ES2939461T3 - Método para tratar o prevenir la lesión por isquemia-reperfusión - Google Patents

Abstract

La presente descripción se refiere a un método para prevenir o tratar la lesión por isquemia-reperfusión en un sujeto, comprendiendo el método administrar un compuesto que inhibe la señalización del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF). En algunos ejemplos, la lesión por isquemia-reperfusión se debe o está asociada con el trasplante de tejido u órgano. En algunos ejemplos, el compuesto es un anticuerpo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para tratar o prevenir la lesión por isquemia-reperfusión

CAMPO

La presente invención se refiere a compuestos para su uso en métodos para prevenir una lesión por isquemia-reperfusión en un sujeto antagonizando la señalización del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) y usos de los mismos, por ejemplo, en el trasplante de órganos.

ANTECEDENTES

La lesión por isquemia-reperfusión (IRI) es una afección patológica provocada por isquemia, es decir, una restricción o reducción del suministro sanguíneo a un tejido u órgano, por ejemplo, un órgano de un donante fallecido para trasplante, seguido de una reperfusión y reoxigenación posteriores. La isquemia provoca la privación de oxígeno y nutrientes a las células y la eliminación inadecuada de los desechos metabólicos, y puede llevar rápidamente a la necrosis y la inflamación. La reperfusión de un tejido u órgano después de un período de isquemia devuelve el suministro sanguíneo y el oxígeno; sin embargo, la propia reperfusión puede acentuar la oxidación y la inflamación provocadas por la isquemia inicial y provocar lesiones adicionales. La reoxigenación puede provocar daño oxidativo a las proteínas celulares, el ADN y la membrana plasmática. Dicho daño oxidativo puede, a su vez, provocar la liberación de radicales libres, lo que da como resultado un mayor daño celular. La lesión por reperfusión se caracteriza, entre otras cosas, por la generación de especies reactivas de oxígeno, activación del complemento, inflamación celular y daño celular endotelial.

En el trasplante de órganos, la lesión por isquemia-reperfusión puede definirse como IRI 'caliente' o IRI 'fría'. La IRI caliente se produce in situ durante la cirugía de trasplante de órganos o durante varias formas de shock o trauma. La IRI fría se produce durante la conservación ex vivo y habitualmente se combina con la IRI caliente durante la cirugía de trasplante de órganos.

Tanto el sistema inmunitario innato como el adaptativo tienen una función central en la patogénesis de la lesión por isquemia-reperfusión. En términos de inmunidad innata, las señales de peligro liberadas por las células moribundas activan los receptores tipo Toll que llevan a la activación y/o producción de factores celulares y solubles que regulan el reclutamiento de células inflamatorias y la producción de mediadores inflamatorios, por ejemplo, quimiocinas, citoquinas y radicales libres. Los neutrófilos se encuentran entre las principales células inflamatorias que responden después de la isquemia y la reperfusión. En el entorno inflamatorio, las células dendríticas captan y procesan los antígenos de las células moribundas, migran a los ganglios linfáticos y activan las células específicas de antígenos del sistema inmunitario adaptativo. Por tanto, la patogénesis de la lesión por isquemia-reperfusión es compleja y es probable que el daño tisular se produzca a través de varios mecanismos como la muerte celular, disfunción microvascular, reprogramación transcripcional, activación del complemento y los sistemas inmunitarios innato y adaptativo.

La lesión por isquemia-reperfusión es un evento frecuente en el trasplante, incluyendo el trasplante renal, y es un factor relevante para determinar el resultado del injerto tanto a corto como a largo plazo. En el trasplante de riñón, la IRI afecta a las células endoteliales y a las células epiteliales tubulares y puede provocar daño renal agudo y función retardada del injerto (DGF), lo que puede afectar a la supervivencia del injerto. La DGF es una de las complicaciones tempranas más frecuentes después de un trasplante de riñón de un donante fallecido o de un donante con criterio expandido y está provocada principalmente por la necrosis de las células epiteliales tubulares provocada por la IRI (Schroppel B, et al., Kidney Int. 2014).

Los compuestos que actualmente se están probando en ensayos clínicos para tratar la lesión por isquemiareperfusión incluyen eculizumab, que es un anticuerpo monoclonal humanizado contra el componente C5 de la cascada del complemento (Rother R, et al. Nat Biotechnol. 2007). El factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) también se ha investigado como agente terapéutico para el tratamiento de la lesión por reperfusión, consultar Nogueira et al., Cell Phys Biochem (2006) y Li et al., Nephrology (2008). Estos estudios han demostrado que el tratamiento con G-CSF tiene efectos protectores en la isquemia renal.

Sin embargo, las terapias eficaces para prevenir o tratar la lesión por isquemia-reperfusión han sido esquivas. Por lo tanto, a partir de lo anterior quedará claro para el experto en la técnica, que hay una necesidad en la técnica de estrategias y métodos para prevenir o tratar el daño provocado por la lesión por isquemia-reperfusión.

Salvadori et al., (2015) World Journal of Transplantation 5(2):52-67 analiza la lesión por isquemiareperfusión en el trasplante de riñón. La US 2013/259824 describe el tratamiento de atraque cerebral isquémico. La WO 2007/025166 describe dispositivos, composiciones y métodos para la protección y reparación de células y tejidos.

SUMARIO

Cualquier referencia a métodos de tratamiento en los párrafos subsiguientes de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacológicas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia (o diagnóstico).

Al producir la presente invención, los inventores procedieron en contra de las enseñanzas anteriores de que el G-CSF puede tener un papel protector en la lesión por isquemia-reperfusión y en su lugar estudiaron los efectos de inhibir la señalización de G-CSF en la lesión por isquemia-reperfusión. Los inventores descubrieron que administrando un compuesto que inhibe la señalización de G-CSF, se redujeron los efectos de la lesión por isquemia-reperfusión. Además, los inventores descubrieron que al inhibir la señalización de G-CSF podían prevenir o tratar la lesión por isquemia-reperfusión en un grado similar al de la inhibición de la activación del complemento a nivel de C5. Estos descubrimientos proporcionan la base para los métodos para prevenir o tratar la lesión por isquemia-reperfusión mediante la inhibición de la señalización de G-CSF.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención proporciona un compuesto que inhibe la señalización del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) para su uso en un método para prevenir la lesión por isquemia-reperfusión en un sujeto, en donde la lesión por isquemia-reperfusión se debe o está asociada con el trasplante de tejido u órganos o cirugía, y en donde el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF es una proteína que comprende una región variable de anticuerpo que se une específicamente a G-CSF o el receptor de G-CSF (G-CSFR) y neutraliza la señalización de G-CSF.

En algunos ejemplos, la lesión por isquemia y/o reperfusión se debe o está asociada con el trasplante de órganos, el almacenamiento de órganos en frío, la muerte cerebral, la aterosclerosis, la trombosis, la tromboembolia, la embolia lipídica, el trauma, el sangrado, una endoprótesis, cirugía, angioplastia, cirugía de derivación, isquemia total, infarto de miocardio, ataque cerebral, enfermedad vascular periférica, sepsis, un tumor o combinaciones de los mismos.

En algunos ejemplos, la lesión por isquemia-reperfusión es una lesión por isquemia-reperfusión caliente. En algunos ejemplos, la lesión por isquemia-reperfusión es lesión por isquemia-reperfusión fría.

En algunos ejemplos, se administra al sujeto el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF.

En un ejemplo, la lesión por isquemia-reperfusión se debe o está asociada con la cirugía. En un ejemplo, la lesión por isquemia-reperfusión se debe o está asociada con la cirugía de derivación de arteria coronaria, por ejemplo, una derivación doble (en el que se derivan dos arterias coronarias [por ejemplo, la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) y la arteria coronaria derecha (RCA)); una derivación triple (en la que se derivan tres vasos, por ejemplo, LAD, RCA y arteria circunfleja izquierda (LCX)); una derivación cuádruple (en la que se derivan cuatro vasos (por ejemplo, LAD, RCA, LCX y la primera arteria diagonal de la LAD)); o una derivación quíntuple (en la que se derivan cinco arterias).

En un ejemplo, la lesión por isquemia-reperfusión se debe o está asociada con el trasplante de órganos, por ejemplo, un trasplante de órganos sólidos. En un ejemplo, el trasplante de órganos es un trasplante de riñón. En un ejemplo, el trasplante de órganos es un trasplante de hígado. En un ejemplo, el trasplante de órganos es un trasplante de corazón. En un ejemplo, el trasplante de órganos es un trasplante de páncreas. En un ejemplo, el trasplante de órganos es un trasplante de pulmón. En un ejemplo, el trasplante de órganos es un trasplante de estómago. En un ejemplo, el trasplante de órganos es un trasplante de intestino. En un ejemplo, el trasplante de órganos es un trasplante de testículos.

En un ejemplo adicional más, el trasplante de órganos es un trasplante de piel, por ejemplo, un trasplante de piel de espesor completo.

En un ejemplo, la lesión por isquemia-reperfusión se debe o está asociada con un trasplante de tejido. En un ejemplo, el trasplante de tejido es un trasplante de vasos sanguíneos. En un ejemplo, el trasplante de tejido es un trasplante de piel, por ejemplo piel vascularizada. En un ejemplo, el trasplante de tejido es un trasplante de islote pancreático. En un ejemplo, el trasplante de tejido es un trasplante de córnea. En un ejemplo, el trasplante de tejido es un trasplante musculoesquelético.

Cuando la lesión por isquemia-reperfusión se debe o está asociada con un trasplante (por ejemplo, trasplante de órganos), el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF puede administrarse antes, durante y/o después del trasplante. En algunos ejemplos, se administra al sujeto el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF, en donde el sujeto es un receptor de trasplante de tejido u órgano. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a un donante de trasplante de tejido u órgano.

En algunos ejemplos, el donante del trasplante de tejido u órgano es un donante vivo. En algunos ejemplos, el donante del trasplante de tejido u órgano es un donante fallecido. En algunos ejemplos, el donante de trasplante de tejido u órgano es una donación después de muerte cerebral (DBD). En algunos ejemplos, el donante de trasplante de tejido u órgano es un donante después de muerte circulatoria (DCD). En algunos ejemplos, el donante de trasplante de tejido u órgano es un donante de criterio ampliado (ECD). En algunos ejemplos, el donante de trasplante de tejido u órgano es un donante de criterios estándar (SCD).

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a un órgano extraído ex vivo, antes del trasplante de órganos. Por ejemplo, el órgano extraído puede perfundirse o infundirse con una solución que comprende el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF antes del trasplante.

La presente invención también proporciona un compuesto que inhibe la señalización de G-CSF para su uso en un método para prevenir la lesión por isquemia-reperfusión en un sujeto, el método comprendiendo administrar el compuesto a un tejido u órgano extraído ex vivo y trasplantar el tejido u órgano extraído a un receptor de trasplante de órgano o tejido.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra al donante de trasplante de órganos y/o al receptor de trasplante de órganos y/o al órgano extraído. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra al donante de trasplante de órganos y al receptor de trasplante de órganos. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra al donante de trasplante de órganos y al órgano extraído. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra al receptor del trasplante de órganos y al órgano extraído.

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra antes de la reperfusión, por ejemplo, en el caso de un trasplante (por ejemplo, trasplante de órgano), el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a un receptor de trasplante de órgano antes de la reperfusión del órgano trasplantado (por ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra antes del trasplante o durante el trasplante pero antes de la reperfusión, por ejemplo, antes de que se liberen las pinzas que restringen el flujo de sangre).

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra antes de la isquemia. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra entre 0 días (por ejemplo, inmediatamente antes de la isquemia o la reperfusión) y 7 días antes de la isquemia o la reperfusión. Por ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra entre 0 días y 6 días o 5 días o 4 días antes de la reperfusión o isquemia. Por ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra entre 0 y 72 horas antes de la reperfusión o isquemia. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra entre 6 y 48 horas antes de la reperfusión o isquemia. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra entre 12 y 36 horas antes de la reperfusión o isquemia. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra 24 horas antes de la reperfusión o isquemia.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra por lo menos 1 hora antes de la reperfusión o isquemia (y hasta 7 días antes de la reperfusión o isquemia). En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra por lo menos 2 o por lo menos 4 o por lo menos 6 o por lo menos 8 o por lo menos 10 o por lo menos 12 horas o por lo menos 14 horas o por lo menos 16 horas o por lo menos 18 horas o por lo menos 20 horas o por lo menos 22 horas o por lo menos 24 horas antes de la reperfusión o isquemia. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra por lo menos 24 horas antes de la reperfusión o isquemia.

Cuando se analiza la cadencia de la administración de un compuesto en la presente, el análisis se referirá a las administraciones múltiples del compuesto. Por ejemplo, cuando se indica que un compuesto se administra entre 0 y 7 días antes de la isquemia o la reperfusión, la presente descripción abarca múltiples administraciones del compuesto (por ejemplo, 2 o 3 o 4 o 5, etc.) entre 0 días y 7 días antes isquemia o reperfusión.

Además, en el caso de un trasplante, el compuesto puede administrarse varias veces después del trasplante.

Cuando se analiza la cadencia de la administración de un compuesto en la presente, la invención también implica una administración individual del compuesto.

En algunos ejemplos, el método comprende administrar el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF al receptor del trasplante. Por ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra al receptor del trasplante antes del trasplante o en o cerca del momento del trasplante del tejido u órgano. En otro ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra al receptor del trasplante durante la cirugía de trasplante de órgano o tejido.

La presente invención también proporciona el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF para su uso en un método para prevenir la lesión por isquemia-perfusión en un sujeto, el método comprendiendo administrar el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF a un receptor del trasplante antes de trasplantar el tejido u órgano y luego trasplantar el órgano al receptor del trasplante.

En un ejemplo, el donante de trasplante de órganos tiene muerte cerebral. Por ejemplo, el donante de órganos está vivo y con soporte vital pero tiene muerte cerebral. Los donantes adicionales se describen en la presente y se consideran aplicables a este ejemplo de la invención.

En el caso de la administración a un donante de órganos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF puede administrarse antes de la extracción del órgano, por ejemplo, entre 0 y 72 horas antes de la extracción del órgano. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra entre 6 y 48 horas antes de la extracción del órgano. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra entre 12 y 36 horas antes de la extracción del órgano. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra aproximadamente 24 horas antes de la extracción del órgano.

En el caso de la administración a un donante con muerte cerebral, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF puede administrarse en un momento entre la muerte cerebral y la extracción del órgano. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF puede administrarse en el plazo de 48 horas después de que se haya declarado la muerte cerebral, por ejemplo, en el plazo de 24 horas, 12 horas o 6 horas después de que se haya declarado la muerte cerebral.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra como una dosis única.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una pluralidad de dosis. Por ejemplo, el compuesto se administra a un receptor de trasplante antes del trasplante o durante el trasplante y luego se administran una o más dosis adicionales al receptor después del trasplante. En otro ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a un donante de trasplante o a un tejido u órgano donado y luego se administran una o más dosis adicionales a un receptor de trasplante después del trasplante.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, como entre aproximadamente 0,05 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg, por ejemplo, entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg, por ejemplo, entre aproximadamente 1 mg/kg y aproximadamente 10 mg/kg. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 1 mg/kg. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de entre aproximadamente 0,4 mg/kg y aproximadamente 0,5 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 0,2 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 0,3 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 0,4 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 0,6 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 0,7 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 0,8 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 1 mg/kg. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de entre aproximadamente 2 mg/kg y aproximadamente 8 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de entre aproximadamente 4 mg/kg y aproximadamente 6 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 5 mg/kg.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad que provoca neutropenia. Por ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad que provoca neutropenia transitoria, por ejemplo, durante un período de menos de una semana o menos de 5 días o menos de 3 días o menos de 1 día.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad que no provoca neutropenia.

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir la inflamación. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir el daño oxidativo.

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para que tenga uno o más de los siguientes efectos:

(i) reducir o prevenir la infiltración de neutrófilos, por ejemplo, en un órgano trasplantado en el caso de un trasplante de órganos; y

(ii) reducir o prevenir la infiltración de macrófagos, por ejemplo, en un órgano trasplantado en el caso de un trasplante de órganos.

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir la infiltración de neutrófilos. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir la infiltración de macrófagos. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o inhibir la expresión del receptor beta de la interleucina 8 (IL-8RP). En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o inhibir la expresión de la proteína 1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1).

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para que tenga uno o más de los siguientes efectos:

(i) reducir o prevenir un aumento en los niveles de creatinina en suero o plasma; y

(ii) reducir o prevenir un aumento en los niveles de urea en suero o plasma.

Los niveles de creatinina en suero o plasma y los niveles de urea en suero o plasma son medidas de la función renal y son útiles para evaluar la función retrasada del injerto, por ejemplo, en el caso de un trasplante de riñón, como se describe en la presente.

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir un aumento en los niveles de creatinina en suero o plasma. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir un aumento en los niveles de urea en suero o plasma.

Los niveles aumentados de albúmina y/o sangre en la orina también pueden indicar insuficiencia renal o daño renal. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir un aumento en los niveles de albúmina en la orina. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir un aumento de los niveles de sangre en la orina del sujeto.

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o inhibir la expresión de uno o más de los siguientes, por ejemplo, por células del órgano trasplantado en el caso de un trasplante de órgano:

(i) molécula de lesión renal 1 (KIM-1);

(ii) lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL);

(iii) interleucina 1 beta (IL-1 p);

(iv) interleucina 6 (IL-6);

(v) factor de necrosis tumoral alfa (TNFa);

(vi) receptor 1 del componente 5a del complemento (C5AR1);

(vii) proteína inflamatoria de macrófagos 2-alfa (MIP2-alfa);

(viii) Molécula de Adhesión Intercelular 1 (ICAM-1);

(ix) E-selectina;

(x) ligando 1 de quimiocina con motivo C-X-C (CXCL1);

(xi) receptor beta de interleucina 8 (IL-8Rp); y

(xii) proteína 1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1).

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir la activación del complemento C5.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir el depósito de C5b-9, por ejemplo, en la superficie de las células del órgano trasplantado en el caso de un trasplante de órgano.

Los métodos para evaluar cada uno de los anteriores se conocen en la técnica y/o se describen en la presente. Además, un experto en la técnica apreciará que el término "reducir" se usa en la presente para referirse a una cantidad menor de cualquiera de los elementos enumerados anteriormente, en relación o con la cantidad en el sujeto antes de la administración del compuesto que inhibe la señalización de G-CSF, o en relación con la cantidad en un sujeto de control correspondiente.

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en combinación con otro compuesto. En algunos ejemplos, el otro compuesto es sulfuro de hidrógeno. En algunos ejemplos, el otro compuesto es un compuesto antiinflamatorio y/o inhibe o reduce específicamente la expresión o actividad de una o más de las moléculas enumeradas en (i)-(x) anteriores. En algunos ejemplos, el otro compuesto es un inmunosupresor, por ejemplo, ciclosporina. Los inmunosupresores adecuados se conocerán en la técnica e incluyen los descritos en James & Mannon, Curr Transplant Rep (2015). Alternativamente, o adicionalmente, el otro compuesto es un corticosteroide, como prednisona y/o prednisolona. Alternativamente, o adicionalmente, el otro compuesto es metotrexato. Alternativamente, o adicionalmente, el otro compuesto es ciclofosfamida. Alternativamente, o adicionalmente, el otro compuesto es micofenolato mofetilo. En algunos ejemplos, el otro compuesto es TR040303, como se describe en Le Lamer et al., J Transl Med (2014). En algunos ejemplos, el otro compuesto es superóxido dismutasa. En algunos ejemplos, el otro compuesto es metformina. En algunos ejemplos, el otro compuesto es un cannabinoide o un análogo sintético del mismo. En algunos ejemplos, el otro compuesto es uno que se usa comúnmente en la cirugía de trasplante.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en combinación con una célula. En algunos ejemplos, la célula es una célula madre, como una célula madre mesenquimal.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en combinación con una terapia génica.

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra simultáneamente con el otro compuesto. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra antes que el otro compuesto. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra después del otro compuesto.

En un ejemplo, tanto el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF como el otro compuesto se administran a un receptor de trasplante de órganos. Otros compuestos adecuados se han descrito anteriormente.

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a un donante de trasplante de órganos antes de la extracción de un órgano para trasplante y el otro compuesto se administra al receptor de trasplante de órganos, opcionalmente en combinación con el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF. Otros compuestos adecuados se han descrito anteriormente.

La invención implica un compuesto que inhibe la señalización de G-CSF que se une a G-CSF o al receptor de G-CSF (G-CSFR). En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se une a G-CSF. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se une al receptor de G-CSF (G-CSFR).

El compuesto que inhibe la señalización de G-CSF es una proteína.

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF es una proteína que comprende una región variable de anticuerpo que se une o se une específicamente a G-CSFR y neutraliza la señalización de G-CSF. La referencia en la presente a una proteína o anticuerpo que se "une a" G-CSFR proporciona un apoyo literal para una proteína o anticuerpo que "se une específicamente a" G-CSFR.

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF es una proteína que comprende una región variable de anticuerpo que se une o se une específicamente a G-CSF y neutraliza la señalización de G-CSF. La referencia en la presente a una proteína o anticuerpo que "se une a" G-CSF proporciona apoyo literal para una proteína o anticuerpo que "se une específicamente a" G-CSF.

El compuesto que inhibe la señalización de G-CSF es una proteína que comprende un Fv. En algunos ejemplos, la proteína se selecciona del grupo que consiste en:

(i) un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv);

(ii) un scFv dimérico (di-scFv); o

(iii) un diacuerpo;

(iv) un tricuerpo;

(v) un tetracuerpo;

(vi) un Fab;

(vii) un F(ab')² ;

(viii) un Fv;

(ix) uno de (i) a (viii) enlazado a una región constante de un anticuerpo, Fc o un dominio constante de cadena pesada (CH) 2 y/o CH3;

(x) uno de (i) a (viii) enlazado a albúmina, fragmentos funcionales o variantes del mismo o una proteína (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo) que se une a la albúmina; o

(xi) un anticuerpo.

En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo. En un ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo desnudo. Los anticuerpos ejemplares se describen en la WO2012171057.

En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que se une a hG-CSFR expresado en la superficie de una célula con una afinidad de por lo menos aproximadamente 5 nM. En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que se une a hG-CSFR expresado en la superficie de una célula con una afinidad de por lo menos aproximadamente 4 nM. En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que se une a hG-CSFR expresado en la superficie de una célula con una afinidad de por lo menos aproximadamente 3 nM. En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que se une a hG-CSFR expresado en la superficie de una célula con una afinidad de por lo menos aproximadamente 2 nM. En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que se une a hG-CSFR expresado en la superficie de una célula con una afinidad de por lo menos aproximadamente 1 nM.

En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que inhibe la proliferación inducida por G-CSF de una célula BaF3 que expresa hG-CSFR con una IC50 de por lo menos aproximadamente 5 nM. En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que inhibe la proliferación inducida por G-CSF de una célula BaF3 que expresa hG-CSFR con una IC50 de por lo menos aproximadamente 4 nM. En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que inhibe la proliferación inducida por G-CSF de una célula BaF3 que expresa hG-CSFR con una IC50 de por lo menos aproximadamente 3 nM. En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que inhibe la proliferación inducida por G-CSF de una célula BaF3 que expresa hG-CSFR con una IC50 de por lo menos aproximadamente 2 nM. En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que inhibe la proliferación inducida por G-CSF de una célula BaF3 que expresa hG-CSFR con una IC50 de por lo menos aproximadamente 1 nM. En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que inhibe la proliferación inducida por G-CSF de una célula BaF3 que expresa hG-CSFR con una IC50 de por lo menos aproximadamente 0,5 nM.

En un ejemplo, la proteína es quimérica, desinmunizada, humanizada, humana o primatizada. En un ejemplo, la proteína o el anticuerpo es humano.

En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada (VH) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 y una región variable de cadena ligera (VL) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5.

En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que comprende una VH que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 y una VL que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3.

En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que comprende una VH que comprende tres CDR de una VH que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 y una VL que comprende tres CDR de una VL que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5.

En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que comprende una VH que comprende tres CDR de una VH que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 y una VL que comprende tres CDR de una VL que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3.

En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que comprende:

(I) una VH que comprende:

(a) una CDR1 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 6;

(b) una CDR2 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 7; y

(c) una CDR3 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 8; y

(II) una VL que comprende:

(a) una CDR1 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 9;

(b) una CDR2 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 10; y

(c) una CDR3 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 11.

En un ejemplo, la proteína es un anticuerpo que comprende:

(i) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14 o 18 y una cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15; o

(ii) una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14 y una cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 18 y dos cadenas ligeras que comprenden una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 15.

CLAVE PARA EL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 - aminoácidos 25-335 de G-CSFR de Homo sapiens (hG-CSFR) con una etiqueta de polihistidina C-terminal

SEQ ID NO: 2 - V^h de C1.2

SEQ ID NO: 3 - Vl de C1.2

SEQ ID NO: 4 - Vh de C1.2G

SEQ ID NO: 5 - V^l de C1.2G

SEQ ID NO: 6 - HCDR1 de C1.2

SEQ ID NO: 7 - HCDR2 de C1.2

SEQ ID NO: 8 - HCDR3 de C1.2

SEQ ID NO: 9 - LCDR1 de C1.2

SEQ ID NO: 10 - LCDR2 de C1.2

SEQ ID NO: 11 - LCDR3 de C 1.2

SEQ ID NO: 12 - secuencia de consenso de HCDR3 de C1.2

SEQ ID NO: 13 - secuencia de consenso de LCDR3 de C1.2

SEQ ID NO: 14 - Cadena pesada de C1.2G con región constante de IgG4 estabilizada

SEQ ID NO: 15 - Cadena ligera de C1.2G con región constante kappa

SEQ ID NO: 16 - secuencia de h-G-CSFR ejemplar

SEQ ID NO: 17 - polipéptido que comprende dominios de Ig y CRH de G-CSFR de Macaca fascicularis (cynoG -CSFR) con una etiqueta de polihistidina C-terminal

SEQ ID NO: 18 - Cadena pesada de C1.2G con región constante de IgG4 estabilizada y que carece de lisina C -terminal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 es una representación gráfica de las concentraciones de creatinina en suero 24 horas después de la reperfusión en el modelo de lesión renal por isquemia-reperfusión caliente. El tratamiento de ratones con 100 gg del anticuerpo anti-G-CSFR VR81 redujo significativamente las concentraciones de creatinina en suero en comparación con el tratamiento de ratones con 100 gg de un anticuerpo de control de isotipo. ANOVA unidireccional (con corrección de Bonferroni), *p<0,05, ***p<0,005 (n = 8 ratones por grupo). Los resultados son representativos de dos experimentos independientes - ver también la Figura 7.

La Figura 2 es una representación gráfica de las concentraciones de urea en plasma 24 horas después de la reperfusión en el modelo de lesión renal por isquemia-reperfusión caliente. El tratamiento de ratones con 100 gg del anticuerpo anti-G-CSFR VR81 redujo significativamente las concentraciones de urea en plasma en comparación con el tratamiento de ratones con 100 gg de un anticuerpo de control de isotipo. Prueba T no pareada *p<0,05 (n = 8 ratones por grupo). Los resultados son representativos de dos experimentos independientes - ver también la Figura 8.

La Figura 3 es una representación gráfica del recuento de neutrófilos por campo de alta potencia (HPF) en tejido renal. El tratamiento de ratones con 100 gg del anticuerpo anti-G-CSFR VR81 redujo significativamente la infiltración renal de neutrófilos en el modelo de IRI renal caliente en comparación con la infiltración de neutrófilos observada en ratones tratados con 100 gg de un anticuerpo de control de isotipo como se evaluó 24 horas después de la reperfusión. ANOVA unidireccional (con corrección de Bonferroni), *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,005 (n = 5-6 ratones por grupo).

La Figura 4 es una representación gráfica del recuento de macrófagos por campo de alta potencia (HPF) en tejido renal. El tratamiento de ratones con 100 gg del anticuerpo anti-G-CSFR VR81 redujo significativamente la infiltración renal de macrófagos en el modelo de IRI renal caliente en comparación con la infiltración de macrófagos observada en ratones tratados con 100 gg de un anticuerpo de control de isotipo evaluado 24 horas después de la reperfusión. ANOVA unidireccional (con corrección de Bonferroni), *p<0,05, **p<0,01 (n = 5-6 ratones por grupo).

La Figura 5 es una representación gráfica de recuento de (A) neutrófilos y (B) macrófagos por campo de alta potencia (HPF) en tejido renal. El tratamiento de ratones con 500 gg del anticuerpo anti-G-CSFR VR81 redujo significativamente la infiltración renal de neutrófilos y macrófagos en el modelo de IRI renal caliente en comparación con la infiltración de neutrófilos observada en ratones tratados con 500 gg de un anticuerpo de control de isotipo evaluado 24 horas después de la reperfusión. ANOVA unidireccional (con corrección de Bonferroni), ****p<0,0001 (n = 5-6 ratones por grupo).

La Figura 6 es una representación gráfica de la lesión tubular renal en el modelo de IRI caliente según lo según se determinó por el grado de necrosis tubular observado en la corteza renal de los ratones tratados (simulado; 100 |jg del anticuerpo anti-G-CSFR VR81; 100 jg de un anticuerpo de control de isotipo). La necrosis se evaluó mediante un método semicuantitativo (Lu B et al. Nephrology 2008) usando microscopía de fluorescencia. Se calificó el grado de necrosis tubular y se usó un sistema de puntuación modificado (ver Tabla 3). ANOVA unidireccional Prueba de Kruskal-Wallis, prueba de comparación múltiple de Dunn, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,005 (n = 8 ratones por grupo distinto del simulado donde n = 3).

La Figura 7 es una representación gráfica de la expresión de ARNm de KIM-1, NGAL, IL-6, IL-8Rp/CXCR2, MCP-1/CCL2, CXCL1, MIP-2/CXCL2, ICAM-1 y C5aR en tejido renal en el modelo de IRI renal caliente evaluado por qRT-PCR. El tratamiento con VR81 a una dosificación de 500 jg/ratón redujo significativamente la expresión de (A) KIM-1, NGAL, IL-6, IL-8Rp/CXCR2, MCP-1/CCL2, CXCL1 y (B) MIP-2/CXCL2, ICAM-1 y C5aR en comparación con el tratamiento con el anticuerpo de control de isotipo. ANOVA unidireccional Prueba de Kruskal-Wallis, prueba de comparación múltiple de Dunn para VR81 frente a control de Ab *p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,005.

La Figura 8 es una representación gráfica del porcentaje de frecuencia de neutrófilos (CD11b+Gr1+) en el modelo de IRI renal caliente evaluado mediante citometría de flujo en (A) riñón y (B) sangre periférica de ratones tratados con 100 jg del anticuerpo anti-G-CSFR VR81 o 100 jg de un anticuerpo anti-C5 (BB5.1) en comparación con ratones tratados con 100 jg de un anticuerpo de control de isotipo y ratones simulados. Se observaron niveles significativamente más bajos de neutrófilos (CD11b+Gr1+) en los riñones de ratones simulados y ratones tratados con VR81 o BB5.1 en comparación con los niveles observados en ratones tratados con un anticuerpo de control de isotipo. Las poblaciones de neutrófilos en la sangre fueron similares en todos los grupos y no se vieron afectadas por los tratamientos. ANOVA unidireccional, prueba de Kruskal-Wallis, prueba de comparación múltiple de Dunn, *p<0,05, **p<0,01 (n = 7-8 ratones por grupo distinto del simulado donde n=4).

La Figura 9 es una representación gráfica de las concentraciones de creatinina en suero en el modelo de IRI renal caliente. El tratamiento con 100 jg del anticuerpo anti-G-CSFR VR81 o 100 jg del anticuerpo anti-C5 BB5.1 redujo significativamente las concentraciones de creatinina en comparación con el tratamiento de ratones con 100 jg de un anticuerpo de control de isotipo. Las reducciones observadas con el VR81 y con BB5.1 no fueron significativamente diferentes. ANOVA unidireccional prueba de Kruskal-Wallis, prueba de comparación múltiple de Dunn, *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,005 (n = 7-8 ratones por grupo).

La Figura 10 es una representación gráfica de las concentraciones de urea en plasma en el modelo IRI renal caliente. El tratamiento con 100 jg del anticuerpo anti-G-CSFR VR81 o 100 jg del anticuerpo anti-C5 BB5.1 redujo significativamente las concentraciones de urea en plasma en comparación con el tratamiento de ratones con 100 jg de un anticuerpo de control de isotipo. Las reducciones observadas con VR81 y con BB5.1 no fueron significativamente diferentes. ANOVA unidireccional prueba de Kruskal-Wallis, prueba de comparación múltiple de Dunn, *p<0,05, **p<0,01 (n = 7-8 ratones por grupo).

La Figura 11 es una representación gráfica de las concentraciones de urea en suero en el modelo IRI renal caliente. El tratamiento de ratones con 500 jg del anticuerpo anti-G-CSFR VR81 redujo significativamente las concentraciones de urea en suero en comparación con el tratamiento de ratones con 500 mg de un anticuerpo de control de isotipo. ANOVA unidireccional prueba de Kruskal-Wallis, prueba de comparación múltiple de Dunn *p<0,05, **p<0,01 (n = 6-8 ratones por grupo).

La Figura 12 es una representación gráfica de las concentraciones de creatinina en suero en el modelo de IRI renal caliente (media ± SEM). El tratamiento de ratones con 500 jg de anticuerpo anti-G-CSFR (VR81) redujo significativamente las concentraciones de creatinina en suero en comparación con el tratamiento de ratones con 500 jg de un anticuerpo de control de isotipo. ANOVA unidireccional prueba de Kruskal-Wallis, prueba de comparación múltiple de Dunn *p<0,05 (n = 6-8 ratones por grupo).

La Figura 13 es una representación gráfica de la frecuencia porcentual de neutrófilos (CD11b+Gr1+Ly6G+) en (A) sangre y (B) riñón en el modelo de IRI renal caliente. El tratamiento con 200 jg/ratón y 500 jg/ratón del anticuerpo anti-G-CSFR VR81 redujo significativamente la frecuencia de neutrófilos en el riñón en comparación con el tratamiento con 500 jg/ratón de un anticuerpo de control de isotipo. Estadísticas: ANOVA unidireccional (con corrección de Bonferroni), *p<0,05, **p<0,0l (n = 6-7 ratones por grupo).

La Figura 14 es una representación gráfica del depósito de C5a en plasma (A) y de C5b-9 en riñón (B). La Figura 15 es una representación gráfica de la frecuencia de neutrófilos (CD11b+Gr1+Ly6G+) en sangre y riñón en el modelo IRI renal caliente. El tratamiento con 500 jg/ratón del anticuerpo anti-G-CSFR VR81 1 h antes de la isquemia redujo significativamente la frecuencia de neutrófilos en el riñón en comparación con el tratamiento con un anticuerpo de control de isotipo. El tratamiento con 500 jg/ratón del anticuerpo de control BB5.1 no redujo significativamente la frecuencia de neutrófilos en el riñón en comparación con el tratamiento con un anticuerpo de control de isotipo. Estadísticas: ANOVA unidireccional prueba de Kruskal-Wallis, prueba de comparación múltiple de Dunn, *p<0,05, **p<0,01 (n = 5-8 ratones por grupo).

DESCRIPCIÓN DETALLADA

General

A lo largo de esta memoria descriptiva, a menos que se indique específicamente lo contrario o el contexto requiera lo contrario, la referencia a un solo paso, composición de la materia, grupo de pasos o grupo de composiciones de la materia se considerará que abarca uno y una pluralidad (es decir, uno o más) de esos pasos, composiciones de materia, grupos de pasos o grupos de composiciones de materia.

Los expertos en la técnica apreciarán que la presente divulgación es susceptible de variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Debe entenderse que la divulgación incluye todas esas variaciones y modificaciones. La divulgación también incluye todos los pasos, características, composiciones y compuestos a los que se hace referencia o se indica en esta memoria descriptiva, individual o colectivamente, y cualquiera y todas las combinaciones o dos cualquiera o más de dichos pasos o características.

La presente divulgación no debe limitarse en el alcance de los ejemplos específicos descritos en la presente, que únicamente se pretende que tengan propósitos de ejemplificación. Los productos, composiciones y métodos funcionalmente equivalentes están claramente dentro del alcance de la presente divulgación.

Cualquier ejemplo de la presente divulgación en la presente se considerará aplicable mutatis mutandis a cualquier otro ejemplo de la divulgación a menos que se indique específicamente lo contrario.

A menos que se defina específicamente lo contrario, se considerará que todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un experto en la técnica (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, inmunología, inmunohistoquímica, química de proteínas y bioquímica).

A menos que se indique lo contrario, la proteína recombinante, el cultivo celular y las técnicas inmunológicas utilizadas en la presente divulgación son procedimientos estándar, bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales técnicas se describen y explican a lo largo de la bibliografía en fuentes como, J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D.M. Glover y B.D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, Volúmenes 1-4, IRL Press (1995 and 1996), y F.M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta ahora), Ed Harlow y David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), y J.E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta ahora).

La descripción y definiciones de regiones variables y partes de las mismas, inmunoglobulinas, anticuerpos y fragmentos de los mismos en la presente pueden aclararse adicionalmente mediante el análisis en Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991, Bork et al., J Mol. Biol. 242, 309-320, 1994, Chothia y Lesk J. Mol Biol. 196: 901 -917, 1987, Chothia et al. Nature 342, 877-883, 1989 y/o Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273, 927-948, 1997.

Se entenderá que el término "y/o", por ejemplo, "X y/o Y" significa "X e Y" o "X o Y" y se considerará que proporciona apoyo explícito para ambos significados o para cualquier significado.

A lo largo de esta memoria descriptiva, se entenderá que la palabra "comprender", o variaciones como "comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos indicados, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos.

Como se usa en la presente, se interpretará que el término "derivado de" indica que un número entero especificado puede obtenerse de una fuente particular, aunque no necesariamente directamente de esa fuente. Definiciones seleccionadas

Un "compuesto", como se contempla en la presente divulgación, puede tomar cualquiera de una variedad de formas que incluyen compuestos naturales, compuestos químicos de molécula pequeña o compuestos biológicos o macromoléculas. Los compuestos ejemplares incluyen un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo, un ácido nucleico, un polipéptido, un péptido y una molécula pequeña.

La referencia en la presente al "factor estimulante de colonias de granulocitos" (G-CSF) incluye formas nativas de G-CSF, formas mutantes del mismo, por ejemplo, filgrastim y formas pegiladas de G-CSF o filgrastim.

Este término también abarca formas mutantes de G-CSF que retienen la actividad para unirse a G-CSFR (por ejemplo, G-CSFR humano) e inducir la señalización.

El G-CSF es un importante regulador de la producción de granulocitos. El G-CSF es producido por células del estroma de la médula ósea, células endoteliales, macrófagos y fibroblastos, y la producción es inducida por estímulos inflamatorios. El G-CSF actúa a través del receptor de G-CSF (G-CSFR), que se expresa en progenitores mieloides tempranos, neutrófilos maduros, monocitos/macrófagos, linfocitos T y B y células endoteliales.

Únicamente con propósitos de nomenclatura y no de limitación, una secuencia ejemplar de un G-CSFR humano se expone en la Secuencia de referencia de NCBI: NP_000751.1 (y se expone en la SEQ ID NO: 16). La secuencia de G-CSFR de otras especies puede determinarse usando secuencias proporcionadas en la presente y/o en bases de datos disponibles públicamente y/o determinarse usando técnicas estándar (por ejemplo, como se describe en Ausubel et al., (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta ahora) o Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). La referencia al G-CSFR humano puede abreviarse como hG-CSFR y la referencia al G-CSFR de mono cynomolgus puede abreviarse como cynoG-CSFR. La referencia a G-CSFR soluble se refiere a polipéptidos que comprenden la región de unión al ligando de G-CSFR. Los dominios de Ig y CRH del G-CSFR están implicados en la unión del ligando y la dimerización del receptor (Fayton et al., J. Biol Chem., 272: 29735-29741, 1997 y Fukunaga et al, EMBO J. 10: 2855-2865, 1991). Las formas solubles de G-CSFR que comprenden estas porciones del receptor se han usado en varios estudios del receptor y la mutación de las cisteínas libres en las posiciones 78, 163 y 228 del receptor ayuda en la expresión y el aislamiento del polipéptido del receptor soluble (Mine et al., Biochem., 43: 2458-24642004) sin afectar la unión del ligando.

Como se usa en la presente, el término "lesión por isquemia-reperfusión" se refiere al daño al tejido u órgano provocado cuando el suministro de sangre regresa al tejido u órgano después de un período de isquemia o falta de oxígeno (anoxia o hipoxia). La ausencia de oxígeno y nutrientes de la sangre durante el período isquémico crea una condición en la que la restauración de la circulación da como resultado inflamación y daño oxidativo a través de la inducción de estrés oxidativo en lugar de la restauración de la función normal. La lesión por isquemiareperfusión (IRI) también se conoce como "lesión por reperfusión", "trauma por reperfusión" y "lesión por reoxigenación". Como se usa en la presente, "lesión por isquemia-reperfusión" incluye tanto lesión por isquemiareperfusión caliente como lesión por isquemia-reperfusión fría.

Como se usa en la presente, el término "isquemia" (también conocido como "isquemia") se refiere a una restricción en el suministro de sangre a los tejidos, lo que provoca una escasez del oxígeno y la glucosa necesarios para el metabolismo celular, además de provocar una acumulación y una eliminación reducida de desechos metabólicos.

El término "reperfusión", como se usa en la presente, se refiere a la restauración del flujo de sangre o de oxígeno al tejido.

Como se usa en la presente, el término "afección" se refiere a una alteración o interferencia con la función normal, y no debe limitarse a ninguna afección específica, e incluirá enfermedades o trastornos.

Como se usa en la presente, los términos "que previene", "prevenir" o "prevención" incluyen administrar un compuesto de la invención para detener o dificultar de este modo, por lo menos parcialmente, el desarrollo de por lo menos un síntoma de una afección. Este término también abarca el tratamiento de un sujeto en remisión para prevenir o dificultar la recaída.

Como se usa en la presente, los términos "que trata", "tratar" o "tratamiento" incluyen administrar un compuesto descrito en la presente para reducir o eliminar de este modo por lo menos un síntoma de una enfermedad o afección especificada.

Como se usa en la presente, el término "neutropenia" se usa para referirse a un recuento absoluto de neutrófilos (ANC) por debajo del límite inferior del intervalo normal, por ejemplo, un ANC de menos de 2000 células/pl de sangre, o menos de 1500 células/pl de sangre, o menos de 1000 células/pl de sangre, por ejemplo menos de 500 células/pl de sangre (ver Sibille et al. 2010 Br J Clin Pharmacol 70(5): 736-748). En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad que no provoca neutropenia grave. Como se usa en la presente, el término "neutropenia grave" se usa para referirse a un recuento absoluto de neutrófilos (ANC) de menos de 1000 células/pl de sangre.

Como se usa en la presente, el término "sujeto" significará cualquier animal, incluyendo humanos, por ejemplo, un mamífero. Los sujetos ejemplares incluyen, pero no se limitan a, humanos y primates no humanos. Por ejemplo, el sujeto es un humano.

Será evidente para los expertos a partir del párrafo anterior que un donante (por ejemplo, un donante de órganos) o un receptor (por ejemplo, un receptor de órganos) incluye mamíferos, por ejemplo, humanos.

Se considerará que el término "proteína" incluye una única cadena polipeptídica, es decir, una serie de aminoácidos contiguos enlazados por enlaces peptídicos o una serie de cadenas polipeptídicas enlazadas entre sí covalentemente o no covalentemente (es decir, un complejo polipeptídico). Por ejemplo, la serie de cadenas polipeptídicas puede enlazarse covalentemente usando un enlace químico o disulfuro adecuado. Los ejemplos de enlaces no covalentes incluyen enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, fuerzas de Van der Waals e interacciones hidrofóbicas.

Se entenderá del párrafo anterior el término "polipéptido" o "cadena polipeptídica" como una serie de aminoácidos contiguos enlazados por enlaces peptídicos.

El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado" es una proteína o polipéptido que en virtud de su origen o fuente de derivación no está asociado con componentes asociados de manera natural que lo acompañan en su estado nativo; está sustancialmente libre de otras proteínas de la misma fuente. Una proteína puede liberarse sustancialmente de componentes asociados de manera natural o puede purificarse sustancialmente mediante aislamiento, usando técnicas de purificación de proteínas conocidas en la técnica. Por "sustancialmente purificada" se entiende que la proteína está sustancialmente libre de agentes contaminantes, por ejemplo, por lo menos aproximadamente un 70% o 75% o 80% o 85% o 90% o 95% o 96% o 97% o 98% o 99% libre de agentes contaminantes.

Se entenderá que el térmico "recombinante" significa el producto de la recombinación genética artificial. Por consiguiente, en el contexto de una proteína recombinante que comprende un dominio de unión a antígeno de anticuerpo, este término no abarca un anticuerpo que se produce de manera natural en el cuerpo de un sujeto que es el producto de la recombinación natural que se produce durante la maduración de las células B. Sin embargo, si se aísla dicho anticuerpo, debe considerarse una proteína aislada que comprende un dominio de unión al antígeno del anticuerpo. De manera similar, si el ácido nucleico que codifica la proteína se aísla y se expresa usando medios recombinantes, la proteína resultante es una proteína recombinante que comprende un dominio de unión a antígeno del anticuerpo. Una proteína recombinante también abarca una proteína expresada por medios recombinantes artificiales cuando está dentro de una célula, tejido o sujeto, por ejemplo, en el que se expresa.

Como se usa en la presente, el término "sitio de unión a antígeno" se entenderá como una estructura formada por una proteína que es capaz de unirse o unirse específicamente a un antígeno. El sitio de unión al antígeno no necesita ser una serie de aminoácidos contiguos, o incluso aminoácidos en una única cadena polipeptídica. Por ejemplo, en un Fv producido a partir de dos cadenas polipeptídicas diferentes, el sitio de unión al antígeno está compuesto por una serie de aminoácidos de una Vl y una Vh que interactúan con el antígeno y que generalmente, aunque no siempre, están en una o más de las CDR en cada región variable. En algunos ejemplos, un sitio de unión a antígeno es una V^h o un V^l o un Fv.

El experto en la técnica sabrá que generalmente se considera que un "anticuerpo" es una proteína que comprende una región variable compuesta por una pluralidad de cadenas polipeptídicas, por ejemplo, un polipéptido que comprende una Vl y un polipéptido que comprende una Vh. Un anticuerpo también comprende generalmente dominios constantes, algunos de los cuales pueden organizarse en una región constante, que incluye un fragmento constante o un fragmento cristalizable (Fc), en el caso de una cadena pesada. Una V^h y una V^l interactúan para formar un Fv que comprende una región de unión a antígeno que es capaz de unirse específicamente a uno o unos pocos antígenos estrechamente relacionados. Generalmente, una cadena ligera de mamíferos es una cadena ligera ^k o una cadena ligera ^y y una cadena pesada de mamíferos es a, 5, £, ^y o p. Los anticuerpos pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG¹, IgG², IgG3, IgG4, IgA¹ e IgA²) o subclase. El término "anticuerpo" también abarca anticuerpos humanizados, anticuerpos primatizados, anticuerpos humanos y anticuerpos quiméricos.

Los términos "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" o "anticuerpo completo" se usan indistintamente para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, en oposición a un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. Específicamente, los anticuerpos completos incluyen aquellos con cadenas pesadas y ligeras que incluyen una región Fc. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia de tipo salvaje (por ejemplo, dominios constantes de secuencia de tipo salvaje humanos) o variantes de secuencia de aminoácidos de los mismos.

Como se usa en la presente, "región variable" se refiere a las partes de las cadenas ligeras y/o pesadas de un anticuerpo como se define en la presente que son capaces de unirse específicamente a un antígeno e incluyen las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad, es decir, CDR1, CDR2, y CDR3, y las regiones marco (FR). Las regiones variables ejemplares comprenden tres o cuatro FR (por ejemplo FR1, FR2, FR3 y opcionalmente FR4) junto con tres CDR. En el caso de una proteína derivada de un IgNAR, la proteína puede carecer de la CDR2. V^h se refiere a la región variable de la cadena pesada. V^l se refiere a la región variable de la cadena ligera.

Como se usa en la presente, el término "regiones determinantes de la complementariedad" (sin. CDR; es decir CDR1, CDR2 y CDR3) se refiere a residuos de aminoácidos de una región variable de anticuerpo la presencia de los cuales es necesaria para la unión al antígeno. Cada región variable tiene típicamente tres regiones CDR identificadas como CDR1, CDR2 y CDR3. Las posiciones de aminoácidos asignadas a las CDR y las FR pueden definirse de acuerdo con Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 y 1991 u otros sistemas de numeración en el desempeño de esta invención, por ejemplo, el sistema de numeración canónico de Chothia y Lesk J. Mol Biol. 196: 901-917, 1987; Chothia et al. Nature 342, 877­ 883, 1989; y/o Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273: 927-948, 1997; el sistema de numeración IMGT de Lefranc et al., Devel. And Compar. Immunol., 27: 55-77, 2003; o el sistema de numeración AHO de Honnegher y Plükthun J. Mol. Biol., 309: 657-670, 2001. Por ejemplo, de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, las regiones marco (FR) de Vh y las CDR están colocadas de la siguiente manera: residuos 1-30 (FR1), 31-35 (CDR1), 36-49 (FR2), 50-65 (CDR2), 66-94 (FR3), 95-102 (CDR3) y 103-113 (FR4). De acuerdo con el sistema de numeración de Kabat, las FR de Vl y las CDR están colocadas de la siguiente manera: residuos 1-23 (FR1), 24-34 (CDR1), 35-49 (FR2), 50-56 (CDR2), 57-88 (FR3), 89-97 (CDR3) y 98-107 (FR4). La presente invención no se limita a las fR y las CDR como se han definido por el sistema de numeración de Kabat, sino que incluye todos los sistemas de numeración, incluyendo los analizados anteriormente. En un ejemplo, la referencia en la presente a una CDR (o una FR) es con respecto a aquellas regiones de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat.

Las "regiones marco" (FR) son aquellos residuos de la región variable distintos de los residuos de CDR.

Como se usa en la presente, el término "Fv" significará cualquier proteína, ya esté compuesta por múltiples polipéptidos o por un único polipéptido, en la que una Vl y una Vh se asocian y forman un complejo que tiene un sitio de unión al antígeno, es decir, capaz de unirse específicamente a un antígeno. La Vh y la Vl que forman el sitio de unión al antígeno pueden estar en una única cadena polipeptídica o en diferentes cadenas polipeptídicas. Además, un Fv de la invención (así como cualquier proteína de la invención) puede tener múltiples sitios de unión a antígeno que pueden o no unirse al mismo antígeno. Se entenderá que este término abarca fragmentos directamente derivados de un anticuerpo así como proteínas correspondientes a dicho fragmento producidas usando medios recombinantes. En algunos ejemplos, la Vh no está enlazada a un dominio constante de cadena pesada (Ch) 1 y/o la V^l no está enlazada a un dominio constante de cadena ligera (C^l). Los polipéptidos o proteínas ejemplares que contienen Fv incluyen un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab'), un scFv, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo o un complejo de orden superior, o cualquiera de los anteriores enlazados a una región constante o dominio del mismo, por ejemplo, un dominio Ch2 o Ch3, por ejemplo, un minicuerpo. Un "fragmento Fab" consiste en un fragmento de unión a antígeno monovalente de una inmunoglobulina, y puede producirse mediante la digestión de un anticuerpo completo con la enzima papaína, para proporcionar un fragmento que consiste en una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada o puede producirse usando medios recombinantes. Puede obtenerse un "fragmento Fab'" de un anticuerpo tratando un anticuerpo completo con pepsina, seguido de reducción, para proporcionar una molécula que consiste en una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada que comprende una V^h y un único dominio constante. De esta manera se obtienen dos fragmentos Fab' por anticuerpo tratado. También puede producirse un fragmento Fab' por medios recombinantes. Un "fragmento F(ab')2" de un anticuerpo consiste en un dímero de dos fragmentos Fab' mantenidos juntos por dos enlaces disulfuro, y se obtiene tratando una molécula de anticuerpo completa con la enzima pepsina, sin reducción posterior. Un fragmento "Fab'²" es un fragmento recombinante que comprende dos fragmentos Fab enlazados usando, por ejemplo, una cremallera de leucina o un dominio CH³. Un "Fv de cadena sencilla" o "scFv" es una molécula recombinante que contiene el fragmento de la región variable (Fv) de un anticuerpo en el que la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada están enlazadas covalentemente por un conector polipeptídico flexible adecuado.

Como se usa en la presente, el término "se une" en referencia a la interacción de un compuesto o un sitio de unión a antígeno del mismo con un antígeno significa que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítopo) en el antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura de proteína específica en lugar de a las proteínas en general. Si un anticuerpo se une al epítopo "A", la presencia de una molécula que contiene el epítopo "A" (o "A" libre, no marcado), en una reacción que contiene "A" marcado y la proteína, reducirá la cantidad de "A marcado" unido al anticuerpo.

Como se usa en la presente, el término "se une específicamente" significará que un compuesto de la invención reacciona o se asocia con más frecuencia, más rápidamente, con mayor duración y/o con mayor afinidad con un antígeno particular o célula que expresa el mismo que lo que lo hace con antígenos o células alternativos. Por ejemplo, un compuesto se une a G-CSFR (por ejemplo, hG-CSFR) con una afinidad materialmente mayor (por ejemplo, 20 o 40 veces o 60 veces o de 80 a 100 veces o de 150 a 200 veces) que lo que lo hace a otros receptores de citoquinas o a antígenos comúnmente reconocidos por anticuerpos naturales polirreactivos (es decir, por anticuerpos de origen natural que se sabe que se unen a una variedad de antígenos que se encuentran de manera natural en humanos). En general, pero no necesariamente, la referencia a la unión significa unión específica, y se entenderá que cada término proporciona apoyo explícito al otro término.

Puede considerarse que una proteína o un anticuerpo se "une preferencialmente" a un polipéptido si se une a ese polipéptido con una constante de disociación (Kd) que es menor que la Kd de la proteína o del anticuerpo para otro polipéptido. En un ejemplo, se considera que una proteína o anticuerpo se une preferentemente a un polipéptido si se une al polipéptido con una afinidad (es decir, Kd) que es por lo menos aproximadamente 20 veces o 40 veces o 60 veces o 80 veces o 100 veces o 120 veces o 140 veces o 160 veces más que la Kd de la proteína o el anticuerpo para otro polipéptido.

Con propósitos de aclaración y como será evidente para el experto en la técnica en base a la materia ejemplificada en la presente, la referencia a "afinidad" en esta memoria descriptiva es una referencia a la Kd de una proteína o anticuerpo.

Para propósitos de aclaración y como será evidente para el experto en la técnica en base a la descripción de la presente, se entenderá que la referencia a una "afinidad de por lo menos aproximadamente" significa que la afinidad (o K^d) es igual al valor mencionado o más alta (es decir, el valor indicado como afinidad es menor), es decir, una afinidad de 2 nM es mayor que una afinidad de 3 nM. Expresado de otra manera, este término podría ser "una afinidad de X o menos", donde X es un valor enumerado en la presente.

Se entenderá que una "IC⁵⁰ de por lo menos aproximadamente" significa que la IC⁵⁰ es igual al valor enumerado o mayor (es decir, el valor enumerado como la IC⁵⁰ es menor), es decir, una IC⁵⁰ de 2 nM es mayor que una IC⁵⁰ de 3 nM. Expresado de otra manera, este término podría ser "una IC⁵⁰ de X o menos", en donde X es un valor enumerado en la presente.

Como se usa en la presente, el término "epítopo" (sinónimo "determinante antigénico") debe entenderse como una región de hG-CSFR a la que se une una proteína que comprende un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. Este término no se limita necesariamente a los residuos o estructuras específicos con los que hace contacto la proteína. Por ejemplo, este término incluye la región que abarca los aminoácidos con los que entra en contacto la proteína y/o 5-10 o 2-5 o 1-3 aminoácidos fuera de esta región. En algunos ejemplos, el epítopo comprende una serie de aminoácidos discontinuos que se colocan cerca unos de los otros cuando se pliega el hG-CSFR, es decir, un "epítopo conformacional". Por ejemplo, un epítopo conformacional comprende aminoácidos en una o más o dos o más o todas las regiones correspondientes a 111-115, 170-176, 218-234 y/o 286-300 de la SEQ ID NO: 1. El experto en la técnica también sabrá que el término "epítopo" no se limita a péptidos o polipéptidos. Por ejemplo, el término "epítopo" incluye agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas como cadenas laterales de azúcar, cadenas laterales de fosforilo o cadenas laterales de sulfonilo y, en ciertos ejemplos, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas.

Se entenderá que el término "inhibe competitivamente" significa que una proteína de la invención (o un sitio de unión a antígeno de la misma) reduce o previene la unión de un anticuerpo o proteína enumerado a G-CSFR, por ejemplo, a hG-CSFR. Esto puede deberse a la proteína (o al sitio de unión al antígeno) y al anticuerpo que se une al mismo epítopo o a un epítopo superpuesto. Será evidente a partir de lo anterior que no es necesario que la proteína inhiba completamente la unión del anticuerpo, sino que solo es necesario que reduzca la unión en una cantidad estadísticamente significativa, por ejemplo, en por lo menos aproximadamente un 10% o un 20% o un 30% o un 40% o un 50% o un 60% o un 70% o un 80% o un 90% o un 95%. Preferiblemente, la proteína reduce la unión del anticuerpo en por lo menos un 30%, más preferiblemente en por lo menos un 50%, más preferiblemente en por lo menos un 70%, aún más preferiblemente en por lo menos un 75%, incluso más preferiblemente en por lo menos aproximadamente un 80% o un 85% e incluso más preferiblemente, por lo menos aproximadamente un 90%. Los métodos para determinar la inhibición competitiva de la unión se conocen en la técnica y/o se describen en la presente. Por ejemplo, el anticuerpo se expone al G-CSFR en presencia o ausencia de la proteína. Si se une menos anticuerpo en presencia de la proteína que en ausencia de la proteína, se considera que la proteína inhibe competitivamente la unión del anticuerpo. En un ejemplo, la inhibición competitiva no se debe al impedimento estérico.

"Superposición" en el contexto de dos epítopos se entenderá que significa que dos epítopos comparten una cantidad suficiente de residuos de aminoácidos para permitir que una proteína (o el sitio de unión al antígeno de la misma) que se une a un epítopo inhiba competitivamente la unión de una proteína (o sitio de unión al antígeno) que se une al otro epítopo. Por ejemplo, los epítopos "superpuestos" comparten por lo menos 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 o 8 o 9 o 20 aminoácidos.

Como se usa en la presente, el término "neutralizar" se entenderá que significa que un compuesto es capaz de bloquear, reducir o prevenir la señalización mediada por G-CSF en una célula a través de G-CSFR. Los métodos para determinar la neutralización se conocen en la técnica y/o se describen en la presente.

Prevención o tratamiento de la lesión por isquemia-reperfusión

La presente invención proporciona un compuesto que inhibe la señalización del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) para su uso en un método para prevenir o tratar la lesión por isquemia-reperfusión en un sujeto, en donde la lesión por isquemia-reperfusión es debe o está asociada con el trasplante de tejido u órganos o cirugía, y en donde el compuesto que inhibe la señalización del G-CSF es una proteína que comprende una región variable del anticuerpo que se une específicamente a G-CSF o el receptor de G-CSF (G-CSFR) y neutraliza la señalización de G-CSF.

Una lesión por isquemia-reperfusión puede estar provocada por un evento natural (por ejemplo, restauración del flujo sanguíneo después de un infarto de miocardio o un ataque cerebral), un traumatismo, un tumor o por uno o más procedimientos quirúrgicos u otras intervenciones terapéuticas que restauran el flujo sanguíneo o el oxígeno a un tejido u órgano que ha estado sometido a un suministro reducido de sangre u oxígeno.

En un ejemplo, la lesión por isquemia-reperfusión está provocada por un procedimiento quirúrgico. Tales procedimientos quirúrgicos incluyen, por ejemplo, derivación de arteria coronaria, cirugía de injerto, angioplastia coronaria, cirugía de trasplante de órganos y similares (por ejemplo, cirugía de derivación cardiopulmonar).

En algunos ejemplos, la lesión por isquemia y/o reperfusión se debe o está asociada con el trasplante de órganos, el almacenamiento de órganos en frío, la muerte cerebral, la aterosclerosis, la trombosis, la tromboembolia, la embolia lipídica, trauma, sangrado, una endoprótesis, cirugía, angioplastia, cirugía de derivación, isquemia total, infarto de miocardio, ataque cerebral, enfermedad vascular periférica, cirugía, sepsis o combinaciones de los mismos.

En algunos ejemplos, la lesión por isquemia-reperfusión se debe o está asociada con el trasplante de órganos. En algunos ejemplos, el órgano es un órgano sólido. En algunos ejemplos, el trasplante de órganos es un trasplante de riñón. En algunos ejemplos, el trasplante de órganos es un trasplante de hígado. En algunos ejemplos, el trasplante de órganos es un trasplante de corazón. En algunos ejemplos, el trasplante de órganos es un trasplante de páncreas. En un ejemplo, el trasplante de órganos es un trasplante de pulmón. En un ejemplo, el trasplante de órganos es un trasplante de estómago. En un ejemplo, el trasplante de órganos es un trasplante de intestino. En un ejemplo, el trasplante de órganos es un trasplante de testículos.

En un ejemplo, la lesión por isquemia-reperfusión se debe o está asociada con un trasplante de tejido. En un ejemplo, el trasplante de tejido es un trasplante de vasos sanguíneos. En un ejemplo, el trasplante de tejido es un trasplante de piel, por ejemplo piel vascularizada. En un ejemplo, el trasplante de tejido es un trasplante de islote pancreático.

Los efectos de la lesión por isquemia-reperfusión incluyen disfunción orgánica, infarto, inflamación, daño oxidativo, daño potencial de la membrana mitocondrial, apoptosis, arritmia relacionada con la reperfusión, aturdimiento cardíaco, lipotoxicidad cardíaca, formación de cicatrices derivadas de isquemia y combinaciones de los mismos. Para la lesión por isquemia-reperfusión debida o asociada con el trasplante de riñón, los efectos también incluyen lesión renal aguda y función retardada del injerto (DGF).

En algunos ejemplos, el compuesto para el uso de la presente invención previene o reduce la probabilidad de lesión renal aguda después del trasplante. Por ejemplo, el método de la presente invención previene o reduce el riesgo de uno o más de los siguientes:

un aumento en los niveles de creatinina en plasma de por lo menos >0,3 mg por dl (26,52 pmol por L) o > 1,5 a dos veces desde el valor de referencia;

menos de aproximadamente 0,5 ml de orina por kg por hora durante por lo menos seis horas; y/o

requirió tratamiento de reemplazo renal.

En algunos ejemplos, el compuesto para el uso de la presente invención previene o reduce la probabilidad de función retrasada del injerto después del trasplante, por ejemplo, trasplante de riñón. Como sabrán los expertos, la función retrasada del injerto está asociada con malos resultados del injerto a largo plazo, rechazo crónico del injerto y/o supervivencia del órgano. Por ejemplo, el método de la presente invención previene o reduce el riesgo de uno o más de los siguientes:

La necesidad de uno o más tratamientos de hemodiálisis en el plazo de los 7 días posteriores al trasplante antes del inicio de la función del injerto;

Relación de reducción de creatinina entre el Día 0 y el Día 7 de menos del 70 por ciento.

En algunos ejemplos, el compuesto para el uso de la presente invención previene o reduce la probabilidad de uno o más de los siguientes:

Falta de función primaria del injerto: una condición en la que el riñón nunca funciona adecuadamente después del trasplante y el paciente continúa necesitando diálisis a pesar del trasplante; y/o

Función lenta del injerto: definida como creatinina en suero mayor de 3 miligramos (mg) por decilitro y sin necesidad de diálisis en el día 5 después del trasplante.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir la inflamación, por ejemplo, en un órgano trasplantado. Como se usa en la presente, el término "inflamación" o "respuesta inflamatoria" se refiere a un conjunto de cambios que se producen en un tejido que experimenta inflamación. En particular, la inflamación se refiere a la respuesta biológica a estímulos dañinos, incluyendo patógenos, células dañadas o irritantes. Los métodos para determinar la inflamación son conocidos en la técnica e incluyen, sin limitación, la medida de la tasa de sedimentación de eritrocitos (ESR), en donde una ESR más alta es indicativa de inflamación, la medida de la proteína C reactiva (CRP), en donde un nivel más alto de CRP es indicativo de inflamación y recuento de leucocitos (aumento en la inflamación).

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir el daño oxidativo, por ejemplo, en un órgano trasplantado. Como se usa en la presente, el término "daño oxidativo" se refiere al daño biomolecular que pueden provocar las especies reactivas durante la restauración del oxígeno. El daño oxidativo puede implicar la peroxidación de lípidos, el daño oxidativo del ADN y el daño oxidativo de las proteínas. Los métodos para determinar la peroxidación de lípidos incluyen, sin limitación, la determinación de MDA (malondialdehído)-TBA (ácido tiobarbitúrico) por HPLC y la cuantificación de isoprostanos (que son productos finales específicos de la peroxidación de ácidos grasos poliinsaturados) por espectrometría de masas. Los métodos para determinar el daño oxidativo del ADN incluyen, sin limitación, la medida de 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (80HdG). Los métodos para determinar el daño oxidativo de las proteínas incluyen, sin limitación, la cuantificación de productos de oxidación de aminoácidos individuales, incluyendo las quinureninas (del triptófano), bitirosina (que parece ser metabólicamente estable y puede detectarse en la orina), hidróxidos de valina e leucina, L-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), orto-tirosina, 2-oxo-histidina, glutamato semialdehído y semialdehído adípico, así como el ensayo de carbonilo (que implica la medición de grupos carbonilo de proteínas). El potencial de membrana mitocondrial (A^q) se refiere al potencial de membrana en forma de gradiente de protones a través de la membrana interna mitocondrial. Los métodos para evaluar el daño potencial de la membrana mitocondrial son conocidos por el experto en la técnica e incluyen el uso de sondas fluorescentes para monitorizar el potencial de la membrana, incluyendo el colorante JC1 (Cell Technology) y la medida de la fluorescencia general en longitudes de onda de excitación y emisión que permiten la cuantificación de verde (485 nm y 535 nm) y fluorescencia roja (550 nm y 600 nm). Se sabe que la isquemia prolongada de cualquier tejido u órgano induce daño potencial a la membrana mitocondrial.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir la infiltración de neutrófilos y/o macrófagos. Como se usa en la presente, los términos "infiltración de neutrófilos" e "infiltración de macrófagos" se refieren al reclutamiento o acumulación de neutrófilos y macrófagos en tejidos o células en respuesta a una variedad de sustancias que se liberan en los sitios de reacciones inflamatorias debido a una lesión por isquemia-reperfusión. Por ejemplo, la infiltración de neutrófilos y/o macrófagos puede producirse en el tejido del órgano donante después del trasplante de órganos. Los métodos para medir la infiltración de neutrófilos y/o macrófagos serán conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, los neutrófilos o macrófagos pueden medirse directamente, como por visualización mediante microscopía de fluorescencia, o indirectamente midiendo la abundancia o actividad de proteínas o enzimas específicas de neutrófilos/macrófagos en un tejido afectado. Los métodos adecuados para medir la infiltración de neutrófilos y/o macrófagos se describen en Soo-Jeong Yu et al Korean J Intern Med (2008) y Pulli el al PloS One (2013).

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir la activación de C5 del complemento. Los métodos para medir la activación de C5a del complemento incluyen, pero no se limitan a, la evaluación de los niveles de C5a en plasma mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir el depósito de C5b-9. Los métodos para medir el depósito de C5b-9 incluyen, pero no se limitan al análisis mediante tinción de inmunofluorescencia de secciones de riñón.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir la expresión de uno o más de los siguientes:

Receptor beta de interleucina 8 (IL-8Rp);

Proteína 1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1);

molécula de lesión renal 1 (KIM-1);

Lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL);

Interleucina 1 beta (IL-1 p);

Interleucina 6 (IL-6);

Factor de necrosis tumoral alfa (TNFa);

Receptor 1 del componente 5a del complemento (C5AR1);

proteína 2-alfa inflamatoria de macrófagos (MIP2-alfa);

Molécula 1 de Adhesión Intercelular (ICAM-1);

E-selectina; y

Ligando 1 de quimiocina de motivo C-X-C (CXCL1).

Los métodos para medir el nivel de expresión de un gen serán conocidos en la técnica. Por ejemplo, el nivel de expresión de un gen puede medirse cuantificando la cantidad de ARNm, por ejemplo, mediante transferencia Northern o mediante PCR de transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) como se describe en Riedy et al Biotechniques (1995). Alternativamente, o además, el nivel de expresión de un gen puede medirse cuantificando el nivel de proteína codificada por el gen, por ejemplo, mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayo inmunoabsorbente ligado a fluorescencia (FLISA), inmunofluorescencia o inmunotransferencia (ver Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir la función retrasada del injerto, por ejemplo, asociada con el trasplante de riñón. La función del injerto retrasada es una manifestación de lesión renal aguda que produce oliguria posterior al trasplante, aumento de la inmunogenicidad del aloinjerto y riesgo de episodios de rechazo agudo, y supervivencia a largo plazo disminuida. Los biomarcadores adecuados para detectar la función retrasada del injerto incluyen NGAL, KIM-1, proteína de unión a ácidos grasos de tipo hepático (L-FABP), interleucina 18 (IL-18), YKL-40 (una glicoproteína de unión a heparina y quitina de 40 kDa, consultar, por ejemplo, Hakala et al., J Biol Chem 1993), clusterina y cistatina C. Tales biomarcadores para detectar la función retrasada del injerto se describen en Malyszko et al., Sci Rep (2015).

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir un aumento en los niveles de creatinina en suero o plasma. Una persona experta en la técnica apreciaría que los niveles elevados de creatinina en suero (o plasma) son un indicador de una función renal deteriorada. A medida que un riñón se deteriora por cualquier motivo, por ejemplo debido a una lesión por isquemia-reperfusión, el nivel de creatinina en la sangre aumentará debido a la mala depuración de creatinina por los riñones. Los niveles anormalmente altos de creatinina advierten por tanto de un posible mal funcionamiento o insuficiencia de los riñones. En la técnica se conocerán métodos adecuados para medir los niveles de creatinina en suero (o plasma), por ejemplo, la reacción de Jaffe usando picrato alcalino, y se describen en Peake y Whiting, Clin Biochem Rev (2006).

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir un aumento en los niveles de urea en suero o plasma. Los niveles elevados de urea en suero o plasma son un indicador de insuficiencia renal y pueden ser el resultado de una lesión por isquemiareperfusión. La urea en suero o plasma puede medirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, la urea en suero o plasma puede medirse por métodos químicos como la reacción de diacetilo (generado a partir de diacetilmonoxima y ácido) con urea para formar diazina, o por métodos enzimáticos usando, por ejemplo, ureasa para generar y medir amoníaco o glutamato deshidrogenasa, en el que se mide el consumo de NADH. Por ejemplo, el kit de ensayo de urea de Cell Biolabs se basa en la reacción de Berthelot en la que la urea se degrada primero en amoníaco y dióxido de carbono, que luego se hace reaccionar con un desarrollador alcalino para producir un producto de color azul verdoso que puede medirse con un lector de placas espectrofotométrico estándar a una densidad óptica entre 580 y 630 nm. Los métodos adecuados para medir los niveles de urea en suero o plasma incluyen los que se describen en Lamb E et al., Kidney Function Tests (Capítulo 25): Tietz Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics (2012).

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir un aumento en los niveles de albúmina en orina. Los niveles elevados de albúmina en la orina son un indicador de la función renal deteriorada y pueden ser el resultado de una lesión por isquemiareperfusión. Los niveles de albúmina en orina pueden medirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, los niveles de albúmina en la orina pueden medirse mediante una prueba de microalbuminuria.

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en una cantidad suficiente para reducir o prevenir un aumento de los niveles de sangre en la orina del sujeto. La presencia de sangre en la orina (también conocida como "hematuria") es un indicador de función renal deteriorada y puede ser el resultado de una lesión por isquemia-reperfusión. Los niveles de sangre en la orina del sujeto pueden medirse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica. Por ejemplo, los niveles de sangre en la orina del sujeto pueden medirse usando una tira reactiva de orina o detectando la presencia de glóbulos rojos mediante el examen microscópico de una muestra de orina.

Anticuerpos

Un compuesto como se describe en la presente de acuerdo con cualquier ejemplo es una proteína que comprende un sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF es un anticuerpo. En algunos ejemplos, el anticuerpo se une a G-CSFR. En algunos ejemplos, el anticuerpo se une a G-CSF.

Los métodos para generar anticuerpos se conocen en la técnica y/o se describen en Harlow y Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988). Generalmente, en tales métodos, se administra G-CSFR o G-CSF (por ejemplo, hG-CSFR o hG-CSF) o una región de los mismos (por ejemplo, un dominio extracelular) o fragmento inmunogénico o epítopo de los mismos o una célula que los expresa y muestra el mismo (es decir, un inmunógeno), opcionalmente formulado con cualquier portador, adyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable adecuado o deseado, a un animal no humano, por ejemplo, un ratón, pollo, rata, conejo, cobaya, perro, caballo, vaca, cabra o cerdo. El inmunógeno puede administrarse por vía intranasal, intramuscular, subcutánea, intravenosa, intradérmica, intraperitoneal o por otra vía conocida.

Los anticuerpos monoclonales son una forma ejemplar de un anticuerpo contemplado por la presente invención. El término "anticuerpo monoclonal" o "mAb" se refiere a una población de anticuerpos homogénea capaz de unirse al mismo antígeno o antígenos, por ejemplo, al mismo epítopo dentro del antígeno. No se pretende que este término esté limitado con respecto a la fuente del anticuerpo o la manera en que se produce.

Para la producción de mAbs puede usarse cualquiera de varias técnicas conocidas como, por ejemplo, el procedimiento ejemplificado en la US4196265 o Harlow and Lane (1988), supra.

Alternativamente, se usa la tecnología ABL-MYC (NeoClone, Madison WI 53713, USA) para producir líneas celulares que secretan MAbs (por ejemplo, como se describe en Largaespada el al, J. Immunol. Methods. 197: 85­ 95, 1996).

Los anticuerpos también pueden producirse o aislarse examinando una biblioteca de presentación, por ejemplo, una biblioteca de presentación en fagos, por ejemplo, como se describe en la US6300064 y/o la US5885793. Por ejemplo, los presentes inventores han aislado anticuerpos completamente humanos de una biblioteca de presentación en fagos.

El anticuerpo de la presente invención puede ser un anticuerpo sintético. Por ejemplo, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un anticuerpo desinmunizado.

En un ejemplo, un anticuerpo descrito en la presente es un anticuerpo quimérico. El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular (por ejemplo, murina, como el ratón) o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de las cadenas son idénticas u homólogas a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie (por ejemplo, primates, como humanos) o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpo. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos se describen, por ejemplo, en la US4816567 y la US5807715.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser humanizados o humanos.

Se entenderá que el término "anticuerpo humanizado" se refiere a una subclase de anticuerpos quiméricos que tienen un sitio de unión a antígeno o una región variable derivada de un anticuerpo de una especie no humana y la estructura del anticuerpo restante se basa en la estructura y/o secuencia de un anticuerpo humano En un anticuerpo humanizado, el sitio de unión al antígeno generalmente comprende las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) del anticuerpo no humano injertadas en las FR apropiadas en las regiones variables de un anticuerpo humano y las regiones restantes de un anticuerpo humano. Los sitios de unión a antígeno pueden ser de tipo salvaje (es decir, idénticos a los del anticuerpo no humano) o pueden estar modificados por una o más sustituciones de aminoácidos. En algunos casos, los residuos de FR del anticuerpo humano se reemplazan por residuos no humanos correspondientes.

En la técnica se conocen métodos para humanizar anticuerpos no humanos o partes de los mismos (por ejemplo, regiones variables). La humanización puede realizarse siguiendo el método de la US5225539 o de la US5585089. No se excluyen otros métodos para humanizar un anticuerpo.

El término "anticuerpo humano" como se usa en la presente se refiere a anticuerpos que tienen regiones variables (por ejemplo, Vh, Vl) y, opcionalmente, regiones constantes derivadas o correspondientes a secuencias encontradas en humanos, por ejemplo, en la línea germinal humana o células somáticas.

Los anticuerpos humanos ejemplares se describen en la presente e incluyen C1.2 y C1.2G y/o regiones variables de los mismos. Estos anticuerpos humanos proporcionan la ventaja de una inmunogenicidad reducida en un humano en comparación con los anticuerpos no humanos. Los anticuerpos ejemplares se describen en la WO2012171057.

Proteínas que contienen el dominio de unión al anticuerpo

Anticuerpos de dominio único

En algunos ejemplos, un compuesto de la invención es una proteína que es o comprende un anticuerpo de dominio único (que se usa indistintamente con el término "anticuerpo de dominio" o "dAb"). Un anticuerpo de dominio único es una cadena polipeptídica única que comprende la totalidad o una parte de la región variable de la cadena pesada de un anticuerpo. En ciertos ejemplos, un anticuerpo de dominio único es un anticuerpo de dominio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; consultar, por ejemplo, la US6248516).

Diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos

En algunos ejemplos, una proteína de la invención es o comprende un diacuerpo, triacuerpo, tetracuerpo o complejo de proteínas de orden superior como los descritos en la WO98/044001 y/o la WO94/007921.

Fv de cadena sencilla (scFv)

El experto en la técnica sabrá que los scFv comprenden regiones Vh y Vl en una única cadena polipeptídica y un conector polipeptídico entre la V^h y la V^l que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno (es decir, para la V^h y la V^l de la cadena polipeptídica sencilla para asociarse entre sí para formar un Fv). Por ejemplo, el conector comprende 12 residuos de aminoácidos en exceso , siendo (Gly4Ser)3 uno de los conectores más favorecidos para un scFv.

Anticuerpos de cadena pesada

Los anticuerpos de cadena pesada difieren estructuralmente de muchas otras formas de anticuerpos, en la medida en que comprenden una cadena pesada, pero no comprenden una cadena ligera. Por consiguiente, estos anticuerpos también se denominan "anticuerpos solo de cadena pesada". Los anticuerpos de cadena pesada se encuentran, por ejemplo, en camélidos y peces cartilaginosos (también llamados IgNAR).

Una descripción general de anticuerpos de cadena pesada de camélidos y las regiones variables de los mismos y métodos para su producción y/o aislamiento y/o uso se encuentra, entre otras, en las siguientes referencias WO94/04678, WO97/49805 y WO 97/49805.

En la WO2005/118629, entre otros, se encuentra una descripción general de anticuerpos de cadena pesada de peces cartilaginosos y las regiones variables de los mismos y métodos para su producción y/o aislamiento y/o uso.

Otros anticuerpos y fragmentos de anticuerpos

La presente invención también contempla otros anticuerpos y fragmentos de anticuerpos, como:

(i) proteínas biespecíficas de "llave y agujero" como se describe en la US5,731,168;

(ii) proteínas heteroconjugadas, por ejemplo, como se describe en la US4,676,980;

(iii) proteínas heteroconjugadas producidas usando un reticulante químico, por ejemplo, como se describe en la US4,676,980; y

(iv) Fab³ (por ejemplo, como se describe en la EP19930302894).

Proteínas tipo V

Un ejemplo de un compuesto de la invención es un receptor de células T. Los receptores de células T tienen dos dominios V que se combinan en una estructura similar al módulo Fv de un anticuerpo. Novotny et al., Proc Natl Acad Sci USA 88: 8646-8650, 1991 describe cómo los dos dominios V del receptor de células T (denominados alfa y beta) pueden fusionarse y expresarse como un polipéptido de cadena sencilla y, además, cómo alterar los residuos de la superficie para reducir la hidrofobicidad directamente análoga a un anticuerpo scFv. Otras publicaciones que describen la producción de receptores de células T de cadena sencilla o receptores de células T multiméricos que comprenden dos dominios V-alfa y V-beta incluyen la WO1999/045110 o la WO2011/107595.

Otras proteínas que no son anticuerpos que comprenden dominios de unión a antígeno incluyen proteínas con dominios de tipo V, que generalmente son monoméricas. Los ejemplos de proteínas que comprenden tales dominios de tipo V incluyen CTLA-4, CD28 e ICOS. En la WO1999/045110 se incluye una divulgación adicional de las proteínas que comprenden dichos dominios de tipo V.

Adnectinas

En un ejemplo, un compuesto de la divulgación es una adnectina. Las adnectinas se basan en el décimo dominio de fibronectina tipo III (10Fn3) de la fibronectina humana en el que las regiones del giro se alteran para conferir la unión al antígeno. Por ejemplo, pueden manipularse tres giros en un extremo del sándwich p del dominio 10Fn3 para permitir que la adnectina reconozca específicamente un antígeno. Para detalles adicionales, consultar la US20080139791 o la WO2005/056764.

Anticalinas

En otro ejemplo, un compuesto de la divulgación es una anticalina. Las anticalinas se derivan de las lipocalinas, que son una familia de proteínas extracelulares que transportan moléculas hidrófobas pequeñas como esteroides, bilinas, retinoides y lípidos. Las lipocalinas tienen una estructura secundaria de lámina p rígida con una pluralidad de giros en el extremo abierto de la estructura cónica que puede manipularse para unirse a un antígeno. Estas lipocalinas manipuladas se conocen como anticalinas. Para una descripción adicional de las anticalinas, consultar la US7250297B1 o la US20070224633.

Aficuerpos

En un ejemplo adicional, un compuesto de la divulgación es un aficuerpo. Un aficuerpo es un andamiaje derivado del dominio Z (dominio de unión a antígeno) de la Proteína A de Staphylococcus aureus que puede manipularse para que se una al antígeno. El dominio Z consiste en un haz de tres hélices de aproximadamente 58 aminoácidos. Las bibliotecas han sido generadas por aleatorización de residuos superficiales. Para detalles adicionales consultar la EP1641818.

Avímeros

En un ejemplo adicional, un compuesto de la divulgación es un avímero. Los avímeros son proteínas multidominio derivadas de la familia de andamiajes del dominio A. Los dominios nativos de aproximadamente 35 aminoácidos adoptan una estructura unida por disulfuro definida. La diversidad se genera mezclando la variación natural mostrada por la familia de dominios A. Para detalles adicionales, consultar la W02002088171.

DARPinas

En un ejemplo adicional, un compuesto de la divulgación es una Proteína Repetida de Anquirina Manipulada (DARPin). Las DARPinas se derivan de la Anquirina, que es una familia de proteínas que median la unión de proteínas de membrana integrales al citoesqueleto. Una única repetición de anquirina es un motivo de 33 residuos que consta de dos hélices a y un giro p. Pueden manipularse para que se unan a diferentes antígenos objetivo mediante la aleatorización de residuos en la primera hélice a y un giro p de cada repetición. Su interfaz de unión puede aumentarse aumentando el número de módulos (un método de maduración por afinidad). Para detalles adicionales, consultar la US20040132028.

G-CSFR soluble

La presente divulgación también contempla una forma soluble del G-CSFR que compite con el G-CSFR asociado a la membrana de origen natural por la interacción con G-CSF. Los expertos en la técnica pueden preparar fácilmente formas solubles del receptor, consultar, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.589.456 y Honjo et al, Acta Crystallograph Sect F Struct Biol Cryst Commun. 61 (Pt 8):788-790, 2005

Anticuerpos y proteínas desinmunizados

La presente divulgación también contempla un anticuerpo o una proteína desinmunizados. Los anticuerpos y proteínas desinmunizados tienen uno o más epítopos, por ejemplo, epítopos de células B o epítopos de células T eliminados (es decir, mutados) para reducir de este modo la probabilidad de que un mamífero provoque una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo o la proteína. Los métodos para producir proteínas y anticuerpos desinmunizados se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en la WO2000/34317, la WO2004/108158 y la WO2004/064724.

Los métodos para introducir mutaciones adecuadas y expresar y ensayar la proteína resultante serán evidentes para el experto en la técnica en base a la descripción en la presente.

Mutaciones en proteínas

La presente divulgación también contempla formas mutantes de una proteína de la invención. A este respecto, los datos presentados en la presente indican sitios dentro de una CDR de una proteína de la invención que pueden cambiarse además de los cambios ejemplares que pueden realizarse. El experto en la técnica comprenderá que adicional o alternativamente pueden realizarse cambios dentro de una región marco de una proteína que contiene una región variable sin inhibir o reducir significativamente su función en el contexto de la presente invención.

Por ejemplo, dicha proteína mutante comprende una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos en comparación con una secuencia expuesta en la presente. En algunos ejemplos, la proteína comprende 30 o menos o 20 o menos o 10 o menos, por ejemplo, 9 o 8 o 7 o 6 o 5 o 4 o 3 o 2 sustituciones conservadoras de aminoácidos. Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la que el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar y/o hidropaticidad y/o hidrofilicidad.

En un ejemplo, una proteína mutante tiene solo, o no más de, uno o dos o tres o cuatro o cinco o seis cambios conservadores de aminoácidos en comparación con una proteína natural. Los detalles de los cambios conservadores de aminoácidos se proporcionan a continuación. Como sabrán los expertos, por ejemplo, a partir de la divulgación de la presente, puede predecirse razonablemente que dichos cambios menores no alterarán la actividad de la proteína.

En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales con ramificación p (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina).

La presente divulgación también contempla cambios de aminoácidos no conservadores (por ejemplo, sustituciones) en una proteína de la presente invención, por ejemplo, en una CDR, como CDR3. Por ejemplo, los presentes inventores han identificado varias sustituciones de aminoácidos no conservadoras que pueden realizarse a la vez que mantiene la actividad de una proteína de la invención. En un ejemplo, la proteína comprende menos de 6 o 5 o 4 o 3 o 2 o 1 sustituciones de aminoácidos no conservadoras, por ejemplo, en una CDR3, como en una CDR3.

La presente divulgación también contempla una o más inserciones o deleciones en comparación con una secuencia expuesta en la presente. En algunos ejemplos, la proteína comprende 10 o menos, por ejemplo, 9 o 8 o 7 o 6 o 5 o 4 o 3 o 2 inserciones y/o deleciones.

Regiones constantes

La presente invención abarca proteínas y/o anticuerpos descritos en la presente que comprenden una región constante de un anticuerpo. Esto incluye fragmentos de unión a antígeno de un anticuerpo fusionado con un Fc.

Las secuencias de regiones constantes útiles para producir las proteínas de la presente divulgación pueden obtenerse de varias fuentes diferentes. En algunos ejemplos, la región constante o parte de la misma de la proteína se deriva de un anticuerpo humano. La región constante o parte de la misma puede derivarse de cualquier clase de anticuerpo, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo de anticuerpo, incluyendo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En un ejemplo, la región constante es el isotipo humano IgG4 o una región constante de IgG4 estabilizada.

En un ejemplo, la región Fc de la región constante tiene una capacidad reducida para inducir la función efectora, por ejemplo, en comparación con una región Fc de IgG 1 o IgG3 humana nativa o de tipo salvaje. En un ejemplo, la función efectora es la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o la fagocitosis mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCP) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Los métodos para evaluar el nivel de la función efectora de una proteína que contiene la región Fc se conocen en la técnica y/o se describen en la presente.

En un ejemplo, la región Fc es una región Fc de IgG4 (es decir, de una región constante de IgG4), por ejemplo, una región Fc de IgG4 humana. Las secuencias de regiones Fc de IgG4 adecuadas serán evidentes para el experto en la técnica y/o estarán disponibles en bases de datos disponibles públicamente (por ejemplo, disponibles del National Center for Biotechnology Information).

En un ejemplo, la región constante es una región constante de IgG4 estabilizada. Se entenderá que el término "región constante de IgG4 estabilizada" significa una región constante de IgG4 que ha sido modificada para reducir el intercambio de brazos Fab o la propensión a experimentar un intercambio de brazos Fab o la formación de un medio anticuerpo o una propensión a formar un medio anticuerpo. El "intercambio de brazos Fab" se refiere a un tipo de modificación de proteína para la IgG4 humana, en la que una cadena pesada de IgG4 y una cadena ligera unida (media molécula) se intercambian por un par de cadenas pesada-ligera de otra molécula de IgG4. Por tanto, las moléculas de IgG4 pueden adquieren dos brazos Fab distintos que reconocen dos antígenos distintos (lo que da como resultado moléculas biespecíficas) El intercambio de brazos Fab se produce de manera natural in vivo y puede ser inducido in vitro por células sanguíneas purificadas o agentes reductores como el glutatión reducido. Un "medio anticuerpo" se forma cuando un anticuerpo de IgG4 se disocia para formar dos moléculas que contienen cada uno una única cadena pesada y una única cadena ligera.

En un ejemplo, una región constante de IgG4 estabilizada comprende una prolina en la posición 241 de la región bisagra de acuerdo con el sistema de Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 1987 y/o 1991). Esta posición corresponde a la posición 228 de la región bisagra de acuerdo con el sistema de numeración EU (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest Washington DC United States Department of Health and Human Services, 2001 y Edelman et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85, 1969). En la IgG4 humana, este residuo es generalmente una serina. Tras la sustitución de la serina por prolina, la región bisagra de IgG4 comprende una secuencia CPPC. A este respecto, el experto en la técnica sabrá que la "región bisagra" es una parte rica en prolina de una región constante de cadena pesada de anticuerpo que enlaza las regiones Fc y Fab que confiere movilidad a los dos brazos Fab de un anticuerpo. La región bisagra incluye residuos de cisteína que están implicados en enlaces disulfuro entre cadenas pesadas. Generalmente se define como la extensión de Glu226 a Pro243 de IgG1 humana de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. Las regiones bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia de IgG 1 colocando los primeros y últimos residuos de cisteína que forman enlaces disulfuro (S-S) entre cadenas pesadas en las mismas posiciones (ver, por ejemplo, la WO2010/080538).

Ejemplos adicionales de anticuerpos IgG4 estabilizados son anticuerpos en los que la arginina en la posición 409 en una región constante de cadena pesada de IgG4 humana (de acuerdo con el sistema de numeración EU) se sustituye por lisina, treonina, metionina o leucina (por ejemplo, como se describe en la WO2006/033386). La región Fc de la región constante puede adicional o alternativamente comprender un residuo seleccionado del grupo que consiste en: alanina, valina, glicina, isoleucina y leucina en la posición correspondiente a 405 (de acuerdo con el sistema de numeración EU). Opcionalmente, la región bisagra comprende una prolina en la posición 241 (es decir, una secuencia CPPC) (como se ha descrito anteriormente).

En otro ejemplo, la región Fc es una región modificada para que tenga una función efectora reducida, es decir, una "región Fc no inmunoestimuladora". Por ejemplo, la región Fc es una región Fc de IgG 1 que comprende una sustitución en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste en 268, 309, 330 y 331. En otro ejemplo, la región Fc es una región Fc de IgG1 que comprende uno o más de los siguientes cambios E233P, L234V, L235A y la deleción de G236 y/o uno o más de los siguientes cambios A327G, A330S y P331S (Armour et al., Eur J Immunol. 29:2613-2624, 1999; Shields et al., J Biol Chem 276(9):6591-604, 2001). Ejemplos adicionales de regiones Fc no inmunoestimuladoras se describen, por ejemplo, en Dall'Acqua et al., J Immunol. 177:1129-1138 2006; y/o Hezareh J Virol;75: 12161-12168, 2001).

En otro ejemplo, la región Fc es una región Fc quimérica, por ejemplo, que comprende por lo menos un dominio C^h2 de un anticuerpo de IgG4 y por lo menos un dominio C^h3 de un anticuerpo de IgG 1, en donde la región Fc comprende una sustitución en uno o más posiciones de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en 240, 262, 264, 266, 297, 299, 307, 309, 323, 399, 409 y 427 (numeración EU) (por ejemplo, como se describe en la WO2010/085682). Las sustituciones ejemplares incluyen 240F, 262L, 264T, 266F, 297Q, 299A, 299K, 307P, 309K, 309M, 309P, 323F, 399S y 427F.

Modificaciones adicionales

La presente divulgación también contempla modificaciones adicionales a un anticuerpo o proteína de la invención.

Por ejemplo, el anticuerpo comprende una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la vida media de la proteína. Por ejemplo, el anticuerpo comprende una región Fc que comprende una o más sustituciones de aminoácidos que aumentan la afinidad de la región Fc por la región Fc neonatal (FcRn). Por ejemplo, la región Fc tiene una afinidad aumentada por FcRn a un pH más bajo, por ejemplo, aproximadamente pH 6,0, para facilitar la unión de Fc/FcRn en un endosoma. En un ejemplo, la región Fc tiene una afinidad aumentada por FcRn a un pH de aproximadamente 6 en comparación con su afinidad a un pH de aproximadamente 7,4, lo que facilita la liberación de Fc en la sangre después del reciclaje celular. Estas sustituciones de aminoácidos son útiles para prolongar la vida media de una proteína, al reducir la depuración de la sangre.

Las sustituciones de aminoácidos ejemplares incluyen T250Q y/o M428L o T252A, T254S y T266F o M252Y, S254T y T256E o H433K y N434F de acuerdo con el sistema de numeración EU. Sustituciones de aminoácidos adicionales o alternativas se describen, por ejemplo, en la US20070135620 o la US7083784.

En un ejemplo, la proteína de la invención comprende además albúmina, un fragmento funcional o una variante de la misma. En un ejemplo, la albúmina, el fragmento funcional o variante de la misma es albúmina en suero, como albúmina en suero humana. En un ejemplo, la albúmina, fragmento funcional o variante de la misma, comprende una o más sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos, por ejemplo, no más de 5 o 4 o 3 o 2 o 1 sustituciones. Las sustituciones de aminoácidos adecuadas para su uso en la presente divulgación serán evidentes para los expertos en la técnica e incluyen sustituciones naturales y sustituciones diseñadas como las descritas, por ejemplo, en la WO2011051489, WO2014072481, WO2011103076, WO2012112188, WO2013075066, WO2015063611 y WO2014179657.

Producción de proteínas

En un ejemplo, una proteína descrita en la presente de acuerdo con cualquier ejemplo se produce cultivando un hibridoma en condiciones suficientes para producir la proteína, por ejemplo, como se describe en la presente y/o como se conoce en la técnica.

Expresión recombinante

En otro ejemplo, una proteína descrita en la presente de acuerdo con cualquier ejemplo es recombinante. En el caso de una proteína recombinante, el ácido nucleico que la codifica puede clonarse en constructos o vectores de expresión, que luego se transfectan en células huésped, como células de E. coli, células de levadura, células de insecto o células de mamífero, como células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (HEK) o células de mieloma que de otro modo no producen la proteína. Las células ejemplares usadas para expresar una proteína son células CHO, células de mieloma o células HEK. Las técnicas de clonación molecular para lograr estos fines se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en Ausubel et al., (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates y Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta ahora) o Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989). Una amplia variedad de métodos de clonación y amplificación in vitro son adecuados para la construcción de ácidos nucleicos recombinantes. Los métodos para producir anticuerpos recombinantes también se conocen en la técnica, consultar, por ejemplo, la US4816567 o la US5530101.

Después del aislamiento, el ácido nucleico se inserta enlazado operativamente a un promotor en un constructo de expresión o vector de expresión para clonación adicional (amplificación del ADN) o para expresión en un sistema sin células o en células.

Como se usa en la presente, el término "promotor" debe entenderse en su contexto más amplio e incluye las secuencias reguladoras de la transcripción de un gen genómico, incluyendo la caja TATA o el elemento iniciador, que se requiere para el inicio de la transcripción precisa, con o sin elementos reguladores adicionales (por ejemplo, secuencias de activación en sentido ascendente, sitios de unión de factores de transcripción, potenciadores y silenciadores) que alteran la expresión de un ácido nucleico, por ejemplo, en respuesta a un estímulo externo y/o de desarrollo, o de una manera específica de tejido. En el presente contexto, el término "promotor" también se usa para describir un ácido nucleico recombinante, sintético o de fusión, o un derivado que confiere, activa o potencia la expresión de un ácido nucleico al que está enlazado operativamente. Los promotores ejemplares pueden contener copias adicionales de uno o más elementos reguladores específicos para potenciar aún más la expresión y/o alterar la expresión espacial y/o la expresión temporal de dicho ácido nucleico.

Como se usa en la presente, el término "enlazado operativamente a" significa colocar un promotor con respecto a un ácido nucleico de tal manera que la expresión del ácido nucleico esté controlada por el promotor.

Están disponibles muchos vectores para la expresión en células. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia señal, una secuencia que codifica una proteína (por ejemplo, derivada de la información proporcionada en la presente), un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. El experto en la técnica conocerá las secuencias adecuadas para la expresión de una proteína. Las secuencias señal ejemplares incluyen señales de secreción procariota (por ejemplo, pelB, fosfatasa alcalina, penicilinasa, Ipp o enterotoxina estable al calor II), señales de secreción de levadura (por ejemplo, líder de invertasa, líder de factor a o líder de fosfatasa ácida) o señales de secreción de mamíferos (por ejemplo, señal de herpes simplex gD).

Los promotores ejemplares activos en células de mamífero incluyen promotor temprano inmediato de citomegalovirus (CMV-IE), promotor del factor de elongación humano 1-a (EF1), promotores de ARN nuclear pequeño (Ula y Ulb), promotor de cadena pesada de a-miosina, promotor del virus simio 40 (SV40), promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), promotor tardío principal de adenovirus, promotor de p-actina; elemento regulador híbrido que comprende un potenciador de CMV/promotor de p-actina o un promotor de inmunoglobulina o un fragmento activo del mismo. Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión; células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); o células de ovario de hámster chino (CHO).

Los promotores típicos adecuados para la expresión en células de levadura como, por ejemplo, una célula de levadura seleccionada del grupo que comprende Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y S. pombe, incluyen, pero no se limitan a, el promotor ADH1, el promotor GAL1, el promotor GAL4, el promotor CUP1, el promotor PH05, el promotor nmt, el promotor RPR1 o el promotor TEF1.

Los medios para introducir el ácido nucleico aislado o el constructo de expresión que comprende el mismo en una célula para la expresión son conocidos por los expertos en la técnica. La técnica usada para una célula dada depende de las técnicas con éxito conocidas. Los medios para introducir ADN recombinante en las células incluyen microinyección, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección mediada por liposomas como mediante el uso de lipofectamina (Gibco, MD, USA) y/o cellfectina (Gibco, MD, USA), captación de ADN mediada por PEG, electroporación y bombardeo de micropartículas como usando partículas de oro o tungsteno recubiertas con ADN (Agracetus Inc., WI USA) entre otras.

Las células huésped usadas para producir la proteína pueden cultivarse en una variedad de medios, dependiendo del tipo de célula usado. Los medios disponibles en el mercado como F10 de Ham (Sigma), médio mínimo esencial ((MeM), (Sigma), RPM1-1640 (Sigma) y medio de Eagle modificado de Dulbecco ((Dm EM), Sigma) son adecuados para cultivar células de mamífero. Los medios para cultivar otros tipos de células analizados en la presente son conocidos en la técnica.

Aislamiento de Proteínas

Los métodos para aislar una proteína se conocen en la técnica y/o se describen en la presente.

Cuando una proteína se secreta en un medio de cultivo, los sobrenadantes de dichos sistemas de expresión pueden concentrarse primero usando un filtro de concentración de proteínas disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. En cualquiera de los pasos anteriores puede incluirse un inhibidor de proteasas como PMSF para inhibir la proteólisis y pueden incluirse antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes accidentales. Alternativamente, o adicionalmente, los sobrenadantes pueden filtrarse y/o separarse de las células que expresan la proteína, por ejemplo, usando centrifugación continua.

La proteína preparada a partir de las células puede purificarse usando, por ejemplo, intercambio iónico, cromatografía de hidroxiapatita, cromatografía de interacción hidrófoba, electroforesis en gel, diálisis, cromatografía de afinidad (por ejemplo, cromatografía de afinidad con proteína A o cromatografía con proteína G) o cualquier combinación de los anteriores.. Estos métodos son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en la WO99/57134 o Ed Harlow y David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988).

El experto en la técnica también sabrá que una proteína puede modificarse para que incluya una etiqueta para facilitar la purificación o la detección, por ejemplo, una etiqueta de polihistidina, por ejemplo, una etiqueta de hexahistidina o una etiqueta de hemaglutinina (HA) del virus de la gripe, o una etiqueta de virus simio 5 (V5), o una etiqueta FLAG, o una etiqueta de glutatión S-transferasa (GST). A continuación, la proteína resultante se purifica usando métodos conocidos en la técnica, como la purificación por afinidad. Por ejemplo, una proteína que comprende una etiqueta hexa-his se purifica poniendo en contacto una muestra que comprende la proteína con ácido níquel-nitrilotriacético (Ni-NTA) que se une específicamente a una etiqueta hexa-his inmovilizada en un soporte sólido o semisólido, lavando la muestra para eliminar la proteína no unida y, posteriormente, eluyendo la proteína unida. Alternativamente, o adicionalmente, en un método de purificación se usa un ligando o anticuerpo que se une a una etiqueta.

Actividad de ensayo de un compuesto

Unión a G-CSFR y mutantes del mismo

Será evidente para el experto en la técnica a partir de la divulgación de la presente que algunos compuestos de la presente invención se unen al dominio de unión al ligando de hG-CSFR y a formas mutantes específicas del dominio de unión al ligando de hG-CSFR (por ejemplo, SEQ ID NO: 1 sin o con ciertas mutaciones puntuales) y/o se unen tano al G-CSFR humano como al de mono cynomolgus. Los métodos para evaluar la unión a una proteína son conocidos en la técnica, por ejemplo, como se describe en Scopes (In: Protein purification: Principles and Practice, Tercera edición, Springer Verlag, 1994). Tal método implica generalmente marcar la proteína y ponerla en contacto con el compuesto inmovilizado. Después del lavado para eliminar la proteína unida no específica, se detecta la cantidad de marcador y, como consecuencia, la proteína unida. Por supuesto, la proteína puede inmovilizarse y el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF puede marcarse. También pueden usarse ensayos de tipo selección. Alternativamente, o adicionalmente, pueden usarse ensayos de resonancia de plasmones superficiales.

Los ensayos descritos anteriormente también pueden usarse para detectar el nivel de unión de un compuesto a hG-CSFR o un dominio de unión a ligando del mismo (por ejemplo, SEQ ID NO: 1) o una forma mutante del mismo.

En un ejemplo, una proteína de la presente invención se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 en el que una alanina se sustituye por la lisina en la posición 167 de la SEQ ID NO: 1 y/o en el que una alanina se sustituye por la histidina en la posición 168 de la SEQ ID NO: 1 sustancialmente al mismo nivel (por ejemplo, dentro del 10% o 5% o 1%) que se une a la SEQ ID NO: 1.

En un ejemplo, una proteína de la presente invención se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 en el que una alanina se sustituye por la arginina en la posición 287 de la SEQ ID NO: 1 a un nivel por lo menos aproximadamente 100 veces o 150 veces o 160 veces o 200 veces menor de lo que se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1. En un ejemplo, una proteína de la presente invención se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 en el que una alanina se sustituye por la arginina en la posición 287 de la SEQ ID NO: 1 a un nivel por lo menos aproximadamente 160 veces menor de lo que se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1.

En un ejemplo, una proteína de la presente invención se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 en el que una alanina se sustituye por la histidina en la posición 237 de la SEQ ID NO: 1 a un nivel de por lo menos aproximadamente 20 veces o 40 veces o 50 veces o 60 veces menor de lo que se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1. En un ejemplo, una proteína de la presente invención se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 en el que una alanina se sustituye por la histidina en la posición 237 de la SEQ ID NO: 1 a un nivel por lo menos aproximadamente 50 veces menor que el que se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1.

En un ejemplo, una proteína de la presente invención se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 en el que una alanina se sustituye por la metionina en la posición 198 de la SEQ ID NO: 1 a un nivel por lo menos aproximadamente 20 veces o 40 veces o 60 veces o 70 veces menor de lo que se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1. En un ejemplo, una proteína de la presente invención se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 en el que una alanina se sustituye por la metionina en la posición 198 de la SEQ ID NO: 1 a un nivel por lo menos aproximadamente 40 veces menor que el que se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1.

En un ejemplo, una proteína de la presente invención se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 en el que una alanina se sustituye por la tirosina en la posición 172 de la SEQ ID NO: 1 a un nivel por lo menos aproximadamente 20 veces o 30 veces o 40 veces menor de lo que se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1. En un ejemplo, una proteína de la presente invención se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 en el que una alanina se sustituye por la tirosina en la posición 172 de la SEQ ID NO: 1 a un nivel por lo menos aproximadamente 40 veces menor que el que se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1.

En un ejemplo, una proteína de la presente invención se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 en el que una alanina se sustituye por la leucina en la posición 171 de la SEQ ID NO: 1 a un nivel por lo menos aproximadamente 100 veces o 120 veces o 130 veces o 140 veces menor de lo que se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1. En un ejemplo, una proteína de la presente invención se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 en el que una alanina se sustituye por la leucina en la posición 171 de la SEQ ID NO: 1 a un nivel por lo menos aproximadamente 140 veces menor que el que se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1.

En un ejemplo, una proteína de la presente invención se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 en el que una alanina se sustituye por la leucina en una posición 111 de la SEQ ID NO: 1 a un nivel por lo menos aproximadamente 20 o 40 veces o 60 o 70 veces menor que el que se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1. En un ejemplo, una proteína de la presente invención se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 en el que una alanina se sustituye por la leucina en una posición 111 de la SEQ ID NO: 1 a un nivel por lo menos aproximadamente 60 veces menor que el que se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1.

En un ejemplo, una proteína de la presente invención se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 en el que una alanina se sustituye por la histidina en la posición 168 de la SEQ ID NO: 1 a un nivel no más de 5 veces o 4 veces o 3 veces o 2 vez o 1 vez menor que el que se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1.

En un ejemplo, una proteína de la presente invención se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1 en el que una alanina se sustituye por la lisina en la posición 167 de la SEQ ID NO: 1 a un nivel no más de 5 veces o 4 veces o 3 veces o 2 veces o 1 vez menor de lo que se une a un polipéptido de la SEQ ID NO: 1.

El nivel de unión se determina convenientemente usando un biosensor.

La presente divulgación contempla cualquier combinación de las características anteriores. En un ejemplo de la invención, una proteína descrita en la presente tiene todas las características de unión expuestas en los siete párrafos anteriores.

Mapeo de epítopos

En otro ejemplo, se mapea el epítopo unido por una proteína de la invención. Los métodos de mapeo de epítopos serán evidentes para el experto en la técnica. Por ejemplo, se producen una serie de péptidos superpuestos que abarcan la secuencia hG-CSFR o una región de la misma que comprende un epítopo de interés, por ejemplo, péptidos que comprenden 10-15 aminoácidos. Luego, la proteína se pone en contacto con cada péptido y se determina el o los péptidos a los que se une. Esto permite la determinación del péptido o péptidos que comprenden el epítopo al que se une la proteína. Si la proteína une múltiples péptidos no contiguos, la proteína puede unirse a un epítopo conformacional.

Alternativamente, o adicionalmente, se mutan los residuos de aminoácidos dentro del hG-CSFR, por ejemplo, mediante mutagénesis de barrido con alanina, y se determinan las mutaciones que reducen o evitan la unión a proteínas. Es probable que cualquier mutación que reduzca o impida la unión de la proteína esté dentro del epítopo al que se ha unido la proteína.

En la presente se ejemplifica un método adicional e implica unir hG-CSFR o una región del mismo a una proteína inmovilizada de la presente invención y digerir el complejo resultante con proteasas. Los péptidos que permanecen unidos a la proteína inmovilizada se aíslan y analizan, por ejemplo, usando espectrometría de masas, para determinar su secuencia.

Un método adicional implica convertir hidrógenos en hG-CSFR o una región del mismo en deutrones y unir la proteína resultante a una proteína inmovilizada de la presente invención. Luego, los deutrones se vuelven a convertir en hidrógeno, el hG-CSFR o región del mismo se aísla, se digiere con enzimas y se analiza, por ejemplo, usando espectrometría de masas para identificar aquellas regiones que comprenden deutrones, que habrían estado protegidas de la conversión a hidrógeno mediante la unión de un proteína descrita en la presente.

Opcionalmente, se determina la constante de disociación (Kd) de una proteína para hG-CSFR o un epítopo del mismo. La "Kd" o el "valor de Kd" para una proteína de unión a hG-CSFR se mide en un ejemplo mediante un ensayo de unión de hG-CSFR radiomarcado o marcado con fluorescencia. Este ensayo equilibra la proteína con una concentración mínima de G-CSFR marcado en presencia de una serie de titulaciones de hG-CSFR no marcado. Después del lavado para eliminar la hG-CSFR no unida, se determina la cantidad de marcador, que es indicativa de la Kd de la proteína.

De acuerdo con otro ejemplo, la Kd o el valor de Kd se mide usando ensayos de resonancia de plasmones superficiales, por ejemplo, usando resonancia de plasmones superficiales BIAcore (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) con hG-CSFR inmovilizado o una región del mismo.

En algunos ejemplos, se seleccionan proteínas que tienen una Kd similar o una Kd más alta que C1.2 o C1.2G, porque es probable que compitan por unirse a hG-CSFR.

Determinación de la unión competitiva

Los ensayos para determinar una proteína que inhiba competitivamente la unión del anticuerpo monoclonal C1.2 o C1.2G serán evidentes para el experto en la técnica. Por ejemplo, C1.2 o C1.2G se conjuga con un marcador detectable, por ejemplo, un marcador fluorescente o un marcador radiactivo. Luego, el anticuerpo marcado y la proteína de prueba se mezclan y se ponen en contacto con hG-CSFR o una región del mismo (por ejemplo, un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 1) o una célula que lo expresa. Luego, se determina el nivel de C1.2 o C1.2G marcado y se compara con el nivel determinado cuando el anticuerpo marcado se pone en contacto con ea hG-CSFR, la región o las células en ausencia de la proteína. Si el nivel de C1.2 o C1.2G marcado se reduce en presencia de la proteína de prueba en comparación con la ausencia de la proteína, se considera que la proteína inhibe de manera competitiva la unión de C1.2 o C1.2G a hG-CSFR.

Opcionalmente, la proteína de prueba se conjuga con un marcador diferente a C1.2 o C1.2G. Este marcado alternativo permite la detección del nivel de unión de la proteína de prueba a hG-CSFR o a la región del mismo o a la célula.

En otro ejemplo, se permite que la proteína se una a hG-CSFR o una región del mismo (por ejemplo, un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 1) o una célula que expresa el mismo antes de poner en contacto el hG-CSFR, la región o la célula con C1.2 o C1.2G. Una reducción en la cantidad de C1.2 o C1.2G unidos en presencia de la proteína en comparación con la ausencia de la proteína indica que la proteína inhibe competitivamente la unión de C1.2 o C1.2G a hG-CSFR. También puede realizarse un ensayo recíproco usando proteína marcada y primero permitiendo que C1.2 o C1.2G se unan a G-CSFR. En este caso, una cantidad reducida de proteína marcada unida a hG-CSFR en presencia de C1.2 o C1.2G en comparación con la ausencia de C1.2 o C1.2G indica que la proteína inhibe de manera competitiva la unión de C1.2 o C1.2G a hG-CSFR.

Cualquiera de los ensayos anteriores puede realizarse con una forma mutante de hG-CSFR y/o la SEQ ID NO: 1 y/o una región de unión a ligando de hG-CSFR a la que se une C1.2 o C1.2G, por ejemplo, como se describe en la presente.

Determinación de la neutralización

Los compuestos de la presente invención, son capaces de neutralizar la señalización de hG-CSFR.

En la técnica se conocen varios ensayos para evaluar la capacidad de un compuesto para neutralizar la señalización de un ligando a través de un receptor.

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF reduce o previene la unión de G-CSF a hG-CSFR. Estos ensayos pueden realizarse como un ensayo de unión competitiva como se describe en la presente usando G-CSF marcado y/o proteína marcada.

En otro ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF reduce la formación de CFU-G cuando se cultivan células de médula ósea CD34⁺ en presencia de G-CSF. En tales ensayos, las células de la médula ósea CD34⁺ se cultivan en un medio de cultivo celular semisólido en presencia de G-CSF (por ejemplo, aproximadamente 10 ng/ml de medio de cultivo celular) y, opcionalmente, factor de células madre (por ejemplo, aproximadamente 10 ng/ml de medio de cultivo celular) en presencia o ausencia de un compuesto de prueba. Después de un tiempo suficiente para que se formen clones de granulocitos (CFU-G), se determina el número de clones o colonias. Una reducción en el número de colonias en presencia del compuesto que inhibe la señalización de G-CSF en comparación con la ausencia del compuesto que inhibe la señalización de G-CSF indica que el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF neutraliza la señalización de G-CSF. Al probar múltiples concentraciones del compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se determina una IC⁵⁰, es decir, una concentración a la que se produce el 50% de la inhibición máxima de la formación de CFU-G. En un ejemplo, la IC⁵⁰ es 0. 2 nM o menos, como 0,1 nM o menos, por ejemplo, 0,09 nM o menos, o 0,08 nM o menos, o 0,07 nM o menos, o 0,06 nM o menos o 0,05 nM o menos. En un ejemplo, la IC⁵⁰ es 0,04 nM o menos. En otro ejemplo, la IC⁵⁰ es 0,02 nM o menos. Las IC⁵⁰ anteriores se refieren a cualquier ensayo de CFU-G descrito en la presente.

En un ejemplo adicional, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF reduce la proliferación de células (por ejemplo, células BaF3) que expresan hG-CSFR que se cultivan en presencia de G-CSF. Las células se cultivan en presencia de G-CSF (por ejemplo, 0,5 ng/ml) y en presencia o ausencia de un compuesto de ensayo. Los métodos para evaluar la proliferación celular son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la reducción de MTT y la incorporación de timidina. Se considera que un compuesto que reduce el nivel de proliferación en comparación con el nivel observado en ausencia del compuesto neutraliza la señalización de G-CSF. Probando múltiples concentraciones del compuesto se determina una IC⁵⁰, es decir, una concentración a la que se produce el 50% de la inhibición máxima de la proliferación celular. En un ejemplo, la IC⁵⁰ es de 6 nM o menos, como 5,9 nM o menos. En otro ejemplo, la IC5ü es 2 nM o menos o 1 nM o menos o 0,7 nM o menos o 0,6 nM o menos o 0,5 nM o menos. Las IC⁵⁰ anteriores se refieren a cualquier ensayo de proliferación celular descrito en la presente.

En un ejemplo adicional, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF reduce la movilización de células madre hematopoyéticas y/o células progenitoras endoteliales in vivo después de la administración de G-CSF y/o reduce el número de neutrófilos in vivo, por ejemplo, después de la administración de G-CSF (sin embargo, esto no es esencial). Por ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra, opcionalmente antes, en el momento o después de la administración de G-CSF o una forma modificada del mismo (por ejemplo, G-CSF PEGilado o filgrastim). Se evalúa el número de células madre hematopoyéticas (por ejemplo, que expresan CD34 y/o Thy1) y/o células progenitoras endoteliales (por ejemplo, que expresan CD34 y VEGFR2) y/o neutrófilos (identificados morfológicamente y/o que expresan, por ejemplo, CD10, CD14, CD31 y/o o CD88). Se considera que un compuesto que reduce el nivel de la célula o células en comparación con el nivel observado en ausencia del compuesto neutraliza la señalización de G-CSF. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF reduce el número de neutrófilos sin inducir neutropenia.

La presente divulgación contempla otros métodos para evaluar la neutralización de la señalización de G-CSF.

Determinación de la función efectora

Como se analiza en la presente, algunas proteínas de la presente invención tienen una función efectora reducida. Los métodos para evaluar la actividad de ADCC son conocidos en la técnica.

En un ejemplo, el nivel de actividad de ADCC se evalúa usando un ensayo de liberación de ⁵¹Cr, un ensayo de liberación de europio o un ensayo de liberación de ³⁵S. En cada uno de estos ensayos, las células que expresan G-CSFR se cultivan con uno o más de los compuestos enumerados que inhiben la señalización de G-CSF durante un tiempo y en condiciones suficientes para que la célula absorba el compuesto. En el caso de un ensayo de liberación de ³⁵S, las células que expresan hG-CSFR pueden cultivarse con metionina y/o cisteína marcadas con ³⁵S durante un tiempo suficiente para que los aminoácidos marcados se incorporen a las proteínas recién sintetizadas. A continuación, las células se cultivan en presencia o ausencia de la proteína y en presencia de células efectoras inmunitarias, por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y/o células NK. Luego se detecta la cantidad de ⁵¹Cr, europio y/o ³⁵S en el medio de cultivo celular y poco o ningún cambio en presencia de la proteína en comparación con la ausencia de proteína (o un nivel reducido del compuesto en comparación con el nivel observado en presencia de un anticuerpo anti-hG-CSFR que comprende un Fc de IgG1 humana) indica que la proteína tiene una función efectora reducida. Publicaciones ejemplares que describen ensayos para evaluar el nivel de ADCC inducida por una proteína incluyen Hellstrom, et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 83:7059-7063, 1986 and Bruggemann, et al., J. Exp. Med. 166:1351 -1361, 1987

Otros ensayos para evaluar el nivel de ADCC inducido por una proteína incluyen el ensayo de citotoxicidad no radiactiva ACTI™ para citometría de flujo (Cell Technology, Inc. CA, USA) o el ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96® (Promega, WI, USA).

También pueden llevarse a cabo ensayos de unión de C1q para confirmar que la proteína es capaz de unirse a C1q y puede inducir la CDC. Para evaluar la activación del complemento, puede realizarse un ensayo CDC (ver, por ejemplo, Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202: 163, 1996.

Determinación de la vida media

Algunas proteínas abarcadas por la presente invención tienen una vida media mejorada, por ejemplo, se modifican para extender su vida media en comparación con las proteínas que no están modificadas. Los métodos para determinar una proteína con una vida media mejorada serán evidentes para el experto en la técnica. Por ejemplo, se evalúa la capacidad de una proteína para unirse a un receptor de Fc neonatal (FcRn). A este respecto, la afinidad de unión aumentada por FcRn aumentó la vida media en suero de la molécula (ver, por ejemplo, Kim et al., Eur J Immunol., 24:2429, 1994).

La vida media de una proteína de la invención también puede medirse mediante estudios farmacocinéticos, por ejemplo, de acuerdo con el método descrito por Kim et al, Eur J of Immunol 24: 542, 1994. Según este método, la proteína radiomarcada se inyecta por vía intravenosa en ratones y se mide periódicamente su concentración en plasma en función del tiempo, por ejemplo de 3 minutos a 72 horas después de la inyección. La curva de depuración obtenida de este modo debe ser bifásica, es decir, una fase alfa y una fase beta. Para la determinación de la vida media in vivo de la proteína, se calcula la tasa de depuración en la fase beta y se compara con la de la proteína de tipo salvaje o no modificada.

Eficacia terapéutica

La eficacia de un compuesto para tratar la lesión por isquemia-reperfusión puede evaluarse usando un ensayo in vivo. Por ejemplo, usando un modelo de ratón como se describe en Bohl et al, Am J Physiol Heart Circ Physiol (2009), Hartsock et al., J Vis Exp (2016), Greenberg et al., Methods Enzymol (2008) o Zhang et al., The FASEB Journal (2016).

Composiciones

En algunos ejemplos, un compuesto de la invención puede administrarse por vía oral, parenteral, por espray de inhalación, adsorción, absorción, vía tópica, rectal, nasal, bucal, vaginal, intraventricular, a través de un depósito implantado en formulaciones de dosificación que contienen portadores farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales, o mediante cualquier otra forma de dosificación conveniente. El término "parenteral", como se usa en la presente, incluye técnicas de infusión o inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intratecal, intraventricular, intrastemal e intracraneal.

Los métodos para preparar un compuesto en una forma adecuada para su administración (por ejemplo, una composición farmacéutica) son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, métodos como los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences (18a ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990) y la U.S. Pharmacopeia: National Formulary (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1984).

Las composiciones farmacéuticas de esta invención son particularmente útiles para la administración parenteral, como la administración intravenosa o la administración subcutánea o la administración en una cavidad corporal o luz de un órgano o articulación. Las composiciones para administración comprenderán comúnmente una solución del compuesto que inhibe la señalización de G-CSF disuelta en un portador farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, un portador acuoso. Pueden usarse una variedad de portadores acuosos, por ejemplo, solución salina tamponada y similares. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según se requiera para aproximarse a las condiciones fisiológicas como agentes tamponadores y reguladores del pH, agentes reguladores de la toxicidad y similares, por ejemplo, acetato sódico, cloruro sódico, cloruro potásico, cloruro cálcico, lactato sódico y similares. La concentración del compuesto de la presente invención en estas formulaciones puede variar ampliamente y se seleccionará principalmente en base a los volúmenes de fluido, viscosidades, peso corporal y similares de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado y las necesidades del paciente. Los portadores ejemplares incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina de suero humano al 5%. También pueden usarse vehículos no acuosos como aceites mixtos y oleato de etilo. También pueden usarse liposomas como portadores. Los vehículos pueden contener cantidades menores de aditivos que mejoran la isotonicidad y la estabilidad química, por ejemplo, tampones y conservantes.

Tras la formulación, los compuestos de la presente invención se administrarán de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que sea terapéuticamente/profilácticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación, como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente, pero también se contemplan otras formas farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas u otros sólidos para administración oral, supositorios, pesarios, soluciones nasales. o espráis, aerosoles, inhalantes, formas liposomales y similares. También pueden usarse cápsulas o composiciones farmacéuticas de "liberación lenta". Las formulaciones de liberación lenta generalmente se diseñan para proporcionar un nivel de fármaco constante durante un período prolongado y pueden usarse para administrar los compuestos de la presente divulgación.

La WO2002/080967 describe composiciones y métodos para administrar composiciones en aerosol que comprenden anticuerpos para el tratamiento de, por ejemplo, asma, que también son adecuados para la administración de una proteína de la presente invención.

Terapias de combinación

En un ejemplo, un compuesto de la presente invención se administra en combinación con otro compuesto útil para tratar una enfermedad o afección descrita en la presente, ya sea como pasos de tratamiento combinados o adicionales o como componentes adicionales de una formulación terapéutica.

Por ejemplo, el otro compuesto es un compuesto antiinflamatorio. Alternativamente, o adicionalmente, el otro compuesto es un inmunosupresor. Alternativamente, o adicionalmente, el otro compuesto es un corticosteroide, como prednisona y/o prednisolona. Alternativamente, o adicionalmente, el otro compuesto es metotrexato. Alternativamente, o adicionalmente, el otro compuesto es ciclofosfamida. Alternativamente, o adicionalmente, el otro compuesto es micofenolato de mofetilo. Alternativamente, o adicionalmente, el otro compuesto es el activador del plasminógeno tisular (t-PA).

En algunos ejemplos, el otro compuesto inhibe o reduce la expresión o actividad de uno o más de:

(i) molécula de lesión renal 1 (KIM-1);

(ii) lipocalina asociada a gelatinasa de neutrófilos (NGAL);

(iii) interleucina 1 beta (IL-1 p);

(iv) interleucina 6 (IL-6);

(v) factor de necrosis tumoral alfa (TNFa);

(vi) receptor 1 del componente 5a del complemento (C5AR1);

(vii) proteína inflamatoria de macrófagos 2-alfa (MIP2-alfa);

(viii) Molécula de Adhesión Intercelular 1 (ICAM-1);

(ix) E-selectina;

(x) ligando 1 de quimiocina con motivo C-X-C (CXCL1);

(xi) receptor beta de interleucina 8 (IL-8Rp); y

(xii) proteína 1 quimioatrayente de monocitos (MCP-1).

En algunos ejemplos, el otro compuesto es sulfuro de hidrógeno. En algunos ejemplos, el otro compuesto es ciclosporina. En algunos ejemplos, el otro compuesto es TR040303, como se describe en Le Lamer et al., J Transl Med (2014). En algunos ejemplos, el otro compuesto es superóxido dismutasa. En algunos ejemplos, el otro compuesto es un cannabinoide o un análogo sintético del mismo.

En algunos ejemplos, el otro compuesto es uno que se usa comúnmente en la cirugía de trasplante.

En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra simultáneamente con el otro compuesto. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra antes que el otro compuesto. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra después del otro compuesto.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en combinación con una célula. En algunos ejemplos, la célula es una célula madre, como una célula madre mesenquimal.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra en combinación con una terapia génica.

Dosificación y cadencia de administración

Las dosificaciones adecuadas de los compuestos de la presente invención variarán dependiendo del compuesto específico, la afección a tratar y/o el sujeto que se está tratando. Está dentro de la capacidad de un médico experto determinar una dosificación adecuada, por ejemplo, comenzando con una dosificación subóptima y modificando gradualmente la dosificación para determinar una dosificación óptima o útil. Alternativamente, para determinar una dosificación apropiada para el tratamiento/profilaxis, se usan datos de ensayos de cultivos celulares o estudios en animales, en donde una dosis adecuada está dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED⁵⁰ del compuesto activo con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Una dosis terapéutica/profilácticamente eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos de cultivos celulares. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración en plasma circulante que incluya la IC⁵⁰ (es decir, la concentración del compuesto que logra una inhibición de los síntomas medio máxima) según se determina en cultivo celular. Dicha información puede usarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra sistémicamente. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra localmente.

Los expertos en la técnica apreciarán que para prevenir o tratar la lesión por isquemia-reperfusión en un sujeto, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF no se administra necesariamente directamente al sujeto. Por ejemplo, el compuesto puede administrarse a un donante de órganos o a un órgano (por ejemplo, un órgano extraído) antes del trasplante al sujeto, lo que reduce de este modo los efectos de la lesión por isquemia-reperfusión resultante en el sujeto después del trasplante. Por tanto, la lesión por isquemia-reperfusión en un sujeto puede tratarse sin administrar directamente al sujeto el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF.

En algunos ejemplos, se administra al sujeto el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF. En algunos ejemplos, el sujeto es un receptor de trasplante de órganos.

En algunos ejemplos, un método de la presente invención comprende administrar una cantidad profiláctica o terapéuticamente eficaz del compuesto descrito en la presente.

El término "cantidad terapéuticamente eficaz" es la cantidad que, cuando se administra, mejora el pronóstico y/o el estado del sujeto y/o que reduce o inhibe uno o más síntomas de una afección clínica descrita en la presente a un nivel que está por debajo del observado y aceptado como clínicamente diagnóstico o clínicamente característico de esa afección. La cantidad a administrar dependerá de las características particulares de la afección a tratar, el tipo y estadio de la afección a tratar, el modo de administración y las características del sujeto, como la salud general, otras enfermedades, edad, sexo, genotipo y peso corporal. Un experto en la técnica podrá determinar las dosificaciones apropiadas dependiendo de estos y otros factores. Por consiguiente, no debe interpretarse que este término limita la presente divulgación a una cantidad específica, por ejemplo, peso o cantidad de compuesto, sino que la presente divulgación abarca cualquier cantidad del compuesto que inhiba la señalización de G-CSF lo suficiente como para lograr el resultado indicado en un sujeto. En un ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto que inhibe la señalización de G-CSF no induce neutropenia.

Como se usa en la presente, el término "cantidad profilácticamente eficaz" significará una cantidad suficiente de un compuesto para prevenir, inhibir o retrasar la aparición de uno o más síntomas detectables de una afección clínica. El experto en la técnica sabrá que tal cantidad variará dependiendo, por ejemplo, del compuesto específico administrado y/o del sujeto particular y/o del tipo o gravedad o nivel de la afección y/o la predisposición (genética o de otro tipo) a la afección. Por consiguiente, no debe interpretarse que este término limita la presente invención a una cantidad específica, por ejemplo, peso o cantidad de compuesto, sino que la presente divulgación abarca cualquier cantidad del compuesto que inhiba la señalización de G-CSF lo suficiente como para lograr el resultado indicado en un sujeto. En un ejemplo, una cantidad profilácticamente eficaz del compuesto que inhibe la señalización de G-CSF no induce neutropenia.

Para la administración in vivo de los compuestos descritos en la presente, las cantidades de dosificación normales pueden variar de aproximadamente 10 ng/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg del peso corporal de un individuo o más por día. Las dosificaciones ejemplares y los intervalos de las mismas se describen en la presente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la gravedad de la enfermedad o trastorno a tratar, el tratamiento puede mantenerse hasta que se logre la supresión deseada de los síntomas.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis inicial (o de carga) de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 30 mg/kg, como de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg, o de aproximadamente 2 mg/kg a 8 mg/kg, o de aproximadamente 4 mg/kg a 6 mg/kg. El compuesto que inhibe la señalización de G-CSF puede administrarse luego a una dosis de mantenimiento más baja de entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 5 mg/kg, como de aproximadamente 0,05 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, por ejemplo, de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg, como aproximadamente 0,1 mg/kg o 0,5 mg/kg o 1 mg/kg o 2 mg/kg o 3 mg/kg o 4 mg/kg o 5 mg/kg. Las dosis de mantenimiento pueden administrarse cada 7-30 días, como cada 10-15 días, por ejemplo, cada 10 u 11 o 12 o 13 o 14 o 15 días. A este respecto, puede usarse una dosis de mantenimiento para mantener un nivel terapéuticamente eficaz del compuesto en la sangre del sujeto durante un período de tiempo, por ejemplo, después de una cirugía de trasplante de órganos.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 1 mg/kg. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de entre aproximadamente 0,4 mg/kg y aproximadamente 0,5 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 0,1 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 0,2 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 0,3 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 0,4 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 0,6 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 0,7 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 0,8 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 1 mg/kg.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de entre aproximadamente 0,01 mg/kg y aproximadamente 50 mg/kg, como entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 40 mg/kg, por ejemplo, entre aproximadamente 2 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg, por ejemplo, entre aproximadamente 5 mg/kg y aproximadamente 25 mg/kg.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de entre aproximadamente 2 mg/kg y aproximadamente 8 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de entre aproximadamente 4 mg/kg y aproximadamente 6 mg/kg.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de entre aproximadamente 10 mg/kg y aproximadamente 40 mg/kg. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de entre aproximadamente 20 mg/kg y aproximadamente 30 mg/kg.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 5 mg/kg. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 10 mg/kg. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a una dosis de aproximadamente 25 mg/kg.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra sin una dosis de carga más alta o una dosis de mantenimiento más baja.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra como una dosis única.

En algunos ejemplos, se administran numerosas dosis, por ejemplo, cada 7-30 días, como cada 10-22 días, por ejemplo, cada 10-15 días, por ejemplo, cada 10 o 11 o 12 o 13 o 14 o 15 o 16 o 17 o 18 o 19 o 20 o 21 o 22 días. Por ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra cada 7 días o cada 14 días o cada 21 días.

En algunos ejemplos, en el momento de comenzar la terapia, se administra al mamífero el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF durante no más de 7 días consecutivos o 6 días consecutivos o 5 días consecutivos o 4 días consecutivos.

En el caso de un mamífero que no responda adecuadamente al tratamiento, pueden administrarse múltiples dosis en una semana. Alternativamente, o además, pueden administrarse dosis crecientes.

En otro ejemplo, para los mamíferos que experimentan una reacción adversa, la dosis inicial (o de carga) puede dividirse durante numerosos días en una semana o durante numerosos días consecutivos.

La administración de un compuesto de la presente invención puede ser continua o intermitente dependiendo, por ejemplo, de la condición fisiológica del receptor, si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico y otros factores conocidos por los practicantes expertos. La administración de un compuesto puede ser esencialmente continua durante un período de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis espaciadas, por ejemplo, durante o después del desarrollo de una afección.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra antes de una isquemia. Por tanto, en algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra entre 0 días (por ejemplo, inmediatamente antes de la isquemia) y 7 días antes de la isquemia. Por ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra entre 0 días y 6 días o 5 días o 4 días antes de la isquemia. Por ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra entre 0 y 48 horas antes de la isquemia. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra entre 12 y 36 horas antes de la isquemia. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra aproximadamente 24 horas antes de la isquemia. En otros ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra después de la isquemia. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra antes y después de la isquemia. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra durante la isquemia, por ejemplo, durante la cirugía de trasplante de órganos o tejidos.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra por lo menos 1 hora antes de la isquemia (por ejemplo, hasta 7 días o más antes de la isquemia). En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra por lo menos 2 o por lo menos 4 o por lo menos 6 o por lo menos 8 o por lo menos 10 o por lo menos 12 horas o por lo menos 14 horas o por lo menos 16 horas o por lo menos por lo menos 18 horas o por lo menos 20 horas o por lo menos 22 horas o por lo menos 24 horas antes de la isquemia.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra antes de la reperfusión. Por tanto, en algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra entre 0 días (por ejemplo, inmediatamente en la reperfusión) y 7 días antes de la reperfusión. Por ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra entre 0 días y 6 días o 5 días o 4 días antes de la reperfusión. Por ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra entre 0 y 48 horas antes de la reperfusión. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra entre 12 y 36 horas antes de la reperfusión. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra aproximadamente 24 horas antes de la reperfusión. En otros ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra después de la reperfusión. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra antes y después de la reperfusión.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra por lo menos 1 hora antes de la reperfusión. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra por lo menos 2 o por lo menos 4 o por lo menos 6 o por lo menos 8 o por lo menos 10 o por lo menos 12 horas o por lo menos 14 horas o por lo menos 16 horas o por lo menos 18 horas o por lo menos 20 horas o por lo menos 22 horas o por lo menos 24 horas (por ejemplo, hasta 7 días o más) antes de la reperfusión.

Trasplante de tejido u órganos

Cuando la lesión por isquemia-reperfusión se debe o está asociada con el trasplante de tejido u órganos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF puede administrarse antes, durante o después del trasplante. Por tanto, en algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra antes del trasplante. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra durante el trasplante, por ejemplo, antes de la liberación de la pinza, en cuyo momento se restablece el flujo sanguíneo al órgano trasplantado. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra después del trasplante.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra al sujeto, en donde el sujeto es un receptor de trasplante de tejido u órgano. En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra al receptor del trasplante de tejido u órgano antes de la reperfusión. En un ejemplo, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra al receptor del trasplante de tejido u órgano después de la reperfusión.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra al donante de trasplante de tejido u órgano antes de la extracción de tejido u órgano.

En algunos ejemplos, el donante del trasplante de tejido u órgano es un donante vivo. En algunos ejemplos, el donante es un donante fallecido. Los donantes fallecidos pueden clasificarse en varios grupos dependiendo de la calidad del órgano y/o la secuencia y mecanismos de cese de las funciones circulatorias y respiratorias. La clasificación de donantes fallecidos se describe en Panduranga & Akinlolu (Clin J Am Soc Nephrol 4:1827-1831, 200).

En algunos ejemplos, el donante es un donante después de la muerte cerebral (DBD), también denominado donante con "muerte cerebral". Un donante DBD es un donante que ha tenido muerte cerebral primaria pero cuyo sistema circulatorio permanece funcional, ya sea de manera natural o por medidas médicas (por ejemplo, ventilación mecánica, fármacos, bomba de balón intraaórtico o dispositivo de oxigenación mecánica extracorpóreo). En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra al donante DBD antes de la extracción de órganos y se distribuye a los órganos de trasplante potenciales mediante la circulación sanguínea.

En algunos ejemplos, el donante es un donante de donación después de la muerte circulatoria (DCD), también denominado donante de 'donación después de la muerte cardíaca' o 'donante sin corazón latiendo'. Un donante DCD es un donante cuya función circulatoria se ha perdido (por ejemplo, muerte cardíaca) antes de la extracción del órgano. En algunos ejemplos, puede ser necesaria la circulación artificial como mediante instrumentos de derivación de corazón-pulmón para administrar el compuesto administrado al donante DCD al órgano u órganos contemplados para la extracción y el trasplante. Los donantes DCD pueden clasificarse en subgrupos adicionales. En algunos ejemplos, el donante DCD es un donante DCD controlado (cDCD). Un donante cDCD es un donante cuyo soporte vital será retirado y cuya familia ha dado su consentimiento por escrito para la donación de órganos en el ambiente controlado del quirófano. En algunos ejemplos, el donante DCD es un donante DCD no controlado (uDCD). Un donante uDCD es un donante, por ejemplo, que muere en la sala de emergencias o en otro lugar del hospital antes de que se obtenga el consentimiento para la donación de órganos y se colocan catéteres en los vasos femorales y el peritoneo para enfriar los órganos hasta que pueda obtenerse el consentimiento. Un donante uDCD también es un donante que ha dado su consentimiento para la donación de órganos pero sufre un paro cardíaco que requiere RCP durante la obtención de los órganos.

En algunos ejemplos, el donante es un donante de criterios ampliados (ECD). Un ECD es un donante que, en el momento de la muerte, tiene 60 años o más o tiene entre 50 y 59 años y tiene dos de los tres criterios siguientes: (1) la causa de la muerte es un accidente cerebrovascular; (2) antecedentes preexistentes de hipertensión sistémica; y (3) creatinina en suero terminal de más de 1,5 mg/dl.

En algunos ejemplos, el donante es un donante de criterios estándar (SCD). Un SCD es un donante que tiene menos de 50 años de edad. En general, todos los donantes fallecidos cuya donación se produjo después de la muerte cerebral y que no cumplen ninguno de los criterios para un ECD (ver arriba) se consideran SCD.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra poco después de la determinación de la muerte cerebral, o tan pronto como sea factible después de la muerte cerebral dadas las consideraciones legales, éticas y del paciente. El médico o el cirujano de trasplante responsable reconocerá una multiplicidad de factores que influyen en el momento de la extracción de órganos de un donante adecuado y el trasplante de los órganos extraídos a un receptor adecuado. Por tanto, en algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra al donante en cualquier momento entre la aparición de la muerte cerebral y la extracción de un órgano previsto para el trasplante.

En algunos ejemplos, el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a un tejido u órgano extraído ex vivo, antes del trasplante de tejido u órgano. Por ejemplo, el tejido u órgano extraído puede perfundirse o infundirse con una solución que comprende el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF antes del trasplante. Kits

A continuación se describen kits que contienen compuestos útiles para el tratamiento de lesiones por isquemia-reperfusión.

En un ejemplo, el kit comprende (a) un recipiente que comprende un compuesto que inhibe la señalización de G-CSF como se describe en la presente, opcionalmente en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable; y (b) un prospecto con instrucciones para reducir un efecto de lesión por isquemia-reperfusión en un sujeto.

De acuerdo con este ejemplo, el prospecto está sobre o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringuillas, etc. Los recipientes pueden estar formados por una variedad de materiales, como vidrio o plástico. El recipiente sostiene o contiene una composición que es eficaz para tratar la lesión por isquemia-reperfusión y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial con un tapón perforable con una aguja de inyección hipodérmica). Por lo menos un agente activo en la composición es el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF que inhibe la señalización de G-CSF. La etiqueta o el prospecto indica que la composición se usa para tratar a un sujeto elegible para el tratamiento, por ejemplo, un receptor de trasplante de órganos, con orientación específica referente a las cantidades de dosificación y los intervalos del compuesto y cualquier otro medicamento que se esté proporcionando. El kit puede comprender además un recipiente adicional que comprenda un tampón diluyente farmacéuticamente aceptable, como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y/o solución de dextrosa. El kit puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringuillas.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Métodos y materiales

Ratones

Se obtuvieron ratones de tipo salvaje C57BL/6 macho adultos de 10 a 12 semanas de edad del Animal Resource Centre, Perth, Australia. Los ratones se alojaron en una instalación para animales aprobada dentro del St. Vincent's Hospital Melbourne, y todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética Animal del St. Vincent's Hospital Melbourne.

Modelo de lesión por isquemia-reperfusión renal caliente

Los ratones se anestesiaron mediante la administración i.p. de 85 mg/kg de ketamina y 15 mg/kg de xilazina. Después de anestesiar a los ratones, se colocaron sobre una almohadilla térmica para mantener su temperatura corporal central a 37° C durante la cirugía. Se realizó una incisión abdominal en la línea media y los pedículos renales se disecaron de forma roma. Después de la nefrectomía derecha, se colocó una pinza microvascular (Roboz, Rockville, MD) en el pedículo renal izquierdo durante 22 min, mientras que el animal se mantuvo a 37° C en una incubadora y bien hidratado. Se retiró la pinza después de la isquemia y se observó el riñón para confirmar la reperfusión completa. A continuación, las heridas quirúrgicas se suturaron en dos capas con seda 5-0. Se instiló solución salina normal tibia (100 ml/kg) en la cavidad peritoneal durante el procedimiento. Se permitió que los ratones se recuperaran durante 2 h bajo una lámpara de calor y luego se mantuvieron sobre una almohadilla térmica. Los ratones se sacrificaron 24 h después de la reperfusión y se obtuvieron muestras de sangre y riñón. Los ratones operados de manera simulada solo tenían nefrectomía derecha, sin IR.

Anticuerpos

Se inyectaron anticuerpo anti-G-CSFR de ratón (Ch5E2-VR8l-mIgG1 k), control de isotipo (BM4, isotipo de ratón IgG1 k) o anti-C5 (muBB5.1-mIgG1K) (Rother R, el al. Nat Biotechnol. 2007) en 100 pg/ratón en 0,2 ml de PBS por vía intraperitoneal 24 h antes de iniciar la isquemia. En un estudio de titulación de dosis, se inyectó anti-G-CSFR de ratón (Ch5E2-VR81-mlgG1K) a 200 mg/ratón o 500 mg/ratón en 0,2 ml de PBS por vía intraperitoneal 24 h antes de la isquemia. El control de isotipo se inyectó a la dosis más alta, 500 pg/ratón. El VR81 es un anticuerpo de IgG1 k monoclonal de ratón producido contra el dominio extracelular de G-CSFR murino y bloquea la unión de G-CSF a G-CSFR como se describe (Campbell et al. Journal of Immunology, 197(11) (2016) 4392-4402). A este respecto, VR81 es un anticuerpo sustituto de ratón para C1.2 y C1.2G descrito en la presente y en la WO2012171057.

Evaluación de la función renal

La función renal se evaluó mediante medición de la creatinina en suero y la urea en suero o plasma 24 horas después de la reperfusión. La creatinina se midió mediante un ensayo colorimétrico cinético basado en el método de Jaffe, analizado en un analizador Roche COBAS Integra 400 Plus. El kit de ensayo de urea de Cell Biolabs se basa en la reacción de Berthelot. Primero se degrada la urea en amoníaco y dióxido de carbono, que luego reacciona con un revelador alcalino para producir un producto de color azul verdoso que puede medirse con un lector de placas espectrofotométricas estándar a una densidad óptica entre 580 y 630 nm.

Histología renal y puntuación

Las secciones de tejido renal (4 mm) se fijaron con formalina al 10% y se incrustaron en parafina y luego se tiñeron con H&E. Las puntuaciones de histología se evaluaron mediante un método semicuantitativo (Lu B et al. Nephrology 2008). Brevemente, se evaluaron de manera ciega tres campos de alta potencia en cada uno de la corteza, la unión córtico-medular y la médula en un mínimo de dos secciones. Se clasificó el grado de necrosis tubular y se usó un sistema de puntuación modificado: 0 = riñón normal; 1 = mínimo (#10% de participación); 2 = leve (10-25% de afectación); 3 = moderado (26-50% de afectación); 4 = grave (51-75% de afectación); y 5 = muy grave (0,75% de afectación).

Activación y depósito del complemento

La activación del complemento en plasma de ratón se midió usando un kit ELISA DuoSet C5a de ratón (DY2150; R&D Systems, Minneapolis, MN) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El depósito de C5b-9 en secciones de riñón se midió por inmunofluorescencia (ver a continuación).

Inmunofluorescencia

Las muestras de biopsia congeladas instantáneamente se cortaron en secciones de 5 mm de espesor, se secaron al aire y o se procesaron inmediatamente o se almacenaron a 280° C hasta su posterior análisis. Después de la fijación con acetona e hidratación, las secciones se tiñeron usando: C9 Alexa 488 anti-ratón de conejo (Bioss Antibodies, Woburn, MA), Ly-6GFITC anti-ratón de rata (Hycult Bio tech), F4/80 FITC anti-ratón rata (Bio-Rad, Raleigh, NC), o Ab de control coincidente con isotipo conjugado con FITC: IgG1 de rata (BD Biosciences, San Diego, CA). Los portaobjetos se analizaron usando un microscopio de fluorescencia/confocal (Nikon A1R). La cuantificación de la intensidad de la fluorescencia como densidad integrada sin procesar se realizó usando el software ImageJ, versión 10.2 (National Institutes of Health) en imágenes TIFF no manipuladas.

Extracción de ARN, síntesis de ADN complementario y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real

Se aisló ARN total de riñones de ratón congelados usando el mini kit de ARN PureLink (Life Technologies, Carlsbad, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La calidad y la cantidad de ARN total se determinaron utilizando el espectrofotómetro NanoDrop (NanoDrop Technologies, Oxfordshire, Reino Unido). La síntesis de ADN complementario de primera cadena se realizó incubando 1,0 gg de ARN total en una mezcla de reacción de 50 gl que contenía 0,5 gg de cebadores Oligo (dT) y 1 gg de cebadores aleatorios (ambos de Invitrogen, Carlsbad, CA) a 70° C durante 10 minutos. A continuación, se añadió una mezcla de reacción de 50 gl que contenía dNTP 10 mM, inhibidor de ribonucleasa recombinante Superscript III 300 U, inhibidor de ribonucleasa recombinante RNaseOUT 60 U, DTT 0,1 M y tampón de primera cadena 5 (todos de Invitrogen). La transcripción inversa se realizó a 42° C durante 1 hora y 70° C durante 10 minutos. El ADN complementario se almacenó a -20° C. La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real se realizó usando el sistema TaqMan Universal PCR Master Mix de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystem, Bedford, MA).

Digestión renal y preparación de sangre periférica

Se cortó con un bisturí un trozo de riñón de 1/8 en trozos más pequeños, que se digirieron en 500 ul de colagenasa tipo I (10 ug/ml en EDTA 2 mM PBS) en condiciones de agitación a 37° C durante 30 min. Las células se aislaron pasando el tejido digerido a través de un filtro de 70 um. Los glóbulos rojos se lisaron usando tampón RCRB (NH4C1 156 mM, NaHCO3 11,9 mM, EDTA 0,097 mM, pH 7,3). Finalmente, las células se volvieron a suspender finalmente en EDTA 2 mM PBS.

La sangre periférica se recogió en tubos revestidos con EDTA, los glóbulos rojos se lisaron usando tampón RCRB (como antes) y las células se volvieron a suspender en EDTA 2 mM PBS.

Citometría de flujo

Se volvieron a suspender suspensiones de células individuales de riñón y sangre periférica en PBS con EDTA 2 mM. Las células se tiñeron con los siguientes Ab: anti-Gr-1 de ratón conjugado con PE (R86-8C5; BD Biosciences), Ly6G anti-ratón conjugado con aloficocianina Cy7 (1A8; BD Biosciences), CD11b anti-ratón conjugado con FITC (M1/70; BD Biosciences), CD69 anti-ratón conjugado con PECy7 (H1.2F3; B^d Biosciences), CD62L anti­ ratón conjugado con eFluor450 (MEL-14; eBiosecience), CD45.2 anti-ratón conjugado con aloficocianina (104; eBiociencias). Se añadió CD16/32 anti-ratón de bloque FcR (93; Biolegend) para reducir la unión no específica y se usó amarillo Fixable Live/Dead (Thermo Fisher Scientific) para excluir las células muertas. Las muestras se fijaron durante la noche con el tampón de fijación BD Cytofix (BD Biosciences) y luego se analizaron en un BD Fortessa usando el software FlowJo.

Análisis estadístico

Las pruebas estadísticas se realizaron usando el software GraphPad Prism. Los múltiples grupos se compararon usando ANOVA unidireccional con una corrección de Bonferroni posterior a la prueba o una prueba de Kruskal-Wallis con la prueba de comparación múltiple de Dunn. Se compararon dos grupos usando una prueba t de Student no pareada (dos colas) o una prueba U de Mann-Whitney. Los resultados se expresan como media ±SEM. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p <0,05.

Ejemplo 2: la inhibición de la señalización de G-CSF en un modelo de IRI renal caliente reduce las concentraciones de creatinina en suero y urea en plasma

Para evaluar si la inhibición de la señalización de G-CSF en ratones sometidos a lesión por isquemiareperfusión (IRI) renal caliente reduce la lesión renal, se realizó un análisis de las concentraciones de creatinina en suero y de urea en plasma/suero.

Se observó una reducción significativa en las concentraciones de creatinina en suero en ratones tratados con 100 gg de un anticuerpo anti-G-CSFR (VR81) (n=8; media ±SEM; 66,13 ± 25,18) en comparación con las concentraciones de creatinina en suero en ratones tratados con 100 gg de un anticuerpo de control de isotipo (n = 8; media ± SEM; 134,38 ± 20,57) (Figura 1, Tabla 1).

Se observó una reducción significativa en las concentraciones de urea en plasma en ratones tratados con un anticuerpo anti-G-CSFR (VR81) (n=8; media ± SEM; 159,02 ± 44,42) en comparación con un anticuerpo de control de isotipo (n=8; media ± SEM 292,49 ± 21,35) (Figura 2, Tabla 1). Las concentraciones de creatinina en suero y urea en plasma en ratones tratados con un anticuerpo anti-G-CSFR (VR81) antes de la IRI fueron comparables a las observadas en ratones no sometidos a tratamiento o cirugía (simulado) (Figuras 1 y 2; Tabla 1). Además, las concentraciones de creatinina en suero y urea en plasma en ratones tratados con VR81 no fueron estadísticamente diferentes de las observadas en ratones tratados con un anticuerpo anti-C5 (BB5.1) (Figuras 9 y 10).

Tabla 1 Niveles de creatinina en suero y urea en plasma en ratones tratados con 100 pg de anticuerpo anti-CSFR VR81 o un anticuer o de control de isoti o or vía intra eritoneal IP - modelo de IRI renal caliente

Ejemplo 3: la inhibición de la señalización de G-CSF en un modelo de IRI renal caliente reduce la infiltración inflamatoria en el tejido renal

Para evaluar el efecto de la administración del anticuerpo anti-G-CSFR (VR81) a ratones sometidos a daño por isquemia-reperfusión (IRI) renal caliente, se midió la infiltración de neutrófilos y macrófagos en el tejido renal mediante microscopía de inmunofluorescencia de acuerdo con el Ejemplo 1.

La infiltración de neutrófilos y macrófagos dentro del intersticio tubular en las uniones corticomedulares de los riñones se redujo significativamente en los ratones tratados con 100 pg de anticuerpo anti-G-CSFR (VR81) en comparación con los ratones tratados con 100 pg de un anticuerpo de control de isotipo. Se observó poca o ninguna infiltración en los ratones simulados (Figuras 3 y 4). Se usó ANOVA unidireccional (con corrección de Bonferroni) para probar la significancia.

En un experimento separado, la infiltración de neutrófilos y macrófagos también se redujo significativamente en ratones tratados con 200 pg y 500 pg de VR81 en comparación con ratones tratados con 500 pg de un anticuerpo de control de isotipo (Tabla 2 y Figura 5).

Tabla 2 Reducción de la infiltración de neutrófilos y macrófagos dentro del intersticio tubular en las uniones corticomedulares de los riñones Prueba de normalidad ómnibus de D'Agostino & Pearson. ANOVA unidireccional prueba de Kruskal-Wallis, prueba de comparación múltiple de Dunn para VR81 frente a control de Ab (*p<0,05,

** <001.

Ejemplo 4: la inhibición de la señalización de G-CSF en un modelo de IRI renal caliente reduce la necrosis en la corteza renal

Se evaluó el daño renal en la corteza renal en el modelo de IRI renal caliente en ratones tratados con 100 |jg de un anticuerpo anti-G-CSFR (VR81). El grado de necrosis tubular se calificó y expresó como una puntuación de lesión tubular (TI) de acuerdo con la Tabla 3. La TI se determinó sin conocimiento del grupo de tratamiento por dos operadores independientes que evaluaron el porcentaje de afectación de la lesión tubular renal (necrosis, formación de costras, hinchazón celular y dilatación).

Se observó una tendencia de lesión tubular reducida en los riñones de los ratones tratados con el anticuerpo anti-G-CSFR (VR81) (Figura 6; se muestra la media de dos evaluaciones independientes por ratón). Los ratones simulados no mostraron lesiones tubulares como se esperaba.

Tabla 3 : Tabla de referencia que define el porcentaje de células necróticas en la corteza renal y la puntuación de lesión tubular TI corres ondiente.

Ejemplo 5: expresión de ARNm de KIM-1, NGAL, IL-6, IL-8Rp/CXCR2, MCP-1/CCL2, CXCL1, MIP-2/CXCL2, ICAM-1 y C5aR en tejido renal - modelo de IRI renal caliente

En un experimento inicial, se inyectó a los ratones 100 jg/ratón del anticuerpo anti-G-CSFR VR81 24 h antes de que se indujera la lesión por isquemia/reperfusión en el modelo de IRI renal caliente. Después de la reperfusión, se aisló el ARN de los riñones y se sometió a qRT-PCR como se describe en el Ejemplo 1. Se determinaron los niveles de transcripción de ARNm de KIM-1, NGAL, IL-6, IL-8Rp/CXCR2, MCP-1/CCL2, ICAM-1, C5aR, IL-1 p, TNFa, CXCL1, MIP-2/CXCL2 y E-selectina. Los niveles de transcripción de estos genes se cuantificaron y normalizaron frente a GAPDH.

El tratamiento con anticuerpos anti-G-CSFR (VR81) a una dosificación de 100 jg/ratón 24 h redujo la expresión génica de NGAL, IL-6, IL-8Rp/CXCR2, ICAM-1, C5aR, MIP-2/CXCL2, MCP- ¹ /CCL² , E-selectina y CXCL1 en comparación con el tratamiento con el anticuerpo de control de isotipo. Estos datos sugieren que la inhibición de la señalización de G-CSF es eficaz para reducir la respuesta inflamatoria asociada con IRI. Se observó un patrón similar de expresión reducida de los genes anteriores en los riñones de ratones tratados con anticuerpo anti-C5 (BB5.1).

Los resultados iniciales se confirmaron usando una dosis de 200 jg/ratón o 500 jg/ratón de VR81. La Tabla 4 y la Figura 7 muestran que el tratamiento con VR81 a una dosificación de 500 jg/ratón redujo significativamente la expresión de KIM-1, NGAL, IL-6, IL-8Rp/CXCR2, ICAM-1, C5aR, MIP-2/CXCL2, MCP-1/CCL2 y CXCL1 en comparación con el tratamiento con el anticuerpo de control de isotipo.

Tabla 4 : Expresión relativa de receptores de quimiocinas y citoquinas en tejido renal de ratones que recibieron dosis de 200 pg o 500 pg de VR81. Prueba de normalidad ómnibus de D'Agostino & Pearson. ANOVA unidireccional Prueba de Kruskal-Wallis, prueba de comparación múltiple de Dunn para VR81 frente a control Ab

* < ** < *** <

Ejemplo 6: la inhibición de la señalización de G-CSF reduce la infiltración de neutrófilos en el riñón en un modelo de IRI renal caliente

Los neutrófilos renales (CD11b+Gr1+) y los leucocitos (CD11b-Gr1-CD45.2+) se enumeraron mediante digestión tisular y citometría de flujo de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1. El porcentaje de células vivas se determinó en base a la tinción con PI del total poblaciones celulares.

Se observó una cantidad reducida de neutrófilos en los riñones de los ratones tratados con 100 pg/ratón de un anticuerpo anti-GCSFR (VR81) o un anticuerpo anti-C5 (BB5.1) (y ratones simulados) en comparación con los ratones tratados con un anticuerpo de control de isotipo (Figura 8A). Las cantidades de neutrófilos en sangre periférica fueron similares en todos los grupos experimentales (Figura 8B).

De manera similar, se observó una reducción significativa en la cantidad de neutrófilos en los riñones de los ratones tratados con 200 pg/ratón o 500 pg/ratón de VR81 en comparación con los ratones tratados con un anticuerpo de control de isotipo (Figura 13A). Sin embargo, no se observó una reducción significativa de neutrófilos en sangre periférica, en relación con el anticuerpo de control de isotipo (Figura 13B).

Estos datos sugieren que el tratamiento con el anticuerpo anti-G-CSFR (VR81) reduce la infiltración de neutrófilos en el riñón y no tiene un impacto significativo sobre el número de neutrófilos en la sangre periférica.

No se observaron diferencias significativas en la expresión de CD69 o CD62L por parte de los neutrófilos en los riñones o la sangre periférica en todos los grupos experimentales de ratones.

No se observaron diferencias significativas en el porcentaje de leucocitos (CD11b-Gr1-CD45.2+) en los riñones de ratones tratados con anticuerpo anti-G-CSFR (VR81) o anticuerpo anti-C5 (BB5.1) en comparación con ratones tratados con un anticuerpo de control de isotipo.

Ejemplo 7: Titulación de dosis de VR81 en el modelo IRI renal cálido

En un estudio de titulación de dosis en el modelo IRI renal tibio descrito en el Ejemplo 1, se inyectó anticuerpo anti-G-CSFR de ratón (VR81) 24 h antes de la lesión por isquemia-reperfusión a una dosis de 200 pg/ratón o 500 pg/ratón. Los ratones tratados con 500 pg/ratón del anticuerpo de control de isotipo sirvieron como controles.

Hubo una reducción significativa en los niveles de creatinina en suero y urea en suero en ratones tratados con 500 pg de VR81, pero no en ratones tratados con 200 pg de VR81 o 500 pg del anticuerpo de control de isotipo como se muestra en la Tabla 5 y las Figuras 11 y 12.

Tabla 5 Niveles de creatinina en suero y urea en suero en ratones dosificados con 200 |jg y 500 |jg de VR81/ratón. Prueba de normalidad ómnibus de D'Agostino & Pearson. ANOVA unidireccional Prueba de Kruskal-Wallis, prueba m r i n m li l D nn r VR 1 fr n nr l A * < ** < 1.

Ejemplo 8: la inhibición de la señalización de G-CSF reduce la activación de C5 del complemento y el depósito de C5b-9 en un modelo de IRI renal caliente

Para evaluar el efecto de la administración del anticuerpo anti-G-CSFR (VR81) a ratones sometidos a daño por isquemia-reperfusión (IRI) renal caliente, se midió la activación de C5 del complemento analizando C5a en plasma usando un kit ELISA de C5a de ratón y se midió el depósito de C5b-9 mediante tinción por inmunofluorescencia de secciones de riñón de acuerdo con el Ejemplo 1.

Hubo una reducción significativa en los niveles de C5a en plasma en los ratones tratados con 500 jg de VR81, en comparación con los ratones tratados con 500 jg del anticuerpo de control de isotipo, como se muestra en la Tabla 6 y la Figura 14 A.

También hubo una reducción significativa en el depósito de C5b-9 en los riñones de los ratones tratados con 500 jg de VR81, en comparación con los ratones tratados con 500 jg del anticuerpo de control de isotipo como se muestra en la Tabla 6 y la Figura 14B.

Tabla 6 Activación de C5 del complemento y depósito de C5b-9 en ratones tratados con 200 jg o 500 jg de VR81

* <005 ** <002 *** <0001 frente al control de Ab.

Ejemplo 9: la administración de un inhibidor de la señalización de G-CSF 1 h antes de la isquemia reduce la frecuencia de neutrófilos en el riñón y la sangre en un modelo de IRI renal caliente

Para evaluar el efecto de la administración de anticuerpos anti-G-CSFR (VR81) a ratones 1 h antes de la isquemia en el modelo de IRI renal caliente, se midieron la frecuencia de neutrófilos (CD11b+Gr1+Ly6G+) en riñón y sangre mediante digestión tisular y citometría de flujo de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1. Se usaron 500 gg/ratón del anticuerpo anti-C5, BB5.1, para comparación.

El tratamiento con 500 jg/ratón del anticuerpo anti-G-CSFR VR81 1 h antes de la isquemia redujo significativamente la frecuencia de neutrófilos en la sangre y en el riñón en comparación con el tratamiento con un anticuerpo de control de isotipo (Figura 15). El tratamiento con 500 jg/ratón del anticuerpo de control BB5.1 no redujo significativamente la frecuencia de neutrófilos en el riñón en comparación con el tratamiento con un anticuerpo de control de isotipo. Estos resultados demuestran que el tratamiento con un inhibidor de la señalización de G-CSF 1 h antes de la isquemia, aunque no es tan eficaz como el tratamiento 24 h antes de la isquemia (Figura 13), es suficiente para reducir significativamente la cantidad de neutrófilos en la sangre y el riñón.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto que inhibe la señalización del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF) para su uso en un método para prevenir la lesión por isquemia-reperfusión en un sujeto, en donde la lesión por isquemiareperfusión se debe o está asociada con el trasplante de tejido u órganos o cirugía, y en donde el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF es una proteína que comprende una región variable de anticuerpo que se une específicamente a G-CSF o el receptor de G-CSF (G-CSFR) y neutraliza la señalización de G-CSF.

2. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el trasplante de órganos es un trasplante de riñón.

3. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en donde el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra a

a) el sujeto, en donde el sujeto es un receptor de trasplante de tejido u órgano; y/o

b) un donante de tejido u órganos antes de la extracción del órgano y/o a un tejido u órgano antes del trasplante.

4. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en donde el uso comprende: a) administrar el compuesto a un receptor de trasplante de tejido u órgano antes o en el momento del trasplante de tejido u órgano y luego trasplantar el tejido u órgano al receptor del trasplante de tejido u órgano;

b) administrar el compuesto a un donante de trasplante de tejido u órgano antes de la extracción del tejido u órgano; extraer el tejido u órgano y trasplantar el tejido u órgano al receptor del trasplante de tejido u órgano; o c) administrar el compuesto a un tejido u órgano extraído ex vivo y trasplantar el tejido u órgano extraído al receptor del trasplante de tejido u órgano.

5. El compuesto para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4, en donde el compuesto se administra al sujeto antes o durante el trasplante y luego se administran una o más dosis adicionales al receptor después del trasplante.

6. El compuesto para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra antes de la isquemia o reperfusión.

7. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF se administra entre 0 y 48 horas antes de la isquemia o reperfusión.

8. El compuesto para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el compuesto que inhibe la señalización de G-CSF es una proteína que comprende un Fv.

9. El compuesto para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la proteína se selecciona del grupo que consiste en:

(i) un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv);

(ii) un scFv dimérico (di-scFv);

(iii) un diacuerpo;

(iv) un tricuerpo;

(v) un tetracuerpo;

(vi) un Fab;

(vii) un F(ab')² ;

(viii) un Fv;

(ix) uno de (i) a (viii) enlazado a una región constante de un anticuerpo, Fc o un dominio constante de cadena pesada (CH) 2 y/o CH3;

(x) uno de (i) a (viii) enlazado a albúmina, un fragmento funcional o variantes del mismo o una proteína que se une a la albúmina; y

(xi) un anticuerpo.

10. El compuesto para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la proteína es un anticuerpo que comprende

(i) una región variable de cadena pesada (V^h) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 4 y una región variable de cadena ligera (V^l) que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 5; o

(ii) una V^h que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2 y una V^l que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3.

11. El compuesto para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la proteína es un anticuerpo que comprende

(i) una VH que comprende:

(a) una región determinante de la complementariedad (CDR) 1 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 6; (b) una CDR2 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 7; y

(c) una CDR3 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 8; y

(ii) una V^l que comprende:

(a) una CDR1 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 9;

(b) una CDR2 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 10; y

(c) una CDR3 que tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 11.