JP4541693B2 - Cd10活性化プロドラッグ化合物 - Google Patents
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Description
ACN=アセトニトリル
Aib=アミノイソ酪酸
All=アリル
Aloc=アリルオキシカルボニル
Amb=4−(アミノメチル)安息香酸
APP=3−アミノ−3−フェニルプロピオン酸
DCC=N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
Boc=t−ブチルオキシカルボニル
Cap=アミノカプロン酸
DBN=1,5−ジアザビシクロ[4.3.0]ノン−5−エン
DBO=1,4−ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン
DBU=1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデセ−7−エン
Dox−HCL=ドキソルビシンの塩酸塩
DCM=ジクロロメタン
DIC=N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド
DIEA=ジイソプロピルエチルアミン
Dg=ジグリコール酸
DMF=ジメチルホルムアミド
Dnr=ダウノルビシン
Dox=ドキソルビシン
Et2O=ジエチルエーテル
Fmoc=9−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Gl=グルタル酸
HATU=O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート
HBTU=2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)1,1,3,3−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート
HEPES=ヒドロキシエチルピペリジン
HOBt=N−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC=高圧液体クロマトグラフィー
MeOH=メタノール
MeOSuc=メチルヘミスクシニル/メチルヘミスクシネート
MTD=最大耐性量
NAA=3−アミノー4,4−ジフェニル酪酸
Nal=2−ナフチルアラニン
Naph=1,8−ナフタレンジカルボン酸
Nle=ノルロイシン
NMP=N−メチルピロリジン
Nva=ノルバリン
PAM樹脂=4−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル
Pyg=ピログルタミン酸
Pyr=3−ピリジルアラニン
rRTOP=組み換えラットTOP
RT,rt=室温
Suc=コハク酸/スクシニル
TCE=トリクロロエチル
TFA=トリフルオロ酢酸
THF=テトラヒドロフラン
Thi=2−チエニルアラニン
Thz=チアゾリジン−4−カルボン酸
Tic=テトラヒドロイソキノリン−3−カルボン酸
TOP=チメットオリゴペプチダーゼ
より詳細には、本発明のプロドラッグは、修飾型治療剤であり、
(1)治療剤、
(2)オリゴペプチド、
(3)安定化基及び
(4)場合によりリンカー基
等のいくつかの部分を含む。
(安定化基)−(オリゴペプチド)−(任意のリンカー基)−(治療剤)。
(1)標的細胞に侵入できる治療剤と、
(2)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1’−(AA)m
(式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、
各AAは独立してアミノ酸を表す)
で表されるオリゴペプチドと、
(3)安定化基と、
(4)場合によりリンカー基と、
を含み、
前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第一結合部位で前記安定化基に直接結合しており、前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第二結合部位で前記治療剤に直接結合しているか、前記治療剤に前記リンカー基を介して間接的に結合しており、
前記安定化基が、全血に存在する酵素による前記化合物の切断を阻害し、
前記化合物が、CD10により切断されることができる。
本発明のプロドラッグは、患者の体内の標的部位又はその付近での標的細胞に関連する酵素との相互作用による優先活性化を利用するように設計される。標的細胞関連酵素の全体又は標的細胞関連酵素の少なくとも活性部位が、外側細胞表面と関連しているか、結合している。別法として、標的細胞関連酵素が、標的細胞の細胞外付近において、分泌されるか、放出されるか、又はある他の方法で存在することができる。
CD10が最初に報告されたのは、中性pHでの125ヨードインスリンB鎖を加水分解できるラットの腎臓の刷子縁膜における活性であった(Wong−Leung等、「Some properties of a microsomal peptidase in rat kidney(ラットの腎臓におけるミクロソームペプチダーゼのある特性)」、Biochem.J.110:5P(1968))。したがって、この酵素が、腎臓刷子縁中性プロテイナーゼと称された。この酵素は、メタロペプチダーゼであることが判明した (Neprilysin,Turner,Handbook of Proteolytic Enzymes、1080−1085(1998))。CD10は、独立してエンケファリンの失活を引き起こす脳膜酵素としても見出された(Malfroy等、「High−affinity enkephalin−degrading peptidase is increased after morphine(モルヒネの後で高親和性エンケファリン分解ペプチダーゼが増加する)」、Nature、276:523−526(1978))。これにより、慣用名エンケファリナーゼが使用されるようになった。また、CD10は、一般的に、文献では、ネプリリシン又は中性エンドペプチダーゼ24.11又はEC3.4.24.11又はNEPと称されている。酵素のクローニング及び配列決定(Devault等、「Amino acid sequence of rabbit kidney neutral endopeptidase−24.11(enkephalinase) deduced from a complementary DNA(相補DNAから推定されたウサギ腎臓中性エンドペプチダーゼ−24.11(エンケファリナーゼ)のアミノ酸配列)」、EMBOJ,6:1317−1322(1987))により、白血球細胞表面抗原と同一であるとの認識に至った。この抗原は、一般的な急性リンパ芽球性白血病抗原(CALLA又はCD10)であり、プレ−B細胞白血病群に存在する(LeTarte等、「Common acute lymphocytic leukemia antigen is identical to neutral endopeptidase(一般的な急性リンパ球性白血病抗原は、中性エンドペプチダーゼと同一である)」、J.Exp.Med,168:1247−1253(1988))。
CD10は、実質的に長さが約40個以下であるアミノ酸のペプチドを加水分解するオリゴペプチダーゼである。但し、一般的に、加水分解効率は、ペプチドの長さの増加とともに減少する。最も効率的に加水分解される基質の一つは、ウンデカペプチド物質Pである(Matsas等、「The metabolism of neuropeptides: the hydrolysis of peptides, including enkephalins, tachykinins and their analogues by endopeptidase−24.11(神経ペプチドの代謝:エンドペプチダーゼ−24.11によるエンケファリン、タキキニン及びそれらの類似物を含むペプチドの加水分解)」、Biochem J,223:433−440(1984))。生体内での主要な基質は、エンケファリン、タキキニン、例えば、物質P、及び心房性ナトリウム利尿ペプチドファミリーであると思われる。
CD10は、原形質膜タンパク質のII型一体膜タンパク質である。これは、タンパク質の大部分とともに外酵素として存在し、活性部位を含み、細胞外空間に向いている。CD10は、23アミノ酸N末端細胞質領域と、28アミノ酸膜スパニング領域と、活性部位を有する約700アミノ酸細胞外領域とから構成されている(Li等、「Neprilysin: Assay Methods, Purification, and Characterization(ネプリリシン:アッセイ法、精製及び特徴付け)」、Methods in Enzymology,248:253−263(1995))。CD10は、1つのサブユニット当たり1モルの亜鉛を含有している。鎖内ジスルフィド結合は、構造及び活性の維持のために重要である。CD10のMrは、組織源によって、約85000〜100000の範囲である。組織源によって異なるのは、グリコシル化の差異による。cDNAクローニングにより、ウサギ酵素、ラット酵素及びヒト酵素が、それぞれ750個のアミノ酸ポリペプチド、742個のアミノ酸ポリペプチド及び742個のアミノ酸ポリペプチドからなることが、明らかとなった(Neprilysin,Turner,Handbook of Proteolytic Enzymes 1080−1085 (1998))。
CD10は、広い組織分布を示すが、酵素活性は異なる組織間で全く異なる。腎臓は最高のCD10濃度を有することが分かった。この酵素は、主に腎臓尿細管の刷子縁膜上に位置する(A.J.Kenny,Trends Biochem.Sci.11,40(1986))。
CD10は、膜からの酵素を界面活性剤処理により可溶化した後に、モノクローナル抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーを適用することにより、精製できる。通常のクロマトグラフィー法も、CD10の精製に適用された。組み換えネプリリシン、すなわち、CD10の大規模発現及び精製が、バキュロウイルス感染昆虫細胞系から得られた。精製方法は、さらにLi等、「Neprilysin:Assay Methods, Purification, and Characterization(ネプリリシン:アッセイ方法、精製及び特徴付け)」、Methods in Enzymology,248:253−263(1995)に記載されている。
マイクロタイタープレートアッセイに適用できるCD10用の特に都合がよく且つ感度のよい2段階アッセイでは、カップリング酵素としてのS.griseusアミノペプチダーゼの存在下で基質Suc−Ala−Ala-|-Leu−NHPhNo2を使用する(Indig等、「Investigation of neutral endopeptidase (EC 3.4.24.11) and of neutral proteinases (EC 3.4.24.4) using a new two−stage enzymatic reaction(新規な2段階反応を用いた中性エンドペプチダーゼ(EC 3.4.24.11)及び中性プロテイナーゼ(EC 3.4.24.4)の調査)」、FEBS,255:237−240(1989))。CD10によるLeu−NHPhNo2の放出の後に、4−ニトロアニリン脱離基のアミノペプチダーゼ放出が生じる(これは、405nmで観察できる)。
CD10は、リンパ前駆体細胞、胚中心Bリンパ球及びある種の骨髄球により発現され、したがって、急性白血病の分類及び悪性リンパ腫の下位分類のために、細胞表面マーカーとして広く使用されている。CD10は、胃腸管及び尿生殖路の癌腫並びにある種の肉腫において広く発現され、これらの腫瘍の鑑別診断のためのマーカーとして有用なことがある(Chu等、「Paraffin−Section Detection of CD10 in 505 Nonhematopoietic Neoplasms: Frequent Expression of Renal Cell Carcinoma and Endometrial Stromal Sarcoma(505非造血新生物におけるCD10のパラフィン切片検出:腎細胞癌及び子宮内膜間質部肉腫の頻発発現)」、Am J Clin Pathol,113:374−382(2000))。
文献には、CD10についての好ましい基質に関するいくつかの手がかりが含まれている。2つの研究(Pozsgay等、「Substrate and Inhibitor Studies of Thermolysin−like Neutral Metalloendopeptidase From Kidney Membrane Fractions. Comparison with Bacterial Thermolysin(腎膜画分からのサーモリシン様中性メタロエンドペプチダーゼの基質及び阻害剤の研究。バクテリアサーモリシンとの比較)」、Biochemistry,25:1292−1299(1986)及びHersh等、「Comparison of the Subsite Specificity of the Mammalian Neutral Endopeptidase 24.11 (Enkephalinase) to the Bacterial Neutral Endopeptidase Thermolysin(哺乳動物中性エンドペプチダーゼ24.11(エンケファリナーゼ)のサブサイト位特異性のバクテリア中性エンドペプチダーゼサーモリシンとの比較)」、The Journal of Biological Chemistry,261:6433−6437(1986))は、CD10の基質特異性を詳細に記載している。これらの刊行物の両方とも、本明細書中に援用する。これらの2つの刊行物において得られている基質特異性の結果を、以下に簡単にまとめて示す。
式AAP3−AAP2−AAP1−AAP1’−AAP2’−AAP3’
{式中、
AAP3は、Phe又はAlaであり、
AAP2は、Pheであり、
AAP1は、Gly又はAlaであり、
AAP1’は、Phe又はLeuであり、
AAP2’は、Leuであり、そして
AAP3’は、Alaである。}
で表される、オリゴペプチドであろう。文献によれば、これらの残基のうち、P3’位は、最も重要性が小さい。
プロドラッグの重要な部分は、安定化基である。安定化基は、プロドラッグ化合物を患者に投与したときに、プロドラッグ化合物が循環血液中で切断されないように保護する役割を果たす。したがって、プロドラッグは、比較的無傷で標的細胞の付近に到達できる。安定化基は、血液、血清及び正常組織に存在するプロテイナーゼ及びペプチダーゼによってプロドラッグが切断されないように保護する。安定化基は、典型的にはオリゴペプチドのN末端をキャッピングしており、したがって、Nキャップ又はNブロックと称されることがある。したがって、安定化基は、安定化基がないとプロドラッグが感受性を有することがあるペプチダーゼを避ける役割を果たす。
(1)アミノ酸以外であるか、
(2)(i)非遺伝的にコードされたアミノ酸又は(ii)アスパラギン酸のβ−カルボキシル基又はグルタミン酸のγ−カルボキシル基でオリゴペプチドのN末端に結合したアスパラギン酸又はグルタミン酸であるアミノ酸、
である。
オリゴペプチドは、一般的に短鎖長、典型的にアミノ酸20個以下のポリペプチドとして定義される。本発明のプロドラッグに有用なオリゴペプチドは、長さが少なくとも3個のアミノ酸、好ましくは長さが3〜6個のアミノ酸である。しかしながら、上記範囲を超える長さのオリゴペプチドも、有用である。
本発明によれば、プロドラッグのオリゴペプチド部分は、式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1’−(AA)mで表される。この式において、n及びmは、整数である。ここで、整数は、いずれかの正の自然数又はゼロである。オリゴペプチドは、長さが3個以上のアミノ酸である。好ましい実施態様によれば、nは0〜3の整数であり、mは0〜3であり、m+nが3以下である。したがって、好ましいオリゴペプチドは、長さが3〜6個のアミノ酸である。上記式における各AAは、独立してアミノ酸を表す。一定のアミノ酸には、上付き文字を付して表し、CD10による切断部位に対する位置を示す。特に、CD10は、アミノ酸のP1位、すなわち、AAP1と、アミノ酸のP1’位、すなわち、AAP1’との間で切断する。
特記のない限りは、全てのアミノ酸が、L配置にある。いずれのアミノ酸がプロドラッグのオリゴペプチド部分に存在してもよいが、一定のアミノ酸が好ましい。
修飾してプロドラッグ形態とするのに特に有利である治療剤は、治療濃度域が狭いものである。治療濃度域が狭い薬剤又は治療剤は、一般的な医療水準により毒性が明らかである投与量が、効力が明らかである投与量に極めて近いものである。
オリゴペプチドと治療剤との間にリンカー基が存在すると、以下の理由で有利なことがある:
1.治療剤に結合したアミノ酸の酵素的放出又は他の酵素的活性工程を容易にするための、立体的な面からのスペーサーとして。
2.治療剤とオリゴペプチドとの間の適切な結合化学反応を可能とする。
3.プロドラッグ複合体を製造する際の合成プロセスを改善する(例えば、結合前にリンカー基を用いて、治療剤又はオリゴペプチドを予備誘導して収率又は特異性を高めることにより)。
4.プロドラッグの物性を改善する。
5.薬剤の細胞内放出のさらなる機構を提供する。
プロドラッグの設計方法は、本発明の別の態様を構成し、最初に上記した本発明のオリゴペプチドを同定することを必要とする。次に、オリゴペプチドを、オリゴペプチドの第一結合部位で、安定化基に結合させる。安定化基は、全血に存在する酵素によるオリゴペプチドの切断を阻害する役割を果たす。オリゴペプチドは、オリゴペプチドの第二結合部位で、治療剤と直接的又は間接的に結合する。第一結合部位は、通常オリゴペプチドのN末端であるが、オリゴペプチドのC末端又はオリゴペプチドの別の部分であってもよい。第二結合部位は、通常オリゴペプチドのC末端であるが、オリゴペプチドのN末端又はオリゴペプチドの別の部分でもよい。治療剤及び安定化基へのオリゴペプチドの結合は、いずれかの順序でおこなってもよいし、同時におこなってもよい。
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表される。
また、本発明によれば、本発明による化合物、特にプロドラッグ化合物と、必要に応じて薬学的に許容される担体、例えば、補助剤又は媒質等を含む、医薬組成物も提供される。
(1)(a)標的細胞に侵入できる治療剤と、
(b)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドと、
(c)安定化基と、
(d)場合によりCD10により切断されることのないリンカー基と、
を含む化合物であって、
前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第一結合部位で前記安定化基に直接結合しており、前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第二結合部位で前記治療剤に直接結合しているか、前記治療剤に前記リンカー基を介して間接的に結合しており、
前記安定化基が、全血に存在する酵素による前記化合物の切断を阻害し、
前記化合物が、CD10により切断されることができる、化合物と、
(2)薬学的に許容される担体と、
を含む、医薬組成物が、提供される。
患者に、治療に有効な量の医薬組成物を、好ましくは非経口及びより好ましくは静脈内投与することを含む、病状の治療方法も、本発明の範囲内である。
(1)標的細胞に侵入できる治療剤と、
(2)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドと、
(3)安定化基と、
(4)場合によりCD10により切断されないリンカー基と、
を含む化合物であって、
前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第一結合部位で前記安定化基に直接結合しており、前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第二結合部位で前記治療剤に直接的に結合しているか、前記治療剤に前記リンカー基を介して間接的に結合しており、
前記安定化基が、全血に存在する酵素による前記化合物の切断を阻害し、
前記化合物が、CD10により切断されることができる、
化合物の治療に効果的な量を患者に投与することを含む、方法が提供される。
本発明のプロドラッグは、腫瘍における細胞の一部又は全ての上で表面マーカーとしてCD10を発現する腫瘍の場合に、特に新規な用途に用いられる。CD10についての免疫組織化学的染色試薬を、CD10で切断されることのできるプロドラッグに対して特定の感受性を有する腫瘍のための診断マーカーとして使用して、治療患者を、事前に選別できる。例えば、腫瘍細胞上でCD10により、CD10で切断されることのできるプロドラッグから放出されるドキソルビシンが局部的に産生されることにより、全ての細胞に無差別に作用すると思われる遊離ドキソルビシンによる治療と比較して、プロドラッグの安全性が相対的に増加すると思われる。
診断又はアッセイ用のキット等の製品も、本発明の範囲内である。このような製品では、好ましくはクマリン等のマーカーを、オリゴペプチド及び安定化基(治療剤の代わり)に結合している以外は、上記した化合物を利用する。使用されるマーカーは、オリゴペプチドに結合されることのできるいずれかの成分として定義され、当該技術分野において公知の方法により容易に検出できる。マーカーの検出に有用である少なくとも一種の試薬が、典型的にキットの一部分として含まれる。すなわち、製品は、以下の構成要素を含む:
(1)(a)マーカーと、
(b)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドと、
(c)安定化基と、
(d)場合によりリンカー基と、
を含む化合物であって、
前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第一結合部位で前記安定化基に直接結合しており、前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第二結合部位で前記マーカーに直接的に結合しているか、前記マーカーに前記リンカー基を介して間接的に結合しており、
前記安定化基が、全血に存在する酵素による前記化合物の切断を阻害し、
前記化合物が、CD10により切断されることができる、
化合物と、
(2)前記マーカーの検出に有用な少なくとも一種の試薬と、
を含む。
オリゴペプチド:ペプチド合成の一般法
本発明のプロドラッグ複合体におけるペプチド(オリゴペプチド)の配列は、固相ペプチド合成(Boc又はFmoc化学反応を用いる)法によるか、又は液相合成により合成できる。一般的なBoc法びFmoc法は、広く使用され、以下の文献に記載されている:Merrifield,J.A.Chem.Soc.,88:2149(1963);Bodanszky及びBodanszky,「The Practice of Peptide synthesis(ペプチド合成の実際)」、Springer−Verlag,Berlin,7−161(1994);並びにStewart,「Solid Phase Peptide Synthesis(固相ペプチド合成)」、Pierce Chemical,Rockford(1984)。
好ましい固相合成法(自動又は手動)を用いて、所望の長さ及び配列のペプチドを、アミノ酸を、固体樹脂に結合している増殖している鎖に段階的に付加することにより合成する。有用なFmoc適合樹脂としては、例えば、Wang樹脂、HMPA−PEGA樹脂、Rink酸樹脂又はヒドロキシエチル−フォトリンカー樹脂などがあるが、これらには限定されない。ペプチド鎖のC末端を、高分子樹脂に共有結合し、保護されたα−アミノ酸を、カップリング試薬を用いた段階的方法により付加する。好ましいα−アミノ保護基は、カップリング条件で安定であり且つ穏やかなアルカリ性条件下で容易に除去できるFmoc基である。反応溶媒は、好ましくはDMF、NMP、DCM、MeOH及びEtOHであるが、これらには限定されない。カップリング剤としては、例えば、DCC、DIC、HATU、HBTUがある。N末端保護基の切断は、DMFにピペリジンを10〜100%添加した溶液中、0〜40℃でおこなわれる。温度は、周囲温度が好ましい。合成の終わりに、最終的なFmoc保護基を、上記のN末端切断法を用いて除去する。樹脂上に残存するペプチドを、酸性条件下で樹脂を処理することにより、酸に感受性のある側鎖保護基とともに、樹脂から切断される。例えば、酸性切断条件として、トリフルオロ酢酸(TFA)をジクロロメタンに混合が挙げられる。ヒドロキシエチル−フォトリンカー樹脂を使用する場合には、切断を生じさせるのに好適な波長は、λ365nmの紫外線である。このプロセスを図示したものを、図3に示す。
N末端誘導ペプチドの調製は、通常固相でおこなわれる。ペプチド合成が完了したら、末端のFmocを除去する。このとき、ペプチドは、まだ固体の支持体上にある。最適なNキャップを、次にペプチドのN末端上に、標準的ペプチドカップリング条件を用いてカップリングする。Fmoc合成法を使用する場合には、Nキャップのカップリング終了後、ペプチドを、上記した方法を用いて樹脂から切断する。
Boc化学反応を用いた固相方法では、Merrifield樹脂又はPAM樹脂が、有用である。カップリング剤活性化Boc保護アミノ酸を順次付加することにより、アミノ酸を、固相上に増殖している鎖にカップリングする。カップリング剤としては、例えば、DCC、DIC、HATU及びHBTUがある。反応溶媒は、DMF、DCM、MeOH又はNMPでよい。Boc保護基の切断は、DCMにTFAを10〜100%添加した溶液中、0〜40℃でおこなう。温度は、周囲温度が好ましい。ペプチド鎖アセンブリが完了したら、N末端保護基(通常Boc)を、上記したようにして除去する。ペプチドを、ジクロロメタン中、液状HF又はトリフルオロメタンスルホン酸を用いて樹脂から除去する。
別法として、プロドラッグペプチド中間体を、Boc又はFmoc化学反応を利用して、液相合成により製造できる。この方法を示した図(図4)では、C末端Leuテトラペプチドを、一般的に一例として使用されるが、他のどのような長さのC末端ペプチドを用いて同様の反応をおこなってもよいことは、理解されるところであろう。ペプチドは、固相法に類似の方法(N末端方向又はC末端方向)によるか、又は例えば、2種の好適な保護ジペプチド又は単一のアミノ酸のトリペプチドのカップリングによる段階的アセンブリにより構築できる。
液相合成によりNキャップドオリゴペプチドを構築するとき、Nキャップを、わずかに修正した方法により合成する必要がある(図4)。まず、FmocオリゴペプチドのC末端は、Nキャップ上のC末端の選択的脱保護と適合する酸不安定又は水素添加感受性保護基で保護する必要がある。次に、Fmoc保護基を、オリゴペプチドから除去してN末端を露出させる必要がある。N末端が脱保護され且つC末端が保護された状態で、オリゴペプチドを、所望のNキャップの活性化半エステルと反応させる。Nキャップは、塩基及び好適な溶媒中で、DCC又はHATU等のアミノ酸を活性化するための方法を用いて、活性化できる。別法として、メチルヘミスクシネートを使用する場合、カップリングは、有機又は無機塩基、例えば、DIEA、トリエチルアミン又はCs2CO3の存在下、不活性溶媒を用いて、メチルヘミスクシニルクロリド(又は他の酸ハライド)(図4)を介して実施することができる。このような合成の一例として、メチル−ヘミスクシネートとβAla−Ile−Ala−Leuベンジルエステルとの反応が挙げられる。カップリング法は、当該技術分野において一般的に使用されている方法のいずれかであることができる(例えば、Bodanszky,M.The Practice of Peptide Synthesis(ペプチド合成の実際),Springer Verlag,185(1984);Bodanszky,M.Principles of Peptide Synthesis(ペプチド合成の原理),Springer Verlag,159(1984)参照)。次に、ベンジル基を、接触水素添加により除去して所望のNキャップメチル−スクシニル型オリゴペプチドを得ることができる。好適な選択的に除去可能なC末端保護基の他の例として、tBu、アルコキシ−メチル及びTCEであることができるが、これらには限定されない。この工程をおこなうための他の方法が、文献に記載されている。
複合及び脱保護工程の一般的な方法
本発明に記載のNキャップ型オリゴペプチド−治療剤は、オリゴペプチドのFmoc形態(FmocがオリゴペプチドのN末端に結合していることを意味する)を、ダウノルビシン、ドキソルビシン又はいずれかの好適な治療剤と、ペプチド合成に使用される標準的な活性化試薬のいずれかを用いてカップリングすることにより、合成できる(図5)。溶媒は、トルエン、酢酸エチル、DMF、DMSO、CH3CN、NMP、THF、DCM又は当該技術分野において公知の他の好適な不活性溶媒でよく、試薬がそこに可溶なものである。好ましい溶媒は、DMF及びNMPである。好適な温度は、−25〜+25℃の範囲であり、周囲温度が好ましい。活性化剤は、以下のものから一つを選択できる:PyBOP、HBTU、HATU、EDC、DIC、DCC、DCC+HOBT、OSu活性化エステル、アジド又はトリフェニルホスホリルアジド。HBTU又はHATUは、好ましい活性化剤である。別法として、このカップリング反応に、保護されたペプチドの酸クロリド又は酸ブロミドを使用してもよい。2〜4当量、有利には2〜2.5当量の塩基が、カップリング反応に必要とされる。塩基は、無機塩基、例えば、CsCO3、Na2CO3若しくはK2CO3又は有機塩基、例えば、TEA、DIEA、DBU、DBN、DBO、ピリジン、置換ピリジン、N−メチル−モルホリン等から選択されることができ、好ましくはTEA又はDIEAである。反応は、−15℃〜50℃の温度、有利には−10℃〜10℃の温度で実施できる。反応時間は、5〜90分間であり、20〜40分間が有利である。生成物は、反応混合物を水に注ぎ、形成した沈殿物を濾過することにより単離される。粗生成物は、さらにDCM、THF、酢酸エチル又はアセトニトリルから、好ましくはジクロロメタン又はアセトニトリルから再結晶することにより精製できる。次に、単離されたFmoc型オリゴペプチド治療剤複合体を、10倍〜100倍過剰の塩基を用いて、−10℃〜50℃の温度で、2〜90分間、好ましくは3〜8分間かけて脱保護する。理想的には、5〜60当量の塩基が、好ましい。ピペリジンは、Fmoc基を脱保護するのに好ましい塩基である。オリゴペプチド−治療剤複合体の脱保護されたアミノ末端を、二酸無水物又は半保護活性化二酸(すなわち、続いて脱保護されるモノエステル)によりアシル化して最終的なNキャップ型オリゴペプチド−治療剤を得る。
酸又は塩基により触媒された完全Nキャップ化合物への保護されたNキャップ−オリゴペプチド治療剤の加水分解により、適度に酸性又は塩基性の条件下であっても、数多くの治療剤が不安定であるため複雑な反応混合物となる。酵素は、基質又は生成物を破壊することなく、加水分解を促進することができる。エステラーゼ又はリパーゼが、この反応に好適な酵素のことがあり、それらの天然又は水溶性の形態であってもよいし、又は市販の固体支持体材料に交差カップリング又は結合により固定化してもよい。評価した可溶性酵素のうち、Candida Antarctica「B」リパーゼ(Altus Biologics社)は、とりわけ有用である。交差カップリングにより固定化された酵素の一例として、ChiroCLEC−PC(商標)(Altus Biologics社)が挙げられる。Candida Antarctica「B」リパーゼ(Altus Biologics社)は、NHS活性化セファロース(Sepharose)(商標)4Fast Flow(American Pharmacia Biotech社)との反応により固定化できる。加水分解中の反応混合物のpHを、慎重に制御し、pHシュタットにより、NaHCO3溶液の添加を制御して、5.5〜7.5、有利には5.7〜6.5に維持する。反応が完了したら、生成物を、濾過した反応混合物を凍結乾燥することにより単離する。固定化酵素は、フィルターケーキに残存しており、必要に応じて再使用できる。
プロドラッグは、アリル半エステル又はアルキル半エステル形態のNキャップオリゴペプチドを治療剤とカップリングした後、複合体から遊離酸を放出することにより、調製することもできる。図8は、スクシニル−βAla−Ile−Ala−Leuとドキソルビシンを用いたこのプロセスを示す。
また、プロドラッグは、図7に示す方法で合成してもよい。この方法では、R’−オリゴペプチド(ここで、R’は、トリチル又は置換トリチルである)を利用する。R’−オリゴペプチドと治療剤とのカップリングは、保護されたオリゴペプチドと治療剤とを0〜20℃で30〜120分間で結合させることについて、上記で説明した方法のいずれか一つにより、実施できる。
本発明のプロドラッグ化合物は、「段階的」逆(N末端からC末端)方向法を用いた固相化学反応を用いることにより、合成できる。
プロドラッグ化合物は、本発明の簡単で効率的な3工程プロセスを用いて合成できる:(1)アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチドと治療剤とを、活性化剤の存在下でカップリングしてアルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド−治療剤複合体を調製する工程、(2)カップリング工程後に残存する未カップリング治療剤を除去する工程、及び(3)アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド−治療剤複合体を脱保護して安定化基−オリゴペプチド−治療剤プロドラッグ化合物を調製する工程。
未結合治療剤は、プロドラッグの製造プロセスの後の段階で存在することがある。例えば、(安定化基)−(オリゴペプチド)複合体を治療剤としてのドキソルビシンとカップリング中、ある場合には、反応が完全には進行しないことが判明した。このカップリング生成物には、約2〜4%の残留ドキソルビシンがあった。最初に酸性洗浄により生成物からドキソルビシンを完全に除去することを試みたときには、完全には除去されなかった。遊離治療剤の完全除去は、スカベンジャー樹脂又はビーズを利用する、実施例47及び図11に概略示したプロセスによりおこなった。
(1)式
Fmoc−(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるFmoc保護オリゴペプチドを選択する工程と、
(2)Fmoc保護オリゴペプチドを、治療剤の存在下で活性化剤で活性化することにより、Fmoc保護オリゴペプチドを治療剤にカップリングしてFmoc保護オリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
(3)前記Fmoc保護オリゴペプチド−治療剤複合体を塩基と接触させることにより、Fmoc保護オリゴペプチド−治療剤複合体を脱保護してオリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
(4)前記オリゴペプチド−治療剤複合体を安定化基にカップリングして前記化合物を形成する工程と、
を含む方法が提供される。
(1)式
(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドを選択する工程と、
(2)前記オリゴペプチドを、アルキルエステル保護安定化基にカップリングしてアルキルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を形成する工程と、
(3)前記アルキルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を、治療剤の存在下で活性化剤により活性化することにより、前記アルキルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を治療剤にカップリングしてアルキルエステル保護安定化基−オリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
(4)前記アルキルエステル保護安定化基−オリゴペプチド治療剤複合体を脱保護して前記化合物を形成する工程と、
を含む方法が提供される。
(1)式
(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドを選択する工程と、
(2)前記オリゴペプチドを、アリルエステル保護安定化基にカップリングしてアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を形成する工程と、
(3)前記アリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を、治療剤の存在下で活性化剤により活性化することにより、前記アリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を治療剤にカップリングしてアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
(4)前記アリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド治療剤複合体を脱保護して前記化合物を形成する工程。
(1)式
トリチル−(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるトリチル保護オリゴペプチドを選択する工程と、
(2)トリチル保護オリゴペプチドを、治療剤の存在下で活性化剤で活性化することにより、トリチル保護オリゴペプチドを治療剤にカップリングしてトリチル保護オリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
(3)酸性条件下でトリチル保護オリゴペプチド−治療剤複合体を脱保護してオリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
(4)前記オリゴペプチド−治療剤複合体を安定化基にカップリングして前記化合物を形成する工程。
本発明の化合物の具体例を、以下に示す:
細胞ホモジェネートのタンパク質特異的活性
種々の培養ヒト細胞ペレットを、pH7.2の100mM HEPES緩衝液に添加して均一化し、得られたホモジェネートを、12.5μg/mLのSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Tyr−Leu−Dox、Suc−βAla−Leu−Tyr−Leu−Doxとともに、37℃で1時間インキュベーションした。さらに、CD10阻害剤としての1μMホスホラミドンを、LNCaP細胞ホモジェネートとともにインキュベーションに含ませた。特異的活性を推定するために、ホモジェネートの可溶性部分におけるタンパク質含量を推定した。タンパク質特異的活性として表した結果(図12)から、CD10を含有することが知られているLNCaP細胞が、最大のSuc−Ile−Ala−Leu−Dox加水分解活性を示すことが明らかである。この活性は、ホスホラミドンにより阻害される。CD10を発現しないPC−3細胞は、他の3種の基質を加水分解するが、Suc−Ile−Ala−Leu−Doxを加水分解しない。
精製CD10による加水分解
ブタ腎臓CD10(Elastin Products社)の精製品の等量を、種々のペプチジルドキソルビシン化合物12.5μg/mLとともに、pH7.4の50mM TrisHCl、150mM NaCl、0.1%Triton X−100中、37℃、10時間の条件で、インキュベーションした。反応生成物を、蛍光検出を用いたHPLCにより分析した。速度は、インキュベーション中、実質的に直線状であった。得られた生成物は、Leu−ドキソルビシンであった。表1に、10時間で加水分解された各試験化合物のパーセントを示す。さらに、これらの結果を、標準試験化合物であるSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxに対して表す。
ペプチドに結合した薬剤が、CD10による切断に及ぼす影響
プロドラッグの「トキシン」位置での構造のCD10触媒速度効果を試験するために、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの加水分解速度を、ドキソルビシンをパラニトロアニリド(pNA)に置換した類似物、すなわち、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−pNAの加水分解速度と比較した。ブタ腎臓CD10(Elastin Products社)を、2種の基質とともに、同一条件(37℃、pH7.4、50mM TrisHCl、150mM NaCl、0.01%Triton X−100)下でインキュベーションし、Leu−Doxの放出速度を、Leu−pNAの放出速度と比較した。得られた結果から、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−pNAは、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxよりも、590倍速く切断されることが分かる。このことは、これらの腫瘍活性化プロドラッグ化合物におけるトキシンの構造(又は結合部位)が、切断速度に影響することがあることを示している。
潜在的プロドラッグのスクリーニング
trouase又はチメットオリゴペプチダーゼによっては切断されないが、CD10によって切断されるプロドラッグ化合物が、本発明にとって好ましい。すなわち、trouaseによる切断性の欠如について化合物をスクリーニングすることが、好ましい。癌細胞trouaseの3種の異なる試料を使用して、種々の試験化合物をスクリーニングした。これらの3種の試料は、以下に示すものであった:
(a)MCF7/6(乳癌)細胞ホモジェネート、
(b)MCF7/6(乳癌)ならし培地、
(c)HeLa(子宮頸癌)細胞抽出物アニオン交換画分プール。
MCF7/6細胞を、DMEM:F12(1:1)、50mg/L牛血清アルブミン、ITS−X(10mg/Lインスリン、5.5mg/Lトランスフェリン、6.7μg/L亜セレン酸ナトリウム、2mg/Lエタノールアミン)を含有する、無血清培地で、密集状態となるまで増殖させ、4℃、10,000xg、20分間の条件で遠心分離し、デカントすることにより、細胞の脂質濃縮物(Gibco#21900−030)100mLを採取した。得られたペレットを、リン酸緩衝生理食塩水(Gibco社)2mLに再懸濁し、18,000xg、10分間の条件で遠心分離した。デカントした後、細胞(湿潤物約300μL)を、1.7mLの10mM pH7.2 HEPES緩衝液(ナトリウム塩)中で、粉砕することにより均一化した。得られたホモジェネートを、18,000xg、4℃、5分間の条件で遠心分離し、上清を、等分し、つづいての化合物のスクリーニングに使用するために、−20℃以下の温度で保存した。
MCF7/6細胞を、10%ウシ胎児血清、0.05%(w/v)L−グルタミン、250IU/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを含有するDMEM/F12(1:1)培地で、密集状態となるまで増殖させた。次に、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、DMEM/F12(1:1)、0.02%BSA、ITS−X(10mg/Lインスリン、5.5mg/Lトランスフェリン、6.7μg/L亜セレン酸ナトリウム、2mg/Lエタノールアミン)中、5%CO2、37℃、24時間の条件でインキュベーションした。次に、ならし培地を、デカントし、YM10(分画MW10,000)限外濾過膜(Millipore社)を備えた攪拌型セル装置を用いて、pH7.2の10mM HEPES緩衝液と一旦交換した後20倍に濃縮した。この溶液を、化合物のスクリーニングに使用するために、等分して、−20℃の温度で保存した。
300億個の工業生産したHeLa細胞(ヒト子宮頸癌、ベルギー国のSeneffeに所在するComputer Cell Culture Centerより入手)を、溶菌水溶液108mLに添加し、超音波処理器及びダウンスホモジェナイザーを用いて、均一化した。溶菌液は、0.02%w/v Triton X−100、0.04%w/vアジ化ナトリウム、及びプロテアーゼ阻害剤混合物(2タブレット/50mL Complete(商標)、無EDTAタブレット、Roche Molecular Biochemicals社製)を含有していた。細胞ホモジェネートを、4℃、5000xg、30分の条件で遠心分離し、得られたペレットを、溶菌液108mL(2回目)に添加し、ダウンスホモジェナイザーを用いて均一化し、上記と同様にして遠心分離した。得られた上清を、混合し、145,000xg、4℃、90分間の条件で遠心分離した。
試験化合物を、12.5μg/mLの濃度で、癌細胞酵素の3種の異なる試料の各々とともに、37℃、2時間の条件でインキュベーションした。インキュベーション後、3容のアセトニトリルを添加して、反応を停止し、タンパク質を混合物から取り出した。試料を、18,000g、5分間の条件で遠心分離し、上清100μLを、水300μLと混合してから、HPLCにより分析した。HPLC分析については、試料50μLを、4.6×50mm 2μ TSK Super−ODSクロマトグラフィーカラムに40℃で注入し、3分間線状勾配で溶離をおこなった(アセトニトリルを、水性20mM酢酸アンモニウムpH4.5緩衝液に添加して26〜68%の勾配としたもの;流量2mL/分)。検出は、励起波長235nm、発光波長560nmでの蛍光によりおこなった。
細胞系でのCD10発現
CD10(CD10)は、高い割合(61%)の前立腺腫瘍を含む、多数の腫瘍の種類(Chu及びArber、Am.J.Clin.Pathol.113:374−382(2000))において、広く発現される。また、CD10は、生体外で培養したある種のヒト前立腺腫瘍由来細胞系で発現することも、分かった。したがって、本発明のペプチドプロドラッグが、前立腺だけでなく、表面でCD10を発現する他の腫瘍の種類から得た腫瘍系に対して細胞障害性であるかどうかを測定することは、重要である。前立腺腫瘍系であるLNCaPは、高レベルのCD10を発現する(Krongrad等、Urol.Res.25:113−116(1997);Liu、Cancer Res.60:3429−3434(2000))。また、培養におけるいくつかの前立腺腫瘍系は、別の十分に特徴付けされた細胞表面関連エンドプロテアーゼである前立腺特異抗原(PSA)を、発現する。表3に示す前立腺腫瘍系は、American Type Culture Collection(ATCC)から得られ、CD10特異的モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーにより、CD10発現についてスクリーニングした(Caltagクローン5−1 B4)。
LNCaP細胞、HT−29細胞及びPC−3細胞での腫瘍活性化プロドラッグ活性
粘着細胞であるLNCaP(前立腺癌)、HT−29(結腸癌)及びPC−3(前立腺癌)を、10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)を含有するDMEM培地で培養した。検討する日に、細胞をトリプシン溶液でプレートから分離した。集めた細胞を洗浄し、10%FCS含有DMEMに細胞0.25×106/mlになるように再懸濁した。細胞懸濁液100μLを、96ウエルプレートに添加し、3時間インキュベーションして細胞を接着させた。このインキュベーションの後、ドキソルビシン又は試験化合物を階段希釈(3倍づつ)し、ウエル一つあたり、化合物100μLを添加した。次に、プレートを、24時間インキュベーションし、100μCi/ml 3H−チミジン10μLでパルシングし、さらに24時間(総インキュベーション時間:48時間)インキュベーションした。プレートを、96ウエルハーベスター(Packard Instruments社)を用いて採取し、Packard Top Count Counterにより、カウントした。4つのパラメータロジスティック曲線を、Prismソフトウェアを用いて3H−チミジンの取り込みと、薬剤モル濃度との関係に適合させて、IC50値を求めた。
Ball−1細胞、Ramos細胞及びNamalwa細胞での腫瘍活性化プロドラッグ活性
LNCaPの他に、Ramos細胞やNamalwa細胞等の多数のB細胞系がCD10(CD10pos細胞)を発現する。しかしながら、別のB細胞系であるBALL−1細胞は、CD10を発現せず、CD10陰性B細胞系(CD10neg細胞)としての役割を果たす。
粘着細胞であるLNCaP(前立腺癌)、PC−3(前立腺癌)及び22RVI(前立腺癌)を、10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)を含有するDMEM培地で培養した。検討する日に、細胞をトリプシン溶液でプレートから分離した。集めた細胞を洗浄し、10%FCS含有DMEMに細胞0.25×106/mlになるように再懸濁した。細胞懸濁液100μLを、96ウエルプレートに添加し、3時間インキュベーションして細胞を接着させた。このインキュベーションの後、ドキソルビシン又は試験化合物を階段希釈(3倍づつ)し、ウエル一つあたり、化合物100μLを添加した。次に、プレートを、24時間インキュベーションし、100μCi/ml 3H−チミジン10μLでパルシングし、さらに24時間(総インキュベーション時間:48時間)インキュベーションした。プレートを、96ウエルハーベスター(Packard Instruments社)を用いて採取し、Packard Top Count Counterにより、カウントした。4つのパラメータロジスティック曲線を、Prismソフトウェアを用いて3H−チミジンの取り込みと、薬剤モル濃度との関係に適合させて、IC50値を求めた。
CD10の阻害により、Ramos細胞及びLNCaP細胞(BALL−1細胞ではない)についてのSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの効力が減少する。
CD10の2つの公知の阻害剤の、Ramos細胞、LNCaP細胞及びBall−1細胞におけるプロドラッグ活性に及ぼす影響を評価した。Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−DoxのIC50は、CD10阻害剤であるホスホラミドンとチオルファンの濃度を増加させて測定した。ホスホラミドンの濃度を増加させると、Ramos細胞とLNCaP細胞でのSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの効力の損失が生じたが、一方、BALL−1細胞は、影響されなかった(表7)。同様に、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−DoxのIC50は、100nMホスホラミドンで処理したLNCaP細胞では、7倍変化した(データは図示せず)。図15は、300nMホスホラミドンの不存在下又は存在下でSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxを用いた場合の、ある種の滴定曲線の一例である。
標的細胞に関連したCD10の検出
ヌードマウスで増殖させた後ホルマリンで固定した異種移植片から採取した、LNCaP及びPC3組織の試料について、免疫組織化学分析を実施した。組織切片を、調製し、CD10又はイソタイプマッチド陰性対照に特異的な抗体で免疫染色した後、ヘモトキシリンで対比染色した。LNCaP試料は、全てのLNCaP細胞の腫瘍組織試料における全ての細胞の周囲に比較的均一に分布した、CD10特異的抗体による染色の強い細胞表面膜関連パターンを示した。これに対して、PC3組織については、免疫反応性は、観察されなかった。CD10により切断されることができるが、TOPによっては切断されることができない化合物、例えば、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、マウスにおけるLNCaP腫瘍の増殖を阻害するのに効果的であったが、これらは、PC3細胞に対しては活性ではなかった(実施例6参照)。したがって、CD10免疫組織化学的性質は、CD10切断可能なプロドラッグに反応する腫瘍を選択するのに有用である。
Suc−Ile−Ala−Leu−Doxは、健康なマウスにおいて良好な耐容性を有する。
本発明の典型的なトリペプチドプロドラッグであるSuc−Ile−Ala−Leu−Doxは、マウスにおいて、十分許容される。単回投与最大耐性量(MTD)試験において、5つの正常マウス群に、Suc−Ile−Ala−Leu−Doxの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、28日間、毎日観察し、体重を、1週間に2回測定した。試験投与量レベルは、0mg/kg、23mg/kg、47mg/kg、70mg/kg、93mg/kg及び117mg/kgであった(それぞれ1kg当たりドキソルビシン0mg、14mg、28mg、42mg、56mg及び70mgに相当する)。急性毒性がなく、観察された唯一の毒性の兆候は、最高投与量群についての群平均体重(試験全体を通じて媒質対照群よりも低かった)が減少したことであった。しかしながら、死亡がなく、どの動物も、病的状態を示さなかった。28日のSuc−Ile−Ala−Leu−Doxの単回投与最大耐性量(MTD)は、この実験では得られず、したがって、試験した最高投与量(117mg/kg)よりも大きい。このMTD(ドキソルビシン66mg/kgに等しい)は、ドキソルビシン単独の場合(4mg/kgよりも大きな投与量で、死亡が生じる)よりも少なくとも16倍大きい。
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、健康マウスにおいて良好な耐容性を有する。
本発明の典型的なテトラペプチドプロドラッグであるSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、マウスにおいて、十分許容される。単回投与最大耐性量(MTD)試験において、5つの正常マウス群に、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、28日間、毎日観察し、体重を、1週間に2回測定した。試験投与量レベルは、0mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg及び125mg/kgであった(それぞれ1kg当たりドキソルビシン0mg、14mg、28mg、42mg、56mg及び70mgに相当する)。投与後、何ら急性毒性は観察されなかった。麻痺及び顕著な体重損失(>初期重量の20%)を含む毒性が、2つの最高投与量群に観察された。14日目に、125mg/kg投与量群における4匹の動物を、処置に関連した毒性のため、安楽死させた。21日目に、次に大きな投与量(100mg/kg)群における2匹の動物を、同様に安楽死させた。次の投与量群(75mg/kg)では、病的状態は観察されず、且つ群平均体重は、試験中に増加した。
Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、ドキソルビシンよりも生体内での優れた耐容性を有する。
本発明の典型的なテトラペプチドプロドラッグであるSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、マウスにおいて、十分許容される。第二単回投与最大耐性量(SD−MTD)試験において、5つの正常ICRマウス群に、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、49日間、毎日観察し、体重を、1週間に2回測定した。試験投与量レベルは、0mg/kg、50mg/kg、75mg/kg又は100mg/kgであった(それぞれ1kg当たりドキソルビシン0mg、28mg、42mg又は56mgに相当する)。いずれの投与量レベルでも、24時間以内で急性毒性はなかった。投与量と時間に依存する毒性の兆候が、試験中に観察された。部分的な尻の麻痺及び顕著な体重損失(>初期重量の20%)を含む毒性が、75mg/kg投与量群及び100mg/kg投与量群において観察された。35日までに、75mg/kg投与量群の40%に死亡が観察された。49日目の生存動物及び毒性の兆候がないことに基づいて、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−DoxについてのSD−MTDを求めたところ、50mg/kg(ドキソルビシン28mg/kgに等しい)であった。この投与量は、極めてよく許容され、悪影響は観察されなかった。したがって、SD−MTDは、ドキソルビシン単独(16mg/kg)についてのSD−MTDよりも、モル基準で、約1.8倍高かった(表9参照)。これは、試験範囲にわたる14mg/kgドキソルビシン当量増分での投与量範囲に基づく、近似SD−MTD測定である。
Suc−Leu−Ala−Leu−Doxは、ドキソルビシンよりも生体内での優れた耐容性を有する。
本発明の典型的なトリペプチドプロドラッグであるSuc−Leu−Ala−Leu−Doxは、マウスにおいて、十分許容される。第二単回投与最大耐性量(SD−MTD)試験において、5つの正常ICRマウス群に、Suc−Leu−Ala−Leu−Doxの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、49日間、毎日観察し、体重を、1週間に2回測定した。試験投与量レベルは、0mg/kg、47mg/kg、59mg/kg、71mg/kg、94mg/kg、117mg/kg、140mg/kg、又は164mg/kg(それぞれ1kg当たりドキソルビシン0mg、28mg、35mg、42mg、56mg、70mg、84mg又は98mgに相当する)。いずれの投与量レベルでも、24時間以内で急性毒性はなかった。投与量と時間に依存する毒性の兆候が、試験中に観察された。部分的な尻の麻痺及び顕著な体重損失(>初期重量の20%)を含む毒性が、94mg/kg投与量群及びそれより多い投与量群において観察された。49日目の生存動物及び毒性の兆候がないことに基づいて、Suc−Leu−Ala−Leu−DoxについてSD−MTDを求めたところ、71mg/kg(ドキソルビシン42mg/kgに等しい)であった。したがって、SD−MTDは、ドキソルビシン単独(16mg/kg)についてのSD−MTDよりも、モル基準で、約2.6倍高かった(表10参照)。これは、試験範囲にわたる7又は14mg/kgドキソルビシン当量増分での投与量範囲に基づく、近似SD−MTD測定である。
Suc−Ile−Ala−Leu−Doxは、ドキソルビシンよりも生体内での優れた耐容性を有する。
本発明の典型的なトリペプチドプロドラッグであるSuc−Ile−Ala−Leu−Doxは、マウスにおいて、十分許容される。第二単回投与最大耐性量(SD−MTD)試験において、5つの正常ICRマウス群に、Suc−Ile−Ala−Leu−Doxの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、49日間、毎日観察し、体重を、1週間に2回測定した。試験投与量レベルは、0mg/kg、94mg/kg、117mg/kg、140mg/kg又は164mg/kgであった(それぞれ1kg当たりドキソルビシン0mg、56mg、70mg、84mg又は98mgに相当する)。いずれの投与量レベルでも、24時間以内で急性毒性はなかった。投与量と時間に依存する毒性の兆候が、試験中に観察された。部分的な尻の麻痺及び顕著な体重損失(>初期重量の20%)を含む毒性が、最高投与量群において観察された。毒性の兆候は、14日目までに164mg/kgで部分的な尻の麻痺、1匹の動物において14日目までに140mg/kg及びここでも1匹の動物において21日目までに117mg/kgで重量損失であった。49日目の生存動物及び毒性の兆候がないことに基づいて、Suc−Ile−Ala−Leu−DoxについてSD−MTDを求めたところ、94mg/kg(ドキソルビシン56mg/kgに等しい)であった。このSD−MTDは、ドキソルビシン単独(16mg/kg)についてのSD−MTDよりも、モル基準で、3.5倍高かった(表11参照)。これは、試験範囲にわたる14mg/kgドキソルビシン当量増分での投与量範囲に基づく、近似SD−MTD測定である。
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、ドキソルビシンよりも生体内での優れた耐容性を有する。
本発明の典型的なテトラペプチドプロドラッグであるSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、マウスにおいて、十分許容される。第二単回投与最大耐性量(SD−MTD)試験において、5つの正常ICRマウス群に、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、49日間、毎日観察し、体重を、1週間に2回測定した。試験投与量レベルは、0mg/kg、50mg/kg、75mg/kg又は100mg/kgであった(それぞれ1kg当たりドキソルビシン0mg、28mg、42mg又は56mgに相当する)。いずれの投与量レベルでも、24時間以内で急性毒性はなかった。投与量と時間に依存する毒性の兆候が、試験中に観察された。部分的な尻の麻痺及び顕著な体重損失(>初期重量の20%)を含む毒性が、最高投与量群において観察された。21日までに、100mg/kg投与量における3匹の動物が、重量損失又は麻痺のため、安楽死させた。75mg/kg投与量群には、病的状態も死亡も、観察されなかった。49日目の生存動物及び毒性の兆候がないことに基づいて、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−DoxについてのSD−MTDを求めたところ、75mg/kg(ドキソルビシン42mg/kgに等しい)であった。このSD−MTDは、ドキソルビシン単独(16mg/kg)についてのSD−MTDよりも、モル基準で、2.6倍高かった(表12参照)。これは、試験範囲にわたる14mg/kgドキソルビシン当量増分での投与量範囲に基づく、近似SD−MTD測定である。
Suc−Ile−Ala−Leu−Doxの代謝
Suc−Ile−Ala−Leu−Doxの代謝及びクリアランスを、正常マウスで試験した。マウスに、Suc−Ile−Ala−Leu−Doxを、単回静脈内ボーラス投与(117mg/kg)した。1時間目及び4時間目に、血漿試料を採取した。血漿試料100μlを、ミクロ遠心分離管(1.5mL)に移し、ダウノルビシン(0.5mg/mlを20μL)の内部標準を、アセトニトリル(400μl)と一緒に添加した。ミクロ遠心分離管にキャップをつけて、短く回転させた後、14,000rpmで遠心分離した。各管から420μlを取り出し、真空乾燥した。各試料を、アセトニトリル(20%)を含有する20mM水性ギ酸アンモニウムpH4.5緩衝液(AF)の65μlで戻してから、逆相液体クロマトグラフィーとタンデム質量分光分析(LCMS/MS)とを組み合わせて分析した。
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの代謝
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの代謝及びクリアランスを、正常マウスに、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxを、単回静脈内ボーラス投与(117mg/kg)して試験した。別々のマウスから、1時間目及び4時間目に、血漿試料を採取した。尿を、代謝ケージに入れた各対のマウスから、投与から2時間目及び24時間目に採取した。血漿試料及び尿試料を、調製し、実施例17に記載のようにして分析した。
未共役治療剤に対するプロドラッグの利点
本発明のプロドラッグには、未共役形態の治療剤に対して治療上の利点がある。
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、腫瘍を有するマウスにおいて良好な耐容性を有する。
プロドラッグSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤は、反復投与条件下、ドキソルビシンよりも耐性が顕著によい。予想されるように、単回MTD(75mg/kg)(実施例16参照)と同様の投与量を反復投与したとき、耐性が低下した。腫瘍を有するマウスにおける反復投与試験では、各群がマウス10匹からなる3つの群に、0mg/kg、53mg/kg又は68mg/kgのSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox(1kg当たりドキソルビシン0mg、30mg及び38mgに相当)を、合計5回の同一の投与量(Q5DX5)で投与し、60日間、頻繁に観察した。全ての処置した動物は、試験全体を通して徐々に重量が減少したが、一方、媒質対照群の重量は、平均初期体重よりも12%まで増加した(図20)。高投与量群における2匹の処置動物が、体重がそれらの初期重量の20%超の重量損失が生じた毒性の兆候が生じたため、試験を終了した。毒性の兆候は、単回高投与(実施例16参照)した後に観察されたものと同様であり、げっし動物におけるドキソルビシンの公知の毒性プロファイルと一致した。このように、蓄積毒性が、比較的高投与レベルでの反復投与から生じた。しかしながら、5回投与後の2つの投与群における動物のドキソルビシンへの最大総暴露量は、それぞれ150mg/kg及び190mg/kgであった。これらの値は、ドキソルビシンの耐性反復投与レベル(5回投与後の総暴露量:4mg/kg又は20mg/kg)よりも、顕著に高い(8〜10倍)。しかしながら、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−DoxのRD−MTDは、ドキソルビシンの耐容要求投与レベル(4mg/kgを5回投与した後の総暴露量20mg/kgから成る標準安全RD有効投与量)よりも、少なくとも6〜5倍高い、約150mg/kgドキソルビシン当量であった。
Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、ドキソルビシンよりも生体内での耐容性がよい。
本発明の典型的なテトラペプチドプロドラッグであるSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、マウスにおいて、十分許容される。第二単回投与最大耐性量(SD−MTD)試験において、5つの正常ICRマウス群に、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、49日間、毎日観察し、体重を、1週間に2回測定した。試験投与量レベルは、0mg/kg、50mg/kg、75mg/kg又は100mg/kgであった(それぞれ1kg当たりドキソルビシン0mg、28mg、42mg又は56mgに相当する)。いずれの投与量レベルでも、24時間以内で急性毒性はなかった。投与量と時間に依存する毒性の兆候が、試験中に観察された。部分的な尻の麻痺及び顕著な体重損失(>初期重量の20%)を含む毒性が、75mg/kg投与量群及び100mg/kg投与量群において観察された。35日までに、75mg/kg投与量群の40%に死亡が観察された。49日目の生存動物及び毒性の兆候がないことに基づいて、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−DoxについてのSD−MTDを求めたところ、50mg/kg(ドキソルビシン28mg/kgに等しい)であった。この投与量は、極めてよく許容され、悪影響は観察されなかった。したがって、SD−MTDは、ドキソルビシン単独(16mg/kg)についてのSD−MTDよりも、モル基準で、約1.8倍高かった(表16参照)。これは、試験範囲にわたる14mg/kgドキソルビシン当量増分での投与量範囲に基づく、近似SD−MTD測定である。
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、腫瘍を有するマウスに効果的である。
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤は、ドキソルビシン耐性結腸直腸癌LS174tを用いたマウス異種移植片モデルにおける、マウスの寿命を延ばし、ヒト腫瘍の増殖を阻害するのに有効であることが分かった。例えば、ヌードマウス10匹からなる群に、約50mgまで増殖させたLS174t塊を皮下移植し、0mg/kg、53mg/kg又は68mg/kgのSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox(1kg当たりドキソルビシン0mg、30mg及び38mgに相当)を、5日間隔で、合計5回の同一の投与量(Q5DX5)で静脈内投与した。腫瘍と体重を、60日間、1週間に2回測定した。図21から明らかなように、両方の投与量とも、媒質対照動物と比較して、腫瘍の増殖を減少するのに有効であった。長期生存マウスが、媒質対照群では0匹であったのに対して、低投与量群及び高投与量群では、それぞれ4匹及び2匹であった。腫瘍が、60日前に1.5gに達した動物の平均生存日数(MDS)は、媒質対照群(18.2日)よりも、低投与量群(29.7日)及び高投与量群(23.4日)が、顕著によかった。このように、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、この投与処方下でのドキソルビシン単独での許容投与量(耐性投与量)(3mg/kg)ではこれまで効果がない、この積極的ヒト腫瘍モデルにおいて有効であった。
ヌードマウスにおけるLNCaP腫瘍に対するSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの効力
Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox治療剤は、前立腺癌LNCaPを用いたマウス異種移植片モデルにおける、ヒト腫瘍の増殖を阻害するのに有効であることが分かった。ヌードマウス6匹又は7匹からなる群に、4000000個のLNCaP細胞を皮下注射し、生理食塩水、ドキソルビシン5mg/kg又はSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox59mg/kg(1kg当たりドキソルビシン33mgに相当)を、7日間隔で、合計5回の同一の投与量(Q7DX5)で静脈内投与した。マウスの重量と腫瘍の測定(キャリパにより)を、投与開始前(0日目)に1週間に少なくとも一度おこない、それから試験中は1週間に2度おこなった。投与開始直前(試験日:−2日目〜0日目)に、マウスを、ランダムに、腫瘍重量を基準として種々の群に分けた。平均腫瘍重量は、0日目で約250mgであった。腫瘍の重量が、カットオフ重量である1.5g(癌エンドポイント)に到達したときか、又はマウスの重量損失が25%超(毒性エンドポイント)となったときに、マウスを安楽死させた。60日目で、試験を終了した。ドキソルビシンを投与した1匹のマウスは、腫瘍が潰瘍化したので、評価から除いた。
SCIDマウスにおけるLNCaP腫瘍に対する効力
次に、LNCaP異種移植片の試験を、次のように変更して実施した:SCIDマウスを使用し、ドキソルビシンとSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの両方についてより低い投与量を試験して、良好な耐容の投与量反応を得るとともに、投与回数を2回に制限し、これを6日間間隔をあけて実施して、化合物のベースライン腫瘍関連重量損失に対する相加的影響を最小限に抑制した。したがって、10匹のCB17.SCIDマウスからなる群に、2500000個のLNCaP細胞を皮下注射し、生理食塩水、ドキソルビシン3若しくは4mg/kg又はSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox40、50若しくは62mg/kg(それぞれ1kg当たりドキソルビシン22、28及び35mgに相当)を、6日間隔で、合計2回の同一の投与量(Q6DX2)で静脈内投与した。マウスの重量と腫瘍の測定(キャリパにより)を、投与開始前(0日目)に1週間に少なくとも一度おこない、それから試験中は1週間に2度おこなった。投与開始直前(試験日:−2日目〜0日目)に、マウスを、ランダムに、腫瘍重量を基準として種々の群に分けた。平均腫瘍重量は、0日目で約200mgであった。腫瘍の重量が、カットオフ重量である1.5g(癌エンドポイント)に到達したときか、又はマウスの重量損失が25%超(毒性エンドポイント)となったときに、マウスを安楽死させた。60日目で、試験を終了した。
Suc−Leu−Ala−Gly−Dox及びSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−DoxのLNCaP異種移植片に対する効力
LNCaPヒト前立腺癌細胞は、表面上で高レベルのCD10を発現する。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox及びSuc−Leu−Ala−Gly−Doxを、単回投与レベルQ7Dx5で試験した。8匹の雄NCrヌードマウスからなる群に、4000000個のLNCaP細胞を皮下注射し、生理食塩水、ドキソルビシン5mg/kg、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox59mg/kg(1kg当たりドキソルビシン33mgに相当)又はSuc−Leu−Ala−Gly−Dox73mg/kg(1kg当たりドキソルビシン47mgに相当;又は1kg当たりSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox81mgに相当)を、7日間隔で、合計5回の同一の投与量(Q7DX5)で静脈内投与した(表19)。マウスの重量と腫瘍の測定(キャリパにより)を、投与開始前(0日目)に1週間に少なくとも一度おこない、それから試験中は1週間に2度おこなった。投与開始直前(試験日:−2日目〜0日目)に、マウスを、ランダムに、腫瘍重量を基準として種々の群に分けた。平均腫瘍重量は、0日目で約250mgであった。腫瘍の重量が、カットオフ重量である1.5g(癌エンドポイント)に到達したときか、又はマウスの重量損失が25%超(毒性エンドポイント)となったときに、マウスを安楽死させた。60日目で、試験を終了した。ドキソルビシンを投与した1匹のマウスは、腫瘍が潰瘍化したので、評価から除いた。
CD10neg細胞系であるHT−29に対するSuc−Leu−Ala−Gly−Doxの効力
マウスの異種移植片試験では、Suc−Leu−Ala−Gly−Doxがヒト結腸癌(HT−29)の増殖に対して効力があることと、長期生存の効果があることが明らかとなった。健康な若い雄ヌードマウスに、5000000個のHT−29細胞を皮下注射した。腫瘍の重量が約100mgに達したとき、8匹のマウスからなる群、10匹のマウスからなる群又は12匹のマウスからなる群に対して、7日ごとに5回、媒質、ドキソルビシン4mg/kg、Suc−Leu−Ala−Gly−Dox40若しくは67mg/kg投与することを、開始した。腫瘍のサイズと体重を、1週間に2回、60日間、測定した。
チメットオリゴペプチダーゼ及びCD10による切断性と、効力との比較
腫瘍活性化プロドラッグ化合物の切断におけるCD10の生体内での役割をさらに評価するために、チメットオリゴペプチダーゼ及びCD10についての明確な切断プロファイルを有するドキソルビシン含有プロドラッグ化合物を、C.B−17.SCIDマウスにおいて増殖するLNCaP異種移植片で試験した。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−Ile−Ala−Leu−Dox及びSuc−Leu−Ala−Gly−Doxを、評価した。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox(3レベル)を除く全ての化合物は、2つのレベルで投与して、全ての化合物についての用量反応を得る試験をおこなった。試験化合物の各々についての切断プロファイルを、表21に示す。
薬物動態学的/代謝試験
ICR正常雌マウスの6つ群に、単回IVボーラス投与により、約100μモル/kgのSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Ala−Gly−Dox又は10μモル/kgのドキソルビシン(Dox)を投与した。血漿を、5分、1時間、2時間、4時間又は6時間の時点で、各群において3匹の個々の動物から得た。親濃度、ジペプチジル−ドキソルビシン(Ala−Leu−Dox、Ala−Gly−Dox)濃度、α−アミノアシル−ドキソルビシン(Leu−Dox又はGly−Dox)濃度及びドキソルビシン濃度を、蛍光検出(λex=480nm、λem=560)を利用した逆相勾配HPLC法を用いて、血漿試料の抽出物について分析した。標準を入手できなかったため、Ala−Gly−Doxのピーク保持時間は、確認しなかった。マウス血漿中における10〜2000ng/mLドキソルビシン溶液の測定に適合させた直線状標準曲線を用いて、量を求めた。
CD10をトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系の分析
CD10が、ペプチド前駆体薬剤を切断できること示す直接の確証を得るために、CD10トランスフェクション体細胞系を、分析した。
a5HindCD10 AAGCTTGCCGCCACCATGGGCAAGTCAGAAAGTCAGATG
a3XbaCD10 TCTAGAAGGGAGGCCAAGTCGAGGTTGGTC
b5XbaCD10 TCTAGAGATTACTATGAATGCACTGGAATC
b3XhoCD10 CTCGAGGTACTCATTATTCAGTTTGTTATC
c5XhoCD10 CTCGAGTTGAACTACAAAGAAGATGAATAC
c3PacCD10 TTAATTAATCACCAAACCCGGCACTTCTTTTC
ドキソルビシン感受性LNCaP前立腺癌モデルにおける、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox及びドキソルビシンによる腫瘍増殖阻害の比較
CD10陽性腫瘍細胞系(LNCaP)におけるSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox対ドキソルビシンの腫瘍阻害の相対的効力の比較を実施して、匹敵する用量反応及び治療指数を確定した。
3つの全ての投与量レベル(モル当量:18、22、28mgドキソルビシン/kg)でSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、22日目で腫瘍の増殖を顕著に阻害し、測定の最終日時点で、全てのマウスが生存していた(図30及び表29)。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの効力においては、投与量に関連した増加傾向はみられず、最大効力は、18mg/kgDox当量で得られた(図30)。さらに、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの3つの全ての投与量では、腫瘍増殖阻害が顕著であり、4mg/kgで投与したドキソルビシンよりも大きかった。この投与量でのドキソルビシンでは、対照からの統計的有意性は得られなかった(表29)。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの3つの全ての投与群では、腫瘍は、所定の癌エンドポイント(>1g)に達しなかった(図31)。したがって、ドキソルビシンではなく、 Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxでは、対照群に対して、腫瘍を有するマウスの生存日数が、顕著に増加した(表29)。
さらに、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、3つの全ての投与量で、極めて良好な耐容性があり、試験を36日目で終了したときには毒性エンドポイントに達するものがなく、群平均補正体重(腫瘍重量を引いた値)の最大損失は、3%であった(図32)。ドキソルビシン4mg/kgを投与したマウスは、22日目で一匹が毒性エンドポイント(重量損失>20%)となり、22日目での群平均補正体重損失は、約7%であった。また、対照群マウスでも、わずかに重量損失が生じ(群平均補正体重損失:最大5%)、腫瘍増殖によると思われる2匹が毒性エンドポイントに達した(表29)。
ドキソルビシン感受性LNCaP前立腺癌モデルにおけるSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox及びトリペプチドであるSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−DoxとSuc−Leu−Ala−Gly−Doxによる腫瘍増殖阻害の比較
腫瘍活性化プロドラッグ化合物の切断における細胞外CD10対TOP(チメットオリゴペプチダーゼ)の生体内の役割をさらに評価するために、CD10に対して明瞭な切断プロファイルを有するドキソルビシン含有プロドラッグ化合物を、ヌードマウス中で増殖させたCD10positiveLNCaP異種移植片で試験した。
固相法又は液相法を用いて合成したペプチド配列を、HPLC(A法、B法及びD法)分析の結果、粗生成物の純度が80%超である場合には、さらに精製することなく使用した。粗生成物の純度が80%以下の場合には、生成物を、さらに分取HPLCのC法を用いて精製した。
HPLC分析を、C−18カラム(4μm、3.9×150mm ID、流量1mL/分)を用いたWaters2690によりおこなった(溶媒A(0.1%TFA/H2O)及び溶媒B(0.1%TFA/ACN)の勾配で溶離)。得られたデータを、Waters Millenniumシステムを用いて、λ254nmで処理した。HPLC分析での勾配は、溶媒A90%から開始し、14分かけて最後に溶媒B100%とした(直線的に)。この方法及び以下の方法についての化合物の純度を、ピーク曲線下の相対面積%で評価した。
HPLC分析を、C−8カラム(3.5μm、4.6×150mm ID、流量1mL/分)を用いたWaters2690によりおこなった(溶媒A(80% 20mMギ酸アンモニウム及び20%アセトニトリル)及び溶媒B(20% 20mMギ酸アンモニウム及び80%アセトニトリル)の勾配を用いて溶離)。得られたデータを、Waters Millenniumシステムを用いて、λ254nmで処理した。HPLC分析での勾配は、溶媒A100%から開始し、30分かけて溶媒B100%とした(直線的に)。
粗生成物の分取精製を、C−4カラム(15μm、40×100mm ID、流量30mL/分)を用いたWaters Delta Prep4000システムにより実施した。溶離は、溶媒A(H2O)及び溶媒B(MeOH)の勾配によりおこなった。分取HPLCの勾配は、溶媒A80%から開始し、70分かけて溶媒B100%とした(直線的に)。UV検出は、λ254nmでおこなった。
HPLC分析を、TSK superODSカラム(TosoHaas社)を用いたHewlett Packard装置によりおこなった:溶媒A(TFA0.1%水溶液);溶媒B(TFA0.1%アセトニトリル溶液);勾配:2分間でB30%→36%、10分間でB36%→41%、3分間でB41%→90%、B90%で5分間、検出波長λ254nm。
さらなる構造測定をNMR法及びMS法でおこない、得られた結果は、請求の範囲に記載の化合物を裏付けるものであった。
TLC分析を、シリカゲル60F−254nm−0.25mmプレート(Merck社)を用い、DCM/MeOH/H2O/ギ酸88% 85/15/1/2の条件で溶離して、実施した。
数ミリグラムの生成物を試験管に入れ、2滴の溶液A(ニンヒドリンの50mg/mLエタノール溶液)、2滴の溶液B(フェノールの4mg/mLエタノール溶液)、そして2滴の溶液C(2mL 0.01M KSCN、ピリジン100mL、水性液)を添加した。得られた混合物を沸騰水浴に5分間入れた。遊離アミンの存在下では溶液は紫色になる。
市販試薬のソース
ドキソルビシン及びダウノルビシンは明治製菓株式会社(日本)製、Pd(PPh3)4はStrem chem社(マサチューセッツ州Newburyport)製、PEGはShearwater社(アラバマ州Huntsville)製、溶媒、HATUはAldrich社(ウィスコンシン州Milwaukee)製、全ての樹脂及びアミノ酸はABI社(カリフォルニア州Foster City)製、Novabiochem社(カリフォルニア州San Diego)製、Advanced Chem Tech社(ケンタッキー州Louisville)製、Peptide International社(ケンタッキー州Louisville)製又はSynPep社(カリフォルニア州Dublin)製であった。
Fmoc−Ile−Ala−Leu−OHの合成
トリペプチド(Fmoc−Ile−Ala−Leu−OH)を、標準的Fmoc化学的性質を用いた固相法により合成した。合成は、典型的にはWangアルコキシ樹脂(添加量0.60ミリモル/g)を使用した。Fmoc保護アミノ酸を、固相ペプチド合成に使用した。
Fmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−OHの合成
テトラペプチド(Fmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−OH)を、標準的Fmoc化学的性質を用いた固相法により合成した。合成は、典型的にはWangアルコキシ樹脂(添加量0.60ミリモル/g)を使用した。Fmoc保護アミノ酸を、固相ペプチド合成に使用した。樹脂に1mMペプチドとなるように、3当量のアミノ酸を、活性化剤としてのHBTUで5分間予備活性化した後、2当量のDIEAとともに、樹脂に添加した。カップリング反応を2時間実施した後、DMF(25mL×3)及びDCM(25mL×3)で洗浄した。このカップリング反応を、同様の条件下で、2当量のアミノ酸を用いて反復した。反応の進行を、ニンヒドリン試験で観察し、ニンヒドリン試験での確認で、2時間後で反応が不完全である場合には、3回目のカップリング工程を、反復した。脱保護は、ピペリジンをDMFに20%添加して調製した溶液を用いて、15〜20分間おこなった。カップリング工程を、次のアミノ酸を用いて、所望のペプチドが樹脂上にアセンブリされるまで反復した。ペプチドの樹脂からの最終的な切断は、樹脂を95%TFAと5%水からなる溶液で処理することによりおこなった。反応混合物を、室温(rt)で2時間攪拌した後、樹脂を、減圧濾過し、TFAで2回洗浄した。濾液を混合し、冷エーテル400mLを添加することにより、ペプチドを沈殿させた。ペプチドを、減圧濾過し、乾燥してFmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−OH(A法で求めたHPLC純度:92%)を得た。粗ペプチドを、MSにより特徴付けし、さらなる精製をおこなうことなく、次の工程に使用した。
Fmoc−Ile−Ala−Leu−Doxの合成
ドキソルビシン・HCl(2.34g、4.03ミリモル)及びFmoc−Ile−Ala−Leu−OH(2.4g、4.48ミリモル)を、室温で無水DMF(150mL)に溶解した。得られた溶液を、高速攪拌し、これにDIEA(1.56mL、8.96ミリモル)を一度に加え、反応混合物を室温で15分間攪拌した。反応混合物を、氷浴を用いて0℃に冷却し、HATU1.87g(4.92ミリモル)を、10分かけてゆっくりと添加した。この反応混合物を、室温でさらに60分間攪拌した。氷冷水(200mL)を、反応混合物に添加したところ、赤色沈澱が生じた。沈殿物を、粗フリット上に集め、水3×50mL及びジエチルエーテル3×50で洗浄し、減圧乾燥してFmoc−Ile−Ala−Leu−Dox(収率89%、A法で求めたHPLC純度:94%)を得た。この生成物を、MSにより特徴付けし、さらなる精製をおこなうことなく、次の工程に使用した。
Fmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−Doxの合成
ドキソルビシン・HCl(1.43g、2.5ミリモル)及びFmoc−βAla−Ile−Ala−Leu−OH(1.6g、2.6ミリモル)を、室温で無水DMF(150mL)に溶解した。得られた溶液を、高速攪拌し、これにDIEA(1mL、5.7ミリモル)を一度に加え、反応混合物を室温で15分間攪拌した。反応混合物を、氷浴を用いて0℃に冷却し、HATU1.07g(2.8ミリモル)を、10分かけてゆっくりと添加した。この反応混合物を、室温でさらに60分間攪拌した。氷冷水(200mL)を、反応混合物に添加したところ、赤色沈澱が生じた。沈殿物を、粗フリット上に集め、水3×50mL及びジエチルエーテル3×50で洗浄し、減圧乾燥してFmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−Dox(収率88%、A法で求めたHPLC純度:92%)を得た。この生成物を、MSにより特徴付けし、さらなる精製をおこなうことなく、次の工程に使用した。
Fmoc−Ile−Ala−Leu−DoxからのSuc−Ile−Ala−Leu−Doxの合成
乾燥DMF20mLにFmoc−Ile−Ala−Leu−Dox(4.4g、4.13ミリモル)を添加して調製した溶液に、ピペリジン(20.4mL、206ミリモル)を一度に添加したところ、色が赤色から紫色に変化した。反応混合物を、室温で5分間攪拌した後、乾燥氷/アセトン浴を用いて−20℃に冷却した。次に、無水コハク酸21.2g(210ミリモル)を、冷却した反応混合物に一度に添加した。反応液を、−5℃で5分間高速攪拌した後、室温でさらに90分間攪拌した。無水ジエチルエーテル750mLを、反応混合物に添加したところ、赤色沈殿が生じた。この沈殿を、中ガラスフリット上に単離し、ジエチルエーテル2×50mLで洗浄し、減圧乾燥してSuc−Ile−Ala−Leu−Doxを得た(収率80%、B法によるHPLC純度88%)。最終生成物を、分取HPLCのC法を用いて精製し、LC/MSにより特徴付けした。その結果、分子量が、939(予想分子量940)であった。
Fmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−DoxからのSuc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−Doxの合成
Fmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−Dox(4g、3.53ミリモル)を、乾燥DMF40mL添加して調製した溶液に、ピペリジン(17.4mL、176ミリモル)を一度に添加したところ、色が赤色から紫色に変化した。反応混合物を、室温で5分間攪拌した後、乾燥氷/アセトン浴を用いて−20℃に冷却した。次に、無水コハク酸18g(180ミリモル)を、冷却した反応混合物に一度に添加した。反応液を、−5℃で5分間高速攪拌した後、室温でさらに90分間攪拌した。無水ジエチルエーテル750mLを、反応混合物に添加したところ、赤色沈殿が生じた。この沈殿を、中ガラスフリット上に単離し、ジエチルエーテル2×50mLで洗浄し、減圧乾燥してSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxを得た(収率78%、B法によるHPLC純度86%)。最終生成物を、分取HPLCのC法を用いて精製し、LC/MSにより特徴付けした。その結果、分子量が、1011(予想分子量1012)であった。
Fmoc−βAla−Ile−Ala−Leu−OBnの合成
Fmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu(24.34g、0.04モル)を、DMF(350mL)とマグネチックスターラを入れた丸底フラスコに添加する。テトラペプチドを溶解後、溶液に、攪拌しながら臭化ベンジル(4.76mL、0.04ミリモル)を添加し、その後炭酸セシウム(13.04g、0.04モル)を添加する。得られた反応混合物を室温で1.5時間攪拌する。次に、反応混合物を、氷水450mLを入れたフラスコにゆっくりと注ぐ。その結果、多量の白色固体が沈殿し、それを吸引濾過により集める。この生成物を、水(2×200mL)で洗浄し、減圧デシケーターに入れる。
β−Ala−Ile−Ala−Leu−OBnの合成
丸底フラスコ(25mL)において、Fmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−OBn(0.7g、1.0ミリモル)を、無水DMFを5mLに溶解する。ピペリジン(1.2mL、12.1ミリモル)を溶液に添加し、得られた混合物を室温で25分間攪拌する。反応を、水(6mL)で停止し、酢酸エチル(2×10mL)で抽出する。混合した有機層を、さらに水(2×5mL)、食塩水(5mL)で洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥する。溶媒を除去すると、白色固体(0.8g)が得られる。
MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−OBnの合成
丸底フラスコ(250mL)で、メチルヘミスクシネート(3.19g、24.2ミリモル)を、無水DMF(50mL)に溶解する。DIEA(4.22mL、24.2ミリモル)、続いてHBTU(9.17g、24.2ミリモル)を、溶液に添加する。得られた混合物を、室温で45分間攪拌する。この混合物に、無水DMF(150mL)にβAla−Ile−Ala−Leu−OBn(粗生成物、10.14g含有、21.3ミリモル)を添加して調製した溶液を、添加する。混合物を、室温で2.5時間連続して攪拌する。次に、反応混合物を、氷水200mLを入れたフラスコに、攪拌しながらゆっくりと注ぐ。その結果、多量の白色固体が沈殿し、それを酢酸エチル(3×200mL)で抽出する。有機層を混合し、混合した有機層を、水(2×200mL)、食塩水(200mL)でさらに洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥する。
MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leuの合成
MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−OBn(1.0g、1.46ミリモル)を、メタノール100mLを入れたエルレンマイヤーフラスコに添加する。50mLのメタノールを加える。この溶液を水素添加反応容器に移す。この容器に、Pd−C(90mg、10%湿潤、50%水;0.042ミリモル)を添加する。室温で2時間水素添加した後、反応を停止、触媒を濾過する。
「尿素法」を用いた、MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu及びドキソルビシンのカップリング
乾燥窒素雰囲気下、MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu26.04g(52.0ミリモル)及びドキソルビシン塩酸塩23.26g(40.2ミリモル)とを、乾燥尿素飽和(ほぼ30%w/v)DMF800mL及びDIEA19.948mLに懸濁/溶解する。この混合物を、ほぼ25分間かけて0〜3℃に冷却する。この時点で、HATU21.2g(56.0ミリモル)を、10分間かけて、ほぼ100mLの尿素飽和DMFに添加した溶液として添加する(この溶液の容積は、最小限に保たなければならない)。反応混合物を、−2〜2℃で10分間攪拌し、2%(v/v)酢酸を含有する氷冷食塩水4000mLに、激しく攪拌しながら、約5分間かけて注ぐ。生成物を、中多孔度フリットガラスフィルター上に濾取し、水で十分に洗浄し、減圧乾燥する。
MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤の合成
丸底フラスコ(50mL)で、MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu(0.25g、0.5ミリモル)及びドキソルビシン(0.29g、0.5ミリモル)を、無水DMF(20mL)に溶解する。得られた混合物を、5分間攪拌後、DIEA(0.17mL、1.0ミリモル)、続いてHBTU(0.19g、0.5ミリモル)を、溶液に添加する。得られた混合物を、室温で4時間攪拌する。DMFを、ロータリーエバポレーターにより除去し、残留物を、1:1塩化メチレン:メタノール4.0mLに溶解する。この溶液に、エーテル40mLを、攪拌しながら、ゆっくりと添加する。沈殿物が形成し、これを吸引濾過により集める。得られた固体を、エーテル(2×10mL)で洗浄し、真空デシケータに入れて乾燥する。
MeOSuc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−Doxからの遊離ドキソルビシンの除去
MeOSuc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−Dox(200mg、0.194ミリモル)、DIEA(0.068mL、0.388ミリモル)及び無水DMF(10mL)を、磁気攪拌棒を備えた50mLフラスコに入れる。MeOSuc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−Doxが完全に溶解したら、イソシアネート樹脂(390mg(0.582)をジクロロメタン5mLに5分間予備膨潤したもの)を、添加し、得られた溶液を、定期的にHPLCで観察しながら、室温で2時間攪拌する。次に、Doxが完全に除去されたことをHPLCにより確認したら、反応混合物をフリットにより濾過して樹脂を除去する。この樹脂を、DMF10mlで洗浄し、DMF洗浄液を、濾過した反応混合物と混ぜる。次に、濾過反応混合物洗浄液を、高真空ポンプと30℃の水浴とを備えたロータリーエバポレーターにより濃縮する。残留物を、DMF5mLに懸濁し、次に、溶液を、高速攪拌した無水ジエチルエーテル溶液にゆっくりと添加する。次に、生成物を、フリット上に濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、減圧乾燥してMeOSuc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−Doxを得る。
架橋酵素を用いた、MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤の加水分解
MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤(1.0g、0.975ミリモル)及びDMF100mLを、500mLフラスコに入れる。得られた懸濁液を、マグネチックスターラーで激しく攪拌する。MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤が完全に溶解したら、脱イオン水400mLを添加し、得られた溶液を、35℃で攪拌する。洗浄したCLEC−PC(Altus Biologics社)固定化酵素の1gのスラリーを3アリコットの脱イオン水中ですすいだ後、20%DMF水溶液10mLに再懸濁してから、使用する。得られた懸濁液を、定期的にHPLCで観察しながら35℃で攪拌する。MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤の全てが消費されたら、反応混合物を、0.45μMナイロンメンブレンフィルターで濾過してCLEC−PC酵素を除去する。CLEC−PCケーキを、メタノール3×10mLで洗浄し、メタノール洗浄液を濾過した反応混合物と混ぜる。次に、濾過した反応混合物+メタノール洗浄液を、高真空ポンプと30℃水浴を備えたロータリーエバポレーターにより濃縮して赤色ガム状物を得る。次に、この赤色ガム状物を、室温で、脱イオン水50mLに懸濁し、メカニカルスターラーで高速攪拌する。この懸濁液に、脱イオン水100mLに重炭酸ナトリウム77.8mg(0.926ミリモル、0.95当量)に添加して調製した溶液を、2分間かけて添加する。得られた懸濁液を、室温で20分間攪拌する。反応混合物を、0.45μMナイロンメンブレンフィルターにより濾取し、凍結乾燥する。
可溶性酵素を用いた、MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤の加水分解
MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤11.0g(10.72ミリモル)を、HPLCグレード水800mLに懸濁し、Ultraturrax T8ホモジナイザーにより、60分間均一化して微細懸濁液を得る。この懸濁液を、35℃で攪拌(500rpm)し、76mM NaHCO3水溶液を添加してpH6.05に調整する。次に、1.0g C.Antarctica「B」リパーゼ(Altus Biologics社)を添加し、反応混合物を、35℃で48時間攪拌する。この48時間の反応時間の間、76mM NaHCO3を定期的に添加することにより、pHを5.3〜6.2に維持し、反応を定期的にHPLCで観察する。反応がほぼ完了したら、次に反応混合物に、76mM NaHCO3水溶液を添加してpH7に調整し、Celite521パッドにより濾過する。次に、清澄反応混合物に、氷酢酸5mLを添加して酸性化(pH約3)する。生じた沈殿物を、Celite521で濾過して単離した後、Celiteパッドをメタノールですすぐ。メタノール溶液を、10〜20μMフリットガラスフィルターで濾過し、ロータリーエバポレーターにて乾燥する。得られた生成物を、76mM NaHCO3(0.95当量)70mLに溶解することにより、ナトリウム塩に転換し、凍結乾燥する。この生成物は、実施例45の生成物と同一である。
固定化Candida Antarctica「B」リパーゼによる、MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤の加水分解
Candida Antarctica「B」リパーゼ(Altus Biologics社)30.0gを、水300mLに溶解し、50mM NaHCO3水溶液(pH=6.4)3×4リットルに対して透析する。ファーマシア(Pharmacia)NHS−活性化セファロース4ファーストフロー(Sepharose 4 Fast Flow)360mLを、粗ガラスフリット漏斗に入れ、それを氷冷1mM HCl水溶液5×450mLですすぐ。次に、すすいだNHS−活性化セファロースを、透析した酵素溶液と混ぜる。得られた懸濁液を、周囲温度(約22℃)で2.0時間攪拌する。次に、セファロース/酵素複合体を、粗フリットガラスフィルター上に単離した後、100mM TRIS水溶液(pH=7.45)1000mLに添加して、15分間攪拌する。この懸濁液を、濾過し、別の100mM水性TRIS緩衝液(pH=7.45)1000mLとともに、4℃で一晩インキュベーションする。朝に、固定化酵素を、濾取し、水洗後、2000mLの3つ口丸底フラスコに入れる。MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤43gを添加し、固体を、脱イオン水800mLに懸濁する。フラスコに、オーバーヘッドスターラーを取り付け、シリンジポンプを制御することにより、反応混合物のpHが5.9〜6.2に保たれるようにpHシュタット設定する。シリンジポンプに、0.1M NaHCO3をチャージする。反応の進行を、HPLCにて追跡する。反応がほぼ完了したら、固定化酵素を濾去し、液相を凍結乾燥する。次に、乾燥固体を、乾燥THF約11mLに懸濁し、濾過する。
メチルスクシニル−N−Cap型βAla−Leu−Ala−Leu−Dox治療剤の大規模合成
ドキソルビシン・HCl69.6g(120ミリモル)とMeOSuc−bAla−Leu−Ala−Leu100g(199ミリモル)とを、窒素下、無水DMF(10L)に溶解した。DIEA76mL(434ミリモル)を、反応混合物に添加し、この反応混合物を、窒素下、室温で10分間攪拌した。次に、反応混合物を、10分間かけて、0℃に冷却した。別個のフラスコに、HATU864g(220ミリモル)をDMF(500mL)に添加して、溶液を調製した。このHATU溶液を、反応混合物に、反応混合物を0℃に維持しながら、20分間かけてゆっくりと添加した。反応混合物を、0℃で30分間攪拌した。
微量のドキソルビシンを除去するための、Ps−イソシアネートビーズを用いたMeOSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの処理
PS−イソシアネートビーズ146.4g(240ミリモル、カリフォルニア州San CarlosにあるArgonaut Lab社製)を、無水DMF1.5Lに溶解し、得られた溶液を、室温で5〜10分間膨潤させた。膨潤ビーズを、ガラスフリット漏斗により濾過し、追加の無水DMF500mLで洗浄した。MeOSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox115g(112ミリモル)を、無水DMF1000mLに溶解し、DIEA2.1mL(12ミリモル)を添加後、膨潤PS−イソシアネートビーズを添加した。反応混合物を、室温で攪拌し、ドキソルビシンピークの量が0.1%未満となるまで、HPLCを用いて観察した。これには、バッチのサイズによって、2〜12時間かかる。HPLC分析は、Water2690カラム:Waters Symmetry Shield C83.5μM 4.6×150mm(カタログ番号WAT094269)、溶媒A:20mMギ酸アンモニウム水溶液(pH=4.5)80%、アセトニトリル20%、溶媒B:20mMギ酸アンモニウム水溶液(pH=4.5)20%、アセトニトリル80%によりおこなった。カラム温度:制御室温、試料温度:4℃、試験時間:37.5分、検出:254nm、流量:1.0mL/分、注入量:10μg(0.5mg/mL×0.02mL)、移動相A及びB。勾配:7.5分間平衡遅延による、移動相A100%から移動相B100%までの、37.5分間直線状勾配。
Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxを得るための、MeOSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの酵素加水分解
CLEC−CAB(Candida Antarctica「B」リパーゼ)酵素を、溶液の形態で購入した(マサチューセッツ州ボストンにあるAltus Biologics社製)。ここで、酵素濃度は、溶液1ミリリットル当たりの乾燥酵素の重量として定義される。粗酵素懸濁液を、数分間震盪して均一溶液を得た。この均一溶液の504mL(328ミリモル)アリコットを、フラスコに入れた。脱イオン水2.5Lを添加し、得られたスラリーを、マグネチックスターラーを用いて、10分間攪拌した。酵素溶液を、酵素を乾燥させずに、粗ガラスフリット漏斗を用いて濾過した。この酵素を、フラスコに戻した。酵素を、水に懸濁し、3回以上濾過した。
ヒドロキシル 3379cm-1
C−H 3000〜2700
カルボニル 1650〜1725
この帰属部位を含む構造と一致する。したがって、炭素シグナルが、約50ppmでの溶媒シグナルの下に隠れており、窒素に隣接するメチレンに場合と一致すると思われる。
Claims (6)
- プロドラッグを設計する方法であって、以下の:
(1)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nは0〜3であり、mは0〜3であり、そしてm+nが3以下であり、
AAP2は、疎水性アミノ酸であり、
AAP1は、アルギニン、アラニン、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、グルタミン、バリン及びセリンからなる群から選択され、
AAP1 ’は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン及びプロリンからなる群から選択され、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドを準備する工程と、
(2)上記オリゴペプチドを当該オリゴペプチドの第一結合部位で、全血に存在する酵素による当該オリゴペプチドの切断を阻害する安定化基に結合させる工程であって、ここで、該安定化基は、アスパラギン酸のβ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合しているアスパラギン酸、及びグルタミン酸のγ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合しているグルタミン酸からなる群から選択される前記工程と、
(3)上記オリゴペプチドを当該オリゴペプチドの第二結合部位で、治療剤に直接的又は間接的に結合させる工程であって、
工程(2)及び工程(3)を、いずれの順序で実施してもよいし、同時に実施してもよく、さらに、工程(1)〜(3)を実施することにより複合体が形成され、
(4)CD10により前記複合体を切断できるかどうかを試験する工程と、
(5)前記複合体がCD10により切断されることができる場合には、前記複合体をプロドラッグとして選択する工程と、
を含む前記方法。 - 前記第一結合部位が、前記オリゴペプチドのN末端である、請求項1に記載の方法。
- 前記第二結合部位が、前記オリゴペプチドのC末端である、請求項1に記載の方法。
- 前記第一結合部位が、前記オリゴペプチドのC末端である、請求項1に記載の方法。
- 前記第二結合部位が、前記オリゴペプチドのN末端である、請求項1に記載の方法。
- プロドラッグを設計するのに有用なオリゴペプチドを同定するための、スクリーニング方法であって、以下の:
(1)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nは0〜3であり、mは0〜3であり、そしてm+nが3以下であり、
AAP2は、疎水性アミノ酸であり、
AAP1は、アルギニン、アラニン、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、グルタミン、バリン及びセリンからなる群から選択され、
AAP1 ’は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン及びプロリンからなる群から選択され、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドを準備する工程と、
(2)CD10により上記オリゴペプチドを切断できるかどうかを試験する工程であって、CD10による切断性が、プロドラッグを設計するための候補としての上記オリゴペプチドの目安である工程と、
を含む前記方法。
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