KR101127476B1

KR101127476B1 - 크링글 도메인의 구조에 기반한 단백질 골격 라이브러리 및 그 용도

Info

Publication number: KR101127476B1
Application number: KR1020090071955A
Authority: KR
Inventors: 김용성; 권명희; 이창한
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2008-08-11
Filing date: 2009-08-05
Publication date: 2012-03-23
Also published as: EP2310559A2; US8492343B2; KR20100019964A; US20120021993A1; WO2010018950A2; JP2011530307A; EP2310559A4; JP5616890B2; WO2010018950A3; CN102149858A

Abstract

크링글 도메인 구조골격 유지에 중요한 보존된 아미노산 잔기를 제외한 잔기에 인위적인 돌연변이가 유도되도록 하는 단계를 포함하는 크링글 도메인 구조 골격에 기반한 단백질 골격 라이브러리 제조방법과 이 라이브러리에서 유래한 다양한 표적분자에 특이적으로 결합하여 표적분자의 생물학적 활성을 조절하는 크링글 도메인 구조기반 단백질 골격 돌연변이체를 제공한다. 또한 본 발명은 크링글 도메인의 구조기반 단백질 골격 단일체들의 조합을 통한 다중체 구축방법 및 다중 특이성을 부여하기 위한 다중체 생성방법을 제공한다. 또한 본 발명은 크링글 도메인의 구조기반 단백질 골격 단일체들의 루프 접목 (loop grafting)을 통해 다결합 단일체 (multivalent monomer) 및 다중특이성 단일체 (multispecific monomer)의 생성방법을 제공한다. 또한 본 발명은 표적분자에 특이적으로 결합하는 크링글 도메인 구조기반 단백질 골격 변이체, 그를 코딩하는 DNA, 또는 관련 분자의 유효량을 동물, 바람직하게는 사람에게 투여함을 포함하여, 질환 또는 장애, 특히 암 및 기타 면역질환관련 질환을 예방, 탐지, 진단, 치료 또는 경감하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

크링글 도메인, 단백질 골격 라이브러리, 비항체 단백질 구조 골격, 단백질 결합체, 치료용 단백질

Description

크링글 도메인의 구조에 기반한 단백질 골격 라이브러리 및 그 용도 {Protein scaffold library based on Kringle domain structure and uses thereof}

본 발명은 크링글 도메인 (Kringle domain)의 구조에 기반한 단백질 골격 라이브러리 구축 방법과 이 라이브러리에서 유래한 다양한 표적분자에 특이적으로 결합하여 표적분자의 생물학적 활성을 조절하는 크링글 도메인 구조기반 단백질 골격 라이브러리 및 돌연변이체 및 크링글 도메인의 구조기반 단백질 골격 단일체의 조합을 통한 다중체 구축방법 및 다중 특이성을 부여하기 위한 다중체 생성방법에 관한 것이다.

또한 본 발명은 크링글 도메인의 구조기반 단백질 골격 단일체들의 루프 접목 (loop grafting) 을 통해 다결합 단일체 (multivalent monomer) 및 다중특이성 단일체 (multispecific monomer)의 생성방법을 제공한다.

단백질의 아미노산 서열과 2차, 3차 구조를 분석하면 많은 단백질들이 독립적인 도메인 (domain, 또는 module)으로 구성되어 있다. 도메인은 구조적 기능적 독립적인 단위이다. 동일한 도메인은 여러 단백질에 하나 이상으로 분포될 수 있 으며, 하나의 단백질은 여러 도메인으로 구성될 수 있다. 도메인의 구체적인 정보는 Prosite (Hulo N 등, Nucleic Acids Res, 36:D245-249, 2008; Website: http://kr.expasy.org/prosite/), SMART (Letunic I 등, Nucleic Acids Res, 34:D257-D260, 2006; Website: http://smart.embl-heidelberg.de/)등의 생물정보학 웹사이트에서 탐색할 수 있으며, 대표적인 도메인의 예는 immunoglobulin-like, 파이브로넥틴 II, III (Fibronectin), 크링글 등이다.

생체분자간 상호작용 (예, 단백질-단백질, 단백질-핵산, 등)은 세포의 생장, 분화, 발달, 세포간/내에서의 신호전달, 물질이동 등 다양한 생명현상을 일으키는 중요한 기능을 한다. 기존에 표적분자에 특이적으로 결합하여 생물학적 활성을 조절하는 분자로서, 항체 (전체 또는 절편)가 주도적으로 개발되어져 왔다. 하지만, 항체의 문제점은 발현 양이 적고, 용해도가 낮으며, 동물세포 발현 세포주을 써야하고, 정제비용이 비싸고, 환원적 세포내 환경에서 안정성이 떨어지는 여러 문제 등이 있다. 따라서, 항체의 문제점을 극복하면서 항체처럼 표적분자 (targeted molecules)에 특이적으로 결합하는 특성을 지닌 항체외 단백질을 개발하려는 노력이 진행되고 있다 (총설논문: Hey 등, Trends in Biotech. 23:514-522, 2005; Skerra, Current Opin. Biotech., 18:295-304, 2007). 이러한 단백질들을 단백질 골격 (protein scaffold), 대체단백질 골격 (alternative protein scaffold), 대체 골격 (alternative scaffold), 비항체 단백질 골격 (non-antibody protein scaffold), 또는 대체 단백질 결합체 (Alternative binding protein)라 한다 (이하 단백질 골격이라 칭함) (총설논문: Skerra A, FEBS J, 275:2677-2683, 2008; Skerra, Current Opin. Biotech., 18:295-304, 2007; Nygren P 등, J Immunol Method, 290:3-28, 2004). 모델 단백질 골격은 구조적인 안정성을 부여하는 부위의 아미노산 서열은 보존시켜 구조 골격은 유지시키고, 표면에 노출되어 있는 잔기 또는 루프구조에 무작위 또는 디자인된 돌연변이를 유도하여 라이브러리를 구축한 다음, 표적분자에 특이적으로 결합하는 돌연변이체를 분리한다.

크링글 도메인은 인간을 포함한 다양한 종의 단백질에 독립적인 모듈로 존재하며, 그 수는 한 개에서 수십 개까지 하나의 단백질에 존재한다 (표 1 참조) (Castellino 등, J Mol Evol, 26:358-369, 1987; Ikeo 등, J Mol Evol, 40:331-336, 1995; Cao 등, Curr Med Chem-Anti-Cancer agents, 2:667-681, 2002). 자연계에 존재하는 다양한 생명체의 893개의 단백질에 아미노산서열이 다른 1663개의 크링글 도메인이 존재하고, 사람에는 31개의 단백질에 아미노산 서열이 다른 39개의 크링글 도메인이 분포되어 있다 (참조: Prosite (Hulo N 등, Nucleic Acids Res, 36:D245-249, 2008; Website: http://kr.expasy.org/prosite/; SMART (Letunic I 등, Nucleic Acids Res, 34:D257-D260, 2006; Website: http://smart.embl-heidelberg.de/) (Castellino 등, J Mol Evol, 26:358-369, 1987; Ikeo 등, J Mol Evol, 40:331-336, 1995). 각 크링글 도메인사이는 약 20 여개의 아미노산 연결고리 (inter-kringle domain)으로 구성되어 있다. 크링글 도메인의 정확한 기능은 아직 불확실하나, 다양한 생체분자 (예, 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 세포막, 인지질 등)에 결합능을 그 소속단백질에 부여하여, 그 소속된 단백질의 다양한 생물학적 활성을 조절한다 (Cao 등, Curr Med Chem-Anti-Cancer agents, 2:667-681, 2002). 크링글 도메인은 대표적으로 성장인자 (growth factors), 단백질 가수분해 효소 (proteases), 혈액응고인자 (coagulation factors), 막 단백질 수용체 (transmembrane receptors) 등에 산재해 있다 (Castellino 등, J Mol Evol, 26:358-369, 1987). 특히 크링글 도메인은 단독으로 또는 다른 단백질 (예, endostatin, angiostatin)의 속해있으면서 신혈관생성억제 (antiangiogenesis) 기능을 할 수 있다. Angiostatin의 경우 4개의 크링글 도메인을 가지고 있고, 이 구조가 angiostatin의 혈관생성 억제 기능에 필수적이다 (Cao 등, Curr Med Chem-Anti-Cancer agents, 2:667-681, 2002). 섬유소분해 (fibrinolysis)에 관여하는 플라스미노겐 (plasminogen) 과 플라스민 (Plasmin)에 존재하는 크링글 도메인의 라이신결합부위 (Lysine binding site)는 두 단백질의 세포외 기질 분자와 세포 수용체와 결합부위로 알려져 있어, 두 단백질의 기능인 섬유소분해 작용에 크링글의 라이신 결합부위가 중요하다 여겨진다 (Cao 등, Curr Med Chem-Anti-Cancer agents, 2:667-681, 2002).

단백질 명	크링글 도메인 수
Prothrombin	2
Plasminogen	5
Urokinase-type plasminogen activator (uPa)	1
Tissue-type plasminogen activator (tPa)	2
Blood coagulation factor XII (Hagenman factor)	1
Apolipoprotein A	38
Hepatocyte growth factor/Scatter Factor (HGF/SF)	4
Macrophage-stimulating protein (MSP)/HGF like protein	4
HGF activator	1
Kremen	1
Neurotrypsin/Motopsin	1
Plasma hyaluronan binding protein (PHBP)	1
Serine protease (Hermandid momus)	1
ROR 1&2	1
Drosophila neurospecific receptor kinase	1
Drosophila receptor kinase	1
C.elegans ROR receptor tyrosine kinase	1
Muscle specific tyrosine kinase (Musk) (Torpedo, Xenopus)	1

상기 표 1은 크링글 도메인을 포함하는 단백질 및 각 단백질의 크링글 도메인 수에 관한 것이다.

크링글 (Kringle)은 인간을 포함한 다양한 생명체의 여러 단백질에 독립적으로 3차 구조를 가지고 존재하는 도메인 (domain) 또는 모듈 (module)이다. 전형적인 크링글 도메인은 약 80 여개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 3개의 다이설파이드본드 (S-S bond)로 연결된 3차 구조를 가지고 있으며, 이 3개의 다이설파이드본드 결합이 구조적으로 단단한 여러 루프구조를 제공하고 있다 (Castellino 등, J Mol Evol, 26:358-369, 1987; Ikeo 등, J Mol Evol, 40:331-336, 1995; Castellino 등, Ciba Found Symp, 212:46-60, 1997; Marti 등, Biochemistry, 38:15741-15755, 1999). 전형적인 크링글 도메인의 다이설파이드 본드 결합 양상은 1-6, 2-4, 3-5 인데, 즉 시스테인1번과 80번 잔기사이에, 시스테인 22번-63번 잔기사이에, 시스테인 51-75번 잔기사이에 형성된다 (Ikeo 등, J Mol Evol, 40:331-336, 1995; Castellino 등, Ciba Found Symp, 212:46-60, 1997; Marti 등, Biochemistry, 38:15741-15755, 1999).

크링글 도메인은 자연계의 생명체에 존재하는 893개 이상의 (사람에는 31개의 이상) 단백질에 존재한다. 크링글 도메인은 구조적 안정성을 부여하기 위한 일부 아미노산이 보존되어 있고, 나머지 부분은 아미노산 또는 뉴클레오타이드 수준에서는 보존되어 있지 않다. 따라서 이러한 크링글 도메인의 전형적인 구조적 특성을 부여하는 아미노산 서열은 보존하여 구조골격 (예, 3개의 분자내 다이설파이드본드 결합 (다이설파이드 본드 결합 양상은 1-6, 2-4, 3-5) 및 이로 인해 생성되는 루프구조)를 이루게 하고, 구조적으로 유연한 루프구조 부분에 의도적인 또는 무작위로 돌연변이를 도입하여 다양한 자연계에 존재하지 않는 아미노산 서열 조합을 갖도록 돌연변이체 라이브러리를 구축하는 방법과 디자인 된 라이브러리에서 다양한 표적분자에 특이적으로 결합하는 크링글 도메인 구조 골격에 기반한 돌연변이체를 분리하여, 동정하고 특성을 규명할 필요가 명백하다. 또한 크링글 도메인 구조기반 돌연변이체는 표적분자의 생물학적 활성을 조절하여, 다양한 질환의 예방, 탐지, 진단, 치료 또는 경감하기 위한 방법 및 조성물로 개발될 수 있다.

본 발명의 목적은 크링글 도메인의 구조에 기반한 단백질 골격 라이브러리를 구축하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 크링글 도메인의 구조에 기반한 단백질 골격 라이브러리에서 유래한 다양한 표적 분자에 특이적으로 결합하여 표적분자의 생물학적 활성을 조절하는 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 표적분자에 특이적으로 결합하는 상기 크링클도메인 구조기반 단백질 골격 변이체를 코딩하는 DNA, 이를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 표적분자에 특이적으로 결합하는 상기 크링클도메인 구조기반 단백질 골격 변이체를 발현, 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 크링글 도메인 구조기반 단백질 골격 변이체의 단일체들에 인간 항체 IgG1의 Fc 도메인을 융합을 통해 avidity 및 면역 반응 유도를 부여하기 위한 Fc-융합 크링글도메인 변이체 생성 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 크링글 도메인 구조기반 단백질 골격 변이체의 단일체들의 조합을 통한 다중체 구축방법 및 다중 특이성을 부여하기 위한 다중체 생성방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 크링글 도메인 구조기반 단백질 골격 변이체의 단 일체들의 루프 접목 (loop grafting)을 통해 다결합 단일체 (multivalent monomer) 및 다중특이성 단일체 (multispecific monomer)의 생성방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 크링글 도메인 구조기반 단백질 골격 변이체의 유효량을 동물, 바람직하게는 사람에게 투여함을 포함하여, 질환 또는 장애, 특히 암 및 기타 면역질환관련 질환을 예방, 탐지, 진단, 치료 또는 경감하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 크링글 도메인 구조골격 유지에 중요한 보존된 아미노산 잔기를 제외한 잔기에 인위적인 돌연변이가 유도되도록 하는 단계를 포함하는 크링글 도메인 구조 골격에 기반한 단백질 골격 라이브러리 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서 크링글 도메인 구조골격 유지에 중요한 보존된 아미노산 잔기는 C1, G6, Y9, D10, G11, T16, G19, C22, Q23, W25, P30, H31, H33, G34, K48, N49, Y50, C51, R52, N53, P54, D55, P61, W62, C63, F64, T65, E73, L74, C75, P78, R79, 또는 C80인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 인위적인 돌연변이는 아미노산 잔기 2, 3, 4, 5, 7, 8, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 24, 26, 27, 28, 29, 32, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 56, 57, 58, 59, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 76, 또는 77에서 일어나며, 이들 잔기가 삭제 또는 세린, 타이로신, 프로 린, 히스티딘, 쓰레오닌, 아스파라긴, 알라닌, 아스파테이트, 글루타민, 알기닌, 라이신, 글루탐산 또는 글라이신인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

상기에서 크링글 도메인 잔기 (residues) 번호는 (numbering system)은 크링글 도메인 표준번호 시스템 (standard KD numbering convention)에 의한다 (Cao Y et al. (2002) Curr. Med. Chem. Anticancer Agents, 2(6): 667-681 ; Marti DN et al. (1999) Biochemistry 38(48):15741-15755).

본 발명의 또 다른 구체예에 있어서, 본 발명의 제조방법은 자연계에 존재하는 크링글 도메인의 유전자를 주형으로 하여 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여, 크링글 도메인 구조골격 유지에 중요한 보존된 아미노산 잔기를 제외한 잔기에 인위적인 돌연변이가 유도되도록 하여, 자연계에 존재하지 않은 아미노산 서열을 갖는 크링글 도메인 구조 골격에 기반한 단백질 골격 라이브러리 제조방법을 제공한다.

여기서 상기 라이브러리로부터 유래한 돌연변이체는 하기 아미노산 서열을 갖는 크링글 도메인 구조 기반 단백질 변이체이며,

CXxXxGXxYDGXxXxTXxGXxCQXWXxXxPHXHGXxXxXxXxXxXxKNYCRNPDXxXxPWCFTXxXxXxXELCXxPRC(서열번호;19)

상기 서열에서 여기서 X는 세린, 타이로신, 프로린, 히스티딘, 쓰레오닌, 아스파라긴, 알라닌, 또는 아스파테이트인 것을 특징으로 하고, x는 글루타민, 알기닌, 라이신, 글루탐산 또는 글라이신인 것을 특징으로 하고,

본 발명의 일 구체예에 있어서, 크링글 도메인은 플라스미노겐의 크링글 도 메인인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택된 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 크링글 도메인의 예는 플라스미노겐의 크링글 도메인인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하며, 상기 플라스미노겐의 크링글 도메인은 서열번호 49에 기재된 아미노산 서열 및 상기 아미노산 서열에 하나 이상의 치환, 결손, 역위 또는 전좌 등의 돌연변이가 유도된 돌연변이체 플라스미노겐의 크링글 도메인도 본 발명의 권리범위에 포함된다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 플라스미노겐의 크링글 도메인을 코딩하는 유전자는 서열번호 50에 기재된 염기 서열을 가지는 유전자 또는 유전자 코드의 디제러시 등을 고려하여 이 서열과 80% 이상의 상동성을 가지는 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 본 발명의 단백질 골격 라이브러리 제조방법으로 제조된 크링글 도메인에 기반하여 구축된 단백질 골격 라이브러리를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 라이브러리는 서열번호 13에 기재된 라이브러리인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하며, 본 발명의 바람직한 실시예에 있어서, 상기 라이브러리는 서열번호 14 내지 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 골격 라이브러리인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 단백질 골격 라이브러리를 표적분자와 반응시켜 표적분자에 특이적 고친화도를 가지는 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 변이체를 선 별하는 방법을 제공한다.

본 발명의 상기의 변이체 선별방법에 있어서, 상기 표적 분자의 예는 세포사멸수용체(DR)4, 세포사멸수용체(DR)5, 종양괴사인자 알파, 당단백질 IIβ/IIIα 수용체(Glycoprotein IIb/IIIa receptor) 또는 당단백질 IIβ/IIIα (Glycoprotein IIβ/IIIα), 혈관내피세포성장인자(VEGF;vascular endothelial growth factor), 혈관내피세포성장인자 수용체(VEGFR, vascular endothelial growth factor receptor), 타이로신 카이네이즈 억제제(tyrosin kinase inhibitor), 표피성장인자 수용체(Epidermal growth factor receptor), 혈소판유래 생장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 혈소판유래 생장인자 수용체 (platelet-derived growth factor receptor, PDGFR), 줄기세포인자수용체 (c-kit), Fms-양 티로신키나제-3 (Flt-3), 인터루킨 1 (interleukin 1), 인터루킨 6 (interleukin 6),인터루킨 32 (interleukin 32), 인터루킨 2 수용체 (interleukin 2 receptor), CD3, CD11a, CD14, CD15, CD16, CD20 CD32, CD64, 또는 Raf인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기의 표적분자에 특이적 고친화도를 가지는 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 변이체를 선별하는 방법에 의하여 제조된 표적분자에 특이적 고친화도를 가지는 크링글 도메인 돌연변이체를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 돌연변이체는 하기 서열 중 어느 하나를 가지는 크링글 도메인 구조에 기반한 단백질 골격 돌연변이체인 것이 바람직하고,

서열번호	클론 이름	아미노산 서열
20	KD404	CSRDKGYRYDGDGNKTLKGHKCQHWTKSKPHDHGYRHKLGNEDKFKKNYCRNPDTRAGPWCFTDQYRDRDELCYQPRC
21	KD408	CDRHKGPKYDGFRDRTHKGHKCQYWDKPRPHHHGHKHGDEFRNRLGKNYCRNPDSQAEPWCFTHKDKYKYELCYQPRC
22	KD409	CAKDKGDKYDGHKHKTNRGDKCQTWAKNRPHFHGHRFEVGHEHKIRKNYCRNPDDQDKPWCFTHGYRNQDELCDGPRC
23	KD413	CAKAEGTGYDGHEHKTHKGIRCQNWYKSKPHYHGHQFRDGDKIKNKKNYCRNPDPRAGPWCFTHGNRNRYELCNQPRC
24	KD415	CTRSKGDEYDGHKHKTNRGLRCQHWPGTKPHFHGDKIKDRHGFRLKKNYCRNPDPQDQPWCFTNRHQHKNELCNQPRC
25	KD421	CAGAEGNEYDGDKYKTHKGYRCQRWDKSRPHNHGNKDRHQHENKVGKNYCRNPDNEAEPWCFTDQHKHGNELCDRPRC
26	KD437	CAKSRGYKYDGNRYKTNKGDKCQAWTKTKPHDHGHRHGHGDRFRNRKNYCRNPDHESKPWCFTYRDRYRHELCNRPRC
27	KD444	CHRTRGDKYDGYEHKTHGGHRCQHWTEPKPHYHGHRDRNKNGIRDKKNYCRNPDPRAEPWCFTNKNGDKHELCDKPRC
28	KD445	CHETKGHKYDGHRLRTNKGDRCQPWTKDKPHHHGFRDQYQVRYKLKKNYCRNPDDQNKPWCFTDGNQHEHELCNGPRC
29	KD449	CDRYKGYRYDGHRYKTHKGHKCQHWDEDQPHNHGHGHRIKDGFEVRKNYCRNPDAGTKPWCFTDKDQNRHELCYKPRC
30	KD456	CDKNRGNGYDGNEIQTDGGVQCQHWTKTKPHHHGLKLQHEHRVKHEKNYCRNPDARTQPWCFTDKHQHKDELCIEPRC
31	KD459	CSRYRGHKYDGYKHRTYKGYQCQSWTKDKPHHHGIRHRNKIRDRFGKNYCRNPDTQNQPWCFTYGDEYRYELCNKPRC
32	Consensus	CARDKGDKYDGHKHKTHKGHKCQHWTKDKPHHHGHRHRDKHRFKLKKNYCRNPDARAKPWCFTDKDRHRHELCNQPRC

본 발명의 다른 실시예에 있어서, 상기 돌연변이체는 하기 서열 중 어느 하나를 가지는 크링글 도메인 구조에 기반한 단백질 골격 돌연변이체인 것이 바람직하며,

서열번호	클론 이름	아미노산 서열
33	KD502	CAEDKGARYDGYQYRTHKGIKCQPWYQHEPHYHGHKDKIRHKNRNKKNYCRNPDAGDRPWCFTHRDKYEHELCNRPRC
34	KD503	CTQTKGHRYDGYKYETNWGHQCQAWTKHKPHLHGNGHRNRHKVGHEKNYCRNPDHRDGPWCFTNQYENENELCHQPRC
35	KD505	CPEDQGDEYDGHEHKTHRGNRCQSWYRPKPHNHGHRIKDRYKYKVKKNYCRNPDTQARPWCFTNRHRDEHELCDQPRC
36	KD506	CPEDRGHEYDGDGDKTNRGHGCQYWDQNKPHHHGHRDKDKFKHRIKKNYCRNPDYETGPWCFTNRYRNKNELCHEPRC
37	KD509	CAQSKGYRYDGDKDKTNKGHKCQDWAQNKPHVHGHRHEDRHQVKSRKNYCRNPDARARPWCFTNQVRYRNELCYKPRC
38	KD537	CTRTKGAKYDGYKHRTHEGNKCQSWNKARPHLHGDRLGNKYEHKARKNYCRNPDNRAEPWCFTDKNQNQHELCYGPRC
39	KD542	CNRAGGHKYDGDRYRTHRGDGCQNWAKTKPHHHGIGHRDKIRDKYRKNYCRNPDAKNGPWCFTNRNGDKNELCIQPRC
40	KD548	CHQTQGPKYDGNKDKTHKGHKCQSWTKNRPHHHGNKIENEDENRFQKNYCRNPDNKHEPWCFTHGHRDKHELCHEPRC
41	KD555	CDGAQGNGYDGNKHKTHRGNKCQAWPKHGPHYHGNGDQDGHRNKHKKNYCRNPDTRSRPWCFTDQNGHKDELCHGPRC
42	KD559	CNKHKGPRYDGHKDKTNKGHECQPWNRPKPHDHGHKHQFKDKNRLEKNYCRNPDHRNEPWCFTHGNRNGDELCFRPRC
43	Consensus	CTEDKGHRYDGDKHKTHKGHKCQSWNKHKPHHHGHRHKDRHKNKHKKNYCRNPDHRARPWCFTNRNRNENELCHRPRC

본 발명의 또 다른 실시예에 있어서, 상기 돌연변이체는 하기 서열 중 어느 하나를 크링글 도메인 구조에 기반한 단백질 골격 돌연변이체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

서열번호	클론 이름	아미노산 서열
44	KDT01	CYEDKGPQYDGDEYGTHKGHRCQNWDENRPHPHGIGHQHKHQVKDGKNYCRNPDDETEPWCFTHKDKYGHELCNRPRC
45	KDT02	CAQDGGPGYDGDKHGTHGGHECQDWTKDGPHIHGFRDQFRDEDQHGKNYCRNPDSQHGPWCFTNEDEHRNELCHEPRC
46	KDT08	CPKSGGNGYDGYKHGTNEGLQCQNWDRAKPHDHGIEVQNEYGDRHEKNNCRNPDDKTRPWCFTHKDRYRNELCYQPRC
47	KDT26	CPRDQGNQYDGFRYGTYRGHRCQHWTRDEPHFHGFGHQHKYTYRHKKNYCRNPDARPRPWCFTHRYQNRNELCHQPRC
48	Consensus	CDEDKGPGYDGDKHGTHKGHECQDWTKDRPHDHGHGDQHKYEDKHGKNYCRNPDDETRPWCFTHKDRNRNELCDQPRC

또한 본 발명은 동일 표적분자에 결합하는 본 발명의 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 변이체를 선별하는 방법에 의하여 생성된 단백질 골격 돌연변이체의 단일체를 이용하여 Fc 융합체, 동형다중체 (homo-oligomers) 또는 이형다중체 (hetero-oligomers)를 생성하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 두 개 이상의 다른 표적분자에 각각 특이적으로 결합하는 본 발명의 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 변이체를 선별하는 방법에 의하여 생성된 단백질 골격 단일체를 분리한 후, 링커를 이용하여 각각의 단일체들의 조합으로 다중체를 생성하여 다중 표적분자에 동시에 결합할 수 있는 다중체 제조방법을 제공한다.

또한 본 발명은 두 개 이상의 다른 표적분자에 각각 특이적으로 결합하는 본 발명의 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 변이체를 선별하는 방법에 의하여 생성된 단백질 골격 단일체를 분리한 후, 결합 루프 분석 (binding loop analysis)을 통한 단일체들의 루프 접목 (loop grafting)을 통해 다결합 단일체 (multivalent monomer) 및 다중특이성 단일체 (multispecific monomer)의 생성방법을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 표적분자에 특이적 고친화도를 가지는 크링글 도메인 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 표적분자에 특이적 고친화도를 가지는 크링글 도메인 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는 TNFα과발현 또는 과존재로 인해 초래되는 자가면역 질환치료 또는 예방용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에 있어서 단백질 골격 (protein scaffold 또는 template) 라이브러리에 활용되는 크링글 도메인은 자연계에 존재하는 다양한 생명체의 893개의 단백질에 분포되어 있는 아미노산 서열이 다른 1663개의 크링글 도메인, 또는 바람직하 게는 사람에서 유래한 31개의 단백질에 분포되어 있는 39개의 크링글 도메인을 포함한다 (참조: Prosite: http://kr.expasy.org/prosite/;SMART:http://smart.embl-heidelberg.de/).

본 발명에 있어서 크링글 도메인의 유래는 인간 유래의 단백질인 프로트롬빈 (Prothrombin), 플라스미노겐 (Plasminogen), 플라스민 (Plasmin), 유로키나제-타입 플라스미노겐 활성자 (Urokinase-type plasminogen activator, uPa), 조직-타입 플라스미노겐 활성자 (Tissue-type plasminogen activator, tPa), 혈액응고인자 XII (Blood coagulation factor XII, Hagenman factor), 아포리보단백질 A (Apolipoprotein A), 간세포 성장인자 (Hepatocyte growth factor/Scatter Factor, HGF/SF), 대식세포 자극 단백질 (Macrophage-stimulating protein (MSP)/HGF like protein), 크레멘 (Kremen), 뉴로트립신 (Neurotrypsin/Motopsin), 혈장 하알로난 결합 단백질 (Plasma hyaluronan binding protein, PHBP) 이 될 수 있다.

본 발명에 있어, 용어 표적분자는 단백질, 인지질, 세포막, 핵산 (DNA, RNA), 탄수화물, 이온 등 자연계에 존재하는 분자들을 의미하며, 이들의 단독분자 형태이든, 또는 이들의 복합체 분자들을 포함한다. 또한 표적분자는 세포, 조직, 또는 자연계에 존재하지 않은 새로운 형태의 분자도 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, 인간 유래 DR5는 (세포사멸수용체-5; TRAIL-receptor 2; DR5) TNF 수용체 패밀리의 일원이고 TRAIL에 결합하고, C-말단에 세포내 죽음 도메인 (death domain)을 갖는 수용체이다 (Pan 등, Science 277:815-818, 1997). DR5는 TRAIL에 결합하는 경우 다양한 암세포주에 대하여 생체외 (in vitro) 또는 생체 내 (in vivo)에서 에폽토시스을 유도한다.

본 발명에 있어서, 인간 유래 DR4는 (세포사멸수용체-4; TRAIL-receptor 1; DR4) TNF 수용체 패밀리의 일원이고 TRAIL에 결합하고, C-말단에 세포내 죽음 도메인 (death domain)을 갖는 수용체이다 (Pan 등, Science 276:111-113, 1997). DR4는 TRAIL에 결합하는 경우 다양한 암세포주에 대하여 생체외 (in vitro) 또는 생체내 (in vivo)에서 에폽토시스을 유도한다. (Pan 등, Science 276:111-113, 1997).

본 발명에 있어서, 인간 유래 TNFα(종양괴사인자, Tumor necrosis factor alpha)는 단일세포 (monocytes) 또는 대식세포 (macrophage) 등의 다양한 세포에서 분비되는 사이토카인 (cytokine)으로 다양한 기능을 가진 염증 촉진 단백질이다 (Pennica D등, Nature, 312:724-729, 1984; Feldmann M, Nature Rev. Immunol, 2:364-371, 2002; Zhang G, Curr Opin Struct Biol, 14:154-160, 2004). TNFα는 관절염 (arthritis), 인슐린 저항성 (insulin resistance), 지질대사 (lipid metabolism) 등의 다양한 질환에 연관되어 있다. TNFα의 수용체 TNF receptor (TNFR1, TNFR2)가 발현되는 다양한 세포에 세포사멸을 유도하여 질환을 유도한다 (Feldmann M, Nature Rev. Immunol, 2:364-371, 2002; Zhang G, Curr Opin Struct Biol, 14:154-160, 2004).

본 발명에 따른 크링글 도메인 구조에 기반한 단백질 골격 라이브러리 구축방법은 크링글 도메인의 전형적인 구조적 안정성을 부여하는 아미노산 서열은 유지하고 (예, 3개의 분자 내 다이설파이드본드 결합 (다이설파이드 본드 결합 양상은 1-6, 2-4, 3-5) 및 주위 보존된 아미노산 잔기), 다이설파이드본드 결합으로 인해 생성되는 루프구조 부분에 다양한 자연계에 존재하지 않는 아미노산 서열 조합을 갖도록 한다.

본 발명에 따른 크링글 도메인 구조에 기반한 단백질 골격 라이브러리를 통해 다양한 표적 분자에 특이적으로 결합하여 표적분자의 생물학적 활성을 조절하는 크링글 도메인 돌연변이체를 선별 분리해 낼 수 있다.

본 발명에 따른 표적분자에 특이적으로 결합하는 크링클 도메인 돌연변이체는 표적분자 특정한 부위 한 곳에만 붙는 것이 아니라 여러 부위에 특이적으로 붙을 수 있어, 표적분자에 다중클론 (polyclonal) 크링글 도메인 돌연변이체를 분리해 낼 수 있다.

본 발명에 따른 표적분자에 특이적으로 결합하는 상기 크링클 도메인 돌연변이체는 효모, 피키아 또는 동물 숙주세포에서 용액상태로 단일체로 발현, 정제할 수 있다.

본 발명에 따른 표적분자에 특이적으로 결합하는 크링클 도메인 돌연변이체는 단일체 또는 이들의 조합을 통해 다중체로 구축될 수 있고, 여러 표적분자에 대하여 각기 골라진 단일체들의 조합으로 하나 이상의 표적분자에 특이적으로 결합하는 다중 특이적 다중체를 생성할 수 있다.

본 발명에 따른 동일 표적분자의 다른 부위 또는 두 개 이상의 서로 다른 표적분자에 결합하는 단일체의 결합 루프 분석 (binding loop analyssi)을 바탕으로 동일 또는 다른 단일체의 다른 루프부위에 옮겨서 다결합 단일체 (multivalent monomer) 또는 다중특이성 단일체 (multispecific monomer)을 생성할 수 있다.

본 발명에 따른 표적분자 DR4 및 DR5에 특이적으로 결합하는 크링클 도메인 돌연변이체는 단일체로 다양한 암세포주에 대한 세포사멸을 유도할 수 있다. 또한 이들의 동일 표적분자에 대하여 다중체로 구축될 수 있고, DR4 및 DR5에 동시에 붙을 수 있는 이중 특이적 다중체를 생성하여, 암세포 세포사멸 효과를 극대화 시킬 수 있다. 여러 표적분자에 대하여 각기 골라진 단일체들의 조합으로 하나이상의 표적분자에 특이적으로 결합하는 다중 특이적 다중체를 생성할 수 있다. 또한 결합 루프 분석 (binding loop analysis)을 바탕으로 같은 표적분자에 대하여 각기 골라진 단일체들의 융합 혹은 결합 루프 접목을 통해 다결합 단일체 (multivalent monomer)를 생성할 수 있으며 다른 표적분자에 대하여 각기 골라진 단일체들의 루프 접목 (loop grafting)을 통해 다중특이성 단일체 (multispecific monomer)를 생성할 수 있다.

본 발명에 따른 표적분자 TNFα에 특이적으로 결합하는 크링클 도메인 돌연변이체는 단일체로 다양한 TNFα을 중화 (neutralization)시켜서, TNFα의 과량 존재로 인해 생성되는 질병 (예, 관절염, Crohns disease) 등에 사용될 수 있다. 또한 TNFα에 대하여 다중체로 구축될 수 있고, 표지분자 (예, Tags) 또는 항체의 불변영역 (Fc)부분 등과 융합되어 생물학적 활성을 극대화시킬 수 있다. 또한 다른 표적분자에 대하여 골라진 단일체들의 조합으로 하나 이상의 표적분자에 특이적으로 결합하는 다중 특이적 다중체를 생성할 수 있다. 또한 결합 루프 분석 (binding loop analysis)을 바탕으로 같은 표적분자에 대하여 각기 골라진 단일체들의 루프 접목(loop grafting)을 통해 다결합 단일체 (multivalent monomer)를 생 성할 수 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 크링글 도메인 돌연변이체의 단일체, 다중체, 융합단백질, 다결합 단일체 (multivalent monomer) 및 다중특이성 단일체 (multispecific monomer) 등의 유효량을 동물, 바람직하게는 사람에게 투여함을 포함하여, 질환 또는 장애, 특히 암 및 기타 면역질환관련 질환을 예방, 탐지, 진단, 치료 또는 경감하기 위한 방법 및 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 실시예는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 인공적인 단일체를 포함하는 단백질을 제공한다. 일부 실시예에서 그 단일체 도메인은 적어도 하나, 둘, 셋 또는 그 이상의 다이설파이드 결합을 포함한다.

본 발명에서 "단일체 도메인" 또는 "단일체"는 단백질 또는 폴리펩타이드에서 발견되는 독립된 부위를 의미한다. 단일체 도메인은 플랭킹 자연 아미노산 서열의 부존재하에서 용액에서 원래 3차 구조를 형성한다. 본 발명의 단일체 도메인들은 타깃 분자에 특이적으로 결합하기 위하여 선택될 수 있다.

본 발명에서 "루프"는 단일체 도메인 단백질의 골격 (scaffold) 구조의 결합에 의하여 환경에 전형적으로 노출되는 단일체 도메인 부위를 의미하고, 표적 분자 결합에 관여한다.

본 발명에서 "다중체"는 적어도 둘 이상의 단일체 도메인을 포함하는 펩타이드를 의미한다. 다중체 내의 분리된 단일체 도메인들은 링커에 의하여 연결될 수 있다.

본 발명의 "표적 분자" 는 단일 분자에서 복합 표적 분자까지 광범위한 물질 및 분자들을 포함한다. 표적 분자들은 단백질, 핵산, 지질, 탄수화물 또는 펩타이드 도메인에 의하여 인지될 수 있는 다른 분자들일 수 있다. 표적 분자들은 여기에 기재된 스크리닝 분석에서 포함되거나 특정 단백질 상호작용을 촉진 또는 저해하여서 정의될 수 있다.

본 발명에서 "링커"는 둘 이상의 독립적인 분리된 단일체 도메인을 연결하거나 결합하는 부위 또는 부위군을 의미한다. 링커는 독립적인 분리된 단일체 도메인을 다중체에서 함께 연결될 때 분리된 상태를 유지하게 한다. 적당한 링커는 폴리펩타이드, 폴리핵산 및 그 유사체를 포함한다. 적당한 링커는 탄소 골격에 삽입된 하나 이상의 산소 원자를 가지는 선택적으로 치환된 알킬렌을 포함한다. 링커는 원래 서열의 일부, 그것의 변이체 또는 합성 서열일 수 있다.

본 발명에서 "벡터"는 숙주에서 숙주 염색체와 독립적으로 복제될 수 있는 폴리뉴크레오타이드를 의미한다. 벡터들의 예는 플라스미드를 포함한다. 벡터들은 전형적으로 복제 오리진을 가지고, 전사 및 번역 종결자, 전사 및 번역 개시 서열 및 특정 핵산의 발현 조절에 유용한 프로모터를 포함할 수 있다.

본 발명에서 "재조합"이란 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산, 단백질 또는 천연 핵산 또는 단백질의 변경의 투여에 의하여 변형되는 것을 의미한다. 따라서 예를 들어 재조합 세포는 세포의 원래(비재조합) 형태에서는 발견되지 아니하는 유전자들을 발현하거나 그러하지 아니하면 전혀 발현되지 아니하거나 비정상적 또는 잘 발현하지 아니하는 천연 유전자들을 발현한다.

본 발명에서 "크링글 도메인 구조 기반 단백질 변이체" 또는 "크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체"란 자연계에 존재하는 크링글 도메인의 전형적인 구조적 안정성을 부여하는 아미노산 서열이 보존되어 크링글 도메인 특유의 구조골격 (예, 3개의 분자 내 다이설파이드본드결합 (다이설파이드 본드 결합 양상은 1-6, 2-4, 3-5) 및 이로 인해 생성되는 루프)는 가지나, 이 외의 루프구조에 자연계에 존재하지 않는 다양한 아미노산 서열의 조합을 가져, 크링글 도메인의 구조는 유지하나 자연계에 존재하지 않은 아미노산 서열을 갖는 단백질을 의미한다. 이러한 크링글 도메인 구조기반 단백질 변이체는 자연계에 존재하는 크링글 도메인이 결합하는 단백질 외에도, 다양한 표적분자에 특이적으로 결합하여 표적분자의 생물학적 활성을 조절할 수 있다.

본 발명에서 "단백질 골격 라이브러리"란 크링글 도메인의 전형적인 구조적 안정성을 부여하는 아미노산 서열지역은 보존시키고, 이 외의 루프구조 부분에 자연계에 존재하지 않는 다양한 아미노산 서열의 조합으로 이루어진 단백질 골격 총 집합체를 의미한다. 이러한 단백질 골격 라이브러리는 다양한 프라이머를 합성하여, overlapping PCR, DNA shuffling, error prone PCR, artificial DNA synthesis 등 다양한 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 이 증폭된 라이브러리는 효모 표면 발현 벡터 또는 동물세포 표면발현벡터에 삽입하고, 형질 전환하여, 발현할 수 있다. 단백질 골격 라이브러리의 크기는 제한될 수 없으나, 형질 전환되는 과정에서 크기가 제한되어 보통 라이브러리의 다양성은 10⁷-10¹³ 정도이다. 이렇게 발현된 단백질 골격 라이브러리에서 다양한 표적분자에 대하여 특이적으로 결합하는 특정 단백질골격 변이체를 선별, 분리해 낼 수 있다.

본 발명에서 "자연계에 존재하지 않은 아미노산"이란 자연적으로 일어나는 폴리펩타이드를 배열하여 해당 위치에서 발생하는 아미노산 이외의 아미노산을 의미한다.

본 발명의 다중체는 적어도 둘 이상의 단일체를 포함한다. 예를 들어 본 발명의 다중체는 2에서 약 4개, 2에서 약 8개, 2에서 약 10개, 3에서 약 10개의 단일체 도메인, 약 4개, 5개, 6개, 또는 약 7개의 단일체 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서 각 단일체 도메인은 한 표적 분자에 특이적으로 결합한다. 이들 실시예의 일부에서 각 단일체 도메인은 표적 분자 상의 다른 위치에 결합한다. 동일한 표적 분자에 결합하는 다중 단일체 도메인은 각 개별 단일체와 비교하여 표적 분자에 대한 다중체의 개량된 결합력을 내는 결합효과를 야기한다.

다른 실시예에서 다중체는 다른 표적 분자들에 대한 특이성을 가지는 단일체 도메인을 포함한다. 예를 들어 그러한 다양한 단일체 도메인의 다중체는 바이러스 복제 시스템의 다른 구성요소에 특이적으로 결합하거나 표적 세포 또는 조직 내의 다른 표적 분자에 결합할 수 있다. 유사하게 치료분자들을 세포 또는 조직 특이성을 가지는 다른 단일체 도메인을 포함하는 다중체의 단일체에 치료 물질을 결합하여서 세포 또는 조직에 표적할 수도 있다.

다중체는 단일체의 다양한 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어 단일 다중체에서는 선택된 단일체 도메인을 동일하거나 일치할 수 있다.

예를 들어 본 발명에서 다중체는 하기 중 하나 일 수 있다: (1) 동형-다중 체(동일한 도메인의 다중체, 즉A1-A1-A1-A1); (2) 이형-다중체, 즉 A1-A2-A3-A4.

본 발명에서 선택된 단일체 도메인은 링커에 의하여 연결되어 다중체를 형성할 수 있다.

링커에 의하여 선택된 단일체 도메인들의 연결은 당업계에 공지된 여러 기술들을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어 선택된 단일체를 코딩하는 폴리뉴크레오타이드의 조합적인 연결(combinatorial assembly)은 제한 효소 처리와 라이게이션, PCR-기반 셀프 프라이밍 오버랩 반응(PCR-based self-priming overlap reaction) 또는 다른 재조합 방법에 의하여 달성될 수 있다.

링커는 자연적으로 존재하거나 합성 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어 합성 링커는 서열과 크기가 랜덤화된 링커일 수 있다.

본 발명에서 선택된 단일체 도메인은 결합 루프 분석 (binding loop analysis)에 기반을 둔 단일체의 루프 접목 (loop grafting)을 통해 다결합 단일체 (multivalent monomer) 및 다중특이성 단일체 (multispecific monomer)를 형성할 수 있다.

결합 루프 분석 (binding loop analysis)은 실시예 도3에 기술된 루프1-7을 기반으로 효모세포발현 기술을 통해 달성될 수 있다.

단일체의 루프 접목 (loop grafting)은 당업계에 공지된 여러 기술들을 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어 선택된 단일체를 코딩하는 폴리뉴크레오타이드의 조합적인 연결(combinatorial assembly)은 제한 효소 처리와 리-라이게이션, PCR-기반 셀프 프라이밍 오버랩 반응 또는 다른 재조합 방법에 의하여 달성될 수 있다.

본 발명의 따른 크링글 도메인 구조에 기반한 단백질 골격 라이브러리 구축방법은 크링글 도메인의 전형적인 구조적 안정성을 부여하는 아미노산 서열은 유지하고, 다이설파이드본드 결합으로 인해 생성되는 루프구조 부분에 다양한 자연계에 존재하지 않는 아미노산 서열 조합을 갖도록 하여 크링글 도메인 구조에 기반한 단백질 골격 라이브러리를 통해 다양한 표적 분자에 특이적으로 결합하여 표적분자의 생물학적 활성을 조절하는 크링글 도메인 돌연변이체를 선별 분리해 낼 수 있는 효과가 있다.

본 발명에 따른 표적분자에 특이적으로 결합하는 크링글 도메인 돌연변이체는 표적분자 특정한 부위 한곳에만 붙는 것이 아니라 여러 부위에 특이적으로 붙을 수 있어, 표적분자에 다중 클론 (polyclonal) 크링글 도메인 돌연변이체를 분리해 낼 수 있다.

또한 본 발명에 따른 표적분자에 특이적으로 결합하는 상기 크링글 도메인 돌연변이체는 피키아 숙주세포에서 용액상태로 단일체로 발현, 정제할 수 있고, 이러한 단일체 또는 이들의 조합을 통해 다중체로 구축될 수 있고, 여러 표적분자에 대하여 각기 골라진 단일체들의 조합으로 하나 이상의 표적분자에 특이적으로 결합하는 다중 특이적 다중체를 생성할 수 있다.

예를 들어 본 발명에 따른 표적분자 DR4 및 DR5에 특이적으로 결합하는 크링클 도메인 돌연변이체는 단량체로 다양한 암세포주에 대한 세포사멸을 유도할 수 있다. 또한 이들의 동일 표적분자에 대하여 다중체로 구축될 수 있고, DR4 및 DR5 에 동시에 붙을 수 있는 이중 특이적 다중체를 생성하여, 암세포 세포사멸 효과를 극대화시킬 수 있다. 또한 이들의 동일 표적 분자에 대하여 단일체의 루프 접목 (loop grafting)을 통해 DR4 및 DR5에 동시에 붙을 수 있는 다결합 단일체 (multivalent monomer)를 생성하여, 암세포 세포사멸 효과를 극대화시킬 수 있다.

여러 표적분자에 대하여 각기 골라진 단일체들의 조합으로 하나이상의 표적분자에 특이적으로 결합하는 다중특이성 단일체 (multispecific monomer)를 생성할 수 있으며, 또한 본 발명에 따른 표적분자 TNFα에 특이적으로 결합하는 크링글 도메인 돌연변이체는 단량체로 다양한 TNFα를 중화 (neutralization)시켜서, TNFα의 과량 존재로 인해 생성되는 질병 (예, 관절염, Crohn's disease) 등에 사용될 수 있다. 또한 TNFα에 대하여 다중체로 구축될 수 있고, 표지분자 (예, Tags) 또는 항체의 불변영역 (Fc)부분 등과 융합되어 생물학적 활성을 극대화시킬 수 있다.

또한 표적분자에 대하여 골라진 단일체들의 조합으로 동형 다중체 (homo-oligomer)를 생성할 수 있다. 또한 단일체의 루프 접목 (loop grafting)을 통해 TNFα에 동시에 붙을 수 있는 다결합 단일체 (multivalent monomer)를 생성하여, 치료 효과를 극대화시킬 수 있다.

이와 같이 크링글 도메인 돌연변이체의 단량체, 다중체, 융합단백질 등의 유효량을 동물, 바람직하게는 사람에게 투여함을 포함하여, 질환 또는 장애, 특히 암 및 기타 면역질환관련 질환을 예방, 탐지, 진단, 치료 또는 경감하기 위한 방법 및 조성물을 제공할 수 있다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

실시예 1: 인간 크링글 도메인의 아미노산 서열과 구조의 특성

사람에는 31개의 단백질에 아미노산 서열이 다른 39개의 크링글 도메인이 분포되어 있다 (참조: Prosite (Hulo N 등, Nucleic Acids Res, 36:D245-249, 2008; Website: http://kr.expasy.org/prosite/; SMART (Letunic I 등, Nucleic Acids Res, 34:D257-D260, 2006; Website: http://smart.embl-heidelberg.de/) (Castellino 등, J Mol Evol, 26:358-369, 1987; Ikeo 등, J Mol Evol, 40:331-336, 1995). 크링글 도메인을 가지고 있는 대표적인 단백질을 예로 들면 아포리포단백질 A (apolipoprotein A :38 종류의 크링글 도메인), 혈액 응혈 인자 XII (blood coagulation factor XII :1 종류의 크링글 도메인), HGF (Hepatocyte growth factor :4 종류의 크링글 도메인), Hepatocyte growth factor like protein (Hepatocyte growth factor like protein :4 종류의 크링글 도메인), Hepatocyte growth factor activator, 플라스미노겐 (5 종류의 크링글 도메인), 트롬빈 (thrombin :2 종류의 크링글 도메인), TPA (Tissue plasminogen activator :2 종류의 크링글 도메인), 유로카이나아제-형 플라스미노겜 액티베이터(Urokinase-type plasminogen activator :1 종류의 크링글 도메인)이다.

도 1은 인간에 존재하는 아미노산 서열이 다른 39개의 크링글 도메인의 보존된 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 도 1에 보이는 바와 같이 각 크링글 도메인은 약 80개의 아미노산으로 구성되며, 특정 위치에 6개의 시스테인이 보존되어 있고 나머지 아미노산은 다양한 아미노산들이 혼재되어 있다 (Cao 등, Curr.Med.Chem. 12:667-681, 2002). 보존 비율에 따라 5가지 색으로 구분하였으며, 각 아미노산 자리에 존재하는 아미노산을 모두 표현하였다. 아미노산 서열이 덜 보존된 부분을 보면 매우 다양한 아미노산이 이미 존재할 수 있음을 보여주고 있다. 이는 크링글 도메인의 전형적인 구조적 안정성을 부여하는 아미노산 서열은 유지시키고 (예, 3개의 분자 내 다이설파이드본드 결합 (다이설파이드 본드 결합 양상은 1-6, 2-4, 3-5) 및 주위 보존된 아미노산 잔기), 아미노산이 상대적으로 덜 보존된 부분에 아미노산 조합 라이브러리를 구축할 수 있음을 보여준다.

도 2는 인간유래 크링글 도메인의 각 잔기에 가장 보존된 아미노산 및 이의 보존율을 도식적으로 나타내었다. 100% 보존된 잔기는 크링글 도메인의 구조적 안정성을 부여하는 시스테인 잔기 (Cys1, Cys22, Cys51, Cys63, Cys75, 및 Cys80)와 시스테인 주변 잔기들이다. 나머지 위치에서의 아미노산은 대부분 70% 이상 또는 40% 이상의 보존율을 보이고, 35번 잔기의 가장 보존된 아미노산이 Gly이고, 이의 보존율은 35% 정도이다. 전형적인 크링글 도메인의 2차원적 구조의 특성은 보존된 6개의 시스테인 잔기사이의 다이설파이드의 결합으로 주어지며, 결합 양상은 1-6, 2-4, 3-5 인데, 즉 시스테인 1번과 80번 잔기사이에, 시스테인 22번-63번 잔기사이에, 시스테인 51-75번 잔기사이에 형성된다 (Ikeo 등, J Mol Evol, 40:331-336, 1995; Castellino 등, Ciba Found Symp, 212:46-60, 1997; Marti 등, Biochemistry, 38:15741-15755, 1999). 보존된 6개의 시스테인은 디슐파이드 결합을 구성해 크링글 도메인의 구조적 안정성을 높여준다 (Magnusson 등, Leiden Universitaire Pers. pp. 25, 1975).

도 3은 플라스미노겐의 크링글 도메인 2의 (PDB ID= 1I5K) 3차 구조를 바탕으로, 아미노산 서열이 덜 보존되어 있는 7 개의 루프를 나타낸 것이다. 도 3a, b는 플라스미노겐 크링글 도메인 2의 이차 구조 및 3 개의 다이설파이드 결합을 보여주며, 도 3c, d는 플라스미노겐 크링글 도메인 2의 표면을 보여준다. 항체의 CDR (complementarity determining region)처럼 다양한 표적 분자와 고친화도, 고특이성을 가진 단백질 구조골격을 개발하기 위해서는, 우선 구조적 안정성을 부여하는 불변의 아미노산이 영역이 있고, 주위에 돌연변이가 들어갈 수 있는 유연성이 있는 루프구조를 갖는 단백질이 최적이다. 이러한 측면에서, 크링글 도메인 접힘에 기반을 두어 다양한 아미노산 조합이 들어갈 수 있는 루프1부터 루프7까지의 부분을 정했다. 루프1은 잔기 2-13, 루프2는 잔기 14-21, 루프3은 잔기 23-36, 루프4는 잔기 37-50, 루프5는 잔기 52-62, 루프6은 잔기 64-74, 루프7은 잔기 76-79이다. 플라스미노겐 크링글 도메인 2는 ~26%의 β-병풍구조 (β-pleated), ~13%의 β-꺽임 (β-turn), ~15%의 3₁-나선구조, ~6%의 3₁₀-나선구조을 가지고, 나머지는 무작위 루프의 구조적 특징을 가지고 루프3은 Marti DN 등, Biochemistry, 38:15741-15755, 1999).

실시예 2: 크링글 도메인 구조기반 변이체 단일체들의 융합을 통한 다중체 구축방법, 다중 특이성의 다중체 생성방법 및 표지분자 융합 구축방법,

도 4는 크링글 도메인의 구조에 기반한 단백질 골격 라이브러리를 구축하여, 표적분자에 특이적으로 결합하는 단백질 골격 단일체를 분리하여 그 활용을 도식화 하여 나타낸 것이다. 도 4a는 표적분자에 결합하여 표적분자의 생물학적 활성을 제어할 수 있는 단일체로의 활용방법, 도 4b는 선별된 단일체의 링커에 의한 연결을 통한 단일체들의 조합으로 이배체, 삼배체 등의 동형다중체 (homo-oligomers) 또는 이형다중체 (hetero-oligomers)을 생성하여 표적분자에 고친화도와 특이성을 가지고 결합토록 활용할 수 있는 방법을 도식적으로 보여준다. 이형다중체 중 표적 분자가 다를 경우의 장점은 표적분자 A, B를 동시에 인식하여 표적분자의 생물학적 활성을 새롭게 조율할 수 있다. 물론 표적분자가 두 종류에 한정되지 않고, 여러 개가 되어 다중특이적인 (multispedific) 다중체를 생성할 수 있다. 다중체를 구축, 생성했을 때의 장점은 표적분자에 대한 친화도가 avidity효과 때문에 증가하고, 다양한 표적분자 부위에 결합하는 단일체의 조합으로 표적분자의 생물학적 활성을 효율적으로 조율할 수 있고, 단일체보다 크기가 커서 약물동력학적 (pharmacokinetics) 측면에서도 장점이 있다. 도 4c는 선별된 크링글 도메인에 기반해, 표지분자 (예, 6XHis tags, C-myc tag, Zinc-fingers, coiled-coil 단백질, DNA binding 단백질, 효소 등) 또는 항체의 불변영역 (Fc)이 융합된 융합단백질을 구축하여 단백질 골격 단일체에 추가적인 기능을 부여하는 방법을 도식적으로 보여준다. 표지분자가 융합되면 표지분자의 특성이 부가적으로 결합되어 정제, 진단, 이미징, 치료 등의 목적으로 활용될 수 있고, 항체의 불변영역을 융합하면 정제, 이미징 뿐만 아니라 생체 내에서 면역세포를 유도하여 다양한 생물학적 활성을 보유케 할 수 있다. 또한, 이들의 융합단백질은 단일체보다 크기가 커서 약물동력학적 (pharmacokinetics) 측면에서도 장점이 있다. 도 4d는 앞서 설명한 것과 같이 하나의 표적 분자 또는 두 개의 표적 분자에 대해 선별된 크링글 도메인 변이체에서 표적분자와 결합하는 결합루프 (binding loop)를 분석한 후 이를 결합루프 (binding loop)를 결합에 참여하지 않는 다른 루프로 접합(loop grafting)하여 새로운 기능을 얻을 수 있다. 첫 번째 같은 표적분자에 대해 선별된 루프를 이용해 다결합 단량체 (multivalent monomer)를 구축할 경우, 단량체만으로 avidity 효과를 유도할 수 있으며, 13kDa이라는 단백질의 분자량을 유지함으로 인해 항체가 불가능한 다양한 약물 전달 체계를 시도해 볼 수 있다. 두 번째 다른 표적분자에 대해 선별된 루프를 이용해 다중특이성 단량체 (multispecific monomer)를 구축할 경우, 각 표적분자만을 목적으로 했을 때의 단점을 극복하고, 상승작용을 유도할 수 있다. 또한 13kDa이라는 단백질의 분자량을 유지함으로 인해 항체가 불가능한 다양한 약물 전달 체계를 시도해 볼 수 있다.

실시예 3: 크링글 도메인 구조에 기반한 단백질 골격 라이브러리의 구축 전략 및 구축

실시예 1에서 인간 크링글 도메인의 아미노산 서열 및 구조적 특성을 분석한 결과를 토대로, 크링글 도메인의 안정적인 구조 골격은 유지하면서 루프1-7 부위에 아미노산 돌연변이가 들어가게 하여, 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리를 구축하고, 이 라이브러리에서 다양한 표적 분자에 특이적으로 결합하여 표적분자의 생물학적 활성을 조절하는 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체를 분리하고자 하였다. 이를 위해 크링글 도메인의 전형적인 구조적 안정성을 부여하는 아미노산 서열은 유지하고 (예, 3개의 분자내 다이설파이드본드 결합 (다이 설파이드 본드 결합 양상은 1-6, 2-4, 3-5) 및 주위 보존된 아미노산 잔기), 다이설파이드본드 결합으로 인해 생성되고, 구조적으로 유연성이 있는 루프구조 부분에 다양한 자연계에 존재하지 않는 아미노산 서열 조합을 갖도록 돌연변이체 라이브러리를 구축하는 전략을 세웠다.

도 5는 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인 2를 바탕으로 다양한 표적분자에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 구조골격으로 활용하기 위해 구체적인 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리를 구축한 전략을 도식적으로 나타낸 것이다. 즉 인간 크링글 도메인 아미노산 서열 중 보존도가 가장 높고 구조적으로 가장 중요 다이설파이드 결합을 하는 6개의 시스테인을 보존하였다 (C1, C22, C51, C63, C75, 및 C80). 또한 크링글 도메인의 구조에서 소수성 핵을 구성하는 아미노산들을 보존하였다 (K48, N49, Y50, C51, R52, N53, P54, D55, P61, W62, C63, F64, 및 T65) (Marti 등, Biochemistry 38:15741-15755, 1999). 이와 더불어 보존도가 높다고 판단되는 G6, Y9, D10, G11, T16, G19, Q23, W25, P30, H31, H33, G34, E73, L74, P78, 및 R79의 아미노산을 보존하였다. 마지막으로 목적 물질에 대한 특이적 친화도만을 가지는 단백질 구조 골격을 구축하기 위해 크링글 도메인이 원래 가지고 있는 결합 능력을 제거해야 한다. Y36, I37, D55, R56, E57, W62, C63, F64, R71, W72, E73, 및 L74의 아미노산들이 형성한 결합 자리에 라이신 (Lys) 또는 이의 유사체 (analog) 물질이 결합한다 (Marti 등, Biochemistry 38:15741-15755, 1999). 위 아미노산 잔기에서 D55, W62, C63, F64, E73, L74을 제외한 나머지 부분을 모두 바뀌게 하였다. 결론적으로 돌연변이가 유도되도록 한 아미노산 잔기 번호는 2, 3, 4, 5, 7, 8, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 24, 26, 27, 28, 29, 32, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 56, 57, 58, 59, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 76, 및 77이었다. 총 45개의 아미노산 잔기에 돌연변이가 유도되도록 하였다.

크링글 도메인의 구조에 기반을 둔 단백질 골격 라이브러리 구축의 목적은 다양한 표적분자에 고친화도를 가지고 특이적으로 결합하는 돌연변이체가 분리되게 하는 것이다. 즉 표적분자가 되는 생체고분자 (단백질/핵산/지질/탄수화물 등) 과 소분자 (small molecules)등과 특이적으로 결합하여야 한다. 이를 위해 원래 항체가 somatic hypermutation시에 많이 추가되는 아미노산인 Tyr, Ser, Arg이 포함하고, 분자간 비공유 결합 (수소결합, 이온결합, 소수성결합 등)을 할 수 있는 아미노산들이 각 돌연변이 지점에 들어가도록 라이브러리를 구축하고자 하였다. 이를 위해 크링글 도메인의 각 잔기에 변이되는 아미노산은 NMC와 VRG가 번갈아 들어가도록 하였다. VRG는 첫번째에 V (V=A, C, 또는 G), 두번째에 R (R= A 또는 G), 세번째에 G)을 코딩하며, 이를 통해 Gln (1/5 삽입확률), Arg (2/5 삽입확률), Lys(1/5 삽입확률), Glu(1/5 삽입확률), Gly(1/5 삽입확률) 5개 아미노산으로 치환될 수 있다. NMC 첫번째에 N(N=A, T, C, 또는 G), 두번째에 M (M=A 또는 C), 세번째에 C)을 코딩하며, Ser(1/8 삽입확률), Tyr(1/8 삽입확률), Pro(1/8 삽입확률), His(1/8 삽입확률), Thr(1/8 삽입확률), Asn(1/8 삽입확률), Ala(1/8 삽입확률), Asp(1/8 삽입확률)의 8개의 아미노산을 동일한 확률로 치환되게 할 수 있다. 이와 같은 아미노산 대체 라이브러리 구축전략은 다양한 물리화학적 특성을 지닌 아미노 산이 치환될 수 있어 다양한 표적분자에 특이적으로 결합할 수 있는 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 라이브러리를 제공할 수 있다.

크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리를 구축하기 위해 8개의 프라이머를 제작해 사용하였다 (표 2). 8개 프라이머는 모두 중간 녹는 온도 (T_m)이 55℃ 이상을 가지는 겹치는 부분을 가지고 있다. 8개의 프라이머(서열번호1~8)를 사용하여 Overlapping PCR을 수행해 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리 발현 벡터를 구축하였다 (도 6) (Lee HW 등, Biochem Biophys Res Commun, 343:896-903, 2006). 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리의 유전자를 증폭시키기 위해 정방향 프라이머(서열번호 9)과 역방향 프라이머(서열번호 10)을 사용해 증폭하였다.

인간 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리가 효모 표면 발현 벡터와 상동성 재조합(homologous recombination) 기작에 의해 효모에 형질 전환되도록 하기 위해 증폭된 인간 크링글 도메인 발현 벡터 (10 μg/μl)와 인간 크링글 도메인 효모 표면 발현 벡터 (pCTCON, Colby 등, Methods enzymol, 388:248-258) (1μg/μl)을 섞어서 동시에 효모에 전기 형질 전환(electroporation)을 10 번 반복해 라이브러리를 구축하였다 (Lee HW 등, Biochem Biophys Res Commun, 343:896-903, 2006; Kim YS등, Proteins: structure, function, and bioinformatics, 62:1026-1035, 2006). 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리의 크기는 계단식 희석을 한 후 선택 배지에 자란 콜로니의 수를 측정해 2x10⁶임을 확인하였다.

서열번호	올리고뉴클레오타이드 염기 서열
서열번호 1	5′-GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT GGT GGT TCT GCT AGC GAG GAA TGT- 3′
서열번호 2	5′-GCC GTC ATA CYB GKN TCC CYB GKN CYB GKN ACA TTC CTC GCT AGC AGA AC- 3′
서열번호 3	5′-G GGA NMC VRG TAT GAC GGC NMC VRG NMC VRG ACC NMC VRG GGA NMC VRG TGC CAG NMC TGG- 3′
서열번호 4	5′-TCC ATG GKN GTG TGG CYB GKN CYB GKN CCA GKN CTG GCA CYB GKN TC- 3′
서열번호 5	5′-C VRG CCA CAC NMC CAT GGA NMC VRG NMC VRG NMC VRG NMC VRG NMC VRG NMC VRG AAG AAT TAC TGT CGT AAC CCC GAT- 3′
서열번호 6	5′-GGT GAA ACA CCA AGG CYB GKN CYB GKN ATC GGG GTT ACG ACA GTA ATT- 3′
서열번호 7	5′-C VRG CCT TGG TGT TTC ACC NMC VRG NMC VRG NMC VRG NMC GAA CTT TGC NMC VRG CCC CGC TGC ACA- 3′
서열번호 8	5′-ATC TCG AGC TAT TAC AAG TCC TCT TCA GAA ATA AGC TTT TGT TCG GAT CCT GGA GGT GTT GTG CAG CGG GGC YBG- 3′
서열번호 9	5′-GGT GGT GGT GGT TCT GGT GGT- 3′
서열번호 10	5′-ATC TCG AGC TAT TAC AAG TCC TCT TCA G- 3′

표 2는 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리 구축된 사용된 올리고뉴클레오타이드 염기 서열을 나타낸다.

실시예 4: 크링글 도메인 구조에 기반한 단백질 골격 라이브러리의 분석

플라스미노겐의 크링글 도메인 2 유전자를 골격으로 구축된 단백질 골격 라이브러리가 계획한 것과 같이 구축되었는지 확인하기 위해, 구축된 효모라이브러리에서 형질 전환된 효모표면 발현 벡터을 무작위로 회수하여 삽입된 크링글 도메인의 뉴클레오타이드 서열을 분석하였다 (Lee HW 등, Biochem Biophys Res Commun, 343:896-903, 2006; Kim YS등, Proteins: structure, function, and bioinformatics, 62:1026-1035, 2006). 뉴클레오타이드 서열은 정방향 프라이머 (서열 번호 11 = 5′-GTT CCA GAC TAC GCT CTG CAG G-3′)와 역방향 프라이머 (서열 번호 12 =5′-GAT TTT GTT ACA TCT ACA CTG TTG-3′)를 이용하여 분석하였고 아미노산 서열은 정규 코드를 통해 결정하였다. 의도된 라이브러리 구축방법에 의해 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리가 가질 수 있는 뉴클레오타이드 염기서열은 서열 번호 13에 나타냈다. 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리에서 무작위로 선정하여 뉴클레오타이드 서열을 결정한 클론의 염기서열은 서열번호 14~18이다. 서열 번호 14-18은 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리가 가질 수 있는 뉴클레오타이드 서열에 포함되며, 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리의 일부 뉴클레오타이드 서열 분석을 통해 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리가 계획한 것과 같이 구축되었음을 확인하였다.

서열번호	염기 서열
서열번호 13	5′-TGT NMC VRG NMC VRG GGA NMC VRG TAT GAC GGC NMC VRG NMC VRG ACC NMC VRG GGA NMC VRG TGC CAG NMC TGG NMC VRG NMC VRG CCA CAC NMC CAT GGA NMC VRG NMC VRG NMC VRG NMC VRG NMC VRG NMC VRG AAG AAT TAC TGT CGT AAC CCC GAT NMC VRG NMC VRG CCT TGG TGT TTC ACC NMC VRG NMC VRG NMC VRG NMC GAA CTT TGC NMC VRG CCC CGC TGC -3′
서열번호 14	5′-TGT AAC GGG GAC GGG GGA GAC AGG TAT GAC GGC AAC AAG CAC AAG ACC CTC AAG GGA TAC CGG TGC CAG CAC TGG ACC AGG ACC AAG CCA CAC CAC CAT GGA GTC GGG CAC CGG GAC AAG ATC CGG TAC AGG GAC CAG AAG CAT TAC TGT CGT AAC CCC GAT ACC GAG ACC GGG CCT TGG TGT TTC ACC AAC AAG AAC GGG GAC AGG TAC GAA CTT TGC CAC GAG CCC CGC TGC -3′
서열번호 15	5′-TGT AAC CAG CAC AAG GGA TCC AGG TAT GAC GGC CAC AAG AAC CGG ACC GTC AAG GGA AAC CAG TGC CAG GAC TGG TAC AAG CCC CAG CCA CAC TTC CAT GGA CTC AGG GAC AAG TCC AAG AAC AAG TTC AAG TTC AAG AAG AAT TAC TGT CGT AAC CCC GAT GCC AGG ACC AGG CCT TGG TGT TTC ACC CAC GAG GAC AAG GAC GAG TAC GAA CTT TGC GAC GGG CCC CGC TGC -3′
서열번호 16	5′-TGT CCC GAG GAC CAG GGA GAC GAG TAT GAC GGC CAC GAG CAC AAG ACC CAC AGG GGA AAC AGG TGC CAG TCC TGG TAC AGG CCC AAG CCA CAC AAC CAT GGA CAC AGG ATC AAG GAC CGG TAC AAG TAC AAG GTC AAG AAG AAT TAC TGT CGT AAC CCC GAT ACC CAG GCC CGG CCT TGG TGT TTT ACC AAC CGG CAC AGG GAC GAG CAC GAA CTT TGC GAC CAG CCC CGC TGC -3′
서열번호 17	5′-TGT ACC AAG CAC CGG GGA ACC AAG TAT GAC GGC CAC AAG AAC AGG ACC TAC CAG GGA AAC AGG TGC CAG AAC TGG TCC CGG AAC AAG CCA CAC CAC CAT GGA GAC AAG TAC GAG AAC AAG TTC CGG GCT CGG GCT CAA GAA GAA TTA CTG TCG TAA CCC CGA TGA CAA GGC CGA GCC TTG GTG TTT ACC GGA CGG GGA CAG GAA CGG GAT CGA ACT TTG CTC AAG CCC CGC TGC - 3′
서열번호 18	5′-TGT ACC CAG CCC GAG GGA CCC AGG TAT GAC GGC AAC GGG CAC AAG ACC CAC CGG GGA CAC CAG TGC CAG GCC TGG CCC AAG GCC CGG CCA CAC GAC CAT GGA CTC AAG CAC AGG GAC AGG CTC CAG GTC CGG GAC AAG AAG AAT TAC TGT CGT AAC CCC GAT GCC GAG GAC GGG CCT TGG TGT TTC ACC CAC CGG CAC GGG TAC GGG CAC GAA CTT TGC GAC GGG CCC CGC TGC-3′

표 3은 크링글 도메인의 구조에 기반하여 구축된 단백질 골격 라이브러리 염기서열 분석을 나타낸다.

실시예 5 : 다양한 표적 분자 준비

실시예 4에서 구축된 크링글 도메인 구조기반 단백질 골격 라이브러리에서 다양한 표적분자에 특이적으로 결합하는 단일체가 분리, 선별될 수 있는지의 여부를 연구하였다. 모델 표적분자는 인간유래 세포사멸 수용체 5 (death receptor 5 (DR5), TRAIL-receptor 2, 이하 DR5라 칭함), 세포사멸 수용체 4 (death receptor 4 (DR4), TRAIL-receptor 1, 이하 DR4라 칭함), 및 TNFα을 사용하였다.

표적분자 (DR4, DR5, TNFα)에 대한 발현 및 정제는 본 그룹에서 이미 발표한 논문에 자세하게 기술되어 있다 (Lee HW 등, Biochem Biophys Res commun, 330:1205-1212; Kim MS 등, J Mol Biol, 374:1374-1388, 2007). 표적분자 DR4는 DR4의 세포외 도메인 (아미노산 잔기 1-216)을 박테리아 발현 벡터에 인 프레임(in frame)으로 제한효소 NheI/HindIII를 사용하여 클로닝하였다 (Lee HW 등, Biochem Biophys Res commun, 330:1205-1212). 이때 박테리아 발현 벡터는 T7 프로모터-DR4-6xHis tag을 가지도록 디자인하였다 (pCRT7NT-TOPO). 표적분자 DR5는 DR5의 세포외 도메인 (아미노산 잔기 1-130)을 박테리아 발현 벡터에 인 프레임(in frame)으로 제한효소 NheI/XhoI를 사용하여 클로닝하였다 (Lee HW 등, Biochem Biophys Res commun, 330:1205-1212). 이때 박테리아 발현 벡터는 T7 프로모터-DR5-6xHis tag을 가지도록 디자인하였다 (pET21b, (Invitrogen, USA)). 표적분자 TNFα는 TNFα의 세포외 도메인 (아미노산 잔기 1-157)을 박테리아 발현 벡터에 인 프레임(in frame)으로 제한효소 NheI/HindIII를 사용하여 클로닝하였다 (Kim MS 등, J Mol Biol, 374:1374-1388, 2007). 이때 박테리아 발현 벡터는 T7 프로모터-TNFα-6xHis tag을 가지도록 디자인하였다 (pET23d, Invitrogen, USA).

발현은 목적 물질 모두 같은 방법을 사용하였다. 대장균을 37℃에서 O.D.₆₀₀=0.6 정도 키운 후, 단백질 발현을 위해 1mM IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, (SIGMA-ALDRICH co., USA))를 첨가한 후, 30℃에서 10시간을 더 키웠다. 원심분리기(Mega 21R, (Hanil, 한국))을 사용해 대장균을 모은 후 초음파를 이용해(SONICS, Vibra Cell^TM, USA) 대장균을 분쇄하였다. 원심분리기(Mega 21R, (Hanil, 한국))를 사용해 대장균 분쇄물을 제거한 상등액 만을 얻어 his-tag 단백질을 특이적으로 잘 정제하는 Talon 수지(Clontech,Inc., USA)를 사용하였다. 정제)를 목적 물질은 SDS-PAGE 상에서 DR4는 약 16kDa, DR5는 약 16kDa, TNFα는 약 17kDa의 분자량을 보여주었으며, 90% 이상의 순도로 정제되었다.

정제된 목적 물질, DR4, DR5, TNFα의 활성은 SPR(Biacore2000, GE Healthcare co., United Kingdom) 을 사용해 DR4, DR5는 TRAIL과의 친화도의 검증을 통해 활성을 확인하고, TNFα는 REMICADE (infliximab, Centocor, Inc., USA)와의 친화도의 검증을 통해 활성을 확인하였다.

실시예 6 : 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 라이브러리에서 다양한 표적분자에 특이적으로 결합하는 단일체 분리 (항-DR4, -DR5, -TNFα크링글 도메인의 선별)

크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리에서 목적 물질, DR4, DR5, TNFα에 특이적 고친화도를(high specific affinity) 보여주는 크링글 도메인을 선별하기 위하여, 실시예 5에서 정제한 목적 물질, DR4, DR5, TNFα를 비오틴화 시킨 후 (EZ-LINK^TM Sulfo-NHS-LC-Biotinlation kit(Pierce Inc., USA)) 효모 세포 표면에 발현된 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리와 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 비오틴화 된 목적 물질과 반응한 효모 세포 표면에 발현된 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리를 Anti-Biotin MACIBead^TM(130-091-147, Miltenyi Biotec Inc., Germany)와 4℃에서 20분간 반응시킨 후 MACS (magnetic activated cell sorting)을 이용하여 목적 물질, DR4, DR5, TNFα에 고친화도를 가지는 크링글 도메인을 효모 세포 표면에 발현한 효모를 부유화하였다 (enrichment). 이어서 MACS를 순차적으로 3회 수행한 후 FACS (fluorescence activated cell sorting)을 순차적으로 3회 수행하였다. FACS는 다음의 과정을 통해 수행되었다. 박테리아에서 정제된 목적 물질, DR4, DR5, TNFα를 비오틴화시킨 후 (EZ-LINK^TM Sulfo-NHS-LC-Biotinlation kit(Pierce Inc., USA)) 이차로 PE가 접합된 스트렙타아비틴 (Streptavidin-R-phycoerythrin conjugate (SA-PE), Molecular Probes (Eugene, USA))을 붙여 FACS (Fluorescence activated cell sorting)를 통하여 분석하였다. 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리가 c-myc tag을 가지고 효모 세포 표면에 발현되도록 하여 일차로 쥐 유래 항-c-myc 9e10mAb (Ig Therapy, 한국)로 결합시키고, 이차로 FITC가 접합된 항 생쥐 항체(FITC-conjugated anti-mouse mAb, Sigma)를 이용하여 염색하여 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리의 발현 정도를 측정하였다.

크링글 도메인 돌연변이체 라이브러리를 이용하여 MACS와 FACS를 순차적으로 수행해 목적 물질, DR4, DR5, TNFα에 특이적 고친화도를 가지는 크링글 도메인 돌연변이체 클론을 선별하기 위해, 각 MACS 또는 FACS를 수행한 후, 100 nM의 비오틴화시킨 표적분자를 이용해 친화도를 FACS를 이용해 분석했다. 대조군으로 플라스미노겐 크링글 도메인 2와 선별 전 단백질 골격 라이브러리에 대해서도 분석하였다.

위와 같은 고속선별을 통해 각 표적분자에 고친화도 특이성은 높은 클론들을 부유화 (enrichment) 한 후, 최종적으로 개별 클론들을 얻었다 (Lee HW 등, Biochem Biophys Res commun, 330:1205-1212; Kim MS 등, J Mol Biol, 374:1374-1388, 2007).

표적분자 DR4에 특이적 고친화도를 보이는 크링글 도메인 돌연변이체 클론들 KD404, KD408, KD409, KD413, KD415, KD421, KD437, KD445, KD456, KD459이 분리되었다.

표적분자 DR5에 특이적 고친화도를 보이는 크링글 도메인 돌연변이체 클론들 KD502, KD503, KD505, KD506, KD537, KD542, KD548, KD555, KD558, KD559이 분리되었다.

표적분자 TNFα에 특이적 고친화도를 보이는 크링글 도메인 돌연변이체 클론들 KDT01, KDT02, KDT08, KDT26이 분리되었다.

각 표적분자에 특이적 고 친화도를 보이는 효모 클론들에서 플라스미드를 회수하여 크링글 도메인 돌연변이체의 핵산 염기서열과 아미노산 서열을 결정하였다. 염기서열은 정방향 프라이머 (서열 번호 11)와 역방향 프라이머 (서열 번호 12)를 이용하여 분석하였고, 아미노산 서열은 정규 코드를 통해 결정하였다.

표 3은 각 표적분자 DR4, DR5, 및 TNFα에 대하여 선별된 개별클론들의 아미노산 서열과 보존된 아미노산 서열을 정돈한 것이다. 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리 구축 전략에 따르면 아미노산 변이가 무작위로 이루어질 경우 각 아미노산들이 X자리에서 12.5%, Z자리에서 16.7%의 확률로 나타나야 한다 (도 4). 하지만 표 3에 나타난 바와 같이 무작위로 들어갈 경우보다 높은 확률로 경향성을 보여주는 아미노산 자리들이 존재한다.

항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 돌연변이체의 아미노산 서열 분석을 바탕으로 N-말단 당화 (N-glycosylation) 분석 결과 KD404가 한 개의 N-말단 당화(N-glycosylation) 자리를 가지고 있었다. 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 돌연변이체의 아미노산 서열 분석을 바탕으로 분석한 등전점(pI)은 모든 클론에서 약 PH 8.0 의 범위를 가지고 있다 (Expasy 분석, Web페이지: www.expasy.org).

실시예 7 :항-DR4, -DR5, -TNFα크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체의 발현 및 정제

크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 변이체 중에 항-DR4 돌연변이체 (KD404, KD408, KD409, KD413, KD415, KD421, KD437, KD445, KD456, KD459), 항-DR5 돌연변이체 (KD502, KD503, KD505, KD506, KD509, KD537, KD542, KD548, KD555, KD559), 및 항-TNFα 변이체 (KDT26, KDT01, KDT02, KDT08)을 효모 Pichia pastoris 발현 벡터 (pPICZaA, Invitrogen, USA)에 인 프레임(in-frame)으로 NheI/BamHI을 이용하여 클로닝 하였다. 이때 피키아 효모 발현벡터는 AOX3 프로모터-MFa 분비 표적화 피키-크링글 도메인-myc tag-6X His tag을 가지도록 디자인되었다 (pPICZaA, Invitrogen, USA).

발현은 효모(Pichia pastoris-GS115, Invitrogen, USA)를 30℃에서 BMGY(buffered complex glycerol, 1% yeast extract(Becton, Dickinson and Company, USA)+ 2% peptone(Becton, Dickinson and Company, USA)+ 1.34% yeast nitrogen base(Becton, Dickinson and Company, USA) + 100mM pH6.0 potassium phosphate (SIGMA-ALDRICH co., USA) + 1% glycerol(BIO BASIC Inc., Canada)) 배지에서 OD₆₀₀=15-20 정도 키운 후, 단백질 발현을 위해 BMMY(buffered complex methanol, 1% yeast extract(Becton, Dickinson and Company, USA)+ 2% peptone(Becton, Dickinson and Company, USA)+ 1.34% yeast nitrogen base(Becton, Dickinson and Company, USA) + 100mM pH6.0 potassium phosphate(SIGMA-ALDRICH co., USA) + 0.5% Methanol(Merck & Co., Inc. USA)) 배지에서 24시간 마다 0.5% 메탄올을 추가하며 3일 동안 키웠다. 정제는 상등액으로부터 정제를 하였으며, 6x His-tag 단백질을 특이적으로 잘 정제하는 Talon 수지(Clontech,Inc., USA)를 사용하였다.

도 7은 표적분자 DR4에 대하여 선별된 KD404, KD408, KD409, KD413, KD415, KD421, KD437, KD445, KD456, KD459 크링글 돌연변이체 클론, 표적분자 DR5에 대하여 선별된 KD502, KD503, KD505, KD506, KD509, KD537, KD542, KD548, KD555, KD559 크링글 돌연변이체 클론, 표적분자 TNFα에 대하여 골라진 KDT01, KDT02, KDT08, KDT26 크링글 돌연변이체의 정체 후, 환원성 (도 7a, c, 및 e) 또는 비환원성 (도 7b, d, 및 f) 조건에서 15% SDS-PAGE을 통해 분석한 것이다. 크링글 도메인은 98% 이상의 순도로 정제되었다. 정제된 크링글 도메인은 환원성, 비환원성 SDS-PAGE 상에서 모두 약 13kDa의 분자량을 보여주었다. 이는 발현 정제된 크링글 도메인이 용액상태에서 단일체 (monomer)로 존재하며, 비자연적 다이설파이드 결합을 통해 이중체 (dimer) 또는 올리고머 (oligomers)를 형성하지 않음을 보여준다. 크링글 도메인의 농도 및 양은 브레드포드 및 BCA를 통해 정량하였다.

도 8은 HPLC (high performance liquid chromatography, The Agilent 1200 Series LC Systems and Modules, Agilent, USA)를 통해서 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인들이 단일체로 존재함을 확인하기 위해, 크기배제 크로마토그래피 칼럼 (Size exclusion chromatography column, Superdex^TM200 10/300GC, GE Healthcare, Sweden)을 실험한 결과이다. 용출 버퍼는 PBS (pH7.4, 137mM NaCl, 10mM Phosphate, 2.7mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA), 유속은 0.5ml/min이다. 단백질 크기 마커로 사용된 단백질은 알부민 (66 kDa), 오발부민 (45 kDa), 키모트립시노겐 (25 kDa), 리보뉴클리아제 A (13.7 kDa) 이다. 모든 크링글 돌연변이체의 클론에서 한 개의 극점이 측정되어 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인이 단일체로 존재함을 보여준다.

실시예 8: 항-DR4, -DR5, -TNFα의 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체의 친화도, 교차 반응성 측정 및 결합자리 분석

항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체들의 표적분자에 대한 친화도와 교차 반응성을 측정하기 위해 ELISA (enzyme linked immunosorbent assay)를 수행하였다. 표적분자 DR4, DR5, TNFα 및 DcR1, DcR2를 96 well EIA/RIA 플레이트 (COSTAR Corning In., USA)에 1시간 동안 37℃에서 결합시킨 후 0.1% PBST (0.1% Tween20, pH7.4, 137mM NaCl, 10mM Phosphate, 2.7mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA)로 10분 간 3회 씻어낸다. 1% PBSB (1% BSA, pH7.4, 137mM NaCl, 10mM Phosphate, 2.7mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA)로 1시간 동안 결합한 후 0.1% PBST (0.1% Tween20, pH7.4, 137mM NaCl, 10mM Phosphate, 2.7mM KCl, SIGMA-ALDRICH co., USA)로 10분 간 3회 씻어낸다. 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 돌연변이체를 결합시킨 후 0.1% PBST로 10분 간 3회 씻어낸다. 일차로 쥐 유래 항-c-myc 9e10mAb (Ig Therapy, 한국)로 결합시키고, 이차로 AP가 접합된 항 생쥐 항체 (alkaline phosphatase-conjugated anti-mouse mAb, Sigma)로 결합시킨다. pNPP (p-nitrophenyl palmitate, (Sigma-aldrich co., USA))로 반응시켜 405nm 흡광도를 정량하였다.

도 9는 표적분자 DR4에 대하여 선별된 KD404, KD408, KD409, KD413, KD415, KD421, KD437, KD445, KD456, KD459 크링글 도메인 돌연변이체, 표적분자 DR5에 대하여 선별된 KD502, KD503, KD505, KD506, KD509, KD537, KD542, KD548, KD555, KD559 크링글 도메인 돌연변이체, 표적분자 TNFα에 대하여 골라진 KDT01, KDT02, KDT08, KDT26 크링글 도메인 돌연변이체들의 친화도를 ELISA로 정량한 것이다. 도 9a는 표적분자 DR4에 대하여 선별된 크링글 도메인 돌연변이체들의 친화도를 ELISA로 정량한 것이다. 친화도는 290 nM ~ 3794 nM 수준으로 측정되었다. 도 9b는 표적분자 DR5에 대하여 선별된 크링글 도메인 돌연변이체의 친화도를 ELISA로 정량한 것이다. 친화도는 294 nM ~ 5396 nM 수준으로 측정되었다. 도 9c는 표적분자 TNFα에 대하여 선별된 클론의 친화도를 ELISA로 정량한 것이며 친화도는 29 nM ~ 3829 nM 수준으로 측정되었다.

도 10은 표적분자 DR4에 대하여 선별된 KD404, KD408, KD409, KD413, KD415, KD421, KD437, KD445, KD456, KD459 크링글 도메인 돌연변이체, 표적분자 DR5에 대하여 선별된 KD502, KD503, KD505, KD506, KD509, KD537, KD542, KD548, KD555, KD559 크링글 도메인 돌연변이체, 표적분자 TNFα에 대하여 골라진 KDT01, KDT02, KDT08, KDT26 크링글 도메인 돌연변이체의 교차반응성을 ELISA로 정량한 것이다. 도 10a은 표적분자 DR4에 대하여 선별된 클론의 DcR1, DcR2, DR4 및 DR5에 대한 반응성을 ELISA로 정량한 것이다. 대부분의 클론이 표적분자 DR4에 특이적으로 결합하였다. KD404는 교차반응성이 DcR1, DR5에서 강하게 나타났고, KD449는 다른 표적부자들에 대해 약한 교차반응성이 나타났다. 이는 DR4에 대하여 선별된 크링글 도메인 돌연변이체 대부분이 표적분자에만 결합하고, 다른 분자에는 결합력이 없거나 매우 미미하여, 교차 반응성은 없는 것을 시사한다. 도 10b는 표적분자 DR5에 대하여 선별된 클론의 DcR1, DcR2, DR4 및 DR5에 대한 반응성을 ELISA로 정량한 것이다. 대부분의 클론이 표적분자 DR5에 특이적으로 결합하였다. KD542, KD548, KD559는 다른 표적분자들에 대해 교차반응성을 가졌다. 이는 DR5에 대하여 선별된 크링글 도메인 돌연변이체가 표적분자에만 결합하고, 다른 분자에는 결합력이 없거나 매우 미미하여, 교차 반응성은 없는 것을 시사한다. 도 10c는 표적분자 TNFα에 대하여 선별된 크링글 도메인 돌연변이체 KDT01, KDT02, KDT08, KDT26의 TNFα, DR4 및 DR5에 대한 반응성을 ELISA로 정량한 것이다. 모든 항-TNFα 크링글 도메인 돌연변이체는 표적분자 TNFα에 특이적으로 결합하였다. 이는 TNFα에 대하여 선별된 크링글 도메인 돌연변이체가 표적분자에만 결합하고, 다른 분자에는 결합력이 없거나 매우 미미하여, 교차 반응성은 없는 것을 시사한다.

도 11은 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 돌연변이체의 결합 자리를 비교하기 위해 TRAIL과 같은 표적분자에 대해 선별된 각각의 크링글 도메인 돌연변이체에 대해 경쟁적 ELISA (competitive ELISA)를 통해 각각의 결합자리를 분석한 것이다. 도 11a, b, c, 및 d는 경쟁적 ELISA (competitive ELISA)를 통해 TRAIL과 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 돌연변이체와의 결합 자리를 비교한 결과이다. 도 11a는 항-DR4 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413이 TRAIL과 다른 결합자리를 가지고 있음을 시사한다. 도 11b는 항-DR4 크링글 도메인 돌연변이체인 KD415가 TRAIL과 다른 결합자리를 가지고 있음을 시사한다. 도 11c는 항-DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD506이 TRAIL과 다른 결합자리를 가지고 있음을 시사한다. 도 11d는 항-DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD548이 TRAIL과 결합자리를 일부 공유함을 시사한다. 도 11e는 항-DR4 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413과 KD415가 서로 결합자리를 공유하지 않음을 시사한다. 도 11f는 항-DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD506과 KD548가 서로 결합자리를 공유하지 않음을 시사한다.

실시예 9: 항-DR4, 항-DR5, 항-TNFα 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이의 이차구조 분석 및 열역학적 안정성 평가

항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체의 표적분자에 대한 이차 구조를 분석하기 위해 Far-UV CD spectra (190-260 nm)를 이용해 분석하였다. 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체는 pH 7.4 PBS에서 100 μg/ml의 농도로 0.1-cm 길이 큐벳 (quartz cuvette)에 담아 J-715 spectropolarimeter (Jasco Inc., Japan)를 이용해 0.5 nm 간격으로 190 nm부터 260 nm까지 측정하였다. 대조군으로는 pH7.4 PBS를 이용해 그래프를 보정하였으며, 4번 중복 측정을 통해 평균 그래프를 얻었다.

도 12는 CD을 통해서 야생형인 플라스미노겐 크링글 도메인 2와 항-DR4 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413, KD415, 항-DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD506, KD548, 항-TNFα 크링글 도메인 돌연변이체인 KDT26의 2차 구조를 분석한 결과이다. 선별된 크링글 도메인 돌연변이체들은 야생형인 플라스미노겐 크링글 도메인 2와 유사한 spectra를 보여주며, 202 - 205 nm 영역에서 음의 최대 꼭지점을 가지고, 220nm에서 약한 음의 변곡점을 가진다. 이러한 CD의 spectra는 전형적인 무작위적 구조와 약한 병풍 구조를 나타낸다. 또한 광범위한 루프 지역에 많은 돌연변이가 일어났음에도 불구하고, 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2와 유사한 2차 구조를 유지함을 알 수 있다.

항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체의 표적분자에 대한 열역학적 안정성을 평가하기 위해 ELISA와 시차주사 열용량 분석기 (Differential Scanning Calorimetry, DSC)를 사용하였다. 열역학적 스트레스가 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체의 표적분자 결합능력에 주는 영향을 평가하기 위해 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체를 37 ℃와 50 ℃에서 1일 간격으로 14일 동안 열역학적 스트레스를 주었다. 열역학적 스트레스를 받은 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체의 결합능력은 실시예 8에서 언급된 것과 같은 방법으로 ELISA를 통해 측정되었다. 도 13은 열역학적 스트레스 하에서 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체의 결합능력을 ELISA를 통해 측정한 결과이다. 그 결과 최초 결합능력의 84 % 이상을 유지함을 보여준다.

항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체가 열역학적 스트레스에 결합 능력을 유지하는 사실을 뒷받침하기 위해 시차주사 열용량 분석을 통해 최대열용량 온도 (T _m)을 분석하였다. 열역학적 변성은 4 ℃부터 90 ℃까지 1 ℃/min의 속도로 측정하였다. 크링글 도메인 돌연변이체를 제외한 동일 버퍼 조성을 통해 측정값을 보정하였다. 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체의 최대열용량온도는 비열 (maximal heat capacity at constant pressure, ΔC _p)의 온도로 측정, 되며, 이를 전환한 것이다 (Chang Y 등, Biochemistry 36(25):7652-7663).

도 14는 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2와 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체의 시차주사 열용량 분석 결과와 최대열용량 온도를 나타냈다. 각 최대열용량온도는 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2는 49.8 ℃ 항-DR4 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413은 50.5 ℃, KD415는 46.7 ℃, 항-DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD506은 49.8 ℃, KD548은 57.2 ℃, 항-TNFα 크링글 도메인 돌연변이체인 KDT26은 51.9 ℃로 측정되었다. 도 14는 광범위한 루프 지역에 많은 돌연변이가 일어났음에도 불구하고, 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2와 유사한 열역학적 안정성을 가짐을 시사한다.

실시예 10: Fc 융합 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인의 발현 및 정제

실시예 7에서 설명한 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 변이체 중 항-DR4 돌연변이체 (KD413, KD415), 항-DR5 돌연변이체 (KD506, KD548), 및 항-TNFα 변이체 (KDT26)가 포함된 효모 Pichia pastoris 발현 벡터 (pPICZaA, Invitrogen, USA)에 인 프레임(in-frame)으로 AflII/XbaI을 이용하여 인간 면역글로불린G1의 힌지 (hindge)부터 Fc 도메인 부분을 클로닝 하였다 (pPICZaA, Invitrogen, USA).

발현은 실시예 7에서 설명한 것과 동일하게 수행되었다. 정제는 상등액으로부터 정제를 하였으며, Fc 단백질을 특이적으로 잘 정제하는 단백직 A-세파로스 FF 컬럼 (rProtein ASepharose FF column, GE Healthcare, USA)을 사용하였다.

도 15는 크링글 도메인 돌연변이체와 인간 항체 IgG1의 Fc 도메인 융합체의 모식도 및 이배체로 존재함을 보여주는 SDS-PAGE 및 HPLC 결과이다. 도 15a는 Fc 융합 크링글 도메인 돌연변이체의 모식도를 보여주며, bivalent로 작용함을 보여준다. 도 15b, 및 c는 항-DR4, -DR5, -TNFα Fc 융합 크링글 돌연변이체 정제 후, 환원성 (도 15b) 또는 비환원성 (도 15c) 조건에서 15% SDS-PAGE을 통해 분석한 것이다. Fc 융합 크링글 도메인은 98% 이상의 순도로 정제되었다. 정제된 크링글 도메인은 환원성 SDS-PAGE 상에서 모두 약 38 kDa, 비환원성 SDS-PAGE 상에서 모두 약 76 kDa의 크기를 보여주었다. 이는 발현 정제된 Fc 융합 크링글 도메인이 용액상태에서 이중체 (dimer)로 존재하며, 힌지 영역의 다이설파이드 결합을 통해 이중체 (dimer)를 잘 형성함을 보여준다. Fc 융합 크링글 도메인의 농도 및 양은 브레드포드 및 BCA를 통해 정량하였다.

도 15d는 HPLC (high performance liquid chromatography, The Agilent 1200 Series LC Systems and Modules, Agilent, USA)를 통해서 항-DR4, -DR5, -TNFα Fc 융합 크링글 도메인들이 이중체로 존재함을 확인하기 위해, 크기배제 크로마토그래피 칼럼(Size exclusion chromatography column, Superdex^TM200 10/300GC, GE Healthcare, Sweden)을 실험한 결과이다. 실험조건은 실시예 7과 동일하다. 단백질 크기 마커로 알코올 디하드로게나제 (150 kDa), 오발부민 (45 kDa), 키모트립시노겐 (25 kDa), 리보뉴클리아제 A (13.7 kDa)을 사용하였다. 모든 Fc 융합 크링글 돌연변이체의 클론에서 한 개의 극점이 측정되어 Fc 융합 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인이 이중체로 존재함을 보여준다.

실시예 11: Fc 융합 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인의 친화도 분석

Fc 융합 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인와 표적 분자간의 친화도를 분석하기 위해 실시예 8에서 언급된 것과 같이 ELISA를 통해 분석하였다. 도 16은 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 돌연변이체와 Fc 융합 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 돌연변이체의 친화도 ELISA를 통해 측정한 결과이다. 도 16의 ELISA 결과를 통해 측정된 Fc 융합 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인의 친화도는 KD413-Fc가 60 ± 8 nM, KD415-Fc가 53 ± 6 nM, KD 506-Fc가 43 ± 6 nM, KD548-Fc가 58 ± 5 nM, KDT26-Fc가 3.8 ± 0.4 nM 이다.

실시예 12: 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체의 in vitro 생물학적 활성 동정

정제된 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 돌연변이체의 세포 사멸 평가를 위해 암세포주 가운데 TRAIL-민감성 세포주인 HCT116 (Human Colorectal Carcinoma cell line, 대장암세포, American Type Culture Collection (ATCC CCL-247)), H460 (Human NSCLC cell lines, 폐암세포, American Type Culture Collection (ATCC HTB-177)), Jurkat (Human acute T cell leukemia cell line, 혈액암세포, American Type Culture Collection (ATCC TIB-152)), HL60 (Human acute promyelocytic leukemia cell line, 혈액암세포, American Type Culture Collection (ATCC CCL-240)), TRAIL 저항성 세포주인 U87MG (Human glioblalioma cell line, 뇌암세포, American Type Culture Collection (ATCC HTB-14)), HepG2 (Human carcinoma hepatocell line, 간암세포, American Type Culture Collection (ATCC HB-8065))을 모델로, 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 돌연변이체 (0.001-5 μM)을 처리한 후 MTT assay를 통해 세포 사멸 평가하였다 (Park KJ 등, Cancer Research, 67:7327-7334, 2007, Orogen N 등, Cancer Research, 60(22):6259-6265, 2000).

부착성 세포주인 HCT116, H460, U87MG, HepG2 세포주를 배양 용기(T-flask)에서 분리하기 위해 TE (trypsin-EDTA )버퍼를 1 ml처리한 후 10% 소태아혈청알부민 (FBS, fatal bovine serum albumin, (GIBCO Invitrogen co., USA))가 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium (GIBCO Invitrogen co., USA)) 배지 5ml로 TE의 반응을 멈추고 1000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 10% 소태아혈청알부민 (FBS, fatal bovine serum albumin, (GIBCO Invitrogen co., USA))이 함유된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium (GIBCO Invitrogen co., USA)) 배지로 재현탁한 후 96 웰 플레이트에 웰 당 세포를 1 x 10⁴ 씩 분주하여 24 시간 동안 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 배양한 후 MTT 분석에 사용하였다. 부유 세포주인 Jurkat, HL60 세포주는 10% 소태아혈청알부민 (FBS, fatal bovine serum albumin, (GIBCO Invitrogen co., USA))이 함유된 RPMI1640 (Dulbecco's Modified Eagle Medium (Welgene, USA)) 배지로 재현탁한 후 96 웰 플레이트에 웰 당 세포를 1 x 10⁴ 씩 분주하여 24 시간 동안 37℃ 5% CO₂ 배양기에서 배양한 후 MTT 분석에 사용하였다.

도 17는 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체 중 생물학적 활성을 가지는 항-DR4 KD413, KD415, KD413-Fc, KD415-Fc (0.001~5μM), 항-DR5 KD506, KD548, KD506-Fc, KD548-Fc (0.001~5μM)에 의해 60시간 배양 후, HCT116 (도 17a), H460 (도 17b), U87MG (도 17c), HepG2 (도 17d), Jurkat (도 17e), HL60 (도 17f)에 농도의존적으로 세포사멸이 유도됨을 MTT assay로 분석한 결과이다. 동일시간 배양한 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2 (PgnKD2) 처리 대조군은 세포사멸이 관찰되지 않았다 (도 17g). 또한 동일시간 배양항 TRAIL 처리 대조군은 TRAIL 민감성 세포주인 HCT116, H460, Jurkat, HL60에서만 세포사멸이 관찰되었다 (도 17g). 각 세포주에 대한 EC50 (세포사멸 50%을 달성하는 단백질 농도) 는 다음과 같으며, 순서대로 HCT116, H460, U87MG, Jurkat, HL60이다. KD413은 5.3±0.2 μM, 5.9±0.5 μM, 0.9±0.2 μM, 0.09±0.03 μM, 1.4±0.2 μM, KD415는 11.0±0.9 μM, 5.3±0.4 μM, 4.9±0.6 μM, 0.2±0.1 μM, 0.13±0.02 μM, KD413-Fc는 0.38±0.08 μM, 0.22±0.06 μM, 0.14±0.04 μM, 0.06±0.01 μM, 0.02±0.01 μM, KD415-Fc는 0.18±0.04 μM, 0.20±0.08 μM, 0.20±0.05 μM, 0.08±0.01 μM, 0.06±0.01, KD506는 6.3±0.5 μM, 10.4±1.4 μM, 5.8±0.6 μM, 0.2±0.1 μM, 0.21±0.01 μM, KD548는 9.3±0.8 μM, 9.9±0.7 μM, 4.6±0.4 μM, 0.3±0.1 μM, 0.26±0.02 μM, KD506-Fc는 0.08±0.03 μM, 0.23±0.05 μM, 0.20±0.06 μM, 0.08±0.01 μM, 0.23±0.04 μM, KD548-Fc는 0.52±0.06 μM, 0.45±0.04 μM, 0.40±0.06 μM, 0.07±0.01 μM, 0.22±0.04 μM이다. 이 결과는 표적분자에 특이적으로 선별된 크링글 도메인 돌연변이체가 표적분자에 결합하여 생물학적 활성을 보여줄 수 있다는 것을 보여준다. 또한 실시예 8에서 기술한 것과 같이 같은 항원에 대해 서로 다른 결합자리를 가지고있기 때문에 서로 다른 결합 자리를 가지는 크링글 도메인 돌연변이체를 같이 처리할 경우 시너지 효과를 얻을 수 있다. 도 17에서 나타난 것과 같이 항-DR4 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413과 KD415를 같이 처리할 경우 시너지 효과로 인해 10 ~ 100배 증진된 EC50를 보여준다. HCT116, H460, U87MG 세 가지 세포주에서의 EC50는 0.053±0.005 μM, 0.066±0.004 μM, 0.121±0.008 μM이다. 항-DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD506과 KD548을 같이 처리할 경우 시너지 효과로 인해 10 ~ 100배 증진된 EC50를 보여준다. HCT116, H460, U87MG 세 가지 세포주에서의 EC50는 0.021±0.002 μM, 0.064±0.005 μM, 0.142±0.012 μM이다.

도 18은 항-DR4, 및 -DR5 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체에 의한 세포 사멸이 정제된 DR4, 및 DR5에 의해 억제됨을 MTT assay로 평가한 결과이다. 이는 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체에 의한 세포 사멸이 세포 표면의 DR4, DR5에 의한 것임을 보여준다. 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 돌연변이체 KD413, KD415, KD506, KD548 1 μM을 대장균에서 정제한 DR4, DR5 10 μM과 1시간 동안 반응시킨 후 위에서 언급한 HCT116, H460 세포주에 처리한 후 40 시간 후 MTT assay로 분석하였다. 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2와 TRAIL을 대조군으로 사용하였다. 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2는 DR4, DR5와 상관없이 세포 사멸을 유도하지 못했으며, TRAIL은 DR4, DR5가 있을 경우 부분적으로 세포 사멸이 저해되었다. 항-DR4 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413, KD415는 DR4에 의해서만 세포 사멸이 저해되었다. 항-DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD506은 DR5에 의해서만 세포 사멸이 저해되었다. 하지만 항-DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD548은 DR4, DR5 모두 결합능력이 있어 (도 10b) TRAIL과 같이 DR4, DR5가 있을 경우 모두 부분적으로 세포 사멸이 저해되었다.

도 19는 부유 세포주인 BJAB 세포주 (Human B lymphocyte, B 세포 림프종)와 DR5를 완전불활성화한 BJAB DR5-/- 세포주, H460 세포주, DR4를 과발현 시킨 H460 세포주에서 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413, KD415, KD506, KD548이 세포 표면의 DR4, DR5와 결합 정도를 실시예 6에서 설명한 방법으로 FACS를 통해 측정한 결과이다. 도 19a, 및 b는 DR5가 완전 knock-out된 경우, 항-DR4 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413, 및 KD415는 세포 표면 결합 정도가 그대로 유지됨을 알 수 있지만, 항-DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD506, 및 KD548은 세포 표면 결합 정도가 감소한다. 이를 통해 항-DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD506, 및 KD548이 세포 표면의 DR5에 특이적으로 결합함을 보여준다. 도 19c, 및 d는 DR4가 과발현될 경우, 항-DR4 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413, KD415는 세포 표면 결합 정도가 증가하지만, 항-DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD506, KD548은 세포 표면 결합 정도가 유지되므로, 세포 표면의 DR4에 특이적으로 항-DR4 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413, KD415가 결합함을 보여준다. 도 19e는 도 19a, 및 b를 도식화한 그래프이고, 도 19f는 도 19c, 및 d를 도식화한 그래프이다.

실시예 13: 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체의 세포 사멸 기작 분석

항-DR4, -DR5 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체의 세포 사멸이 에폽토시스 기작임을 분석하기 위해 실시예 11에서 기술한 바와 같이 부유 세포주인 Jurkat과 HL60 세포주에 항-DR4, DR5 크링글 도메인을 35 시간 처리한 후 annexin V-FITC와 propidium iodide (PI)로 염색을 하고 실시예 6에서 설명한 것과 같이 FACS로 측정하였다. 대조군으로 0.5 μg/ml (~30nM) TRAIL을 4시간 동안 처리하고 FACS로 분석하였다.

도 20은 Jurkat과 HL60 세포주에서 annexin V-FITC와 PI 염색을 FACS로 분석한 결과이다. 대조군인 TRAIL은 초기 에폽토시스의 특징인 annexin V-FITC+/PI-인 세포가 Jurkat 세포주에서 39.6 %, HL60 세포주에서 39.7 %, 항-DR4 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413은 Jurkat 세포주에서 17.5 %, HL60 세포주에서 35.9 %, 항-DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD548은 Jurkat 세포주에서 40.6 %, HL60 세포주에서 21.35 %로 분포하여 에폽토시스가 세포 사멸 기작임을 보여준다.

실시예 14: 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체의 in vivo 생물학적 동정

항-DR4, -DR5 크링글 도메인 돌연변이체의 in vivo 생물학적 동정을 위해, 4 주령의 암컷 BALB/c athymic nude mice (CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl, 15-20 g, Orientbio Inc. (Korea))에 HCT116과 U87MG 세포주를 오른쪽 다리에 한 마리당 5×10⁶ 세포를 접종하였다. 약 7일 후 종양의 크기가 약 ~50 mm³가 되었을 때 7마리의 쥐에 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413, KD548을 처리하고, 대조군으로 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2와 TRAIL을 사용하였다. 치료는 2 일 간격으로 총 7번 실행되었으며 항-DR4, DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413, KD548, 야생형 플리스미노겐 크링글 도메인 2는 20 mg/kg, TRAIL은 15 mg/kg의 농도로 종양에 직접 주입하였다 (Ashkenazi A & Herbst RS J Clin Invest, 118(6):1979-1990, 2008, Ashkenazi A 등, J Clin Invest 104(2):155-162, 1999). 종양의 크기는 종양의 길이와 너비를 측정해, 0.5×(길이)×(너비)²의 공식으로 계산하였다 (van der Sloot AM 등, Proc Natl Acd Sci USA, 103(23):8634-8639, 2006, Pukac L 등, Br J. Cancer 92(*)1430-1441, 2005). 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2, 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413, KD548과 TRAIL이 주입된 쥐들은 특별한 행동이나 모습, 몸무게 변화가 없었으며, 종양 접종 23일 후 희생되었으며, 종양을 적출하고 종양의 무게를 측정하였다.

도 21은 종양 접종이후, 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2, 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413, KD548과 TRAIL을 종양 내 직접 주입한 이후, 2일 간격으로 종양의 부피를 측정한 데이터와, 종양을 적출한 데이터이다. 도 21a는 HCT116 세포주, 도 21b는 TRAIL 저항성 세포주인 U87MG 세포주의 결과이다. 이 동물실험 결과는 항-DR4, DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413, KD548이 in vivo에서 TRAIL 민감성 세포주인 HCT116, 저항성 세포주인 U87MG 세포주에서 종양성장을 효과적으로 저해함을 시사한다.

실시예 15: 항-TNFα 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체의 생물학적 활성 평가

야생형 플라스미노겐 크링글 도메인2와 infliximab (Remicade, Johnson & Johnson)을 대조군으로 하여, 항-TNFα 크링글 도메인 돌연변이체인 KDT26과 KDT26의 Fc 융합체인 KDT26-Fc의 인간 TNFα의 세포독성을 WEHI 164 세포주 (쥐 섬유육종, mouse fibrosarcoma, ATCC CRL-1751)에서 동정하였다 (김민수 등, J Mol Biol 374(5):1374-1388, 2007, 송무영 등, Exp Mol Med 40(1):35-42, 2008). WHEI 164 세포주를 1×10⁴ cells/well로 96웰 플레이트에 삼배수로 접종하여, 10% (v/v) FBS가 들어간 RPMI 1640에서 20시간 배양한 후 배지에 2 /ml actinomycin D를 추가하고 함께 1 ng/ml의 인간 TNFα를 처리한 후 0.1 nM 2 μM의 농도로 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인2, 항-TNFα 크링글 도메인 돌연변이체인 KDT26과 KDT26-Fc, infliximab을 처리하고 20시간 후 MTT assay로 세포 사멸을 평가하였다. IC₅₀(50% inhibiting concentration)는 시그마 플랏 소프트웨어(Sigma plot, SPSS Inc)를 이용해 결정하였다.

도 22a는 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2, 항-TNFα 크링글 도메인 돌연변이체인 KDT26과 KDT26-Fc, infliximab의 TNFα에 의한 WEHI 164 세포주의 세포 사멸 저해를 평가한 결과이다. infliximab의 IC₅₀는 약 2 nM이며, KDT26의 IC₅₀는 0.78±0.03 μM, KDT26-Fc의 IC₅₀는 5.2±0.7 nM로 측정되었다.

in vivo 에서 TNFα의 세포독성 중화실험을 위해, 6 주령 C57BL/6 mice (Orientbio)를 병원체가 없는 조건에서 복강 주사를 통해 KDT26-Fc (5 and 25 μg/mouse), infliximab (5 and 25 μg/mouse), 인간 항체 대조군 IgG1 (Sigma) (5 μg/mouse)을 13 마리에 주입하였다. 한 시간 후, 투여 12 시간 후 치사율 90 %임을 확인한 투약량인 쥐 한 마리당 0.4 μg 인간 TNFα와 쥐 한 마리당 7 mg D-galactosamine (GalN, Sigma)를 복강 주사로 주입하였다 (송무영 등, Exp Mol Med 40(1):35-42, 2008). 생존율은 6 시간마다 기록하였고, 로그-랭크 테스트를 사용해 생존율을 분석하였다.

도 22b는 대조군인 인간 IgG1, infliximab, KDT26-Fc의 in vivo에서 TNFα의 매개 독성 저해를 생존 분석 그래프로 나타낸 것이다. p 값은 5 μg/mouse로 주입한 infliximab의 경우 0.0001, 25 μg/mouse로 주입한 infliximab의 경우 0.0001, 5 μg/mouse로 주입한 KDT26-Fc는 0.002, 25 μg/mouse로 주입한 KDT26-Fc는 0.0038로 측정되었다. 이는 항-TNFα 크링글 도메인 돌연변이체인 KDT26-Fc가 효과적으로 동물 실험 모델에서 작용함을 시사한다.

실시예 16. 동일 표적분자에 결합하는 크링글 도메인 돌연변이체 단일체를 동형다중체 (homo-oligomers)를 생성하는 방법

실시예 2에서 설명한 것과 같이 동형다중체를 생성할 경우의 장점은 표적분자에 대한 친화도가 avidity효과 때문에 증가하고, 다양한 표적분자 부위에 결합하는 단일체의 조합으로 표적분자의 생물학적 활성을 효율적으로 조율할 수 있고, 단일체보다 크기가 커서 약물동력학적 (pharmacokinetics) 측면에서도 장점이 있다. 이를 위해 항-DR4 크링글 도메인 변이체인 KD413, KD415, 항-DR5 크링글 도메인 변이체인　KD506, KD548, 항-TNFα크링글 도메인 변이체인 KDT26 단일체을 링커 (linker)을 이용하여 동형이배체를 구축하였다.

크링글 도메인 동형 이배체는 크링글 도메인사이에 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₄ [(G₄S)₄]의 링커를 이용하여 구축하였다. 즉 KD413, KD415, KD506, KD548, KDT26이 클로닝되어 있는 효모 Pichia pastoris 발현 벡터 (pPICZaA, Invitrogen, USA)에 인 프레임(in-frame)으로 BamHI/AflII를 이용하여 (G₄S)₄의 링커를 가진 크링글 도메인 동형이배체 (homodimer)를 클로닝 하였다 (도 23a). 이때 피키아 효모 발현벡터는 AOX3 프로모터-MFa 분비 표적화 서열-크링글 도메인-myc tag-6X His tag을 가지도록 디자인되었다 (pPICZaA, Invitrogen, USA). 구축된 동형이배체의 발현 및 정제는 실시예8에서 설명된 크링글 도메인 변이체를 정제하는 것과 같은 방법을 통해 수행되었다.

동형이배체의 표적 분자에 대한 친화도는 실시예8에서 설명된 것과 같이 ELISA를 통해 결정되었으며, 각 크링글 도메인 변이체 단량체와 비교하였다 (도23b,c,d).

도23은 항-DR4 KD413, KD415 크링글 도메인 변이체, 항-DR5 KD506, KD548 크링글 도메인 변이체, 항-TNFαKDT26 크링글 도메인 변이체을 (G₄S)₄ 링커를 이용하여 동형이배체 (homodimer)를 구축한 모식도 및 각 표적분자에 대한 친화도를 ELISA로 정량한 것이다. 도23a는 구축된 동형이배체의 모식도를 나타낸 것이다. 도 23b는 항-DR4 KD413 및 KD415 동형이배체의 DR4에 대한 친화도를 ELISA로 결정하였다. 항-DR4 KD413 동형 이배체의 친화도는 43 nM, 항-DR4 KD415 동형이배체의 친화도는 87 nM로 결정되었다. 도 23c는 항-DR5 KD506 및 KD548 동형이배체의 DR5에 대한 친화도를 ELISA로 결정한 것이다. 항-DR5 KD506 동형이배체의 친화도는 31 nM, 항-DR5 KD548 동형이배체의 친화도는 53 nM로 결정되었다. 도 23d는 항-TNFα KDT26 동형이배체의 TNFα에 대한 친화도를 ELISA로 결정한 것이다. 친화도는 8 nM 수준으로 측정되었다. 위 실험결과는 크링글 도메인 단량체를 동형이배체로 변환하였을 경우, avidity효과로 타겟분자에 대한 친화도가 약 10배 정도 향상됨을 보여준다.

실시예 17. 두 개 이상의 다른 표적분자에 각각 특이적으로 결합하는 크링글 도메인 변이체를 링커를 이용하여 각각의 단일체들의 조합으로 다중체를 생성하여 다중 표적분자에 동시에 결합할 수 있는 다중체 제조방법.

항-DR4 크링글 도메인 변이체인 KD413와 KD415를, 항-DR4 크링글 도메인 변이체인 KD413과 항-DR5 크링글 도메인 변이체인　KD506을 링커 (linker)을 이용하여 이형이배체를 구축하였다.

크링글 도메인 이형이배체는 선별된 크링글 도메인 변이체 사이에 (G₄S)₄ 링커를 이용하여 구축하였으며, 실시예 16와 같은 방법으로 구축하였다. 발현 및 정제는 실시예8에서 설명된 크링글 도메인 변이체를 정제하는 것과 같은 방법을 통해 수행되었다.

도 24는 항-DR4 KD413 및 항-DR4 KD415 크링글 도메인 변이체 또는 항-DR4 KD413 및 항-DR5 KD506 크링글 도메인 변이체을 (G₄S)₄ 링커를 이용하여 이형 이배체 (heterodimer)를 구축한 모식도 및 각 표적분자에 대한 친화도를 ELISA로 정량한 것이다. 도24a는 구축된 이형이배체의 모식도를 나타낸 것이다. 도24b는 KD413-KD415 이형접합체의 DR4에 대한 친화도, 도24c는 KD413-KD506의 DR4에 대한 친화도, 도24d는 KD413-KD506의 DR5에 대한 친화도을 ELISA로 결정한 것이다. 또한 도24b, c 및 d에서 이형이배체에 대한 친화도는 이형이배체를 구성하는 크링글 도메인 변이체인 항-DR4 KD413, 항-DR4 KD415, 항-DR5 KD506와 비교하였다. 도24e는 KD413-KD506의 DR4 및 DR5에 대한 결합을 샌드위치 ELISA (sandwich ELISA)로 결정한 것이다. 즉, KD413-KD506 이형이배체가 표적분자인 DR4, DR5에 동시에 결합함을 보여준 결과이다. 위 실험결과는 다른 표적분자에 특이적으로 결합하는 크링글 도메인 변이체를 이형이배체로 연결하였을 경우 이중특이성 (bispecificity)가 부여됨을 보여주는 결과이다.

실시예 18. 항-DR4, DR5, TNFα 크링글 도메인 변이체의 표적분자와 결합하는 결합루프 맵핑(binding loop mapping).

실시예 1에서 기술한 것과 같이 크링글 도메인은 7개의 루프가 있고, 크링글 도메인 기반 비항체 단백질 골격 라이브러리는 7개의 루프를 모두 변이시켜 라이브러리를 구축하였다. 따라서 항-DR4 크링글 도메인 변이체인 KD413, KD415, 항-DR5 크링글 도메인 변이체인 KD506, KD548, 항-TNFα 크링글 도메인 변이체인 KDT26는 표적분자와 결합 가능한 7개의 루프를 가진다. 7개의 루프 중 표적분자와 결합하는 루프를 찾기 위해 항-DR4 크링글 도메인 변이체인 KD413, KD415, 항-DR5 크링글 도메인 변이체인 KD506, KD548, 항-TNFα 크링글 도메인 변이체인 KDT26의 루프를 야생형인 플라스미노겐 크링글 도메인 2의 아미노산 서열을 가지도록 back mutation하였다. 루프 1, 2, 3, 및 4를 항-DR4 크링글 도메인 변이체인 KD413, KD415, 항-DR5 크링글 도메인 변이체인 KD506, KD548, 항-TNFα 크링글 도메인 변이체인 KDT26의 아미노산 서열을 가지고 나머지 루프의 아미노산 서열은 야생형인 플라스미노겐 크링글 도메인 2의 아미노산 서열을 가진 클론들을 KD413L1234, KD415L1234, KD506L1234, KD548L1234, KDT26L1234로 명명하였다. 이와 같은 방식으로 루프 5, 6 및 7을 제외한 나머지 아미노산 서열이 야생형인 플라스미노겐 크링글 도메인 2의 아미노산 서열을 가진 클론들을 KD413L567, KD415L567, KD506L567, KD548L567, KDT26L567로 명명하였다. 루프 5 및 6을 제외한 나머지 아미노산 서열이 야생형인 플라스미노겐 크링글 도메인 2의 아미노산 서열을 가진 클론들을 KD413L56, KD415L56, KD506L56, KD548L56, KDT26L56로 명명하였다. 루프 5를 제외한 나머지 아미노산 서열이 야생형인 플라스미노겐 크링글 도메인 2의 아미노산 서열을 가진 클론들을 KD413L5, KD415L5, KD506L5, KD548L5, KDT26L5로 명명하였다.

도 25는 각 표적분자에 대해서 크링글 도메인 변이체의 결합 루프 분석 (binding loop analysis)을 수행한 것이다. 즉 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2의 아미노산 서열로 각각의 루프가 back mutation된 항-DR4, DR5 크링글 도메인 변이체를 효모표면 발현 시스템을 이용하여, DR4, DR5, DcR1 및/또는 DcR2에 대한 결합능력을, 항-TNFα 크링글 도메인 변이체의 TNFα에 대한 결합능력을 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석한 후, 결합정도를 MFI (mean fluorescence intensity)로 정량화한 것이다.

KD413은 표적분자인 교차반응성 없이 DR4에 대해서만 결합하고, KD413L56이 표적분자인 DR4의 친화도가 가장 강하여, 루프 5 및 6이 표적분자인 DR4와 결합에 가장 중요함을 알 수 있다.

KD415는 표적분자인 교차반응성 없이 DR4에 대해서만 결합하고, KD415L567이 표적분자인 DR4의 친화도가 가장 강하여, 루프 5, 6 및 7이 표적분자인 DR4와 결합에 가장 중요함을 알 수 있다.

KD506은 표적분자인 교차반응성 없이 DR5에 대해서만 결합하고, KD506L567이 표적분자인 DR5의 친화도가 가장 강하여, 루프 5, 6 및 7이 표적분자인 DR5와 결합에 가장 중요함을 알 수 있다.

KD548은 실시예 8의 결과와 같이 DR4, DR5 모두 결합하고, KD548L56이 표적분자인 DR5의 친화도가 가장 강하여, 루프 5 및 6이 표적분자인 DR5와 결합에 가장 중요함을 알 수 있다.

KDT26은 표적분자인 교차반응성 없이 TNFα에 대해서만 결합하고, KDT26L56이 표적분자인 TNFα의 친화도가 가장 강하여, 루프 5 및 6이 표적분자인 TNFα와 결합에 가장 중요함을 알 수 있다.

실시예 19. 동일 표적분자의 다른 부위 또는 두 개 이상의 서로 다른 표적분자에 결합하는 크링글 도메인 변이체의 결합 루프를 동일 또는 다른 단일체의 다른 루프부위에 옮겨서 다결합 단일체 (multivalent monomer) 또는 다중특이성 단일체 (multispecific monomer)을 생성 제조하는 방법.

실시예 18에서 결합루프분석 (binding loop analysis)를 통해 항-DR4, DR5, TNFα 크링글 도메인 변이체가 표적분자의 결합에 관여하는 중요 루프를 결정하였다. 이 루프들을 접목 (grafting)하여, 다결합단일체 (multivalent monomer) 및 다중특이성 단일체 (multispecific monomer)를 구축하였다.

항-DR4 KD413의 경우 루프 5 및 6이 표적분자 DR4 결합에 중요한 역할을 하므로, KD413의 루프 5 및 6을 도26과 같이 3차 구조상 반대방향을 향하고 있는 KD413의 루프 3 및 4로 각각 접목 (grafting)시켰다. DR4에 대해 결합능력이 있는 루프 5 및 6의 아미노산 서열이 2곳에 존재하는 이중결합단일체(bivalent monomer)인 크링글 도메인 변이체 KD413-4를 구축하였다.

항-DR4 KD413의 경우 루프 5 및 6이 표적분자 DR4 결합에 중요한 역할을 하고, 항-DR5 KD506의 경우 루프 5, 6 및 7이 표적분자 DR5 결합에 중요한 역할을 하므로, KD413의 루프 5 및 6을 3차 구조상 반대방향을 향하고 있는 KD506 루프 3 및 4로 접목시켰다. DR4에 대해 결합능력이 있는 항-DR4 KD413의 루프 5 및 6과 DR5에 대해 결합능력이 있는 루프 5, 6 및 7이 한 분자에 있는 이중특이성 단일체 (bispecific monomer)인 크링글 도메인 변이체 KD506-4를 구축하였다.

항-DR5 KD548의 경우 루프 5 및 6이 표적분자 DR5에 대한 결합에 중요한 역할을 하고, 항-DR4 KD413의 경우 루프 5 및 6이 표적분자 DR4에 대한 결합에 중요한 역할을 하므로 KD548의 루프 5 및 6을 3차 구조상 반대방향을 향하고 있는 KD413 루프 3 및 4로 접목시켰다. DR4에 대해 결합능력이 있는 항-DR4 KD413 루프 5 및 6과 DR5에 대해 결합능력이 있는 항-DR5 KD548 루프 5 및 6이 한 분자에 있는 이중특이성 단일체 (bispecific monomer)인 크링글 도메인 변이체 KD413-5를 구축하였다.

도 26은 크링글 도메인 변이체의 루프들을 접목(grafting) 방법 예을 모식도로 나타낸 것이다. 예를 들어 크링글 도메인의 루프 5 및 6을 3차 구조상 반대편을 향하면서, 루프 구조가 가장 닮아있는 루프 3 및 4로 grafting 시키는 방법을 도식화 한 것이다.

도 27은 이중결합 단일체 (bivalent monomer)로 구축된 크링글 도메인 변이체인 KD413-4 와 이중특이성 단일체 (bispecific monomer)로 구축된 크링글 도메인 변이체인 KD413-5 및 KD506-4가 표적분자 결합을 sandwich ELISA로 정량한 것이다. 도27a는 항-DR4 이중결합 단일체인 KD413-4가 바닥에 코팅된 DR4와 용액상태 (soluble)의 DR4에 동시에 결합함을 보여주는 결과이다. 대조군으로 KD413L56을 사용하였으며 이중결합성 (bivalency)이 없음을 확인하였다.

도27b는 항-DR4/DR5 이중특이성 단일체인 KD413-5가 바닥에 코팅된 DR4와 용액상태 (soluble)의 DR5에 동시에 결합함을 보여주는 결과이다. 대조군으로 KD413L56을 사용하였으며 이중결합성 (bivalency)이 없음을 확인하였다. 도27c는 항-DR5/DR4 이중 특이성 단일체인 KD506-4가 바닥에 코팅된 DR5와 용액상태 (soluble)의 DR4에 동시에 결합함을 보여주는 결과이다. 대조군으로 KD506L567을 사용하였으며 이중결합성 (bivalency)이 없음을 확인하였다.

위 실험결과는 동일 표적분자의 다른 부위 또는 두 개 이상의 서로 다른 표적분자에 결합하는 크링글 도메인 변이체의 결합 루프를 동일 또는 다른 단일체의 다른 루프부위에 옮겨서 다결합 단일체 (multivalent monomer) 또는 다중특이성 단일체 (multispecific monomer)을 생성할 수 있다는 것을 보여준다.

도 1은 인간에 존재하는 아미노산 서열이 다른 39개의 크링글 도메인의 보존된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 2는 인간유래 크링글 도메인의 각 잔기에 가장 보존된 아미노산 및 이의 보존율을 도식적으로 나타내었다.

도 3은 플라스미노겐의 크링글 도메인 2의 (PDB ID= 1B2I) 3차 구조를 바탕으로, 아미노산 서열이 덜 보존되어 있는 7 개의 루프를 나타낸 것이다. 도 3a, b는 플라스미노겐 크링글 도메인 2의 이차 구조 및 3 개의 다이설파이드 결합을 보여주며, 도 3c, d는 플라스미노겐 크링글 도메인 2의 표면을 보여준다.

도 4는 크링글 도메인의 구조에 기반한 단백질 골격 라이브러리를 구축하여, 표적분자에 특이적으로 결합하는 단백질 골격 단일체를 분리하여 그 활용을 도식화하여 나타낸 것이다. 도 4a는 각 표적 분자에 대해 선별된 크링글 도메인 변이체의 친화도 개량, 도 4b는 각 표적분자의 작용 메커니즘에 따른 크링글 도메인 변이체의 다량체 구축, 도 4c는 각 표적분자에 대해 선별된 크링글 도메인 변이체의 Fc 융합체 구축, 도 4d는 각 표적분자에 대해 선별된 크링글 도메인 변이체의 결합 루프 분석 (binding loop analysis) 및 다결합 단일체 (multivalent monomer)와 다중특이성 단일체 (multispecific monomer) 구축 방법을 모식도로 보여준다.

도 5는 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인 2를 바탕으로 다양한 표적분자에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 구조골격으로 활용하기 위해 구체적인 크링글 도메인 기반 단백질 골격 라이브러리를 구축한 전략을 도식적으로 나타낸 것이다.

도 6은 크링글 도메인 단백질 골격 라이브러리의 구축 과정을 모식화한 것이다. 도 6a는 8개의 프라이머가 오버랩(overlap)하여 크링글 도메인 단백질 골격 라이브러리의 유전자가 형성되는 과정을 나타내며, 도 6b는 효모 표면 발현 과정을 도식화한 것이다.

도 7은 표적분자 DR4에 대하여 선별된 KD404, KD408, KD409, KD413, KD415, KD421, KD437, KD445, KD456 및 KD459 크링글 돌연변이체, 표적분자 DR5에 대하여 선별된 KD502, KD503, KD505, KD506, KD509, KD537, KD542, KD548, KD555 및 KD559 크링글 돌연변이체, 표적분자 TNFα에 대하여 골라진 KDT01, KDT02, KDT08 및 KDT26 크링글 돌연변이체의 정체 후, 환원성 (도 7a, c, e) 또는 비환원성 (도 7b, d, f) 조건에서 15% SDS-PAGE을 통해 분석한 것이다.

도 8은 HPLC (high performance liquid chromatography, The Agilent 1200 Series LC Systems and Modules, Agilent, USA)를 통해서 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인들이 단일체로 존재함을 확인하기 위해, 크기배제 크로마토그래피 칼럼(Size exclusion chromatography column, Superdex^TM200 10/300GC, GE Healthcare, Sweden)을 실험한 결과이다.

도 9는 표적분자 DR4에 대하여 선별된 KD404, KD408, KD409, KD413, KD415, KD421, KD437, KD445, KD456 및 KD459 크링글 도메인 돌연변이체, 표적분자 DR5에 대하여 선별된 KD502, KD503, KD505, KD506, KD509, KD537, KD542, KD548, KD555 및 KD559 크링글 도메인 돌연변이체, 표적분자 TNFα에 대하여 골라진 KDT01, KDT02, KDT08 및 KDT26 크링글 도메인 돌연변이체의 친화도를 ELISA로 정량한 것이다.

도 10은 표적분자 DR4에 대하여 선별된 KD404, KD408, KD409, KD413, KD415, KD421, KD437, KD445, KD456 및 KD459 크링글 도메인 돌연변이체, 표적분자 DR5에 대하여 선별된 KD502, KD503, KD505, KD506, KD509, KD537, KD542, KD548, KD555 및 KD559 크링글 도메인 돌연변이체, 표적분자 TNFα에 대하여 골라진 KDT01, KDT02, KDT08 및 KDT26 크링글 도메인 돌연변이체의 교차반응성을 ELISA로 정량한 것이다.

도 11은 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 돌연변이체의 결합 자리 (binding site)를 비교하기 위해 TRAIL과 같은 표적분자에 대해 선별된 각각의 크링글 도메인 돌연변이체에 대해 경쟁적 ELISA (competitive ELISA)를 통해 각각의 결합 자리 (binding site)를 분석한 것이다.

도 12는 CD을 통해서 야생형인 플라스미노겐 크링글 도메인 2와 항-DR4 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413, KD415, 항-DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD506, KD548, 항-TNFα 크링글 도메인 돌연변이체인 KDT26의 2차 구조를 분석한 결과이다.

도 13은 열역학적 스트레스 하에서 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체의 결합능력을 ELISA를 통해 측정한 결과이다.

도 14는 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2와 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체의 시차주사 열용량 분석 결과와 최대 열용량 온도를 나타냈다.

도 15는 크링글 도메인 돌연변이체와 인간 항체 IgG1의 Fc 도메인 융합체의 모식도 및 이배체로 존재함을 보여주는 SDS-PAGE 및 HPLC 결과이다.

도 16은 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 돌연변이체와 Fc 융합 항-DR4, -DR5, -TNFα 크링글 도메인 돌연변이체의 친화도 ELISA를 통해 측정한 결과이다.

도 17는 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체 중 생물학적 활성을 가지는 항-DR4 KD413, KD415, KD413-Fc, KD415-Fc (0.001~5μM), 항-DR5 KD506, KD548, KD506-Fc, KD548-Fc (0.001~5μM)에 의해 60시간 배양 후, HCT116 (도 17a), H460 (도 17b), U87MG (도 17c), HepG2 (도 17d), Jurkat (도 17e), HL60 (도 17f)에 농도의존적으로 세포사멸이 유도됨을 MTT assay로 분석한 결과이다. 대조군으로 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2와 TRAIL을 사용하였다(도 17g).

도 18은 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 돌연변이체에 의한 세포 사멸이 정제된 DR4, DR5에 의해 억제됨을 MTT assay로 평가한 결과이다.

도 19는 부유 세포주인 BJAB 세포주 (Human B lymphocyte, B 세포 림프종)와 DR5를 knock-out한 BJAB DR5-/- 세포주, H460 세포주, DR4를 과발현 시킨 H460 세포주에서 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413, KD415, KD506, KD548이 세포 표면의 DR4, DR5와 결합 정도를 실시예 6에서 설명한 방법으로 FACS를 통해 측정한 결과이다.

도 20은 Jurkat과 HL60 세포주에서 annexin V-FITC와 PI 염색을 FACS로 분석 한 결과이다.

도 21은 종양 접종이후, 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2, 항-DR4, -DR5 크링글 도메인 돌연변이체인 KD413, KD548과 TRAIL을 종양 내 직접 주입한 이후, 2일 간격으로 종양의 부피를 측정한 데이터와, 종양을 적출한 데이터이다.

도 22는 항-TNFα 크링글 도메인 돌연변이체의 생물학적 활성을 in vitro 및 in vivo에서 동정한 결과이다. 도 22a는 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2, 항-TNFα 크링글 도메인 돌연변이체인 KDT26과 KDT26-Fc, infliximab의 TNFα에 의한 WEHI 164 세조주의 세포 사멸 저해를 평가한 결과이다. 도 22b는 대조군인 인간 IgG1, infliximab, KDT26-Fc의 in vivo에서 TNFα의 매개 독성 저해를 생존 분석 그래프로 나타낸 것이다.

도 23은 항-DR4 KD413, KD415 크링글 도메인 변이체, 항-DR5 KD506, KD548 크링글 도메인 변이체, 항-TNFαKDT26 크링글 도메인 변이체을 (G₄S)₄ 링커를 이용하여 동형이배체 (homodimer)를 구축한 모식도 및 각 표적분자에 대한 친화도를 ELISA로 정량한 것이다. 도23a는 구축된 동형이배체의 모식도를 나타낸 것이다. 도 23b는 항-DR4 KD413 및 KD415 동형이배체의 DR4에 대한 친화도를 ELISA로 결정한 것이고, 도 23c는 항-DR5 KD506 및 KD548 동형이배체의 DR5에 대한 친화도를 ELISA로 결정한 것이고, 도 23d는 항-TNFα KDT26 동형이배체의 TNFα에 대한 친화도를 ELISA로 결정한 것이다.

도 24는 항-DR4 KD413 및 항-DR4 KD415 크링글 도메인 변이체 또는 항-DR4 KD413 및 항-DR5 KD506 크링글 도메인 변이체을 (G₄S)₄ 링커를 이용하여 이형 이배체 (heterodimer)를 구축한 모식도 및 각 표적분자에 대한 친화도를 ELISA로 정량한 것이다. 도24a는 구축된 이형이배체의 모식도를 나타낸 것이다. 도24b는 KD413-KD415 이형접합체의 DR4에 대한 친화도, 도24c는 KD413-KD506의 DR4에 대한 친화도, 도24d KD413-KD506의 DR5에 대한 친화도을 ELISA로 결정한 것이다. 도24e는 KD413-KD506의 DR4 및 DR5에 대한 결합을 샌드위치 ELISA (sandwich ELISA)로 결정한 것이다.

도 25는 각 표적분자에 대해서 선별된 크링글 도메인 변이체의 결합 분석 (binding loop analysis)을 수행한 것이다. 크링글 도메인 변이체의 각각의 루프를 야생형 플라스미노겐 크링글 도메인 2 아미노산 서열로 backmutation 시킨 후, 효모세포표면에 발현시킨 후, DR4, DR5, DcR1, DcR2, TNFα에 대한 결합능력을 유세포 분석기(flow cytometry)로 분석한 후, 결합정도를 MFI (mean fluorescence intensity)로 정량화한 것이다.

도 26은 크링글 도메인 변이체의 루프들을 접목(grafting) 방법 예를 모식도로 나타낸 것이다. 예를 들어 크링글 도메인의 루프 5 및 6을 3차 구조상 반대편을 향하면서, 루프 구조가 가장 닮아있는 루프 3 및 4로 grafting 시키는 방법을 도식화 한 것이다.

도 27은 이중결합 단일체 (bivalent monomer)로 구축된 크링글 도메인 변이체인 KD413-4 와 이중특이성 단일체 (bispecific monomer)로 구축된 크링글 도메인 변이체인 KD413-5 및 KD506-4가 표적분자 결합을 sandwich ELISA로 정량한 것이다. 도27a는 항-DR4 이중결합 단일체인 KD413-4가 바닥에 코팅된 DR4와 용액상태 (soluble)의 DR4에 동시에 결합함을 보여주는 결과이고, 도27b는 항-DR4/DR5 이중특이성 단일체인 KD413-5가 바닥에 코팅된 DR4와 용액상태 (soluble)의 DR5에 동시에 결합함을 보여주는 결과이고, 도27c는 항-DR5/DR4 이중 특이성 단일체인 KD506-4가 바닥에 코팅된 DR5와 용액상태 (soluble)의 DR4에 동시에 결합함을 보여주는 결과이다. 대조군으로는 KD413L56, KD506L567, KD548L56이 사용되었으며, 모두 sandwich ELISA 결과를 통해 이중결합 또는 이중특이성이 없음을 확인하였다.

<110> Ajou University Industry Cooperation Foundation <120> Protein scaffold library based on Kringle domain structure and uses thereof <150> KR2008-0078475 <151> 2008-08-11 <160> 50 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 ggtggtggtg gttctggtgg tggtggttct ggtggtggtg gttctgctag cgaggaatgt 60 60 <210> 2 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gccgtcatac ybgkntcccy bgkncybgkn acattcctcg ctagcagaac 50 <210> 3 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggganmcvrg tatgacggcn mcvrgnmcvr gaccnmcvrg gganmcvrgt gccagnmctg 60 g 61 <210> 4 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tccatggkng tgtggcybgk ncybgkncca gknctggcac ybgkntc 47 <210> 5 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cvrgccacac nmccatggan mcvrgnmcvr gnmcvrgnmc vrgnmcvrgn mcvrgaagaa 60 ttactgtcgt aaccccgat 79 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial 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acctgaagaa gaattactgt cgtaaccccg atagggagct gcggccttgg 180 tgtttcacca ccgaccccaa caagcgctgg gaactttgcg acatcccccg ctgc 234

Claims

크링글 도메인 구조골격 유지에 중요한 보존된 아미노산 잔기를 제외한 잔기에 인위적인 돌연변이가 유도되도록 하는 단계를 포함하는 크링글 도메인 구조 골격에 기반한 단백질 골격 라이브러리 제조방법으로, 상기 크링글 도메인 구조골격 유지에 중요한 보존된 아미노산 잔기는 C1, G6, Y9, D10, G11, T16, G19, C22, Q23, W25, P30, H31, H33, G34, K48, N49, Y50, C51, R52, N53, P54, D55, P61, W62, C63, F64, T65, E73, L74, C75, P78, R79, 및 C80로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기를 포함하는 크링글 도메인 구조 골격에 기반한 단백질 골격 라이브러리 제조방법.
삭제
제 1항에 있어서, 인위적인 돌연변이는 아미노산 잔기 2, 3, 4, 5, 7, 8, 12, 13, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 24, 26, 27, 28, 29, 32, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 56, 57, 58, 59, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 76, 및 77로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 잔기에서 일어나며, 이들 잔기가 삭제 또는 세린, 타이로신, 프로린, 히스티딘, 쓰레오닌, 아스파라긴, 알라닌, 아스파테이트, 글루타민, 알기닌, 라이신, 글루탐산 및 글라이신으로 구성된 군으로 부터 선택된 적어도 하나 이상의 잔기로 치환되는 크링글 도메인 구조 골격에 기반한 단백질 골격 라이브러리 제조방법.
제 1항에 있어서, 자연계에 존재하는 크링글 도메인의 유전자를 주형으로 하여 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하여, 크링글 도메인 구조골격 유지에 중요한 보존된 아미노산 잔기를 제외한 잔기에 인위적인 돌연변이가 유도되도록 하여, 자연계에 존재하지 않은 아미노산 서열을 갖는 크링글 도메인 구조 골격에 기반한 단백질 골격 라이브러리 제조방법;

여기서 상기 라이브러리로부터 유래한 돌연변이체는 하기 아미노산 서열을 갖는 크링글 도메인 구조 기반 단백질 변이체이고,

CXxXxGXxYDGXxXxTXxGXxCQXWXxXxPHXHGXxXxXxXxXxXxKNYCRNPDXxXxPWCFTXxXxXxXELCXxPRC(서열번호;19)

상기 서열에서 여기서 X는 세린, 타이로신, 프로린, 히스티딘, 쓰레오닌, 아스파라긴, 알라닌, 또는 아스파테이트인 것을 특징으로 하고, x는 글루타민, 알기닌, 라이신, 글루탐산 또는 글라이신인 것을 특징으로 함.
제 4항에 있어서, 상기 프라이머는 서열번호 1 내지 서열번호 8로 구성된 군으로부터 선택된 단백질 골격 라이브러리 제조방법.
제 5항에 있어서, 크링글 도메인은 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인인 단백질 골격 라이브러리 제조방법.
제 6항에 있어서, 상기 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인은 서열번호 49에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질 골격 라이브러리 제조방법.
제 6항에 있어서, 상기 인간 플라스미노겐의 크링글 도메인은 서열번호 50에 기재된 염기 서열을 가지는 단백질 골격 라이브러리 제조방법.
크링글 도메인 구조골격 유지에 중요한 보존된 아미노산 잔기를 제외한 잔기에 인위적인 돌연변이가 유도된 크링글 도메인에 기반하여 구축된 단백질 골격 라이브러리로, 상기 크링글 도메인 구조골격 유지에 중요한 보존된 아미노산 잔기는 C1, G6, Y9, D10, G11, T16, G19, C22, Q23, W25, P30, H31, H33, G34, K48, N49, Y50, C51, R52, N53, P54, D55, P61, W62, C63, F64, T65, E73, L74, C75, P78, R79, 및 C80로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 잔기를 포함하는 크링글 도메인 구조 골격에 기반한 단백질 골격 라이브러리 제조방법.
제 9항에 있어서, 상기 라이브러리는 서열번호 13에 기재된 라이브러리인 단백질 골격 라이브러리.
제 10항에 있어서, 상기 라이브러리는 서열번호 14 내지 서열번호 18로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 골격 라이브러리.
제 9항의 단백질 골격 라이브러리를 표적분자와 반응시켜 표적분자에 특이적 고친화도를 가지는 크링글 도메인 구조 기반 단백질 골격 변이체를 선별하는 방법.
제 12항에 있어서, 상기 표적 분자는 세포사멸수용체(DR)4, 세포사멸수용체(DR)5, 종양괴사인자 알파, 당단백질 IIβ/IIIα 수용체(Glycoprotein IIb/IIIa receptor) 또는 당단백질 IIβ/IIIα (Glycoprotein IIβ/IIIα), 혈관내피세포성장인자(VEGF;vascular endothelial growth factor), 혈관내피세포성장인자 수용체(VEGFR, vascular endothelial growth factor receptor), 타이로신 카이네이즈 억제제(tyrosin kinase inhibitor), 표피성장인자 수용체(Epidermal growth factor receptor), 혈소판 생장인자(platelet-derived growth factor), 혈소판 생장인자 수용체 (platelet-derived growth factor receptor), 줄기세포인자수용체 (c-kit), Fms-유사 타이로신키나제-3 (Flt-3), 인터루킨 1 (interleukin 1), 인터루킨 6 (interleukin 6), 인터루킨 32 (interleukin 32), 인터루킨 2 수용체 (interleukin 2 receptor), Cr3, Cr11a, Cr14, Cr15, Cr16, Cr20 Cr32, Cr64, 또는 Raf인 표적분자에 특이적 고친화도를 가지는 크링글 도메인구조에 기반 단백질 골격 돌연변이체를 선별하는 방법.
제12항의 방법에 의하여 제조된 표적분자에 특이적 고친화도를 가지는 크링글 도메인 구조에 기반한 단백질 골격 돌연변이체.
제 14항에 있어서, 상기 돌연변이체는 서열번호 20 내지 서열번호 32로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 크링글 도메인 구조에 기반한 단백질 골격 돌연변이체.
제 14항에 있어서, 상기 돌연변이체는 서열번호 33 내지 서열번호 43으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 크링글 도메인 구조에 기반한 단백질 골격 돌연변이체.
제 14항에 있어서, 상기 돌연변이체는 서열번호 44 내지 서열번호 48로 구성 된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 가지는 크링글 도메인 구조에 기반한 단백질 골격 돌연변이체.
동일 또는 다른 표적분자에 결합하는 제 12항의 방법에 의하여 생성된 단백질 골격 돌연변이체의 단일체를 이용하여 동형다중체 (homo-oligomers) 또는 이형다중체 (hetero-oligomers)을 생성하는 방법.
두 개 이상의 다른 표적분자에 각각 특이적으로 결합하는 제 12항의 방법에 의하여 생성된 단백질 골격 단일체를 분리한 후, 링커를 이용하여 각각의 단일체들의 조합으로 다중체를 생성하여 다중 표적분자에 동시에 결합할 수 있는 다중체 제조방법.
동일 표적분자의 다른 부위 또는 두 개 이상의 서로 다른 표적분자에 결합하는 제 12항의 방법에 의하여 생성된 단일체의 결합 루프를 동일 또는 다른 단일체의 다른 루프부위에 옮겨서 다결합 단일체 (multivalent monomer) 또는 다중특이성 단일체 (multispecific monomer)을 생성 제조하는 방법.
제 15항 또는 제 16항의 단백질 골격 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는 암 치료 또는 예방용 조성물.
제 17항의 단백질 골격 돌연변이체를 유효성분으로 포함하는 TNFα에 의한 세포독성 억제용 조성물.