CN107312091A - 靶向人cd19抗原的人源化单克隆抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体，并将其应用于嵌合抗原受体T细胞的构建与制备，而后在体外实验中验证了嵌合抗原受体T细胞肿瘤治疗效果。靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体由前导肽、靶向人CD19抗原的单链抗体、连接ScFv所用的铰链区、跨膜结构域和免疫受体酪氨酸活化基序组成，将该嵌合抗原受体构建成慢病毒表达载体，然后感染免疫细胞，能够在免疫细胞表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体，通过识别肿瘤细胞表面的CD19抗原，从而杀死表达CD19抗原的肿瘤，实现肿瘤治疗目的，为肿瘤靶向治疗提供了新的工具。

Description

靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及抗人CD19抗原人源化单克隆抗体设计，还 涉及表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体的慢病毒表达载体，以及慢病毒表达 载体的制备方法和应用。
背景技术
单克隆抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆 抗体；细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。将 针对某一肿瘤抗原的单克隆抗体与化疗药物或放疗物质联合，利用单克隆抗体 的导向作用，将药物或放疗物质携带至靶器官，直接杀伤靶细胞，称为肿瘤导 向治疗。另外，将放射性标记物与单克隆抗体连接，注入患者体内可进行放射 免疫显像，协助肿瘤的诊断。以小鼠来源单克隆抗体用于疾病治疗，直接使用 小鼠抗体进行人体治疗时，因为鼠抗的异质性会引起人抗鼠抗体反应(Human anti-mouse antibody reaction，HAMA)，导致抗体半衰期短，在循环系统中被很快清除，失去疗效。因此，治疗用鼠源单抗需要进行人源化修饰以提高抗 体的人源化程度、减弱HAMA。人源化抗体就是指抗体的可变区部分(即VH和 VL区)或抗体全部由人类抗体基因所编码。人源化抗体可以大大减少异源抗体 对人类机体造成的免疫副反应，人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型 抗体等逐步发展为人源化抗体。
将鼠源抗体改造为人源化抗体有以下几种主要形式：鼠可变区(Viarableregion，VRs)+人恒定区(Constant region，CRs)、鼠互补决定区 (Complementaritydetermining region，CDRs)+人框架区(Fragment regions， FRs)、鼠CDRs+人FRs等，尤其以“鼠CDRs+人FR”模式最为常见，这种人源 化抗体形式仅仅保留了CDRs中的鼠源残基，而将其余部分替换为人抗残基，能 将鼠抗的异源反应降到较低水平。但是直接将鼠抗CDRs移入人抗FRs通常会导 致抗体失去原有抗原结合活性，因此需要对影响抗原抗体结合的关键残基进行 反复修改，而后通过大量抗原抗体结合特异性、亲和力检测，从而筛选得到具 有活性的抗体序列。传统人源化改造方案大多基于小鼠抗体与人抗体的序列同 源性分析。
过继细胞治疗(Adoptive cell therapy，ACT)是生物治疗技术的一种， 通过对自体免疫细胞(主要是T细胞)进行体外扩增，然后将其回输给肿瘤患 者以达到治疗目的的方法，被认为是继手术、放、化疗后的第4种癌症治疗方 式，在临床治疗中受到广泛应用。过继细胞治疗技术主要包括：淋巴因子活化 的杀伤细胞(Lymphokine activated killercell，LAK)与IL-2联合治疗晚 期恶性肿瘤取得了一定疗效；肿瘤浸润淋巴细胞(Tumorinfiltrating lymphocytes，TIL)，治疗转移性黑色素瘤取得了较好的临床效果；细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine induced killer cell，CIK)对肝癌、肺癌等肿瘤 取得了显著的效果。但是目前上述三种治疗方法均需活化T细胞。T细胞活化 需要两种活化信号，即T细胞表面的TCR-CD3与MHC-I分子结合产生活化的第 一信号，决定T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性；T细胞表面的共刺激分子与相应 配体结合产生活化的第二信号，决定T细胞增殖。但肿瘤细胞在肿瘤微环境中 可下调自身MHC、配体分子的表达，从而抑制T细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。 因此需要对T细胞进行基因改造，使其重新获得对肿瘤细胞的杀伤能力。目前 这种改造主要有两种方式：基因转导TCR(T cell receptor，TCR)和嵌合抗 原受体(Chimericantigen receptor，CAR)。
CAR是模拟TCR功能的人工受体，由抗原识别域、铰链区和跨膜区及胞内 信号域依次连接组成，胞内信号域通常为CD3ζ链或FcRγ，或与一种或多种 共刺激分子相连，如4-1BB(CD137)，CD28，ICOS(CD278)。肿瘤细胞表面的抗 原(受体)与嵌合抗原受体的抗体(配体)结合时，通过铰链区和跨膜区将信 号传递至胞内，胞内信号域再将信号转化为活化信号，激活效应细胞，效应细 胞通过分泌穿孔素或者产生细胞因子杀伤肿瘤细胞，同时效应细胞本身也发生 扩增，进一步扩大免疫杀伤作用。嵌合抗原受体较TCR改造更具优势，体现在： (1)更特异：抗体(配体)特异性识别抗原(受体)；(2)效率高：不会出 现转基因TCR与患者内源性TCR发生错配；(3)非MHC-I限制性：不需要与 MHC-I分子结合，可克服肿瘤细胞、肿瘤微环境下调MHC-I分子造成的免疫逃 逸；(4)抗原选择范围广：抗原可以是糖类、脂类、蛋白质。目前CAR修饰的 免疫细胞治疗的临床试验大量开展，其中，抗CD19、CD20CAR修饰的T细胞治 疗B细胞系血液肿瘤效果显著。实体肿瘤临床试验则有抗叶酸嵌合抗原受体治 疗卵巢癌，抗碳酸酐酶嵌合抗原受体治疗肾癌，抗二唾液酸神经节苷脂(GD2) 嵌合抗原受体治疗经母细胞瘤等。
发明内容
针对现有技术中的不足之处，本发明提供了一种靶向人CD19抗原的人源化 单克隆抗体。
为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：
靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体，所述单克隆抗体由轻链可变区、重 链可变区、IgG Fc恒定区构成；抗人CD19抗原的人源化单链抗体(ScFv)氨 基酸序列如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；鼠抗人CD19抗原 的单克隆抗体株FMC63轻、重链可变区的CDR区氨基酸序列如SEQ ID NO.15、 SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17以及SEQ IDNO.18、SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20 所示。
作为本发明的一种优选方案，所述抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9所示；所述抗人CD19抗原的人源化单克隆 抗体由鼠源抗人CD19单克隆抗体FMC63改造而来，与抗原抗体对接关系最为密 切的残基如表1所示，对非关键残基以外的骨架序列参考人源抗体骨架区序列 进行人源化修饰改造，而后对序列进行随机突变以恢复抗体亲和力性能，通过 亲和力筛选和分子对接模拟的方法优选得到抗人CD19抗原的人源化单克隆抗 体，轻、重链可变区序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6及SEQID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。
作为本发明的另一种优选方案，所述抗体重链可变区包含在SEQ ID NO.4、 SEQID NO.5、SEQ ID NO.6所示重链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个 或三个修饰但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列、或与SEQ ID NO.4、 SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6所示氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；
所述抗体轻链可变区包含在SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所 示轻链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30个、 20个或10个修饰的氨基酸序列、或与SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9 所示氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
作为本发明的又一种优选方案，所述抗人CD19抗原的人源化单克隆抗体可 用于构建嵌合抗原受体(CAR)，CAR包含包括人源化抗人CD19结合结构域的 抗体或抗体片段、跨膜结构域、以及包含刺激结构域的胞内信号传导结构域。
作为本发明的一种改进方案，所述嵌合抗原受体依次由前导肽、靶向人 CD19抗原的人源化单链抗体、连接ScFv所用的铰链区、跨膜结构域、免疫受 体酪氨酸活化基序(CD3ζ、FcεRIγ信号链)组成。
作为本发明的另一种改进方案，所述前导肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.10 所示；所述连接ScFv所用的铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述 跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述免疫共刺激分子CD28的 核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示(在另一优选方案中，免疫共刺激分子也可为 CD137分子，核苷酸序列如如SEQ ID NO.14所示)；
所述靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体的核糖核酸序列如SEQ ID NO.21、 SEQ IDNO.22、SEQ ID NO.23所示，所述前导肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.10 所示；所述连接ScFv所用的铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述 跨膜结构域的核苷酸序列如SEQID NO.12所示。
作为本发明的又一种改进方案，构建表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体 的慢病毒表达载体pl-CAG-CD19-8h-28TM-28Z，所述慢病毒载体的启动子与终 止子之间依次连有前导肽、靶向人CD19抗原的单链抗体、连接ScFv所用的铰 链区、跨膜结构域和免疫受体酪氨酸活化基序，所述前导肽位于所述启动子下 游，所述靶向人CD19抗原的ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3所示。
作为本发明的进一步改进方案，任意慢病毒载体通过酶切的方式将前导肽、 靶向人CD19抗原的单链抗体、连接ScFv所用的铰链区、跨膜结构域和免疫受 体酪氨酸活化基序顺序的表达框连接到病毒载体基因启动子后面。
作为本发明的进一步改进方案，所述靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体 或所述表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体及其慢病毒表达载体在制备表达靶 向人CD19抗原的嵌合抗原受体免疫细胞中的应用；
所述免疫细胞为T细胞、B淋巴细胞，NK淋巴细胞、单核细胞或中性粒细胞。
本发明所述将载体导入免疫细胞的方法可以为基因枪法、电转法、病毒转导 法，本发明的一个实施方案中所述导入法为病毒转导法。
作为本发明的进一步改进方案，所述表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体 及其慢病毒表达载体制备或者表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体免疫细胞， 或利用所述表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体及其慢病毒表达载体在制备治 疗表达CD19抗原肿瘤的药物中的应用；
所述表达CD19抗原肿瘤包括B细胞急性淋巴样白血病(B-ALL)、T细胞 急性淋巴样白血病(T-ALL)、急性淋巴样白血病(ALL)、慢性髓性白血病(CML)、 慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞早幼淋巴细胞样白血病、母细胞性浆细胞 样树突状细胞肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、 毛细胞性白血病、小细胞或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生病症、MALT 淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、边缘带淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常和骨 髓增生异常综合征、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细 胞肿瘤等血液系统肿瘤。
术语“人CD19”指人的白细胞表面分化抗原19(Cluster of differentiation19protein，CD19)，是一个在B细胞肿瘤上可以检测到表达 的抗原。人CD19的氨基酸序列可见于UniProt/Swiss-Prot，ID序号为P15391， 编码人CD19的核苷酸序列可以见于ID号NM_001178098。人CD19在大多数B 细胞肿瘤，例如急性淋巴母细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病和非霍奇金淋巴 瘤上表达。
本发明术语“人源化单克隆抗体”是经人工改造的小鼠单克隆抗体，鼠源 单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术进行改造并重新表达的抗体，其大部分 氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性， 又降低了其异源性，有利于抗体应用于人体。
本发明术语“分子对接”是一种利用计算机对大分子相互作用情况进行预 测的分析手段，分子对接依据配体与受体作用的“锁-钥原 理”(lock and key principle)，模拟小分子配体与受体生物大分子相互作 用。配体与受体相互作用是分子识别的过程，主要包括静电作用、氢键作用、 疏水作用、范德华作用等，通过计算即可对分子间相互结合的模式及亲和力进 行预测。
发明中术语“单链抗体”(Single-chain antibody variable region fragment，ScFv)是指由抗体VL区氨基酸序列和VH区氨基酸序列经接头多肽 连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。
本发明中术语“嵌合抗原受体”(Chimeric antigen receptor，CAR)是 人工改造受体，能够将识别肿瘤抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞 (如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒 感染的细胞。
本发明中术语“T细胞活化相关信号”是指与T细胞活化所需要两个信号， 即T细胞表面TCR-CD3复合体与抗原肽-MHC分子结合，提供T细胞活化的第一 信号，决定T细胞的杀伤特异性。
本发明中术语“共刺激信号分子”(Co-stimulating molecules)是指免 疫细胞表面的一些粘附分子，如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、CD40等， 通过与其配体结合，激活免疫细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细 胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间。
本发明中术语“免疫受体酪氨酸活化基序”(Immunoreceptor tyrosine-baseactivation motifs，ITAM)是指免疫细胞活化相关受体(如BCR/Igα/Igβ， TCR/CD3、FcαR和FcRγ等)胞浆区所共有的以酪氨酸残基(Tyrosine，Y)为基 础的氨基酸序列基序，其特征为：两个酪氨酸残基被大约13个其它氨酸残基隔 开(YXX[L/V]X 7-11YXX[L/V])，其中酪氨酸是蛋白激酶磷酸化位点，被磷酸化 后能够与信号转导途径下游的信号分子结合，导致细胞的活化。
发明中术语“肿瘤特异性抗原”(Tumor specific antigen，TSA)是肿瘤 细胞特有的或只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞的新抗原。
发明中术语“肿瘤相关抗原”(Tumor-associated antigen，TAA)是指非 肿瘤细胞所特有的、正常细胞和其他组织上也存在的抗原，只是其含量在细胞 癌变时明显增高的抗原。
与现有技术相比，本发明具有如下技术效果：
1、本发明的目的之一在于提供靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体；本 发明的目的之二在于提供靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体，表达该嵌合抗原受 体的免疫细胞(T细胞、NK细胞、B细胞等)可有效杀伤CD19抗原阳性的肿瘤 细胞，而对CD19抗原阴性的细胞无毒副作用；本发明的目的之三在于提供表达 靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体的慢病毒表达载体；本发明的目的之四在于提 供表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体的慢病毒表达载体，在制备表达靶向人 CD19抗原的嵌合抗原受体的免疫细胞中的应用；本发明的目的之五在于提供靶 向人CD19抗原的嵌合抗原受体或表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体的慢病 毒表达载体制备的表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体的免疫细胞；本发明的 目的之六在于提供靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体或表达靶向人CD19抗原的 嵌合抗原受体的慢病毒表达载体在制备治疗表达CD19抗原肿瘤的药物中的应 用。
2、本发明公开了靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体，其包括前导肽、靶向 人CD19抗原的单链抗体、连接ScFv所用的铰链区、跨膜结构域和免疫受体酪 氨酸活化基序；将该嵌合抗原受体在免疫细胞中表达后，可有效杀伤CD19抗原 阳性的肿瘤细胞，而对CD19抗原阴性的细胞无毒副作用，因此能够用于CD19 阳性肿瘤的靶向治疗。
附图说明
图1是抗人CD19抗原的人源化单克隆抗体可变区结构模拟图；
图2是抗人CD10抗原的人源化单克隆抗体可变区结构与鼠源抗体结构的叠 合图；
图3是靶向CD19的嵌合抗原受体的结构示意图以及慢病毒表达载体设计及 鉴定的示意图；
图4是表达靶向CD19嵌合抗原受体的T细胞经过12天培养，细胞表型检 测结果；
图5是表达靶向CD19嵌合抗原受体的T细胞对CD19阳性和阴性肿瘤细胞 的杀伤情况；
图6是靶向CD19嵌合抗原受体的T细胞在经CD19阳性细胞刺激激活后的 增殖情况；
图7是靶向CD19嵌合抗原受体的T细胞在小鼠血液移植瘤模型中对CD19 阳性移植瘤的治疗情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细地描述。
实施例1、设计抗人CD19抗原的人源化单克隆抗体
(1)鼠抗人CD19抗原的单克隆抗体株FMC63轻、重链可变区的CDR区氨 基酸序列如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17以及SEQ ID NO.18、 SEQ ID NO.19、SEQ IDNO.20所示。序列在经过IMGT/BLAST数据库经序列分 析及比对，选择同源性最高人抗体序列作为改造模板。
(2)经过分子对接模拟，与抗原抗体对接关系最为密切的抗体氨基酸残基 如表1所示，对关键残基以外的骨架序列参考人源抗体骨架区序列进行人源化 修饰改造，而后对人源化抗体进行随机突变，再以抗原抗体亲和力筛选和分子 对接模拟的方法进行亲和力评估预测，优选得到抗人CD19抗原的人源化单链抗 体(ScFv)氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
表1
(3)根据人源抗体ScFv氨基酸序列使用IEDB数据库PIGS工具同源模拟 建模分别得到三个人源化改造后的抗体ScFv模拟结构，使用CHIMERA 1.11rc 分别将其与FMC63模拟结构进行叠合，计算其RMSD值作为主链结构一致性的衡 量标准，如图2所示。
实施例2、表达靶向人CD19抗原(CD19)的嵌合抗原受体的慢病毒制备
(1)制备靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体的基因序列
合成依次含前导肽(又称信号肽)、抗人CD19抗原的单链抗体ScFv，hFc 铰链区、跨膜区和胞内信号段的嵌合抗原受体序列，其结构如图3所示。其中 前导肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示； 抗人CD19抗原的人源化单链抗体hCD19-1、hCD19-2、hCD19-3的氨基酸序列 如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.21、 SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.23所示，作为对照的鼠抗人CD19抗原FMC63抗体 来源的单链抗体CD19氨基酸序列如SEQ ID NO.24所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示；hFc铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.8；跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.10 所示；胞内信号段的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。最终合成的人源化抗CD19嵌合抗原受体核苷酸序列如SEQ ID NO.26、SEQ ID NO.27、SEQ ID NO.28所示，未做人源化的鼠抗对照抗体命名 为mCD19，以其作为ScFv的嵌合抗原受体核苷酸序列如SEQ ID NO.29所示。
然后以嵌合抗原受体序列为模板进行PCR扩增，反应体系按KOD FX NEO DNA 聚合酶(购自TOYOBO公司)说明书加样，PCR反应条件为95℃预变性5min； 95℃变性10s，55℃退火15s，68℃延伸30s，30个循环。将扩增产物用1％琼 脂糖(w/v)凝胶进行鉴定，结果显示，扩增获得约2000bp的DNA片段，然后 用回收试剂盒(Promega公司)进行DNA片段回收，具体方法见说明书，回收 获得嵌合抗原受体，将DNA回收片段送南京金斯瑞生物科技公司测序。
(2)构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体pl-CAG-CD19-8h-28TM-28Z
将克隆获得的编码嵌合抗原受体的基因序列用限制性内切酶NheI和XhoI (购自Thermo公司)双酶切，同时用限制性内切酶NheI和XhoI酶切慢病毒表 达载体pRRLSIN.cPPT.EF1a-GFP.WPRE(改造自Trono实验室 pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE质粒)(http://www.addgene.org/12252/),利 用限制性内切酶NheI和XhoI酶同时酶切pRRLSIN.cPPT.EF1a-GFP.WPRE质粒， 酶切反应按说明书进行。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶DNA 片段回收试剂盒进行7113bp的DNA片段回收，然后将合成的带有NheI和XhoI 酶切位点的嵌合抗原受体序列片段用限制性内切酶NheI和XhoI酶同时酶切后， 与上述回收得到的7113bp的DNA片段进行连接，即可获得装载不同ScFv的 pl-CAG-CD19-8h-28TM-28Z嵌合抗原受体表达载体，根据装载ScFv的不同，将 嵌合抗原受体表达载体分别简称为mCD19、hCD19-1、hCD19-2、hCD19-3慢病毒 载体。
酶切反应按说明书进行。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后用琼脂糖凝胶 DNA片段回收试剂盒进行DNA片段回收，然后将目的片段和载体片段通过T4连 接酶(购自Promega公司)进行连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体， 结构如图3所示。将慢病毒载体取5μL转化大肠杆菌TOP10，30℃培养16h后 挑取单克隆，挑取的单克隆在30℃条件下培养12h后用质粒抽提试剂盒 (Invitrogen公司)抽提质粒，具体方法见说明书。抽提的质粒经限制性内切 酶HindIII酶切电泳鉴定，结果如图3所示。
实施例3、CD19抗原的嵌合抗原受体修饰T细胞的制备
(1)慢病毒的包装
本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体步骤如下：用含10％FBS(w/v)的 DMEM培养基培养293T细胞至较佳状态；然后将293T细胞以1×105/cm2的密度 传至1个75cm2的培养瓶中培养22h，保证转染时细胞汇合度为70-80％；再用 预热的含2％FBS(w/v)的DMEM培养基换液，培养2h备用；将680μL ddH2O、 20μg慢病毒载体(分别为mCD19、hCD19-1、hCD19-2、hCD19-3慢病毒载体)、 100μL 2.5mM CaCl2加入15mL离心管中，混合均匀，混匀后用移液器向混合液 中逐滴加入2×HBS，同时用10mL移液器吹打混匀，混匀后室温静置15min， 然后将混合液逐滴加入上述制备的细胞中，继续培养12-16h后，用含10％ FBS(w/v)的DMEM培养基更换培液。细胞在培养48h、72h后分别收集细胞上清 用于病毒纯化。
(2)慢病毒的纯化
将病毒上清收集在50ml离心管中，3000r/min离心10min然后用0.45μm 滤膜过滤，滤液3000r/min离心10min后转移至新的50mL离心管；根据病毒上 清量，分别加入50％PEG6000(w/v)、4M NaCl，再用医用盐水定容到总体积 35mL(PEG6000终浓度为8.5％、NaCl终浓度为0.3M)，4℃冰箱静置90min， 30min/次颠倒混匀；样品于4℃、5000r/min条件下离心30min，弃尽上清，用 200μL含10％FBS的DMEM培养基重悬病毒，1.5mL EP管分装，每管40μL， -80℃保存备用。
(3)慢病毒滴度测定
1)病毒感染293T细胞
提前12h将293T细胞铺板至含10％FBS(w/v)DMEM培养液的24孔板中，确 保感染病毒前细胞汇合度在40％-70％之间，且细胞状态佳。向每个孔中加入1μL 的6g/mLPolybrene溶液，而后取已纯化的慢病毒载体1μL，用医用生理盐 水稀释10倍制成工作液分别加入对应孔中，24h后用含10％FBS(w/v)的DMEM 培养基换液，感染72h后1000r/min离心5min以收集细胞，抽提基因组。
2)抽提基因组
将收集的细胞用PBS重悬，1000r/min离心5min，弃尽上清，重复1次； 再用200μLPBS重悬细胞，并加入20μL蛋白酶K，200μL AL裂解液，吹打 混匀，56℃孵育10min；然后加入200μL预冷的乙醇，上下颠倒混匀，将溶液 转移至过滤柱中，室温静置1min，8000r/min离心1min，弃尽上清；接着加入 700μL AW1溶液，8000r/min离心1min，弃尽上清；再加入500μLAW2溶液， 8000r/min离心1min，弃尽上清，并将过滤柱转移至新的1.5mL EP管中，开盖 静置1min以挥发乙醇；加入50μL灭菌ddH2O(60℃预热)，静置2min，12000r/min 离心1min。(基因组抽提试剂盒为QIAamp DNA Blood Mini Kit购于Qiagen 公司)。
3)qRT-PCR测定病毒滴度
反应体系如下：SYBR Premix Ex Taq II(2×)10L，上游引物(GAG up)1L，下游引物(GAG dn)1L，抽提的基因组1L，RNase-Free dH2O 7L， 每个样品、标准品至少3个重复孔。然后按如下程序进行扩增：95℃预变性30s， 95℃变性5s，60℃退火30s，72℃延伸30s，反应结束后，用分析软件分析数 据，根据标准曲线计算病毒滴度，结果用TU/mL表示。
(4)慢病毒感染T细胞
1)人外周血单核细胞的分离
用加有抗凝剂的采血管采集正常人外周血约60mL，分装于两个50mL离心管， 每管各30mL，分别加入7.5mL羟乙基淀粉稀释。离心管室温静置自然沉降约 30min，收集上层血浆，而后1400r/min离心15min后用生理盐水重悬沉淀。将 细胞悬液以体积比1:1的比例小心加载到淋巴细胞分离液上，400g梯度离心15min，离心机降速DEC设置为5。离心后，离心管由上至下分为四层，即血浆 层、环状乳白色外周血淋巴细胞(PBMC)层、透明分离液层和红细胞层。小心 吸取第二层的PBMC至新离心管并用生理盐水洗涤2次，第一次400g离心10min， 第二次1100r/min离心5min，而后以生理盐水重悬细胞，移液器吸取PBMC细 胞悬液并转移至培养瓶中，以含有10％FBS(w/v)的RPMI 1640完全培养基培养。
2)慢病毒载体感染T淋巴细胞
用含10％FBS的RPMI 1640完全培养基培养新制备的单个核细胞PBMC，第 1天加入抗CD3单克隆抗体活化；前3天进行慢病毒感染；分别加入20感染复 数(MOI)的mCD19、hCD19-1、hCD19-2、hCD19-3慢病毒载体，未感染的外周 血淋巴细胞(PBMC)作为空白对照；24h后将培养基更换为含有500IU/mL重组 人IL-2的RPMI 1640完全培养基，继续培养10-20天。
实施例4、靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体(CAR)表达检测
采用流式细胞术检测CAR在T细胞中的表达。将培养至14天的已感染病毒 的T细胞，300g离心5min，弃尽上清以收集细胞；用含有1％FBS(w/v)的PBS 溶液重悬细胞，并将细胞调整密度为1×106个/mL；将收集的细胞分装为6管， 每管100μL，向每管细胞中加入20μLFITC标记小鼠抗人CD3单克隆抗体 (Biolegend公司)、PerCP标记小鼠抗人CD8单克隆抗体抗体(Biolegend公 司)、Alexa Fluor 647标记的Protein L(Thermo Fisher公司)；4℃孵育 30min，PBS溶液洗涤2次，上流式细胞仪进行检测，结果如图4所示，FL1通 道为CD3阳性率，FL4通道的Protein L阳性率表明T细胞CAR表达阳性率在 70％以上，FL3通道为CD3阳性细胞及Protein L阳性细胞中CD8阳性细胞的比 例。以上结果显示mCD19、hCD19-1、hCD19-2、hCD19-3慢病毒载体成功转染T 细胞，CAR表达阳性率在70％以上，且有40％，能够用于进一步的鉴定实验。
实施例5、表达靶向CD19的嵌合抗原受体的T淋巴细胞抗肿瘤效果验证
以稳定表达萤火虫荧光素酶的CD19阳性Raji细胞(简称为Raji-luc)以 及稳定表达萤火虫荧光素酶及人CD19抗原的K562细胞(简称为 K562-hCD19-luc)作为靶细胞，同时以稳定表达荧光素酶的CD19阴性K562细胞(简称为K562-luc)作为对照，效应细胞为mCD19、hCD19-1、hCD19-2、hCD19-3 慢病毒载体感染T细胞制备得到的CAR-T细胞，并以未感染病毒的PBMC细胞作 为对照。将靶细胞按照密度1×105个/mL接种96孔板中，每孔100μL；而后 按照10:1、5:1、1:1的效靶比铺效应细胞，每组铺3复孔，单孔细胞混合液总 体积为200L。细胞混匀后置于5％CO2、37℃培养箱培养24h，而后将96孔板 利用水平转子离心机300g离心5min，每孔吸取上清130L用于后续杀伤后细 胞因子释放的ELISA检测，离心后的孔板底部细胞使用Steady-Glo Luciferase Assay System(Promega Cat.#E2520)试剂盒提供的标准方法检 测杀伤效果，杀伤率用下列公式计算：
不同效靶比CAR-T细胞的杀伤结果如图5A/B/C所示，而24h后CAR-T细胞 的IFN-因子释放结果如图5D所示。结果表明，表达靶向CD19抗原的嵌合抗 原受体的T淋巴细胞对CD19阳性肿瘤细胞具有显著杀伤作用，而对CD19阴性 细胞杀伤较弱且与PBMC组相差不显著。ELISA实验表明CAR-T细胞释放IFN-， 表明CAR-T细胞的刺激信号工作正常。同时，通过比较不同CAR-T细胞的杀伤 效果，发现hCD19-3慢病毒转染组CAR-T对CD19阳性细胞杀伤效果与改造前 mCD19慢病毒转染组无显著差异，但其对于CD19阴性细胞的杀伤效果显著降低， 显示对ScFv经过人源化改造后的嵌合抗原受体改善了特异性杀伤的性能。
实施例6、表达靶向CD19的嵌合抗原受体的T淋巴细胞刺激后长期增殖及 细胞因子分泌能力检测
(1)表达靶向CD19的嵌合抗原受体的T淋巴细胞刺激后长期增殖能力检测
将病毒载体感染的CAR-T细胞体外刺激活化并长期培养，定期使用流式细 胞术检测其中CD3、protein-L双阳性的CAR-T细胞比例，而后以CAR-T细胞比 例乘细胞总数计算出CAR-T细胞数并绘制增殖曲线，以检验CAR-T细胞是否具 备刺激后的长期增殖能力，评估其临床治疗潜力。首先要对CAR-T细胞计数并 检测CD3、protein-L双阳性群体中CD4、CD8阳性细胞的比例，而后以CD19 阳性的Raji细胞及转染表达CD19的K562细胞(简称为K562-hCD19)为靶细 胞与CAR-T共培养以刺激CAR-T细胞活化，以CD19阴性的K562细胞为对照，将CAR-T细胞与靶细胞以效靶比5:1共培养，24孔板铺板靶细胞5×104个/孔， 置于5％CO2、37℃培养箱培养24h，而后将培养板300g离心5min后收集各孔上 清，采用ELISA方法检测细胞因子释放情况。刺激活化48小时(h)后1:1比 例补加新鲜培养基，分别于刺激后第3天，第7天对CAR-T细胞进行计数，并 同时流式检测CD3、protein-L双阳性CAR-T细胞的CD4、CD8阳性比例，以及 CD4，CD8阳性细胞中CD45RA+/RO-/CD62L+，CD45RA-/RO+/CD62L+以及 CD45RA+/-/CD62L-细胞比例；如果第7天细胞数量依然有增加，则铺入靶细胞 进行第二次刺激。进行N次刺激后细胞数目不再增加时，统计分析CAR-T细胞 在靶细胞刺激期间的增殖曲线，结果如图6A所示。实验显示，hCD19-2组与 hCD19-3组CAR-T细胞刺激后增殖能力与mCD19组没有显著差异，表明这两个 带有人源化ScFv的抗原嵌合受体T细胞维持了与mCD19大体相当的刺激后增殖 能力。
(2)表达靶向CD19的嵌合抗原受体的T淋巴细胞刺激后细胞因子释放能 力检测
24孔板铺板靶细胞5×104个/孔并将CAR-T细胞与靶细胞以效靶比5:1共 培养，置于5％CO2、37℃培养箱培养24h后，300g离心5分钟后收集各孔上清。 刺激48h后1:1比例补加新鲜培养基，如果第7天细胞数量依然有增加，则铺 入靶细胞进行第二次刺激，并于刺激活化24h后收集上清。进行N次刺激后细 胞数目不再增加时，最后一次收集细胞培养上清。实验发现，CAR-T细胞在经 历三次刺激活化后细胞数目不再增殖，分别在每次刺激活化24h后收集细胞上 清，离心后ELISA检测IFN-、IL-2、TNF-因子释放量，结果如图6B/C/D 所示。实验表明，同样经过三次刺激情况下，hCD19-3慢病毒感染组具有较好 的IFN-、IL-2、TNF-因子释放能力，显示其长期刺激后的因子释放性能较 mCD19有一定的改善，相较mCD19CAR-T细胞具有更好的临床应用前景。
实施例7、表达靶向CD19的嵌合抗原受体的T淋巴细胞在动物模型中的抗 肿瘤效果验证
建立人CD19阳性肿瘤细胞系的小鼠移植瘤模型用于验证表达靶向CD19的 嵌合抗原受体的T淋巴细胞在动物模型中的抗肿瘤效果。
体内验证使用小鼠为NOD.Cg-PrkdcscidII2rgtm1Sug/JicCrl，简称NOG小鼠， 由日本实验动物研究所(CIEA)的Mamoru Ito培育而成，为通过杂交NOD/SCID 小鼠和γ-链IL-2受体敲除(IL2rγKO)小鼠所建立的一个免疫功能严重不全 的小鼠品系，为国际上CAR-T体内相关成瘤实验的最常见品系。小鼠购于北京 维通利华实验动物技术有限公司，于SPF级环境下安装国家相关实验动物法规 要求饲养及实验。体内验证使用的成瘤靶向细胞为前期体外验证使用的稳定表 达萤火虫荧光素酶的CD19阳性细胞系Raji(简称Raji-luc)。治疗注射的效 应细胞为慢病毒载体mCD19、hCD19-1、hCD19-2、hCD19-3感染的CAR-T细胞， 对照为未感染病毒的PBMC细胞。
具体实验方案：4-6周龄(w)雌性NOG小鼠于维通利华购买，于动物房饲 养3天(d)以上适应环境，后可用于后续实验。小鼠通过耳号标记以便于区分。 成瘤当天计为0d，前一天成瘤细胞系(Raji-luc)更换培养基，成瘤当天吸去 培养基，PBS清洗，胰酶消化成单个细胞，计数，PBS重悬为1×107/mL的细胞 注射液，注射前将细胞混匀，尾静脉注射100L肿瘤细胞注射液。成瘤后3d 尾静脉注射效应CAR-T细胞注射前一天给效应细胞换液，注射当天吸去培养基， PBS清洗，胰酶消化成单个细胞，计数，PBS重悬为1×107/mL的细胞注射液， 尾静脉注射100L效应细胞注射液。分组为前面成瘤后小鼠随机分组，每组8 只，对照组注射未感染慢病毒载体的PBMC细胞，实验组为转染mCD19、hCD19-1、 hCD19-2、hCD19-3慢病毒表达载体的效应CAR-T细胞。之后于8d、15d、22d、 29d、43d活体成像，显示肿瘤生长情况。期间每天观察小鼠存活情况并记录。
活体成像原理：成瘤细胞为表达萤火虫荧光蛋白Luciferase，注射与小鼠 体内之后，可以通过腹腔注射Luciferase的底物D-Luciferin，使得肿瘤细胞 自发荧光，通过PerkinElmer公司的IVS活体成像系统拍照成像，可以通过发 光情况判断肿瘤的生长情况。
活体成像具体流程：成像当天，按150mg/kg腹腔注射底物D-Luciferin， 6min左右小鼠放于活体成像系统气体麻醉室中麻醉(麻醉时间3min左右)， 10min将小鼠躺放于活体成像仪中成像，对肿瘤细胞分布与生长情况进行观测。 成像结果及小鼠生存曲线如图7所示，结果显示hCD19-3慢病毒转染CAR-T细 胞显示出优于其他组别的良好抗肿瘤效果，该组8只实验小鼠在30d时全部存 活。
综合以上结果，相对未做人源化改造的鼠抗人CD19嵌合抗原受体T细胞， 应用本发明所述的人源化改造方案得到的抗人CD19抗原的嵌合抗原受体T细胞 在体外细胞实验中杀伤特异性更好，而在体内动物实验中呈现出更好的治疗效 果，具有临床上治疗儿童和成人复发B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)，慢 性淋巴细胞白血病(CLL)，和B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)等CD19阳性血 液系统肿瘤的应用价值。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管 参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解， 可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的 宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
抗人CD19抗原的单链人源化单克隆抗体（ScFv）氨基酸序列
SEQ ID NO.1：
DIQMTQSTSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDGTPKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLEQEDFATYYCQQGNTLPYTFGGGTRLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVAPSQTLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKALEWLALIWGSETTYYNTSLKSRLTIIKDTSKNQVVLKMTNMQTDDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGSSVTVSS
SEQ ID NO.2：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAPRLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGGGTRLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKALEWLGVIWGSETTYYNSSLKTRLTISKDNSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGSSVTVSS
SEQ ID NO.3：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGGGTRLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKALEWLALIWGSETTYYSTSLKTRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGSSVTVSS
抗体重链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO.4：
QVQLQESGPGLVAPSQTLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKALEWLALIWGSETTYYNTSLKSRLTIIKDTSKNQVVLKMTNMQTDDTAVYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGSSVTVSS
SEQ ID NO.5：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKALEWLGVIWGSETTYYNSSLKTRLTISKDNSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGSSVTVSS
SEQ ID NO.6：
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPGKALEWLALIWGSETTYYSTSLKTRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGSSVTVSS
轻链可变区氨基酸序列
SEQ ID NO.7：
DIQMTQSTSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPDGTPKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLEQEDFATYYCQQGNTLPYTFGGGTRLEIK
SEQ ID NO.8：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAPRLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGGGTRLEIK
SEQ ID NO.9：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISKYLNWYQQKPGKAPKLLIYHTSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTLPYTFGGGTRLEIK
前导肽的核糖核酸序列
SEQ ID NO.10:
atgggatggagctgtatcatcctcttcctggtagcaacagctacaggcgtgcacagt
所述连接ScFv所用的铰链区的核苷酸序列
SEQ ID NO.11:
gcggccgccgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaa
跨膜结构域的核苷酸序列
SEQ ID NO.12:
gatcccaaactctgctacctgctggatggaatcctcttcatctatggtgtcattctcactgccttgttcctg
CD28的核苷酸序列
SEQ ID NO.13:
ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc
CD137的核苷酸序列
SEQ ID NO.14:
gttaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg
FMC63抗体CDR区序列
SEQ ID NO.15：
QDISKY
SEQ ID NO.16：
HTS
SEQ ID NO.17：
QQGNTLPYT
SEQ ID NO.18：
GVSLPDYG
SEQ ID NO.19：
IWGSETT
SEQ ID NO.20：
AKHYYYGGSYAMDY
靶向人CD19抗原的人源化单链抗体核苷酸序列
SEQ ID NO.21：
gacatccagatgacccagagcacaagctctctgagcgccagcgtgggagacagagtgaccatcacttgcagggccagccaggacatcagcaagtacctgaattggtaccagcagaagcccgacggcacacctaagctgctgatctaccacacaagcagactgcacagcggagtgcctagcagattcagcggcagcggaagcggaaccgactacaccctgaccatcagcagcctggagcaggaggacttcgccacctactactgccagcagggcaacacactgccttacaccttcggcggaggcacaagactggagatcaagggcagcacaagcggaagcggcaaaccaggaagcggagaaggaagcaccaagggacaggtgcagctgcaggaatcaggaccaggactggtggctccttctcagaccctgagcctgacttgcaccgtgtcaggagtgtccctgccagattacggcgtgtcttggatcagacagccccccagaaaggccctggagtggctggctctgatttggggaagcgagaccacctactacaacaccagcctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaccagcaagaaccaggtggtgctgaagatgaccaacatgcagaccgacgacaccgccgtgtactattgcgccaagcactactactacggcggaagctacgccatggactattggggccagggaagcagcgtgaccgtgtctagc
SEQ ID NO.22：
gacatccagatgacccagagcccttcttctctgagcgccagcgtgggagacagagtgaccatcacttgcagggccagccaggacatcagcaagtacctgaattggtaccagcagaagccaggcaaggcccctaagctgctgatctaccacacatctagcctgcagagcggagtgcctagcagattcagcggcagcggaagcggaaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagccagaggacttcgccacctactactgccagcagggcaacacactgccttacaccttcggcggaggcacaagactggagatcaagggcagcacaagcggaagcggcaaaccaggaagcggagaaggaagcaccaagggacaggtgcagctgcaggaaagcggaccaggactggtgaagccttctcagaccctgagcctgacttgcaccgtgtcaggagtgtccctgccagattacggcgtgtcttggatcagacagcccccaggaaaggccctggagtggctggctctgatttggggaagcgagaccacctactacagcaccagcctgaagacccggctgacaatcagcaaggacaccagcaagaaccaggtggtgctgaccatgaccaacatggaccccgtggacaccgccacctactattgcgccaagcactactactacggcggaagctacgccatggactattggggccagggaagcagcgtgaccgtgtctagc
SEQ ID NO.23：
gacatccagatgacccagagcccttcttctctgagcgccagcgtgggagacagagtgaccatcacttgcagggccagccaggacatcagcaagtacctgaattggtaccagcagaagccaggcaaggcccctagactgctgatctaccacacaagcagactgcacagcggagtgcctagcagattcagcggcagcggaagcggaaccgactacaccctgaccatcagcagcctgcagccagaggacttcgccacctactactgccagcagggcaacacactgccttacaccttcggcggaggcacaagactggagatcaagggcagcacaagcggaagcggcaaaccaggaagcggagaaggaagcaccaagggacaggtgcagctgcaggaaagcggaccaggactggtgaagccttctcagaccctgagcctgacttgcaccgtgtcaggagtgtccctgccagattacggcgtgtcttggatcagacagcccccaggaaaggccctggagtggctgggagtgatttggggaagcgagaccacctactacaacagcagcctgaagacccggctgaccatcagcaaggacaacagcaagaaccaggtggtgctgaccatgaccaacatggaccccgtggacaccgccacctactattgcgccaagcactactactacggcggaagctacgccatggactattggggccagggaagcagcgtgaccgtgtctagc
FMC63单链抗体氨基酸、核苷酸序列
SEQ ID NO.24：
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS
SEQ ID NO.25：
gacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggagcaggaggacatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggagatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggagagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgtaccgtgtccggcgtgtccctgcccgactacggcgtgtcctggatccggcagccccctaggaagggcctggagtggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgtgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgtccagc
靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体的核苷酸序列
SEQ ID NO.26：
atggctctgccagtgacagctctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacccgacatccagatgacccagagcacaagctctctgagcgccagcgtgggagacagagtgaccatcacttgcagggccagccaggacatcagcaagtacctgaattggtaccagcagaagcccgacggcacacctaagctgctgatctaccacacaagcagactgcacagcggagtgcctagcagattcagcggcagcggaagcggaaccgactacaccctgaccatcagcagcctggagcaggaggacttcgccacctactactgccagcagggcaacacactgccttacaccttcggcggaggcacaagactggagatcaagggcagcacaagcggaagcggcaaaccaggaagcggagaaggaagcaccaagggacaggtgcagctgcaggaatcaggaccaggactggtggctccttctcagaccctgagcctgacttgcaccgtgtcaggagtgtccctgccagattacggcgtgtcttggatcagacagccccccagaaaggccctggagtggctggctctgatttggggaagcgagaccacctactacaacaccagcctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaccagcaagaaccaggtggtgctgaagatgaccaacatgcagaccgacgacaccgccgtgtactattgcgccaagcactactactacggcggaagctacgccatggactattggggccagggaagcagcgtgaccgtgtctagcctcgagaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgcgacgaattcttctgggtgctggtcgtggtgggtggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtgaggagcaagcggagcagaggcggccacagcgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa
SEQ ID NO.27：
atggctctgccagtgacagctctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacccgacatccagatgacccagagcccttcttctctgagcgccagcgtgggagacagagtgaccatcacttgcagggccagccaggacatcagcaagtacctgaattggtaccagcagaagccaggcaaggcccctaagctgctgatctaccacacatctagcctgcagagcggagtgcctagcagattcagcggcagcggaagcggaaccgacttcaccctgaccatcagcagcctgcagccagaggacttcgccacctactactgccagcagggcaacacactgccttacaccttcggcggaggcacaagactggagatcaagggcagcacaagcggaagcggcaaaccaggaagcggagaaggaagcaccaagggacaggtgcagctgcaggaaagcggaccaggactggtgaagccttctcagaccctgagcctgacttgcaccgtgtcaggagtgtccctgccagattacggcgtgtcttggatcagacagcccccaggaaaggccctggagtggctggctctgatttggggaagcgagaccacctactacagcaccagcctgaagacccggctgacaatcagcaaggacaccagcaagaaccaggtggtgctgaccatgaccaacatggaccccgtggacaccgccacctactattgcgccaagcactactactacggcggaagctacgccatggactattggggccagggaagcagcgtgaccgtgtctagcctcgagaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgcgacgaattcttctgggtgctggtcgtggtgggtggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtgaggagcaagcggagcagaggcggccacagcgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa
SEQ ID NO.28：
atggctctgccagtgacagctctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacccgacatccagatgacccagagcccttcttctctgagcgccagcgtgggagacagagtgaccatcacttgcagggccagccaggacatcagcaagtacctgaattggtaccagcagaagccaggcaaggcccctagactgctgatctaccacacaagcagactgcacagcggagtgcctagcagattcagcggcagcggaagcggaaccgactacaccctgaccatcagcagcctgcagccagaggacttcgccacctactactgccagcagggcaacacactgccttacaccttcggcggaggcacaagactggagatcaagggcagcacaagcggaagcggcaaaccaggaagcggagaaggaagcaccaagggacaggtgcagctgcaggaaagcggaccaggactggtgaagccttctcagaccctgagcctgacttgcaccgtgtcaggagtgtccctgccagattacggcgtgtcttggatcagacagcccccaggaaaggccctggagtggctgggagtgatttggggaagcgagaccacctactacaacagcagcctgaagacccggctgaccatcagcaaggacaacagcaagaaccaggtggtgctgaccatgaccaacatggaccccgtggacaccgccacctactattgcgccaagcactactactacggcggaagctacgccatggactattggggccagggaagcagcgtgaccgtgtctagcctcgagaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgcgacgaattcttctgggtgctggtcgtggtgggtggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtgaggagcaagcggagcagaggcggccacagcgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa
SEQ ID NO.29：
atggctctgccagtgacagctctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacccgacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggagcaggaggacatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggagatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggagagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgtaccgtgtccggcgtgtccctgcccgactacggcgtgtcctggatccggcagccccctaggaagggcctggagtggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgtgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgtccagcctcgagaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgcgacgaattcttctgggtgctggtcgtggtgggtggcgtgctggcctgctacagcctgctggtgacagtggccttcatcatcttttgggtgaggagcaagcggagcagaggcggccacagcgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa

Claims (10)

1.靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体由轻链可变区、重链可变区、IgG Fc恒定区构成；抗人CD19抗原的人源化单链抗体(ScFv)氨基酸序列如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体，其特征在于：所述抗体重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示；所述轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。
3.根据权利要求1所述的靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体，其特征在于：所述抗体重链可变区包含在SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示重链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列、或与SEQID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示氨基酸序列具有95-99％同一性的序列；
所述抗体轻链可变区包含在SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示轻链可变区的氨基酸序列中具有至少一个、两个或三个修饰但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列、或与SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示氨基酸序列具有95-99％同一性的序列。
4.根据权利要求1所述的靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体，其特征在于：所述抗人CD19抗原的人源化单克隆抗体可用于构建嵌合抗原受体(CAR)，CAR包含包括人源化抗人CD19结合结构域的抗体或抗体片段、跨膜结构域、以及包含刺激结构域的胞内信号传导结构域。
5.根据权利要求4所述的靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体，其特征在于：所述嵌合抗原受体依次由前导肽、靶向人CD19抗原的人源化单链抗体、连接ScFv所用的铰链区、跨膜结构域、免疫受体酪氨酸活化基序(CD3ζ、FcεRIγ信号链)组成。
6.根据权利要求5所述的靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体，其特征在于：所述前导肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述连接ScFv所用的铰链区的核苷酸序列如SEQ IDNO.11所示，所述跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述免疫共刺激分子CD28的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
7.根据权利要求5所述的靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体，其特征在于：构建表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体的慢病毒表达载体，所述慢病毒载体的启动子与终止子之间依次连有前导肽、靶向人CD19抗原的单链抗体、连接ScFv所用的铰链区、跨膜结构域和免疫受体酪氨酸活化基序，所述前导肽位于所述启动子下游，所述靶向人CD19抗原的ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
8.根据权利要求7所述的靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体，其特征在于：任意慢病毒载体通过酶切的方式将前导肽、靶向人CD19抗原的单链抗体、连接ScFv所用的铰链区、跨膜结构域和免疫受体酪氨酸活化基序顺序的表达框连接到病毒载体基因启动子后面。
9.根据权利要求8所述的靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体，其特征在于：所述靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体或所述表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体及其慢病毒表达载体在制备表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体免疫细胞中的应用；
所述免疫细胞为T细胞、B淋巴细胞，NK淋巴细胞、单核细胞或中性粒细胞。
10.根据权利要求8所述的靶向人CD19抗原的人源化单克隆抗体，其特征在于：所述表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体及其慢病毒表达载体制备或者表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体免疫细胞，或利用所述表达靶向人CD19抗原的嵌合抗原受体及其慢病毒表达载体在制备治疗表达CD19抗原肿瘤的药物中的应用；
所述表达人CD19抗原肿瘤包括儿童和成人复发B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)。
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Cited By (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107880128A (zh) * 2017-12-21 2018-04-06 常州费洛斯药业科技有限公司 一种抗cd19的全人源抗体或抗体片段及其方法和应用
CN108047332A (zh) * 2018-01-15 2018-05-18 浙江阿思科力生物科技有限公司 以cd19为靶点的特异性抗体、car-nk细胞及其制备和应用
WO2018201794A1 (zh) * 2017-05-02 2018-11-08 重庆精准生物技术有限公司 抗人cd19抗原的嵌合抗原受体及其应用
CN108840931A (zh) * 2018-06-29 2018-11-20 生研医药科技（武汉）有限公司 抗cd19的单克隆抗体及其制备方法与应用
CN109535260A (zh) * 2018-11-22 2019-03-29 东南大学 一种靶向cd46的人源嵌合抗原受体及其应用
CN109879966A (zh) * 2018-12-29 2019-06-14 博生吉医药科技(苏州)有限公司 基于鼠源cd19抗体的人源化设计及表达验证
EP3517125A1 (en) * 2018-01-24 2019-07-31 Xuanwu Hospital of Capital Medical University Chimeric antigen receptor for efficient targeted proliferation in vitro and uses thereof
WO2019161796A1 (en) * 2018-02-23 2019-08-29 Beijing Meikang Geno-Immune Biotechnology Co., Ltd. A cd19-based chimeric antigen receptor and application thereof
CN110950954A (zh) * 2018-09-26 2020-04-03 重庆精准生物技术有限公司 抗cd123人源化单链抗体及其应用
WO2020108090A1 (en) * 2018-11-29 2020-06-04 Zhejiang Ruijiamei Biotech Co., Ltd. Car-t cells with humanized cd19 scfv with mutation in cdr 1 region
CN111253487A (zh) * 2018-12-03 2020-06-09 广东东阳光药业有限公司 Cd19抗体及其应用
WO2020155310A1 (zh) * 2019-01-28 2020-08-06 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种新型scFv氨基酸序列、包含其的嵌合抗原受体及其应用
CN111733186A (zh) * 2020-07-03 2020-10-02 天津英科赛奥科技有限公司 靶向cd19的人源化嵌合抗原受体制备及其应用
WO2020212756A3 (en) * 2019-04-18 2020-12-03 Genkin Dmitry Dmitrievich Reprogramming of polymorphonuclear leukocytes
CN112125976A (zh) * 2018-01-26 2020-12-25 重庆精准生物技术有限公司 改造的铰链及其在构建car骨架中的应用
CN113698491A (zh) * 2020-05-22 2021-11-26 重庆精准生物技术有限公司 融合蛋白及靶向cd19的car及其应用
CN113728096A (zh) * 2019-12-17 2021-11-30 合源生物科技(天津)有限公司 一种靶向cd19的嵌合抗原受体及其用途
WO2022121880A1 (zh) * 2020-12-08 2022-06-16 南京北恒生物科技有限公司 靶向cd19的人源化抗体及其用途
CN115335405A (zh) * 2020-04-02 2022-11-11 南京驯鹿医疗技术有限公司 全人源抗人cd22的嵌合抗原受体及其应用
CN116253794A (zh) * 2022-08-19 2023-06-13 首都医科大学宣武医院 一种用于car-t细胞调控的抗体及其应用
CN116496397A (zh) * 2023-04-03 2023-07-28 上海科棋药业科技有限公司 靶向cd19 car-t细胞人源化抗体
CN116514992A (zh) * 2022-11-07 2023-08-01 武汉波睿达生物科技有限公司 一种信号肽序列优化的靶向cd19的嵌合抗原受体及其应用
CN116589598A (zh) * 2023-02-27 2023-08-15 武汉波睿达生物科技有限公司 共表达fosb的嵌合抗原受体及其应用
WO2023208157A1 (zh) * 2022-04-29 2023-11-02 上海先博生物科技有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101233156A (zh) * 2005-06-20 2008-07-30 米德列斯公司 Cd19抗体及其用途
CN106544365A (zh) * 2016-10-25 2017-03-29 山东兴瑞生物科技有限公司 一种人抗cd19嵌合抗原受体修饰的cik的制备方法及应用
CN106554414A (zh) * 2015-09-18 2017-04-05 科济生物医药（上海）有限公司 抗cd19全人抗体以及靶向cd19的免疫效应细胞

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101233156A (zh) * 2005-06-20 2008-07-30 米德列斯公司 Cd19抗体及其用途
CN106554414A (zh) * 2015-09-18 2017-04-05 科济生物医药（上海）有限公司 抗cd19全人抗体以及靶向cd19的免疫效应细胞
CN106544365A (zh) * 2016-10-25 2017-03-29 山东兴瑞生物科技有限公司 一种人抗cd19嵌合抗原受体修饰的cik的制备方法及应用

Cited By (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018201794A1 (zh) * 2017-05-02 2018-11-08 重庆精准生物技术有限公司 抗人cd19抗原的嵌合抗原受体及其应用
CN107880128B (zh) * 2017-12-21 2021-03-02 常州费洛斯药业科技有限公司 一种抗cd19的全人源抗体或抗体片段及其方法和应用
CN107880128A (zh) * 2017-12-21 2018-04-06 常州费洛斯药业科技有限公司 一种抗cd19的全人源抗体或抗体片段及其方法和应用
CN108047332B (zh) * 2018-01-15 2021-08-24 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 以cd19为靶点的特异性抗体、car-nk细胞及其制备和应用
CN108047332A (zh) * 2018-01-15 2018-05-18 浙江阿思科力生物科技有限公司 以cd19为靶点的特异性抗体、car-nk细胞及其制备和应用
EP3517125A1 (en) * 2018-01-24 2019-07-31 Xuanwu Hospital of Capital Medical University Chimeric antigen receptor for efficient targeted proliferation in vitro and uses thereof
CN112125976A (zh) * 2018-01-26 2020-12-25 重庆精准生物技术有限公司 改造的铰链及其在构建car骨架中的应用
CN112125976B (zh) * 2018-01-26 2022-06-03 重庆精准生物技术有限公司 改造的铰链及其在构建car骨架中的应用
WO2019161796A1 (en) * 2018-02-23 2019-08-29 Beijing Meikang Geno-Immune Biotechnology Co., Ltd. A cd19-based chimeric antigen receptor and application thereof
CN108840931A (zh) * 2018-06-29 2018-11-20 生研医药科技（武汉）有限公司 抗cd19的单克隆抗体及其制备方法与应用
CN110950954B (zh) * 2018-09-26 2021-06-25 重庆精准生物技术有限公司 抗cd123人源化单链抗体及其应用
CN110950954A (zh) * 2018-09-26 2020-04-03 重庆精准生物技术有限公司 抗cd123人源化单链抗体及其应用
CN109535260A (zh) * 2018-11-22 2019-03-29 东南大学 一种靶向cd46的人源嵌合抗原受体及其应用
CN109535260B (zh) * 2018-11-22 2021-08-10 东南大学 一种靶向cd46的人源嵌合抗原受体及其应用
JP2022514815A (ja) * 2018-11-29 2022-02-16 ジョージアン ルイジアメイ バイオテック カンパニー リミテッド ＣＤＲ１領域に突然変異したヒト化ＣＤ１９ ｓｃＦｖを有するＣＡＲ－Ｔ細胞
WO2020108090A1 (en) * 2018-11-29 2020-06-04 Zhejiang Ruijiamei Biotech Co., Ltd. Car-t cells with humanized cd19 scfv with mutation in cdr 1 region
JP7232547B2 (ja) 2018-11-29 2023-03-03 ジョージアン ルイジアメイ バイオテック カンパニー リミテッド ＣＤＲ１領域に突然変異したヒト化ＣＤ１９ ｓｃＦｖを有するＣＡＲ－Ｔ細胞
CN111253487A (zh) * 2018-12-03 2020-06-09 广东东阳光药业有限公司 Cd19抗体及其应用
CN111253487B (zh) * 2018-12-03 2024-02-02 广东东阳光药业股份有限公司 Cd19抗体及其应用
WO2020114358A1 (zh) * 2018-12-03 2020-06-11 广东东阳光药业有限公司 Cd19抗体及其应用
CN109879966A (zh) * 2018-12-29 2019-06-14 博生吉医药科技(苏州)有限公司 基于鼠源cd19抗体的人源化设计及表达验证
CN109879966B (zh) * 2018-12-29 2021-07-20 博生吉医药科技(苏州)有限公司 基于鼠源cd19抗体的人源化设计及表达验证
US11713348B2 (en) 2019-01-28 2023-08-01 Guangdong Zhaotai Invivo Biomedicine Co., Ltd ScFv amino acid sequence, chimeric antigen receptor containing same and application thereof
WO2020155310A1 (zh) * 2019-01-28 2020-08-06 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种新型scFv氨基酸序列、包含其的嵌合抗原受体及其应用
WO2020212756A3 (en) * 2019-04-18 2020-12-03 Genkin Dmitry Dmitrievich Reprogramming of polymorphonuclear leukocytes
CN113728096B (zh) * 2019-12-17 2023-10-20 合源生物科技(天津)有限公司 一种靶向cd19的嵌合抗原受体及其用途
CN113728096A (zh) * 2019-12-17 2021-11-30 合源生物科技(天津)有限公司 一种靶向cd19的嵌合抗原受体及其用途
CN115335405A (zh) * 2020-04-02 2022-11-11 南京驯鹿医疗技术有限公司 全人源抗人cd22的嵌合抗原受体及其应用
CN115335405B (zh) * 2020-04-02 2024-02-23 南京驯鹿生物技术股份有限公司 全人源抗人cd22的嵌合抗原受体及其应用
CN113698491B (zh) * 2020-05-22 2024-04-30 重庆精准生物技术有限公司 融合蛋白及靶向cd19的car及其应用
CN113698491A (zh) * 2020-05-22 2021-11-26 重庆精准生物技术有限公司 融合蛋白及靶向cd19的car及其应用
CN111733186A (zh) * 2020-07-03 2020-10-02 天津英科赛奥科技有限公司 靶向cd19的人源化嵌合抗原受体制备及其应用
WO2022121880A1 (zh) * 2020-12-08 2022-06-16 南京北恒生物科技有限公司 靶向cd19的人源化抗体及其用途
WO2023208157A1 (zh) * 2022-04-29 2023-11-02 上海先博生物科技有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体及其应用
CN116253794A (zh) * 2022-08-19 2023-06-13 首都医科大学宣武医院 一种用于car-t细胞调控的抗体及其应用
CN116514992B (zh) * 2022-11-07 2024-05-24 武汉波睿达生物科技有限公司 一种信号肽序列优化的靶向cd19的嵌合抗原受体及其应用
CN116514992A (zh) * 2022-11-07 2023-08-01 武汉波睿达生物科技有限公司 一种信号肽序列优化的靶向cd19的嵌合抗原受体及其应用
CN116589598A (zh) * 2023-02-27 2023-08-15 武汉波睿达生物科技有限公司 共表达fosb的嵌合抗原受体及其应用
CN116496397B (zh) * 2023-04-03 2024-03-01 科弈(浙江)药业科技有限公司 靶向cd19 car-t细胞人源化抗体
CN116496397A (zh) * 2023-04-03 2023-07-28 上海科棋药业科技有限公司 靶向cd19 car-t细胞人源化抗体

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