方式可以降低过度的炎症反应。此外，苯丙氨酸残基的取代可以用于增加/引入CMAP27衍生的肽的抗炎能力。

实施例7-CMAP27衍生的肽增加通过DNA的免疫细胞的吸收的活化。

为了研究肽对DNA吸收的影响，将HD11细胞以3×10⁵个细胞接种到24-孔板中，用2.5nM Alexa-Fluor 488标记的ODN-2006，在存在和不存在CMAP27衍生的肽(5μM)的情况下刺激4h，然后通过流式细胞术分析DNA吸收。在相同条件下，17h后通过收集上清液检测HD11细胞的激活并确定一氧化氮的产生。

CMAP27衍生的肽CMAP1-26-NH₂、CMAP1-21-NH₂、CMAP4-21-NH₂、CMAP5-21-NH₂和CMAP7-21-NH₂均增强了HD11细胞的ODN-2006的吸收(图13A)并且增加DNA-引起的一氧化氮产生(图13B)。增大的DNA吸收和DNA-引起的活化是相关的，这表明通过CMAP27衍生的肽增强的DNA吸收是增强DNA-诱导的激活中的重要的步骤。

总之，在存在CMAP27衍生的肽的情况下，可以通过感染的免疫细胞更容易地检测细菌CpG-DNA。

Claims

1.N-末端截短的CMAP27-衍生物，其中所述衍生物选自由以下组成的组：CMAP4-21、CMAP5-21、CMAP6-21、CMAP7-21、CMAP8-21、CMAP9-21、CMAP4-21(F5→W)、CMAP4-21(F5→Y)、CMAP4-21(F12→W)、CMAP4-21(F12→Y)、CMAP4-21(F5、F12→W)、CMAP4-21(F5、F12→Y)、CMAP4-21(F5→W、F12→Y)、CMAP4-21(F5→Y、F12→W)、CMAP7-21(F12→W)和CMAP7-21(F12→Y)，其中CMAP27具有氨基酸序列RFGRFLRKIRRFRPKVTITIQGSARFG。

2.根据权利要求1所述的N-末端截短的CMAP27-衍生物制备用于小鸡的卵内接种的疫苗的用途，其中所述N-末端截短的CMAP27-衍生物选自由CMAP4-21、CMAP5-21、CMAP6-21和CMAP7-21组成的组。

3.一种免疫组合物，包含根据权利要求1所述的N-末端截短的CMAP27-衍生物。

4.根据权利要求1所述的N-末端截短的CMAP27-衍生物用于制备治疗禽类传染病的药物的用途。

5.根据权利要求1所述的N-末端截短的CMAP27-衍生物制备用于给予禽类的抗生素药物的用途。

6.根据权利要求1所述的N-末端截短的CMAP27-衍生物制备用于增加动物的体重的组合物的用途，其中所述动物是禽类。

7.通过用根据权利要求1所述的N-末端截短的CMAP27-衍生物卵内接种禽类物种的卵用于增加所述禽类体重的方法。