CN116096751A - 三特异性t细胞接合器 - Google Patents

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Abstract

提供了三特异性T细胞接合器或TSMAb’，即能够同时接合同一靶点或不同靶点上三种不同类型表位的抗体。更具体地，本发明针对结合DLL3、MUC17或CLDN18.2并激活CD(分化簇)分子(例如CD3、CD28和CD137)的三特异性分子。还提供了一种治疗疾病(如癌症)的方法，所述方法使用抗DLL3、MUC17或CLD18的抗体(或片段，其配有激活CD3、CD28和/或CD137的激动剂抗体的抗体(或片段)。

Description

三特异性T细胞接合器
相关申请
本申请要求于2020年1月31日提交的美国临时专利申请号62/968,999、于2020年2月25日提交的美国临时专利申请号62/981,048和于2020年3月17日提交的美国临时专利申请号62/991,070的优先权。上述申请的内容通过引用并入本文。
序列表参考
本申请包含一份以ASCII格式电子方式提交的序列表，在此通过引用将其全部并入本文。该ASCII副本创建于2021年2月1日，命名为GB1-003US_SL.txt，大小为1,131,402字节。
发明领域
本发明总体上涉及癌症治疗，更具体地，涉及一种包含抗DLL3、CLDN18.2和Muc17的抗体或其免疫反应片段的新化合物，所述新化合物用于癌症治疗。
背景技术
癌症通常被定义为一组涉及异常细胞生长的疾病，其有可能侵犯或扩散至身体其他部位。2019年，在美国约180万人被诊断患有癌症。在美国每年估计有606,880人死于癌症。肺和支气管癌导致的死亡最多。结直肠癌和胰腺癌分别是癌症死亡的第二和第三大常见原因。
癌症与多种因素有关，包括吸烟、肥胖、饮食不良、缺乏体育活动和过度饮酒。其他因素包括某些感染、电离辐射暴露和环境污染物。某些癌症与感染有关，如幽门螺旋杆菌、乙型肝炎、丙型肝炎、人乳头瘤病毒感染、EB病毒和人类免疫缺陷病毒(HIV)。
传统癌症治疗的目的是去除癌组织并预防其扩散。这些治疗方案包括手术、化疗、放疗、激素治疗、靶向治疗和姑息护理。通常根据癌症的种类、部位和级别以及患者的健康状况和偏好进行治疗。这些选择有局限性。特别是当癌症已经转移时，它们可能没有效果。此外，化疗和放疗有一系列与细胞毒性相关的副作用。
因为癌细胞比大多数正常细胞分裂更快，所以它们可以对化疗药物敏感。然而，化疗药物也会攻击身体中的其他细胞，特别是快速分裂的细胞，如血细胞和口腔、胃及肠中的细胞。因此，需要改进治疗癌症的药物和方法，使其更有针对性并且副作用更少。
一个有希望的治疗发展领域包括使用抗体的靶向治疗。例如，抗体药物偶联物的使用可用于将药物靶向肿瘤。免疫偶联物是与第二分子偶联的抗体，所述第二分子通常是毒素、放射性同位素或标记物。免疫偶联物可在肿瘤内提供相对高浓度的药物，但全身给药非偶联的(即非靶向的)药物以达到相同的肿瘤浓度可能导致对正常细胞的毒性水平。
另一个有希望的治疗发展领域是利用免疫系统攻击和杀死肿瘤细胞。检查点抑制剂，如抗CTLA4、抗PD1和抗PDL1疗法，已经改变了癌症的治疗方式。类似地，双特异性T细胞接合器或CAR-T工程化T细胞对细胞毒性T细胞的直接激活已经在许多类型的癌症中带来了前所未有的治疗方法。
δ样配体3(DLL3)是一种抑制性notch配体，其在正常组织中表达水平相对较低。其在小细胞肺癌(SCLC)和其他神经内分泌肿瘤中高水平表达，从而为癌症诊断和治疗提供潜在的治疗靶点。
粘蛋白17(Mucin 17)，也称为MUC17，是由20多个成员组成的粘蛋白家族的成员之一。粘蛋白是一种大型、高度糖基化的膜结合蛋白。它们通常在粘膜区域发挥作用，以保护上皮细胞不受环境影响，并调控细胞的增殖和存活。MUC17在胰腺癌、阑尾癌和一些结肠癌中表达，因此是这些癌症的靶抗原。因此，MUC17是靶向治疗(如抗体药物偶联物、T细胞接合器和CAR-T细胞)的候选靶点。
紧密连接蛋白18(Claudin-18,CLDN18)是一种由CLDN18基因编码的人蛋白质。其属于紧密连接蛋白组，一个在上皮细胞中形成紧密细胞连接链成分的蛋白质家族。研究表明，胃肿瘤中存在大量亚型2(Claudin 18.2或CLDN18.2)。其具有暴露的细胞外茎环，可用于单克隆抗体结合。这些生物学特性导致了抗claudin 18.2的单克隆抗体的发展，如克罗地沙单抗(claudiximab)(IMAB362)。
CD3、CD28和CD137是T细胞上的受体。T细胞可以通过CD3、CD28和CD137被抗原提呈细胞分别利用激活信号MHC I类和II类、CD80和CD86以及4-1BBL激活。CD3是T细胞受体(TCR)的一部分，是受体的信号传导成分。CD3有三个亚单位，ε、δ和γ。ε与δ及ζ均相关，其共同负责信号传导。CD3信号传导被认为是激活T细胞所需的信号1。共受体CD28和CD137被认为是信号2。信号1和信号2都是T细胞充分激活、增殖和存活所必需的。
本发明公开了三特异性T细胞接合器。三特异性和三特异性分子可结合DLL3、MUC17和/或CLDN18.2并激活CD(分化簇)分子(例如CD3、CD28和CD137)。还提供了使用抗体和抗体偶联物、其药物组合物和制品治疗疾病(例如癌症)的方法。
发明概述
本文描述和要求保护的本发明具有诸多特征和实施例，包括但不限于本发明概述中阐述或描述或引用的特征和实施例。本文描述和要求保护的发明不限于或不受本发明概述中定义的特征或实施例的限制，本发明概述仅用于说明而非限制。
本发明的一个方面是一种抗DLL3的抗体。所述抗体可以是片段，例如抗原结合片段(Fab)或单链可变片段(Scfv)。
本发明的一个方面是一种激活CD3、CD28和/或CD137的激动剂抗体。
本发明的一个方面是一种双特异性或三特异性分子，其包括抗DLL3的抗体(或片段)，其配有激活CD3、CD28或CD137的激动剂抗体的抗体(或片段)。
本发明的一个方面是一种治疗疾病(如癌症)的方法，所述方法使用抗DLL3的抗体(或片段)，其配有激活CD3、CD28或CD137的激动剂抗体的抗体(或片段)。
本发明的一个方面是一种治疗疾病的方法，其相互结合使用两个或多个本文所述的三特异性分子。
本发明的一个方面是一种治疗疾病的方法，其相互结合使用本文所述的一个双特异性和一个三特异性分子。
本发明的一个方面是一种治疗疾病的方法，其相互结合使用两个或多个本文所述的三特异性分子。
本发明的一个方面是一种激活T细胞对表达DLL3的细胞的细胞毒性的方法。
本发明的一个方面是一种激活T细胞的细胞毒性的方法，所述方法使用双特异性分子，所述双特异性分子包括抗DLL3的抗体(或片段)，其配有激活CD3、CD28或CD137的激动剂抗体的抗体(或片段)。
本发明的一个方面是一种结合人DLL3蛋白的人源化抗体，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域与SEQ ID NO:56-74或75具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的序列同一性。
所公开的方法可使用任何DLL3抗体，包括例如，含有氨基酸序列如SEQ ID NO:1-27或29所示的三个重链可变区CDR的抗DLL3抗体。
本发明的一个方面是一种结合人DLL3蛋白的人源化抗体，其包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域与SEQ ID NO:76-90或91具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的序列同一性。
所公开的方法可使用任何DLL3抗体，包括例如，含有氨基酸序列如SEQ ID NO:32-54或55所示的三个轻链可变区CDR的抗DLL3抗体。
本发明的一个方面是一种抗MUC17的抗体。所述抗体可以是片段，例如抗原结合片段(Fab)或单链可变片段(Scfv)。
本发明的一个方面是一种激活CD3、CD28和/或CD137的激动剂抗体。
本发明的一个方面是一种双特异性或三特异性分子，其包括抗MUC17的抗体(或片段)，其配有激活CD3、CD28或CD137的激动剂抗体的抗体(或片段)。
本发明的一个方面是一种治疗疾病(如癌症)的方法，所述方法使用抗MUC17的抗体(或片段)，其配有激活CD3、CD28或CD137的激动剂抗体的抗体(或片段)。
本发明的一个方面是一种治疗疾病的方法，其相互结合使用两个或多个本文所述的双特异性或三特异性分子。
本发明的一个方面是一种激活T细胞对表达MUC17的细胞的细胞毒性的方法。
本发明的一个方面是一种激活T细胞的细胞毒性的方法，所述方法使用双特异性分子或三特异性分子，其包括抗MUC17的抗体(或片段)，其配有激活CD3、CD28或CD137的激动剂抗体的抗体(或片段)。
本发明的一个方面是一种结合人MUC17蛋白的人源化抗体，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域与SEQ ID NO:127-245或246具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的序列同一性。
所公开的方法可使用任何MUC17抗体，包括例如，含有氨基酸序列如SEQ ID NO:92-111或112所示的三个重链可变区CDR的抗MUC17抗体。
所公开的方法可使用任何MUC17抗体，包括例如，含有氨基酸序列如SEQ ID NO:113-125或126所示的三个轻链可变区CDR的抗MUC17抗体。
本发明的一个方面是一种结合人MUC17蛋白的人源化抗体，其包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域与SEQ ID NO:147-168或169具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的序列同一性。
所公开的方法可使用任何MUC17抗体，包括例如，含有氨基酸序列如SEQ ID NO:92-111或112所示的三个重链可变区CDR的抗MUC17抗体。
所公开的方法可使用任何MUC17抗体，包括例如，含有氨基酸序列如SEQ ID NO:113-125或126所示的三个轻链可变区CDR的抗MUC17抗体。
本发明的一个方面是一种治疗疾病(如癌症)的方法，所述方法使用抗CLDN18.2的抗体(或片段)，其配有激活CD3、CD28或CD137的激动剂抗体的抗体(或片段)。
本发明的一个方面是一种激活T细胞对表达CLDN18.2的细胞的细胞毒性的方法。
本发明的一个方面是一种激活T细胞的细胞毒性的方法，所述方法使用双特异性或三特异性分子，所述双特异性或三特异性分子包括抗CLDN18.2的抗体(或片段)，其配有激活CD3、CD28或CD137的激动剂抗体的抗体(或片段)。
本发明的一个方面是一种激活T细胞的细胞毒性的方法，所述方法使用三特异性分子，所述三特异性分子包括抗CLDN18.2的抗体(或片段)，其配有激活CD3、CD28和/或CD137的激动剂抗体的抗体(或片段)。
所公开的方法可使用任何CLDN18.2抗体，包括例如，含有氨基酸序列如SEQ IDNO:170-186或187所示的三个重链可变区CDR的抗CLDN18.2抗体。
本发明的一个方面是一种结合人CLDN18.2蛋白的人源化抗体，其包含重链可变结构域，所述重链可变结构域与SEQ ID NO:197-205或206具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的序列同一性。
所公开的方法可使用任何CLDN18.2抗体，包括例如，含有氨基酸序列如SEQ IDNO:188-195或196所示的三个轻链可变区CDR的抗CLDN18.2抗体。
本发明的一个方面是一种结合人CLDN18.2蛋白的人源化抗体，其包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域与SEQ ID NO:207-212或213具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少100％的序列同一性。
所公开的方法可使用任何CLDN18.2抗体，包括例如，含有氨基酸序列如SEQ IDNO:170-186或187所示的三个重链可变区CDR的抗CLDN18.2抗体。
所公开的方法可使用任何CLDN18.2抗体，包括例如，含有氨基酸序列如SEQ IDNO:188-195或196所示的三个轻链可变区CDR的抗CLDN18.2抗体。
本发明的另一个方面是一种激活T细胞的细胞毒性的方法，所述方法使用三特异性分子，所述三特异性分子包括一个以上抗DLL3、MUC17和/或CLDN18.2的抗体(或片段)，其配有一个或多个激活CD3、CD28或CD137的激动剂抗体的抗体(或片段)。
本发明的另一个方面是一种三特异性分子，其包括(a)抗DLL3抗体、抗Muc17抗体或抗Cldn18.2抗体、(b)第一抗原结合体和(c)第二抗原结合体。在一个实施方式中，所述第一抗原结合体包括抗CD28 scFv结构域，并且所述第二抗原结合体包括抗CD3 Scfv-Fc结构域。所述第一抗原结合体和第二抗原结合体构成异二聚体结构。在一个实施方式中，所述三特异性分子包括如SEQ ID NO:347所示的第一链、如SEQ ID NO.276所示的第二链和如SEQID NO.297所示的第三链。在另一个实施方式中，所述三特异性分子包括如SEQ ID NO:430所示的第一链、如SEQ ID NO:276所示的第二链和如SEQ ID NO:297所示的第三链。或者，所述三特异性分子可以包括如SEQ ID NO:481所示的第一链、如SEQ ID NO:406所示的第二链和如SEQ ID NO:413所示的第三链。
在一些实施方式中，所述靶向结构域使用本领域已知的合适交联技术，通过肽键经由肽接头或通过共价结合物彼此连接。
在一些实施方式中，所述靶向结构域包括抗体可变区。在一些实施方式中，所述靶向结构域为选自下组的形式：单域抗体(sdAb)、片段可变(Fv)异二聚体、单链Fv(scFv)、Fab片段、TriFab，或其组合。
在一些实施方式中，所述三特异性分子与检查点抑制剂共同施用。
在一些实施方式中，所述三特异性分子与抗PD1和/或抗PDL1拮抗剂共同施用。
将通过以下结合附图的更详细的描述使本发明各方面的其他特征和优点变得明显，这些附图以示例的方式说明了本发明的各方面的原理。
附图简述
附图说明了本发明的各个方面。在这些图中：
图1A至1R描绘了用于本发明三特异性分子的Scfv-scfv-Fc x Fab-Fc形式。
图1A描绘了抗CD3、抗DLL3、抗CD28(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1B描绘了抗CD3、抗DLL3、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1C描绘了抗CD28、抗DLL3、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1D描绘了抗CD28、抗DLL3、抗CD3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1E描绘了抗CD137、抗DLL3、抗CD3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1F描绘了抗CD137、抗DLL3、抗CD28(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1G描绘了抗DLL3、抗CD3、抗CD28(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1H描绘了抗DLL3、抗CD3、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1I描绘了抗DLL3、抗CD28、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1J描绘了抗DLL3、抗CD28、抗CD3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1K描绘了抗DLL3、抗CD137、抗CD3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1L描绘了抗DLL3、抗CD137、抗CD28(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1M描绘了抗CD28、抗CD3、抗DLL3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1N描绘了抗CD137、抗CD3、抗DLL3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1O描绘了抗CD137、抗CD28、抗DLL3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1P描绘了抗CD3、抗CD28、抗DLL3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1Q描绘了抗CD3、抗CD137、抗DLL3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图1R描绘了抗CD28、抗CD137、抗DLL3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图2A为显示了抗DLL3抗体与表达人DLL3的CHO细胞结合的图。
图2B为显示了抗DLL3抗体与表达食蟹猴DLL3的CHO细胞结合的图。
图3为显示了抗DLL3 scfv-Fc与表达人DLL3的CHO细胞结合的图。
图4为显示了在CHO-DLL3细胞存在的情况下，相比于CD3scfv-Fc x DLL3Fab-Fc双特异性分子3D1I或CD28scfv-Fc x DLL3Fab-Fc双特异性分子28D18，CD28scfv-CD3scFv-Fcx DLL3-Fab-Fc三特异性分子328D3更高水平地使PBMC激活以分泌IFNγ的图。
图5为显示了在CHO-DLL3细胞存在的情况下，相比于CD3scfv-Fc x DLL3Fab-Fc双特异性分子3D4I或CD28scfv-Fc x DLL3Fab-Fc双特异性分子28D15，CD28scfv-CD3scFv-Fcx DLL3-Fab-Fc三特异性分子328D2更高水平地使PBMC激活以分泌IFNγ的图。
图6为显示了在CHO-DLL3细胞存在的情况下，相比于CD3scfv-Fc x DLL3Fab-Fc双特异性分子3D22I或CD28scfv-Fc x DLL3Fab-Fc双特异性分子28D17，三特异性分子328D1更高水平地使PBMC激活以分泌IFNγ的图。
图7为显示了在NCI-H82细胞存在的情况下，相比于CD3scfv-Fc x DLL3Fab-Fc双特异性3D39I，CD28scfv-CD3scFv-Fc x DLL3-Fab-Fc三特异性分子328D4和328D5更好地激活PBMC，使其分泌更多IL-2的图。
图8A-8C描绘了具有两个CD137 Fab片段的双特异性和三特异性分子。
图8A显示了抗CD137、抗DLL3、抗DLL3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子的双特异性分子。
图8B描绘了抗CD137、抗DLL3、抗CD3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图8C描绘了抗CD137、抗DLL3、抗CD3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图9A-9F描绘了具有两个CD137 scfv片段的双特异性分子和三特异性分子。
图9A描绘了抗DDL3、抗CD3、抗CD137、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Fc-Scfv)分子。
图9B描绘了抗DDL3、抗CD3、抗CD137、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Scfv-Fc-Scfv)分子。
图9C描绘了抗CD137、抗CD137、抗DLL3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图9D描绘了抗DLL3、抗CD137、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图9E描绘了抗DDL3、抗CD3、抗CD137(Fab-Fc-Scfv x Scfv-Fc-Scfv)分子。
图9F描绘了抗DLL3、抗CD3、抗CD137、抗CD137(Fab-Fc-Scfv-Scfv x Scfv-Fc)分子。
图10A至10R描绘了用于本发明三特异性分子的Scfv-scfv-Fc x Fab-Fc形式。
图10A描绘了抗CD3、抗MUC17、抗CD28(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10B描绘了抗CD3、抗MUC17、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10C描绘了抗CD28、抗MUC17、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10D描绘了抗CD28、抗MUC17、抗CD3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10E描绘了抗CD137、抗MUC17、抗CD3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10F描绘了抗CD137、抗MUC17、抗CD28(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10G描绘了抗MUC17、抗CD3、抗CD28(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10H描绘了抗MUC17、抗CD3、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10I描绘了抗MUC17、抗CD28、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10J描绘了抗MUC17、抗CD28、抗CD3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10K描绘了抗MUC17、抗CD137、抗CD3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10L描绘了抗MUC17、抗CD137、抗CD28(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10M描绘了抗CD28、抗CD3、抗MUC17(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10N描绘了抗CD137、抗CD3、抗MUC17(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10O描绘了抗CD137、抗CD28、抗MUC17(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10P描绘了抗CD3、抗CD28、抗MUC17(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10Q描绘了抗CD3、抗CD137、抗MUC17(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图10R描绘了抗CD28、抗CD137、抗MUC17(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图11A为显示了MUC17xCD3双特异性与表达MUC17的CHOK1细胞结合的图。
图11B为显示了MUC17xCD3双特异性与ASPC1肿瘤细胞结合的图。
图12是显示了hu1MU11A和hu1MU32A以Scfv形式保留了Muc17结合活性的图。
图13是显示了CD3xCD28xMuc17三特异性分子对ASPC1细胞具有与CD3双特异性3M62I相似的由PBMC介导的最大杀伤力的图。
图14是显示了在ASPC1细胞存在的情况下，相比CD3双特异性3M62I，Muc17xCD3xcD28三特异性分子328M2、328M3、328M4和328M5更高水平地使PBMC激活以分泌IL-2的图。
图15是显示了相较于CD3双特异性3M55I，CD3ScfvxCD28-scFv x Muc17Fab三特异性分子328M1和328M2更好地激活T细胞以杀伤MUC17-CHO细胞，且效果与CD3和CD28双特异性的组合3M55I+28M3相似的图。
图16A-16B是显示了CD28scfvxCD3scfvxMuc17Fab三特异性分子328M2仅在表达Muc17的CHO存在时才激活PBMC以表达CD25，在没有Muc17靶细胞时不发生激活的图。相比之下，CD3scFvxCD28scFvxMuc17-Fab三特异性328M1能够在没有Muc17的情况下非特异性激活细胞，类似于缺少Muc17结合的双特异性328-1。
图16A显示了当PBMC存在于表达MUC17的CHO细胞中时，CD25(MFI)的表达受到双特异性和三特异性分子T细胞浓度增加的刺激。图16B显示了当PBMC存在于亲本CHO细胞中时，CD25(MFI)的表达受到双特异性和三特异性分子T细胞浓度增加的刺激。
图17A和17B是显示了当PBMC与表达Muc17的CHO细胞共培养时，相比基准CD3双特异性3M8B7，CD137xCD3xMuc17三特异性分子34M1和34M4使CD4和CD8 T细胞数目增加至更高水平的图。
图18A-18D描绘了Muc17xCD137和DLL3xCD137双特异性分子。
图19A-19C描绘了具有两个CD137 Fab片段的MUC17双特异性和三特异性分子。
图19A描绘了抗CD137、抗MUC17、抗MUC17(Fab-Fc-Scfv)分子。
图19B描绘了抗CD137、抗MUC17、抗CD3(Fab-Fc-Scfv x Fab-Fc-Scfv)分子。
图19C描绘了抗CD137、抗MUC17、抗CD3(Fab-Fc x Fc-Scfv-Scfv)分子。
图19E-9J描绘了具有两个抗CD137片段的双特异性分子和三特异性分子。
图19E描绘了抗CD137、抗CD137、抗MUC17(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图19F描绘了抗MUC17、抗CD137、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图19G描绘了抗MUC17、抗CD137、抗CD3、抗CD137(Fab-Fc-Scfv x Scfv-Fc-Scfv)分子。
图19H描绘了抗MUC17、抗CD137、抗CD137、抗CD3(Fab-Fc-Scfv-Scfv x Scfv-Fc)分子。
图19I描绘了抗MUC17、抗CD3、抗CD137、抗CD137(scfv-scfv-Fc-Scfv x Fc-Scfv)分子。
图19J描绘了抗DDL3、抗CD3、抗CD137、抗MUC17、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Scfv-Fc-Scfv)分子。
图20A至20R描绘了用于本发明三特异性分子的Scfv-scfv-Fc x Fab-Fc形式。
图20A描绘了抗CD3、抗CLDN18.2、抗CD28(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20B描绘了抗CD3、抗CLDN18.2、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20C描绘了抗CD28、抗CLDN18.2、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20D描绘了抗CD28、抗CLDN18.2、抗CD3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20E描绘了抗CD137、抗CLDN18.2、抗CD3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20F描绘了抗CD137、抗CLDN18.2、抗CD28(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20G描绘了抗CLDN18.2、抗CD3、抗CD28(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20H描绘了抗CLDN18.2、抗CD3、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20I描绘了抗CLDN18.2、抗CD28、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20J描绘了抗CLDN18.2、抗CD28、抗CD3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20K描绘了抗CLDN18.2、抗CD137、抗CD3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20L描绘了抗CLDN18.2、抗CD137、抗CD28(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20M描绘了抗CD28、抗CD3、抗CLDN18.2(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20N描绘了抗CD137、抗CD3、抗CLDN18.2(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20O描绘了抗CD137、抗CD28、抗CLDN18.2(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20P描绘了抗CD3、抗CD28、抗CLDN18.2(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20Q描绘了抗CD3、抗CD137、抗CLDN18.2(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图20R描绘了抗CD28、抗CD137、抗CLDN18.2(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图21是显示了相较于单用3C27I CD3xCLDN18.2双特异性，三特异性分子328C1、328C 2、328C3、328C4更高水平地使T细胞激活以分泌IL-2的图。
图22是显示了在SNU-601细胞存在的情况下，相较于双特异性3C18I，CD3xCD137xCLDN18.2三特异性分子34C4和34C3使PBMC激活以表达更多CD25的图。
图23是显示了在SNU-601细胞存在的情况下，相比于单用双特异性3C18I，CD3xCD137xCLDN18.2三特异性分子34C4和34C3使PBMC激活以分泌更多IFNγ的图。
图24是显示了在表达CLDN18.2的CHO细胞存在的情况下，CD3xCD137xCLDN18.2三特异性34C3使CD8 T的数量增加超过了CD3 T细胞接合器3C27I刺激的数量增加的图。
图25A-25C描绘了具有两个CD137 Fab或Scfv片段的CLDN18.2双特异性和三特异性分子。
图25A描绘了抗CD137、抗CLDN18.2、抗CLDN(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。
图25B描绘了抗CD137、抗CLDN18.2、抗CD3三特异性分子(Fab-Fc-Scfv x Fab-Fc-Scfv)分子。
图25C描绘了抗CD137、抗CLDN18.2、抗CD3三特异性分子(Fab-Fc-Scfv-Scfv xFab-Fc)。
图25D描绘了抗CD137、抗CD137、抗CLDN18.2双特异性分子(Scfv-Scfv-Fc x Fab-Fc)。
图25E描绘了抗CLDN18.2、抗CD137、抗CD137三特异性分子(Scfv-Scfv-Fc x Fab-Fc)。
图25F描绘了抗CLDN18.2、抗CD137、抗CD3、抗CD13718.2(Fab-Fc-Scfv x Scfv-Fc-Scfv)分子。
图25G描绘了抗CLDN18.2、抗CD3、抗CD137、抗CD137(Fab-Fc-Scfv-Scfv x Scfv-Fc)分子。
图25H描绘了抗CLDN18.2、抗CD3、抗CD137、抗CD137(scfv-scfv-Fc-Scfv x Fc-Scfv)分子。
图25I描绘了抗CLDN18.2、抗CD3、抗CD137、抗CD137(scfv-scfv-Fc x Scfv-Fc-Scfv)分子。
定义
本说明书中对“一个实施方式/方面”或“一实施方式/方面”的引用是指与该实施方式/方面相关的所描述的特定特征、结构或特性包含在本发明的至少一个实施方式/方面中。在说明书各处对短语“在一个实施方式/方面中”或“在另一实施方式/方面中”的使用不一定都是指相同的实施方式/方面，也不一定是与其他实施方式/方面相互排除的单独或替代的实施方式/方面。此外，还描述了可能在一些实施方式/方面中展示，但在其他实施方式/方面中未展示的各种特征。类似地，描述了可能在一些实施方式/方面中需要，但在其他实施方式/方面中不需要的各种需求。在某些情况下，实施方式和方面可以互换使用。
在本发明的上下文中、以及在每个术语使用的特定上下文中，本说明书中使用的术语通常具有其在本领域的通常含义。在下文或说明书的其他部分中，讨论了用于描述本发明的一些术语，从而向专业人员提供关于本发明描述的额外指导。应当理解，相同的事物可以用不止一种方式来表达。
因此，本文讨论的任何一个或多个术语都可以使用替代语言和同义词。无论一个术语是否在本文中阐述或讨论，其都没有任何特殊意义。提供了某些术语的同义词。一个或多个同义词的列举并不排除使用其他同义词。本说明书中任何地方使用的示例(包括本文讨论的任何术语的示例)仅是说明性的，并不旨在进一步限制本发明或任何示例术语的范围和意义。同样，本发明不限于本说明书中给出的各种实施方式。
下文给出了根据本发明实施方式的仪器、装置、方法及其相关结果的实施例，其并非旨在进一步限制本发明的范围。需注意，为了方便读者，实施例中可使用标题或副标题，其不应限制本发明的范围。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。如有矛盾，以包括定义的本文件为准。
适用时，除非另有说明，否则本说明书和所附权利要求书中使用的术语“约”或“一般”表示+/-20％的幅度。此外，适用时，除非另有说明，否则本说明书和所附权利要求书中使用的术语“基本上”表示+/-10％的幅度。应当理解，并非所有上述术语的使用都是可量化从而使得所引用范围是可被应用的。
术语“受试者”或“患者”是指任何需要治疗的单一动物，更优选地为哺乳动物(包括非人动物，例如狗、猫、马、兔子、动物园动物、牛、猪、羊和非人灵长类)。最优选地，本文所述的患者是人。在一个实施方式中，诊断或治疗的“对象”是原核或真核细胞、组织培养物、组织或动物，例如哺乳动物，包括人类。
如本文所用，术语“包括”意在表示组合物和方法包括所列的元素，但不排除其他未列出的元素。当用于定义组合物和方法时，“基本上包括”不包括改变所述组合物和/或方法的基本性质的其他元素，但不排除其他未列出的元素。因此，本文定义的基本上包括所述元素的组合物不排除痕量的元素，例如来自任何分离和纯化方法的污染物或药学上可接受的载体(例如磷酸盐缓冲盐、防腐剂等)，但不包括其他未指明的氨基酸。“由……组成”不包括多于痕量的其他成分元素和多于用于施用本文所述组合物的实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例都在本发明及其所包含的发明的范围内。
术语“三特异性单克隆抗体”或“TSMAb”是指能够同时接合三个不同种类表位的抗体。
术语“活性剂”或“活性成分”是指一种物质、化合物或分子，其具有生物活性，或者对其给药的对象产生生物学或生理学效果。换言之，“活性剂”或“活性成分”是指组合物中全部或部分效果归因于其的一个或多个组分。活性剂可以是主要活性剂，换言之，所述组合物的全部或部分效果归因于组合物的该组分。活性剂可以是次要试剂，换言之，所述组合物的附加部分和/或其他效果归因于组合物的该组分。
在一个实施方式中，“药物组合物”旨在包括活性剂(例如抗DLL3、抗MUC17或抗CLDN18.2抗体和抗体偶联物)和惰性或活性载体在无菌组合物中的组合，所述无菌组合物适用于体外、体内或离体的诊断或治疗用途。在一个方面，所述药物组合物基本上不含内毒素，或者在使用剂量或浓度下对受体无毒性。
在一个实施方式中，“有效量”是指(但不限于)足以实现所需治疗结果的定义成分的量。在一个实施方式中，该结果可以是有效的癌症治疗。
在一个实施方式中，如本文所用，术语“治疗的”、“治疗”等在本文中使用以指(但不限于)获得所需的药理和/或生理效果。就完全或部分预防疾病或其体征或症状而言，该效果可以是预防性的，和/或就改善疾病或感染的症状而言，或就部分或完全治愈疾病和/或由该疾病引起的不良反应而言，该效果可以是治疗性的。
如本文所用，术语“重组”是指非天然存在的多肽或多核苷酸，其可以通过将多核苷酸或多肽以通常不会一起出现的排列组合而产生。该术语可以指通过生物宿主产生的多肽，所述生物宿主选自哺乳动物表达系统、昆虫细胞表达系统、酵母表达系统和细菌表达系统。
术语“δ样3”或“DLL3”是指在人类中由DLL3基因编码的蛋白质。该基因突变导致常染色体隐性遗传病脊椎肋骨发育不全(Jarcho-Levin)综合征。DLL3在细胞内部正常表达，在正常组织中低水平表达。然而，肺肿瘤细胞过表达该基因并且细胞表面DLL3水平升高。
术语“粘蛋白17”或“MUC17”是指包括20多个成员的粘蛋白家族的成员之一。粘蛋白是一种大型、高度糖基化的膜结合蛋白。它们几乎只在肠道中表达。其总体功能是保护上皮细胞不受环境影响，并调控细胞的增殖和存活。MUC17在胰腺癌组织中(在蛋白水平上)高表达。MUC17在胰腺癌、阑尾癌和一些结肠癌中表达。在正常胰腺中、胰腺炎中或其他癌症细胞系中未检测到其表达。
术语“紧密连接蛋白18”或“CLD 18”是指在人类中由CLDN18基因编码的蛋白质。CLDN18属于庞大的紧密连接蛋白家族，其在上皮细胞中形成紧密连接链。“Claudin 18.2”或“CLDN18.2”表示肿瘤(尤其是胃系统肿瘤)中大量存在的亚型2。
术语“CD”或“分化分子簇”是指有助于识别和表征白细胞的细胞表面标记物，例如CD3、CD28和CD137。CD3是T细胞受体(TCR)复合体的信号传导成分。因为CD3是T细胞激活所必需的，所以靶向CD3的药物(通常是单克隆抗体)正被研究作为治疗癌症的免疫刺激剂。
CD28是产生T细胞介导的免疫应答所需的主要共刺激分子。在与其配体CD80和CD86相互作用后，CD28转导使抗凋亡蛋白表达的激活信号，并使包括IL-2在内的几种细胞因子的合成增强。CD28共刺激受体存在于所有T细胞上。靶向抗其他CD28家族成员CTLA-4、PD-1或其B7配体的抗体作为检查点抑制剂发挥作用以克服肿瘤免疫耐受，可用于癌症免疫治疗，相比之下，靶向抗CD28的激动剂抗体在临床上已导致严重的不良事件。
CD137是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员。其别名为肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNFRSF9)、4-1BB，能诱导淋巴细胞激活。激动剂抗CD137抗体作为一种对效应/记忆T细胞尤其重要的激活共刺激分子，并促进T淋巴细胞的存活和增殖。例如，BBK-4、乌瑞芦单抗(Urelumab)和乌托咪单抗(Utomilumab)(PF-05082566)靶向该受体以刺激免疫系统对癌症的更强烈攻击。
PD-1(程序性细胞死亡蛋白1或CD279)是细胞表面的一种蛋白，其通过抑制T细胞炎症活性来下调免疫系统和促进自我耐受，从而在调节免疫系统对人体细胞的反应中发挥作用。PD-1通过其任何一种配体PD-L1或PD-L2与相邻细胞的接合抑制TCR信号传导和TCR介导的增殖、转录激活和细胞因子产生。这可以预防自身免疫疾病，但也可以防止免疫系统杀伤癌细胞。设计用于阻断PD-1/PD-L1相互作用的治疗性抗体具有治疗癌症的潜力。
程序性死亡配体1(PD-L1)也称为分化簇274(CD274)或B7同源物1(B7-H1)，是一种在人类中由CD274基因编码的蛋白质。PD-L1与激活的T细胞、B细胞和髓细胞上的其受体PD-1结合，以调控激活或抑制。
如本文所用，术语“抗体”是指通过一个或多个免疫球蛋白可变区特异性识别并结合抗原的多肽或多肽复合物。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分为κ或λ。重链分为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义了免疫球蛋白的种类IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。通常，抗体的抗原结合区在结合的特异性和亲和力方面最为关键，并由可变结构域编码。抗体可以是完整抗体、其抗原结合片段或单链。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对都有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N端定义了约100到110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指轻链和重链的可变结构域。
例如，抗体作为完整的免疫球蛋白存在，或作为通过用各种肽酶消化产生的若干特征明确的片段存在。因此，举例而言，胃蛋白酶在铰链区中二硫键下方消化抗体以产生F(ab)'2，其是本身为轻链VL-CL通过二硫键连接到VH--CH1的Fab的二聚体。虽然各种抗体片段是根据对完整抗体的消化来定义的，但技术人员将意识到，这些片段可以通过化学方法或使用重组DNA方法从头合成。因此，如本文所用，术语抗体还包括通过对完整抗体进行修饰产生的抗体片段，或使用重组DNA方法从头合成的抗体片段(例如，单链Fv)或使用噬菌体展示库识别的抗体片段(参见，例如，McCafferty等人，Nature 348:552-554(1990))。
因此，在本发明的任一方面，术语抗体还包括微型抗体、scFv、双链抗体、三链抗体等。ScFv和双链抗体是小型二价生物特异性抗体片段，具有高亲和力和特异性。其高信噪比通常更好，因为更高的特异性和快速血液清除率增加了其对特定抗原的诊断性和治疗性靶向的潜力(Sundaresan等人，J Nucl Med 44:1962-9(2003))。此外，这些抗体具有优势，因为它们可以在必要时被基因工程改造成不同类型的抗体片段，从小的单链抗体(scFv)到具有不同亚型的完整IgG(Wu和Senter，Nat.Biotechnol.23:1137-1146(2005))。在一些实施方式中，所述抗体片段是scFv-scFv或双链抗体的一部分。在一些实施方式中，在任一方面，本发明提供用于本发明用途的高活性抗体。
术语“激动剂抗体”指刺激或激活器官的抗体。抗体可以作为受体的激动剂，基本上取代正常配体的活性。当抗体以模拟生理配体结合的方式结合受体，从而导致抗体介导的激动作用时，即产生激动剂活性。例如，在弥漫性毒性甲状腺肿(Grave’s disease)中，抗促甲状腺素受体的激动剂抗体刺激甲状腺释放甲状腺激素，从而导致甲状腺功能亢进。激动剂抗体在聚集时也可以通过抗体的Fc部分以反式或顺式与Fc受体结合，或通过抗原介导的聚集，来进行刺激。后一种聚集机制要求双特异性或三特异性分子的一半接合抗原，双特异性或三特异性分子的另一半接合刺激受体。示例性刺激受体是刺激T细胞的CD3、CD28和4-1BB。
术语“抗体片段”或“抗原结合片段”是指抗体的一部分，例如Fab'、Fab、Fv、scFv等。无论结构如何，抗体片段都与完整抗体识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”还包括双链抗体和任何人工合成的或基因工程编辑的蛋白质，所述蛋白质包含免疫球蛋白可变区，所述免疫球蛋白可变区通过与特定抗原结合形成复合物，从而起到类似抗体的作用。
术语“抗原结合片段”或“Fab”是指抗体上与抗原结合的区域。其包括重链和轻链各自的一个恒定区和一个可变区(即四个域：VH、CH1、VL和CL1)。可变区包含补位(抗原结合位点)，其包括单体氨基末端的一组互补决定区。因此，Y的每一个臂都与抗原上的一个表位结合。
术语“Fc区”或“片段结晶区”是指抗体CH2-CH3的尾部区域，该区域与被称为Fc受体的细胞表面受体和补体系统的一些蛋白质相互作用。这种“效应子功能”允许抗体激活免疫系统，导致细胞毒性作用(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)和/或补体依赖性细胞毒性作用(CDC)。ADCC和ADCP通过Fc与免疫系统细胞表面的Fc受体的结合介导。CDC通过Fc与补体系统蛋白质(如C1q)的结合介导。
在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区有两个相同的蛋白质片段，分别来自抗体两条重链的第二和第三恒定区。IgM和IgE Fc区在每条多肽链中有三个重链恒定区(CH结构域2-4)，而IgG由2个CH结构域2和3组成。IgG的Fc区具有高度保守的N-糖基化位点。Fc片段的糖基化对于Fc受体介导的活性至关重要。附着于该位点的N-聚糖主要是复合型核心岩藻糖基双触角结构。此外，少量的这些N-聚糖也具有一分为二的GlcNAc和α-2，6连接的唾液酸残基。
特定的IgG亚类可能优选用于特定用途。例如，IgG1在介导ADCC和CDC方面比IgG2和IgG4更有效。因此，当效应子功能不理想时，可以优选IgG2 Fc。然而，含有IgG2 Fc的分子通常更难制造，并且可能不如含有IgG1 Fc的分子稳定。此外，可以通过向Fc中引入一个或多个突变增强或降低抗体的效应子功能(参见，例如，Strohl,Curr.Opin.Biotech.,20:685-691,2009)。具有增强的效应子功能的示例性IgG1 Fc分子包括具有以下取代的分子：
S239D/I332E、S239D/A330S/1332E、S239D/A330L/1332E、S298A/D333A/K334A、P2471/A339D、P2471/A339Q、D280H/K290S、D280H/K290S/S298D、D280H/K290S/S298V、F243L/R292P/Y300L、F243L/R292P/Y300L/P396L、F243L/R292P/Y300L/V3051/P396L、G236A/S239D/I332E、K326A/E333A、K326W/E333S、K290E/S298G/T299A、K290N/S298G/T299A、K290E/S298G/T299A/K326E、K290N/S298G/T299A/K326E。
岩藻糖基化是增加含IgG Fc蛋白质的效应子功能的另一种方法。从附在Fc上的双触角复合型寡糖中去除核心岩藻糖，可以大幅增加ADCC效应子功能，且不会改变抗原结合或CDC效应子功能。有不同的方法可以减少或消除含Fc分子的岩藻糖基化。这些方法包括在某些哺乳动物细胞系中的重组表达，所述哺乳动物细胞系包括FUT8敲除细胞系、变体CHO系Lec13、大鼠杂交瘤细胞系YB2/0、包含特异性抗FUT8基因的小干扰RNA的细胞系，以及共表达β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III和高尔基α-甘露糖苷酶II的细胞系。或者，含有Fc的分子可以在非哺乳动物细胞中表达，例如植物细胞、酵母或原核细胞(例如大肠杆菌)。
可能需要降低效应子功能。具有降低的效应子功能的示例性Fc分子包括具有以下取代的分子：
N297A或N297Q(IgG1)、L234A/L235A(IgG1)、V234A/G237A(IgG2)、L235A/G237A/E318A(IgG4)、H268Q/V309L/A330S/A331S(IgG2)、C220S/C226S/C229S/P238S(IgG1)、C226S/C229S/E233P/L234V/L235A(IgG1)、L234F/L235E/P331S(IgG1)、S267E/L328F(IgG1)。
轻链和重链都分为结构和功能同源区。术语“恒定”和“可变”在功能上使用。在这方面，应理解轻链部分的可变区(VL)和重链部分的可变区(VH)决定了抗原识别和特异性。相反，轻链的恒定结构域(CL)和重链的恒定结构域(CH1、CH2和CH3)赋予了重要的生物学特性，如分泌、经胎盘的活动性、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，常规抗体中恒定区结构域的编号随其距离抗原结合位点或抗体氨基末端的距离越远而增加。在常规抗体中，N端部分是可变区，C端部分是恒定区；CH3和CL结构域分别包括重链和轻链的羧基末端。
如本文所用，术语“重链恒定区”包括源自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。含有重链恒定区的多肽包括选自下组的至少一个：CH1结构域、铰链(例如，上、中和/或下铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域，或其变体或片段。例如，本发明中使用的抗原结合多肽可包括：含有CH1结构域的多肽链；含有CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH2结构域的多肽链；含有CH1结构域和CH3结构域的多肽链；含有CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH3结构域的多肽链，或含有CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在一些实施方式中，本发明的多肽包括含有CH3结构域的多肽链。此外，本发明中使用的抗体可缺乏CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的全部或部分)。应理解，重链恒定区可被修饰以使其氨基酸序列与天然出现的免疫球蛋白分子不同。
本文所公开的抗体的重链恒定区可源自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链恒定区可包括源自IgG1分子的CH1结构域和源自IgG3分子的铰链区。在另一个示例中，重链恒定区可包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG3分子的铰链区。在另一个示例中，重链部分可包括部分源自IgG1分子和部分源自IgG4分子的嵌合铰链。
如本文所用，术语“轻链恒定区”包括源自抗体轻链的氨基酸序列。优选地，所述轻链恒定区包括恒定κ结构域或恒定λ结构域中的至少一个。“轻链重链对”是指轻链和重链的集合，其可以通过轻链的CL结构域和重链的CH1结构域之间的二硫键形成二聚体。
各种免疫球蛋白类恒定区的亚单位结构和三维构型是众所周知的。如本文所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(最氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域与VH结构域相邻，且是免疫球蛋白重链分子铰链区的氨基末端。
如本文所用，术语“CH2结构域”包括重链分子的一部分，从抗体的例如约残基244延伸到残基360，使用常规编号方案(残基244至360，Kabat编号系统；残基231-340，EU编号系统)。CH2结构域是独特的，因为其与另一个结构域并非紧密配对。相反，两个N-连接的支链碳水化合物链位于完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。CH3结构域从CH2结构域延伸到IgG分子的C末端，包括约108个残基。
如本文所用，术语“铰链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的重链分子的部分。此铰链区包括约25个残基，并且是柔性的，从而允许两个N末端抗原结合区独立地移动。铰链区可细分为三个不同的结构域：上、中和下铰链结构域。
术语“双特异性单克隆抗体”或“BSMAb”是指能够同时结合同一靶点或不同靶点上两种不同类型表位的抗体。其优点是能够将特定的多克隆免疫细胞(例如T细胞和NK细胞)重新定向至肿瘤细胞来增强肿瘤杀伤。这些抗体可分为两类：携带Fc区并因此保留Fc介导的效应子功能的IgG样双特异性抗体，和依赖其抗原结合能力发挥作用的非IgG样抗体。重组技术也导致了小片段分子的产生。来自两种不同单克隆抗体的单链可变片段可以结合形成二价双特异性抗体。示例包括：双特异性T细胞接合器(BiTE)、串联单链可变片段(taFv)、双特异抗体(diabody,Db)、单链双特异抗体(scDb)和三特异抗体(triple body)。这些基于scFv的抗体片段由于尺寸小(范围为50至60kDa)，具有高肿瘤特异性和高肿瘤穿透性。
术语“三特异性单克隆抗体”或“TSMAb”是指能够同时结合同一靶点或不同靶点上三种不同类型表位的抗体。
术语“scFv”或“scFv片段抗体”是指以VL-VH或VH-VL的构型存在的，由VH和VL结构域组成的小分子抗体，VH和VL结构域之间有一个连接区。scFv片段抗体更容易穿透血管壁和实体瘤，使得其成为靶向药物的优选载体。
术语“scFvs”或“单链可变片段”是指可通过连接两个scFv进行工程化改造的二价(或双价)单链可变片段(di-scFv,bi-scFv)。其可以通过产生具有两个VH区和两个VL区的单肽链来实现，产生串联scFv，也称为scFv-scFv分子。另一种可能是产生带有连接肽的scFv，这些连接肽太短以致于两个可变区无法折叠在一起(约五个氨基酸)，迫使scFv二聚化。这种类型称为双特异抗体。
术语“人源化抗体”是指来自非人类物种的抗体，其蛋白质序列已被修饰以增加其与人类天然产生的抗体变体的相似性。“人源化”过程通常应用于为施用于人类而开发的单克隆抗体(例如作为抗癌药物开发的抗体)。当开发特定抗体的过程涉及到在非人类免疫系统(例如小鼠免疫系统)中的产生时，人源化可能是必要的。
双特异性或三特异性抗体可以通过化学交联或杂交瘤技术产生。或者，双特异性或三特异性抗体分子可以通过重组技术产生，例如通过将2个scFv分子与短连接子连接在一起。例如，VH1-连接子1-VL1-连接子2-VH2-连接子3-VL2。连接子l和连接子3的长度在15-30个氨基酸之间，连接子2的长度为5-10个氨基酸。连接子可由多种氨基酸组成，例如GGGGS、GKPGS、GEPGS和/或GGPGS的重复单元。2个scFv分子的二聚化可以是通过将连接子的长度从约15个氨基酸减少到约5个氨基酸来实现，所述连接子连接VH和VL结构域，通常用于产生scFv片段。这些连接子有利于链内的VH和VL结构域组装，其结构为VH1-连接子1-VL2-连接子2-VH2-连接子3VL1，连接子1和连接子3的长度为5个氨基酸。可以使用任何合适的短连接子。从而，两个片段组装成二聚体分子。进一步将连接子长度减少到0-2个氨基酸可以生成三聚体(三链抗体)或四聚体(四链抗体)分子。
“嵌合抗体”是一种抗体分子，其中(a)恒定区或其一部分被改变、替换或交换，从而使得抗原结合位点(可变区)与不同的或改变的种类、效应子功能和/或物种的恒定区相连，或与赋予嵌合抗体新特性的完全不同的分子相连，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或(b)可变区或其一部分被具有不同的或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。
高效生产双特异性抗体制剂的挑战之一是在共表达不同结合特异性的链时减少同型二聚体分子的形成，以利于异二聚体的形成。“异二聚体抗体”可以利用“杵-臼”或“电荷对”形式优先促进2个分子的正确结合，以形成具有2种特异性的异二聚体。这些形式对于抗体中恒定区的重链Fc部分是特定的。对于杵-臼形式，“杵”部分是通过用较大的氨基酸代替较小的氨基酸来进行基因工程改造的。其与“臼”适配，“臼”是通过用较小的氨基酸代替较大的氨基酸来进行基因工程改造的。在第一个Fc中引入T366W突变产生“杵”，在第二个Fc引入T366S、L368A和Y407V突变产生“臼”(根据Kabat EU编号系统对残基进行编号)。对于电荷对形式，通过在相反的Fc结构域中引入接合电荷残基来稳定离子相互作用，从而有利于异二聚化。例如，第一Fc结构域中的D356K、E357K和D399K，以及第二Fc结构域中的K370E、K409D和K439E突变，或其组合。例如，根据Kabat EU编号系统进行编号的第一Fc链中的K392D和K409D突变，和第二Fc链中的D399K和D356K突变，第一Fc中的K409E和Fc中的D399K，第一Fc中的K409E和第二Fc中的D399R，第一Fc中的K409D和第二Fc中的D399K，第一Fc中的K409D和第二Fc中的D399R，第一Fc中的K392E和第二Fc中的D399R，第一Fc的K392E和第二Fc中的D399K，第一Fc中的K392D和第二Fc中的D399R，第一Fc中的K392D和第二Fc中的D399K，第一Fc中的K409D和K360D以及第二Fc中的D399K和D356K，第一Fc中的K409D和K370D以及第二Fc中的D399K和E357K，第一Fc中的K409D和K392D以及第二Fc中的D399K、D356K和E357K，第一Fc中的K409D和K392D以及第二Fc中的D399K，第一Fc中的K409D和K392D以及第二Fc中的D399K和D356K，第一Fc中的K409D和K392D以及第二Fc中的D399K和E357K，第一Fc中的K409D和K370D以及第二Fc中的D399K和D357K，第一Fc中的D399K和第二Fc中的K409D和K360D，和/或第一Fc中的K409D和K439D以及第二Fc中的D399K和D356K。此外，半胱氨酸可被引入以稳定异二聚体的配对，例如第一Fc中的S234C和第二Fc中的Y349C，或者第一Fc中的Y349C和第二Fc中的S344C。
当涉及蛋白质或肽时，短语“特异性(或选择性)结合”抗体或“对……特异性(或选择性)免疫反应的”指的是决定蛋白质存在与否的结合反应，所述结合反应通常在蛋白质和其他生物制品的异质群体中。因此，在指定的免疫分析条件下，指定的抗体与特定蛋白质结合程度至少为背景的两倍，通常超过背景的10至100倍。在这样的条件下，抗体的特异性结合需要根据其对特定蛋白质的特异性来选择抗体。例如，可以选择多克隆抗体，以仅获得与所选抗原而不是与其他蛋白质具有特异性免疫反应的多克隆抗体。这种选择可以通过除去与其他分子发生交叉反应的抗体来实现。多种免疫分析形式可用于选择与特定蛋白具有特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫分析通常用于选择与蛋白质具有特异性免疫反应的抗体(有关可用于确定特异性免疫反应性的免疫分析形式和条件的描述请参见例如Harlow和Lane，《抗体使用，实验室手册(Using Antibodies,A Laboratory Manual)》(1998))。
“免疫应答”是指免疫系统的细胞(例如T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突状细胞和中性粒细胞)以及由任何这些细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括Ab、细胞因子和补体)的作用，该作用导致选择性靶向、结合、杀伤、破坏和/或清除脊椎动物体内入侵的病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞，或者，在自身免疫疾病、神经退行性疾病或病理性炎症的情况下，所述作用导致选择性靶向、结合、杀伤、破坏和/或清除正常人体细胞或组织。
“免疫调节剂”是指调节免疫应答的物质、试剂、信号通路或其组成部分。“调节”、“调整”或“调控”免疫应答是指免疫系统细胞或此类细胞的活性的任何变化。这种调节包括刺激或抑制免疫系统，表现为各种细胞类型数量的增加或减少，此类细胞活性的增加或降低，或免疫系统内可能发生的任何其他变化。抑制性和刺激性免疫调节剂已被鉴定，其中一些可在癌症、传染病或神经退行性微环境中具有增强功能。
细胞毒性T细胞(也称为TC、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、细胞溶解性T细胞、CD8+T细胞或杀伤性T细胞)是一种T淋巴细胞(一种白细胞)，其可杀死癌细胞、被感染(尤其是病毒感染)的细胞，或以其他方式受损的细胞。
术语“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其他方式调整免疫应答的方法，对患有疾病或有疾病感染或复发风险的患者进行的治疗。对受试者的“治疗”或“诊治”是指对受试者进行的任何类型的干预或处理，或向受试者施用活性剂，其目的是逆转、减轻、改善、抑制、减缓或预防与疾病相关的症状、并发症、状况或生化指标的发生、进程、发展、严重程度或复发。
“增强内源性免疫应答”意味着增加受试者已有的免疫应答的有效性或效力。有效性和效力的这种增加可以通过，例如克服抑制内源性宿主免疫应答的机制或刺激增强内源性宿主免疫应答的机制来实现。
当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，该核酸是“可操作地连接”的。例如，如果一前导序列或分泌引导序列的DNA作为参与多肽分泌的前蛋白进行表达，则该DNA与所述多肽的DNA可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则该启动子或增强子与编码序列可操作地连接；或者，如果核糖体结合位点被定位为便于翻译的位置，则其与编码序列可操作性地连接。一般而言，“可操作地连接”是指被连接的DNA序列彼此靠近，并且对于分泌引导序列而言，被连接的DNA序列是连续的且处于阅读阶段。然而，增强子不必是连续的。连接是通过在方便的限制位点进行连接反应来完成的。如果这些位点不存在，则根据常规做法使用合成寡核苷酸接头或连接子。
“保守修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。对于特定的核酸序列，保守修饰变体是指编码相同或基本相同氨基酸序列的核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，保守修饰变体是指基本相同的序列。由于遗传密码子的简并性，大量功能相同的核酸可编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码丙氨酸氨基酸。因此在由密码子限定的丙氨酸的每个位置，密码子可被改变为所述的任何相应密码子，而不会改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，是保守修饰变异的一种。本文中编码多肽的每个核酸序列还描述了核酸的每一种可能的沉默变异。技术人员将理解，核酸中的每个密码子(除了AUG(通常是甲硫氨酸的唯一密码子)和TGG(通常是色氨酸的唯一密码子))可被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每个沉默变异都隐含在关于表达产物的每个所描述的序列中，而不是关于实际探针序列的序列中。
在涉及两个或更多核酸或多肽序列时，术语“相同”或百分比“同一性”是指两个或多个相同的序列或子序列，或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列(即当两个或多个序列被比较和对齐以获得在比较窗口或指定区域上的最大相似性时，其在指定区域上具有约60％的同一性，优选地65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)，所述百分比使用具有以下所述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法测得，或通过手动对齐和目视检查测得。这样的序列就被称为“基本相同”。这个定义也指，或者也可应用于，测试序列的互补链。该定义还包括具有删除和/或添加，以及具有替换的序列。如下文所述，优选的算法可考虑间隙等。优选地，同一性存在于长度至少约为25个氨基酸或核苷酸的区域上，或更优选地存在于长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上。
进行序列比较时，通常用一条序列作为参考序列，与测试序列进行比较。使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，必要时指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，可使用默认程序参数，也可指定可选参数。然后，序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
本文所用的“比较窗口”包括涉及选自下组的多个连续位点中任一的片段：从20到参考序列的全长，通常为约25到100，或50到约150，更通常为约100到约150，其中在两个序列最佳对齐后，一个序列可与具有相同数量连续位点的参考序列进行比较。用于比较的序列对齐方法是本领域众所周知的。用于比较的最佳序列对齐可以通过以下方法进行：例如，通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法，通过Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源对齐算法，通过Pearson和Lipman，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的相似性检索法，通过这些算法的计算机实现(威斯康星州麦迪逊市科学大道575号遗传学计算机组威斯康星州遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过手动对齐和目视检查(参见，例如《分子生物学实验指南(CurrentProtocols in Molecular Biology)》(Ausubel等人编辑，1995年增补版))。
适用于确定序列同一性和序列相似性的百分比的优选算法示例是BLAST和BLAST2.0算法，分别如Altschul等人，Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)和Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中所述。使用BLAST和BLAST 2.0，用本文所述的参数来确定本发明核酸和蛋白质的序列同一性百分比。进行BLAST分析的软件可通过美国国立生物技术信息中心公开获得。该算法首先通过识别查询序列中长度为W的短片段来识别高得分序列对(HSP)，当短片段与数据库序列中相同长度的片段对齐时，则这些片段匹配或符合某个正阈值得分T。T指邻域词得分阈值(Altschul等人，见前)。这些最初的邻域词命中充当了种子，用于启动搜索以找到包含它们的更长的HSP。只要累积对齐分数可以增加，就沿着每条序列向两个方向延伸词命中。对于核苷酸序列，累积分数使用参数M(一对匹配残基的奖励分数；始终＞0)和N(不匹配残基的罚分；始终＜0)计算。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积分数。词命中在各方向上的延伸在下列情况下停止：累积对齐分数从其达到的最大值下降了值X；由于一个或多个负评分残基对齐的累积，累积分数降到了0或0以下；或到达了任一序列的末尾。BLAST算法的参数W、T和X决定了对齐的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的默认字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默认字长(W)为3、期望值(E)为10，并使用BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))对齐值(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，且用于两条链的比较。
“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物及其互补链。该术语包括含有已知核苷酸类似物或经修饰主链残基或键的核酸，这些核酸可以是人工合成的、自然产生的和非自然产生的，与参考核酸具有类似的结合性质，并且以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的示例包括但不限于：硫代磷酸酯、磷酰胺、膦酸甲酯、手性甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽核酸(PNAs)。
除非另有说明，特定核酸序列还隐含包括其保守修饰变体(例如，简并密码子替换)和互补序列，以及明确指示的序列。具体而言，简并密码子替换可以通过产生其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；
Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes8:91-98(1994))。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
特定核酸序列也隐含包括“剪接变体”。类似地，由核酸编码的特定蛋白质隐含包括由该核酸剪接变体编码的任何蛋白质。“剪接变体”顾名思义是基因选择性剪接的产物。转录后，初始核酸转录产物可被剪接，以便不同(替换)核酸剪接产物编码不同的多肽。剪接变体的产生机制各不相同，但都包括外显子的交替剪接。该定义还包括由同一核酸通过通读转录衍生的替代多肽。该定义包括剪接反应的任何产物，包括剪接产物的重组形式。在Leicher等人，J.Biol.Chem.
273(52):35095-35101(1998)中讨论了钾通道剪接变体的示例。
当涉及核酸部分时，使用的术语“异源”表示该核酸包括两个或多个在性质上彼此之间没有发现相同关系的子序列。例如，核酸通常是重组产生的，具有来自不相关基因的两个或多个序列，这些序列被排列以产生新的功能性核酸，例如，来自一个来源的启动子和来自另一来源的编码区。类似地，异源蛋白质表示该蛋白质包含两个或多个在性质上彼此之间没有相同关系的子序列(例如，融合蛋白)。
如本文所用，术语“预防”是指抑制或延缓疾病发生的所有行为。
如本文所用，术语“治疗”是指减轻、改善或缓解疾病症状的所有行为。在本说明书中，“治疗”是指癌症、神经退行性疾病或传染病的症状通过施用本文所公开的抗体而得到减轻、改善或缓解。
术语“施用”是指通过某种合适的方法将一定量的预定物质引入患者体内。本文公开的组合物可以通过任何常见途径给药，只要其能够到达所需组织，所述途径例如但不限于：腹腔内、静脉内、肌肉内、皮下、皮内、口服、局部、鼻内、肺内或直肠内给药。然而，由于肽在口服给药时会被消化，因此用于口服给药的组合物的活性成分应被包被或配制以防止在胃中的降解。
术语“受试者”是指被怀疑患有或被诊断为患有癌症、神经退行性疾病或传染病的对象。然而，任何使用本文所公开的药物组合物进行治疗的受试者都包括在内且不限于此。本文公开的包含抗DLL3抗体的药物组合物被施用于被怀疑患有癌症、神经退行性疾病或传染病的受试者。
含有所需序列和控制序列的合适载体的构建采用标准的连接和限制技术，这在本领域中是众所周知的(参见Maniatis等人，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，冷泉港实验室，纽约(1982))。分离的质粒、DNA序列或合成的寡核苷酸以所需的形式被切割、裁剪和重新连接。
对于抗体(例如重组、单克隆或多克隆抗体)的制备，可以使用本领域已知的许多技术(参见，例如Kohler和Milstein，《自然(Nature)》256:495-497(1975)；Kozbor等人，《今日免疫学(Immunology Today)》4:72(1983)；Cole等人，《单克隆抗体与癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)》，Alan R.Liss股份有限公司，第77-96页(1985)；Coligan，《免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》(1991)；Harlow和Lane，《抗体，实验室手册(Antibodies,A Laboratory Manual)》(1988)；和Goding，《单克隆抗体：原理与实践(Monoclonal Antibodies:Principles and Practice)》(1986年第二版))。编码感兴趣的抗体重链和轻链的基因可从细胞中克隆，例如，编码单克隆抗体的基因可从杂交瘤中克隆出来，并用于生产重组单克隆抗体。编码单克隆抗体重链和轻链的基因库也可从杂交瘤或浆细胞中制备。重链和轻链基因产物的随机组合可产生大量具有不同抗原特异性的抗体(参见，例如Kuby，《免疫学(Immunology)》(1997年第三版))。单链抗体或重组抗体的生产技术(美国专利号4,946,778、美国专利号4,816,567)可用于产生本发明多肽的抗体。此外，转基因小鼠或其他生物体(如其他哺乳动物)可用于表达人源化抗体或人类抗体(参见，例如，美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，Marks等人，《生物/技术(Bio/Technology)》10:779-783(1992)；Lonberg等人，《自然》368:856-859(1994)；Morrison，《自然(Nature)》368:812-13(1994)；Fishwild等人，《自然生物技术(Nature Biotechnology)》14:845-51(1996)；Neuberger，《自然生物技术(Nature Biotechnology)》14:826(1996)；以及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。或者，噬菌体展示技术可用于识别抗体和特异性结合选定抗原的异聚Fab片段(参见，例如，McCafferty等人，《自然(Nature)》348:552-554(1990)；Marks等人，《生物技术(Biotechnology)》10:779-783(1992))。抗体也可以制备为双特异性的，即能够识别两种不同的抗原(参见，例如，WO 93/08829，Traunecker等人，EMBOJ.10:3655-3659(1991)；和Suresh等人，《酶学方法(Methods in Enzymology)》121:210(1986))。抗体也可以是异源偶联物，例如两个共价连接的抗体或免疫毒素(参见，例如，美国专利号4,676,980、WO 91/00360；和WO 92/200373)。
将抗体人源化的方法在本领域是众所周知的。通常，人源化的抗体具有从非人类来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基一般被称为引入残基，通常取自引入可变域。人源化基本上可以按照Winter及其同事的方法(参见，例如Jones等人，《自然(Nature)》321:522-525(1986)；Riechmann等人，《自然(Nature)》332:323-327(1988)；Verhoeyen等人，《科学(Science)》239:1534-1536(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992))，通过用啮齿动物CDRs或CDR序列替换人类抗体的相应序列进行。因此，此类人源化抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于完整的人可变结构域已被非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是一种人类抗体，其中一些CDR残基和可能的一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基取代。
术语“癌症”是指人类癌症和恶性肿瘤、肉瘤、腺癌等，包括实体瘤、肾癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、尿路癌、尿道癌、阴茎癌、外阴癌、阴道癌、宫颈癌、结肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、脑癌、头颈癌、皮肤癌、子宫癌、睾丸癌、食道癌和肝癌。其他癌症包括例如霍奇金病、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、小细胞肺癌、原发性脑瘤、胃癌、结肠癌、恶性胰岛细胞瘤、恶性类癌、癌前皮肤病变、睾丸癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食管癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、宫颈癌、子宫内膜癌和肾上腺皮质癌。
术语“检查点抑制剂”或“免疫检查点抑制剂”是指诸如抑制/阻断抑制性检查点分子的药物的试剂。一些癌症可以通过刺激免疫检查点靶点来保护自身免受攻击。检查点疗法可以阻断抑制性检查点，恢复免疫系统功能。
术语“免疫检查点调节剂”是指受体及其相关配体，它们共同提供了抑制或刺激信号通路的手段，否则会导致T细胞激活。免疫检查点调节剂包括TIGIT及其CD155配体，PVR；PD-1及其配体，PD-L1和PD-L2；CTLA-4及其配体，B7-1和B7-2；TIM-3及其配体，半乳糖凝集素-9；LAG-3及其配体，包括肝窦内皮细胞凝集素(LSECtin)和半乳糖凝集素-3；CD122及其CD122R配体；CD70、B7H3、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA)和VISTA。
术语“检查点调节剂拮抗剂”、“免疫检查点结合拮抗剂”和“免疫检查点拮抗剂”指的是一类干扰(或抑制)免疫检查点调节剂活性的试剂，从而通过其与检查点调节剂或其配体的结合，阻断或抑制通过检查点调节剂受体的信号传导。通过抑制这种信号传导，可以逆转免疫抑制，从而重新建立或增强针对癌细胞的T细胞免疫。免疫检查点调节剂拮抗剂包括无论是单独形式还是作为融合蛋白或结合物的一部分的抗体片段、肽抑制剂、显性负性肽和小分子药物。检查点调节剂拮抗剂的示例靶点包括PD1、PDL1、CTLA4、LAG3、TIM-3、TIGIT、VISTA。
术语“免疫检查点结合激动剂”和“免疫检查点激动剂”是指刺激免疫检查点调节剂活性的一类试剂，从而通过其与检查点调节剂或其配体的结合，刺激通过检查点调节剂受体的信号传导。通过刺激这种信号传导，可以重新建立或增强针对癌细胞的T细胞免疫。检查点调节剂激动剂的靶点包括：肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员(例如CD27、CD40、OX40(CD134))、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关蛋白(GITR)和4-1BB(CD137)及它们的配体。检查点调节剂激动剂的其他靶点属于B7-CD28超家族，包括CD28和ICOS。
在上述任一实施方式中，本发明的抗体可进一步与一种或多种癌症疗法共同施用，例如化疗、放疗、免疫治疗、手术或激素治疗。
在一个实施方式中，所述化疗剂是烷基化剂：氮芥、亚硝基脲、四嗪、氮杂环丙烷、顺铂及其衍生物，以及非经典烷基化剂。氮芥包括：二氯甲二乙胺、环磷酰胺、马法兰、氯丁嘧啶、异环磷酰胺和白消安。亚硝基脲包括：N-亚硝基-N-甲基脲(MNU)、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)和司莫司汀(MeCCNU)、福莫司汀和链脲佐菌素。四嗪包括：达卡巴嗪、米托唑胺和替莫唑胺。氮杂环丙烷包括：塞替派、丝裂霉素和地吖醌(AZQ)。顺铂及其衍生物包括：顺铂、卡铂和奥沙利铂。在一个实施方式中，所述化疗剂是抗代谢剂：抗叶酸剂(例如，甲氨蝶呤)、氟嘧啶(例如，氟尿嘧啶和卡培他滨)、脱氧核苷类似物和巯基嘌呤。在另一实施方式中，所述化疗剂是一种抗微管剂，例如长春花生物碱(例如长春新碱和长春花碱)和紫杉烷(例如紫杉醇和多西他赛)。在另一实施方式中，所述化疗剂是拓扑异构酶抑制剂或细胞毒性抗生素，例如阿霉素、米托蒽醌、博莱霉素、放线菌素和丝裂霉素。
患者与抗体或抗体片段的接触可以通过静脉、腹腔内、肌肉内、肿瘤内或皮内给予患者抗体。在一些实施方式中，所述抗体与癌症治疗剂共同施用。
本文中使用的术语“制剂”是指结合在一起的本文中公开的抗体和赋形剂，其可用于给药，并且能够结合相应的受体并启动产生所需活性的信号转导途径。所述制剂可任选地包括其他试剂。
根据本领域的惯例，所有数值指定(例如pH、温度、时间、浓度和分子量)，包括范围值，都应理解为近似值。当在本文中使用时，术语“约”可能意味着根据上下文给出的适当情况，所述量的变化(+)或(-)1％、5％或10％。应理解，尽管并非总是明确说明，但本文所述试剂仅为示例性试剂，且其等价物是本领域已知的。
许多已知和有用的化合物等可在宾夕法尼亚州伊斯顿市麦克出版公司(MackPublishing Company)出版的《雷明顿制药科学(Remington’s PharmaceuticalSciences)》(第13版)——各种给药的标准参考中找到。如本文所用，术语“制剂”是指至少一种活性成分与一种或多种其他成分(通常也称为赋形剂)的组合，所述其他成分可以独立地为活性成分或非活性成分。术语“制剂”可以指或可以不指用于施用给人或动物的药学上可接受的组合物，并且可以包括作为存储或研究用途的有用中间体的组合物。
本发明方法的患者和受试者除了人类之外，还可以是动物受试者，因此适合此类受试者的制剂也是合适的。此类受试者包括牲畜和宠物以及运动动物，如马、灰狗等。
发明详述
DLL3基因为制造有助于控制Notch通路(胚胎发育的重要通路)的蛋白质提供了指导。DLL3通常是一种胞内蛋白，但也表达于癌细胞表面。DLL3在细胞内部正常表达，在正常组织中低水平表达。然而，肺肿瘤细胞过表达该基因并且细胞表面DLL3水平升高。最近的研究报道，DLL3也表达于其他神经内分泌来源的肿瘤类型，包括黑色素瘤、多形性胶质母细胞瘤、小细胞膀胱癌、转移性去势抵抗性前列腺癌和神经内分泌肺肿瘤。
CD(分化簇)分子(例如CD3、CD28和CD137)CD3、CD28和CD137是存在于T细胞上的受体。T细胞可通过CD3、CD28和CD137被抗原提呈细胞激活。激活或招募T细胞以杀伤肿瘤细胞需要两种平行的治疗策略。
本发明的实施方式包括使用抗DLL3抗体和抗体结合物、其药物组合物和制品来诊断、预测、治疗、监测和预防癌症(包括难治性癌症)的方法。更具体地，本发明针对结合DLL3并激活CD(分化簇)分子(例如CD3、CD28和CD137)的双特异性或三特异性分子。
本发明的实施方式还包括使用抗MUC17抗体和抗体结合物、其药物组合物和制品来诊断、预测、治疗、监测和预防癌症(包括难治性癌症)的方法。更具体地，本发明针对结合MUC17并激活CD(分化簇)分子(例如CD3、CD28和CD137)的双特异性或三特异性分子。
本发明的实施方式还包括使用抗CLDN18.2抗体和抗体结合物、其药物组合物和制品来诊断、预测、治疗、监测和预防癌症(包括难治性癌症)的方法。更具体地，本发明针对结合CLDN18.2并激活CD(分化簇)分子(例如CD3、CD28和CD137)的双特异性分子。
DLL3 T细胞接合器
本发明的实施方式包括双特异性和三特异性单克隆抗体(分别为BSMAb和TSMAb)。第一抗体的单链可变片段(scFv)可以与第二抗体的抗原结合片段(Fab)连接。例如，抗CD3抗体的scFv部分可以与抗DLL3抗体的Fab部分连接。其可以通过4xGKPGS或4xG4S连接子连接。IgG1 Fc可以通过电荷对或“杵臼”突变或电荷对突变进行异二聚化。通过引入N297A/G突变或LLP突变，可以最小化Fc效应子功能。该组合可将效应细胞(T细胞或NK细胞)带入肿瘤细胞附近，以增强抗肿瘤效果。
图1A-1R、8A-8C和9A-9F描述了本发明三特异性分子的几种形式。DLL3 x CD3三特异性分子可以激活T细胞对表达DLL3的CHO细胞或NCI-H82肿瘤细胞的细胞毒性。这通过细胞死亡时LDH的释放以及T细胞上CD25的上调得到例证。当与DLL3 x CD28或DLL3 x CD137三特异性分子结合时，T细胞进一步被激活、增殖并释放IFNγ和IL-2。
CD28信号传导对于抗PD1和抗PDL1抗体的活性至关重要，因此，将DLL3 x CD28三特异性分子与抗PD1及抗PDL1分子共同给药可增强对PD1/PDL1通路抑制的反应。CD137在活化的T细胞上高表达，单独刺激PD1/PDL1不能刺激其表达。然而，DLL3 x CD137或DLL3 xCD28 x CD137刺激结合PD-1阻断可产生强大的抗肿瘤免疫。
图1A-1R描绘了以Scfv-Scfv-Fc x Fab-Fc结构将抗-DLL3与抗-CD3、抗-CD28与抗-CD137组合在一起的三特异性分子。图1A-1F描绘了scfv-DLL3scfv-Fc x Fab-Fc结构的三特异性。图1G-1L描绘了DLL3scfv-scfv-Fc x Fab-Fc结构的三特异性分子。图1M-1R描绘了scfv-scfv-Fc x DLL3Fab-Fc结构的三特异性分子。
图8A-8C描绘了具有两个CD137 Fab片段的双特异性和三特异性分子。图8A描绘了抗-CD137、抗-DLL3、抗-DLL3(Fab-Fc-Scfv)分子。图8B描绘了抗-CD137、抗-DLL3、抗-CD3(Fab-Fc-Scfv x Fab-Fc-Scfv)分子。图8C描绘了抗-CD137、抗-DLL3、抗-CD3(Fab-Fc-Scfv-Scfv x Fab-Fc)分子。
图9A-9F描绘了具有两个CD137片段的三特异性分子。图9A描绘了抗-DDL3、抗-CD3、抗-CD137、抗-CD137(scfv-scfv-Fc-Scfv x Fc-Scfv)分子。图9B描绘了抗-DDL3、抗-CD3、抗-CD137、抗-CD137(scfv-scfv-Fc x Scfv-Fc-Scfv)分子。图9C描绘了抗-CD137、抗-CD137、抗-DLL3(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。图9D描绘了抗-DLL3、抗-CD137、抗-CD137(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。图9E描绘了抗-DLL3、抗-CD3、抗-DLL3、抗-CD137(Fab-Fc-Scfv x Scfv-Fc-Scfv)分子。图9F描绘了抗-DLL3、抗-CD3、抗-CD137、抗-CD137(Fab-Fc-Scfv-Scfv x Scfv-Fc)分子。
MUC17 T细胞接合器
图10A-10R、18A-18D和19A-19J描述了本发明三特异性分子的几种形式。
图10A-10R描绘了以Scfv-Scfv-Fc x Fab-Fc结构将抗-MUC17与抗-CD3、抗-CD28与抗-CD137组合在一起的三特异性分子。图10A-10F描绘了scfv-MUC17scfv-Fc x Fab-Fc结构的三特异性。图1G-1L描绘了MUC17scfv-scfv-Fc x Fab-Fc结构的三特异性分子。图1M-1R描绘了scfv-scfv-Fc x MUC17Fab-Fc结构的三特异性分子。
图18A-18D描绘了Muc17 x CD137和DLL3 x CD137双特异性分子。
图19A-19C描绘了具有两个CD137 Fab片段的三特异性分子。图19A描绘了抗-CD137、抗-MUC17、抗-MUC17(Fab-Fc-Scfv-Scfv)分子。图19B描绘了抗-CD137、抗-MUC17、抗-CD3(Fab-Fc-Scfv x Fab-Fc-Scfv)分子。图19C描绘了抗-CD137、抗-MUC17、抗-CD3(Fab-Fc-Scfv-Scfv x Fab-Fc)分子。图19E-9J描绘了具有两个CD137 scfv片段的双特异性分子和三特异性分子。图19E描绘了抗-CD137、抗-CD137、抗-MUC17(scfv-scfv-Fc xFab-Fc)分子。图19F描绘了抗-MUC17、抗-CD137、抗-CD137(scfv-scfv-Fc x Fab-Fc)分子。图19G描绘了抗-MUC17、抗-CD137、CD3、CD137(Fab-Fc-Scfv x Scfv-Fc-Scfv)分子。图19H描绘了抗-MUC17、抗-CD137、抗-CD137、CD3(Fab-Fc-Scfv-Scfv x Scfv-Fc)分子。图19I描绘了抗-MUC17、抗-CD3、抗-CD137、抗-CD137(scfv-scfv-FScfv x Fc-Scfv)分子。图19J描绘了抗-DDL3、抗-CD3、抗-CD137、抗-MUC17(scfv-scfv-Fc x Scfv-Fc-Scfv)分子。
在一个实施方式中，所述三特异性分子可以与例如PD1、PDL1、TIGIT、LAG3、TIM3、VISTA或CTLA4的拮抗剂共同施用或组合。或者，所述三特异性分子可以与例如PD1 xTIGIT、LAG3 x TIGIT、PD1 x LAG3、PD1 x TIM3或VEGF x TGFBR2的双特异性拮抗剂共同施用或组合。所述三特异性分子也可以与例如CD40、GITR、CD27、OX40或4-1BB的激动剂共同施用或组合。
CLDN18.2 T细胞接合器
本发明的实施方式包括双特异性和三特异性单克隆抗体(分别为BSMAb和TSMAb)。第一抗体的单链可变片段(scFv)可以与第二抗体的抗原结合片段(Fab)连接。例如，抗CD3抗体的scFv部分可以与抗CLDN8.2抗体的Fab部分连接。其可以通过4xGKPGS或4xG4S连接子连接。IgG1 Fc可以通过电荷对或“杵臼”突变或电荷对突变进行异二聚化。通过引入N297A/G突变或LLP突变，可以最小化Fc效应子功能。该组合可将效应细胞(T细胞或NK细胞)带入肿瘤细胞附近，以增强抗肿瘤效果。
CD28信号传导对于抗PD1和抗PDL1抗体的活性至关重要，因此，将CLDN18.2 xCD28三特异性分子与抗PD1及抗PDL1分子共同给药可增强对PD1/PDL1通路抑制的反应。CD137在活化的T细胞上高表达，单独刺激PD1/PDL1不能刺激其表达。然而，CLDN18.2 xCD137或CLDN18.2 x CD28 x CD137刺激结合PD-1阻断可产生强大的抗肿瘤免疫。
图20A–20R和25A–25I描绘了本发明三特异性分子的几种形式。CLDN18.2 x CD3三特异性分子可以激活T细胞对表达CLDN18.2的CHO细胞或NCI-H82肿瘤细胞的细胞毒性。这通过细胞死亡时LDH的释放以及T细胞上CD25的上调得到例证。当与CLDN18.2 x CD28或CLDN18.2 x CD137三特异性分子结合时，T细胞进一步被激活、增殖并释放IFNγ和IL-2。
图20A-20R描绘了以Scfv-Scfv-Fc x Fab-Fc结构将抗-CLDN18.2与抗-CD3、抗-CD28与抗-CD137组合在一起的三特异性分子。图20A-20F描绘了scfv-CLDn18.1scfv-Fc xFab-Fc结构的三特异性分子。图20G-20L描绘了CLDN18.2scfv-scfv-Fc x Fab-Fc结构的三特异性分子。图20M-20R描绘了scfv-scfv-Fc x CLDN18.2Fab-Fc结构的三特异性分子。
图25A-25C描绘了具有两个CD137 Fab片段的CLDN18.2双特异性和三特异性分子。
图25A描绘了抗-CD137、抗-CLDN18.2、抗-CLDN(Fab-Fc-Scfv)分子。图25B描绘了抗-CD137、抗-CLDN18.2、抗-CD3(Fab-Fc-Scfv x Fab-Fc-Scfv)分子。图25D和25E描绘了具有两个CD137片段的三特异性分子。
图25D描绘了抗-CD137、抗-CD137、抗-CLDN18.2双特异性分子(Scfv-Scfv-Fc xFab-Fc)。类似地，图25E描绘了抗-CLDN18.2、抗-CD137、抗-CD137三特异性分子(Scfv-Scfv-Fc x Fab-Fc)。
图25F-25I描绘了具有两个CD137 scfv片段的三特异性分子。图25F描绘了抗-CLDN18.2、抗-CD3、抗-CD137、抗-CD137(Fab-Fc-Scfv x ScfvFc-Scfv)分子。图25G描绘了抗-CLDN18.2、抗-CD3、抗-CD137、抗-CD137(Fab-Fc-Scfv-Scfv x Scfv-Fc)分子。图25H描绘了抗-CLDN18.2、抗-CD3、抗-CD137、抗-CD137(scfv-scfv-Fc-Scfv x Fc-Scfv)分子。图25I描绘了抗-CLDN18.2、抗-CD3、抗-CD137、抗-CD137(scfv-scfv-Fc x Scfv-Fc-Scfv)分子。
在一个实施方式中，所述三特异性分子可以与例如PD1、PDL1、TIGIT、LAG3、TIM3、VISTA或CTLA4的拮抗剂共同施用或组合。或者，所述三特异性分子可以与例如PD1 xTIGIT、LAG3 x TIGIT、PD1 x LAG3、PD1 x TIM3或VEGF x TGFBR2的双特异性拮抗剂共同施用或组合。所述三特异性分子也可以与例如CD40、GITR、CD27、OX40或4-1BB的激动剂共同施用或组合。
三特异性T细胞接合器的生产方法
另一方面涉及生产三特异性抗体的方法，其包括培养瞬时或稳定表达一个或多个构建物的细胞，所述构建物编码三特异性抗体中的一个或多个多肽链；以及从培养的细胞中纯化三特异性抗体。可以采用能够生产功能性三特异性抗体的任何细胞。在优选的实施方式中，表达三特异性抗体的细胞是来源于真核或哺乳动物，优选人细胞或中国仓鼠细胞。可使用来自不同组织细胞类型的细胞表达三特异性抗体。在其它实施方式中，所述细胞是酵母细胞、昆虫细胞或细菌细胞。优选地，用表达三特异性抗体的载体稳定地转化生产三特异性抗体的细胞。
可以通过任何常规方法将编码抗体重链或轻链的一个或多个表达载体引入细胞，例如通过裸DNA技术、阳离子脂质介导的转染、聚合物介导的转染、肽介导的转染、病毒介导的感染、物理或化学试剂或处理、电穿孔等。此外，可以将一个或多个用于表达三特异性抗体的表达载体连同有助于选择表达三特性抗体的稳定转克隆的选择性标记来转染细胞。可根据本领域已知的技术收集和/或纯化由此类细胞产生的抗体，例如通过离心、色谱等。
用于哺乳动物细胞的合适的选择性标记包括二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、水霉素、玉米霉素、速溶菌素和嘌呤霉素。当这种选择性标记物成功转移到哺乳动物宿主细胞中时，如果置于选择性压力下，转化的哺乳动物宿主细胞可以存活。有两种广泛使用的不同类型的选择性策略。第一类策略是基于细胞的新陈代谢和使用缺乏不依赖补充培养基生长能力的突变细胞系。两个示例是CHO DHFR细胞和小鼠LTK细胞。这些细胞在不添加例如胸腺嘧啶或次黄嘌呤的营养素的情况下缺乏生长能力。由于这些细胞缺乏完整核苷酸合成途径所需的特定基因，除非在补充培养基中提供缺失的核苷酸，否则它们无法存活。补充培养基的另一个选项是将完整的DHFR或TK基因导入缺乏相应基因的细胞，从而改变其生长需求。未经DHFR或TK基因转化的个体细胞将无法在非补充培养基中存活。
第二类策略是显性选择，其是在任何细胞类型中使用的选择方案，并且不需要使用突变细胞系。这些方案通常使用药物来阻止宿主细胞的生长。那些具有新基因的细胞会表达一种传递耐药性的蛋白，并能从选择中活下来。这种显性选择的示例使用新霉素、霉酚酸或潮霉素。这三个示例利用真核控制下的细菌基因传递分别对合适的药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的耐药性。其他包括新霉素类似物G418和嘌呤霉素。
示例性的表达三特异性抗体的细胞包括人Jurkat、人胚胎肾(HEK)293、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、小鼠WEHI纤维肉瘤细胞，以及单细胞原生动物物种，如塔伦塔利什曼原虫。此外，可以使用用c-myc或其他永生化剂永生化的原代细胞来生产稳定转化的抗体生产细胞系。
在一些实施方式中，所述细胞系表达至少1 mg、至少2 mg、至少5 mg、至少10 mg、至少20 mg、至少50 mg、至少100 mg、至少500 mg、至少1 g、至少2 g、至少4 g或至少10 g的三特异性抗体/升培养物。在任何合适的培养基(如RPMI、DMEM和AIM
Figure BDA0003908291310000331
)中培养和维持后，可以从表达三特异性抗体的细胞中分离出三特异性的抗体。可使用常规的蛋白纯化方法(例如，亲和纯化、色谱等)纯化三特异性抗体，包括使用蛋白A或蛋白G免疫亲和纯化。在一些实施方式中，三特异性抗体经工程化改造从而分泌到培养上清液中以便从中分离。
治疗方法
本申请的另一方面涉及一种治疗细胞增殖性紊乱的方法。该方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明的三特异性抗体。另一方面，治疗细胞增殖性紊乱的方法包括向有需要的受试者施用有效量的一种或多种表达本发明的三特异性抗体的表达载体。
可采用任何合适的给药途径或方式为患者提供治疗或预防有效剂量的三特异性抗体。示例性给药途径或方式包括肠外{例如，静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、肿瘤内)、口服、局部(鼻部、经皮、皮内或眼内)、粘膜{例如，鼻部、舌下、口腔、直肠、阴道)、吸入、淋巴管内、椎管内、颅内、腹腔内、气管内、膀胱内、鞘内、肠内、肺内、淋巴管内部、腔内、眶内、囊内和经尿道，以及经导管或支架的局部输送。
可以在任何药学上可接受的载体或赋形剂中配制包含本发明的三特异性抗体的药物组合物。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药物组合物可以包括合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。示例性的载体或赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖、淀粉、纤维素衍生物、明胶和聚乙二醇等聚合物。示例性的药学上可接受的载体包括下列一种或多种：水、生理盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其组合。在许多情况下，最好在组合物中包括等渗剂，例如糖、多醇，例如甘露醇、山梨醇或氯化钠。药学上可接受的载体可进一步包含少量辅料，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，其可提高治疗剂的保质期或有效性。
所述三特异性抗体可加入到适于肠外给药的药物组合物中。合适的缓冲液包括但不限于琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠或磷酸钾。氯化钠可用于调节浓度为0-300mM(对液体剂型，最佳地为150mM)的溶液的毒性。冻干剂型可包括防冻剂，主要是0-10％蔗糖(最佳地为0.5-1.0％)。其他合适的防冻剂包括海藻糖和乳糖。冻干剂型可包括填充剂，主要是1-10％甘露醇(最佳地为2-4％)。稳定剂可用于液体和冻干剂型中，主要是1-50mM L-蛋氨酸(最佳地为5-10mM)。其他合适的填充剂包括甘氨酸、精氨酸，其可以0-0.05％>聚山梨酯-80(最佳地为0.005-0.01％)加入。其他表面活性剂包括但不限于聚山梨酯20和BRIJ表面活性剂。
治疗性三特异性抗体制剂可以冷冻干燥并作为无菌粉末储存，优选真空储存，并在注射前用抑菌水(含有例如苯甲醇防腐剂)或无菌水重构。药物组合物可配制成通过注射(例如，通过推注或连续输注)来肠外给药。
药物组合物中的治疗剂可以配制为“治疗有效量”或“预防有效量”。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间下，达到所需治疗效果的有效用量。重组载体的治疗有效量可能因治疗条件、病情严重程度和病程、给药方式、抗体或制剂是为预防还是治疗目的而给药、特定制剂的生物利用度、三特异性抗体在个体中引发预期反应的能力、既往治疗、患者的年龄、体重和性别、患者的临床病史和对抗体的反应、所用三特异性血清的类型、主治医生的判断等而变化。治疗有效量也是指重组载体的任何毒性或有害作用被治疗有益作用所抵消的用量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间下，达到所需预防效果的有效用量。
优选地，三特异性抗体中的多肽结构域来自将在其中施用它们以减少对施用治疗剂的炎症反应的同一宿主。
三特异性抗体适合一次或在一系列治疗中给予患者，并且可以在诊断后的任何时间给予患者。三特异性抗体可以作为唯一的治疗，或与用于治疗相关症状的其他药物或治疗剂组合给予。
总体而言，无论是通过一次还是多次给药，所述三特异性抗体的治疗有效量或预防有效量将在约1ng/kg体重/天至约100mg/kg体重/天的范围内给药。在具体的实施方式中，各三特异性抗体在以下的范围内给药：约1ng/kg体重/天-约10mg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天-约1mg/kg体重/天、约1ng/kg体重/天-约100g/kg体重/天、约1ng/kg体重/天-约10g/kg体重/天、约1ng/kg体重/天-约1g/kg体重/天、约1ng/kg体重/天-约100ng/kg体重/天、约1ng/kg体重/天-约10ng/kg体重/天、约10ng/kg体重/天-约100mg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天-约10mg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天-约1mg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天-约100g/kg体重/天、约10ng/kg体重/天-约10mg/kg体重/天、约10ng/kg体重/天-约1mg/kg体重/天、10ng/kg体重/天-约100ng/kg体重/天、约100ng/kg体重/天-约100mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天-约10mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天-约1mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天-约100mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天-约10mg/kg体重/天、约100ng/kg体重/天-约1mg/kg体重/天、约1mg/kg体重/天-约100mg/kg体重/天、约1mg/kg体重/天-约10mg/kg体重/天、约1mg/kg体重/天-约1mg/kg体重/天、约1mg/kg体重/天-约100mg/kg体重/天、约1mg/kg体重/天-约10mg/kg体重/天、约10mg/kg体重/天-约100mg/kg体重/天、约10mg/kg体重/天-约10mg/kg体重/天、约10mg/kg体重/天-约1mg/kg体重/天、约10mg/kg体重/天-约100mg/kg体重/天、约100mg/kg体重/天-约100mg/kg体重/天、约100mg/kg体重/天-约10mg/kg体重/天、约100mg/kg体重/天-约1mg/kg体重/天、约1mg/kg体重/天-约100mg/kg体重/天、约1mg/kg体重/天-约10mg/kg体重/天、约10mg/kg体重/天-约100mg/kg体重/天。
在其他实施方式中，所述三特异性抗体以每三天500g至20g或每三天25mg/kg体重的剂量给药。
在其它实施方式中，各三特异性抗体的给药范围选自下组：每次单独注射约10ng-约100ng、每次单独注射约10ng-约1g、每次单独注射约10ng-约10g、每次单独注射约10ng-约100mg、每次单独注射约10ng-约1mg、每次单独注射约10ng-约10mg、每次单独注射约10ng-约100mg、每次注射约10ng-约1000mg、每次单独注射约10ng-约10,000mg、每次单独注射约100ng-约1mg、每次单独注射约100ng-约10mg、每次单独注射约100ng-约100mg、每次单独注射约100ng-约1mg、每次单独注射约100ng-约10mg、每次单独注射约100ng-约100mg、每次注射约100ng-约1000mg、每次单独注射约100ng-约10,000mg、每次单独注射约1mg-约10mg、每次单独注射约1mg-约100mg、每次单独注射约1mg-约1mg、每次单独注射约1mg-约10mg、每次单独注射约1mg-约100mg、每次注射约1mg-约1000mg、每次单独注射约1mg-约10,000mg、每次单独注射约10mg-约100mg、每次单独注射约10mg-约1mg、每次单独注射约10mg-约10mg、每次单独注射约10mg-约100mg、每次注射约10mg-约1000mg、每次单独注射约10mg-约10,000mg、每次单独注射约100mg-约1mg、每次单独注射约100mg-约10mg、每次单独注射约100mg-约100mg、每次注射约100mg-约1000mg、每次单独注射约100mg-约10,000mg、每次单独注射约1mg-约10mg、每次单独注射约1mg-约100mg、每次注射约1mg-约1000mg、每次单独注射约1mg-约10,000mg、每次单独注射约10mg-约100mg、每次注射约10mg-约1000mg、约10mg-约10,000mg、每次注射约100mg-约1000mg、每次单独给药约100mg-约10,000mg和每次单独给药约1000mg-约10,000mg。所述三特异性抗体可以每天、每2、3、4、5、6或7天、或每1、2、3或4周给药。
在其它具体的实施方式中，所述三特异性抗体的给药量可以以下组剂量给药：约0.0006mg/天、0.001mg/天、0.003mg/天、0.006mg/天、0.01mg/天、0.03mg/天、0.06mg/天、0.1mg/天、0.3mg/天、0.6mg/天、1mg/天、3mg/天、6mg/天、10mg/天、30mg/天、60mg/天、100mg/天、300mg/天、600mg/天、1000mg/天、2000mg/天、5000mg/天或10,000mg/天。如预期的，剂量将取决于患者的病症、体形、年龄和状况。
在某些实施方式中，将三特异性抗体的编码序列整合入合适的表达载体(例如，病毒或非病毒载体)以在具有细胞增殖性疾病的患者中表达有效量的三特异性抗体。在包括给药例如一个或多个重组AAV(rAAV)病毒的某些实施方式中，所述药物组合物可以包含rAAV，其数量包含每kg至少1010、至少1011、至少1012、至少1013或至少1014个基因组拷贝(GC)或重组病毒颗粒，或其中任何范围。在某些实施方式中，药物组合物包含有效量的重组病毒(例如rAAV)，其数量包含每位受试者至少1010、至少1011、至少1012、至少1013、至少1014、至少1015基因组拷贝或重组病毒颗粒基因组拷贝，或其中任何范围。
剂量可以在几种技术上认可的适用于任何特定细胞增殖性疾病的动物模型中测试。
递送方法还可以包括使用与杀伤的病毒连接或不连接的聚阳离子浓缩DNA、配体连接的DNA、脂质体、真核细胞递送载体细胞、光聚合水凝胶材料沉积物、使用手持基因转移粒子枪、电离辐射、核酸电荷中和或与细胞膜融合、粒子介导的基因转移等。
在该实施方式的其它方面，本文公开的药物组合物将肿瘤体积降低例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在该实施方式的另外其它方面，本文公开的药物组合物将肿瘤体积降低例如，约5％-约100％、约10％-约100％、约20％-约100％、约30％-约100％、约40％-约100％、约50％-约100％、约60％-约100％、约70％-约100％、约80％-约100％、约10％-约90％、约20％-约90％、约30％-约90％、约40％-约90％、约50％-约90％、约60％-约90％、约70％-约90％、约10％-约80％、约20％-约80％、约30％-约80％、约40％-约80％、约50％-约80％、或约60％-约80％、约10％-约70％、约20％-约70％、约30％-约70％、约40％-约70％或约50％-约70％。
本文公开的药物组合物是足以允许对个人进行常规给药的量。在该实施方式的各方面，本文公开的药物组合物可以是，例如至少5mg、至少10mg、至少15mg、至少20mg、至少25mg、至少30mg、至少35mg、至少40mg、至少45mg、至少50mg、至少55mg、至少60mg、至少65mg、至少70mg、至少75mg、至少80mg、至少85mg、至少90mg、至少95mg或至少100mg的药物组合物。在该实施方式的其它方面，本文公开的药物组合物可以是，例如至少5mg、至少10mg、至少20mg、至少25mg、至少50mg、至少75mg、至少100mg、至少200mg、至少300mg、至少400mg、至少500mg、至少600mg、至少700mg、至少800mg、至少900mg、至少1,000mg、至少1,100mg、至少1,200mg、至少1,300mg、至少1,400mg或至少1,500mg的药物组合物。在该实施方式的另外其它方面，本文公开的药物组合物可以在以下范围，例如约5mg-约100mg、约10mg-约100mg、约50mg-约150mg、约100mg-约250mg、约150mg-约350mg、约250mg-约500mg、约350mg-约600mg、约500mg-约750mg、约600mg-约900mg、约750mg-约1,000mg、约850mg-约1,200mg或约1,000mg-约1,500mg。在该实施方式的另外其它方面，本文公开的药物组合物可以在以下范围，例如约10mg-约250mg、约10mg-约500mg、约10mg-约750mg、约10mg-约1,000mg、约10mg-约1,500mg、约50mg-约250mg、约50mg-约500mg、约50mg-约750mg、约50mg-约1,000mg、约50mg-约1,500mg、约100mg-约250mg、约100mg-约500mg、约100mg-约750mg、约100mg-约1,000mg、约100mg-约1,500mg、约200mg-约500mg、约200mg-约750mg、约200mg-约1,000mg、约200mg-约1,500mg、约5mg-约1,500mg、约5mg-约1,000mg，或约5mg-约250mg。
本文公开的药物组合物可以包含足以溶解本文公开的药物组合物的量的溶剂、乳剂或其它稀释剂。在该实施方式的其它方面，本文公开的药物组合物可以包含溶剂、乳剂或其它稀释剂，其含量为，例如，少于约90％(v/v)、少于约80％(v/v)、少于约70％(v/v)、少于约65％(v/v)、少于约60％(v/v)、少于约55％(v/v)、少于约50％(v/v)、少于约45％(v/v)、少于约40％(v/v)、少于约35％(v/v)、少于约30％(v/v)、少于约25％(v/v)、少于约20％(v/v)、少于约15％(v/v)、少于约10％(v/v)、少于约5％(v/v)或少于约1％(v/v)。在该实施方式的其它方面，本文公开的药物组合物可以包含溶剂、乳剂或其它稀释剂，其含量范围在，例如约1％(v/v)-90％(v/v)、约1％(v/v)-70％(v/v)、约1％(v/v)-60％(v/v)、约1％(v/v)-50％(v/v)、约1％(v/v)-40％(v/v)、约1％(v/v)-30％(v/v)、约1％(v/v)-20％(v/v)、约1％(v/v)-10％(v/v)、约2％(v/v)-50％(v/v)、约2％(v/v)-40％(v/v)、约2％(v/v)-30％(v/v)、约2％(v/v)-20％(v/v)、约2％(v/v)-10％(v/v)、约4％(v/v)-50％(v/v)、约4％(v/v)-40％(v/v)、约4％(v/v)-30％(v/v)、约4％(v/v)-20％(v/v)、约4％(v/v)-10％(v/v)、约6％(v/v)-50％(v/v)、约6％(v/v)-40％(v/v)、约6％(v/v)-30％(v/v)、约6％(v/v)-20％(v/v)、约6％(v/v)-10％(v/v)、约8％(v/v)-50％(v/v)、约8％(v/v)-40％(v/v)、约8％(v/v)-30％(v/v)、约8％(v/v)-20％(v/v)、约8％(v/v)-15％(v/v)或约8％(v/v)-12％(v/v)。
本文公开的药物组合物中，本文公开的药物组合物的最终浓度可以是任何所需的浓度。在该实施方式的一方面，药物组合物中药物组合物的最终浓度可以是治疗有效量。在该实施方式的其它方面，药物组合物中药物组合物的最终浓度可以是例如，至少0.00001mg/mL、至少0.0001mg/mL、至少0.001mg/mL、至少0.01mg/mL、至少0.1mg/mL、至少1mg/mL、至少10mg/mL、至少25mg/mL、至少50mg/mL、至少100mg/mL、至少200mg/mL或至少500mg/mL。在该实施方式的其它方面，药物组合物中药物组合物的最终浓度可以是以下范围，例如约0.00001mg/mL-约3,000mg/mL、约0.0001mg/mL-约3,000mg/mL、约0.01mg/mL-约3,000mg/mL、约0.1mg/mL-约3,000mg/mL、约1mg/mL-约3,000mg/mL、约250mg/mL-约3,000mg/mL、约500mg/mL-约3,000mg/mL、约750mg/mL-约3,000mg/mL、约1,000mg/mL-约3,000mg/mL、约100mg/mL-约2,000mg/mL、约250mg/mL-约2,000mg/mL、约500mg/mL-约2,000mg/mL、约750mg/mL-约2,000mg/mL、约1,000mg/mL-约2,000mg/mL、约100mg/mL-约1,500mg/mL、约250mg/mL-约1,500mg/mL、约500mg/mL-约1,500mg/mL、约750mg/mL-约1,500mg/mL、约1,000mg/mL-约1,500mg/mL、约100mg/mL-约1,200mg/mL、约250mg/mL-约1,200mg/mL、约500mg/mL-约1,200mg/mL、约750mg/mL-约1,200mg/mL、约1,000mg/mL-约1,200mg/mL、约100mg/mL-约1,000mg/mL、约250mg/mL-约1,000mg/mL、约500mg/mL-约1,000mg/mL、约750mg/mL-约1,000mg/mL、约100mg/mL-约750mg/mL、约250mg/mL-约750mg/mL、约500mg/mL-约750mg/mL、约100mg/mL-约500mg/mL、约250mg/mL-约500mg/mL、约0.00001mg/mL-约0.0001mg/mL、约0.00001mg/mL-约0.001mg/mL、约0.00001mg/mL-约0.01mg/mL、约0.00001mg/mL-约0.1mg/mL、约0.00001mg/mL-约1mg/mL、约0.001mg/mL-约0.01mg/mL、约0.001mg/mL-约0.1mg/mL、约0.001mg/mL-约1mg/mL、约0.001mg/mL-约10mg/mL或约0.001mg/mL-约100mg/mL。
本说明书的各方面部分地公开了对患有癌症的个体的治疗。如本文所用，术语“治疗”是指在个体中降低或消除癌症的临床症状；或在个体中延迟或预防癌症的临床症状的发作。例如，术语“治疗”可以意味着将癌症的特征性症状(包括但不限于肿瘤体积)降低例如，至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。与癌症相关的实际症状是众所周知的，并且可以由本领域一般技术人员通过考虑以下因素来确定，包括但不限于癌症的部位、癌症的原因、癌症的严重程度和/或受癌症影响的组织或器官。本领域技术人员知晓与特定类型癌症相关的合适症状或指标，并知晓如何确定个体是否为本文所公开的治疗方法的候选者。
在另一方面，本文公开的药物组合物降低癌症相关疾病的症状的严重程度。在该实施方式的各方面，本文公开的药物组合物将癌症相关疾病的症状的严重程度降低例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在该实施方式的其它方面，本文公开的药物组合物将癌症相关疾病的症状的严重程度降低例如，约10％-约100％、约20％-约100％、约30％-约100％、约40％-约100％、约50％-约100％、约60％-约100％、约70％-约100％、约80％-约100％、约10％-约90％、约20％-约90％、约30％-约90％、约40％-约90％、约50％-约90％、约60％-约90％、约70％-约90％、约10％-约80％、约20％-约80％、约30％-约80％、约40％-约80％、约50％-约80％、或约60％-约80％、约10％-约70％、约20％-约70％、约30％-约70％、约40％-约70％或约50％-约70％。
在该实施方式的各方面，治疗有效量的本文公开的药物组合物将癌症相关症状降低例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在该实施方式的其它方面，治疗有效量的本文公开的药物组合物将癌症相关症状降低例如，至多10％、至多15％、至多20％、至多25％、至多30％、至多35％、至多40％、至多45％、至多50％、至多55％、至多60％、至多65％、至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、至多95％或至多100％。在该实施方式的另外其它方面，治疗有效量的本文公开的药物组合物将癌症相关症状降低例如，约10％-约100％、约10％-约90％、约10％-约80％、约10％-约70％、约10％-约60％、约10％-约50％、约10％-约40％、约20％-约100％、约20％-约90％、约20％-约80％、约20％-约20％、约20％-约60％、约20％-约50％、约20％-约40％、约30％-约100％、约30％-约90％、约30％-约80％、约30％-约70％、约30％-约60％或约30％-约50％。
在该实施方式的另外其它方面，治疗有效量的本文公开的药物组合物一般在约0.001mg/kg-约100mg/kg的范围内，并且例如每3、5、7、10或14天给药。在该实施方式的各方面，有效量的本文公开的药物组合物可以是例如，至少0.001mg/kg、至少0.01mg/kg、至少0.1mg/kg、至少1.0mg/kg、至少5.0mg/kg、至少10mg/kg、至少15mg/kg、至少20mg/kg、至少25mg/kg、至少30mg/kg、至少35mg/kg、至少40mg/kg、至少45mg/kg或至少50mg/kg，并且例如每3、5、7、10或14天给药。在该实施方式的其它方面，有效量的本文公开的药物组合物可以在以下范围，例如约0.001mg/kg-约10mg/kg、约0.001mg/kg/天-约15mg/kg、约0.001mg/kg-约20mg/kg、约0.001mg/kg-约25mg/kg、约0.001mg/kg-约30mg/kg、约0.001mg/kg-约35mg/kg、约0.001mg/kg-约40mg/kg、约0.001mg/kg-约45mg/kg、约0.001mg/kg-约50mg/kg、约0.001mg/kg-约75mg/kg或约0.001mg/kg-约100mg/kg，并且例如每3、5、7、10或14天给药。在该实施方式的另外其它方面，有效量的本文公开的药物组合物可以在以下范围，例如约0.01mg/kg-约10mg/kg、约0.01mg/kg-约15mg/kg、约0.01mg/kg-约20mg/kg、约0.01mg/kg-约25mg/kg、约0.01mg/kg-约30mg/kg、约0.01mg/kg-约35mg/kg、约0.01mg/kg-约40mg/kg、约0.01mg/kg-约45mg/kg、约0.01mg/kg-约50mg/kg、约0.01mg/kg-约75mg/kg或约0.01mg/kg-约100mg/kg，并且例如每3、5、7、10或14天给药。在该实施方式的另外其它方面，有效量的本文公开的药物组合物可以在以下范围，例如约0.1mg/kg-约10mg/kg、约0.1mg/kg-约15mg/kg、约0.1mg/kg-约20mg/kg、约0.1mg/kg-约25mg/kg、约0.1mg/kg-约30mg/kg、约0.1mg/kg-约35mg/kg、约0.1mg/kg-约40mg/kg、约0.1mg/kg-约45mg/kg、约0.1mg/kg-约50mg/kg、约0.1mg/kg-约75mg/kg或约0.1mg/kg-约100mg/kg，并且例如每3、5、7、10或14天给药。
剂量可以是单剂量或累积(连续剂量)，并且能够由本领域技术人员容易地确定。例如，癌症治疗可以包括一次性施用有效剂量的本文公开的药物组合物。或者，癌症治疗可包括在一系列时间段内多次施用有效剂量的药物组合物，例如，每天一次、每天两次、每天三次、每几天一次或每周一次。根据个人症状的严重程度等因素，给药时间因人而异。例如，有效剂量的本文公开的药物组合物可以在不确定的时间段内每天给予个体一次，或者直到个体不再需要治疗为止。本领域普通技术人员将认识到，可以在治疗全程中监测个体的状况，并且可以相应地调整所给予的本文公开的药物组合物的有效量。
在一个实施方式中，相比于未接受相同治疗的患者，本文公开的癌症治疗剂能够将患有癌症的个体中的癌细胞数量或肿瘤体积降低例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在该实施方式的其它方面，相比于未接受相同治疗的患者，癌症治疗剂能够将患有癌症的个体中的癌细胞数量或肿瘤体积降低例如，约10％-约100％、约20％-约100％、约30％-约100％、约40％-约100％、约50％-约100％、约60％-约100％、约70％-约100％、约80％-约100％、约10％-约90％、约20％-约90％、约30％-约90％、约40％-约90％、约50％-约90％、约60％-约90％、约70％-约90％、约10％-约80％、约20％-约80％、约30％-约80％、约40％-约80％、约50％-约80％、或约60％-约80％、约10％-约70％、约20％-约70％、约30％-约70％、约40％-约70％或约50％-约70％。
在进一步的实施方式中，癌症治疗剂及其衍生物具有2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月或更高的半衰期。
在一实施方式中，癌症治疗剂的给药周期是1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长。在进一步的实施方式中，停止给药的周期是1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长。
在该实施方式的各方面，治疗有效量的本文公开的癌症治疗剂将个体中癌细胞群体和/或肿瘤细胞体积降低或维持在例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％。在该实施方式的其它方面，治疗有效量的本文公开的癌症治疗剂将个体中癌细胞群体和/或肿瘤细胞体积降低或维持在例如，至多10％、至多15％、至多20％、至多25％、至多30％、至多35％、至多40％、至多45％、至多50％、至多55％、至多60％、至多65％、至多70％、至多75％、至多80％、至多85％、至多90％、至多95％或至多100％。在该实施方式的另外其它方面，治疗有效量的本文公开的癌症治疗剂将个体中癌细胞群体和/或肿瘤细胞体积降低或维持在例如，约10％-约100％、约10％-约90％、约10％-约80％、约10％-约70％、约10％-约60％、约10％-约50％、约10％-约40％、约20％-约100％、约20％-约90％、约20％-约80％、约20％-约20％、约20％-约60％、约20％-约50％、约20％-约40％、约30％-约100％、约30％-约90％、约30％-约80％、约30％-约70％、约30％-约60％或约30％-约50％。
药物组合物或癌症治疗剂被给药至个体。个体通常是人，但可以是动物，包括但不限于狗、猫、鸟、牛、马、羊、山羊、爬行动物和其他动物，无论是否驯养。通常，作为候选治疗对象的任何个体都是某种形式癌症的候选患者，无论该癌症是良性还是恶性，是实体瘤还是其他肿瘤，是不位于肿瘤中的癌细胞或其他形式的癌症。最常见的癌症类型包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、结直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾癌、白血病、肺癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌、胃癌和甲状腺癌。术前评估通常包括常规病史和体检，以及公开手术的所有相关风险和益处的彻底知情同意。
在一方面，本文公开的药物组合物降低癌症相关疾病的症状。在该实施方式的各方面，本文公开的药物组合物将癌症相关疾病的症状降低例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在该实施方式的其它方面，本文公开的药物组合物将癌症相关疾病的症状降低例如，约10％-约100％、约20％-约100％、约30％-约100％、约40％-约100％、约50％-约100％、约60％-约100％、约70％-约100％、约80％-约100％、约10％-约90％、约20％-约90％、约30％-约90％、约40％-约90％、约50％-约90％、约60％-约90％、约70％-约90％、约10％-约80％、约20％-约80％、约30％-约80％、约40％-约80％、约50％-约80％、或约60％-约80％、约10％-约70％、约20％-约70％、约30％-约70％、约40％-约70％或约50％-约70％。
在另一方面，本文公开的药物组合物降低给定时间段内发生癌症相关疾病症状的频率。在该实施方式的各方面，本文公开的药物组合物将给定时间段内发生癌症相关疾病症状的频率降低例如，至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在该实施方式的其它方面，本文公开的药物组合物将给定时间段内发生癌症相关疾病症状的频率降低例如，约10％-约100％、约20％-约100％、约30％-约100％、约40％-约100％、约50％-约100％、约60％-约100％、约70％-约100％、约80％-约100％、约10％-约90％、约20％-约90％、约30％-约90％、约40％-约90％、约50％-约90％、约60％-约90％、约70％-约90％、约10％-约80％、约20％-约80％、约30％-约80％、约40％-约80％、约50％-约80％、或约60％-约80％、约10％-约70％、约20％-约70％、约30％-约70％、约40％-约70％或约50％-约70％。
表1 DLL3 HC和LC对
Figure BDA0003908291310000421
Figure BDA0003908291310000431
表2-DLL3–CD3
Figure BDA0003908291310000432
Figure BDA0003908291310000441
表3-DLL3–CD28
形式 分子名称 链1 Seq ID 链2 Seq ID 链3 Seq ID
CD28-Fab/DLL3-scFv 28D1 425 426 431
CD28-Fab/DLL3-scFv 28D2 425 426 434
CD28-Fab/DLL3-scFv 28D3 425 426 432
CD28-Fab/DLL3-scFv 28D4 425 426 433
CD28-scFv/DLL3-Fab 28D9 427 290 298
CD28-scFv/DLL3-Fab 28D10 427 291 295
CD28-scFv/DLL3-Fab 28D11 427 292 298
CD28-scFv/DLL3-Fab 28D12 427 292 296
CD28-scFv/DLL3-Fab 28D13 428 291 295
CD28-scFv/DLL3-Fab 28D14 429 291 295
CD28-scFv/DLL3-Fab 28D15 430 291 295
CD28-scFv/DLL3-Fab 28D16 430 292 296
CD28-scFv/DLL3-Fab 28D17 430 276 302
CD28-scFv/DLL3-Fab 28D18 430 290 298
CD28-scFv/DLL3-Fab 28D19 430 276 297
表4-DLL4–41BB
Figure BDA0003908291310000451
表5-DLL3 x CD3 x CD28
Figure BDA0003908291310000452
Figure BDA0003908291310000461
表6-DLL3 x CD3 x CD137
Figure BDA0003908291310000462
表7-MUC17 VH和VL对
Figure BDA0003908291310000463
Figure BDA0003908291310000471
表8–MUC17 VH x CD3
Figure BDA0003908291310000472
Figure BDA0003908291310000481
表9–MUC17 x CD28
形式 分子名称 链1 Seq ID 链2 Seq ID 链3 Seq ID
Muc17-Fab/CD28-scFv 28M1 427 368 384
Muc17-Fab/CD28-scFv 28M2 427 380 399
Muc17-Fab/CD28-scFv 28M3 427 369 398
Muc17-Fab/CD28-scFv 28M4 430 368 384
Muc17-Fab/CD28-scFv 28M5 430 380 399
Muc17-Fab/CD28-scFv 28M6 430 369 398
表10–MUC17 x 41BB
形式 分子名称 链1 SEQ ID 链2 SEQ ID 链3 SEQ ID
Muc17-scfv/4-1BB-Fab 4M1 366 437 438
Muc17-scfv/4-1BB-Fab 4M2 367 437 438
Muc17-scfv/4-1BB-Fab 4M3 474 437 438
4-1BB-scFv/Muc17-Fab 4M4 451 369 398
4-1BB-scFv/Muc17-Fab 4M5 545 369 398
4-1BB-scFv/Muc17-Fab 4M6 450 369 398
4-1BB-scFv/Muc17-Fab 4M7 451 380 399
4-1BB-scFv/Muc17-Fab 4M8 452 380 399
4-1BB-scFv/Muc17-Fab 4M9 453 369 398
4-1BB-scFv/Muc17-Fab 4M10 447 369 398
4-1BB-scFv/Muc17-Fab 4M11 448 369 398
4-1BB-scFv/Muc17-Fab 4M12 444 369 398
4-1BB-scFv/Muc17-Fab 4M13 443 369 398
4-1BB-scFv/Muc17-Fab 4M14 452 380 399
4-1BB-scFv/Muc17-Fab 4M15 453 380 399
表11–MUC17 x CD3 x CD28
形式 分子名称 链1 Seq ID 链2 Seq ID 链3 Seq ID
CD3-scFvxCD28-scFv/Muc17-Fab 328M1 480 369 398
CD28-scFvxCD3-scFv/Muc17-Fab 328M2 481 369 398
CD28-scFvxCD3-scFv/Muc17-Fab 328M3 481 380 399
CD28-scFvxCD3-scFv/Muc17-Fab 328M4 481 368 384
Muc17-scFvxCD3-scFv/CD28-Fab 328M5 362 482 483
表12-MUC17 x CD3 x CD137
形式 分子名称 链1 Seq ID 链2 Seq ID 链3 Seq ID
Muc17-scFvxCD3-scFv/4-1BB-Fab 34M1 362 437 438
4-1BB-scFvxCD3-scFv/Muc17-Fab 34M2 486 380 399
4-1BB-scFvxCD3-scFv/Muc17-Fab 34M3 484 380 399
Muc17-scFvxCD3-scFv/4-1BB-Fab 34M4 362 439 440
表13 CLDN18.2 VH和HL对
Figure BDA0003908291310000491
Figure BDA0003908291310000501
表14–CLDN18.2 x CD3
形式 分子名称 链1 SEQ ID 链2 SEQ ID 链3 SEQ ID
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C17C 263 407 414
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C18C 263 405 418
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C19C 263 405 417
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C20C 263 404 418
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C21C 263 404 417
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C22C 263 402 415
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C23C 263 402 411
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C24C 263 401 415
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C25C 263 401 411
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C26C 263 408 416
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C27C 263 406 413
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C28C 263 403 413
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C29C 263 410 412
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C30C 263 410 419
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C31C 263 409 412
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C32C 263 409 419
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C18D 264 405 418
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C18I 269 405 418
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C18K 271 405 418
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C22D 264 402 415
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C22I 269 402 415
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C22K 271 402 415
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C26D 264 408 416
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C26I 269 408 416
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C26K 271 408 416
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C27D 264 406 413
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C27I 269 406 413
Cldn-Fab/CD3-scFv 3C27K 271 406 413
CLDN-scFvxCD3-scFv-scfc 3CBM  
表15–CLDN18.2 x CD28
形式 分子名称 链1 Seq ID 链2 Seq ID 链3 Seq ID
Cldn-Fab/CD28-scFv 28C1 427 405 418
Cldn-Fab/CD28-scFv 28C2 427 402 415
Cldn-Fab/CD28-scFv 28C3 427 408 416
Cldn-Fab/CD28-scFv 28C4 427 406 413
Cldn-Fab/CD28-scFv 28C5 430 405 418
Cldn-Fab/CD28-scFv 28C6 430 402 415
Cldn-Fab/CD28-scFv 28C7 430 408 416
Cldn-Fab/CD28-scFv 28C8 430 406 413
Cldn-Fab/CD28-scFv 28C9 435 408 416
Cldn-Fab/CD28-scFv 28C10 436 408 416
表16–CLDN18.2 x 41BB
形式 分子名称 链1 SeqID 链2 SeqID 链3 SeqID
Cldn-scfv/4-1BB-Fab 4C1 475 437 438
Cldn-scfv/4-1BB-Fab 4C2 476 437 438
Cldn-scfv/4-1BB-Fab 4C3 477 437 438
Cldn-scfv/4-1BB-Fab 4C4 478 437 438
Cldn-Fab/4-1BB-scFv 4C5 451 405 418
Cldn-Fab/4-1BB-scFv 4C6 454 405 418
Cldn-Fab/4-1BB-scFv 4C7 451 408 416
Cldn-Fab/4-1BB-scFv 4C8 459 408 416
Cldn-Fab/4-1BB-scFv 4C9 479 408 416
Cldn-Fab/4-1BB-scFv 4C10 464 408 416
Cldn-Fab/4-1BB-scFv 4C11 460 408 416
Cldn-Fab/4-1BB-scFv 4C12 463 408 416
Cldn-Fab/4-1BB-scFv 4C13 465 408 416
Cldn-Fab/4-1BB-scFv 4C14 461 408 416
Cldn-Fab/4-1BB-scFv 4C15 454 408 416
Cldn-Fab/4-1BB-scFv 4C16 457 408 416
Cldn-Fab/4-1BB-scFv 4C17 455 408 416
Cldn-Fab/4-1BB-scFv 4C18 458 408 416
Cldn-Fab/4-1BB-scFv 4C19 456 408 416
表17-CLDN18.2 x CD3 x CD28
形式 分子名称 链1 SEQ ID 链2 SEQ ID 链3 SEQ ID
CD3-scFvxCD28-scFv/Cldn-Fab 328C1 481 405 418
CD3-scFvxCD28-scFv/Cldn-Fab 328C2 481 402 415
CD3-scFvxCD28-scFv/Cldn-Fab 328C3 481 408 416
CD3-scFvxCD28-scFv/Cldn-Fab 328C4 481 406 413
表18-CLDN18.2 x CD3 x CD137
形式 分子名称 链1 SEQ ID 链2 SEQ ID 链3 SEQ ID
CD3-scFvx4-1BB-scFv/Cldn-Fab 34C1 491 405 418
CD3-scFvx4-1BB-scFv/Cldn-Fab 34C2 490 405 418
4-1BB-scFvxCD3-scFv/Cldn-Fab 34C3 486 405 418
4-1BB-scFvxCD3-scFv/Cldn-Fab 34C4 484 405 418
Cldn-scFvxCD3-scFv/4-1BB-Fab 34C5 492 437 438
Cldn-scFvxCD3-scFv/4-1BB-Fab 34C6 493 437 438
Cldn-scFvxCD3-scFv/4-1BB-Fab 34C7 492 439 440
Cldn-scFvxCD3-scFv/4-1BB-Fab 34C8 493 439 440
表19-CLDN18.2 x CD28 x CD137
形式 分子名称 链1 SEQ ID 链2 SEQ ID 链3 SEQ ID
CD28-scFvx4-1BB-scFv/Cldn-Fab 284C1 500 405 418
CD28-scFvx4-1BB-scFv/Cldn-Fab 284C2 501 405 418
4-1BB-scFvxCD28-scFv/Cldn-Fab 284C3 502 405 418
4-1BB-scFvxCD28-scFv/Cldn-Fab 284C4 503 405 418
实施例
将参考以下实施例进一步理解本文所描述的组合物和方法，这些实施例旨在单纯地作为示例性的。本文所描述的组合物和方法的范围不受示例性实施例的限制，其仅用作单个方面的说明。任何功能等效的方法都在本发明的保护范围之内。基于前文的描述和附图，除了本文明确描述的那些之外，本文所描述的组合物和方法的各种修改对于对本领域技术人员而言将变得显而易见。这些修改属于本发明的保护范围。
实施例1
人源化抗DLL3抗体与表达人和食蟹猴DLL3的CHO细胞结合
为评价抗DLL3抗体的结合能力，将人连续稀释的抗DLL3抗体添加至过表达人或食蟹猴(cyno)DLL3的CHO-K1细胞(20,000个细胞/孔)中。将混合物在4℃下培养20分钟、清洗三次、并使用二抗(PE标记的F(ab')2-山羊抗人类IgG Fc；Thermo H10104)在4℃下进行染色20分钟。以7-氨基-放线菌素D(7-AAD)溶液清洗并重悬细胞，并以10％中性缓冲福尔马林溶液固定15分钟，然后用iQue Intellicyt系统进行分析。图2A是浓度(nM)与平均荧光强度的关系图。
在该实施例中使用了四种人源化抗体(DLL3.1、DLL3.2、DLL3.3、DLL3.4)。用表达食蟹猴DLL3的CHO细胞重复该实验。图2B是抗体浓度(nM)相对的细胞结合平均荧光强度的图。
实施例2
抗DLL3scfv-Fc与表达huDLL3的CHO细胞结合
重复实验以评估抗DLL3scfv-Fc抗体片段结合人DLL3的能力。图3是DLL3分子浓度(nM)相对的细胞结合平均荧光强度的图。本实施例中使用了六种抗体片段(DLL3.1 VH-VL、DLL3.2 VH-VL、DLL3.3 VH-VL、DLL3.4 VH-VL、DLL3.1 VL-VH和DLL3.4 VL-VH)。
实施例3
在CHO-DLL3细胞存在的情况下，相比CD3scfv-Fc x DLL3Fab-Fc双特异性分子3D1I或CD28scfv-Fc x DLL3Fab-Fc双特异性分子28D18，CD28scfv-CD3scfv-Fc x DLL3-Fab-Fc三特异性分子328D3更高水平地使PBMC激活以分泌IFNγ
图4是分子浓度(nM)相对ELISA检测的IFNγ(650nm处吸光度)的图。ELISA使用50uL浓度2μg/ml的小鼠抗人IFNγ捕获抗体包被过夜的高蛋白结合96孔板进行。用PBS+0.05％吐温-20(PBST)洗板，并用含1％BSA的200uL PBS封闭。洗涤后，将包被的板与来自用分子刺激的PBMC：靶细胞培养物的50uL上清液共孵育120分钟。洗板，然后用0.5μg/ml浓度的50uL生物素化的小鼠抗人IFNγ检测抗体孵育60分钟。洗板并与链霉亲和素-HRP孵育20分钟。洗涤后，使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)对捕获的IFNγ进行定量。
实施例4
在CHO-DLL3细胞存在的情况下，相比于CD3scfv-Fc x DLL3Fab-Fc双特异性分子3D4I或CD28scfv-Fc x DLL3Fab-Fc双特异性分子28D15，CD28scfv-CD3scFv-Fc x DLL3-Fab-Fc三特异性分子328D2更高水平地使PBMC激活以分泌IFNγ
图5是分子浓度(nM)相对使用如实施例3所描述的ELISA检测的IFNg(650nm处吸光度)的图。
实施例5
在CHO-DLL3细胞存在的情况下，相比CD3scfv-Fc x DLL3Fab-Fc双特异性分子3D22I或CD28scfv-Fc x DLL3Fab-Fc双特异性分子28D17，CD28scfv-CD3scfv-Fc x DLL3-Fab-Fc三特异性分子328D1更高水平地使PBMC激活以分泌IFNγ
图6是分子浓度(nM)相对使用如实施例3所描述的ELISA检测的IFNg(650nm处吸光度)的图。
实施例6
在NCI-H82细胞存在的情况下，相比于CD3scfv-Fc x DLL3Fab-Fc双特异性分子3D39I，CD28scfv-CD3scFv-Fc x DLL3-Fab-Fc三特异性分子328D4和328D5更好地激活PBMC以分泌更多IL-2
图7是浓度(nM)相对IFNg(650nm处吸光度)的图。培养48小时后，根据分泌到培养基中的IL-2增加量检测T细胞激活。IL-2分泌使用IL-2ELISA检测。ELISA使用50μL浓度2μg/ml的小鼠抗人IL-2捕获抗体包被过夜的高蛋白结合96孔板进行。用PBS+0.05％吐温-20(PBST)洗板，并用含1％BSA的200μL PBS封闭。洗涤后，将包被的板与来自用双特异性分子刺激的PBMC：靶细胞培养物的50uL上清液共孵育120分钟。洗板，然后用0.5μg/ml浓度的50uL生物素化的小鼠抗人IL-2检测抗体孵育60分钟。洗板并与链霉亲和素-HRP孵育20分钟。洗涤后，使用3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)对捕获的IL-2进行定量。
实施例7
MUC17xCD3双特异性分子结合Muc17-CHOK1和ASPC1细胞
评估了7种人源化抗体1MU11A、1MU32A、1MU36A、1MU16A、1MU37A、1MU43A和1MU47A与表达MUC17膜近端片段的CHO-K1细胞结合的能力。
为了评价抗MUC17抗体结合表达MUC17的细胞的能力，将连续稀释的抗MUC17抗体以20，000个细胞/孔的浓度加入到表达MUC17的CHO-K1细胞中。将抗体:细胞混合物在4℃下培养20分钟、清洗三次、并使用二抗(PE标记的F(ab')2-羊抗人IgG Fc；Thermo H10104)在4℃下进行染色20分钟。以7-氨基-放线菌素D(7-AAD)溶液清洗并重悬细胞，并以10％中性缓冲福尔马林溶液固定15分钟，然后用iQue Intellicyt系统进行分析。图11A是浓度(nM)相对结合至MUC17-CHO细胞的平均荧光强度(MFI)的图。
用内源性地表达全长人MUC17的APSC1细胞重复实验。图11B显示了与ASPC1细胞结合的抗体的浓度(nM)相对的平均荧光强度(MFI)图。
实施例8
hu1MU11A和hu1MU32A以Scfv形式保留了Muc17结合活性
图12是分子的Fab-Fc和Scfv-Fc形式的浓度(nM)相对结合MUC17的650nm处吸光度的图。
实施例9
CD3xCD28xMuc17三特异性分子对ASPC1细胞具有与CD3双特异性3M62I相似的PBMC介导的最大杀伤力
本实验旨在评价人外周单核(PBMCs)效应细胞在MUC17xCD3xCD28三特异性分子刺激下杀伤表达Muc17的CHO靶细胞的能力。在时间0处将1％Triton-X(最大杀伤)添加到细胞混合物中，细胞毒性测定为受损细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH)的量占总LDH释放的百分比。对于细胞毒性测定，在96孔板中将靶细胞(MUC17-CHO或ASPC1)和效应细胞(人PBMC)悬浮在200ul含有10％血清的培养基中，效靶比为10:1。将双特异性分子的稀释液加入到培养物中，一式三份。将96孔板在37℃下培养48小时。然后将细胞在250×g下离心10分钟，将100μl上清液转移到每孔含有100μl LDH测试试剂的光学透明96孔板的相应孔中。将板在室温下孵育至多30分钟。使用微量滴定板读数器在490-500nm处测量所有样品的吸光度。图13是分子浓度(nM)相对最大杀伤百分比的图。
实施例10
在ASPC1细胞存在的情况下，相比CD3双特异性分子3M62I，Muc17xCD3xcD28三特异性分子328M2、328M3、328M4和328M5更高水平地使PBMC激活以分泌IL-2
图14是分子浓度(nM)相对如实施例6所述使用ELISA检测培养基中分泌的IL-2的650nm处吸光度的图。
实施例11
相较于CD3双特异性3M55I，CD3Scfv x CD28SScfvxMUC17-Fab三特异性分子328M1和328M2更好地激活T细胞以杀伤MUC17-CHO细胞，效果与CD3和CD28双特异性分子的组合3M55I+28M3相似。图15是分子浓度(nM)相对最大杀伤百分比的图。
实施例12
CD28scfvxCD3scfvxMuc17Fab三特异性328M2仅在表达Muc17的CHO细胞存在时才激活PBMC表达CD25，在没有Muc17靶细胞时不发生激活。相比之下，CD3scFvxCD28scFvxMuc17-Fab三特异性328M1能够在没有Muc17的情况下非特异性激活细胞，类似于缺少Muc17结合性的双特异性分子328-1。
图16A显示了当PBMC存在于表达MUC17的CHO细胞中时，CD25(MFI)的表达受到双特异性和三特异性分子T细胞浓度增加的刺激，显示328M1和328M2均类似地激活T细胞表达CD25。
图16B显示了当PBMC存在于亲本CHO细胞中时，CD25(MFI)的表达受到双特异性和三特异性分子T细胞浓度增加的刺激，显示当没有表达MUC17的细胞时，328M1激活T细胞，但328M2无法激活T细胞。类似地，在MUC17靶细胞不存在时，缺乏抗MUC17 Fab的328-1也能激活T细胞，但328-2不能。
版本-1具有结构CD3Scfv-CD28Scfv-Fc x MUC17Fab-Fc或Fc，版本-2具有结构CD28scfv-CD3Scfv-Fc x MUC17Fab-Fc或Fc。这表明，版本-2结构CD28scfv-CD3Scfv-Fc相对版本-1结构CD3Scfv-CD28Scfv-Fc具有改进的性质，这是由于版本-2结构需要靶细胞的存在才能激活T细胞，从而更不容易造成非特异性T细胞激活和潜在的毒性。
实施例13
当PBMC与表达Muc17的CHO细胞共培养时，相比基准CD3双特异性分子3M8B7，CD137xCD3xMuc17三特异性分子34M1和34M4使CD4和CD8 T细胞数目增加至更高水平
图17A是nM表示的分子浓度(处理(nM))相对CD8+细胞数的图，细胞数通过用荧光标记的抗CD3和CD4或CD8抗体对细胞进行染色并通过流式细胞术评估来确定。
图17B是nM表示的分子浓度(处理(nM))相对CD4+细胞数的图，细胞数通过用荧光标记的抗CD3和CD4或CD8抗体对细胞进行染色并通过流式细胞术评估来确定。
实施例14
相较于单用3C27I CD3xCldn18.2双特异性T细胞接合器，三特异性分子328C1、328C2、328C3、328C4更高水平地使T细胞激活以分泌IL-2。
图21是分子浓度(nM)相对ELISA测定的分泌的IL-2浓度(pg/mL)的图。
实施例15
在SNU-601存在的情况下，相较于3C18I，CD3xCD137xCLDN18.2三特异性分子34C4和34C3使PBMC激活以表达更多CD25
图22是分子浓度(nM)相对来自培养物的CD3+T细胞上CD25平均荧光强度(MFI)的图。
实施例16
在SNU-601细胞存在的情况下，相比于单用3C18I，CD3xCD137xCLDN18.2三特异性分子34C4和34C3使PBMC激活以分泌更多IFNγ
图23是分子浓度(nM)相对ELISA测定的IFNg(650nm处吸光度)的图。
实施例17
在表达CLDN18.2的CHO细胞存在的情况下，CD3xCD137xCLDN18.2三特异性34C3使CD8 T的数量增加超过了CD3 T细胞接合器3C27I刺激的数量增加
图24是nM表示的分子浓度(处理(nM))相对CD8+细胞数的图，细胞数通过用来自培养物的流式细胞术来确定。
本说明书所述的治疗方法可包括以药学有效量施用包含所述抗体的组合物的步骤。每日总剂量应由医生通过适当的医学判断确定，并施用一次或多次。针对任何特定患者的具体治疗有效量水平可根据医学领域中公知的各种因素而变化，包括所要达到的反应的种类和程度、根据是否与其它药物一起使用的具体组合物、患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食、给药时间和途径、组合物的分泌速率、治疗的时间段、与本文公开的组合物组合使用或同时使用的其它药物，以及医学领域公知的类似因素。
在另一个方面，本说明书提供了治疗性蛋白质或药物组合物的用途，包括用于制备用于预防或治疗癌症、神经退行性疾病或传染性疾病的药物。
在一个实施方式中，组合物的剂量可以每天、每半周、每周、每两周或每月给药。治疗期可以是一周，两周，一个月，两个月，四个月，六个月，八个月，一年或更长时间。初始剂量可以大于维持剂量。在一个实施方式中，剂量范围为每周剂量至少为0.01mg/kg、至少0.25mg/kg、至少0.3mg/kg、至少0.5mg/kg、至少0.75mg/kg、至少1mg/kg、至少2mg/kg、至少3mg/kg、至少4mg/kg、至少5mg/kg、至少6mg/kg、至少7mg/kg、至少8mg/kg、至少9mg/kg、至少10mg/kg、至少15mg/kg、至少20mg/kg、至少25mg/kg、或至少30mg/kg。在一个实施方式中，每周剂量可能至多为1.5mg/kg、至多2mg/kg、至多2.5mg/kg、至多3mg/kg、至多4mg/kg、至多5mg/kg、至多6mg/kg、至多7mg/kg、至多8mg/kg、至多9mg/kg、至多10mg/kg、至多15mg/kg、至多20mg/kg、至多25mg/kg、或至多30mg/kg。在一个特定的方面,所述每周剂量的范围可以是5mg/kg至20mg/kg。在另一个方面,所述每周剂量的范围可以是10mg/kg至15mg/kg。
本说明书还提供了用于向受试者给药的药物组合物。本文公开的药物组合物可以进一步包括药学上可接受的运载体、赋形剂或稀释剂。如本文所用，术语“药学上可接受的”是指所述组合物足以达到治疗效果并且无有害副作用，其可以根据以下因素容易地确定：疾病类型、患者的年龄、体重、健康状况、性别和药物敏感性、给药途径、给药方式、给药频率、治疗持续时间、与本文公开的组合物联合使用或同时使用的药物、以及医学上已知的其他因素。
含有本文公开的抗体的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。用于口服给药时，所述运载体可包括(但不限于)粘合剂、润滑剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、悬浮剂、着色剂和矫味剂。用于注射制剂时，所述运载体可包括缓冲剂、防腐剂、镇痛剂、增溶剂、等渗剂和稳定剂。用于局部给药的制剂时，所述运载体可包括基质、赋形剂、润滑剂和防腐剂。
本公开的组合物可以和上述药学上可接受的运载体共同配制为多种剂型。例如，用于口服给药时，所述药物组合物可被配制为片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆或薄膜片。用于注射制剂时，药物组合物可以配制为单剂型安瓿或多剂量容器。所述药物组合物也可配制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂和长效制剂。
另一方面，适用于药物制剂的运载体、赋形剂和稀释剂的实例包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。此外，所述药物制剂还可以包括填充剂、抗凝血剂、润滑剂、保湿剂、矫味剂和防腐剂。
此外，本文公开的药物组合物可具有选自下组的任意制剂：片剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮液、内服液体、乳液、糖浆、无菌水溶液、非水溶剂、冻干制剂和栓剂。
所述组合物可配制成适合患者身体的单一剂型，并且优选根据制药领域的典型方法配制成可用于肽药物的制剂，以便通过口服或肠胃外途径给药，例如通过皮肤、静脉内、肌肉内、动脉内、髓内、髓内、脑室内、经肺、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、结肠内、局部、舌下、阴道或直肠给药，但不限于此。
所述组合物可通过与各种药学上可接受的载体混合使用，如生理盐水或有机溶剂。为了增加稳定性或吸收性，可以使用碳水化合物(如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖)、抗氧化剂(如抗坏血酸或谷胱甘肽)、螯合剂、低分子量蛋白质或其它稳定剂。
本文公开的药物组合物的给药剂量和频率由活性成分的类型以及各种因素决定，例如待治疗的疾病、给药途径、患者的年龄、性别、体重和疾病严重程度。
本文公开的组合物的总有效剂量可以单剂量施用于患者，或者可以根据分次治疗方案以多剂量长时间施用。在本文公开的药物组合物中，活性成分的含量可根据疾病的严重程度而变化。优选地，本文公开的肽的每日总剂量可以是每1kg患者体重约0.0001μg至500mg。然而，肽的有效剂量的确定需考虑各种因素，包括患者的年龄、体重、健康状况、性别、疾病严重程度、饮食和分泌率，以及药物组合物的给药途径和治疗频率。有鉴于此，本领域技术人员可以容易地确定适合于本文公开的药物组合物的特定用途的有效剂量。本文公开的药物组合物并不特别受限于制剂、给药途径和方式，只要显示出合适的效果即可。
此外，所述药物组合物可以单独施用或与其它显示出预防或治疗功效的药物制剂联合施用或同时施用。
在另一方面，本说明书提供了用于预防或治疗癌症、传染性疾病或神经退行性疾病的方法，其包括步骤：向受试者施用嵌合蛋白或包括该嵌合蛋白的药物组合物。
鉴于本文提供的教导和指示，本领域技术人员将理解，本文中描述的制剂可以同样适用于许多类型的生物制药，包括那些举例说明的，以及本领域已知的其它制剂。鉴于本文提供的教导和指示，本领域技术人员还将理解，例如，可以根据与要配制的生物制药的化学和功能相容性和/或给药方式、以及其他化学的、功能的、生理的和/或本领域公知的医学因素选择一种或多种赋形剂、表面活性剂和/或可选组分的类型和/或数量。例如，与还原糖相比，当与多肽生物制药一起使用时，非还原糖表现出有利的赋形剂性质。因此，本文参考多肽生物制药进一步举例说明示例性制剂。然而，应用于多肽生物制药的适用性、化学和物理性质、考虑因素和方法的范围可以类似地适用于多肽生物制药以外的生物制药。
在各种实施方式中，制剂可以包括但不限于制剂中的生物活性剂(如本文所述的病毒、蛋白质、抗体、肽等)的组合。例如，本文中描述的制剂可以包括用于治疗一种或多种病症(包括但不限于疾病)的单一生物活性剂。在一个实施方式中，本文中描述的制剂还可以包括，但不限于，用于单一或多种情况的两种或多种不同的生物活性剂。制剂中的多种生物活性剂的用途可以例如针对相同或不同的适应症。类似地，在另一个实施方式中，可以在制剂中使用多种生物活性剂来治疗例如病理症状和由初级治疗引起的一种或多种副作用。在进一步的实施方式中，如本文所述的制剂还可以包括但不限于多种生物活性剂，以实现不同的医疗目的，包括例如同时治疗和监测病理状况的进展。在其他的实施方式中，多种、并行的疗法(例如本文举例说明的那些以及本领域公知的其它组合)对于患者依从性特别有用，因为单一制剂即可满足部分或全部的建议治疗和/或诊断。本领域技术人员将知晓那些可添加入广泛组合疗法的生物活性剂。类似地，在各种实施方式中，制剂可以与小分子药物和一种或多种生物活性剂与一种或多种小分子药剂的组合一起使用。因此，在各种实施方式中，提供了一种制剂，其含有1、2、3、4、5或6或更多种不同的生物活性剂，以及与一种或多种小分子药物组合的一种或多种生物活性剂。
在各种实施方式中，制剂可以包括本领域已知的一种或多种防腐剂和/或添加剂。类似地，制剂可以进一步被配制成各种已知递送制剂中的任一种，但不限于此。例如，在一个实施方式中，制剂可以包含表面活性剂、佐剂、生物可降解聚合物、水凝胶等，这些任选组分、它们的化学和功能特性都是本领域已知的。类似地，在给药后促进生物活性剂快速、持续或延迟释放的制剂也是本领域已知的。所述的制剂可以制造为包括这些或本领域已知的其它制剂组分。
因此，组合物可以作为单剂量给药，或者作为两个或多剂量(其可能含有或可能不含有相同量的所需分子)随时间施用，或者作为通过植入装置或导管连续输注。进一步细化合适剂量由本领域普通技术人员常规进行，并且属于其常规执行任务的范围。通过使用适当的剂量反应数据，可以确定适当的剂量。在各种实施方式中，本文中描述的制剂中的生物活性剂可以，但不限于，在延长的整个阶段内向患者施用，例如用于慢性病症的长期给药。所述组合物可以是固体、半固体或气雾剂，而药物组合物被配制成片剂、凝胶片、锭剂、口服溶解条、胶囊剂、糖浆、口服混悬剂、乳剂、颗粒剂、喷剂或微丸剂。
在一个实施方式中，用于口服、直肠、阴道、肠胃外、肺、舌下和/或鼻内递送制剂时，片剂可以通过压制或模制制备，任选地具有一种或多种辅助成分或添加剂。在一个实施方式中，压制片剂的制备例如通过在合适的压片机中压制自由流动形式的活性成分，例如粉末或颗粒，其任选地与粘合剂(例如但不限于聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如但不限于羟基乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)和/或表面活性剂或分散剂混合。
在一个实施方式中，模制片剂例如但不限于通过在合适的压片机中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备。在一个实施方式中，片剂可以任选地被包衣或刻痕，并且可以被配制以提供活性成分的缓释或控释，使用例如(但不限于)不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放曲线。在一个实施方式中，片剂可任选地以含包衣形式提供，不限于例如薄膜、糖衣或肠溶衣，以提供在除胃之外的肠部分中的释放。在一个实施方式中，用于片剂和胶囊制造的工艺、设备和收费制造商是本领域公知的。
在一个实施方式中，胶囊制剂可以使用硬胶囊或软胶囊，包括但不限于明胶胶囊或素食胶囊，例如由羟甲基丙基纤维素(HMPC)制成的那些。在一个实施方式中，一个类型的胶囊是明胶胶囊。在一个实施方式中，可以使用胶囊填充机来填充胶囊，例如但不限于可从诸如米兰达国际(Miranda International)等商业供应商处获得的那些，或使用业内众所周知的胶囊制造技术，如《药用胶囊(Pharmaceutical Capules)》,2.sup.nd Ed.,F.Podczeck和B.Jones,2004。在一个实施方式中，制备胶囊制剂可以(但不限于)使用收费制造中心诸如坐落于普渡研究园区(Purdue Research Park)的Chao工业制药与合约制造中心(Chao Center for Industrial Pharmacy&Contract Manufacturing)。
用于给药的包装和器械可以通过多种考虑来确定，例如(但不限于)要给药的材料的体积、储存条件、是由熟练的医疗保健从业者给药或是患者自我依从给药、剂量制度、地缘政治环境(例如，发展中国家暴露在极端温度条件下)和其他实际考虑因素。
注射装置包括笔式注射器、自动注射器、安全注射器、注射泵、输液泵、玻璃预填充注射器、塑料预填充注射器和无针注射器，注射器可以预先填充液体，或者可以是双腔的，例如用于与冻干材料一起使用。用于此类用途的注射器的一个例子是Lyo-JectTM，这是一种双腔预填充溶胶注射器，可从德国拉芬斯堡Vetter GmbH获得。另一个例子是LyoTip，它是一种预填充注射器，其被设计以方便地提供冻干制剂，可从美国加利福尼亚州卡马里奥的LyoTip公司提供的。注射给药可以是(但不限于)静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下注射，视情况而定。非注射途径给药可以是(但不限于)经鼻、口、眼、真皮或肺部，视情况而定。
在某些实施方式中，试剂盒可以包括但不限于一个或多个单腔或多腔注射器(例如，液体注射器和溶胶试剂盒)，用于施用本文所述的一种或多种制剂。在各种实施方式中，该试剂盒可包含用于肠胃外、皮下、肌内或静脉给药的制剂组分，其以准备装入注射器并给药给受试者的形式在部分真空下密封在小瓶中。在这方面，组合物可以在部分真空下设置在其中。在所有这些实施方式和其它实施方式中，所述试剂盒可以包含一个或多个符合前述任何一种的小瓶，其中每个小瓶含有用于向受试者给药的单个单位剂量。
所述试剂盒可以包含如本文配置的冻干制剂，其重构后提供相应的组合物。在各种实施方式中，试剂盒可以包含冻干制剂和用于重构冻干制剂的无菌稀释剂。
本文还描述了用于治疗需要治疗的受试者的方法，包括向受试者施用有效量的本文所述的制剂。制剂的治疗有效量或剂量将取决于受试者的疾病或症状以及实际临床环境。
在一个实施方式中，如本文所述的制剂可以通过任何合适的途径给药，特别是通过肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)给药。可以理解，优选途径将随着接受者的病情和年龄以及所治疗的疾病而变化。确定最有效给药手段和剂量的方法对于本领域技术人员来说是已知的，并且将随着用于治疗的组合物、治疗目的和被治疗的受试者而变化，但不限于此。根据治疗医生选择的剂量水平和模式可以进行单次或多次给药，但不限于此。合适的剂量制剂和施用这些药剂的方法在本领域是已知的。
如本文所述的制剂可用于制造药物和通过根据常规程序给药来治疗人和其他动物。
本文还提供了使用氨基酸组合开发合适的病毒制剂的组合方法。这些方法对于开发稳定的液体或冻干制剂，特别是药物病毒制剂是有效的。
根据本文描述的实施方式的组合物具有期望的性质，例如期望的溶解度、粘度、可注射性和稳定性。根据本文所述的实施方式的冻干制剂也具有期望的特性，例如期望的回收率、稳定性和重构性。
在一个实施方式中，所述药物制剂的pH值为至少约3.5、3.75、4、4.25、4.5、4.75、5、5.25、5.5、5.75、6、6.25、6.5、6.75、7、7.25、7.5、7.75、8、8.25、8.5、8.75或9。
在一个实施方式中，药物制剂的pH为约3至约9、约4至约19、约5至约9、约6至约8、约6至约7、约6至约9、约5至约6、约5至约7、约5至约8、约4至约9、约4至约8、约4至约7、约4至约6、约4至约5、约3至约8、约3至约7、约3至约6、约3至约5、约3至约4、约7至约8、约7至约9、约7至约10。
本文描述了本发明的某些实施方式，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。当然，在阅读上述描述后，对这些描述的变化对于本领域普通技术人员将变得显而易见。发明人预期到技术人员可以适当采用这些变化，并且发明人意欲以不同于本文中具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括在适用法律允许的情况下所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同形式。此外，除非在上下文中另有说明或以其他方式与上下文明显矛盾，否则上述所有可能变化形式的任何组合都包含在本发明中。
本发明的可选实施方式、元素或步骤的组不应被解释为限制。每个组成员可以单独或与本文公开的其他组成员任意组合地被涉及和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，预计组中的一个或多个成员可能将被包含在组中或从组中删除。当发生任何此类包含或删除时，说明书被视为包含修改后的组，从而满足在所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述要求。
除非另有说明，否则在本说明书和权利要求书中使用的所有表示特征、项目、数量、参数、性质、术语等的数字都应理解为在所有情况下都由术语“约”修饰。如本文所用，术语“约”是指由此限定的特征、项目、数量、参数、性质或术语包含在所述特征、项目、数量、参数、性质或术语的值之上和之下正负百分之十的范围。因此，除非有相反的说明，说明书和所附权利要求书中提出的数值参数是可能变化的近似值。至少，并且不为了限定权利要求范围根据等同原则的应用，每个数字表述至少应根据所报告的有效数字的数量和应用普通的四舍五入技术来解释。尽管阐述本发明广泛范围的数值范围和数值是近似值，但具体实施例中阐述的数值范围和数值尽可能准确地报告了。然而，任何数值范围或数值都固有地包含某些误差，这些误差是在其各自的测试测量中必然会产生的。数值范围的列举仅意在以简写方式单独引用落入该范围内的每个单独数值。除非另有说明，否则数值范围的每个单独数值均如同被单独提及那样并入本说明书中。
除非本文另有说明或根据上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求中)使用的术语“一”、“一个”、“该”和类似的指称将被解释为涵盖单数和复数。除非本文另有说明或根据上下文明显矛盾，否则在上下文中描述的所有方法都可以以任何合适的顺序执行。提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，而不是对本发明另外要求保护的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应被解释为指示任何对本发明的实践必不可少的未要求保护的元素。
本文公开的特定实施方式可以在权利要求中使用由……组成或基本上由……组成的语言进一步限定。当在权利要求中使用时，无论是提交的还是每次修改添加的，过渡术语“由……组成”排除了任何未在权利要求中指定的元素、步骤或材料。过渡术语“基本上由……组成”将权利要求的范围限制为指定的材料或步骤以及不实质影响本质和新颖性特征的材料或步骤。如此要求保护的本发明的实施方式在本文中有固有地或明确地描述及应用。
本发明的可选实施方式、元素或步骤的组不应被解释为限制。每个组成员可以单独或与本文公开的其他组成员任意组合地被涉及和要求保护。出于方便和/或可专利性的原因，预计组中的一个或多个成员可能将被包含在组中或从组中删除。当发生任何此类包含或删除时，说明书被视为包含修改后的组，从而满足在所附权利要求中使用的所有马库什组的书面描述要求。
本说明书中引用和确认的所有专利、专利公布文本和其他出版物均出于描述和公开的目的单独并明确地通过引用整体并入本文，例如，在此类出版物中描述的可能与本发明关联使用的组合物和方法。提供这些出版物仅是为了在本申请的提交日期之前对其进行公开。这方面的任何内容都不应被解释为承认发明人无权以在先发明或任何其他原因提前进行此类公开。所有关于这些文件的日期或内容的陈述都是基于申请人可获得的信息，且不构成对这些文件的日期或内容的正确性的承认。
最后，应当理解，尽管本说明书的各个方面都通过提及具体实施方式来强调，但本领域技术人员将很容易理解，这些公开的实施方式仅说明本文所公开的主题原理。因此，应当理解，所公开的主题绝不限于本文所述的特定方法、方案和/或试剂等。因此，可以根据本文的教导且不背离本说明书的精神对所公开的主题进行各种修改或更改或替代配置。最后，此处使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不用于限制本发明的范围，本发明的范围仅由权利要求书定义。因此，本发明不限于所示和所描述的精确内容。
表20-序列
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Claims (56)

1.一种三特异性分子，其包含：
a)抗DLL3抗体、抗Muc17抗体或抗Cldn18.2抗体；
b)第一抗原结合体；和
c)第二抗原结合体。
2.如权利要求1所述的三特异性分子，其中所述第一抗原结合体包括抗CD28 scFv结构域，并且所述第二抗原结合体包括抗CD3 Scfv-Fc结构域。
3.如权利要求1所述的三特异性分子，其中所述第一抗原结合体和第二抗原结合体构成异二聚体结构。
4.如权利要求1所述的三特异性分子，其包括SEQ ID NO:347、SEQ ID NO:276和SEQ IDNO:297。
5.如权利要求1所述的三特异性分子，其包括SEQ ID NO:430、SEQ ID NO:276和SEQ IDNO:297。
6.如权利要求1所述的三特异性分子，其包括SEQ ID NO:481、SEQ ID NO:406和SEQ IDNO:413。
7.一种刺激T细胞活性的方法，其包括施用治疗量的如权利要求1所述的三特异性分子的步骤。
8.一种三特异性抗体，其包含：
a)抗CD28单链可变区片段(scFv)，
b)抗CD3单链可变区片段(scFv)，和
c)抗DLL3抗原结合片段(Fab)-可结晶片段区域(Fc区域)。
9.一种三特异性分子，其包含抗DLL3抗体，其配有第一激活剂抗体和第二激活剂抗体，
其中所述第一激活剂抗体和第二激活剂抗体各激活CD3、CD28和CD137中的一种或多种。
10.一种利用如权利要求9所述的三特异性分子激活T细胞对表达DLL3的细胞毒性的方法。
11.一种利用如权利要求9所述的三特异性分子治疗癌症的方法。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、阑尾癌和结肠癌中的至少一种。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述三特异性分子与一种或多种检查点调节剂共同施用。
14.如权利要求9所述的三特异性分子，其进一步包含免疫检查点激动剂或免疫检查点拮抗剂。
15.一种利用如权利要求14所述的三特异性分子激活T细胞对表达DLL3的细胞毒性的方法。
16.一种利用如权利要求14所述的三特异性分子治疗癌症的方法。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述癌症是肺癌、胰腺癌、阑尾癌和结肠癌中的至少一种。
18.一种三特异性抗体，其包含：
第一靶向结构域，其具有针对DLL3的结合特异性；
第二靶向结构域，其具有针对第一分化簇受体的结合特异性，
第三靶向结构域，其具有针对第二分化簇受体的结合特异性，
其中所述第一靶向结构域、第二靶向结构域和第三靶向结构域各包含一个或多个抗体可变区。
19.如权利要求18所述的三特异性抗体，其中所述第一分化簇受体和第二分化簇受体各为CD3、CD28或CD137中的一个。
20.如权利要求18所述的三特异性抗体，其中所述第一靶向结构域、第二靶向结构域和第三靶向结构域各包含至少一个选自下组的抗体片段：单域抗体(sdAb)、可变片段(Fv)异源二聚体、单链Fv(scFv)、Fab片段，或其组合。
21.一种利用如权利要求18所述的三特异性抗体激活T细胞对表达DLL3的细胞毒性的方法。
22.一种利用如权利要求10所述的三特异性分子治疗癌症的方法。
23.如权利要求21所述的方法，其进一步包括施用一种或多种免疫检查点调节剂。
24.如权利要求22所述的方法，其进一步包括施用一种或多种免疫检查点调节剂。
25.一种三特异性分子，其包含抗MUC17抗体，其配有第一激活剂抗体和第二激活剂抗体，
其中所述第一激活剂抗体和第二激活剂抗体各激活CD3、CD28和CD137中的一种或多种。
26.一种利用如权利要求25所述的三特异性分子激活T细胞对表达MUC17的细胞毒性的方法。
27.一种利用如权利要求25所述的三特异性分子治疗癌症的方法。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、阑尾癌和结肠癌中的至少一种。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述三特异性分子与一种或多种检查点调节剂共同施用。
30.如权利要求27所述的三特异性分子，其进一步包含免疫检查点激动剂或免疫检查点拮抗剂。
31.一种利用如权利要求30所述的三特异性分子激活T细胞对表达MUC17的细胞毒性的方法。
32.一种利用如权利要求30所述的双特异性分子治疗癌症的方法。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、阑尾癌和结肠癌中的至少一种。
34.一种三特异性抗体，其包含：
第一靶向结构域，其具有针对MUC17的结合特异性；
第二靶向结构域，其具有针对第一分化簇受体的结合特异性，
第三靶向结构域，其具有针对第二分化簇受体的结合特异性，
其中所述第一靶向结构域、第二靶向结构域和第三靶向结构域各包含一个或多个抗体可变区。
35.如权利要求34所述的三特异性抗体，其中所述第一分化簇受体和第二分化簇受体各为CD3、CD28或CD137中的一个。
36.如权利要求34所述的三特异性抗体，其中所述第一靶向结构域、第二靶向结构域和第三靶向结构域各包含至少一个选自下组的抗体片段：单域抗体(sdAb)、可变片段(Fv)异源二聚体、单链Fv(scFv)、Fab片段，或其组合。
37.一种利用如权利要求34所述的三特异性抗体激活T细胞对表达MUC17的细胞毒性的方法。
38.一种利用如权利要求34所述的三特异性分子治疗癌症的方法。
39.如权利要求37所述的方法，其进一步包括施用一种或多种免疫检查点调节剂。
40.如权利要求38所述的方法，其进一步包括施用一种或多种免疫检查点调节剂。
41.一种三特异性分子，其包含抗CLDN18.2抗体，其配有第一激活剂抗体和第二激活剂抗体，
其中所述第一激活剂抗体和第二激活剂抗体各激活CD3、CD28和CD137中的一种或多种。
42.一种利用如权利要求41所述的三特异性分子激活T细胞对表达CLDN18.2的细胞毒性的方法。
43.一种利用如权利要求41所述的三特异性分子治疗癌症的方法。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、阑尾癌和结肠癌中的至少一种。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述三特异性分子与一种或多种检查点调节剂共同施用。
46.如权利要求41所述的三特异性分子，其进一步包含免疫检查点激动剂或免疫检查点拮抗剂。
47.一种利用如权利要求41所述的三特异性分子激活T细胞对表达CLDN18.2的细胞毒性的方法。
48.一种利用如权利要求41所述的双特异性分子治疗癌症的方法。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述癌症是胰腺癌、阑尾癌和结肠癌中的至少一种。
50.一种三特异性抗体，其包含：
第一靶向结构域，其具有针对CLDN18.2的结合特异性；
第二靶向结构域，其具有针对第一分化簇受体的结合特异性，
第三靶向结构域，其具有针对第二分化簇受体的结合特异性，
其中所述第一靶向结构域、第二靶向结构域和第三靶向结构域各包含一个或多个抗体可变区。
51.如权利要求50所述的三特异性抗体，其中所述第一分化簇受体和第二分化簇受体各为CD3、CD28或CD137中的一个。
52.如权利要求50所述的三特异性抗体，其中所述第一靶向结构域、第二靶向结构域和第三靶向结构域各包含至少一个选自下组的抗体片段：单域抗体(sdAb)、可变片段(Fv)异源二聚体、单链Fv(scFv)、Fab片段，或其组合。
53.一种利用如权利要求50所述的三特异性抗体激活T细胞对表达CLDN18.2的细胞毒性的方法。
54.一种利用如权利要求50所述的三特异性分子治疗癌症的方法。
55.如权利要求53所述的方法，其进一步包括施用一种或多种免疫检查点调节剂。
56.如权利要求54所述的方法，其进一步包括施用一种或多种免疫检查点调节剂。
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