CN101233156A

CN101233156A - Cd19抗体及其用途

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Publication number: CN101233156A
Application number: CNA2006800281846A
Authority: CN
Inventors: C·拉奥-奈克; D·J·金; 刘杰; 黄海春; D·B·帕斯莫尔; A·F·贝尔; J·M·卡达雷利; C·潘; T·U·蒂·多; S·陈
Original assignee: Medarex LLC
Current assignee: E.R. expensive precious & Sheng Si limited liability company is executed
Priority date: 2005-06-20
Filing date: 2006-06-20
Publication date: 2008-07-30
Anticipated expiration: 2026-06-20
Also published as: CN101233156B; ZA200710916B

Abstract

本发明提供以高亲和力特异性结合CD19的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。还提供了编码这种抗体的核酸分子，用于表达该CD19抗体的表达载体、宿主细胞和方法。还提供了包含该CD19抗体的免疫偶联物、双特异性分子和药物组合物。还公开了检测CD19的方法，以及治疗包括非何杰金氏淋巴瘤在内的各种B细胞恶性肿瘤的方法。

Description

CD19抗体及其用途

相关申请的交叉参考

本申请要求2005年6月20日提交的美国临时专利申请No.60/692,531、2005年12月8日提交的美国临时专利申请No.60/748,956和2006年6月6日提交的美国临时专利申请No.60/804,083的权利；所有这些申请都全部引入本文作为参考。

发明背景

CD19是95kDa的膜受体，它在B细胞分化早期表达，并且继续表达直到B细胞被触发最终分化(Pezzutto等人(1987).J.Immunol.138：2793；Tedder等人(1994)Immunol.Today 15：437)。CD 19胞外域含有两个被较小的潜在二硫键连接的结构域分隔开的C2型免疫球蛋白(IG)样结构域。CD19胞质域在结构上是独特的，但是在人、小鼠和豚鼠之间高度保守(Fujimoto等人，(1998)Semin Immunol.10：267)。CD 19是在B淋巴细胞表面上发现的蛋白质复合物的一部分。该蛋白质复合物包含CD19、CD21(补体受体，2型)、CD81(TAPA-1)和CD225(Leu-13)(Fujimoto，同上)。

CD19是B细胞中跨膜信号的一种重要调节剂。细胞表面CD19密度的增加或减少影响B细胞的发育和功能，导致疾病如自身免疫或低丙球蛋白血症(Fujimoto，同上)。CD19复合物通过交联两种在B细胞膜上发现的分离的信号转导复合物而在体内加强B细胞对抗原的应答。这两种信号转导复合物与膜IgM和CD 19结合，通过不同的机制激活磷脂酶C(PLC)。CD 19和B细胞受体交联减少了激活PLC所需的IgM分子的数量(Fujimoto，同上；Ghetie，同前)。另外，CD 19作为Arc家族激酶扩增的特化的衔接蛋白质起作用(Hasegawa等人(2001)J Immunol 167：3190)。

已经显示CD 19结合既增强也抑制B细胞激活和增殖，这取决于发生的交联的量(Tedder，同上)。CD 19在90％以上的B细胞淋巴瘤上表达，并且预测其在体外和体内影响淋巴瘤的生长(Ghetie，同上)。已经产生的抗CD 19抗体为鼠抗体。使用鼠抗体治疗人类受试者的一个缺点是给病人施用后发生人抗小鼠(HAMA)应答。因此，需要更有效地治疗和/或预防CD 19介导的疾病的改善的治疗性抗CD 19抗体。

发明概述

本发明提供与CD 19结合并且表现出许多所需特性的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。这些特性包括：与人CD 19高亲和力结合。也提供了使用本发明的抗体和组合物治疗多种CD 19介导的疾病的方法。

在一个方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其中该抗体：

(a)以1×10^-7M或更低的K_D与人CD 19结合；且

(b)与Raji和Daudi B细胞肿瘤细胞结合。

优选地，该抗体为人抗体，但是在替代实施方案中，该抗体也可以是鼠抗体、嵌合抗体或人源化抗体。

在一个实施方案中，该抗体以5×10^-8M或更低的K_D与人CD 19结合，以2×10^-8M或更低的K_D与人CD 19结合，以1×10^-8M或更低的K_D与人CD 19结合，以5×10^-9M或更低的K_D与人CD 19结合，以4×10^-9M或更低的K_D与人CD 19结合，以3×10^-9M或更低的K_D与人CD 19结合，或以2×10^-9M或更低的K_D与人CD 19结合。

在另一实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体与参比抗体交叉竞争结合CD 19，其中该抗体：(a)以1×10^-7M或更低的K_D与人CD 19结合；且(b)与Raji和DaudiB细胞肿瘤细胞结合。在多种实施方案中，所述参比抗体包括：(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ IDNO：8的氨基酸序列的轻链可变区；

或所述参比抗体包括：(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链可变区；

或所述参比抗体包括：(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区；

或所述参比抗体包括：(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链可变区；

或所述参比抗体包括：(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区；

或所述参比抗体包括：(a)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链可变区；

或所述参比抗体包括：(a)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区；

或所述参比抗体包括：(a)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链可变区。

在另一方面，本发明涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包含产自或源自人V_H 5-51基因的重链可变区，其中该抗体与CD 19特异性结合。本发明也提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包含产自或源自人V_H 1-69基因的重链可变区，其中该抗体与CD 19特异性结合。本发明还提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包含产自或源自人V_K L18基因的轻链可变区，其中该抗体与CD 19特异性结合。本发明进一步提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包含产自或源自人V_K A27基因的轻链可变区，其中该抗体与CD 19特异性结合。本发明甚至进一步提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包含产自或源自人V_K L15基因的轻链可变区，其中该抗体与CD 19特异性结合。

在一个优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包含：(a)人V_H 5-51或1-69基因的重链可变区；和(b)人V_K L18、A27或V_K L15的轻链可变区；其中该抗体与CD 19特异性结合。

在另一方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包括包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区；和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：(a)重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35和36的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；(b)轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57和58的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；(c)该抗体以1×10^-7M或更低的K_D与人CD 19结合；(d)与Raji和Daudi B细胞肿瘤细胞结合。

优选地，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28和29的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。优选地，重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21和22的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：37、38、39、40、41、42和43的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。

一种优选的组合包括：

(a)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：23的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：30的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：37的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：44的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：51的轻链可变区CDR3。

另一优选组合包括：

(a)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：23的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：30的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：37的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：44的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：52的轻链可变区CDR3。

另一优选组合包括：

(a)包含SEQ ID NO：17的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：24的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：31的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：38的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：45的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：53的轻链可变区CDR3。

另一优选组合包括：

(a)包含SEQ ID NO：18的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：25的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：32的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：39的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：46的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：54的轻链可变区CDR3。

另一优选组合包括：

(a)包含SEQ ID NO：19的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：26的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：33的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：40的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：47的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：55的轻链可变区CDR3。

另一优选组合包括：

(a)包含SEQ ID NO：20的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：27的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：34的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：41的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：48的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：56的轻链可变区CDR3。

另一优选组合包括：

(a)包含SEQ ID NO：21的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：28的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：35的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：42的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：49的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：57的轻链可变区CDR3。

另一优选组合包括：

(a)包含SEQ ID NO：22的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：29的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：36的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：43的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：50的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：58的轻链可变区CDR3。

本发明的其他优选抗体或其抗原结合部分包括：

(a)包含选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13、14和15的氨基酸序列的轻链可变区；

其中该抗体与CD 19特异性结合。

一种优选的组合包括：(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区。

另一优选组合包括：(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链可变区。

另一优选组合包括：(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区。

另一优选组合包括：(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链可变区。

另一优选组合包括：(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区。

另一优选组合包括：(a)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链可变区。

另一优选组合包括：(a)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区。

另一优选组合包括：(a)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链可变区。

在本发明的另一方面，提供了与上述任意抗体竞争结合CD 19的抗体或其抗原结合部分或片段。

本发明的抗体可以是，例如，如IgG1或IgG4同种型的全长抗体。或者，这些抗体可以是抗体片段，如Fab、Fab’或Fab’2片段，或单链抗体。

本发明也提供一种免疫偶联物，其包含与诸如细胞毒素或放射性同位素等治疗剂连接的本发明的抗体或其抗原结合部分或片段。本发明也提供一种双特异性分子，其包含与第二功能部分连接的本发明的抗体或其抗原结合部分或片段，该第二功能部分具有与该抗体或其抗原结合部分不同的结合特异性。

还提供包含本发明的抗体或其抗原结合部分或片段或免疫偶联物或双特异性分子和药学上可接受的载体的组合物。

本发明也包括编码本发明的抗体或其抗原结合部分或片段的核酸分子，以及包含这些核酸的表达载体，和包含这些表达载体的宿主细胞。

本发明的其他特征和优点通过下面的详述和实施例将是显而易见的，该详述和实施例不应理解为限制性的。贯穿本申请中引用的所有参考文献、Genbank项、专利和公布的专利申请的内容均在此处特别引入作为参考。

附图说明

图1A显示21D4和21D4a人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ ID NO：59)和氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：16)、CDR2(SEQ ID NO：23)和CDR3(SEQ ID NO：30)区，并指出了V、D和J的种系来源。

图1B显示21D4人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：66)和氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：37)、CDR2(SEQ ID NO：44)和CDR3(SEQ ID NO：51)区，并指出了V和J的种系来源。

图1C显示21D4a人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQID NO：67)和氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。勾画出了CDR1(SEQ IDNO：37)、CDR2(SEQ ID NO：44)和CDR3(SEQ ID NO：52)区，并指出了V和J的种系来源。

图2A显示47G4人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：60)和氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：17)、CDR2(SEQ ID NO：24)和CDR3(SEQ ID NO：31)区，并指出了V、D和J的种系来源。

图2B显示47G4人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：68)和氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：38)、CDR2(SEQ ID NO：45)和CDR3(SEQ ID NO：53)区，并指出了V和J的种系来源。

图3A显示27F3人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：61)和氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：18)、CDR2(SEQ ID NO：25)和CDR3(SEQ ID NO：32)区，并指出了V、D和J的种系来源。

图3B显示27F3人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：69)和氨基酸序列(SEQ ID NO：11)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：39)、CDR2(SEQ ID NO：46)和CDR3(SEQ ID NO：54)区，并指出了V和J的种系来源。

图4A显示3C10人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：62)和氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：19)、CDR2(SEQ ID NO：26)和CDR3(SEQ ID NO：33)区，并指出了V、D和J的种系来源。

图4B显示3C10人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：70)和氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：40)、CDR2(SEQ ID NO：47)和CDR3(SEQ ID NO：55)区，并指出了V和J的种系来源。

图5A显示5G7人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：63)和氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：20)、CDR2(SEQ ID NO：27)和CDR3(SEQ ID NO：34)区，并指出了V、D和J的种系来源。

图5B显示5G7人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：71)和氨基酸序列(SEQ ID NO：13)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：41)、CDR2(SEQ ID NO：48)和CDR3(SEQ ID NO：56)区，并指出了V和J的种系来源。

图6A显示13F1人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：64)和氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：21)、CDR2(SEQ ID NO：28)和CDR3(SEQ ID NO：35)区，并指出了V、D和J的种系来源。

图6B显示13F1人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：72)和氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：42)、CDR2(SEQ ID NO：49)和CDR3(SEQ ID NO：57)区，并指出了V和J的种系来源。

图7A显示46E8人单克隆抗体重链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：65)和氨基酸序列(SEQ ID NO：7)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：22)、CDR2(SEQ ID NO：29)和CDR3(SEQ ID NO：36)区，并指出了V、D和J的种系来源。

图7B显示46E8人单克隆抗体轻链可变区的核苷酸序列(SEQ IDNO：73)和氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。勾画出了CDR1(SEQ ID NO：43)、CDR2(SEQ ID NO：50)和CDR3(SEQ ID NO：58)区，并指出了V和J的种系来源。

图8显示21D4(SEQ ID NO：1)和21D4a(SEQ ID NO：1)的重链可变区氨基酸序列与人种系V_H 5-51氨基酸序列(SEQ ID NO：74)的比对。JH4b种系公开为SEQ ID NO：80。

图9显示47G4的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：2)与人种系V_H 1-69氨基酸序列(SEQ ID NO：75)的比对。JH5b种系公开为SEQID NO：81。

图10显示27F3的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：3)与人种系V_H 5-51氨基酸序列(SEQ ID NO：74)的比对。JH6b种系公开为SEQID NO：82。

图11显示3C10的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：4)与人种系V_H 1-69氨基酸序列(SEQ ID NO：75)的比对。JH6b种系公开为SEQ ID NO：82。

图12显示5G7的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：5)与人种系V_H 5-51氨基酸序列(SEQ ID NO：74)的比对。JH6b种系公开为SEQID NO：83。

图13显示13F1的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：6)与人种系V_H 5-51氨基酸序列(SEQ ID NO：74)的比对。JH6b种系公开为SEQID NO：82。

图14显示46E8的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：7)与人种系V_H 5-51氨基酸序列(SEQ ID NO：74)的比对。JH6b种系公开为SEQ ID NO：82。

图15显示21D4的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：8)与人种系V_K L18氨基酸序列(SEQ ID NO：76)的比对。JK2种系公开为SEQ ID NO：84。

图16显示21D4a的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：9)与人种系V_K L18氨基酸序列(SEQ ID NO：76)的比对。JK3种系公开为SEQ ID NO：85。

图17显示47G4的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：10)与人种系V_K A27氨基酸序列(SEQ ID NO：77)的比对。JK3种系公开为SEQ ID NO：85。

图18显示27F3的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：11)与人种系V_K L18氨基酸序列(SEQ ID NO：76)的比对。JK2种系公开为SEQ ID NO：84。

图19显示3C10的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：12)与人种系V_K L15氨基酸序列(SEQ ID NO：78)的比对。JK2种系公开为SEQ ID NO：84。

图20显示5G7的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：13)与人种系V_K L18氨基酸序列(SEQ ID NO：76)的比对。JK1种系公开为SEQ ID NO：86。

图21显示13F1的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：14)与人种系V_K L18氨基酸序列(SEQ ID NO：76)的比对。JK2种系公开为SEQ ID NO：87。

图22显示46E8的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：15)与人种系V_K L18氨基酸序列(SEQ ID NO：76)的比对。JK2种系公开为SEQ ID NO：87。

图23显示证明抗人CD 19的人单克隆抗体47G4与人CD 19特异性结合的实验结果。

图24显示证明抗CD 19的人单克隆抗体在Raji细胞上竞争结合的实验结果。

图25A-D显示流式细胞实验结果，该结果证明抗人CD 19的人单克隆抗体21D4、21D4a、47G4、3C10、5G7和13F1与B细胞肿瘤细胞系的细胞表面结合。(A)人CD 19转染的CHO细胞上的HuMAb 21D4和47G4的流式细胞分析。(B)Raji B肿瘤细胞上的HuMAb 47G4的流式细胞分析。(C)Raji B肿瘤细胞上的HuMAb21D4和47G4的流式细胞分析。(D)Raji B肿瘤细胞上的HuMAb21D4、21D4a、3C10、5G7和13F1的流式细胞分析。

图26A-B显示内化实验结果，通过3H胸苷释放试验，证明抗人CD 19的人单克隆抗体21D4和47G4进入CHO-CD 19和表达CD 19的Raji B肿瘤细胞。(A)HuMAb 47G4向CHO-CD 19细胞中内化。(B)HuMAb 21D4和47G4向Raji B肿瘤细胞中内化。

图27显示胸苷掺入测定结果，该结果证明抗人CD 19的人单克隆抗体杀死Raji B细胞肿瘤细胞。

图28显示Ramos系统模型中小鼠存活率的Kaplan-Meier图。

图29显示Ramos系统模型中小鼠的体重变化。

图30A-B显示体内小鼠肿瘤模型研究结果，该结果证明用裸抗CD 19抗体21D4治疗在体内对淋巴瘤具有直接的抑制作用。(A)ARH-77肿瘤，(B)Raji肿瘤。

图31显示抗体依赖性细胞毒性(ADCC)测定的结果，该结果证明非岩藻糖基化的人单克隆抗CD 19抗体以ADCC依赖的方式对人白血病细胞具有提高的细胞毒性。

图32显示体内小鼠肿瘤模型研究结果，该结果证明毒素偶联的抗CD 19抗体减少了肿瘤体积。

图33显示Raji肿瘤模型研究中小鼠的体重变化。

图34显示食蟹猴研究的结果，显示在岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗CD 19 HuMAb处理后CD20+细胞群体减少。

图35显示用岩藻糖基化或非岩藻糖基化抗CD 19 HuMAb处理后个体食蟹猴的结果。

图36A-C显示胸苷掺入测定的结果，该结果证明单独的或与毒素偶联的抗人CD 19的人单克隆抗体杀死Raji和SU-DHL-6B细胞肿瘤细胞。

发明详述

本发明涉及以高亲和力特异性结合CD 19的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体源自特定重链和轻链种系序列，和/或包含特定结构特征，如包含特定氨基酸序列的CDR区。本发明提供分离的抗体、制备该抗体的方法、含有该抗体的免疫偶联物和双特异性分子、和含有本发明的抗体、免疫偶联物或双特异性分子的药物组合物。本发明还涉及使用该抗体的方法，例如用于检测CD 19，以及治疗与CD 19表达有关的疾病，如表达CD 19的B细胞恶性肿瘤。因此，本发明也提供使用本发明的抗-CD 19抗体治疗B细胞恶性肿瘤的方法，例如治疗非何杰金氏淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、B系弥散性大细胞淋巴瘤和多发性骨髓瘤。

为了使本发明更容易理解，首先定义了一些术语。其他的定义在发明详述内容中说明。

术语“CD 19”是指，例如，人CD 19的变体、同种型和物种同源物。因此，本发明的人抗体在某些情况下可与来自人类以外物种的CD 19交叉反应。在某些实施方案中，该抗体对于一种或多种人CD 19蛋白可能是完全特异性的，并且可能不表现出物种或其他类型的非人交叉反应性。人CD 19一个实例的完整氨基酸序列的Genbank登录号为NM_001770(SEQ ID NO：79)。

术语“免疫应答”是指例如淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和上述细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，其导致选择性损伤、破坏或从人体中清除侵入的病原体、被病原体感染的细胞或组织、癌细胞，或(在自身免疫或病理性炎症的情况下)正常人细胞或组织。

“信号转导途径”是指在信号从一个细胞的一部分向一个细胞的另一部分传送中起作用的多种信号转导分子之间的生化关系。本文使用的短语“细胞表面受体”包括，例如，能够接收信号和跨过细胞质膜传播这种信号的分子和分子复合物。本发明的“细胞表面受体”的一个例子是CD 19受体。

这里提到的术语“抗体”包括完整抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含通过二硫键互相连接在一起的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(在此缩写为V_H)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域C_H1、C_H2和C_H3组成。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为V_L)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域C_L组成。V_H和V_L区可进一步再分为高变区，称为互补决定区(CDR)，CDR散布在被称为构架区(FR)的更加保守的区域中。每个V_H和V_L均由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端向羧基端以如下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有可与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，该宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一成分(C1q)。

本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”)是指保留与抗原(例如CD 19)特异性结合的能力的抗体的一个或多个片段。已证明抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段来行使。术语抗体的“抗原结合部分”中所包括的结合片段的例子包括：(i)Fab片段，即由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)₂片段，即包含在铰链区处通过二硫键连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)Fab’片段，基本是具有铰链区部分的Fab(参见FUNDAMENTALIMMUNOLOGY，Paul ed.第三版1993)；(iv)由V_H和C_H1结构域组成的Fd片段；(v)由抗体单臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段；(vi)由V_H结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341：544-546)；(vii)分离的互补决定区(CDR)和(viii)纳米抗体(nanobody)，即含有单链可变域和两个恒定域的重链可变区。此外，尽管Fv片段的两个结构域V_L和V_H由单独的基因编码，但是它们可以利用重组方法通过合成连接体连接在一起，该连接体使它们能够制成一条蛋白质链，其中V_L和V_H区配对构成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。这种单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段用本领域技术人员公知的常规技术获得，并用与完整抗体相同的方法对这些片段的实用性进行筛选。

本文使用的“分离的抗体”是指基本不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与CD 19特异性结合的分离的抗体基本不含与除CD 19以外的抗原特异性结合的抗体)。但是，与CD 19特异性结合的分离的抗体与诸如来自其他物种的CD 19分子等其他抗原可能具有交叉反应性。而且，分离的抗体可基本不含其他细胞材料和/或化学物质。

本文使用的术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和性。

本文使用的术语“人抗体”包括具有如下可变区的抗体，在该可变区中，构架区和CDR区都源自人种系免疫球蛋白序列。而且，如果该抗体含有恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包含并非由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。但是，本文使用的术语“人抗体”不包括其中源自另一哺乳动物种如小鼠的种系的CDR序列已被移植到人构架序列上的抗体。

术语“人单克隆抗体”是指表现单一结合特异性的抗体，其具有其中构架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。在一个实施方案中，人单克隆抗体由杂交瘤产生，该杂交瘤包括与无限增殖化细胞融合的B细胞，该B细胞从具有含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物(例如转基因小鼠)中获得。

本文使用的术语“重组人抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如：(a)从对于人免疫球蛋白基因的转基因或转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤(下文进一步描述)中分离的抗体，(b)从经转化表达人抗体的宿主细胞如转染瘤中分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库中分离的抗体，和(d)通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪接为其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组人抗体具有其中构架区和CDR区均源自人种系免疫球蛋白序列的可变区。但是在某些实施方案中，这些重组人抗体可以经历体外诱变(或者，当使用人Ig序列的转基因动物时，经历体内体细胞诱变)，因此重组抗体的V_H和V_L区的氨基酸序列尽管是源自人种系V_H和V_L序列并与之相关的序列，但可能不是在体内天然存在于人抗体种系的所有组成成分(repertoire)中。

本文使用的术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。

短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”在此与术语“与抗原特异性结合的抗体”可互换使用。

术语“人抗体衍生物”是指人抗体的任何修饰形式，例如抗体和其它试剂或抗体的偶联物。

术语“人源化抗体”是指其中来源于另外一种哺乳动物种如小鼠的种系的CDR序列已经被移植到人构架序列上的抗体。在人构架序列内也可以进行其它的构架区修饰。

术语“嵌合抗体”是指其中可变区序列来源于一个物种而恒定区序列来源于另一个物种的抗体，例如其中可变区序列来源于小鼠抗体而恒定区序列来源于人抗体的抗体。

本文使用的术语“与人CD 19特异性结合”的抗体是指以1×10^-7M或更低、更优选5×10^-8M或更低、更优选3×10^-8M或更低、更优选1×10^-8M或更低、甚至更优选5×10^-9M或更低的K_D与人CD 19结合的抗体。

本文使用的术语“K_assoc”或“K_a”是指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文使用的术语“K_dis”或“K_d”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。本文使用的术语“K_D”是指解离常数，它是由K_d与K_a的比值获得的(即K_d/K_a)，并且表示为摩尔浓度(M)。抗体的K_D值可能用本领域建立的方法测定。测定抗体K_D的一种优选方法是使用表面等离振子共振法，优选使用生物传感器系统，如Biacore

系统。

本文使用的术语IgG抗体的“高亲和力”是指抗体对于靶抗原的K_D为1×10^-7M或更低、更优选5×10^-8M或更低、甚至更优选1×10^-9M或更低、甚至更优选5×10^-9M或更低。但是对于其他抗体同种型来说，“高亲和力”结合可能不同。例如，对于IgM同种型来说，“高亲和力”结合是指抗体具有10^-6M或更低、更优选10^-7M或更低、甚至更优选10^-8M或更低的K_D。

本文使用的术语“受试者”包括任何人或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖类动物、爬行类动物等。

抗-CD 19抗体

本发明的抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。例如，这些抗体与人CD 19特异性结合。优选地，本发明的抗体以高亲和力与CD 19结合，例如K_D为1×10^-7M或更低。本发明的抗-CD 19抗体优选地表现出以下一种或多种特性：

(a)以1×10^-7M或更低的K_D与人CD 19结合；

(b)与Raji和Daudi B细胞肿瘤细胞结合。

优选地，该抗体以5×10^-8M或更低的K_D与人CD 19结合，以1×10^-8M或更低的K_D与人CD 19结合，以5×10^-9M或更低的K_D与人CD 19结合，以4×10^-9M或更低的K_D与人CD 19结合，以3×10^-9M或更低的K_D与人CD 19结合，或以2×10^-9M或更低的K_D与人CD 19结合，或以1×10^-9M或更低的K_D与人CD 19结合。

评价抗体对CD 19的结合能力的标准试验在本领域中是公知的，包括，例如ELISA、Western印迹分析、RIA和流式细胞分析。合适的试验在实施例中详细描述。抗体的结合动力学(例如结合亲和力)也可以通过本领域公知的标准试验(如Scatchard或Biacore

系统分析)来评价。为了评价与Raji或Daudi B细胞肿瘤细胞的结合，Raji(ATCC保藏号CCL-86)或Daudi(ATCC保藏号CCL-213)细胞可以从公开来源获得，如美国典型培养物保藏中心，并且在标准试验如流式细胞分析中使用。

单克隆抗体21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8

本发明优选的抗体是如实施例16、17、18、19、20、21和22所述分离并进行结构表征的人单克隆抗体21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的V_H氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：1、1、2、3、4、5、6和7中。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的V_L氨基酸序列分别显示在SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13、14和15中。

假定这些抗体中的每一个都能够与CD 19结合，则V_H和V_L序列可以“混合并匹配”，从而产生本发明的其他的抗-CD 19结合分子。CD19与这些“混合并匹配的”抗体的结合可以用上文及实施例中所述的结合试验(例如ELISA)检测。优选地，当V_H和V_L链混合并匹配时，来自特定V_H/V_L配对的V_H序列被替换为结构上相似的V_H序列。同样，优选地，来自特定V_H/V_L配对的V_L序列被替换为结构上相似的V_L序列。

因此，在一个方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：

其中该抗体与CD19、优选与人CD19特异性结合。

优选的重链和轻链组合包括：

(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区；或

(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链可变区；或

(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区；或

(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链可变区；或

(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区；或

(a)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链可变区；或

(a)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区；或

(a)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链可变区。

在另一方面，本发明提供包含21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3或其组合的抗体。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的V_H CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21和22中。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的V_H CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28和29中。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的V_H CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35和36中。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的V_K CDR1的氨基酸序列示于SEQ ID NO：37、38、39、40、41、42和43中。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的V_K CDR2的氨基酸序列示于SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49和50中。21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的V_K CDR3的氨基酸序列示于SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57和58中。CDR区用Kabat系统(Kabat，E.A.等人(1991)Sequencesof Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH出版号91-3242)勾画出。

假如这些抗体均能与CD19结合，并且抗原结合特异性主要是由CDR1、2和3区提供的，则V_H CDR1、CDR 2和CDR 3序列与V_KCDR1、CDR 2和CDR 3序列可以“混合并匹配”(即来自不同抗体的CDR可以混合并匹配，但是每个抗体必须含有V_H CDR1、CDR 2和CDR 3和V_K CDR1、CDR 2和CDR 3)，从而产生本发明的其他的抗-CD 19结合分子。CD 19与这些“混合并匹配的”抗体的结合可以用上文及实施例中所述的结合试验(例如ELISA，Biacore

分析)检测。优选地，当V_H CDR序列混合并匹配时，来自特定V_H序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被替换为结构上相似的CDR序列。同样，当V_K CDR序列混合并匹配时，来自特定V_K序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选地被替换为结构上相似的CDR序列。对于本领域技术人员而言显而易见的是，通过将一个或多个V_H和/或V_L CDR区序列替换为来自此处公开的单克隆抗体21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的CDR序列的结构上相似的序列，可以产生新的V_H和V_L序列。

因此，在另一个方面，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：

(a)包含选自SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21和22的氨基酸序列的重链可变区CDR1；

(b)包含选自SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28和29的氨基酸序列的重链可变区CDR2；

(c)包含选自SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35和36的氨基酸序列的重链可变区CDR3；

(d)包含选自SEQ ID NO：37、38、39、40、41、42和43的氨基酸序列的轻链可变区CDR1；

(e)包含选自SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列的轻链可变区CDR2；和

(f)包含选自SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57和58的氨基酸序列的轻链可变区CDR3；

其中该抗体与CD 19、优选与人CD 19特异性结合。

在一个优选实施方案中，该抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：23的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：30的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：37的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：44的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：51的轻链可变区CDR3。

在另一优选实施方案中，该抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：23的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：30的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：37的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：44的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：52的轻链可变区CDR3。

在另一优选实施方案中，该抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：17的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：24的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：31的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：38的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：45的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：53的轻链可变区CDR3。

在另一优选实施方案中，该抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：18的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：25的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：32的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：39的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：46的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：54的轻链可变区CDR3。

在另一优选实施方案中，该抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：19的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：26的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：33的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：40的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：47的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：55的轻链可变区CDR3。

在另一优选实施方案中，该抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：20的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：27的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：34的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：41的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：48的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：56的轻链可变区CDR3。

在另一优选实施方案中，该抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：21的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：28的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：35的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：42的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：49的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：57的轻链可变区CDR3。

在另一优选实施方案中，该抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：22的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：29的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：36的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：43的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：50的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：58的轻链可变区CDR3。

本领域公知，不依赖于CDR1和/或CDR2域，单独的CDR3域即可以决定抗体对于同源抗原的结合特异性，并且基于共同的CDR3序列可以预测性地产生具有相同结合特异性的多种抗体。参见，例如，Klimka等人，British J.of Cancer 83(2)：252-260(2000)(描述了仅使用鼠抗-CD30抗体Ki-4的重链可变域CDR3产生人源化抗-CD30抗体)；Beiboer等人，J.Mol Biol.296：833-849(2000)(描述了仅使用亲本鼠MOC-31抗-EGP-2抗体的重链CDR3序列产生重组上皮糖蛋白-2(EGP-2)抗体)；Rader等人，Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.95：8910-8915(1998)(描述了使用鼠抗整联蛋白α_vβ₃抗体LM609的重链和轻链可变CDR3域的一组人源化抗整联蛋白α_vβ₃抗体，其中每个成员抗体在CDR3域之外含有不同的序列，并且能够与亲本鼠抗体结合相同的表位，其亲和力与亲本鼠抗体一样高或更高)；Barbas等人，J.Am.Chem.Soc.116：2161-2162(1994)(公开了CDR3域对抗原结合提供了最重要的贡献)；Barbas等人，Proc，Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：2529-2533(1995)(描述了三种抗人胎盘DNA的Fab(SI-1，SI-40和SI-32)的重链CDR3序列向抗破伤风类毒素Fab的重链上的移植，由此替换了存在的重链CDR3，并且证明单独的CDR3提供结合特异性)；和Ditzel等人，J.Immunol.157：739-749(1996)(描述了移植研究，其中仅向单特异性IgG破伤风类毒素结合Fab p313抗体转移亲本多特异性Fab LNA3的重链CDR3足以保留亲本Fab的结合特异性)。上述每一参考文献都全文引入作为参考。

因此，本发明提供了包含一个或多个来自人或非人动物来源的抗体的重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中该单克隆抗体能够特异性结合CD 19。在某些方面，本发明提供包含一个或多个来自非人抗体如小鼠或大鼠抗体的重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中该单克隆抗体能够特异性结合CD 19。在某些实施方案中，这些本发明的包含一个或多个来自非人抗体的重链和/或轻链CDR3域的抗体与相应的亲本非人抗体(a)能够竞争结合；(b)保留功能特性；(c)结合相同的表位；和/或(d)具有类似的结合亲和力。

在其他方面，本发明提供包含一个或多个来自人抗体(如从非人动物获得的人抗体)的重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中该人抗体能够特异性结合CD 19。在其他方面，本发明提供包含一个或多个来自第一人抗体(如从非人动物获得的人抗体)的重链和/或轻链CDR3域的单克隆抗体，其中该第一人抗体能够特异性结合CD 19，并且其中来自该第一人抗体的CD3域代替了缺乏对CD 19的结合特异性的人抗体中的CDR3域，从而产生能够特异性结合CD 19的第二人抗体。在某些实施方案中，这些本发明的包含一个或多个来自第一人抗体的重链和/或轻链CDR3域的抗体与相应的亲本第一人抗体(a)能够竞争结合；(b)保留功能特性；(c)结合相同的表位；和/或(d)具有类似的结合亲和力。

具有特定种系序列的抗体

在某些实施方案中，本发明的抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。

例如，在一个优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_H 5-51基因的重链可变区，其中该抗体与CD 19特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_H 1-69基因的重链可变区，其中该抗体与CD 19特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_K L18基因的轻链可变区，其中该抗体与CD 19特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_K A27基因的轻链可变区，其中该抗体与CD 19特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含产自或源自人V_K L15基因的轻链可变区，其中该抗体与CD 19特异性结合。在另一优选实施方案中，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体：

(a)包含产自或源自人V_H 5-51或V_H 1-69基因(该基因分别编码SEQ ID NO：74和75所示的氨基酸序列)的重链可变区；

(b)包含产自或源自人V_K L18、V_k A27或V_K L15基因(该基因分别编码SEQ ID NO：76、77和78所示的氨基酸序列)的轻链可变区；且

(c)与CD 19、优选与人CD 19特异性结合。

分别具有V_H 5-51和V_k L18的V_H和V_K的抗体的例子是21D4、21D4a、27F3、5G7、13F1和46E8。分别具有V_H 1-69和V_k A27的V_H和V_K的抗体的一个例子是47G4。分别具有V_H 1-69和V_k L15的V_H和V_K的抗体的一个例子是3C10。

在本文中，如果一种人抗体的可变区是从使用人种系免疫球蛋白基因的系统中获得的，则该人抗体包含“产自”或“源自”特定种系序列的重链或轻链可变区。这样的系统包括用目标抗原免疫携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠，或者用目标抗原筛查展示在噬菌体上的人免疫球蛋白基因文库。“产自”或“源自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体可以这样鉴定：将该人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，选择在序列上最接近于该人抗体序列(即有最高％同一性)的人种系免疫球蛋白序列。“产自”或“源自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体与该种系序列相比可能包含氨基酸差异，例如由于天然发生的体细胞突变或定点突变的有意引入而导致的氨基酸差异。但是，选择的人抗体在氨基酸序列上与人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列一般至少90％相同，并且含有当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠种系序列)相比较时确认该人抗体属于人类抗体的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体在氨基酸序列上与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列可以至少95％、或者甚至至少96％、97％、98％或99％相同。一般来说，源自特定人种系序列的人抗体表现与该人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有不超过10个氨基酸的差异。在某些情况下，该人抗体可能表现与该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列有不超过5个、或者甚至不超过4、3、2或1个氨基酸的差异。

同源抗体

在另一实施方案中，本发明的抗体包含的重链和轻链可变区含有与此处所述优选抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列，并且其中该抗体保留了本发明抗-CD 19抗体的所需功能特性。

例如，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链可变区和轻链可变区，其中：

(a)重链可变区包含与选自SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6和7的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；

(b)轻链可变区包含与选自SEQ ID NO：8、9、10、11、12、13、14和15的氨基酸序列至少80％同源的氨基酸序列；

(c)该抗体以1×10^-7M或更低的K_D与人CD 19结合；

(d)与Raji和Daudi B细胞肿瘤细胞结合。

在各种实施方案中，该抗体可以是，例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。

在另外一些实施方案中，V_H和/或V_L氨基酸序列可以与上述序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。具有与上述序列的V_H和V_L区高度(即80％或更高)同源的V_H和V_L区的抗体可以如下获得：诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)编码SEQ IDNO：59、60、61，62、63、64、65、66、61、68、69、70、71、72或73的核酸分子，然后用此处所述的功能试验检测编码的被改变抗体的保留的功能(即以上(c)到(d)所述的功能)。

本文使用的两个氨基酸序列之间的百分同源性等同于两个序列之间的百分同一性。考虑为了两个序列之间进行最佳比对所需要引入的空位的数目和每个空位的长度后，两个序列之间的百分同一性是这两个序列共有的相同位点的数目的函数(即％同源性＝相同位点的数目/位点的总数×100)。两个序列之间的序列比较和百分同一性的确定可以如下面的非限制性实施例中所述用数学算法实现。

两个氨基酸序列之间的百分同一性可以用已经整合入ALIGN程序(2.0版本)中的E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.4：11-17(1988))的算法来确定，其使用PAM120权重残基表，12的空位长度罚分，4的空位罚分。另外，两个氨基酸序列之间的百分同一性也可以用已经整合入GCG软件包(可从www.gcg.com获得)的GAP程序中的Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))的算法来确定，其使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵，16、14、12、10、8、6或4的空位权重，和1、2、3、4、5或6的长度权重。

另外，或者可替代地，本发明的蛋白质序列可以选一步作为“查询序列”用于检索公共数据库，例如鉴定相关序列。这种检索可以用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的XBLAST程序(2.0版本)进行。BLAST蛋白质检索可以用XBLAST程序进行，得分＝50，字长＝3，以获得与本发明的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以采用如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402所述的空位BLAST。当采用BLAST和空位BLAST程序时，可以使用各自程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。

具有保守修饰的抗体

在某些实施方案中，本发明的抗体包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于本文所述优选抗体(例如21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8)的特定氨基酸序列或其保守修饰，并且其中该抗体保留本发明抗-CD 19抗体的所需功能特性。因此，本发明提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中：

(a)重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35和36的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列，

(b)轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57和58的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列，

(c)该抗体以1×10^-7M或更低的K_D与人CD 19结合；

(d)与Raji和Daudi B细胞肿瘤细胞结合。

在一个优选实施方案中，重链可变区CDR2序列包含选自SEQ IDNO：23、24、25、26、27、28和29的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列。在另一优选实施方案中，重链可变区CDR1序列包含选自SEQ IDNO：16、17、18、19、20、21和22的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：37、38、39、40、41、42和43的氨基酸序列和其保守修饰的氨基酸序列。

本文使用的术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变含该氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。这样的保守修饰包括氨基酸置换、添加和缺失。可以通过本领域公知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，向本发明抗体中引入修饰。保守氨基酸置换是将氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基的家族在本领域中已经定义。这些家族包括：具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。因此，本发明抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被置换为来自相同侧链家族的其他氨基酸残基，并且可以用此处所述的功能试验检测改变的抗体保留的功能(即以上(c)至(d)所述的功能)。

与本发明的抗-CD 19抗体结合相同表位的抗体

在另一实施方案中，本发明提供与本发明的任意CD 19单克隆抗体结合相同表位的抗体(即能够与本发明的任意单克隆抗体交叉竞争结合CD 19的抗体)。在优选实施方案中，用于交叉竞争研究的参比抗体可以是单克隆抗体21D4(具有分别如SEQ ID NO：1和8所示的V_H和V_L序列)，或单克隆抗体21D4a(具有分别如SEQ IDNO：1和9所示的V_H和V_L序列)，或单克隆抗体47G4(具有分别如SEQ ID NO：2和10所示的V_H和V_L序列)，或单克隆抗体27F3(具有分别如SEQ ID NO：3和11所示的V_H和V_L序列)，或单克隆抗体3C10(具有分别如SEQ ID NO：4和12所示的V_H和V_L序列)，或单克隆抗体5G7(具有分别如SEQ ID NO：5和13所示的V_H和V_L序列)，或单克隆抗体13F1(具有分别如SEQ ID NO：6和14所示的V_H和V_L序列)，或单克隆抗体46E8(具有分别如SEQ ID NO：7和15所示的V_H和V_L序列)。这些交叉竞争抗体可以根据它们在标准CD 19结合测定中与21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8交叉竞争的能力来鉴定。例如，可以利用BIAcore

分析、ELISA测定或流式细胞分析来证明与本发明抗体的交叉竞争。被测试抗体抑制例如21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8与人CD 19结合的能力证明，该测试抗体可以与21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8竞争结合人CD 19，因此所结合的人CD 19上的表位与21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8相同。在一个优选实施方案中，所结合的人CD 19上的表位与21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8相同的抗体是人单克隆抗体。这些人单克隆抗体可以如实施例所述制备和分离。

工程化抗体和修饰的抗体

具有此处所公开的一种或多种V_H和/或V_L序列的抗体可以用作起始材料来构建一种修饰的抗体，该修饰的抗体相对于与起始抗体相比可以具有改变的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即V_H和/或V_L)例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个构架区内的一个或多个氨基酸来构建抗体。另外，或者，可以通过修饰恒定区内的残基来构建抗体，例如改变该抗体的效应功能。

在某些实施方案中，可以利用CDR移植来改造抗体的可变区。抗体主要是通过位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基与靶抗原相互作用。由于这个原因，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列在各个抗体之间更加多样化。由于CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，因此通过构建如下的表达载体能够表达模拟特定天然存在抗体的特性的重组抗体：该表达载体包含来自特定天然存在抗体的CDR序列，该CDR序列被移植到来自具有不同特性的不同抗体的构架序列上(参见，例如，Riechmann，L.等(1998)Nature332：323-327；Jones，P.等(1986)Nature 321：522-525；Queen，C.等(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10029-10033；Winter的美国专利5,225,539，和Queen等人的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

因此，另一个实施方案涉及一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区，该CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21和22，SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28和29，和SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35和36的氨基酸序列，并且包括含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，该CDR1、CDR2和CDR3序列分别包含选自SEQ ID NO：37、38、39、40、41、42和43，SEQ IDNO：44、45、46、47、48、49和50，和SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57和58的氨基酸序列。因此，这些抗体含有单克隆抗体21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8的V_H和V_L CDR序列，但是也可能含有与这些抗体不同的构架序列。

这些构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或发表的参考文献中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在以下资源中发现：“VBase”人种系序列数据库(可从因特网上www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase获得)，以及Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242；Tomlinson，I.M.等(1992)“The Repertoire of Human Germline V_HSequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with DifferentHypervariable Loops”J.Mol.Biol.227：776-798；和Cox，J.P.L.等(1994)“A Directory of Human Germ-line V_H Segments Reveals a Strong Bias intheir Usage”Eur.J.Immunol.24：827-836；其内容均引入本文作为参考。作为另一个例子，用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在Genbank数据库中发现。例如，在HCo7 HuMAb小鼠中发现的下列重链种系序列可以根据如下Genbank登录号获得：1-69(NG_0010109，NT_024637和/或BC070333)，3-33(NG_0010109和NT_024637)和3-7(NG_0010109和NT_024637)。作为另一个例子，在VK HCol2 HuMAb小鼠中发现的以下重链种系序列可以根据如下Genbank登录号获得：1-69(NG_0010109，NT_024637和BC070333)，5-51(NG_0010109和NT_024637)，4-34(NG_0010109和NT_024637)，3-30.3(CAJ556644)和3-23(AJ406678)。

使用本领域技术人员公知的一种被称为缺口BLAST(Altschul等人(1997)Nucleic Acids Research 25：3389-3402)的序列相似性检索方法，将抗体蛋白质序列与汇编的蛋白质序列数据库进行比较。BLAST是一种启发式算法，其中抗体序列和数据库序列之间的统计学显著性比对可能含有所比对的字句的高得分的片段对(HSP)。延伸或修剪不能提高其得分的片段对被称为命中(hit)。简要地说，翻译VBASE来源的核苷酸序列(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php)，而保留FR1至FR3构架区之间并且包括该构架区的区域。数据库数据的平均长度为98个残基。除去在蛋白质全长上准确匹配的重复序列。使用程序blastp，除关闭的低复杂性过滤器和BLOSUM62置换矩阵以外应用缺省标准参数对蛋白质进行BLAST检索，对于排名前5位的命中，过滤器产生序列匹配。在所有6个框架内的核苷酸序列都翻译，在数据库序列的匹配片段中没有终止密码子的框架被认为是潜在命中。然后使用BLAST程序tblastx进行证实，该程序翻译所有6个框架内的抗体序列，并且比较其翻译与在所有6个框架内动态翻译的VBASE核苷酸序列。

同一性是抗体序列和蛋白质数据库之间在序列全长上的完全氨基酸匹配。阳性(同一性+置换匹配)不同，但是氨基酸置换由BLOSUM62置换矩阵指导。如果抗体序列以相同的同一性匹配两个数据库序列，则阳性最强的命中被判断为匹配序列命中。

用于本发明抗体的优选构架序列在结构上类似于所选择的本发明抗体使用的构架序列，例如，类似于本发明优选的单克隆抗体使用的V_H 5-51构架序列(SEQ ID NO：74)和/或V_H 1-69构架序列(SEQID NO：75)和/或V_K L18构架序列(SEQ ID NO：76)和/或V_K A27构架序列(SEQ ID NO：77)和/或V_K L15构架序列(SEQ ID NO：78)。V_H CDR1、CDR 2和CDR 3序列和V_K CDR1、CDR 2和CDR 3序列可以被移植到与该构架序列的来源种系免疫球蛋白基因具有相同序列的构架区上，或者CDR序列可以被移植到与该种系序列相比含有一个或多个突变的构架区上。例如，已经发现，在某些情况中，将构架区内的残基进行突变对于保持或增强抗体的抗原结合能力是有利的(参见，例如，Queen等的美国专利5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

另一种类型的可变区修饰是突变V_H和/或V_K CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基，从而改善目标抗体的一种或多种结合特性(例如亲和力)。可以进行定点诱变或PCR介导的诱变，以引入突变，对抗体结合的影响，或者其他目标功能特性，可以用此处所述和实施例中提供的体外或体内试验来评价。优选引入(如上文所述的)保守修饰。这些突变可以是氨基酸置换、添加或缺失，但是优选置换。而且，一般改变CDR区内的不超过1、2、3、4或5个残基。

因此，在另一个实施方案中，本发明提供分离的抗-CD 19单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含的重链可变区含有：(a)V_H CDR1区，其包含选自SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21和22的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21和22相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(b)V_H CDR2区，其包含选自SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28和29的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28和29相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(c)V_H CDR3区，其包含选自SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35和36的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35和36相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(d)V_K CDR1区，其包含选自SEQ ID NO：37、38、39、40、41、42和43的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：37、38、39、40、41、42和43相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；(e)V_K CDR2区，其包含选自SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49和50相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列；和(f)V_KCDR3区，其包含选自SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57和58的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57和58相比具有1、2、3、4或5个氨基酸置换、缺失或添加的氨基酸序列。

本发明的工程化抗体包括例如为了改善抗体特性而对其V_H和/或V_K内的构架残基进行了修饰的抗体。进行这样的构架修饰一般是为了降低抗体的免疫原性。例如，一种方法是将一个或多个构架残基“回复突变”为相应的种系序列。更特别地，经历体细胞突变的抗体可含有与衍生该抗体的种系序列不同的构架残基。通过比较抗体构架序列与衍生该抗体的种系序列，可以鉴定这些残基。

例如，下面的表I显示了抗-PD-1抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4的构架区中不同于重链亲本种系序列的大量氨基酸改变。为了使构架区序列中的一个或多个氨基酸残基恢复为其种系构型，可以通过(例如)定点诱变或PCR介导的诱变，将该体细胞突变“回复突变”为种系序列。

表1.抗体17D8、2D3、4H1、5C4、4A11、7D3和5F4相对于重链种系构型的修饰

抗-CD 19抗体	氨基酸位点	抗体的氨基酸	种系构型的原始氨基酸
抗-CD 19抗体	氨基酸位点	抗体的氨基酸	种系构型的原始氨基酸	21D4	30	S	T
	77	R	S	21D4	30	S	T
	77	R	S	21D4a	30	S	T
	77	R	S	21D4a	30	S	T
	77	R	S	47G4	24	D	A
3C10	77	N	S	47G4	24	D	A
3C10	77	N	S		88	A	S
5G7	19	N	K		88	A	S
5G7	19	N	K		77	N	S
13F1	19	Q	K		77	N	S
13F1	19	Q	K		28	T	S
	85	G	S		28	T	S
	85	G	S	46E8	19	Q	K
	28	T	S	46E8	19	Q	K
	28	T	S		85	G	S

另一种类型的构架修饰涉及对构架区内、乃至一个或多个CDR区内的一个或多个残基进行突变，以除去T细胞表位，从而降低该抗体的潜在的免疫原性。该方法也被称为“脱免疫”，在Carr等人的公布号为20030153043的美国专利中详细记载。

除了在构架区或CDR区内进行的修饰以外，或者作为它的替代方案，也可以将本发明的抗体改造为在Fc区内包括修饰，一般是为了改变该抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞毒性。此外，也可以将本发明的抗体化学修饰(例如一个或多个化学部分可以连接到该抗体上)，或者修饰改变其糖基化，以改变该抗体的一种或多种功能特性。这些实施方案均在下文详细描述。Fc区中残基的编号是Kabat的EU指数的编号。

在一个实施方案中，修饰CH1的铰链区，使该铰链区中半胱氨酸残基的数目改变，例如增加或减少。该方法在Bodmer等人的美国专利No.5,677,425号中详细记载。改变CH1铰链区中半胱氨酸的数目是为了(例如)促进轻链和重链的装配，或提高或降低抗体的稳定性。

在另一实施方案中，对抗体的Fc铰链区进行突变，以降低该抗体的生物半衰期。更具体地，向Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区引入一个或多个氨基酸突变，使得该抗体与葡萄球菌蛋白A(SpA)的结合比天然Fc-铰链结构域与SpA的结合减弱。该方法在Ward等人的美国专利No.6,165,745号中详细记载。

在另一实施方案中，修饰抗体以提高其生物半衰期。可以使用各种方法。例如，如Ward的美国专利No.6,277,375所述，可以引入一个或多个如下突变：T252L、T254S、T256F。或者，如Presta等人的美国专利No.5,869,046和6,121,022所述，为了提高生物半衰期，该抗体可以在CH1或CL区内进行改变，使之含有来自IgG Fc区CH2结构域的两个环的补救受体结合表位。

在其他一些实施方案中，通过将至少一个氨基酸残基置换为不同的氨基酸残基来改变Fc区，以改变抗体的效应功能。例如，可以将选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320、322的一个或多个氨基酸置换为不同的氨基酸残基，使得该抗体对效应配体的亲和力改变，但是保留亲本抗体的抗原结合能力。其亲和力被改变的效应配体可以是，例如，Fc受体或补体的C1成分。该方法在Winter等人的美国专利No.5,624,821和5,648,260中更详细地描述。

在另外一个实施例中，可以将选自氨基酸残基329、331和322的一个或多个氨基酸置换为不同的氨基酸残基，使得该抗体的C1q结合改变和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)降低或消除。该方法在Idusogie等人的美国专利No.6,194,551中更详细地描述。

在另外一个实施例中，改变氨基酸位点2316、17、18、19、20、21和2239中的一个或多个氨基酸残基，从而改变该抗体固定补体的能力。该方法在Bodmer等人的PCT公布WO 94/29351中进一步描述。

在另外一个实施例中，为了提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗体对Fcγ受体的亲和力，通过在下列位点处修饰一个或多个氨基酸来修饰Fc区：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。该方法在Presta的PCT公布WO 00/42072中进一步描述。而且，人IgG1上对于FcγRI、FcγRII、FcγRIII和FcRn的结合位点已经作图，并且已经描述了具有改善的结合的变体(参见，Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.276：6591-6604)。位点256、290、298、333、334和339处的特定突变显示改善了与FcγRIII的结合。另外，下列组合突变体显示改善了与FcγRIII的结合：T256A/S298A，S298A/E333A，S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。

在另一实施方案中，修饰抗体的糖基化。例如，可以制备无糖基化的抗体(即该抗体缺乏糖基化)。例如，为了提高抗体对抗原的亲和力，可以改变糖基化。这样的碳水化合物修饰可以通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。例如，可以进行一个或多个氨基酸置换，使一个或多个可变区构架糖基化位点消失，从而消除该位点处的糖基化。这种无糖基化可以提高抗体对抗原的亲和力。这种方法在Co等人的美国专利No.5,714,350和6,350,861中更详细地描述。

另外，或者可替代地，可以制备糖基化类型改变的抗体，如岩藻糖基残基数目减少的低岩藻糖基化抗体，或等分GlcNac结构增多的抗体。已经证明这种改变的糖基化模式提高了抗体的ADCC能力。这种碳水化合物修饰可以通过(例如)在糖基化机制改变的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机制改变的细胞在本领域中已有描述，能够用作宿主细胞在其中表达本发明的重组抗体，从而产生糖基化改变的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因，FUT8(α(1，6)岩藻糖基转移酶基因)，因此在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物中缺乏岩藻糖。通过使用两种替代载体定向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因，产生Ms704、Ms705和Ms709FUT8^-/-细胞系(参见Yamane等的美国专利申请No.20040110704和Yamane-Ohnuki等.(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-22)。另一个例子是，Hanai等的EP 1,176,195描述了具有功能破坏的FUT8基因的细胞系，该基因编码岩藻糖转移酶，由于减少或消除了α(1，6)键相关的酶，在这种细胞系中表达的抗体表现为低岩藻糖基化。Hanai等也描述了用于向结合抗体Fc区的N-乙酰葡萄糖胺上添加岩藻糖的酶活性低或不具有酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。Presta的PCT公布WO 03/035835记载了一种变异CHO细胞系，Lec13细胞，其将岩藻糖连接到Asn(297)-连接的碳水化合物上的能力降低，也导致在该宿主细胞中表达的抗体为低岩藻糖基化(参见，Shields，R.L.等(2001)J.Biol.Chem.277：26733-26740)。Umana等人的PCT公布WO 99/54342记载了表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如β(1，4)-N-乙酰葡糖氨基转移酶III(GnTIII))的工程化细胞系，因此该工程化细胞系中表达的抗体表现为等分GlcNac结构增加，导致抗体的ADCC活性提高(参见，Umana等(1999)Nat.Biotech.17：176-180)。此外，抗体的岩藻糖残基可以用岩藻糖苷酶切下。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶从抗体上除去岩藻糖残基(Tarentino，A.L.等.(1975)Biochem.14：5516-23)。

本发明涉及的对此处所述抗体的另一种修饰是PEG化。例如，为了提高抗体的生物(例如血清)半衰期，可以将该抗体PEG化。为了PEG化一种抗体，一般在一个或多个PEG基团与抗体或抗体片段连接的条件下，将该抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)如PEG的反应性酯或醛衍生物反应。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应进行PEG化。本文使用的术语“聚乙二醇”包括用来衍生化其他蛋白质的任何PEG形式，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施方案中，将要PEG化的抗体是一种无糖基化的抗体。将蛋白质PEG化的方法在本领域中公知，并且可以用于本发明的抗体。参见，例如，Nishimura等人的EP0154316和Ishikawa等人的EP 0 401 384。

抗体的物理性质

本发明的抗体可以进一步通过抗CD 19抗体的各种物理性质进行表征。可以利用各种试验基于这些物理性质检测和/或区分不同类别的抗体。

在某些实施方案中，本发明的抗体可以在轻链或重链可变区中含有一个或多个糖基化位点。可变区中一个或多个糖基化位点的存在可能由于抗原结合改变而导致抗体的免疫原性提高或者抗体的pK改变(Marshall等人(1972)Annu Rev Biochem 41：673-702；Gala FA和MorrisonSL(2004)J Immunol 172：5489-94；Wallick等人(1988)J Exp Med168：1099-109；Spiro RG(2002)Glycobiology 12：43R-56R；Parekh等人(1985)Nature 316：452-7；Mimura等人(2000)Mol Immunol 37：697-706)。已知糖基化在含有N-X-S/T序列的基序处发生。可变区糖基化可以用Glycoblot试验进行检测，该试验切割抗体，产生Fab，然后利用测定高碘酸盐氧化和席夫碱形成的试验检测糖基化。或者，可变区糖基化也可以用Dionex光层析法(Dionex-LC)检测，该方法从Fab上切下糖成为单糖，并且分析各个糖的含量。在某些情况中，优选不含可变区糖基化的抗-CD 19抗体。这可以通过选择在可变区中不含糖基化基序的抗体或者利用本领域公知的标准技术突变糖基化基序内的残基来实现。

在一个优选实施方案中，本发明的抗体不含天冬酰胺异构化位点。脱酰胺或异天冬氨酸作用可以分别在N-G或D-G序列上发生。脱酰胺或异天冬氨酸作用导致产生异天冬氨酸，这通过在侧链羧基末端而不是在主链上产生扭结的结构而降低了抗体的稳定性。异天冬氨酸的产生可以用iso-quant试验来测定，该试验利用反相HPLC检测异天冬氨酸。

每种抗体具有独特的等电点(pI)，但是通常抗体落入6至9.5的pH范围内。IgG1抗体的pI一般落入7-9.5的pH范围内，IgG4抗体的pI一般落入6-8的pH范围内。抗体可以具有该范围之外的pI。尽管这种作用通常未知，但是推测pI落于正常范围之外的抗体在体内条件下可能具有一定的解折叠和不稳定性。等电点可以用毛细管等电聚焦试验来测定，该试验产生pH梯度，并且可以利用激光聚焦来提高精确性(Janini等人(2002)Electrophoresis 23：1605-11；Ma等人(2001)Chromatographia 53：S75-89；Hunt等人(1998)J Chromatogr A800：355-67)。在某些情况中，优选pI值落入正常范围内的抗CD 19抗体。这可以通过选择pI位于正常范围内的抗体或者通过利用本领域公知的标准技术突变带电荷的表面残基来实现。

每种抗体的熔解温度指示热稳定性(Krishnamurthy R和ManningMC(2002)Curr Pharm Biotechnol 3：361-71)。较高的热稳定性表示在体内有较高的总体抗体稳定性。抗体的熔点可以用诸如差示扫描量热法(Chen等人(2003)Pharm Res 20：1952-60；Ghirlando等人(1999)ImmunolLett 68：47-52)等技术来测量。T_M1表示抗体最初解折叠的温度。T_M2表示抗体完全解折叠的温度。通常，优选地本发明的抗体的T_M1大于60℃，优选大于65℃，甚至更优选大于70℃。此外，抗体的热稳定性也可以利用圆二色性来测量(Murray等人(2002)J.Chromatogr Sci 40：343-9)。

在一个优选实施方案中，选择不快速降解的抗体。抗CD 19抗体的破裂可以用本领域公知的毛细管电泳(CE)和MALDI-MS来测定(Alexander AJ和Hughes DE(1995)Anal Chem 67：3626-32)。

在另一个优选实施方案中，选择具有最小的聚集作用的抗体。聚集可以导致触发不希望的免疫应答和/或改变的或不利的药代动力学性质。通常，抗体具有25％或更少的聚集是可以接受的，优选20％或更少，甚至更优选15％或更少，甚至更优选10％或更少，甚至更优选5％或更少。聚集可以用本领域公知的几种技术来测定，包括大小排阻柱(SEC)高效液相层析(HPLC)和光散射法，用来鉴定单体、二聚体、三聚体或多聚体。

抗体工程化方法

如上所述，能够利用具有此处公开的V_H和V_K序列的抗-CD 19抗体，通过修饰V_H和/或V_K序列或与之连接的恒定区，产生新的抗-CD 19抗体。因此，在本发明的另一方面，利用本发明的抗-CD 19抗体(例如21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8)的结构特征，产生结构上相关的抗-CD 19抗体，该结构上相关的抗体保留本发明抗体的至少一种功能特性，如与人CD 19结合。如上所述，例如，21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8的一个或多个CDR区或其突变可以与已知的构架区和/或其他CDR重组组合，从而产生另外的重组工程化的本发明的抗-CD 19抗体。其他类型的修饰包括以上部分所述的修饰。用于工程化方法的起始材料是此处提供的一种或多种V_H和/或V_K序列，或其一个或多个CDR区。为了产生工程化抗体，不一定必须实际制备(即表达为蛋白质)具有此处提供的一种或多种V_H和/或V_K序列，或其一个或多个CDR区的抗体。而是用该序列中所含的信息作为起始材料，产生由原始序列衍生的“第二代”序列，然后制备该“第二代”序列，并将其表达为蛋白质。

因此，在另一实施方案中，本发明提供一种制备抗-CD 19抗体的方法，包括：

(a)提供：(i)重链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21和22的CDR1序列、选自SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28和29的CDR2序列、和/或选自SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35和36的CDR3序列；和/或(ii)轻链可变区抗体序列，其包含选自SEQ ID NO：37、38、39、40、41、42和43的CDR1序列、选自SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49和50的CDR2序列、和/或选自SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57和58的CDR3序列；

(b)改变重链可变区抗体序列和/或轻链可变区抗体序列内的至少一个氨基酸残基，从而产生至少一个改变的抗体序列；和

(c)将该改变的抗体序列表达为蛋白质。

可以利用标准分子生物学技术制备和表达所述改变的抗体序列。

优选地，由改变的抗体序列编码的抗体保留此处所述抗-CD 19抗体的一种、一些或全部功能特性，该功能特性包括但不限于：

(i)以1×10^-7M或更低的K_D与人CD 19结合；

(ii)与Raji和Daudi B细胞肿瘤细胞结合。

改变的抗体的功能特性可以用本领域中使用的和/或此处所述的(如实施例中所述的)标准试验(例如流式细胞术、结合测定)来评价。

在本发明抗体的工程化方法的某些实施方案中，可以沿全部或部分抗-CD 19抗体编码序列随机或选择性引入突变，并可以针对结合活性和/或如此处所述的其他功能特性，筛选获得的修饰的抗-CD 19抗体。突变方法在本领域中已经描述。例如，Short的PCT公布WO 02/092780记载了利用饱和诱变、合成连接装配或它们的组合产生和筛选抗体突变的方法。另外，Lazar等人的PCT公布WO 03/074679也记载了利用计算筛选方法优化抗体的生理化学性质的方法。

编码抗体的核酸分子

本发明的另一方面涉及编码本发明的抗体的核酸分子。该核酸可以存在于完整细胞、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式存在。当通过包括碱/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳在内的标准技术和本领域公知的其他方法与其他细胞成分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)分离纯化时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”。参见，F.Ausubel等ed.(1987)Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing and Wiley Interscience，New York。本发明的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以含有或者可以不含内含子序列。在一个优选实施方案中，该核酸是cDNA分子。

本发明的核酸可以利用标准分子生物学技术获得。对于杂交瘤(例如，由如下文进一步描述的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，编码由杂交瘤制备的抗体轻链和重链的cDNA可以用标准PCR扩增或cDNA克隆技术获得。对于从免疫球蛋白基因文库中获得的抗体(例如使用噬菌体展示技术)，可以从文库中回收编码该抗体的一种或多种核酸。

本发明优选的核酸分子是编码21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1或46E8单克隆抗体的V_H和V_L序列的核酸分子。编码21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的V_H序列的DNA序列分别在SEQ ID NO：59、60、61、62、63、64和65中示出。编码21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的V_L序列的DNA序列分别在SEQ ID NO：66、67、68、69、70、71、72和73中示出。

一旦获得编码V_H和V_L片段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，编码V_L或V_H的DNA片段与编码另外一种蛋白质如抗体恒定区或柔性连接体的另一个DNA片段有效连接。如本文使用的术语“有效连接”意思是两个DNA片段连接在一起，使得这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持符合阅读框。

通过将编码V_H的DNA与编码重链恒定区(CH1、CH2和CH3)的另外一种DNA分子有效连接，可以将分离的编码V_H区的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中公知(参见，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选的是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码V_H的DNA可以与只编码重链CH1恒定区的另外一种DNA分子有效连接。

通过将编码V_L的DNA与编码轻链恒定区CL的另外一种DNA分子有效连接，可以将分离的编码V_L区的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中公知(参见，例如，Kabat，E.A.等(1991)Sequences of Proteins of Immunologicl Interest，第五版，U.S.Department of Health and Human Services，NIH出版号91-3242)，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。

为了产生scFv基因，将编码V_H和V_L的DNA片段与编码柔性连接体例如编码氨基酸序列(Gly₄-Ser)₃的另外一个片段有效连接，使得V_H和V_L序列可以表达为连续的单链蛋白质，其V_L和V_H区通过该柔性连接体连接(参见，例如Bird等(1988)Science 242：423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；McCafferty等(1990)Nature348：552-554)。

单克隆抗体的产生

本发明的单克隆抗体(mAb)能够通过多种技术制备，包括常规的单克隆抗体方法，例如，Kohler和Milstein(1975)Nature 256：495所述的标准体细胞杂交技术。虽然优选体细胞杂交技术，但是原则上，能使用制备单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒或致癌转化。

用于制备杂交瘤的优选的动物系统是鼠系统。用小鼠产生杂交瘤是一种完善建立的程序。免疫程序和分离用于融合的被免疫脾细胞的技术是本领域公知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是公知的。

本发明的嵌合或人源化抗体可以基于如上所述获得的非人单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从目标非人杂交瘤中获得，并且使用标准分子生物学技术将其改造为含有非鼠(例如人类)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以利用本领域公知的方法将鼠可变区连接到人恒定区上(参见，例如，Cabilly等人的美国专利No.4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以利用本领域公知的方法将鼠CDR区插入人构架内(参见，例如，Winter的美国专利No.5,225,539，和Queen等人的美国专利No.5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。

在一个优选实施方案中，本发明的抗体是人单克隆抗体。这种抗CD 19人单克隆抗体能用携带部分人免疫系统而不是小鼠系统的转基因或转染色体小鼠产生。这些转基因和转染色体小鼠包括在此分别被称作HuMab小鼠

和KM小鼠的小鼠，并且在此通称为“人Ig小鼠”。

HuMab小鼠

(Medarex

，Inc.)包含编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座，和使内源μ和κ链基因座失活的定向突变(参见，例如，Lonberg等(1994)Nature 368(6474)：856-859)。因此，该小鼠表现为小鼠IgM或κ表达降低，并且响应于免疫，导入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，从而产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等(1994)，同上；综述Lonberg，N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113：49-101；Lonberg，N.和Huszar，D.(1995)Intern.Rev.Immunol.Vol.13：65-93，和Harding，F.和Lonberg，N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci 764：536-546)。HuMab小鼠

的制备和使用，以及该小鼠携带的基因组修饰，在下面的文献中详细描述：Taylor，L.等(1992)Nucleic Acids Research 20：6287-6295；Chen，J.等(1993)International Immunology 5：647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci USA 90：3720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4：117-123；Chen，J.等(1993)EMBO J.12：821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.152：2912-2920；Taylor，L.等(1994)International Immunology6：579-591；和Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851，这些文献的内容全文引入本文作为参考。进一步参见，Lonberg和Kay的美国专利No.5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；和Surani等人的美国专利No.5,545,807；Lonberg和Kay的PCT公布号WO92/03918，WO 93/12227，WO 94/25585，WO 97/13852，WO 98/24884和WO 99/45962；和Korman等人的PCT公布号WO 01/14424。

在另一实施方案中，可以用转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠，例如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠，产生本发明的人抗体。这种小鼠在此被称为“KM小鼠^TM”，在Ishida等人的PCT公布WO 02/43478中详细描述。

再者，表达人免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统在本领域中可以获得，能够用来产生本发明的抗-CD 19抗体。例如，可以使用一种被称作Xenomouse(Abgenix，Inc.)的替代转基因系统，这种小鼠在例如Kucherlapati等人的美国专利No.5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中描述。

而且，表达人免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统在本领域中可以获得，能够用来产生本发明的抗-CD 19抗体。例如，可以使用携带人重链转染色体和人轻链转染色体的小鼠，其被称作“TC小鼠”；这种小鼠在Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：722-727中描述。另外，本领域中已经描述了携带人重链和轻链转染色体的牛(Kuroiwa等(2002)Nature Biotechnology 20：889-894)，其能够用来产生本发明的抗-CD 19抗体。

本发明的人单克隆抗体也可以使用用于筛查人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法制备。这种用于分离人抗体的噬菌体展示方法在本领域中已经建立。参见，例如，Ladner等人的美国专利No.5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等人的美国专利No.5,427,908和5,580,717；McCafferty等人的美国专利No.5,969,108和6,172,197；和Griffiths等人的美国专利No.5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,9130，31，32，33，34，35和36,593,081。

本发明的人单克隆抗体也可以用SCID小鼠制备，该SCID小鼠中重构了人免疫细胞，因此在免疫时能够产生人抗体应答。这种小鼠在例如Wilson等人的美国专利No.5,476,996和5,698,767中描述。

人Ig小鼠的免疫

当使用人Ig小鼠产生本发明的人抗体时，根据Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1996)Nature Biotechnology14：845-851；和PCT公布WO 98/24884和WO 01/14424所述，用纯化的或富集的CD 19抗原和/或重组CD 19或表达CD 19的细胞或CD 19融合蛋白的制剂免疫该小鼠。优选地，第一次输注时小鼠为6-16周龄。例如，可以使用纯化的或重组的CD 19抗原的制剂(5-50μg)腹膜内免疫人Ig小鼠。

产生抗CD 19完全人单克隆抗体的详细程序在下面的实施例1中描述。应用各种抗原积累的经验证明，当最初使用弗氏完全佐剂中的抗原腹膜内(IP)免疫，接着隔周用弗氏不完全佐剂中的抗原腹膜内免疫(最多共六次)时，转基因小鼠产生应答。但是，发现弗氏佐剂之外的佐剂也是有效的。另外，发现在没有佐剂时，全细胞具有高度免疫原性。在免疫方案进程中用眼眶后取血获得的血浆样品监测免疫应答。通过ELISA(如下所述)筛选血浆，用具有足够抗-CD 19人免疫球蛋白效价的小鼠进行融合。用抗原对小鼠进行静脉内加强免疫，3天后处死并且取出脾脏。预期每次免疫可能需要2-3次融合。每一种抗原一般免疫6-24只小鼠。通常HCo7和HCo12系都使用。另外，HCo7和HCo12转基因可以杂交，产生具有两种不同人重链转基因(HCo7/HCo12)的一种小鼠。可替代地或者另外，如实施例1所述，可以使用KM小鼠

系。

产生人单克隆抗体的杂交瘤的制备

为了制备产生本发明的人单克隆抗体的杂交瘤，从被免疫的小鼠中分离脾细胞和/或淋巴结细胞，并且与合适的无限增殖化细胞系(例如小鼠骨髓瘤细胞系)融合。根据抗原特异性抗体的产生筛选得到的杂交瘤。例如，可以使用50％PEG，将来自被免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数量的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。或者，可以使用CytoPulse大腔室细胞融合电穿孔仪(CytoPulse Sciences，Inc.Glen Burnie Maryland)，使用基于电场的电融合法，将来自被免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液融合。将细胞以大约2×10⁵的密度接种于平底微量滴定板中，接着在含有20％胎克隆血清，18％“653”条件培养基，5％Origen(IGEN)，4mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，5mM HEPES，0.055mM 2-巯基乙醇，50单位/毫升青霉素，50mg/ml链霉素，50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma；融合后24小时加入HAT)的选择性培养基中温育两周。大约两周之后，在用HT替换了HAT的培养基中培养细胞。然后通过ELISA根据人单克隆IgM和IgG抗体筛选各孔。一旦发生广泛的杂交瘤生长，则通常在10-14天之后观察培养基。将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，如果对于人IgG仍然是阳性，则可以通过有限稀释将单克隆抗体至少亚克隆两次。然后体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。

为了纯化人单克隆抗体，选择的杂交瘤可以在用于单克隆抗体纯化的两升旋转摇瓶中生长。过滤上清液，浓缩，之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析。洗脱下来的IgG通过凝胶电泳和高效液相色谱法检查以确保纯度。将缓冲溶液换成PBS，用1.43的消光系数根据OD280确定浓度。可将单克隆抗体分成等份并且在-80℃下保存。

产生单克隆抗体的转染瘤的制备

利用(例如)本领域公知的重组DNA技术和基因转染方法的组合(例如，Morrison，S.(1985)science 229：1202)，也能在宿主细胞转染瘤中产生本发明的抗体。

例如，为了表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如，使用表达目标抗体的杂交瘤进行PCR扩增或cDNA克隆)，获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并将该DNA插入到表达载体中，使得基因与转录和翻译控制序列有效连接。在上下文中，术语“有效连接”意思是抗体基因连接到载体中，使得载体中的转录和翻译控制序列发挥它们调节该抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择与所用的表达宿主细胞相匹配的表达载体和表达控制序列。抗体轻链基因和抗体重链基因可被插入到分开的载体中，或者，更通常地，将两个基因插入到同一表达载体中。通过标准方法将抗体基因插入到表达载体中(例如，抗体基因片段上的互补限制性位点与载体连接，或者如果不存在限制性位点的活，则平端连接)。通过插入到已经编码期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得V_H区段与载体中的C_H区段有效连接，而V_K区段与载体中的C_L区段有效连接，可以利用本文描述的抗体的轻链和重链可变区产生任意抗体同种型的全长抗体基因。另外，或者可替代地，重组表达载体能编码有利于宿主细胞分泌抗体链的信号肽。可将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽与该抗体链基因的氨基末端符合阅读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的蛋白质的信号肽)。

除了抗体链基因，本发明的重组表达载体还带有控制该抗体链基因在宿主细胞中表达的调节序列。术语“调节序列”包括启动子、增强子和控制抗体链基因转录或翻译的其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这样的调节序列例如在Goeddel(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990))中描述。本领域技术人员应当理解，表达载体的设计，包括调节序列的选择，取决于诸如要转化的宿主细胞的选择、期望的蛋白质表达水平等因素。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如来源于巨细胞病毒(CMV)、猿病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))和多瘤病毒的启动子和/或增强子。可替代地可以使用非病毒调节序列，例如泛蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。另外，调节元件也可由来自诸如SRα启动子系统等不同来源的序列组成，SRα启动子系统含有来自SV40早期启动子的序列和人1型T细胞白血病病毒的长末端重复序列(Takebe，Y.等(1988)Mol.Cell.Biol.8：466-472)。

除了抗体链基因和调节序列以外，本发明的重组表达载体还可以携带另外的序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如，复制起点)和选择性标记基因。选择性标记基因有利于筛选载体已经导入其中的宿主细胞(参见，例如，Axel等人的美国专利No.4,399,216，4,634,665和5,179,017)。例如，选择性标记基因一般给已经导入载体的宿主细胞带来抗药性，例如G418、潮霉素或氨甲喋呤抗性。优选的选择性标记基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(在dhfr-宿主细胞中用于氨甲喋呤选择/扩增)和neo基因(用于G418选择)。

为了表达轻链和重链，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染到宿主细胞中。术语“转染”的各种形式包括常用于将外源DNA导入原核或真核宿主细胞中的各种技术，例如，电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等等。虽然在理论上可以在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗体，但是优选在真核细胞中，最优选在哺乳动物宿主细胞中表达该抗体，因为这样的真核细胞，特别是哺乳动物细胞，比原核细胞更可能组装和分泌正确折叠并且具有免疫活性的抗体。据报道，原核表达抗体基因无法高产率地产生活性抗体(Boss，M.A.和Wood，C.R.(1985)Immunology Today 6：12-13)。

用于表达本发明的重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢(CHO细胞)(包括Urlaub和Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220中描述的dhfr-CHO细胞，和DHFR选择性标记一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp(1982)Mol.Biol.159：601-621所述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞和SP2细胞。特别地，用于NSO骨髓瘤细胞的另一种优选表达系统是WO 87/04462(Wilson)、WO 89/01036(Bebbington)和EP 338,841(Bebbington)公开的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足以使抗体在宿主细胞中表达的时间，或更优选地，培养足以使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中的时间，而产生抗体。可应用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。

抗体与抗原结合的表征

通过(例如)标准ELISA，可以检测本发明的抗体与CD 19的结合。简要地说，用0.25μg/ml的纯化CD 19在PBS中的溶液包被微量滴定板，然后用PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。向各个孔中加入抗体的稀释液(例如，来自CD 19免疫小鼠的血浆的稀释液)，并且在37℃下温育1-2小时。用PBS/Tween洗涤培养板，之后和与碱性磷酸酶偶联的第二试剂(例如，对于人抗体，为山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)一起在37℃下温育1小时。洗涤后，培养板用pNPP底物(1mg/ml)显色，并且在OD 405-650下分析。优选地，用表现出最高效价的小鼠进行融合。

如上所述的ELISA分析也可以用来筛选表现出与CD 19免疫原有阳性反应性的杂交瘤。将与CD 19高亲合力结合的杂交瘤进行亚克隆，并且进一步表征。从每个杂交瘤中选择保留母细胞反应性的一个克隆(通过ELISA)，制备5-10小瓶细胞库，保存在-140℃下，用于抗体纯化。

为了纯化抗-CD 19抗体，选择的杂交瘤在用于单克隆抗体纯化的两升旋转摇瓶中生长。过滤上清液并且浓缩，然后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，NJ)进行亲和层析。通过凝胶电泳和高效液相色谱检查洗脱的IgG以确保纯度。将缓冲溶液换成PBS，并且使用1.43的消光系数根据OD₂₈₀确定浓度。将单克隆抗体分成等份并且在-80℃下保存。

为了确定选择的抗-CD 19单克隆抗体是否与独特表位结合，可以使用商售试剂(Pierce，Rockford，IL)将每种抗体生物素化。可以使用如上所述的CD 19包被的ELISA板，应用未标记的单克隆抗体和生物素化单克隆抗体进行竞争研究。可以使用链霉抗生物素蛋白-碱性磷酸酶探针检测生物素化mAb的结合。

为了确定被纯化的抗体的同种型，可以用对特定同种型抗体具有特异性的试剂进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，在4℃下用1μg/ml抗人免疫球蛋白包被微量滴定板的孔过夜。用1％BSA封闭之后，平板与1μg/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照物在室温下反应1-2小时。这些孔然后与人IgG1或人IgM特异性碱性磷酸酶偶联的探针反应。如上所述使平板显色并且分析。

可以通过Western印迹法进一步检测抗-CD 19人IgG与CD 19抗原的反应性。简要地说，制备CD 19并进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，将分离的抗原转移到硝酸纤维素膜上，用10％胎牛血清封闭，并用待检测的单克隆抗体探查。人IgG的结合可以用抗人IgG碱性磷酸酶检测，并用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.Co.St.Louis，Mo.)显色。

免疫偶联物

另一方面，本发明涉及与诸如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素等治疗性部分偶联的抗-CD 19抗体或其片段。这些偶联物在此被称为“免疫偶联物”。包括一个或多个细胞毒素的免疫偶联物被称作“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒剂包括对细胞有害(例如杀伤细胞)的任何试剂。实例包括：紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙啶、吐根碱、丝裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-脱氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素和它们的类似物或同系物。治疗剂还包括，例如：抗代谢物(例如，氨甲喋呤、6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、氨烯咪胺(decarbazine))，烷化剂(例如，氮芥、苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、苯丙氨酸氮芥、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露糖醇、链唑霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺合铂(II)(DDP)顺铂)，氨茴霉素类(例如，柔红菌素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，放线菌素D(以前称为放线菌素)、博来霉素、光辉霉素和安曲霉素(AMC))，和抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。

能与本发明抗体偶联的治疗性细胞毒素的其他优选例子包括倍癌霉素、刺孢霉素、美坦生、auristatin、和它们的衍生物。刺孢霉素抗体偶联物的一个例子是可作为商品购得的(Mylotarg

；American HomeProducts)。

可以利用本领域使用的连接体技术将细胞毒素与本发明的抗体偶联。已经用于将细胞毒素与抗体偶联的连接体类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫化物和含肽的连接体。可以选择，例如，在溶酶体区室内易被低pH切割或易被蛋白酶切割的连接体，该蛋白酶例如是在肿瘤组织中优先表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D)。

关于细胞毒素的类型、用于偶联治疗剂与抗体的连接体和方法的进一步讨论，参见Saito，G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55：199-215；Trail，P.A.等(2003)Cancer.Immunol.Immunother.52：328-337；Payne，G.(2003)Cancer Cell 3：207-212；Allen，T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2：750-763；Pastan，I.和Kreitman，R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3：1089-1091；Senter，P.D.和Springer，C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53：247-264。

本发明的抗体也可以与放射性同位素偶联，产生细胞毒性放射性药物，也被称作放射性免疫偶联物。能够与诊断或治疗性使用的抗体偶联的放射性同位素的例子包括但不限于碘¹³¹、铟¹¹¹、钇⁹⁰和镥¹⁷⁷。制备放射性免疫偶联物的方法在本领域中已经建立。放射性免疫偶联物的例子可以作为商品获得，包括Zevalin

(IDEC Pharmaceuticals)和Bexxar

(Corixa Pharmaceuticals)，并且能够利用类似的方法使用本发明的抗体制备放射性免疫偶联物。

本发明的抗体偶联物可用于修饰特定的生物学反应，且药物部分不应理解为局限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有需要的生物活性的蛋白质或多肽。这样的蛋白质包括，例如：具有酶活性的毒素或其活性片段，如相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学反应调节物，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其他生长因子。

将这种治疗性部分与抗体偶联的技术是众所周知的，参见，例如，Arnon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs InCancer Therapy”，in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(ed.)，pp.243-56(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery”，in Controlled Drug Delivery(2nd Ed.)，Robinson等人(ed.)，pp.623-53(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”，inMonoclonal Antibodies’84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(ed.)，pp.475-506(1985)；“Analysis，Results，And Future ProspectiveOf The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，inMonoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等人(ed.)，pp.303-16(Academic Press 1985)，和Thorpe等人，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。

双特异性分子

另一方面，本发明涉及包含本发明的抗-CD 19抗体或其片段的双特异性分子。本发明的抗体或其抗原结合部分可以被衍生化或连接到另一个功能性分子上，如另一个肽或蛋白质(例如另一个抗体或受体的配体)上，从而生成可与至少两个不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。本发明的抗体实际上可以被衍生化或连接到一个以上的其他功能性分子上，从而生成可与两个以上不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；这样的多特异性分子也包括在本文使用的术语“双特异性分子”内。为了产生本发明的双特异性分子，本发明的抗体可与一个或多个其他结合分子如其他抗体、抗体片段、肽或结合模拟物功能性连接(如通过化学偶联、基因融合、非共价结合等)，从而得到双特异性分子。

因此，本发明包括双特异性分子，其具有至少一种对于CD 19的第一结合特异性和对于第二种目标表位的第二结合特异性。在本发明一个特定实施方案中，第二种目标表位是Fc受体，如人FcγRI(CD64)或人Fcα受体(CD89)。因此，本发明包括既能与表达FcγR或FcαR的效应细胞(如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))结合，又能与表达CD 19的靶细胞结合的双特异性分子。这些双特异性分子将表达CD 19的细胞导向于效应细胞，并且触发Fc受体介导的效应细胞活性，如表达CD 19的细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放、或超氧阴离子的产生。

在其中双特异性分子是多特异性分子的本发明的一个实施方案中，除抗-Fc结合特异性和抗-CD 19结合特异性之外，该分子还可包括第三结合特异性。在一个实施方案中，该第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如与参与细胞毒性活性的表面蛋白质结合因而增强针对靶细胞的免疫应答的分子。“抗增强因子部分”可以是与诸如抗原或受体等特定分子结合，从而导致结合决定簇对Fc受体或靶细胞抗原的作用增强的抗体、功能性抗体片段或配体。“抗增强因子部分”可与Fc受体或靶细胞抗原结合。可替代地，抗增强因子部分可以与一种实体结合，该实体不同于第一和第二结合特异性所结合的实体。例如，抗增强因子部分可与细胞毒性T细胞结合(如经由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或其他免疫细胞，该细胞导致针对靶细胞的免疫应答增强)。

在一个实施方案中，本发明的双特异性分子包含至少一个抗体或其抗体片段作为结合特异性，包括(例如)Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv、Fd、dAb或单链Fv。该抗体也可以是轻链或重链二聚体，或任何其最小片段，如Fv或单链构建体，如Ladner等人的美国专利No.4,946,778所述，该专利的内容引入本文作为参考。

在一个实施方案中，对于Fcγ受体的结合特异性由单克隆抗体提供，该单克隆抗体的结合不被人免疫球蛋白G(IgG)阻断。本文使用的术语“IgG受体”是指位于染色体1上的8个γ-链基因的任意一个。这些基因编码总共12个跨膜或可溶性受体同种型，这些同种型分组为3个Fcγ受体类别：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。在一个优选实施方案中，Fcγ受体是人高亲和力FcγRI。人FcγRI是72kDa的分子，对单体IgG表现出高亲和力(10⁸-10⁹M^-1)。

某些优选抗-Fcγ单克隆抗体的制备和表征在Fanger等人的PCT申请WO 88/00052和美国专利号4,954,617中描述，在此处将其内容整体引入作为参考。这些抗体在与受体的Fcγ结合位点不同的位点处与FcγRI、FcγRII或FcγRIII的表位结合，因而，其结合基本不被生理学水平的IgG阻断。可用于本发明中的特定抗-FcγRI抗体为mAb 22、mAb 32、mAb 44、mAb 62和mAb 197。产生mAb 32的杂交瘤可从美国典型培养物保藏中心获得，ATCC保藏号为HB9469。在另外一些实施方案中，抗-Fcγ受体抗体是单克隆抗体22的人源化形式(H22)。H22抗体的产生和表征在Graziano，R.F.等人(1995)J.Immunol 155(10)：4996-5002和Tempest等人的PCT公布WO 94/10332中描述。产生H22抗体的细胞系以HA022CL1的名称保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号为CRL11177。

在另外一些优选实施方案中，对Fc受体的结合特异性由可与人IgA受体如Fc-α受体(FcαRI(CD89))结合的抗体提供，该抗体的结合优选地不被人免疫球蛋白A(IgA)阻断。术语“IgA受体”包括位于染色体19上的一个α-基因的基因产物(FcαRI)。已知该基因编码几个55-110kDa的可变剪接跨膜同种型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性和嗜中性粒细胞上组成型表达，但不在非效应细胞群体上组成型表达。FcαRI对IgA1和IgA2两者均具有中等亲和力(约5×10⁷M^-1)，在暴露于诸如G-CSF或GM-CSF的细胞因子后该亲和力增加(Morton，H.C.等(1996)Critical Reviews in Immunology 16：423-440)。已描述了4种FcαRI-特异性单克隆抗体，它们被确定为A3、A59、A62和A77，它们在IgA配体结合域之外与FcαRI结合(Monteiro，R.C.等(1992)J.Immunol.148：1764)。

FcαRI和FcγRI是用于本发明的双特异性分子的优选触发受体，因为它们(1)主要表达于诸如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞的免疫效应细胞上；(2)高水平表达(如每个细胞表达5,000-100,000个)；(3)是细胞毒性(如ADCC、吞噬作用)的介质；(4)介导导向于它们的抗原(包括自身抗原)的增强的抗原呈递。

优选人单克隆抗体，可以在本发明的双特异性分子中使用的其他抗体包括鼠、嵌合和人源化单克隆抗体。

可通过应用本领域中公知的方法偶联组成的结合特异性，如抗-FcR和抗-CD 19结合特异性，制备本发明的双特异性分子。例如，双特异性分子的每一种结合特异性可单独生成，然后彼此偶联。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联剂或交联剂进行共价偶联。交联剂的例子包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚氨基-S-乙酰-硫代乙酸盐(SATA)、5，5’-二硫代二(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基双马来酰亚胺(oPDM)、N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶二硫代)丙酸盐(SPDP)和磺基琥珀酰亚氨基4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己基-1-羧酸盐(sulfo-SMCC)(参见，例如，Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160：1686；Liu，MA等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：8648)。其他方法包括Paulus(1985)Behring Ins.Mitt.No.78，118-132)；Brennan等(1985)Science 229：81-83和Glennie等(1987)J.Immunol.139：2367-2375所描述的方法。优选的偶联剂为SATA和sulfo-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)获得。

当结合特异性是抗体时，它们可通过两个重链的C-末端铰链区的巯基键合而偶联。在一个特别优选的实施方案中，对铰链区进行修饰以使其在偶联前含有奇数个，优选1个巯基残基。

可替代地，两种结合特异性可在同一载体中编码，并在相同的宿主细胞中表达和装配。当双特异性分子是mAb×mAb、mAb×Fab、Fab×F(ab’)₂或配体x Fab融合蛋白时，该方法是特别有用的。本发明的双特异性分子可以是包含一个单链抗体和一个结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可以包含至少两个单链分子。制备双特异性分子的方法例如在美国专利5,260,203、5,455,030、4,881,175、5,132,405、5,091,513、5,476,786、5,013,653、5,258,498和5,482,858中描述，均引入本文作为参考。

双特异性分子与其特异性靶标的结合可通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(如生长抑制)或Western印迹分析来证实。这些试验中的每一个通常通过应用对目标复合物具有特异性的标记试剂(如抗体)来检测特定目标蛋白质-抗体复合物的存在。例如，可以利用识别和特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。或者，这些复合物可利用多种其他免疫分析中的任一种来检测。例如，可对抗体进行放射性标记并且在放射免疫测定(RIA)中使用(参见，例如，Weintraub，B.Principles ofRadioimmunoassays，Seventh Training Course on Radioligand AssayTechniques，The Endocrine Society，1986年3月，引入本文作为参考)。可以通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器的手段或者通过放射自显影方法检测放射性同位素。

药物组合物

另一方面，本发明提供一种组合物，例如药物组合物，其含有与药学上可接受的载体配制在一起的一种或组合的本发明的单克隆抗体或其抗原结合部分。这样的组合物可以包含一种或组合的(例如两种或多种不同的)本发明的抗体或免疫偶联物或双特异性分子。例如，本发明的药物组合物可以含有结合靶抗原上的不同表位或具有互补活性的抗体组合(或免疫偶联物或双特异性分子)。

本发明的药物组合物也可以在联合治疗中施用，即与其他药剂联用。例如，联合治疗可包括本发明的抗-CD 19抗体联合至少一种其他的抗炎剂或免疫抑制剂。可在联合治疗中使用的治疗剂的例子在下面本发明抗体的应用一节中更详细地描述。

本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。根据施用途径，可将活性化合物即抗体、免疫偶联物或双特异性分子包裹于一种材料中，以保护该化合物免受可使该化合物失活的酸和其他天然条件的作用。

本发明的药物组合物可包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保持了亲代化合物的所需生物活性而不引起任何不期望的毒理学作用的盐(参见如Berge，S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66：1-19)。这样的盐的例子包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括那些由诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等无毒性无机酸衍生的盐，以及由诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族和芳族磺酸等无毒性有机酸衍生的盐。碱加成盐包括那些由诸如钠、钾、镁、钙等碱土金属衍生的盐，以及由诸如N，N’-二苄基乙二胺、N-甲基葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等无毒性有机胺衍生的盐。

本发明的药物组合物也可含有药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的例子包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。

可用于本发明药物组合物中的适当的水性或非水性载体的例子包括水，乙醇，多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)，及其适当的混合物，植物油如橄榄油，和注射用有机酯如油酸乙酯。例如通过应用包被材料如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的颗粒大小，以及通过应用表面活性剂，能够维持适当的流动性。

这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过上述的灭菌程序或通过包含诸如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚山梨酸等各种抗细菌剂和抗真菌剂确保防止存在微生物。也可能需要在组合物中包含等渗剂，例如，糖、氯化钠等。另外，通过包含延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。

药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射液或分散液的粉末剂。这些用于药学活性物质的介质和试剂的使用是本领域公知的。除了任何与活性化合物不相容的常规介质或试剂范围外，包括其在本发明的药物组合物中的应用。还可以向组合物中掺入补充的活性化合物。

治疗性组合物一般必须是无菌的并且在制备和贮存条件下稳定的。可以将组合物配制成溶液、微乳状液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物的溶剂或分散剂。例如，通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散液的情况下通过保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。在很多情况下，组合物中优选包含等渗剂，例如，糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇或氧化钠。通过在组合物中加入延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可实现注射型药物延长的吸收。

通过将活性化合物以需要的量混入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着无菌微过滤，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和上面所列其他所需成分的无菌载体中制备分散剂。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末剂，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，由其预先无菌过滤的溶液得到活性成分加任何额外所需成分的粉末。

可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量根据所治疗的受试者和特定给药方式而不同。可以与载体材料组合制备单一剂量形式的活性成分的量一般是产生治疗效果的组合物的量。通常，以100％计，这个量的范围是大约0.01％至大约99％的活性成分，优选大约0.1％至大约70％，最优选大约1％至大约30％的活性成分，与药学上可接受的载体相组合。

调节剂量方案，以提供最佳的期望的反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一大丸剂，可以随时间施用几次分开的剂量，或者根据治疗状况的紧急情况所需，可以按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易给药并且剂量均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为单位剂量用于所治疗的受试者的物理不连续单位；每个单位含有预定量的活性化合物，经计算该预定量的活性化合物与需要的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定治疗效果，和(b)本领域中固有的对于配制这种用于治疗个体敏感性的活性化合物的限制。

对于抗体的给药而言，剂量范围为约0.0001至100mg/kg，更通常为0.01至5mg/kg受者体重。例如，剂量可以是0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重，或在1-10mg/kg范围内。一个治疗方案的例子需要每周给药一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3月一次、或每3-6月一次。本发明的抗-CD 19抗体的优选剂量方案包括经静脉内给予1mg/kg体重或3mg/kg体重，该抗体使用如下剂量方案之一给药：(i)每4周一次，共6次，然后每3个月一次；(ii)每3周一次；(iii)3mg/kg体重一次，然后每3周1mg/kg体重。

在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体，在该情况中，每种抗体的给药剂量落在所述范围内。抗体通常在有必要时多次给药。单次给药之间的间隔可以是，例如，每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以是不定期的，例如通过测定患者中抗靶抗原的抗体的血液水平来确定。在一些方法中，调节剂量以达到约1-1000μg/ml的血浆抗体浓度，在一些方法中为约25-300μg/ml。

可替代地，抗体也可以作为持续释放制剂来给药，在此情况中需要频率较低的给药。剂量和频率根据抗体在患者中的半衰期而不同。通常，人抗体表现出最长的半衰期，之后是人源化抗体、嵌合抗体和非人类抗体。给药剂量和频率根据处理是预防性的还是治疗性的而不同。在预防性应用中，在长时间内以较不频繁的间隔给予相对较低的剂量。有些患者在余生中持续接受处理。在治疗性应用中，有时需要以较短的间隔给予较高的剂量，直到疾病的进展减轻或停止，优选直到患者表现为疾病症状部分或完全改善。之后，可以以预防性方案给患者给药。

本发明药物组合物中活性成分的实际剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。

本发明的抗-CD 19抗体的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于CD 19+肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地将细胞生长或肿瘤生长抑制至少约20％，更优选至少约40％，更优选至少约60％，更优选至少约80％。化合物抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查化合物抑制细胞生长的能力来评价该组合物的这种性能，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。治疗有效量的治疗性化合物能够减小肿瘤大小，或者以其他方式缓解受试者的症状。本领域技术人员可以根据如下因素确定这种量，如受试者的大小、受试者症状的严重性和选择的特定组合物或给药途径。

本发明的组合物可以利用本领域公知的一种或多种方法通过一种或多种给药途径给药。本领域技术人员应当理解，给药途径和/或方式根据期望的结果而不同。本发明抗体的优选给药途径包括静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内、皮下、脊柱或其他肠胃外给药途径，例如注射或输注。本文使用的短语“肠胃外给药”是指除肠和局部给药以外的给药模式，通常是注射，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

可替代地，本发明的抗体也可以通过非肠胃外途径给药，如局部、表皮或粘膜途径给药，例如，鼻内、经口、阴道、直肠、舌下或局部。

活性化合物可以与保护化合物不被快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴剂和微胶囊递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。制备这样的制剂的很多方法受专利保护或者通常为本领域技术人员所公知。参见，例如，Sustainedand controlled Release Drug Delivery Systems，J.R.Robinson，ed.Marcel Dekker，Inc.New York，1978。

治疗性组合物可应用本领域公知的医疗装置给药。例如，在一个优选实施方案中，本发明的治疗组合物可用无针皮下注射装置给药，如在美国专利No.5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。可用于本发明的公知的植入物和模块的例子包括：美国专利No.4,487,603，该专利公开了用于以受控速率分散药物的可植入微量输注泵；美国专利No.4,486,194，该专利公开了用于通过皮肤给药的治疗装置；美国专利No.4,447,233，该专利公开了用于以精确的输注速率递送药物的医用输注泵；美国专利No.4,447,224，该专利公开了用于连续递送药物的变流可植入输注装置；美国专利No.4,439,196，该专利公开了具有多腔区室的渗透药物递送系统：和美国专利No.4,475,196，该专利公开了一种渗透药物递送系统。这些专利引入本文作为参考。本领域技术人员公知许多其他这样的植入物、递送系统和模块。

在某些实施方案中，本发明的人单克隆抗体可配制为确保在体内的正确分布。例如，血-脑屏障(BBB)阻止了许多高度亲水性的化合物。为了确保本发明的治疗性化合物能够跨过BBB(如果需要时)，可将它们配制在如脂质体中。至于制备脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体包含可被选择性地转运入特定细胞或器官内的一个或多个部分，从而增强定向药物递送(参见，例如，V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29：685)。定向部分的例子包括叶酸或生物素(参见，例如，Low等人的美国专利5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153：1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357：140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39：180)；表面活性剂蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.J.Physiol.1233：134)；p120(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269：9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346：123；J.J.Killion；I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4：273。

应用和方法

本发明的抗体(特别是人抗体)、抗体组合物和方法，具有与诊断和治疗CD 19介导的疾病有关的许多体外和体内诊断和治疗应用。例如，这些分子可以施用于在体外或离体培养的细胞，或者(例如)在体内施用于人类受试者，从而治疗、预防或诊断多种疾病。本文使用的术语“受试者”包括人和非人动物。非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、牛、马、鸡、两栖类动物和爬行类动物。优选的受试者包括患有CD 19活性介导的疾病的人类患者。这些方法特别适合治疗患有与异常CD 19表达相关的疾病的人类患者。当抗CD 19抗体与另一种药物一起给药时，这两种药物可以相继或同时给药。

假如本发明的抗体与CD 19特异性结合，则本发明的抗体可以用来特异性检测细胞表面上的CD 19表达，而且能够用来通过免疫亲和纯化方法纯化CD 19。

此外，假定CD 19在各种肿瘤细胞上表达，则本发明的人抗体、抗体组合物和方法能够用来治疗患有致肿瘤疾病的受试者，例如以存在表达CD 19的肿瘤细胞为特征的疾病，包括，例如，非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、多发性骨髓瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小卵裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴结瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞/中心细胞性(cb/cc)滤泡性淋巴瘤、B系弥漫性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)-样T细胞淋巴瘤、HIV相关体腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症和其他B细胞淋巴瘤。

另外，CD 19的过量表达可以导致B细胞耐受的丧失和自身免疫性疾病的产生(Tedder等人.(2005)Curr Dir Autoimmun 8：55)。这种自身免疫作用已经通过类风湿性关节炎患者的发炎关节中CD 19+B细胞的积累而见到(He等人.(2001)J Rheumatol 28：2168)。这样，本发明的人抗体、抗体组合物和方法可以用来治疗自身免疫病(例如以存在表达CD 19的B细胞为特征的疾病，包括例如类风湿性关节炎)的患者。

在一个实施方案中，本发明的抗体(例如人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)可以用于检测CD 19的水平或在其膜表面上含有CD 19的细胞的水平，然后可将该水平与特定疾病症状相关联。此外，也可以利用这些抗体抑制或阻断CD 19的功能，然后可以将其与特定疾病症状的预防或缓解相关联，因此提示CD 19是该疾病的介质。这可以如下实现，例如，在抗体与CD 19之间能够形成复合物的条件下，使样品和对照样品接触抗-CD 19抗体。检测并比较样品和对照中抗体与CD 19之间形成的任何复合物。

在另一实施方案中，可以在开始时检测本发明的抗体(例如人抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)与体外治疗或诊断应用相关的结合活性。例如，能够用以下实施例中所述的流式细胞分析来检测本发明的组合物。

本发明的抗体(例如人抗体、多特异性和双特异性分子、免疫偶联物和组合物)在CD 19相关疾病的治疗和诊断中具有额外的应用。例如，人单克隆抗体、多特异性或双特异性分子和免疫偶联物可以用来在体内或体外引发一种或多种下列生物活性：抑制表达CD 19的细胞的生长和/或将其杀死；介导表达CD 19的细胞在人效应细胞存在下的吞噬作用，或者阻断CD 19配体与CD 19的结合。

在一个特定实施方案中，本发明的抗体(例如人抗体、多特异性和双特异性分子和组合物)在体内用于治疗、预防或诊断多种CD 19相关疾病。CD 19相关疾病的例子尤其包括自身免疫病、类风湿性关节炎、癌症、非何杰金氏淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、多发性骨髓瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小卵裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴结瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞/中心细胞性(cb/cc)滤泡性淋巴瘤、B系弥漫性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)-样T细胞淋巴瘤、HIV相关体腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症和其他B细胞淋巴瘤。

在体内和体外施用本发明的抗体组合物(例如人单克隆抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)的适当途径在本领域中公知，可以由本领域技术人员选择。例如，抗体组合物可以通过注射(例如静脉内或皮下)给药。使用的分子的适宜剂量将取决于受试者的年龄和体重以及抗体组合物的浓度和/或制剂。

如前所述，本发明的人抗-CD 19抗体可以与诸如细胞毒剂、放射性毒剂或免疫抑制剂等一种或多种其他治疗剂共同给药。抗体可以与该治疗剂连接(作为免疫复合物)，或者可以与该治疗剂分开给药。对于后者(分开给药)，抗体可以在治疗剂之前、之后或同时给药，或者可以与其他已知治疗如抗癌治疗例如放射治疗共同应用。这些治疗剂包括，抗肿瘤剂，如多柔比星(阿霉素)、顺铂、硫酸博来霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、羟基脲，它们本身仅在对患者具有毒性或亚毒性的水平时有效。顺铂以100mg/剂的剂量静脉内给药，每4周1次，阿霉素以60-75mg/ml的剂量静脉内给药，每21天1次。本发明的人抗-CD 19抗体或其抗原结合片段与化疗剂的共同给药提供了两种抗癌剂，它们通过对人肿瘤细胞产生细胞毒性作用的不同的机制起作用。这种共同给药能够解决由于发展耐药性或肿瘤细胞抗原性改变(这将使它们对抗体没有反应性)引起的问题。

靶特异性效应细胞，例如与本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)有关的效应细胞，也可以用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人白细胞，如巨噬细胞、嗜中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性细胞、自然杀伤细胞和其他带有IgG或IgA受体的细胞。需要时，效应细胞可以从所治疗的受试者中获得。靶特异性效应细胞可以作为在生理学可接受的溶液中的细胞悬浮液给药。施用的细胞数可以是10⁸-10⁹个的数量级，但是根据治疗目的而不同。通常，该量足以获得在靶细胞处如表达CD 19的肿瘤细胞处的集中，以及通过例如吞噬作用实现对细胞的杀伤。给药途径也可以不同。

应用靶特异性效应细胞的治疗可以与其他清除靶细胞的技术一起进行。例如，使用本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)和/或具有这些组合物的效应细胞的抗肿瘤治疗可以与化学治疗一起使用。另外，可以应用联合免疫治疗将两种不同的细胞毒性效应群体导向至肿瘤细胞排斥。例如，与抗-Fc-γRI或抗-CD3连接的抗-CD 19抗体可以与IgG-或IgA-受体特异性结合剂一起使用。

本发明的双特异性和多特异性分子也可以用来调节效应细胞上的FcγR或FcγR水平，例如通过对细胞表面上的受体加帽以及将其清除。抗-Fc受体的混合物也可以用于该目的。

具有补体结合位点(如来自IgG1、-2或-3或IgM的补体结合部分)的本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)，也可以在补体的存在下使用。在一个实施方案中，用本发明的结合剂和适宜的效应细胞离体处理含有靶细胞的细胞群体能够通过加入补体或含有补体的血清来实现。补体蛋白的结合能够改善用本发明的结合剂包被的靶细胞的吞噬作用。在另一实施方案中，用本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)包被的靶细胞也能够被补体裂解。在另一实施方案中，本发明的组合物不激活补体。

本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子和免疫偶联物)也可以与补体一起施用。在某些实施方案中，本发明提供了含有人抗体、多特异性或双特异性分子和血清或补体的组合物。当补体与人抗体、多特异性或双特异性分子紧密接近时，这些组合物可能是有利的。另外，本发明的人抗体、多特异性或双特异性分子和补体或血清也可以分开施用。

本发明的范围内还包括药盒，该药盒包括本发明的抗体组合物(例如人抗体、多特异性或双特异性分子，或免疫偶联物)和使用说明。该药盒可以进一步包括一种或多种另外的试剂，如免疫抑制剂、细胞毒剂或放射性毒剂，或一种或多种另外的本发明的人抗体(例如，具有补充活性的人抗体，它所结合的CD 19抗原上的表位与第一人抗体不同)。

因此，可以给用本发明的抗体组合物治疗的患者(在本发明的人抗体给药之前、同时或之后)另外施用另一种治疗剂，如细胞毒剂或放射性毒剂，该治疗剂可以增强或增加人抗体的治疗效果。

在另外一些实施方案中，可以另外用调节(例如增强或抑制)Fcγ或Fcγ受体的表达或活性的药物治疗受试者，例如用细胞因子治疗受试者。在用多特异性分子治疗过程中施用的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(TNF)。

本发明的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)也可以用来靶向表达FcγR或CD 19的细胞，例如标记这些细胞。对于这种应用，可以将结合剂与能够被检测到的分子连接。因此，本发明提供离体或在体外定位表达Fc受体如FcγR或CD 19的细胞的方法。可检测标记物可以是，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。

在一个特定实施方案中，本发明提供检测样品中CD 19抗原的存在，或测定CD 19抗原量的方法，包括在抗体或其部分与CD 19之间能够形成复合物的条件下使样品和对照样品接触可与CD 19特异性结合的人单克隆抗体或其抗原结合部分。然后检测复合物的形成，其中样品与对照样品之间复合物形成的差异指示样品中CD 19抗原的存在。

在另外一些实施方案中，本发明提供通过对受试者施用上述人抗体而治疗受试者的CD 19介导的疾病的方法，该疾病例如是自身免疫病、类风湿性关节炎、癌症、非何杰金氏淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、伯基特淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、皮肤T细胞淋巴瘤、结节性小卵裂细胞淋巴瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、伦纳特淋巴瘤、免疫母细胞性淋巴结瘤、T细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞/中心细胞性(cb/cc)滤泡性淋巴瘤、B系弥漫性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)-样T细胞淋巴瘤、HIV相关体腔淋巴瘤、胚胎性癌、未分化鼻咽癌(例如施明克瘤)、卡斯尔曼病、卡波西肉瘤、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症和其他B细胞淋巴瘤。这些抗体及其衍生物用来抑制CD 19诱导的与某些疾病有关的活性，如增殖和分化。通过将抗体与CD 19接触(例如通过对受试者施用抗体)，CD 19诱导这些活性的能力得到抑制，因此相关疾病得到治疗。抗体组合物可以单独给药或者与诸如细胞毒剂或放射性毒剂的另一种治疗剂一起给药，该另一种治疗剂与抗体组合物联合或协同作用，以治疗或预防CD 19介导的疾病。

在另一实施方案中，通过将化合物与抗体连接，可以利用本发明的免疫偶联物将该化合物(例如治疗剂、标记物、细胞毒素、放射毒素、免疫抑制剂等)靶向至具有CD 19细胞表面受体的细胞。例如，抗CD 19抗体可以与美国专利No.6,81,354和6,548,530、美国专利公开Nos.20030050331、20030064984、20030073852和20040087497所述或WO 03/022806公开的任一种毒素化合物偶联。因此，本发明也提供用于离体或在体内定位表达CD 19的细胞(例如应用可检测标记物，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)的方法。可替代地，免疫偶联物通过将细胞毒素或放射毒素靶向至CD 19，也可以杀伤具有CD 19细胞表面受体的细胞。

本发明进一步通过下面的实施例进行阐述，不应将这些实施例理解为进一步的限制。全部附图和在本申请中引用的全部参考文献、专利和公开专利申请的内容均引入本文作为参考。

实施例

实施例1：抗CD 19人单克隆抗体的制备

抗原

用B细胞肿瘤细胞系Raji(ATCC保藏号CCL-86)和Daudi(ATCC保藏号CCL-213)作为免疫用抗原。

转基因转染色体KM-小鼠

用表达人抗体基因的转基因转染色体KM系小鼠制备抗CD 19的完全人单克隆抗体。在这种小鼠系中，已经如Chen等(1993)EMBO J.12：811-820所述将内源小鼠κ轻链基因纯合地破坏，并且已经如PCT公布WO 01/09187的实施例1对于HuMab小鼠所述将内源小鼠重链基因纯合地破坏。该小鼠携带人κ轻链转基因KCo5，如Fishwild等(1996)Nature Biotechnology 14：845-851所述。该小鼠也携带人重链转染色体SC20，如PCT公布WO 02/43478所述。

KM-小鼠

的免疫：

为了产生抗CD 19的完全人单克隆抗体，用Raji或Daudi B细胞肿瘤细胞系免疫KM-小鼠

群体。一般性免疫方案在Lonberg，N.等(1994)Nature 368(6474)：856-859；Fishwild，D.等(1996)NatureBiotechnology 14：845-851和PCT公开WO 98/24884中描述。在第一次输注抗原时小鼠为6-16周龄。利用细胞制剂腹膜内(IP)免疫小鼠(KM-小鼠)。

转基因小鼠用在完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原腹膜内免疫两次，然后用在不完全弗氏佐剂或Ribi佐剂中的抗原IP免疫3-21天(最多可达总共11次免疫)。通过眼眶后采血监测免疫应答。通过ELISA对血浆进行筛选(如下文所述)，用具有足够的抗-CD 19人免疫球蛋白效价的小鼠进行融合。用抗原经静脉内对小鼠进行加强免疫，3天后处死并取出脾脏。

产生抗-CD 19抗体的KM-小鼠

的选择

为了选择产生可与CD 19结合的抗体的KM-小鼠

，如最初Fishwild，D.等人(1996)(同上)所述，通过改良的ELISA检测来自被免疫小鼠的血清。简要地说，用在PBS中浓度为1-2μg/ml的纯化重组CD 19融合蛋白以50μl/孔的量包被微量滴定板，4℃下温育过夜，然后用PBS中的5％BSA以200μl/孔封闭。将来自CD 19免疫的小鼠的血浆稀释液加入各孔中，在室温下温育1-2小时。用PBS/Tween洗涤培养板，然后与碱性磷酸酶偶联的山羊抗人κ轻链多克隆抗体在室温下温育1小时。洗涤后，培养板用pNPP底物显色，并用分光光度计在OD 415-650处分析。用显示最高抗-CD 19抗体效价的小鼠进行融合。如下文所述进行融合，通过ELISA检测杂交瘤上清液的抗-CD 19活性。

产生抗CD 19人单克隆抗体的杂交瘤的产生

根据标准程序使用PEG或者使用Cyto Pulse大腔室细胞融合电穿孔仪(Cyto Pulse Sciences，Inc.Glen Burnie，MD)使用基于电场的电融合法将从KM-小鼠

中分离的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后根据抗原特异性抗体的产生筛选获得的杂交瘤。使用50％PEG(Sigma)将来自被免疫小鼠的脾淋巴细胞单细胞悬液与1/4数量的SP2/0非分泌型小鼠骨髓瘤细胞(ATCC CRL 1581)融合。将细胞以约1×10⁵/孔的密度接种于平底微量滴定板上，然后在选择性培养基中温育约两周，该培养基含有10％胎牛血清、10％P388D1(ATCC，CRL TIB-63)条件培养基、在DMEM(Mediatech，CRL 10013，含有高浓度葡萄糖、L-谷氨酰胺、丙酮酸钠)中的3-5％origen(IGEN)，加5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma，CRL P-7185)。1-2周后，将细胞在用HT替代了其中的HAT的培养基中培养。然后通过ELISA(如上所述)根据人抗CD19单克隆IgG抗体筛选各个孔。一旦发生广泛的杂交瘤生长，则通常在10-14天后监测培养基。将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，并且如果对于人IgG仍然是阳性，则通过有限稀释将抗CD 19单克隆抗体亚克隆至少两次。然后在体外培养稳定的亚克隆，以在组织培养基中产生少量的抗体用于进一步表征。

选择杂交瘤克隆21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8进一步分析。

实施例2：人单克隆抗体21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8的结构表征

利用标准PCR技术从21D4杂交瘤中获得编码21D4和21D4a的单克隆抗体的重链和轻链可变区的cDNA序列，并利用标准DNA测序技术进行测序。注意到21D4杂交瘤产生重链与两条轻链(SEQID NOs：8和9)之一配对的抗体。两种抗体(即分别具有SEQ ID NOs：1和8的V_H和V_L序列的21D4，和分别具有SEQ ID NOs：1和9的V_H和V_L序列的21D4a)与CD 19结合。编码47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8单克隆抗体的重链和轻链可变区的cDNA序列分别利用标准PCR技术从21D4、21D4a、47G4、27F3、3C10、5G7、13F1和46E8杂交瘤获得，并且利用标准DNA测序技术测序。

21D4的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图1A和SEQ ID NO：59和1中。

21D4的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图1B和SEQ ID NO：66和8中。

21D4重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，21D4重链应用了来自人种系V_H 5-51的V_H区段、来自人种系3-10的D区段和来自人种系JH4b的J_H区段。21D4 V_H序列与种系V_H 5-51序列的比对显示在图8中。利用Kabat CDR区测定系统对21D4 V_H序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图1A和8以及SEQ ID NO：16、23和30所示。

21D4轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，21D4轻链应用了来自人种系V_K L18的V_L区段和来自人种系JK 2的J_K区段。21D4 V_L序列与种系V_K L18序列的比对显示于图15中。利用Kabat CDR区测定系统对21D4 V_L序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图1B和15以及SEQ ID NO：37、44和51所示。

21D4a的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图1A和SEQ ID NO：59和1中。

21D4a的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图1C和SEQ ID NO：67和9中。

21D4a重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，21D4a重链应用了来自人种系V_H 5-51的V_H区段、来自人种系3-10的D区段和来自人种系JH 4b的J_H区段。21D4a V_H序列与种系V_H 5-51序列的比对显示于图8中。利用Kabat CDR区测定系统对21D4a V_H序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图1A和8以及SEQ ID NO：16、23和30所示。

21D4a轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，21D4a轻链应用了来自人种系V_K L18的V_L区段和来自人种系JK 3的J_K区段。21D4a V_L序列与种系V_K L118序列的比对显示于图16中。利用Kabat CDR区测定系统对21D4a V_L序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图1C和16以及SEQ ID NO：37、44和52所示。

47G4的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图2A和SEQ ID NO：60和2中。

47G4的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图2B和SEQ ID NO：68和10中。

47G4重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，47G4重链应用了来自人种系V_H 1-69的V_H区段、来自人种系1-69的D区段和来自人种系JH 5b的J_H区段。47G4 V_H序列与种系V_H 1-69序列的比对显示于图9中。利用Kabat CDR区测定系统对47G4 V_H序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图2A和9以及SEQ ID NO：17、24和31所示。

47G4轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，47G4轻链应用了来自人种系V_K A27的VL区段和来自人种系JK 3的JK区段。47G4 V_L序列与种系V_K A27序列的比对显示于图17中。利用Kabat CDR区测定系统对47G4 V_L序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图2B和17以及SEQ ID NO：38、45和53所示。

27F3的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图3A和SEQ ID NO：61和3中。

27F3的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图3B和SEQ ID NO：69和11中。

27F3重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，27F3重链应用了来自人种系V_H 5-51的V_H区段、来自人种系6-19的D区段和来自人种系JH 6b的J_H区段。27F3 V_H序列与种系V_H 5-51序列的比对显示于图10中。利用Kabat CDR区测定系统对27F3 V_H序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图3A和10以及SEQ ID NO：18、25和32所示。

27F3轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，27F3轻链应用了来自人种系V_K L18的V_L区段和来自人种系JK 2的J_K区段。27F3 V_L序列与种系V_K L18序列的比对显示于图18中。利用Kabat CDR区测定系统对27F3 V_L序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图3B和18以及SEQ ID NO：39、46和54所示。

3C10的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图4A和SEQ ID NO：62和4中。

3C10的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图4B和SEQ ID NO：70和12中。

3C10重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，3C10重链应用了来自人种系V_H 1-69的V_H区段、来自人种系1-26的D区段和来自人种系JH 6b的J_H区段。3C10 V_H序列与种系V_H 1-69序列的比对显示于图11中。利用Kabat CDR区测定系统对3C10 V_H序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图4A和11以及SEQ ID NO：19、26和33所示。

3C10轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，3C10轻链应用了来自人种系V_K L15的V_L区段和来自人种系JK 2的JK区段。3C10 V_L序列与种系V_K L15序列的比对显示于图19中。利用Kabat CDR区测定系统对3C10 V_L序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图4B和19以及SEQ ID NO：40、47和55所示。

5G7的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图5A和SEQ ID NO：63和5中。

5G7的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图5B和SEQ ID NO：71和13中。

5G7重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，5G7重链应用了来自人种系V_H 5-51的V_H区段、来自人种系3-10的D区段和来自人种系JH 6b的J_H区段。5G7 V_H序列与种系V_H 5-51序列的比对显示于图12中。利用Kabat CDR区测定系统对5G7 V_H序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图5A和12以及SEQ ID NO：20、27和34所示。

5G7轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，5G7轻链应用了来自人种系V_K L18的V_L区段和来自人种系JK1的J_K区段。5G7 V_L序列与种系V_K L18序列的比对显示于图20中。利用Kabat CDR区测定系统对5G7 V_L序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图5B和20以及SEQ ID NO：41、48和56所示。

13F1的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图6A和SEQ ID NO：64和6中。

13F1的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图6B和SEQ ID NO：72和14中。

13F1重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，13F1重链应用了来自人种系V_H 5-51的V_H区段、来自人种系6-19的D区段和来自人种系JH 6b的J_H区段。13F1 V_H序列与种系V_H 5-51序列的比对显示于图13中。利用Kabat CDR区测定系统对13F1 V_H序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图6A和13以及SEQ ID NO：21、28和35所示。

13F1轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，13F1轻链应用了来自人种系V_K L18的V_L区段和来自人种系JK 2的J_K区段。13F1 V_L序列与种系V_K L18序列的比对显示于图21中。利用Kabat CDR区测定系统对13F1 V_L序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图6B和21以及SEQ ID NO：42、49和57所示。

46E8的重链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图7A和SEQ ID NO：65和7中。

46E8的轻链可变区的核苷酸和氨基酸序列分别显示于图7B和SEQ ID NO：73和15中。

46E8重链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白重链序列的比较证明，46E8重链应用了来自人种系V_H 5-51的V_H区段、来自人种系6-19的D区段和来自人种系JH 6b的J_H区段。46E8 V_H序列与种系V_H 5-51序列的比对显示于图14中。利用Kabat CDR区测定系统对46E8 V_H序列的进一步分析勾画出了重链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图7A和14以及SEQ ID NO：22、29和36所示。

46E8轻链免疫球蛋白序列与已知人种系免疫球蛋白轻链序列的比较证明，46E8轻链应用了来自人种系V_K L18的V_L区段和来自人种系JK 2的J_K区段。46E8V_L序列与种系V_K L18序列的比对显示于图22中。利用Kabat CDR区测定系统对46E8 V_L序列的进一步分析勾画出了轻链CDR1、CDR2和CDR3区，分别如图7B和22以及SEQ ID NO：43、50和58所示。

实施例3：抗-CD 19人单克隆抗体的结合特异性和结合动力学的表征

在该实施例中，通过ELISA分析检测了抗-CD 19抗体21D4和47G4的结合亲和力。

通过ELISA测定的结合特异性

微量滴定板用50μl在PBS中的1.0μg/ml纯化的全长CD19-Fc融合蛋白包被，然后用150μl在PBS中的1％牛血清白蛋白封闭。使培养板温育30分钟至1小时，洗涤三次。向各个孔中加入HuMab抗CD 19抗体47G4的稀释液，并且在37℃下温育1小时。用已知的鼠抗CD 19抗体作为阳性对照。用PBS/Tween洗涤培养板，之后跟与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗人IgGκ特异性第二试剂一起在37℃下温育1小时。洗涤后，培养板用ABTS底物(1.46mMol/L)显色，并且在OD 490nm下分析。结果显示在图23中。CD 19 HuMab 47G4与人CD 19肽特异性结合。

抗CD 19抗体的表位作图

利用流式细胞术确定抗CD 19 HuMab的表位分组。抗CD 19人单克隆抗体21D4、21D4a、3C10、5G7、5G7-N19K、5G7-N19Q和13F1的表位结合如下评价：温育Raji B肿瘤细胞与0.3μg/ml生物化的21D4或21D4a抗CD 19人单克隆抗体，洗涤，然后添加冷抗CD 19人单克隆抗体。同种型对照抗体用作阴性对照。结合用FITC标记的抗人IgG Ab检测。流式细胞分析用FACScan流式细胞法(Becton Dickinson，San Jose，CA)进行。结果显示在图24中。经分析数据，抗CD 19抗体21D4、21D4a、3C10、5G7和13F1的竞争相同的表位区。

实施例4：CD 19抗体与B细胞来源的肿瘤细胞系的结合

通过流式细胞分析评价CD 19 HuMab与B细胞肿瘤系Raji和Daudi或与CHO-CD 19转染的细胞系的结合。用含有编码CD 19跨膜形式的全长cDNA的表达质粒转染CHO细胞。Raji、Daudi和CD 19-CHO细胞系与下列CD 19 HuMab之一温育：21D4、21D4a、47G4、5G7、5G7-N19K、5G7-N19Q、3C10或13F1。用已知的鼠抗CD 19抗体作为阳性对照。洗涤细胞，通过藻红蛋白标记的抗人或抗小鼠第二抗体检测，并且通过流式细胞术分析。与CHO-CD 19细胞系、Daudi B细胞系、Raji B细胞系和对Raji B细胞系的扩大结合组的结合结果分别显示在图25A、25B、25C和25D中。人抗CD 19单克隆抗体21D4和47G4与CHO-CD 19细胞系结合。人抗CD 19单克隆抗体21D4、21D4a、47G4、5G7、5G7-N19K、5G7-N19Q、3C10和13F1与Raji B细胞系结合。抗CD 19 HuMab抗体21D4、21D4a、3C10、5G7、5G7-N19K、5G7-N19Q和13F1的计算的EC₅₀值分别为0.1413、0.1293、0.2399、0.1878、0.2240、0.2167和0.2659。也显示47G4结合Daudi B肿瘤细胞系。所有结果都显示为通过染色的几何平均荧光强度(GMFI)所测量的。这些数据显示CD 19蛋白在B细胞来源的肿瘤细胞系表面表达，并且抗CD 19 HuMab抗体21D4、21D4a、47G4、5G7、5G7-N19K、5G7-N19Q、3C10和13F1与细胞表面上表达的CD 19结合。

实施例5：抗-CD 19人抗体21D4和47G4与Raji B肿瘤细胞的Scatchard结合分析

Raji细胞从ATCC获得(保藏号CCL-86)，并且在含有10％胎牛血清(FBS)的RPMI中生长。细胞用含有10％FBS的RPMI在4℃下洗涤2次，用含有10％胎牛血清的RPMI培养基(结合缓冲液，含有24mM Tris pH 7.2，137mM NaCl，2.7mN KC1，2mM葡萄糖，1mMCaCl₂，1mM MgCl₂，0.1％BSA)将细胞调节为4×10⁷细胞/ml。Millipore板(MAFB NOB)用溶于水中的1％脱脂奶粉包被，4℃贮存过夜。用结合缓冲液洗板，向Millipore 96孔玻璃纤维滤板的对照孔(非特异性结合NSB)中加入25μl未标记的抗体(1000倍过量)。向最大结合对照孔中只加入25μl缓冲液(总结合)。加入在结合缓冲液中的25μl不同浓度的¹²⁵I-抗-CD 19抗体21D4或47G4和25μl Raji细胞(4×10⁷细胞/ml)。培养板在4℃摇床上以200RPM温育2小时。在温育结束时用0.2ml冷结合缓冲液(24mM Tris pH 7.2，500mMNaCl，2.7mN KC1，2mM葡萄糖，1mM CaCl₂，1mM MgCl₂，0.1％BSA)洗Millipore板3次。取出滤板，在γ计数仪中计数。使用Prism软件(San Diego，CA)用单位点结合参数进行平衡结合的评价。利用上述Scatchard结合试验，该抗体对Raji细胞的K_D分别为，21D4约为2.14nM，47G4约为12.02nM。

实施例6：抗CD 19单克隆抗体的内化

利用Hum-Zap内化试验检测抗CD 19 HuMAb内化到表达CD 19的Raji B肿瘤细胞或CD 19转染的人CHO细胞内的能力。Hum-Zap检测第一人抗体通过第二抗体的结合的内化，该第二抗体对偶联到毒素皂草素上的人IgG具有亲和力。

CHO-CD 19或Raji B肿瘤细胞系以1.0×10⁴细胞/孔接种到100μl孔中过夜或者次日两小时。抗CD 19抗体21D4或47G4以30nM的起始浓度添加到孔中，并且以1∶3的连续稀释倍数向下滴定。用非CD 19特异性的人同种型对照抗体作为阴性对照。Hum-Zap(Advanced Targeting Systems，IT-22-25)以11nM的浓度加入，并且将板温育48小时。然后将板用1.0μCi ³H-胸苷脉冲18-24小时，收获，并且用Top Count闪烁计数仪(Packard Instruments)读数。CHO-CD 19和B肿瘤细胞的内化结果分别显示在图26A和26B中。只有HuMAb47G4在CHO-CD 19细胞上检测。抗CD 19抗体47G4在CHO-CD 19细胞上显示抗体浓度依赖性的³H-胸苷掺入减少。21D4和47G4HuMAb在Raji B肿瘤细胞上都显示抗体浓度依赖性的³H-胸苷掺入减少。该数据证实抗CD 19抗体21D4和47G4内化到表达CD 19的CHO-CD 19转染细胞和B肿瘤细胞内。

实施例7：毒素偶联的抗CD 19抗体的细胞杀伤的评价

在该实施例中，通过胸苷掺入试验检测了与毒素偶联的抗CD 19单克隆抗体杀伤CD 19+细胞系的能力。

抗CD 19单克隆抗体通过连接体如肽基、腙或二硫键连接体与毒素偶联。CD 19+表达Raji细胞系以2.5×10⁴细胞/孔接种3小时。向孔中添加起始浓度为30nM的抗CD 19抗体-毒素偶联物，并且以1∶3的连续稀释倍数向下滴定。用非CD 19特异性的同种型对照抗体作为阴性对照。10倍过量的冷抗体21D4a或同种型对照抗体用于竞争结合。使板温育69小时。然后将板用1.0μCi ³H-胸苷脉冲24小时，收获，并且用Top Count闪烁计数仪(Packard Instruments，Meriden，CT)读数。结果与EC50值一起显示在图27中。该数据证实抗CD 19抗体21D4杀死Raji B细胞肿瘤细胞。

实施例8：应用抗CD 19抗体对体内B细胞肿瘤的治疗

在该实施例中，植入癌性B细胞肿瘤的SCID小鼠用裸抗CD 19抗体或毒素偶联的抗CD 19抗体在体内处理，以检查这些抗体对肿瘤生长的体内效果。

毒素偶联的抗CD 19抗体如上所述制备。缺乏功能性B和T淋巴细胞的重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠用于研究B细胞恶性肿瘤。静脉内注射来自Ramos B肿瘤细胞系的细胞。小鼠用19.6mg/kg毒素偶联的抗CD 19抗体或30mg/kg裸抗CD 19抗体处理。用同种型对照抗体或配制缓冲液作为阴性对照。动物通过腹膜内注射大约200μl含有抗体或载体的PBS而给药。抗体-毒素偶联物作为单一剂量在第7天注射，而裸抗体作为单一剂量预防模型在第1天注射，或者作为治疗模型在第7、14、21天注射。每日监测小鼠的后腿麻痹，共约6周。使用电子卡尺从三个维度上测量肿瘤(高度×宽度×长度)，并计算肿瘤体积。当后腿麻痹时，对小鼠行安乐死。

通过Kaplan-Meier分析证实(图28)，在用毒素偶联的抗CD 19抗体、预防性施用的裸抗CD 19抗体、或作为治疗方案施用的抗CD 19抗体治疗后，平均存活时间延长。所显示的平均存活时间的最大延长在使用裸抗CD 19抗体进行预防性治疗时达到。

也测量了体重的变化，并且将其计算为体重变化百分比。该数据显示在图29中。在30天期间，使用一种毒素-偶联的抗体使体重具有净增长变化，使用抗体和毒素(非偶联物)导致体重的净降低变化。利用预防性裸抗CD 19抗体或抗CD 19抗体治疗方案，体重具有净增长变化。

实施例9：使用裸抗CD 19抗体治疗体内肿瘤异种移植模型

植入淋巴瘤的小鼠用裸抗CD 19抗体体内治疗，以检查抗体对肿瘤生长的体内效果。

ARH-77(人B淋巴母细胞白血病；ATCC保藏号CRL-1621)和Raji(人B淋巴细胞伯基特淋巴瘤；ATCC保藏号CCL-86)细胞在体外用标准实施方案程序增殖。6-8周龄的雄性CB17.SCID小鼠(Taconic，Hudson，NY)每只小鼠在右胁下皮下植入在0.2mlPBS/Matrigel(1∶1)中的5×10⁶ARH-77或Raji细胞。对小鼠称重，在植入后每周两次使用电子卡尺测量肿瘤的三个维度。肿瘤体重计算为高度×宽度×长度/2。带有平均为80mm³的ARH-77肿瘤或平均为170mm³的Raji肿瘤的小鼠随机分入治疗组。在第0天，给小鼠腹膜内施用PBS载体、同型对照抗体或裸抗-CD 19 HuMAb 2H5。当肿瘤达到肿瘤终点(2000mm³)时对小鼠行安乐死。结果显示在图30A(ARH-77肿瘤)和30B(Raji肿瘤)中。裸抗-CD 19抗体21D4延长了达到肿瘤终点体积(2000mm³)的平均时间，并且减慢了肿瘤生长的进展。因此，单独用抗-CD 19抗体治疗对肿瘤生长具有直接的体内抑制作用。

实施例10：非岩藻糖基化HuMAb的产生

已经证实具有减少的岩藻糖基残基的抗体提高了抗体的ADCC能力。在该实施例中，生产了缺乏岩藻糖基残基的抗-CD 19 HuMAb21D4。

缺乏岩藻糖基转移酶基因FUT8(Biowa，Inc.Princeton，NJ)的CHO细胞系Ms704-PF用表达抗体21D4的重链和轻链的载体电穿孔。通过在含有6mM L-谷氨酰胺和500μg/ml G418(Invitrogen，Carlsbad，CA)的Ex-Cell 325-PF CHO培养基(JRH Biosciences，Lenexa，KS)中生长而选择耐药性克隆。通过标准ELISA试验针对IgG的表达来筛选克隆。

通过CE-LIF对MAb的寡糖表征

来源于CHO岩藻糖基化细胞系的抗CD 19抗体衍生的N连接的寡糖和Ms704-PF衍生的抗CD 19单克隆抗体样品的对比分析通过毛细管电泳激光诱导的荧光(cLIF)来进行(Chen和Evangelista(1998)Electrophoresis 15：1892)。通过样品与12.5mU PNGaseF(Prozyme)在40℃下温育过夜，从IgG样品(100μg)上释放纯化的抗体的N-连接的寡糖。在使用的条件下，从在CHO岩藻糖基化和非岩藻糖基化细胞中表达的HuMAb 21D4的Fc部分上释放N-连接的聚糖。经乙醇沉淀除去MAb蛋白后，含有聚糖的上清液通过真空离心干燥，并且在温和还原胺化条件下重悬浮在19mM 8-氨基芘-1，3，6-三磺酸酯(APTS)(Beckman)中，其中脱唾液酸化和岩藻糖残基的丢失最小化(在THF(Sigma)中15％乙酸和1M氰硼氢化钠)。聚糖标记反应在40℃下继续过夜，随后用水将样品稀释25倍。将APTS标记的聚糖加到在P/ACE MDQ CE系统(Beckman)上具有激光诱发的荧光的毛细管电泳中，其具有反极性，使用50μm内径和50cm有效长度的N-CHO包被的毛细管(Beckman)。压力(8秒)注射样品，并且使用碳水化合物分离凝胶缓冲液(Beckman)在20℃和25kV下分离20分钟。应用具有3mW氩离子激光的激光诱发的荧光检测系统(Beckman)在488nm的激发波长和520nm的发射波长下监测分离(Ma和Nashabeh(1999)Anal.Chem.71：5185)。在从岩藻糖基化细胞系获得的抗体和从Ms704-PF细胞系获得的抗体之间观察到寡糖谱的差异，这与Ms704-PF衍生的抗CD 19抗体中不存在岩藻糖残基一致。

使用HPAE-PAD通过HPLC的单糖分析

使用2N TFA(用于估计中性糖)或6N HC1(用于估计氨基糖)在100℃下对IgG样品(200μg)进行酸解4小时。通过在室温下真空离心将样品干燥，并用200μl水重建，之后进行HPAE-PAD分析(Dionex)。单糖用具有前置柱氨基捕获器(Amino Trap)和硼酸盐捕获器的CarboPac PA104×250mm柱(Dionex)分离。步骤按照DionexTechnical Note 53进行。利用单糖标准(Dionex)测定单糖峰的身份和相对丰度。

也用标准毛细管等电聚焦试剂盒试验(Beckman Coulter)检测了非岩藻糖基化抗CD 19 21D4抗体。该试验观察到，岩藻糖基化21D4的pI值为pH 8.45，岩藻糖基化21D4a的pI值为8.44和8.21，非岩藻糖基化21D4抗体的pI值为8.52和8.30。

实施例11：抗CD 19抗体的ADCC活性的评价

在该实施例中，在荧光细胞毒性试验中检测了岩藻糖基化和非岩藻糖基化抗CD 19单克隆抗体在效应细胞存在下通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)杀伤CD 19+细胞的能力。

非岩藻糖基化人抗CD 19单克隆抗体21D4如上所述制备。人效应细胞如下所述从全血中制备。通过标准Ficoll-paque分离法从肝素化的全血中纯化人外周血单核细胞。将该细胞重悬浮在含有10％FBS(培养基)和200U/ml人IL-2的RPMI 1640培养基中，并在37℃下温育过夜。次日，收集细胞，用培养基洗一次，并以2×10⁷细胞/ml的浓度重悬浮。在补充2.5mM丙磺舒(probenecid)(试验基质)的培养基中靶CD 19+细胞与BATDA试剂(Perkin Elmer，Wellesley，MA)以每1×10⁶靶细胞2.5μl BATDA的比例37℃温育20分钟。用含有20mM HEPES和2.5mM丙磺舒的PBS洗涤靶细胞4次，离心，使得在测定基质中的终浓度为1×10⁵细胞/ml。

如下所述，利用Delfia荧光发射分析检测CD 19+细胞系ARH-77(人B淋巴母细胞白血病；ATCC保藏号CRL-1621)对岩藻糖基化和非岩藻糖基化人抗CD 19单克隆抗体21D4的抗体特异性ADCC。靶细胞系ARH-77(100μl标记的靶细胞)与50μl效应细胞和50μl21D4或非岩藻糖基化21D4抗体一起温育。在整个实验过程中均使用1∶50的靶：效比。使用人IgG1同种型对照作为阴性对照。在以2100rpm离心和37℃温育1小时后，收集上清液，再次快速离心，将20μl上清液转移到平底板上，向其中加入180μl Eu溶液(PerkinElmer，Wellesley，MA)，在Fusion Alpha TRF读板机(Perkin Elmer)上读数。裂解百分比如下计算：(样品释放-自发释放×100)/(最大释放-自发释放)，其中自发释放是只含靶细胞的孔的荧光，最大释放是含有靶细胞并且用3％Lysol处理的孔的荧光。对于ARH-77细胞系的细胞毒性％特异性裂解显示在图31中。CD 19+表达细胞系ARH-77显示与HuMAb抗-CD 19抗体21D4有关的抗体介导的细胞毒性，以及与非岩藻糖基化形式的抗-CD 19抗体21D4相关的特异性裂解百分比的提高。该数据证实非岩藻糖基化HuMAb抗-CD 19抗体显示对CD 19+表达细胞的特异性细胞毒性增加。

实施例12：通过差示扫描量热法测定的抗-CD 19单克隆抗体的热稳定性

使用熔解温度的量热分析比较了抗-CD 19单克隆抗体的热稳定性。

熔解温度的量热测量^TM在与自动采样器组合的VP-毛细管DSC差示扫描量热仪平台(MicroCal LLC，Northampton，MA，USA)上进行。样品细胞体积为0.144mL。糖基化和脱糖基化形式的抗体的变性数据通过将浓度为2.3μM的该样品以1℃/min的速度从30℃加热到95℃来进行。蛋白质样品存在于pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中。在参比细胞中使用相同的缓冲液，来通过比较获得摩尔热容。使用软件Origin v7.0将观察到的热解曲线对基线进行修正，并且基于2状态模型分析标准化的数据。数据显示在表2中。

表2.抗-CD 19抗体的热稳定性测量

克隆	热稳定性T_ml(℃)
克隆	热稳定性T_ml(℃)	21D4	68.7
21D4a	69.7	21D4	68.7
21D4a	69.7	5G7	68.5
5G7IgG4	67.4	5G7	68.5
5G7IgG4	67.4	13F1IgG4	68.4
46E8	66.4	13F1IgG4	68.4
46E8	66.4	47G4	67.2

实施例13：糖基化位点的评价

通过序列分析发现HuMAb抗CD 19抗体5G7在可变区具有N-X-S/T糖基化基序。N-连接的序列位点(N-X-S/T)的存在是必需的，但是不足以向MAb上添加碳水化合物。也就是说，可能具有由于蛋白质折叠和溶剂可及性而实际上没有添加碳水化合物的N-X-S/T序列。5G7可变区中糖基化位点的确证通过LC-MS和Western分析进行。

液相色谱-质谱(LC-MS)是测定蛋白质如抗体的质量的标准方法。在分析前，通过将样品与12.5mU PNGaseF(Prozyme)在40℃下温育过夜，将抗CD 19 HuMAb 5G7和13F1的N-连接的寡糖从IgG样品(100μg)上释放下来。在使用的条件下，N-连接的聚糖从HuMAb的Fc部分上释放下来。对于克隆5G7，我们观察到两个高丰度的质量；一个(49,855 Da)对应于经PNGaseF消化在保守的N-连接位点(N297)处除去恒定区中的糖后预测的质量，第二个质量(52,093 Da)符合在第二个位点处添加碳水化合物的情况。我们发现PNGaseF消化未除去Fab-区聚糖；因此，该数据支持克隆5G7的可变区中存在碳水化合物。对于克隆13F1，观察的质量与未连接碳水化合物的蛋白质序列的预测质量相一致。

为了证实上述结果，我们使用碳水化合物特异性染色方法对克隆5G7和13F1的Fab片段进行了Western Blot试验。通过向含1mM半胱氨酸的25μg IgG样品中添加1.25μg活化的木瓜蛋白酶产生Fab和Fc片段。样品在40℃下温育4小时，用30mM碘乙酰胺终止反应。通过4-20％Tris-甘氨酸SDS-PAGE随后通过电转印到PVDF膜上分析样品。印迹的碳水化合物特异性染色用Gel Code糖蛋白染色试剂盒(Pierce)按照厂商推荐的方案进行。结果在5G7抗体中检测到Fab糖基化，而在13F1抗体中没有。这些结果表明5G7抗体在Fab区中糖基化。

如上所述，抗CD 19单克隆抗体5G7含有具有糖基化位点的可变区。由于可变区中的糖基化位点可能由于抗原结合改变而导致抗体的免疫原性提高或pK值改变，因此突变可变区N-X-S/T糖基化基序以减少糖基化可能是有利的。使用标准分子生物学方法，修饰5G7抗体序列，以将开始于位点19的N-I-S序列改变为K-I-S(5G7-N19K)或Q-I-S(5G7-N19Q)。

实施例14：通过荧光光谱法测定的抗CD 19单克隆抗体的稳定性

通过荧光光谱法测量化学变性的中点来比较抗CD 19单克隆抗体的稳定性。

化学变性的荧光测量在具有Micromax读板器的SPEX Fluorolog3.22(SPEX，Edison，NJ)上进行。对在PBS缓冲液中以16种不同浓度的盐酸胍平衡24小时的抗体样品进行测量。测量在黑色、小体积、非结合的表面384孔板(Corning，Acton，MA)中进行，并且在12μL的孔体积中需要2μM抗体。在280nm处激发荧光，发射光谱在300-400nm之间测量。扫描速度为每nm1秒，裂缝设置为5nm带通。用PBS作为缓冲液空白，从数据中自动减除。数据显示在表3中。

表3.抗CD 19抗体的荧光稳定性

克隆	非折叠中点(M)	聚集峰(M)
克隆	非折叠中点(M)	聚集峰(M)	21D4	3.01
21D4a	2.97		21D4	3.01
21D4a	2.97		5G7	2.91
5G7 IgG4	2.63		5G7	2.91
5G7 IgG4	2.63		27F3	2.77
13F1 IgG4	2.58	2.29	27F3	2.77
13F1 IgG4	2.58	2.29	46E8	2.43	2.16
47G4	1.68		46E8	2.43	2.16

实施例15：使用抗CD 19抗体治疗体内B细胞Raji肿瘤

在该实施例中，用裸抗CD 19抗体或毒素偶联的抗CD 19抗体在体内治疗植入癌性B细胞肿瘤的SCID小鼠，以检查该抗体对肿瘤生长的体内效果。

毒素偶联的抗CD 19抗体如上所述制备。利用缺乏功能性B和T淋巴细胞的重度联合免疫缺陷(SCID)小鼠研究B细胞恶性肿瘤。皮下注射来自Raji B肿瘤细胞系的细胞。小鼠用30mg/kg抗体或0.3μM/kg(毒素)抗体-毒素偶联物治疗。用同种型对照抗体或配制缓冲液作为阴性对照。给动物腹膜内注射大约200μl含有抗体或载体的PBS进行给药。抗体作为单剂量(SD)在第0天注射，或者作为重复剂量(RD)在第0、7、14天注射。每天使用电子卡尺监测小鼠的肿瘤生长；测量肿瘤的三个维度(高度×宽度×长度/2)，计算肿瘤体积。当肿瘤达到肿瘤终点(2000mm³)或显示大于20％的体重减轻时对小鼠行安乐死。结果显示在图32中。在每种情况中，抗CD 19抗体都比阴性对照显示更小的肿瘤体积，毒素偶联抗体比裸抗体治疗显示更小的肿瘤体积。

也测量了体重的变化，并将其计算为体重变化百分比。结果显示在图33中。结果表明使用毒素偶联抗体得到体重的净降低变化，使用载体或裸抗体得到体重的净增长。

实施例16：食蟹猴中的B细胞研究

在该实施例中，给食蟹猴静脉内注射亲本抗CD 19抗体或非岩藻糖基化(nf)的抗CD 19抗体。给药后测量绝对白细胞计数和白细胞亚群，并与给药前的值进行比较。

采自食蟹猴的血样用亲本抗CD 19抗体或非岩藻糖基化的抗CD 19抗体染色，并且使用标准方法进行FACS分析。来自研究中包括的所有猴的B细胞用亲本和非岩藻糖基化的抗CD 19抗体都染色为阳性。每组包括两只雄性和两只雌性猴。在第-7天和给药前采集血样。通过隐静脉进行慢大丸剂静脉注射，给动物施用1mg/kg亲本或非岩藻糖基化的抗CD 19抗体。给药后24、48、72小时和第7、14、21、28天采集血样。采集血样进行PK测定、血液学和流式细胞分析。在每一时间点，监测血液的下列细胞表面抗原：CD2+/CD20+(所有淋巴细胞)，CD20+(B-淋巴细胞)，CD3+(T-淋巴细胞)，CD3+/CD4+(T-辅助淋巴细胞)，CD3+/CD8+(T-细胞毒性淋巴细胞)，CD3-/CD16+(NK细胞)，CD3-/CD14+(单核细胞)。

图34显示了与第-7天和给药前的平均值相比CD20阳性细胞数的变化。亲本抗CD 19抗体在24小时后诱导CD20阳性B细胞数减少55％，非岩藻糖基化的抗体产生更强的抑制，B细胞数下降大约90％。在非岩藻糖基化抗CD 19组中，B细胞计数在治疗后第2、3、7天保持在该水平上，而亲本抗体开始恢复到基线。图35显示每只个体猴的CD20阳性细胞相对于基线的％变化。与亲本抗CD 19抗体相比，用非岩藻糖基化抗CD 19抗体处理的所有4只猴都显示更显著的CD20阳性细胞百分数下降。这些数据结合起来表明非岩藻糖基化抗CD 19抗体在排除循环B细胞方面比亲本抗体更有效。

实施例17：抗CD 19抗体的免疫组化研究

为了评价HuMab抗-CD 19的组织结合分布，在一组正常的(非肿瘤)人组织中检查了FITC偶联的21D4(21D4-FITC，F∶P＝4)和非岩藻糖基化的21D4(nf 21D4)(nf 21D4-FITC，F∶P＝3)，这些组织包括脾、扁桃腺、小肠、小脑、大脑、心脏、肝脏、肺和肾(1-2个样品/每个组织)，以及B细胞肿瘤，包括慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、B系弥散性大细胞淋巴瘤(1-2个样品/每个肿瘤)。非岩藻糖基化21D4抗体如上所述制备。用FITC偶联的Hu-IgG₁(Hu-IgG₁-FITC)作为同种型对照抗体。

骤冻的并且OCT包埋的正常和淋巴瘤组织购自CooperativeHuman Tissue Network(Philadelphia，PA)或National Disease ResearchInstitute(Philadelphia，PA)。5μm的冷冻切片用丙酮在室温下固定10分钟，在使用前贮存于-80℃。使用EnVision+System(Dako.Carpinteria，CA)按照我们的常规方案进行间接过氧化物酶免疫染色。简要来说，将切片用PBS(Sigma，St.Louis，MO)洗涤两次，然后与Dako EnVision+System提供的过氧化物酶封闭液温育10分钟。用PBS洗涤两次后，将切片与补充1％人γ球蛋白和1mg/ml热聚集的人IgG的Dako蛋白封闭液温育20分钟，以封闭非特异性结合位点。然后，向切片上加第一抗体(21D4-FITC和nf 21D4-FITC，0.4或2μg/ml)或同种型对照(Hu-IgG1-FITC，0.4或2μg/ml)，并温育1小时。用PBS洗涤三次后，将切片与小鼠抗FITC抗体(20μg/ml)一起温育30分钟。用PBS另外洗涤三次后，切片与Dako EnVision+System提供的过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG聚合物一起温育30分钟。最后，如上所述洗涤切片，并与Dako EnVision+System提供的DAB底物-发色团溶液反应6分钟。然后用去离子水洗涤切片，按照常规组织学程序用Mayer苏木精(Dako)复染，脱水，清洁，并盖上玻片Permount(Fischer Scientific，Fair Lawn，NJ)。

在淋巴样或富含淋巴样组织(脾、扁桃腺和小肠)和淋巴瘤组织中观察21D4-FITC和nf21D4-FITC的特异性染色。在脾和扁桃腺中，强特异性染色主要分布在B细胞区，即脾的淋巴结、扁桃腺的外套层和生发中心。在小肠中，强特异性染色主要位于派伊尔淋巴集结或集合淋巴结中，在粘膜固有层中的扩散淋巴细胞中有弱到强的染色。强染色也表现在滤泡性淋巴瘤和边缘区淋巴瘤的肿瘤细胞中，在慢性淋巴细胞性白血病、B系弥散性大细胞淋巴瘤和外套细胞淋巴瘤中有中到强的染色。

在正常的小肠、小脑、大脑、心脏、肝脏、肺和肾组织中，除了在肺和肾组织中的局灶性淋巴细胞或集合中有一些染色之外，用21D4-FITC或nf21D4-FITC染色时没有观察到明显的染色。另外，这些组织在可达10μg/ml的较高浓度下染色。类似地，与同种型对照抗体相比没有观察到特异性染色。

21D4-FITC和nf21D4-FITC的比较在所有组织中显示类似的染色模式。特异性染色在0.4μg/ml时饱和或接近饱和。然而，21D4-FITC的染色强度比nf21D4-FITC大约强0.5-1级。这可能部分是由于21D4-FITC的较高的F∶P比(4相对于3)。

实施例18：抗CD 19抗体的细胞杀伤的评价

在该实施例中，利用胸苷掺入试验检测了单独的或与毒素偶联的抗CD 19单克隆抗体杀伤CD 19+细胞系的能力。

抗CD 19单克隆抗体通过连接体如肽基、腙或二硫键连接体与毒素偶联。CD 19+表达Raji或SU-DHL-6细胞系以1×10⁴细胞/孔接种。向孔中添加起始浓度为30nM的单独的抗CD 19抗体或抗CD 19抗体-毒素偶联物，并且以1∶3的连续稀释倍数向下滴定，共8个稀释度。用非CD 19特异性的同种型对照抗体作为阴性对照。使板温育69小时。然后将板用0.5μCi ³H-胸苷脉冲24小时，收获，并且用Top Count闪烁计数仪(Packard Instruments，Meriden，CT)读数。结果与EC50值一起显示在图36中。图36A显示裸抗体对于Raji细胞的结果。图36B显示裸抗体对于SU-DHL-6细胞的结果。图36C显示毒素偶联的抗CD 19抗体对于SU-DHL-6细胞的结果。该数据证实抗CD 19抗体21D4结合并杀死Raji B细胞肿瘤细胞，并且对SU-DHL-6细胞具有意外的高水平的细胞杀伤。

实施例19：B细胞排除研究

为了确定抗CD 19抗体是否能够排除B细胞，建立了全血B细胞排除试验。

人全血购自AllCells Inc.(Berkeley，CA)，并且在同一天在室温下运输。2ml全血在存在或不存在1-30mg/ml的指定抗体或作为未处理组的PBS的条件下温育。血-抗体混合物在37℃和5％CO₂下温育过夜。在实验当天，通过温育10分钟然后离心，用RBS裂解缓冲液以1∶10的比例裂解血液两次。在第二次离心后，细胞沉淀物用FACS缓冲液(PBS+钙和镁，含有2％FBS和20％维尔烯)洗涤一次，然后使用标准流式细胞分析方案，用作为T细胞标记物的抗CD3抗体(Becton Dickinson目录号#555332)和作为B细胞标记物的抗CD22抗体(Becton Dickinson目录号#340708)进行FACS染色。细胞在冰上温育20分钟，之后最终洗涤，并且重悬浮在5mg/ml在FACS缓冲液中的碘化丙锭(Sigma目录号#P4864)溶液中。使用BectonDickinson的FASCalibur系统和CeliQuest软件通过流式细胞分析收集数据，并且使用FiowJo软件利用淋巴细胞大小门控(gating)进行分析。通过测定非处理组中的％阳性B细胞减去抗体处理组中的％阳性B细胞除以非处理组中的％阳性B细胞乘以100来计算变化百分比。结果显示在表4中。来自健康献血者的血液在温育过夜(无抗体)后保留了8.7％的B细胞。与未处理的、无抗体组相比，全血与30mg/ml阳性对照Rituxan温育导致B细胞数排除46％。非岩藻糖基化(nf)抗CD 19抗体处理组对B细胞排除具有显著的影响，抑制B细胞约40％。亲本抗体对B细胞数具有中度的影响。

表4.全血的B-细胞排除

样品	％阳性(CD22)	％变化
样品	％阳性(CD22)	％变化	无抗体	8.7	-
同种型对照	7.5	14.2	无抗体	8.7	-
同种型对照	7.5	14.2	Rituxan	4.7	46.3
亲本抗CD 19mAb	7.0	20.0	Rituxan	4.7	46.3
亲本抗CD 19mAb	7.0	20.0	Nf抗-CD 19mAb	5.2	40.5

序列表概述

SEQ IDNO：	序列	SEQ IDNO：	序列
SEQ IDNO：	序列	SEQ IDNO：	序列	1	V_H氨基酸21D4和21D4a	41	V_K CDR1氨基酸5G7
2	V_H氨基酸47G4	42	V_K CDR1氨基酸13F1	1	V_H氨基酸21D4和21D4a	41	V_K CDR1氨基酸5G7
2	V_H氨基酸47G4	42	V_K CDR1氨基酸13F1	3	V_H氨基酸27F3	43	V_K CDR1氨基酸46E8
4	V_H氨基酸3C10	44	V_K CDR2氨基酸21D4和21D4a	3	V_H氨基酸27F3	43	V_K CDR1氨基酸46E8
4	V_H氨基酸3C10	44	V_K CDR2氨基酸21D4和21D4a	5	V_H氨基酸5G7	45	V_K CDR2氨基酸47G4
6	V_H氨基酸13F1	46	V_K CDR2氨基酸27F3	5	V_H氨基酸5G7	45	V_K CDR2氨基酸47G4
6	V_H氨基酸13F1	46	V_K CDR2氨基酸27F3	7	V_H氨基酸46E8	47	V_K CDR2氨基酸3C10
8	V_K氨基酸21D4	48	V_K CDR2氨基酸5G7	7	V_H氨基酸46E8	47	V_K CDR2氨基酸3C10
8	V_K氨基酸21D4	48	V_K CDR2氨基酸5G7	9	V_K氨基酸21D4a	49	V_K CDR2氨基酸13F1
10	V_K氨基酸47G4	50	V_K CDR2氨基酸46E8	9	V_K氨基酸21D4a	49	V_K CDR2氨基酸13F1
10	V_K氨基酸47G4	50	V_K CDR2氨基酸46E8	11	V_K氨基酸27F3	51	V_K CDR3氨基酸21D4
12	V_K氨基酸3C10	52	V_K CDR3氨基酸21D4a	11	V_K氨基酸27F3	51	V_K CDR3氨基酸21D4
12	V_K氨基酸3C10	52	V_K CDR3氨基酸21D4a	13	V_K氨基酸5G7	53	V_K CDR3氨基酸47G4
14	V_K氨基酸13F1	54	V_K CDR3氨基酸27F3	13	V_K氨基酸5G7	53	V_K CDR3氨基酸47G4

15	V_K氨基酸46E8	55	V_K CDR3氨基酸3C10
15	V_K氨基酸46E8	55	V_K CDR3氨基酸3C10	16	V_H CDR1氨基酸21D4和21D4a	56	V_K CDR3氨基酸5G7
17	V_H CDR1氨基酸47G4	57	V_K CDR3氨基酸13F1	16	V_H CDR1氨基酸21D4和21D4a	56	V_K CDR3氨基酸5G7
17	V_H CDR1氨基酸47G4	57	V_K CDR3氨基酸13F1	18	V_H CDR1氨基酸27F3	58	V_K CDR3氨基酸46E8
19	V_H CDR1氨基酸3C10	59	V_H核苷酸21D4和21D4a	18	V_H CDR1氨基酸27F3	58	V_K CDR3氨基酸46E8
19	V_H CDR1氨基酸3C10	59	V_H核苷酸21D4和21D4a	20	V_H CDR1氨基酸5G7	60	V_H核苷酸47G4
21	V_H CDR1氨基酸13F1	61	V_H核苷酸27F3	20	V_H CDR1氨基酸5G7	60	V_H核苷酸47G4
21	V_H CDR1氨基酸13F1	61	V_H核苷酸27F3	22	V_H CDR1氨基酸46E8	62	V_H核苷酸3C10
23	V_H CDR2氨基酸21D4和21D4a	63	V_H核苷酸5G7	22	V_H CDR1氨基酸46E8	62	V_H核苷酸3C10
23	V_H CDR2氨基酸21D4和21D4a	63	V_H核苷酸5G7	24	V_H CDR2氨基酸47G4	64	V_H核苷酸13F1
25	V_H CDR2氨基酸27F3	65	V_H核苷酸46E8	24	V_H CDR2氨基酸47G4	64	V_H核苷酸13F1
25	V_H CDR2氨基酸27F3	65	V_H核苷酸46E8	26	V_H CDR2氨基酸3C10	66	V_K核苷酸21D4
27	V_H CDR2氨基酸5G7	67	V_K核苷酸21D4a	26	V_H CDR2氨基酸3C10	66	V_K核苷酸21D4
27	V_H CDR2氨基酸5G7	67	V_K核苷酸21D4a	28	V_H CDR2氨基酸13F1	68	V_K核苷酸47G4
29	V_H CDR2氨基酸46E8	69	V_K核苷酸27F3	28	V_H CDR2氨基酸13F1	68	V_K核苷酸47G4
29	V_H CDR2氨基酸46E8	69	V_K核苷酸27F3	30	V_H CDR3氨基酸21D4和21D4a	70	V_K核苷酸3C10
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31	V_H CDR3氨基酸47G4	71	V_K核苷酸5G7	32	V_H CDR3氨基酸27F3	72	V_K核苷酸13F1
33	V_H CDR3氨基酸3C10	73	V_K核苷酸46E8	32	V_H CDR3氨基酸27F3	72	V_K核苷酸13F1
33	V_H CDR3氨基酸3C10	73	V_K核苷酸46E8	34	V_H CDR3氨基酸5G7	74	VH 5-51种系氨基酸
35	V_H CDR3氨基酸13F1	75	VH 1-69种系氨基酸	34	V_H CDR3氨基酸5G7	74	VH 5-51种系氨基酸
35	V_H CDR3氨基酸13F1	75	VH 1-69种系氨基酸	36	V_H CDR3氨基酸46E8	76	VK L18种系氨基酸
37	V_K CDR1氨基酸21D4和21D4a	77	VK A27种系氨基酸	36	V_H CDR3氨基酸46E8	76	VK L18种系氨基酸
37	V_K CDR1氨基酸21D4和21D4a	77	VK A27种系氨基酸	38	V_K CDR1氨基酸47G4	78	VK L15种系氨基酸
39	V_K CDR1氨基酸27F3	79	CD19氨基酸	38	V_K CDR1氨基酸47G4	78	VK L15种系氨基酸
39	V_K CDR1氨基酸27F3	79	CD19氨基酸	40	V_K CDR1氨基酸3C10	80	JH4b种系
		81	JH5b种系	40	V_K CDR1氨基酸3C10	80	JH4b种系
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85	JK3种系
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87	JK2种系	86	JK1种系

序列表

<110>米德列斯公司

<120>CD 19抗体及其用途

<130>04280/2203058-WO0

<140>

<141>

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<150>60/692,531

<151>2005-06-20

<160>87

<170>PatentIn Ver.3.3

<210>1

<211>121

<212>PRT

<213>人

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tct ctg aag atc tcc tgt aag ggt tct gga tac agc ttt agc agc agc 96

Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Ser

20 25 30

tgg atc ggc tgg gtg cgc cag atg ccc ggg aaa ggc ctg gag tgg atg 144

Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

ggg atc atc tat cct gat gac tct gat acc aga tac agt ccg tcc ttc 192

Gly Ile Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe

50 55 60

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Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Arg Thr Ala Tyr

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Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

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Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Asp Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

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Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Gln Phe

50 55 60

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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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Ala Arg Glu Ala Val Ala Ala Asp Trp Leu Asp Pro Trp Gly Gln Gly

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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu

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Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

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Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

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Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

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Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met

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Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

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Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

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cta cag tgg agc ggc ctg aag gcc tcg gac acc gcc atg tat tac tgt 288

Leu Gln Trp Ser Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

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Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

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<212>DNA

<213>人

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag ttt aat agt tac ccg tgg 288

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Trp

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acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 321

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

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<212>DNA

<213>人

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<221>CDS

<222>(1)..(321)

<400>72

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Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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20 25 30

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

tat gat gcc tcc agt ttg gaa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc 192

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

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Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<212>DNA

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Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag ggc att agc agt gct 96

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala

20 25 30

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

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agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agc ctg cag cct 240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

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gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag ttt aat agt tac cct cac 288

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His

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act ttt ggc cag ggg acc aag ctg gag atc aaa 321

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

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<212>PRT

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Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr

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Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys

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Ala Arg

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<212>PRT

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Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

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Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

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Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser

85 90 95

<210>78

<211>95

<212>PRT

<213>人

<400>78

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro

85 90 95

<210>79

<211>556

<212>PRT

<213>人

<400>79

Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met

1 5 10 15

Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp

20 25 30

Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln

35 40 45

Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu

50 55 60

Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile

65 70 75 80

Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu

85 90 95

Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr

100 105 110

Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp

115 120 125

Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro

130 135 140

Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala

145 150 155 160

Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro

165 170 175

Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro

180 185 190

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser

195 200 205

Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser

210 215 220

Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp

225 230 235 240

Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala

245 250 255

Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu

260 265 270

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly

275 280 285

Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu

290 295 300

Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg

305 310 315 320

Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val

325 330 335

Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu

340 345 350

Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala

355 360 365

Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp

370 375 380

Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly

385 390 395 400

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu

405 410 415

Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu

420 425 430

Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly

435 440 445

Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu

450 455 460

Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser

465 470 475 480

Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly

485 490 495

Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln

500 505 510

Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala

515 520 525

Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp

530 535 540

Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg

545 550 555

<210>80

<211>13

<212>PRT

<213>人

<400>80

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210>81

<211>15

<212>PRT

<213>人

<400>81

Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10 15

<210>82

<211>18

<212>PRT

<213>人

<400>82

Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val

1 5 10 15

Ser Ser

<210>83

<211>14

<212>PRT

<213>人

<400>83

Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210>84

<211>12

<212>PRT

<213>人

<400>84

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

<210>85

<211>12

<212>PRT

<213>人

<400>85

Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

1 5 10

<210>86

<211>12

<212>PRT

<213>人

<400>86

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

1 5 10

<210>87

<211>11

<212>PRT

<213>人

<400>87

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

1 5 10

Claims

1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其中该抗体：

(a)以1×10^-7M或更低的K_D与人CD 19结合；且

(b)与Raji和Daudi B细胞肿瘤细胞结合。

2.权利要求1的抗体，其为人抗体。

3.权利要求1的抗体，其为嵌合抗体或人源化抗体。

4.权利要求2的抗体，其为IgG1或IgG4同种型的全长抗体。

5.权利要求2的抗体，其为抗体片段或单链抗体。

6.权利要求2的抗体，其中所述抗体是非岩藻糖基化的。

7.权利要求2的抗体，其中所述抗体以5×10^-8M或更低的K_D与人CD 19结合。

8.权利要求2的抗体，其中所述抗体以5×10^-9M或更低的K_D与人CD 19结合。

9.权利要求2的抗体，其中所述抗体具有高于65℃的热稳定性温度。

10.权利要求2的抗体，其中人CD 19包括具有如SEQ ID NO：79[Genbank登录号NM_001770]所示氨基酸序列的多肽。

11.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其中该抗体与参比抗体交叉竞争结合CD 19，其中该抗体：

(a)以1×10^-7M或更低的K_D与人CD 19结合；且

(b)与Raji和Daudi B细胞肿瘤细胞结合。

12.权利要求11的抗体，其中所述参比抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区。

13.权利要求11的抗体，其中所述参比抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链可变区。

14.权利要求11的抗体，其中所述参比抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区。

15.权利要求11的抗体，其中所述参比抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链可变区。

16.权利要求11的抗体，其中所述参比抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区。

17.权利要求11的抗体，其中所述参比抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链可变区。

18.权利要求11的抗体，其中所述参比抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区。

19.权利要求11的抗体，其中所述参比抗体包括：

(a)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链可变区。

20.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包括产自或源自人V_H 5-51基因或人V_H 1-69基因的重链可变区，其中该抗体与CD 19特异性结合。

21.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包括产自或源自人V_K L18基因、V_K A27基因或人V_K L15基因的轻链可变区，其中该抗体与CD 19特异性结合。

22.权利要求21的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其还包括产自或源自人V_H 5-51基因或人V_H 1-69基因的重链可变区。

23.权利要求1的抗体，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：23的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：30的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：37的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：44的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：51的轻链可变区CDR3。

24.权利要求1的抗体，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：16的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：23的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：30的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：37的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：44的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：52的轻链可变区CDR3。

25.权利要求1的抗体，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：17的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：24的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：31的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：38的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：45的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：53的轻链可变区CDR3。

26.权利要求1的抗体，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：18的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：25的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：32的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：39的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：46的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：54的轻链可变区CDR3。

27.权利要求1的抗体，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：19的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：26的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：33的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：40的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：47的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：55的轻链可变区CDR3。

28.权利要求1的抗体，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：20的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：27的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：34的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：41的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：48的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：56的轻链可变区CDR3。

29.权利要求1的抗体，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：21的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：28的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：35的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：42的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：49的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：57的轻链可变区CDR3。

30.权利要求1的抗体，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：22的重链可变区CDR1；

(b)包含SEQ ID NO：29的重链可变区CDR2；

(c)包含SEQ ID NO：36的重链可变区CDR3；

(d)包含SEQ ID NO：43的轻链可变区CDR1；

(e)包含SEQ ID NO：50的轻链可变区CDR2；和

(f)包含SEQ ID NO：58的轻链可变区CDR3。

31.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或其片段，其包括：

包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区；和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区；其中：

(a)重链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO：30、31、32、33、34、35和36的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；

(b)轻链可变区CDR3序列包含选自SEQ ID NO：51、52、53、54、55、56、57和58的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；

(c)该抗体以1×10^-7M或更低的K_D与人CD 19结合；且

(d)与Raji和Daudi B细胞肿瘤细胞结合。

32.权利要求31的抗体，其中重链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO：23、24、25、26、27、28和29的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR2序列包含选自SEQ ID NO：44、45、46、47、48、49和50的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。

33.权利要求32的抗体，其中重链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：16、17、18、19、20、21和22的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列；且轻链可变区CDR1序列包含选自SEQ ID NO：37、38、39、40、41、42和43的氨基酸序列及其保守修饰的氨基酸序列。

34.权利要求31的抗体，其为人抗体。

35.权利要求31的抗体，其为人源化或嵌合抗体。

36.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包括：

其中该抗体与CD 19特异性结合。

37.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列的轻链可变区。

38.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列的轻链可变区。

39.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列的轻链可变区。

40.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列的轻链可变区。

41.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列的轻链可变区。

42.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的轻链可变区。

43.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：14的氨基酸序列的轻链可变区。

44.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分或片段，其包括：

(a)包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列的重链可变区；和

(b)包含SEQ ID NO：15的氨基酸序列的轻链可变区。

45.一种组合物，其含有权利要求1的抗体或其抗原结合部分或片段，和药学上可接受的载体。

46.一种免疫偶联物，其包含与治疗剂连接的权利要求1的抗体或其抗原结合部分或片段。

47.一种组合物，其含有权利要求46的免疫偶联物和药学上可接受的载体。

48.权利要求46的免疫偶联物，其中所述治疗剂是细胞毒素。

49.一种组合物，其含有权利要求48的免疫偶联物和药学上可接受的载体。

50.权利要求46的免疫偶联物，其中所述治疗剂是放射性同位素。

51.一种组合物，其含有权利要求50的免疫偶联物和药学上可接受的载体。

52.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1的抗体或其抗原结合部分。

53.一种表达载体，其包含权利要求52的核酸分子。

54.一种宿主细胞，其包含权利要求53的表达载体。

55.一种制备抗-CD 19抗体的方法，包括在权利要求54的宿主细胞中表达该抗体，并且从所述宿主细胞中分离该抗体。

56.一种抑制表达CD 19的肿瘤细胞生长的方法，包括使该细胞与有效抑制肿瘤细胞生长的量的权利要求1的抗体或其抗原结合部分或片段相接触。

57.权利要求56的方法，其中所述肿瘤细胞是B细胞恶性肿瘤。

58.权利要求57的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是非何杰金氏淋巴瘤。

59.权利要求57的方法，其中所述B细胞恶性肿瘤是外套细胞淋巴瘤。

60.一种消耗受试者中B细胞的方法，包括给该受试者施用有效消耗受试者中B细胞的量的抗CD 19抗体。

61.权利要求60的方法，其中所述抗CD 19抗体是权利要求1-44任一项的抗体。

62.权利要求1-44中任一项的抗CD 19抗体，其用于消耗受试者中B细胞的治疗性用途。

63.权利要求1-44中任一项的抗CD 19抗体在制备消耗受试者中的B细胞的药物中的用途。