JP2004537527A - Cd10活性化プロドラッグ化合物 - Google Patents
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Abstract
Description
【0001】
本発明は、プロドラッグとして有用な新規な化合物に関する。このようなプロドラッグは、患者の疾患、とりわけ腫瘍を治療するのに使用できる。
【背景技術】
【0002】
数多くの治療剤、例えば、アントラサイクリン及びビンカアルカロイドは、とりわけ癌の治療に効果的である。しかしながら、これらの分子は、生体内において、急性毒性、とりわけ骨髄毒性及び粘膜毒性だけでなく、アントラサイクリンの場合に慢性心毒性、及びビンカアルカロイドの場合には慢性神経毒性の特徴を示すことがしばしばある。同様に、メトトレキサートを、リウマチ性疾患等の炎症反応の治療に使用できるが、その毒性が大きいためにその用途が限られている。したがって、より特異的で且つより安全な抗腫瘍剤を開発することが、腫瘍細胞に対する大きな効果及びこれらの製品の副作用(毒性、非腫瘍細胞の破壊等)の数及び重症度を減少させるために、望ましい。また、より特異的な抗炎症剤の開発も、望ましい。
【0003】
毒性の問題を最小限に抑えるためには、治療剤を、プロドラッグの形態で患者に投与することが有利である。プロドラッグは、生体内において、それらの構造のある種の化学的又は酵素的修飾により薬剤(活性治療化合物)に転換されることのできる分子である。毒性を減少させるために、この転換は、循環系又は非標的細胞ではなく、作用部位又は標的組織に限定されなければならない。しかしながら、プロドラッグは、血液及び血清において安定性が低いという特徴を示すことがしばしばある。これは、血液及び血清中に酵素が存在し、これにより、プロドラッグが患者の体内の所望の部位に到達する前に分解され、その結果、活性化されることがあるためである。
【0004】
このような問題を克服する望ましい種類のプロドラッグが、PCT国際公開WO96/05863及び米国特許第5,962,216号に開示されている。これらの両方とも、引用することにより本明細書の内容とする。しかしながら、さらに有用なプロドラッグ化合物及びこのようなプロドラッグの製造方法が、開発されることが望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
とりわけ既存の類似の構造を有するプロドラッグに対して、高度に特異的な作用、減少した毒性、及び血液中での向上した安定性を示すプロドラッグが、特に望まれている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の化合物は、プロドラッグ型治療剤である。この治療剤は、オリゴペプチドに直接的又は間接的に結合しており、次にこのオリゴペプチドが安定化基に結合している。この化合物は、CD10により切断されることができる。本発明のプロドラッグは、高度の特異的作用、減少した毒性、血清及び血液中での改善された安定性を示し、CD10により活性化されるまで、標的細胞には入らないか、入ったとしても最小限である。また、CD10又は別のサーモリシン様酵素により切断されることのできる複合体も、本発明に含まれる。
【0007】
また、本発明は、本発明による化合物と、任意の薬学的に許容される担体、補助剤、媒質等を含む、医薬組成物に関する。診断又はアッセイ用キット等の製品も、記載される。
【0008】
さらに、治療剤を修飾することによりプロドラッグを生成することにより、プロドラッグを設計する方法及び毒性を減少させる方法が、開示される。このような修飾により、遊離の治療剤と比較して、治療指数が改善される。CD10により切断されることのできる好適な配列のオリゴペプチドをスクリーニングする方法は、プロドラッグの設計に利用できる。
【0009】
さらに、本発明には、本発明のプロドラッグを投与することによる、腫瘍等の病状又は疾患を治療する方法も、含まれる。病状には、CD10関連標的細胞が関与している。
【0010】
いくつかのプロドラッグの製造方法も、本発明に含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【0011】
略語
ACN=アセトニトリル
Aib=アミノイソ酪酸
All=アリル
Aloc=アリルオキシカルボニル
Amb=4−(アミノメチル)安息香酸
APP=3−アミノ−3−フェニルプロピオン酸
DCC=N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
Boc=t−ブチルオキシカルボニル
Cap=アミノカプロン酸
DBN=1,5−ジアザビシクロ[4.3.0]ノン−5−エン
DBO=1,4−ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン
DBU=1,8−ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデセ−7−エン
Dox−HCL=ドキソルビシンの塩酸塩
DCM=ジクロロメタン
DIC=N,N’−ジイソプロピルカルボジイミド
DIEA=ジイソプロピルエチルアミン
Dg=ジグリコール酸
DMF=ジメチルホルムアミド
Dnr=ダウノルビシン
Dox=ドキソルビシン
Et2O=ジエチルエーテル
Fmoc=9−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Gl=グルタル酸
HATU=O−(7−アザベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート
HBTU=2−(1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)1,1,3,3−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート
HEPES=ヒドロキシエチルピペリジン
HOBt=N−ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC=高圧液体クロマトグラフィー
MeOH=メタノール
MeOSuc=メチルヘミスクシニル/メチルヘミスクシネート
MTD=最大耐性量
NAA=3−アミノー4,4−ジフェニル酪酸
Nal=2−ナフチルアラニン
Naph=1,8−ナフタレンジカルボン酸
Nle=ノルロイシン
NMP=N−メチルピロリジン
Nva=ノルバリン
PAM樹脂=4−ヒドロキシメチルフェニルアセトアミドメチル
Pyg=ピログルタミン酸
Pyr=3−ピリジルアラニン
rRTOP=組み換えラットTOP
RT,rt=室温
Suc=コハク酸/スクシニル
TCE=トリクロロエチル
TFA=トリフルオロ酢酸
THF=テトラヒドロフラン
Thi=2−チエニルアラニン
Thz=チアゾリジン−4−カルボン酸
Tic=テトラヒドロイソキノリン−3−カルボン酸
TOP=チメットオリゴペプチダーゼ
【0012】
本発明には、プロドラッグ型治療剤として説明される化合物が含まれる。この治療剤は、オリゴペプチドに直接的又は間接的に結合されており、このオリゴペプチドは、安定化基に結合されている。必要に応じて、リンカー基が、治療剤とオリゴペプチドとの間に存在していてもよい。オリゴペプチドは、長さにおいて少なくとも3種のアミノ酸であり、好ましくは長さにおいて3〜6種のアミノ酸である。この化合物は、CD10酵素により切断されやすいという特徴がある。
【0013】
プロドラッグ
より詳細には、本発明のプロドラッグは、修飾型治療剤であり、
(1)治療剤、
(2)オリゴペプチド、
(3)安定化基及び
(4)場合によりリンカー基
等のいくつかの部分を含む。
【0014】
プロドラッグのこれらの各部分を、以下でより詳細に説明する。プロドラッグのこれらの部分の典型的な位置づけは、以下のとおりである:
(安定化基)−(オリゴペプチド)−(任意のリンカー基)−(治療剤)。
【0015】
安定化基は、オリゴペプチドの第一結合部位で、オリゴペプチドに直接結合している。オリゴペプチドは、オリゴペプチドの第二結合部位で、治療剤に直接的又は間接的に結合している。オリゴペプチド及び治療剤が間接的に結合している場合には、リンカー基が、存在する。
【0016】
プロドラッグの2つの部分が直接的に結合している場合、これらの2つの部分の間に、共有結合が存在することを意味している。したがって、安定化基及びオリゴペプチドは、オリゴペプチドの第一結合部位、典型的にはオリゴペプチドのN末端で、共有化学結合を介して、直接的に結合している。オリゴペプチド及び治療剤が直接的に結合しているときには、オリゴペプチドの第二結合部位で互いに共有結合している。オリゴペプチドの第二結合部位は、典型的にはオリゴペプチドのC末端であるが、オリゴペプチドの他の場所でもよい。
【0017】
プロドラッグの2つの部分が間接的に結合している場合、2つの部分の各々が、リンカー基に共有結合していることを意味する。別の実施態様によれば、プロドラッグは、オリゴペプチドが治療剤に間接的に結合している。したがって、オリゴペプチドは、リンカー基に共有結合しており、このリンカー基が治療剤に共有結合している。
【0018】
別の実施態様では、プロドラッグの配位を逆にして、安定化基をこれらのオリゴペプチドのC末端でオリゴペプチドに結合し、治療剤をオリゴペプチドのN末端に直接的又は間接的に結合するようにしてもよい。したがって、別の実施態様によれば、オリゴペプチドの第一結合部位はオリゴペプチドのC末端でよく、オリゴペプチドの第二結合部位はオリゴペプチドのN末端でよい。治療剤とオリゴペプチドとの間には、リンカー基が場合により存在してもよい。本発明のプロドラッグの別の実施態様は、第一の実施態様と同様に機能する。
【0019】
本発明のプロドラッグは、典型的にはオリゴペプチド部分内で切断されることができる。プロドラッグが効果的であるためには、プロドラッグは、典型的には生体内で修飾されて、標的細胞に入ることができるプロドラッグの部分を生成する。プロドラッグのオリゴペプチド部分内の第一の切断は、プロドラッグの活性部分、すなわち、標的細胞への輸送に適したプロドラッグの部分を、切断生成物の一つとして残すことができる。別法として、プロドラッグの輸送に適した部分を生じさせるためには、一種以上のペプチダーゼによるさらなる切断が必要なことがある。プロドラッグの活性又は輸送に適した部分は、少なくとも治療剤を有し、且つ標的細胞に侵入して、治療効果を、直接又は標的細胞内でのさらなる転換により示すことができるプロドラッグの部分である。
【0020】
したがって、化合物は活性部分を有し、この活性部分は、標的細胞と関連した酵素により切断した後の方が、このような切断をする前よりも標的細胞に、もっと侵入することができる。安定化基及びオリゴペプチドの構造は、血液又は非標的組織に存在することができる酵素によるプロドラッグの除去及び代謝作用を制限するように選択され、且つさらに、プロドラッグの細胞への輸送が制限されるように選択される。安定化基は、生体内におけるエクソペプチダーゼによるプロドラッグの切断をブロックし、さらに、プロドラッグの好ましい電荷又は他の物性を賦与するように作用することができる。オリゴペプチドのアミノ酸配列は、標的細胞に関連する酵素であり、以下でより詳細に説明する、CD10により切断されることができるように選択される。異なる長さのオリゴペプチドを有するプロドラッグを、本発明に使用することができるが、少なくとも3種のアミノ酸のオリゴペプチドが好ましく、3〜6種のアミノ酸のオリゴペプチドがとりわけ好ましい。
【0021】
治療剤、とりわけ抗腫瘍治療剤及び/又は抗炎症治療剤を修飾して、プロドラッグ形態とすることにより、不活性とすることが望ましい。本発明によれば、標的細胞は、通常腫瘍細胞、又は炎症反応に関与、とりわけリウマチ性疾患と関連している炎症反応に関与している、マクロファージ、好中球及び単球等の細胞である。治療剤を修飾してプロドラッグの形態とすると、治療剤の副作用の一部分も減少する。
【0022】
プロドラッグは、患者に投与され、安定な形態で血流を介して搬送され、標的細胞の付近で、標的細胞関連酵素により認識され、修飾される。酵素活性は、細胞外の正常細胞付近に存在するのは最小限でしかないので、プロドラッグは、活性化されず、その輸送に適した部分(治療剤を含む)が正常細胞に入るのはほんの最小限でしかない。しかしながら、腫瘍又は他の標的細胞付近では、局部的環境において関連酵素の存在量が増加するので、プロドラッグの切断が生じる。プロドラッグ形態から修飾され、標的細胞に侵入すると、治療剤(必要に応じて、一つ以上のアミノ酸及びおそらくリンカー基にも結合している)が作用して、標的細胞を殺したり、標的細胞の増殖をブロックする。図2は、典型的なプロドラッグが細胞外で切断され、標的細胞に侵入する例を示している。一旦標的細胞内に入ると、さらに修飾されて治療効果を得ることができる。プロドラッグの一部分が、正常細胞に接近したり、損傷させたりすることがあるが、プロドラッグの輸送に適した部分は、標的細胞の付近に主に放出される。したがって、正常細胞に対する毒性を、最小限に抑えることができる。
【0023】
本発明の化合物は、全身循環及び正常組織において、高安定性、すなわち、活性治療剤の放出レベルが低いので、良好なプロドラッグである。本発明のプロドラッグは、血液中又は正常組織中では顕著には活性化されないけれども、腫瘍部位又は他の標的部位で活性化される。その結果、本発明のプロドラッグは、公知の化合物と比較して、改善された治療指数、改善された毒性プロファイル及び好ましい薬動力学を有している。
【0024】
特定の理論には限定されないが、CD10により認識されることができる特定の配列を有する化合物は、CD10酵素又は類似のサーモリシン様酵素により、標的細胞付近で活性化される。CD10は、標的細胞寿命サイクルの少なくとも一部分の間、存在する。
【0025】
本発明の好ましい実施態様には、CD10によりオリゴペプチド部分が切断されることのできるが、チメットオリゴペプチダーゼ(「TOP」)による切断には耐性を有する化合物が含まれる。TOPは、WO00/33888においてより詳細に記載されている種類の酵素に属するものであると思われる。さらなる実施態様によれば、化合物は、好ましくはさらに前立腺特異的抗原(PSA)による切断に対する耐性があるという特徴があるオリゴペプチドを含む。このような耐性は、生理学的条件下で測定される。
【0026】
これについて、化合物は、一定の酵素の精製試料による切断速度が、意図する化合物と同じ治療剤にカルボキシル末端を介して共役しているSuc−βAla−Leu−Ala−Leuの切断速度の15%以下、好ましくは5%以下、理想的には1%以下である場合には、切断に対して耐性がある。この速度は、同じアッセイ条件下で比較しなければならない。
【0027】
化合物と一定の酵素とを、生理学的条件、特に標的細胞の外側のモデルの実験条件下でインキュベーションしたときに、1時間当たり化合物の10%超、好ましくは1時間当たり化合物の50%超が切断される場合には、この化合物は、この酵素により切断されることができる。実験条件下での一定酵素の濃度は、標的組織の細胞外環境を示すものでなければならない。
【0028】
ここで、本発明の化合物は、
(1)標的細胞に侵入できる治療剤と、
(2)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
(式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、
各AAは独立してアミノ酸を表す)
で表されるオリゴペプチドと、
(3)安定化基と、
(4)場合によりリンカー基と、
を含み、
前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第一結合部位で前記安定化基に直接結合しており、前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第二結合部位で前記治療剤に直接結合しているか、前記治療剤に前記リンカー基を介して間接的に結合しており、
前記安定化基が、全血に存在する酵素による前記化合物の切断を阻害し、
前記化合物が、CD10により切断されることができる。
【0029】
好ましくは、nは0〜3であり、mは0〜3であり、m+nが3以下である。
【0030】
この化合物は、生理学的条件下でCD10により切断されることができる。
【0031】
本発明の化合物は、当該技術分野において具体的に開示されているものを含まない。例えば、WO00/33888、米国特許第5,962,216号、WO00/69472、WO98/52966、米国特許第5,599,686号及び他の刊行物が、関連がある。したがって、前記化合物のオリゴペプチドがLeu−Ala−Leuであるときには、前記安定化基がスクシニル若しくはβAlaではなく、又は前記治療剤がドキソルビシン及びダウノルビシンのうちの一方ではない。同様に、前記オリゴペプチドがβAla−Leu−Ala−Leuであるときには、前記安定化基がスクシニルではなく、又は前記治療剤がドキソルビシン及びダウノルビシンのうちの一方ではない。前記オリゴペプチドがβAla−Leu−Ala−Leuであるときには、前記安定化基がグルタリルではなく、又は前記治療剤がドキソルビシンではない。さらに、前記化合物が、Succ−Ala−Leu−Ala−Leu−Dnr、pGlu−Ala−Leu−Ala−Leu−Dox、D−Ala−Leu−Ala−Leu−Dnr、D−Leu−Ala−Leu−Ala−Leu−Dnr、D−Leu−D−Ala−Leu−Ala−Leu−Dnr、アセチル−His−Ser−Ser−Lys−Leu−Gln−Dox、モルホリノカルボニル−His−Ser−Ser−Lys−Leu−Gln−Leu−Dox、N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド−Gly−Phe−Leu−Gly−Dox、N−グルタリル−(4−ヒドロキシプロリル)−Ala−Ser−シクロヘキシルグリシン−Gln−Ser−Leu−Dox、N−Cbz−Gly−Phe−Ala−Leu−Dox及びN−Cbz−Gly−Phe−Ala−Leu−PABC−Doxからなる群から選択されたものではない。
【0032】
標的細胞関連酵素
本発明のプロドラッグは、患者の体内の標的部位又はその付近での標的細胞に関連する酵素との相互作用による優先活性化を利用するように設計される。標的細胞関連酵素の全体又は標的細胞関連酵素の少なくとも活性部位が、外側細胞表面と関連しているか、結合している。別法として、標的細胞関連酵素が、標的細胞の細胞外付近において、分泌されるか、放出されるか、又はある他の方法で存在することができる。
【0033】
従来開示されている標的細胞関連酵素の一つは、trouaseである。この酵素は、WO00/33888により詳細に記載されている。trouaseは、一種の酵素と思われ、チメットオリゴペプチダーゼ(「TOP」)が、これに属する。trouaseは、選択性と切断において、高度の識別性がある。trouaseは、オリゴペプチドの切断部位のカルボキシル側でロイシンとイソロイシンとの間で著しい差異を示すエンドペプチダーゼである。適切なアッセイ条件下で、trouaseは、スクシニル−βAla−Leu−Ala−Leu−ダウノルビシンを容易に切断するが、スクシニル−βAla−Ile−Ala−Leu−ダウノルビシンについては活性が少なくとも20倍小さいという明確な特徴がある。
【0034】
本発明に特に関連しているがtrouase酵素とは異なる、別の標的細胞関連酵素は、CD10である。
【0035】
CD10の歴史
CD10が最初に報告されたのは、中性pHでの125ヨードインスリンB鎖を加水分解できるラットの腎臓の刷子縁膜における活性であった(Wong−Leung等、「Some properties of a microsomal peptidase in rat kidney(ラットの腎臓におけるミクロソームペプチダーゼのある特性)」、Biochem.J.110:5P(1968))。したがって、この酵素が、腎臓刷子縁中性プロテイナーゼと称された。この酵素は、メタロペプチダーゼであることが判明した (Neprilysin,Turner,Handbook of Proteolytic Enzymes、1080−1085(1998))。CD10は、独立してエンケファリンの失活を引き起こす脳膜酵素としても見出された(Malfroy等、「High−affinity enkephalin−degrading peptidase is increased after morphine(モルヒネの後で高親和性エンケファリン分解ペプチダーゼが増加する)」、Nature、276:523−526(1978))。これにより、慣用名エンケファリナーゼが使用されるようになった。また、CD10は、一般的に、文献では、ネプリリシン又は中性エンドペプチダーゼ24.11又はEC3.4.24.11又はNEPと称されている。酵素のクローニング及び配列決定(Devault等、「Amino acid sequence of rabbit kidney neutral endopeptidase−24.11(enkephalinase) deduced from a complementary DNA(相補DNAから推定されたウサギ腎臓中性エンドペプチダーゼ−24.11(エンケファリナーゼ)のアミノ酸配列)」、EMBOJ,6:1317−1322(1987))により、白血球細胞表面抗原と同一であるとの認識に至った。この抗原は、一般的な急性リンパ芽球性白血病抗原(CALLA又はCD10)であり、プレ−B細胞白血病群に存在する(LeTarte等、「Common acute lymphocytic leukemia antigen is identical to neutral endopeptidase(一般的な急性リンパ球性白血病抗原は、中性エンドペプチダーゼと同一である)」、J.Exp.Med,168:1247−1253(1988))。
【0036】
CD10の生物学的活性
CD10は、実質的に長さが約40個以下であるアミノ酸のペプチドを加水分解するオリゴペプチダーゼである。但し、一般的に、加水分解効率は、ペプチドの長さの増加とともに減少する。最も効率的に加水分解される基質の一つは、ウンデカペプチド物質Pである(Matsas等、「The metabolism of neuropeptides: the hydrolysis of peptides, including enkephalins, tachykinins and their analogues by endopeptidase−24.11(神経ペプチドの代謝:エンドペプチダーゼ−24.11によるエンケファリン、タキキニン及びそれらの類似物を含むペプチドの加水分解)」、Biochem J,223:433−440(1984))。生体内での主要な基質は、エンケファリン、タキキニン、例えば、物質P、及び心房性ナトリウム利尿ペプチドファミリーであると思われる。
【0037】
文献によれば、主要な特異性要件は、P1’位置におけるバルク疎水性残基であり、この酵素は、通常エンドペプチダーゼとして機能する。P1’位置におけるLeuは最高の加水分解速度を示すが、一方、Pheは最低のKm値を示す。文献における最小の確認された基質は、化学走化性ペプチドホルミル−Met−Leu−Pheである。これは、Met-|-Leu結合で切断が生じる(Connelly等、「Neutral endopeptidase 24.11 in human neutrophils: cleavage of chemotactic peptide(ヒト好中における中性エンドペプチダーゼ24.11:化学走化性ペプチドの切断)」、Proc.Natl Acad.Sci.,USA,86:7103−7107(1985))。
【0038】
この酵素は、少なくとも4個のアミノ酸側鎖を収容する長い活性部位を有する。CD10による加水分解を効率的にするコンセンサス配列は、−Phe−Phe−Gly-|-Phe−Leu−(Ala)−(Neprilysin,Turner,Handbook of Proteolytic Enzymes 1080−1085(1998))として提案されている。ある基質の場合、CD10は、例えば、[Leu]−エンケファリン:Tyr−Gly−Gly-|-Phe−Leu(kcat/Km43.9分−1mM−1)の加水分解において、ペプチジル−ジペプチダーゼ形質を示す。[Leu]−エンケファリンのC末端アミド化誘導体の加水分解効率は、はるかに低い((kcat/Km1.7分−1mM−1)。これは、[Leu]−エンケファリンにおける遊離C末端カルボキシレート基と、酵素の活性部位におけるアルギニル残基(Arg102)との相互作用を反映している(Bateman等、「Identification of the active site arginine in rate neutral endopeptidase 24.11 (enkephalinase) as Arg 102 and analysis of a glutamine 102 mutant(速度による中性エンドペプチダーゼ24.11(エンケファリナーゼ)の活性部位アルギニン、Arg102の同定及びグルタミン102突然変異体の分析)」、J.Biol.Chem,264:6151−6157(1989))。他の生物学的に活性な基質の切断の位置の例として、物質Pについては、Arg−Pro−Lys−Pro−Gln−Gln-|-Phe-|-Phe−Gly-|-Leu−Met−NH2がある。この場合、加水分解のコンセンサス配列と一致するGly-|-Leu結合で、加水分解速度が最も高い。ニューロテンシンでは、以下の加水分解部位がみられる:Pyg−Leu−Tyr−Glu−Asn−Lys−Pro−Arg−Arg−Pro-|-Tyr-|-Ile−Leu。コレシストキニン−8では、Asp−Tyr−Met−Gly-|-Trp−Met−Asp-|-Phe−NH2である。合成基質及び天然ペプチドについてのKm値は、通常10μM〜1mMの範囲である。
【0039】
文献によれば、CD10の最適pHは、6.0である(Neprilysin,Turner,Handbook of Proteolytic Enzymes 1080−1085 (1998))。CD10は亜鉛キレート化試薬により阻害され、酵素の種々の合成阻害剤が設計された。そのうちで最初のものが、チオルファン([DL−3−メルカプト−2−ベンジルプロパノイル]−グリシン)であった。
【0040】
CD10の構造化学
CD10は、原形質膜タンパク質のII型一体膜タンパク質である。これは、タンパク質の大部分とともに外酵素として存在し、活性部位を含み、細胞外空間に向いている。CD10は、23アミノ酸N末端細胞質領域と、28アミノ酸膜スパニング領域と、活性部位を有する約700アミノ酸細胞外領域とから構成されている(Li等、「Neprilysin: Assay Methods, Purification, and Characterization(ネプリリシン:アッセイ法、精製及び特徴付け)」、Methods in Enzymology,248:253−263(1995))。CD10は、1つのサブユニット当たり1モルの亜鉛を含有している。鎖内ジスルフィド結合は、構造及び活性の維持のために重要である。CD10のMrは、組織源によって、約85000〜100000の範囲である。組織源によって異なるのは、グリコシル化の差異による。cDNAクローニングにより、ウサギ酵素、ラット酵素及びヒト酵素が、それぞれ750個のアミノ酸ポリペプチド、742個のアミノ酸ポリペプチド及び742個のアミノ酸ポリペプチドからなることが、明らかとなった(Neprilysin,Turner,Handbook of Proteolytic Enzymes 1080−1085 (1998))。
【0041】
CD10は、種に応じて、5又は6のN結合グリコシル化部位で高度にグリコシル化される。酵素の他のポストトランスレーショナル修飾はないように思われ、また、天然循環阻害剤も同定されなかった。染色体領域3q21−q27に位置するCD10遺伝子は、単一のコピーに存在し、スパンが80kb超であり、24のエクソンからなり、哺乳動物種の間に高度に保存されている(Barker等、「The common acute lymphoblastic leukemia antigen maps to chromosomal region 3(q21−q27)(染色体領域3(q21−q27)に対する一般的な急性リンパ芽球性白血病抗原マップ)」、J.Immunol,142:283−287(1989))。
【0042】
CD10のC末端領域は、数多くの亜鉛ペプチダーゼに典型的であるHEXXH亜鉛結合モチーフを含んでいる。このモチーフにおけるヒスチジン(ウサギ配列におけるHis583及び587)は、第三の亜鉛リガンドとしての役割を果たす位置646でのグルタメートとともに、亜鉛リガンドのうちの2つを構成している。Glu584は、触媒作用にとって欠くことができない。
【0043】
CD10の生態
CD10は、広い組織分布を示すが、酵素活性は異なる組織間で全く異なる。腎臓は最高のCD10濃度を有することが分かった。この酵素は、主に腎臓尿細管の刷子縁膜上に位置する(A.J.Kenny,Trends Biochem.Sci.11,40(1986))。
【0044】
相対的に高い濃度のCD10が、腸、リンパ節及び胎盤の刷子縁上皮細胞の膜において見出される。一方、顕著なレベルの酵素が、胃、小腸及び結腸における筋細胞に局在化している(A.J.Kenny,S.L.Stephenson及びA.J.Turnerによる「Mammalian Ectoenzymes(哺乳動物の外酵素)」(A.J.Kenny及びA.J.Turner編)、p169、Elsevier,Amsterdam(1987))。CD10は、副腎、睾丸、前立腺、線維芽細胞、好中球及び肺において、より低濃度で見出される(A.J.Kenny,S.L.Stephenson及びA.J.Turnerによる「Mammalian Ectoenzymes(哺乳動物の外酵素)」(A.J.Kenny及びA.J.Turner編)、p169、Elsevier,Amsterdam(1987);N.Sales,I.Dutriez,B.Maziere,M.Ottaviani及びB.P.Roques,Regul.Pept.33,209(1991))。上気道において、酵素は、上皮細胞、粘膜下腺の漿液細胞及び血管壁において生じると考えられる(J.N.Baraniuk,K.Ohkubo,O.J.Kwon,J.Mak,J.Rohde,M.A.Kaliner,S.R.Durham及びP.J.Barnes,J.Appl.Physiol.74,272(1993))。ヒト子宮内膜にCD10がみられる(間質細胞に限られる)ことは、排卵周期を調節する役割を果たしている可能性のあることを示唆している(M.L.Casey,J.W.Smith,K.Nagai,L.B.Hersh及びP.C.MacDonald,J.Biol.Chem.266,23041(1991);J.R.Head,P.C.MacDonald及びM.L.Casey,J.Clin.Endocrinol.Metab.76,769(1993))。
【0045】
哺乳動物の脳において、CD10は、脈絡叢、黒質、尾状核、淡蒼球、嗅結節、側坐核及び脊髄の膠様質において、比較的高濃度でみられた。また、酵素が、ラット及びヒト脊髄の髄膜においても検出された(G.Waksman,R.Bouboutou,J.Devin,R.Besselievre,M.C.Fournie−Zaluski及びB.P.Roques,Biochem.Biophys.Res.Commun.131,262(1985);J.M.Zajac,Y.Charnay,J.M.Soleilhac,N.Sales及びB.P.Roques,FEBS Lett.216,118(1987))。
【0046】
CD10の精製
CD10は、膜からの酵素を界面活性剤処理により可溶化した後に、モノクローナル抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーを適用することにより、精製できる。通常のクロマトグラフィー法も、CD10の精製に適用された。組み換えネプリリシン、すなわち、CD10の大規模発現及び精製が、バキュロウイルス感染昆虫細胞系から得られた。精製方法は、さらにLi等、「Neprilysin:Assay Methods, Purification, and Characterization(ネプリリシン:アッセイ方法、精製及び特徴付け)」、Methods in Enzymology,248:253−263(1995)に記載されている。
【0047】
CD10のアッセイ
マイクロタイタープレートアッセイに適用できるCD10用の特に都合がよく且つ感度のよい2段階アッセイでは、カップリング酵素としてのS.griseusアミノペプチダーゼの存在下で基質Suc−Ala−Ala-|-Leu−NHPhNo2を使用する(Indig等、「Investigation of neutral endopeptidase (EC 3.4.24.11) and of neutral proteinases (EC 3.4.24.4) using a new two−stage enzymatic reaction(新規な2段階反応を用いた中性エンドペプチダーゼ(EC 3.4.24.11)及び中性プロテイナーゼ(EC 3.4.24.4)の調査)」、FEBS,255:237−240(1989))。CD10によるLeu−NHPhNo2の放出の後に、4−ニトロアニリン脱離基のアミノペプチダーゼ放出が生じる(これは、405nmで観察できる)。
【0048】
CD10活性を理解するのに使用される、多数の他のアッセイ方法がある。これらには、トリチウム化したエンケファリン誘導体の加水分解を測定する放射アッセイ、蛍光体を含有する合成ペプチドの加水分解に続いての蛍光アッセイ、及び内部クエンチ基質の切断に続いてのアッセイなどがある(Li等、「Neprilysin:Assay Methods, Purification, and Characterization(ネプリリシン:アッセイ法、精製及び特徴付け)」、Methods in Enzymology,248:253−263(1995))。
【0049】
標的細胞におけるCD10
CD10は、リンパ前駆体細胞、胚中心Bリンパ球及びある種の骨髄球により発現され、したがって、急性白血病の分類及び悪性リンパ腫の下位分類のために、細胞表面マーカーとして広く使用されている。CD10は、胃腸管及び尿生殖路の癌腫並びにある種の肉腫において広く発現され、これらの腫瘍の鑑別診断のためのマーカーとして有用なことがある(Chu等、「Paraffin−Section Detection of CD10 in 505 Nonhematopoietic Neoplasms: Frequent Expression of Renal Cell Carcinoma and Endometrial Stromal Sarcoma(505非造血新生物におけるCD10のパラフィン切片検出:腎細胞癌及び子宮内膜間質部肉腫の頻発発現)」、Am J Clin Pathol,113:374−382(2000))。
【0050】
CD10抗原が、前駆体B細胞急性リンパ芽球性白血病と広く関連していることが分かった(Greaves等、「Selective expression of the common acute lymphoblastic leukemia (gp100) antigen on immature lymphoid cells and thier malignant counterparts(未成熟リンパ細胞及びそれらの悪性対応物についての一般的な急性リンパ芽球性白血病(gp100)抗原の選択的発現)」、Blood,61:628−639(1983))。また、CD10は、T細胞急性リンパ芽球性白血病とも関連している(Weiss等、「Lymphoblastic lymphoma: an immunophenotype study of 26 cases with comparison to T cell acute lymphoblastic leukemia(リンパ芽球性リンパ腫:T細胞急性リンパ芽球性白血病と比較した、26症例の免疫表現型の研究))」、Blood,67:474−478(1986))。
【0051】
CD10は、泌尿生殖路の新生物、例えば、腎細胞癌、移行上皮癌及び前立腺癌(Chu等、「Paraffin−Section Detection of CD10 in 505 Nonhematopoietic Neoplasms: Frequent Expression of Renal Cell Carcinoma and Endometrial Stromal Sarcoma(505非造血新生物におけるCD10のパラフィン切片検出:腎細胞癌及び子宮内膜間質部肉腫の頻発発現)」、Am J Clin Pathol,113:374−382(2000))において広く発現する。また、子宮内膜間質部肉腫、横紋筋肉腫、膵臓腺癌、神経鞘腫及び悪性黒色腫は、CD10について陽性である(Chu等、「Paraffin−Section Detection of CD10 in 505 Nonhematopoietic Neoplasms: Frequent Expression of Renal Cell Carcinoma and Endometrial Stromal Sarcoma(505非造血新生物におけるCD10のパラフィン切片検出:腎細胞癌及び子宮内膜間質部肉腫の頻発発現)」、Am J Clin Pathol,113:374−382(2000))。CD10は、高分化型結腸腺癌、膵臓腺癌及び前立腺癌の悪性腺細胞の先端面に明確に限定されたが、一方、低高分化型腺癌及び他の腫瘍、例えば、黒色腫、移行上皮癌、腎細胞癌及び子宮内膜間質部肉腫においては、CD10は、明確にびまん性細胞形質又は膜質/Golgiパターンを示した(Chu等、「Paraffin−Section Detection of CD10 in 505 Nonhematopoietic Neoplasms: Frequent Expression of Renal Cell Carcinoma and Endometrial Stromal Sarcoma(505非造血新生物におけるCD10のパラフィン切片検出:腎細胞癌及び子宮内膜間質部肉腫の頻発発現)」、Am J Clin Pathol,113:374−382(2000))。
【0052】
基質特異性
文献には、CD10についての好ましい基質に関するいくつかの手がかりが含まれている。2つの研究(Pozsgay等、「Substrate and Inhibitor Studies of Thermolysin−like Neutral Metalloendopeptidase From Kidney Membrane Fractions. Comparison with Bacterial Thermolysin(腎膜画分からのサーモリシン様中性メタロエンドペプチダーゼの基質及び阻害剤の研究。バクテリアサーモリシンとの比較)」、Biochemistry,25:1292−1299(1986)及びHersh等、「Comparison of the Subsite Specificity of the Mammalian Neutral Endopeptidase 24.11 (Enkephalinase) to the Bacterial Neutral Endopeptidase Thermolysin(哺乳動物中性エンドペプチダーゼ24.11(エンケファリナーゼ)のサブサイト位特異性のバクテリア中性エンドペプチダーゼサーモリシンとの比較)」、The Journal of Biological Chemistry,261:6433−6437(1986))は、CD10の基質特異性を詳細に記載している。これらの刊行物の両方とも、本明細書中に援用する。これらの2つの刊行物において得られている基質特異性の結果を、以下に簡単にまとめて示す。
【0053】
CD10に最適な基質は、
式AAP3−AAP2−AAP1−AAP1 ’−AAP2 ’−AAP3 ’
{式中、
AAP3は、Phe又はAlaであり、
AAP2は、Pheであり、
AAP1は、Gly又はAlaであり、
AAP1 ’は、Phe又はLeuであり、
AAP2 ’は、Leuであり、そして
AAP3 ’は、Alaである。}
で表される、オリゴペプチドであろう。文献によれば、これらの残基のうち、P3’位は、最も重要性が小さい。
【0054】
この膜結合メタロエンドペプチダーゼの主要な特異性は、疎水性アミノ酸残基のアミノ側のペプチド結合にある。他のプロテアーゼと同様に、この酵素は、少なくとも4個のアミノ酸残基を収容する長い基質結合部位を有している。酵素の活性部位は、明らかにS1’サブサイトに、疎水性アミノ酸残基の側鎖と相互作用する疎水性ポケットを有している。
【0055】
回転率定数(kcat)及び特異性定数(kcat/km)は、P1’におけるGly残基を、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基により置き換えると、大きく増加する。したがって、Gly残基をLeuにより置き換えると、回転率定数が140倍増加し、特異性定数が370倍増加する。しかしながら、文献で報告されている実験によれば、Leu残基をPhe残基に置き換えたり、さらにTyr残基により置き換えると、これらのパラメータが減少する。
【0056】
酵素のS1’サブサイトでの疎水性ポケットに結合している残基を変更した基質を用いた得られた運動パラメータから、P1’にLeu残基が存在すると最高のkcatが得られ、一方、Phe残基では、Kmが最低となることが、あきらかとなった。TyrによるPhe残基の置換により、Kmが著しく増加するとともに、回転率定数が減少した。
【0057】
P1’位にPhe残基が存在すると、P2’位に存在する残基の種類とは無関係に、回転率定数が顕著に減少した。このことは、S1’サブサイトに結合する残基には、サイズについて明確な制限があることを示唆している。確かに、この位置にAla残基を有する基質で、最高の反応速度が得られた。P1’位にPhe残基を有する場合、Km値が最低であった。このことは、この残基により、最高の結合親和力が得られることを示唆している。
【0058】
P1’サブサイトでは、アミノ酸置換の効果が、主にkcat、ひいてはkcat/Kmに反映される。この位置にAla残基が存在すると、Gly又はPheに対してkcat値が8倍及び3.5倍高くなる。この位置におけるD−アミノ酸の置換により、未反応基質が生じる。酵素とのP1’相互作用には、強い疎水性相互作用はない。
【0059】
P2’位置がPhe残基である場合には、酵素についてのKm値は低かった。また、この残基を有する基質では、P1'位置をAla残基又はGly残基で置き換えたときに、高反応速度と低Km値の両方が得られた。
【0060】
酵素のP2’サブサイトにおけるアミノ酸置換の主要な効果は、Kmに反映され、Alaよりも、Leuの結合が3倍強く、Glyの結合が3倍弱い。P2’での酵素の疎水性相互作用は、P1’相互作用に影響をおよぼさず、したがって、Kmに直接に反映される。P2’位での結合相互作用は、Phe及びAlaがGlyに対してKm値が4倍低いことから分かるように、疎水性相互作用を伴うと思われる。酵素におけるP2’位におけるD−Ala残基は、触媒作用に大きくは影響しない。D−Ala残基は、この位置に受容されることができ、その結果kcat値が最大となる。
【0061】
蛍光発生基質ダンシル−D−Ala−Gly−(pNO2)Phe−Glyは、この酵素により、かなりの速度で加水分解される。酵素は、遊離酸において、そのアミドに対するよりも結合が、8〜9倍増加する。この知見は、酵素に対する基質の結合は、部分的には、疎水性サブサイト相互作用だけでなく、比較的強力な遊離COOH末端カルボキシル基との静電的相互作用にも依存していることを示唆している。このイオン性相互作用は、COOH末端に対してよりも、基質の切断を優先するものでなければならない。
【0062】
本発明のプロドラッグの活性化に関与している酵素は、標的細胞の外膜と関連していると思われるが、循環において極めて低レベルでしかみられない。酵素が、標的細胞自体により生成されるか、又は標的細胞と関連する正常細胞、例えば、白血球、間質細胞、B細胞、好中球又はマクロファージにより生成されている可能性が、最も高い。ここで、用語「白血球」は、リンパ球、単球、マクロファージ、顆粒球、多形核白血球、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞等を含む。したがって、例えば、標的細胞関連酵素は、標的細胞の細胞外付近に何らかの他の方法で存在すると思われる。多くの場合、本発明のプロドラッグは、癌の治療用の治療剤を含み、標的細胞は腫瘍細胞である。したがって、酵素は、細胞膜の外の腫瘍細胞に結合してもよいし、酵素は、酵素を発現する腫瘍関連細胞のため、細胞外に存在していてもよい。
【0063】
本発明の酵素により優先的に切断され且つ他のエンドペプチダーゼによる体内のいずれかの場所での切断には耐性を有する化合物が、とりわけ有用である。なんらかの検出可能な割合で小さなペプチドを切断することが知られており、且つ本発明のプロドラッグの過剰又は不適切な活性化を生じることのある他の酵素には、TOP、PSA及びマトリックスメタロプロテイナーゼなどがある。CD10により切断されることができるが、TOP酵素による切断に対しては耐性がある化合物が、とりわけ有用である。CD10により切断されることができるが、TOPによる切断には耐性のある化合物としては、例えば、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox及びSuc−Ile−Ala−Leu−Doxがある。
【0064】
また、CD10により切断されることができるが、前立腺特異的抗原(PSA)による切断には耐性がある化合物も、有用である。これらの種類の化合物の例として、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox及びSuc−Ile−Ala−Leu−Doxも挙げられる。
【0065】
安定化基
プロドラッグの重要な部分は、安定化基である。安定化基は、プロドラッグ化合物を患者に投与したときに、プロドラッグ化合物が循環血液中で切断されないように保護する役割を果たす。したがって、プロドラッグは、比較的無傷で標的細胞の付近に到達できる。安定化基は、血液、血清及び正常組織に存在するプロテイナーゼ及びペプチダーゼによってプロドラッグが切断されないように保護する。安定化基は、典型的にはオリゴペプチドのN末端をキャッピングしており、したがって、Nキャップ又はNブロックと称されることがある。したがって、安定化基は、安定化基がないとプロドラッグが感受性を有することがあるペプチダーゼを避ける役割を果たす。
【0066】
理想的には、安定化基が、一定のアッセイ条件下で、ヒト血液にプロドラッグ化合物を37℃で2時間保存することにより試験したときに、プロドラッグが分解、すなわち、切断されないように保護する役割を果たし、ヒト血液に存在する酵素によるプロドラッグの切断率が20%未満、好ましくは2%未満であるときに、安定化基は、本発明のプロドラッグにおいて有用である。
【0067】
より詳細には、安定化基は、
(1)アミノ酸以外であるか、
(2)(i)非遺伝的にコードされたアミノ酸又は(ii)アスパラギン酸のβ−カルボキシル基又はグルタミン酸のγ−カルボキシル基でオリゴペプチドのN末端に結合したアスパラギン酸又はグルタミン酸であるアミノ酸、
である。
【0068】
例えば、ジカルボン酸(若しくは高次カルボン酸)又はその薬学的に許容される塩を、安定化基として使用できる。2個を超えるカルボン酸を有する化学ラジカルも、プロドラッグの一部として可能であるので、ジカルボン酸(若しくは高次のカルボン酸)を有する末端基は、典型的なNキャップである。したがって、Nキャップは、アミドがペプチドのアミノ末端に結合し、残りのカルボン酸が遊離しており、未結合である、2つ以上のカルボン酸を含む化学ラジカルのモノアミド誘導体であることができる。この目的には、Nキャップは、好ましくはコハク酸、アジピン酸、グルタル酸又はフタル酸であり、コハク酸及びアジピン酸が最も好ましい。本発明のプロドラッグ化合物において有用なNキャップの他の例には、ジグリコール酸、フマル酸、ナフタレンジカルボン酸、ピログルタミン酸、酢酸、1−ナフチルカルボン酸、2−ナフチルカルボン酸、1,8−ナフチルジカルボン酸、アコニット酸、カルボキシケイ皮酸、トリアゾールジカルボン酸、グルコン酸、4−カルボキシフェニルボロン酸、(PEG)n類似物、例えば、ポリエチレングリコール酸、ブタンジスルホン酸、マレイン酸、ニペコチン酸及びイソニペコチン酸などがある。
【0069】
さらに、以下に列挙するもののうちの一つ等の非遺伝的にコードされたアミノ酸も、安定化基として使用できる:β−アラニン、チアゾリジン−4−カルボン酸、2−チエニルアラニン、2−ナフチルアラニン、D−アラニン、D−ロイシン、D−メチオニン、D−フェニルアラニン、3−アミノ−3−フェニルプロピオン酸、γ−アミノ酪酸、3−アミノ−4,4−ジフェニル酪酸、テトラヒドロイソキノリン−3−カルボン酸、4−アミノメチル安息香酸及びアミノイソ酪酸。
【0070】
さらに、ある実験では、凝集している正に帯電したプロドラッグをマウスに血管内投与すると、急性毒性が生じた。しかしながら、このプロドラッグ上の電荷を、負に帯電した安定化基での誘導化により逆にしたときには、このような毒性は観察されなかった。
【0071】
数多くの細胞障害化合物は、固有的に溶解度が低い。例えば、正に帯電したアントラサイクリンは、高濃度で凝集物を形成することがあり、これらの凝集物が、静脈内投与されたときに、静脈内凝固が生じることがある。数多くのオリゴペプチドを生理的pHで露出した正帯電アミノ末端を有するので、これらの凝集物は、生体内で多正帯電表面を形成することがあり、投与から数分内で凝固カスケードを生じる。このため、凝集物を形成する正に帯電したプロドラッグが、治療用途に不適当となる可能性がある。
【0072】
WO00/33888においてより詳細に記載されているように、このような危険な可能性のある障害に対処する一つの方法に、負に帯電しているか、又は中性の官能性のペプチド鎖N末端に安定化基を利用することがある。例えば、プロドラッグの安定化基としてスクシニルを使用すると、プロドラッグの急性毒性を軽減することができる。これにより、ヒトにおける静脈内投与のための実用的な治療としてペプチドプロドラッグを使用する際の重要な問題を解決できる。
【0073】
オリゴペプチド
オリゴペプチドは、一般的に短鎖長、典型的にアミノ酸20個以下のポリペプチドとして定義される。本発明のプロドラッグに有用なオリゴペプチドは、長さが少なくとも3個のアミノ酸、好ましくは長さが3〜6個のアミノ酸である。しかしながら、上記範囲を超える長さのオリゴペプチドも、有用である。
【0074】
ナンバリングスキーム
本発明によれば、プロドラッグのオリゴペプチド部分は、式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される。この式において、n及びmは、整数である。ここで、整数は、いずれかの正の自然数又はゼロである。オリゴペプチドは、長さが3個以上のアミノ酸である。好ましい実施態様によれば、nは0〜3の整数であり、mは0〜3であり、m+nが3以下である。したがって、好ましいオリゴペプチドは、長さが3〜6個のアミノ酸である。上記式における各AAは、独立してアミノ酸を表す。一定のアミノ酸には、上付き文字を付して表し、CD10による切断部位に対する位置を示す。特に、CD10は、アミノ酸のP1位、すなわち、AAP1と、アミノ酸のP1’位、すなわち、AAP1 ’との間で切断する。
【0075】
オリゴペプチドは、右をカルボキシル末端(すなわち、C末端)、左をアミノ末端(すなわち、N末端)とする従来の方法で記載する。
【0076】
本発明のオリゴペプチドでは、AAP2は、いずれかのアミノ酸を表す。AAP1も、いずれかのアミノ酸を表し、AAP1 ’についても、同様である。オリゴペプチドのコアAAP2−AAP1−AAP1 ’部に結合して、追加のアミノ酸が存在していてもよい。一般的に、AAP2又はAAP1 ’に0〜3個の追加のアミノ酸が結合しているが、3個を超えるアミノ酸が結合することも、可能である。これらの追加のアミノ酸は、上記式において、(AA)n又は(AA)mとして表される。(AA)n又は(AA)mにより表されるものにおける各AAも、独立してアミノ酸を表す。したがって、m=1であるとき、(AA)mは、AAm=1を表し、AAm=1は、AAP1 ’に結合している。そのとき、AAm=1は、P2’位にあり、AAP2 ’により表すことができる。m=2であるとき、(AA)mは、AAm=1−AAm=2を表し、AAm=1は、P2’位にあり、AAm=2はP3’位にあり、AAm=1は、AAP1 ’に結合している。m=3であるとき、(AA)mは、AAm=1−AAm=2−AAm=3を表し(すなわち、AAP2 ’ AAP3 ’ AAP4 ’)、AAm=1は、AAP1 ’に結合している。同様に、AAn=1又はAAn=2−AAn=1又はAAn=3−AAn=2−AAn=1が存在していもよく、この場合、AAn=1は、AAP2に結合しており、AAP3を表す。したがって、AAn=2は、P4位にあり、AAn=3は、P5位にある、等である。
【0077】
好ましいアミノ酸
特記のない限りは、全てのアミノ酸が、L配置にある。いずれのアミノ酸がプロドラッグのオリゴペプチド部分に存在してもよいが、一定のアミノ酸が好ましい。
【0078】
特に、AAP1は、アルギニン、アラニン、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、グルタミン、バリン及びセリンからなる群から選択されたものが好ましい。
【0079】
同様に、AAP1 ’は、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン及びプロリンからなる群から選択されたものが好ましい。AAP1 ’は、好ましくは疎水性アミノ酸である。
【0080】
本発明のある実施態様によれば、特定のAAP1−AAP1 ’対が好ましい。具体的には、AAP1−AAP1 ’の組み合わせは、Arg−Leu、Arg−Ile、Arg−Phe、Arg−Val、Ala−Phe、Ala−Leu、Gly−Phe、Gly−Leu、Leu−Phe、Leu−Tyr、Met−Leu、Pro−Phe、Pro−Tyr、Pro−Leu、Phe−Leu、Phe−Phe、Tyr−Ile、Tyr−Pro、Tyr−Leu、Gln−Phe、Val−Tyr、Val−Phe及びSer−Leuからなる群から選択されるものが好ましい。
【0081】
疎水性アミノ酸は、好ましくはAAP2として存在する。したがって、イソロイシンが、P2位におけるアミノ酸として特に有用である。mが1〜3の場合、AAm=1は、好ましくは疎水性アミノ酸でもよい。
【0082】
例えば、以下のアミノ酸配列が、CD10切断可能配列の少なくとも一部分としてオリゴペプチドに存在してもよい:βAla−Leu−Ala−Leu、Ile−Ala−Leu、βAla−Ile−Ala−Leu、Leu−Ala−Leu、Met−Ala−Leu及びPhe−Ala−Leu。
【0083】
治療剤
修飾してプロドラッグ形態とするのに特に有利である治療剤は、治療濃度域が狭いものである。治療濃度域が狭い薬剤又は治療剤は、一般的な医療水準により毒性が明らかである投与量が、効力が明らかである投与量に極めて近いものである。
【0084】
安定化基及びオリゴペプチド並びに場合によりリンカー基に結合して本発明のプロドラッグを形成する治療剤は、癌、炎症性疾患又はある種の他の病状の治療に有用である。好ましくは、治療剤は、以下の種類の化合物から選択されたものである:アルキル化剤、増殖防止剤、チューブリン結合剤、ビンカアルカロイド類、エネジイン、ポドフィロトキシン又はポドフィロトキシン誘導体、プテリジン薬剤群、タキサン類、アントラサイクリン類、ドラスタチン、トポイソメラーゼ阻害剤、白金配位錯体化学療法剤及びメイタンシノイド。
【0085】
特に、治療剤は、以下の化合物又はそれらの誘導体若しくは類似物から選択したものが有利である:ドキソルビシン(Doxorubicin)、ダウノルビシン(Daunorubicin)、ビンブラスチン(Vinblastine)、ビンクリスチン(Vincristine)、カリーチアマイシン(Calicheamicin)、エトポシド(Etoposide)、硫酸エトポシド(Etoposide phosphate)、CC−1065、デュオカルマイシン(Duocarmycin)、KW−2189、メトトレキサート(Methotrexate)、メトプテリン(Methopterin)、アミノプテリン(Aminopterin)、ジクロロメトトレキサート(Dichloromethotrexate)、ドセタキセル(Docetaxel)、パクリタキセル(Paclitaxel)、エピチオロン(Epithiolone)、コンブレタスタチン(Combretastatin)、コンブレタスタチンA4リン酸塩(CombretastatinA4Phosphate)、ドラスタチン10(Dolastatin 10)、ドラスタチン11(Dolastatin 11)、ドラスタチン15(Dolastatin 15)、トポテカン(Topotecan)、カンプトテシン(Camptothecin)、マイトマイシンC(Mitomycin C)、ポルフィロマイシン(Porfiromycin)、5−フルオロウラシル(5−Fluorouracil)、6−メルカプトプリン(6−Mercaptopurine)、フルダラビン(Fludarabine)、タモキシフェン(Tamoxifen)、シトシンアラビノシド(Cytosine arabinoside)、アデノシンアラビノシド(Adenosine arabinoside)、コルヒチン(Colchicine)、ハリコンドリンB(Halichondrin B)、シスプラチン(Cisplatin)、カルボプラチン(Carboplatin)、マイトマイシンC(Mitomycin C)、ブレオマイシン(Bleomycin)、メルファラン(Melphalan)、クロロキン(Chloroquine)、シクロスポリンA(Cyclosporin A)及びメイタンシン(Maytansine)。ここで、誘導体とは、記載の化合物と、別の化学的部分とを反応させることにより得られる化合物であり、記載の化合物の薬学的に許容される塩、酸、塩基又はエステルなどがある。類似物とは、記載の化合物と類似の構造的及び機能的性質、例えば、生物活性を有する化合物のことである。
【0086】
リンカー基
オリゴペプチドと治療剤との間にリンカー基が存在すると、以下の理由で有利なことがある:
1.治療剤に結合したアミノ酸の酵素的放出又は他の酵素的活性工程を容易にするための、立体的な面からのスペーサーとして。
2.治療剤とオリゴペプチドとの間の適切な結合化学反応を可能とする。
3.プロドラッグ複合体を製造する際の合成プロセスを改善する(例えば、結合前にリンカー基を用いて、治療剤又はオリゴペプチドを予備誘導して収率又は特異性を高めることにより)。
4.プロドラッグの物性を改善する。
5.薬剤の細胞内放出のさらなる機構を提供する。
【0087】
リンカーの構造は、必要とする官能性により決まる。可能なリンカー化学物質として、例えば、ヒドラジド、エステル、エーテル及びスルフィドリルが挙げられる。アミノカプロン酸は、二官能リンカー基の一例として挙げられる。アミノカプロン酸をリンカー基の一部として使用するとき、オリゴペプチドの番号付けでは、アミノ酸としてカウントしない。
【0088】
プロドラッグの設計
プロドラッグの設計方法は、本発明の別の態様を構成し、最初に上記した本発明のオリゴペプチドを同定することを必要とする。次に、オリゴペプチドを、オリゴペプチドの第一結合部位で、安定化基に結合させる。安定化基は、全血に存在する酵素によるオリゴペプチドの切断を阻害する役割を果たす。オリゴペプチドは、オリゴペプチドの第二結合部位で、治療剤と直接的又は間接的に結合する。第一結合部位は、通常オリゴペプチドのN末端であるが、オリゴペプチドのC末端又はオリゴペプチドの別の部分であってもよい。第二結合部位は、通常オリゴペプチドのC末端であるが、オリゴペプチドのN末端又はオリゴペプチドの別の部分でもよい。治療剤及び安定化基へのオリゴペプチドの結合は、いずれかの順序でおこなってもよいし、同時におこなってもよい。
【0089】
得られた複合体を、当業者には公知の方法を用いて、CD10による切断性について試験してもよい。例えば、複合体を、細胞源から精製したCD10とともにインキュベーションし、得られた生成物を、実施例2で説明する蛍光検出を用いたHPLCにより分析することにより、複合体を、CD10による切断性について試験してもよい。複合体が、CD10により切断されることができる場合には、これをプロドラッグとして選択することができる。
【0090】
まだ安定化基又は治療剤基に結合していないオリゴペプチドも、複合体の切断性を試験するのに用いられる方法により、CD10による切断性について試験してもよい。CD10による切断性は、そのオリゴペプチドがプロドラッグを設計するのに使用できるかどうかの候補としての目安となる。
【0091】
本発明の別の態様によれば、プロドラッグを設計するのに有用なオリゴペプチドを同定するための、スクリーニング方法が提供される。3個以上のアミノ酸からなるオリゴペプチドが、準備され、CD10による切断性について試験される。上記したように、CD10による切断性は、プロドラッグを設計する際に、そのオリゴペプチドが候補として使用できるかどうかの目安となる。
【0092】
さらに、CD10により切断されることができるが、TOPによる切断に対して耐性があるかどうかの試験をおこなうことが、好ましい。さらには、CD10により切断されることができるが、前立腺特異的抗原(PSA)の切断に対して耐性があるかどうかの試験をおこなうことが、好ましい。また、得られた複合体を、全血における安定性について試験することもできる。全血において安定な試験化合物が、選択される。また、CD10により切断されることができ且つ好ましくは他の酵素による切断に対して耐性を有する化合物を、選択する。このような方法により設計されたプロドラッグも、本発明の一部を構成する。
【0093】
さらに、本発明によれば、患者に投与しようとしている治療剤の毒性を減少させる方法も提供される。すなわち、治療剤を、CD10により切断されることができ且つ好ましくはTOP及びPSAによる切断には耐性があるオリゴペプチドに直接的又は間接的に結合することにより、修飾プロドラッグ型治療剤が形成される。このオリゴペプチドは、安定化基にも結合される。好ましくは、オリゴペプチドは、式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表される。
【0094】
より好ましくは、nは、0〜3であり、mは、0〜3であり、m+nは3以下である。
【0095】
このように形成されたプロドラッグは、患者に投与したときの治療剤の毒性を減少させる。また、この方法により治療剤を修飾することにより、治療剤を、患者に、未結合形態で投与するよりも、治療剤の投与量を増加することもできる。
【0096】
医薬組成物
また、本発明によれば、本発明による化合物、特にプロドラッグ化合物と、必要に応じて薬学的に許容される担体、例えば、補助剤又は媒質等を含む、医薬組成物も提供される。
【0097】
より詳細には、本発明によれば、
(1)(a)標的細胞に侵入できる治療剤と、
(b)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドと、
(c)安定化基と、
(d)場合によりCD10により切断されることのないリンカー基と、
を含む化合物であって、
前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第一結合部位で前記安定化基に直接結合しており、前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第二結合部位で前記治療剤に直接結合しているか、前記治療剤に前記リンカー基を介して間接的に結合しており、
前記安定化基が、全血に存在する酵素による前記化合物の切断を阻害し、
前記化合物が、CD10により切断されることができる、化合物と、
(2)薬学的に許容される担体と、
を含む、医薬組成物が、提供される。
【0098】
好ましくは、化合物の式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、nは0〜3であり、mは0〜3であり、m+nが3以下である。
【0099】
また、本発明は、病状の治療に使用しようとする医薬品を調製するための、医薬組成物の使用に関する。
【0100】
医薬組成物は、例えば、患者に対して、非経口投与、とりわけ静脈内投与、筋肉内投与又は腹腔内投与により投与できる。非経口投与に用いられる本発明の医薬組成物は、無菌、水性若しくは非水性溶液、懸濁液、乳濁液を含む。薬学的に許容される担体、溶媒又は媒質として、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、注射可能な有機エステル、例えば、エチルオレエート又はシクロデキストリンを、用いることができる。等張食塩水も、医薬組成物の一部分を構成してもよい。これらの組成物は、湿潤剤、乳化剤及び/又は分散剤も含有できる。
【0101】
殺菌を、いくつかの方法、例えば、細菌フィルターを使用したり、組成物に殺菌剤を含有させたり、照射により、実施できる。また、組成物は、使用時に、滅菌水又は他の滅菌注射可能媒体に溶解することができる、滅菌固体組成物の形態で調製することもできる。
【0102】
医薬組成物は、当該技術分野において周知であり(例えば、ビタミンC、リンゴ酸、酸化防止剤等)且つ本発明の化合物と組み合わせて使用して、投与目的である病状の治療を改善及び延命できる補助剤を含むこともできる。
【0103】
患者に対する本発明による化合物の投与量は、Bruce A.Chabner及びJerry M.Collins、Cancer Chemotherapy、Lippincott編、ISBN0−397−50900−6(1990)に記載されている、この分野で公知の治療剤の、少なくとも通常の投与量でよいし、又は治療する医師の判断で、プロドラッグ剤の優れた有効性の提供又は治療される患者の具体的な状況に応じて調整してもよい。したがって、投与量は、本発明の化合物の調製に使用される治療剤により異なる。
【0104】
プロドラッグ化合物による治療
患者に、治療に有効な量の医薬組成物を、好ましくは非経口及びより好ましくは静脈内投与することを含む、病状の治療方法も、本発明の範囲内である。
【0105】
したがって、患者の治療方法は、治療に有効な量の本発明の化合物を、患者に投与することを含む。
【0106】
プロドラッグ化合物は、一般的に癌、腫瘍性疾患、腫瘍、炎症性疾患及び感染症を含む数多くの病状を治療するのに、有用である。治療するのに好ましい疾患としては、例えば、乳癌、結腸直腸癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌及び膵癌である。より詳細には、いくつかの特定の腫瘍がCD10に対して陽性であることが確認されたので、ここで教示される化合物を用いてこれらの腫瘍の治療することは、とりわけ有利である。具体的には、以下の腫瘍のうちの一つの治療を、おこなうことができる:B細胞リンパ芽球性白血病、T細胞リンパ芽球性白血病、ホジキンリンパ腫や非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、メラノーマ、眼メラノーマ、皮膚メラノーマ、直腸腺癌、肝細胞癌、腎細胞癌、卵巣癌、前立腺癌、肝臓癌、移行上皮癌、膵臓腺癌、肺癌、乳癌及び結腸癌。
【0107】
薬学的に許容される媒質(例えば、等張食塩水)に配合したプロドラッグ化合物を、動物又はヒトに、1日1回あたり0.05mg/kg〜300mg/kgの範囲で、静脈内投与できる。また、点滴又は他の低速導入法により投与してもよい。
【0108】
ヒト患者は、本発明のプロドラッグの通常のレシピエントであるが、動物への使用も可能である。
【0109】
本発明によれば、CD10関連標的細胞を含む疾患の治療方法であって、
(1)標的細胞に侵入できる治療剤と、
(2)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドと、
(3)安定化基と、
(4)場合によりCD10により切断されないリンカー基と、
を含む化合物であって、
前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第一結合部位で前記安定化基に直接結合しており、前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第二結合部位で前記治療剤に直接的に結合しているか、前記治療剤に前記リンカー基を介して間接的に結合しており、
前記安定化基が、全血に存在する酵素による前記化合物の切断を阻害し、
前記化合物が、CD10により切断されることができる、
化合物の治療に効果的な量を患者に投与することを含む、方法が提供される。
【0110】
好ましくは、nは0〜3であり、mは0〜3であり、m+nが3以下である。この化合物は、生理条件下、CD10により切断されることができる。
【0111】
また、本発明によれば、以下で詳細に説明するように、患者における腫瘍等の疾患を治療する方法が提供される。この方法は、標的細胞におけるCD10を検出する工程と、CD10が標的細胞と関連している場合には、CD10により切断されることのできるプロドラッグを患者に投与する工程とを含む。検出工程は、さらに患者から組織の試料を得る工程と、この試料をCD10抗体と混ぜる工程と、CD10抗体の試料への結合が生じた場合には測定をおこなう工程とを含む。
【0112】
CD10で切断されることのできるプロドラッグを腫瘍又は他の標的細胞に投与することを含む、CD10陽性腫瘍又は他のCD10陽性標的細胞を治療する方法も、明確に本発明の範囲内である。CD10で切断されることのできるプロドラッグは、上記したように特徴付けられる。また、特に、患者における前立腺癌の治療方法であって、CD10により切断されることのできるプロドラッグを患者に投与することを含む方法も、含まれる。このプロドラッグは、一般的に前立腺癌の治療に有用な治療剤を含む。本発明の別の態様によれば、薬剤の製造用として記載されている化合物の、CD10関連標的細胞を有する疾患を患っている患者の治療のための使用が提供される。
【0113】
上記したように、標的細胞は、CD10が、標的細胞によるか、標的細胞と関連する正常細胞、例えば、白血球、間質細胞、B細胞、好中球又はマクロファージにより生成される場合に、関連するCD10でよい。したがって、CD10は、標的細胞の細胞外膜に結合していてもよいし、又は標的細胞関連細胞がこの酵素を発現するので細胞外に存在していてもよい。
【0114】
ヒト腫瘍組織上のCD10の免疫反応性の、CD10陽性腫瘍の診断及び治療における使用
本発明のプロドラッグは、腫瘍における細胞の一部又は全ての上で表面マーカーとしてCD10を発現する腫瘍の場合に、特に新規な用途に用いられる。CD10についての免疫組織化学的染色試薬を、CD10で切断されることのできるプロドラッグに対して特定の感受性を有する腫瘍のための診断マーカーとして使用して、治療患者を、事前に選別できる。例えば、腫瘍細胞上でCD10により、CD10で切断されることのできるプロドラッグから放出されるドキソルビシンが局部的に産生されることにより、全ての細胞に無差別に作用すると思われる遊離ドキソルビシンによる治療と比較して、プロドラッグの安全性が相対的に増加すると思われる。
【0115】
固形癌又は組織に腫瘍細胞が存在する疑いのある患者は、通常の医療方法により腫瘍の存在を確認した後に、腫瘍組織の生検により、スクリーニングすることができる。標準的な診断モノクローナル抗体を、組織病理学者が通常の方法で使用して、CD10の免疫反応性に基づいて、腫瘍を同定及び分類することができる。特に、ヒトCD10に対するマウスモノクローナル抗体であるクローン56C6(英国ニューキャッスルにあるNovocastra Laboratories社)は、この目的に広く使用される(Suzuki等、「Imbalance between neutral endopeptidase 24.11 and endothelin−1 expression in human endometrial carcinoma(ヒト子宮内膜癌における中性エンドペプチダーゼ24.11とエンドセリン−1発現とのアンバランス)」、Oncology 60:258−267(2001);及びChu及びArber、「Paraffin−section detection of CD10 in 505 nonhematopoietic neoplasms. Frequent expression in renal cell carcinoma and endometrial stromal sarcoma(505非造血新生物におけるCD10のパラフィン切片検出:腎細胞癌及び子宮内膜間質部肉腫の頻発発現)」、Am.J.Pathol.113:374−382(2000))。
【0116】
腫瘍の小バイオプシーを、免疫組織化学的に以下のように処理できる。バイオプシーを、中性緩衝ホルマリンに固定した後、パラフィンに埋封し、切片(6〜10ミクロン)を調製することができる。この切片を、脱パラフィン化し、再水和化することができる。熱によるエピトープ検索のために、脱パラフィン化切片を0.01Mクエン酸緩衝液に添加し、電子レンジで処理できる。免疫組織化学的染色は、アビジン−ビオチンイムノペルオキシダーゼ法を用いて実施できる。ヒトCD10に対するマウスモノクローナル抗体であるクローン56C6は、1:20希釈液として使用できる。マウスIgG1 MOPC−31C抗体は、陰性アイソタイプ適合対照として使用できる。次に、切片を、Mayerのヘマトキシリンで対比染色する。CD10の免疫反応性は、アイソタイプ対照ではないヒト抗CD10対照で処理された組織上のとりわけ陽性細胞の周縁の褐色染色により示される。これらの腫瘍は、CD10により切断されやすいプロドラッグでの処理についての標的である。
【0117】
同様に、CD10について陽性のことがある他の非固形ヒト腫瘍、例えば、バイオプシーされることのできないことがある血液系腫瘍は、免疫化学法によりCD10の存在によりスクリーニングし、標準的な臨床的フローサイトメトリー(例えば、FACS)法により分析できる。陽性としてスクリーニングされるこのような腫瘍も、CD10により切断されることのできるプロドラッグについての標的であろう。Ramos(ヒトB細胞リンパ腫)細胞系を用いた生体外アッセイから、CD10は、この方法により、細胞上で容易に検出されることができることが明らかである。
【0118】
診断又はアッセイ
診断又はアッセイ用のキット等の製品も、本発明の範囲内である。このような製品では、好ましくはクマリン等のマーカーを、オリゴペプチド及び安定化基(治療剤の代わり)に結合している以外は、上記した化合物を利用する。使用されるマーカーは、オリゴペプチドに結合されることのできるいずれかの成分として定義され、当該技術分野において公知の方法により容易に検出できる。マーカーの検出に有用である少なくとも一種の試薬が、典型的にキットの一部分として含まれる。すなわち、製品は、以下の構成要素を含む:
(1)(a)マーカーと、
(b)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドと、
(c)安定化基と、
(d)場合によりリンカー基と、
を含む化合物であって、
前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第一結合部位で前記安定化基に直接結合しており、前記オリゴペプチドが前記オリゴペプチドの第二結合部位で前記マーカーに直接的に結合しているか、前記マーカーに前記リンカー基を介して間接的に結合しており、
前記安定化基が、全血に存在する酵素による前記化合物の切断を阻害し、
前記化合物が、CD10により切断されることができる、
化合物と、
(2)前記マーカーの検出に有用な少なくとも一種の試薬と、
を含む。
【0119】
好ましくは、nは、0〜3であり、mは、0〜3であり、m+nは3以下である。
【0120】
製品は、例えば、患者の試験試料とともに使用して、腫瘍を診断するか、又はプロドラッグ療法による治療が可能な患者を同定することができる。
【0121】
プロセス化学の基本手順
オリゴペプチド:ペプチド合成の一般法
本発明のプロドラッグ複合体におけるペプチド(オリゴペプチド)の配列は、固相ペプチド合成(Boc又はFmoc化学反応を用いる)法によるか、又は液相合成により合成できる。一般的なBoc法びFmoc法は、広く使用され、以下の文献に記載されている:Merrifield,J.A.Chem.Soc.,88:2149(1963);Bodanszky及びBodanszky,「The Practice of Peptide synthesis(ペプチド合成の実際)」、Springer−Verlag,Berlin,7−161(1994);並びにStewart,「Solid Phase Peptide Synthesis(固相ペプチド合成)」、Pierce Chemical,Rockford(1984)。
【0122】
一般的なFmoc固相法
好ましい固相合成法(自動又は手動)を用いて、所望の長さ及び配列のペプチドを、アミノ酸を、固体樹脂に結合している増殖している鎖に段階的に付加することにより合成する。有用なFmoc適合樹脂としては、例えば、Wang樹脂、HMPA−PEGA樹脂、Rink酸樹脂又はヒドロキシエチル−フォトリンカー樹脂などがあるが、これらには限定されない。ペプチド鎖のC末端を、高分子樹脂に共有結合し、保護されたα−アミノ酸を、カップリング試薬を用いた段階的方法により付加する。好ましいα−アミノ保護基は、カップリング条件で安定であり且つ穏やかなアルカリ性条件下で容易に除去できるFmoc基である。反応溶媒は、好ましくはDMF、NMP、DCM、MeOH及びEtOHであるが、これらには限定されない。カップリング剤としては、例えば、DCC、DIC、HATU、HBTUがある。N末端保護基の切断は、DMFにピペリジンを10〜100%添加した溶液中、0〜40℃でおこなわれる。温度は、周囲温度が好ましい。合成の終わりに、最終的なFmoc保護基を、上記のN末端切断法を用いて除去する。樹脂上に残存するペプチドを、酸性条件下で樹脂を処理することにより、酸に感受性のある側鎖保護基とともに、樹脂から切断される。例えば、酸性切断条件として、トリフルオロ酢酸(TFA)をジクロロメタンに混合が挙げられる。ヒドロキシエチル−フォトリンカー樹脂を使用する場合には、切断を生じさせるのに好適な波長は、λ365nmの紫外線である。このプロセスを図示したものを、図3に示す。
【0123】
固相合成による一般的なNキャップ法
N末端誘導ペプチドの調製は、通常固相でおこなわれる。ペプチド合成が完了したら、末端のFmocを除去する。このとき、ペプチドは、まだ固体の支持体上にある。最適なNキャップを、次にペプチドのN末端上に、標準的ペプチドカップリング条件を用いてカップリングする。Fmoc合成法を使用する場合には、Nキャップのカップリング終了後、ペプチドを、上記した方法を用いて樹脂から切断する。
【0124】
一般的なBoc固相法
Boc化学反応を用いた固相方法では、Merrifield樹脂又はPAM樹脂が、有用である。カップリング剤活性化Boc保護アミノ酸を順次付加することにより、アミノ酸を、固相上に増殖している鎖にカップリングする。カップリング剤としては、例えば、DCC、DIC、HATU及びHBTUがある。反応溶媒は、DMF、DCM、MeOH又はNMPでよい。Boc保護基の切断は、DCMにTFAを10〜100%添加した溶液中、0〜40℃でおこなう。温度は、周囲温度が好ましい。ペプチド鎖アセンブリが完了したら、N末端保護基(通常Boc)を、上記したようにして除去する。ペプチドを、ジクロロメタン中、液状HF又はトリフルオロメタンスルホン酸を用いて樹脂から除去する。
【0125】
液相合成によるFmocオリゴペプチドの調製のための基本的手順
別法として、プロドラッグペプチド中間体を、Boc又はFmoc化学反応を利用して、液相合成により製造できる。この方法を示した図(図4)では、C末端Leuテトラペプチドを、一般的に一例として使用されるが、他のどのような長さのC末端ペプチドを用いて同様の反応をおこなってもよいことは、理解されるところであろう。ペプチドは、固相法に類似の方法(N末端方向又はC末端方向)によるか、又は例えば、2種の好適な保護ジペプチド又は単一のアミノ酸のトリペプチドのカップリングによる段階的アセンブリにより構築できる。
【0126】
液相合成の一つの方法は、図4に示すFmoc化学反応を用いたプロドラッグペプチド中間体の段階的構築である。C末端は、副生成物の形成を減少させるために保護する必要がある。図4におけるC末端R基は、Me、tBu、ベンジル又はTCEである(ここで、Nキャップがメチルスクシニルであるときには、C末端R基は、メチルであることはできない)。DMFを溶媒として用いるが、DMFの代わりに、他の溶媒、例えば、DMSO、CH3CN又はNMP(又はそれらの混合物)を使用してもよい。増殖ペプチド鎖保護アミノ末端を脱保護する際に、ピペリジンの代わりに、ピリジン、Et3N又は他の塩基を用いてもよい。同様に、HBTUを活性化剤として上記図に示してあるが、他の活性化剤、例えば、DCC、DIC、DCC+HOBt、OSu、活性化エステル、アジド又はトリフェニルホスホリルアジドを使用してもよい。さらに、保護されたペプチド酸クロリド又は酸ブロミドを使用して、アミノ酸又はペプチド断片に直接カップリングすることができる。オリゴペプチドアセンブリが完了したら、N末端を脱保護し、C末端保護ペプチドは、所望のNキャップを受容できる状態となる。
【0127】
液相合成によるNキャップドオリゴペプチドの調製のための基本手順
液相合成によりNキャップドオリゴペプチドを構築するとき、Nキャップを、わずかに修正した方法により合成する必要がある(図4)。まず、FmocオリゴペプチドのC末端は、Nキャップ上のC末端の選択的脱保護と適合する酸不安定又は水素添加感受性保護基で保護する必要がある。次に、Fmoc保護基を、オリゴペプチドから除去してN末端を露出させる必要がある。N末端が脱保護され且つC末端が保護された状態で、オリゴペプチドを、所望のNキャップの活性化半エステルと反応させる。Nキャップは、塩基及び好適な溶媒中で、DCC又はHATU等のアミノ酸を活性化するための方法を用いて、活性化できる。別法として、メチルヘミスクシネートを使用する場合、カップリングは、有機又は無機塩基、例えば、DIEA、トリエチルアミン又はCs2CO3の存在下、不活性溶媒を用いて、メチルヘミスクシニルクロリド(又は他の酸ハライド)(図4)を介して実施することができる。このような合成の一例として、メチル−ヘミスクシネートとβAla−Ile−Ala−Leuベンジルエステルとの反応が挙げられる。カップリング法は、当該技術分野において一般的に使用されている方法のいずれかであることができる(例えば、Bodanszky,M.The Practice of Peptide Synthesis(ペプチド合成の実際),Springer Verlag,185(1984);Bodanszky,M.Principles of Peptide Synthesis(ペプチド合成の原理),Springer Verlag,159(1984)参照)。次に、ベンジル基を、接触水素添加により除去して所望のNキャップメチル−スクシニル型オリゴペプチドを得ることができる。好適な選択的に除去可能なC末端保護基の他の例として、tBu、アルコキシ−メチル及びTCEであることができるが、これらには限定されない。この工程をおこなうための他の方法が、文献に記載されている。
【0128】
ジ−又はトリペプチドの「フラグメント縮合」等の上記した方法の組み合わせも、考慮できる。反応条件は、当該技術分野において周知であり、引用文献に詳細に記載されている。上記した方法の利点は、液相合成により製造される生成物の精製が容易なことである。
【0129】
プロドラッグ複合体
複合及び脱保護工程の一般的な方法
本発明に記載のNキャップ型オリゴペプチド−治療剤は、オリゴペプチドのFmoc形態(FmocがオリゴペプチドのN末端に結合していることを意味する)を、ダウノルビシン、ドキソルビシン又はいずれかの好適な治療剤と、ペプチド合成に使用される標準的な活性化試薬のいずれかを用いてカップリングすることにより、合成できる(図5)。溶媒は、トルエン、酢酸エチル、DMF、DMSO、CH3CN、NMP、THF、DCM又は当該技術分野において公知の他の好適な不活性溶媒でよく、試薬がそこに可溶なものである。好ましい溶媒は、DMF及びNMPである。好適な温度は、−25〜+25℃の範囲であり、周囲温度が好ましい。活性化剤は、以下のものから一つを選択できる:PyBOP、HBTU、HATU、EDC、DIC、DCC、DCC+HOBT、OSu活性化エステル、アジド又はトリフェニルホスホリルアジド。HBTU又はHATUは、好ましい活性化剤である。別法として、このカップリング反応に、保護されたペプチドの酸クロリド又は酸ブロミドを使用してもよい。2〜4当量、有利には2〜2.5当量の塩基が、カップリング反応に必要とされる。塩基は、無機塩基、例えば、CsCO3、Na2CO3若しくはK2CO3又は有機塩基、例えば、TEA、DIEA、DBU、DBN、DBO、ピリジン、置換ピリジン、N−メチル−モルホリン等から選択されることができ、好ましくはTEA又はDIEAである。反応は、−15℃〜50℃の温度、有利には−10℃〜10℃の温度で実施できる。反応時間は、5〜90分間であり、20〜40分間が有利である。生成物は、反応混合物を水に注ぎ、形成した沈殿物を濾過することにより単離される。粗生成物は、さらにDCM、THF、酢酸エチル又はアセトニトリルから、好ましくはジクロロメタン又はアセトニトリルから再結晶することにより精製できる。次に、単離されたFmoc型オリゴペプチド治療剤複合体を、10倍〜100倍過剰の塩基を用いて、−10℃〜50℃の温度で、2〜90分間、好ましくは3〜8分間かけて脱保護する。理想的には、5〜60当量の塩基が、好ましい。ピペリジンは、Fmoc基を脱保護するのに好ましい塩基である。オリゴペプチド−治療剤複合体の脱保護されたアミノ末端を、二酸無水物又は半保護活性化二酸(すなわち、続いて脱保護されるモノエステル)によりアシル化して最終的なNキャップ型オリゴペプチド−治療剤を得る。
【0130】
別法として、最終的なプロドラッグを、メチル半エステル型スクシニル−N−capオリゴペプチド等の保護されたNキャップ形態のオリゴペプチドから同様にして調製し、治療剤に結合できる。この方法は、図6に示す。
【0131】
ここで、保護されたN−Cap−オリゴペプチド治療剤を、治療剤の安定性と適合する方法により脱保護される。例えば、ジカルボキシル−ペプチジル−アントラサイクリンを、メチル基で保護し、エステラーゼで脱保護できる。他の治療剤については、脱保護に、ベンジル保護基及び接触水素添加を選択することができる。
【0132】
塩の形態の負に帯電したNキャップオリゴペプチド−治療剤を、以下の基から選択される溶媒を用いて調製できる:アルコール(例えば、メタノール、エタノール又はイソプロパノール)、水、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ジグライム又は他の極性溶媒。ナトリウム源は、1モル当量のNaHCO3、NaOH、Na2CO3、NaOAc、NaOCH3(一般的に、ソジウムアルコキシド)又はNaHである。Na+をチャージしたイオン交換カラム(例えば、強又は弱イオン交換体)も、適切な場合、塩形態のNキャップオリゴペプチド治療剤を製造するこの最後の工程に有用である。ナトリウムは、単に一例として挙げたにすぎない。
【0133】
一般的に、プロドラッグを、薬学的に許容される塩の形態に転換してプロドラッグの溶解度を改善してもよい。Nキャップ−オリゴペプチド治療剤を、薬学的に許容される塩、例えば、NaHCO3、Na2CO3、NaOH、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、KHCO3、K2CO3、CaCO3、NH4OH、CH3NH2、(CH3)2NH、(CH3)3N、アセチルトリエチルアンモニウムで、中和する。好ましい塩の形態のプロドラッグは、ナトリウムであり、好ましい中和塩は、NaHCO3である。
【0134】
ドキソルビシン及びダウノルビシンを含むアントラサイクリン型分子が、極めて低濃度で有機溶媒中でゲルを形成することは、十分に立証されている(Matzanke,B.F.等、Eur.J.Biochem.,207:747−55(1992);Chaires,J.B.等、Biochemistry,21:3927−32(1982);Hayakawa,E.等、Chem.Pharm.Bull.,39:1282−6(1991)。このことは、ペプチドアントラサイクリン複合体を製造するときに、清浄な生成物を高収率で得るのにかなりの障害となる可能性がある。ゲルの形成は、望ましくない副反応の発生の原因となる。この問題を最小限とする一つの方法に、カップリング反応に、極めて希薄な溶液(1〜2%)を使用することがある。しかしながら、この方法は、プロセス環境においては、実用的ではない(多量の廃棄物、複雑な単離)。この問題を克服するために、尿素又は他のカオトロピック剤を使用して、ゲルを形成する強力な疎水性及び水素結合力を破壊することができる。したがって、カップリング反応を、尿素含有溶媒、有利にはDMF又はNMPに尿素を添加して20%〜飽和溶液としたものを用いて実施すると、たとえ反応剤の濃度が10%を超えても、副反応を2%未満に維持することができる。これにより、結合工程を高濃度で実施できるようになり、収量が良好となる。
【0135】
一般的な酵素法
酸又は塩基により触媒された完全Nキャップ化合物への保護されたNキャップ−オリゴペプチド治療剤の加水分解により、適度に酸性又は塩基性の条件下であっても、数多くの治療剤が不安定であるため複雑な反応混合物となる。酵素は、基質又は生成物を破壊することなく、加水分解を促進することができる。エステラーゼ又はリパーゼが、この反応に好適な酵素のことがあり、それらの天然又は水溶性の形態であってもよいし、又は市販の固体支持体材料に交差カップリング又は結合により固定化してもよい。評価した可溶性酵素のうち、Candida Antarctica「B」リパーゼ(Altus Biologics社)は、とりわけ有用である。交差カップリングにより固定化された酵素の一例として、ChiroCLEC−PC(商標)(Altus Biologics社)が挙げられる。Candida Antarctica「B」リパーゼ(Altus Biologics社)は、NHS活性化セファロース(Sepharose)(商標)4Fast Flow(American Pharmacia Biotech社)との反応により固定化できる。加水分解中の反応混合物のpHを、慎重に制御し、pHシュタットにより、NaHCO3溶液の添加を制御して、5.5〜7.5、有利には5.7〜6.5に維持する。反応が完了したら、生成物を、濾過した反応混合物を凍結乾燥することにより単離する。固定化酵素は、フィルターケーキに残存しており、必要に応じて再使用できる。
【0136】
一般的なアリル又はアルキルエステル法
プロドラッグは、アリル半エステル又はアルキル半エステル形態のNキャップオリゴペプチドを治療剤とカップリングした後、複合体から遊離酸を放出することにより、調製することもできる。図8は、スクシニル−βAla−Ile−Ala−Leuとドキソルビシンを用いたこのプロセスを示す。
【0137】
アリル−スクシニル−βAla−Ile−Ala−Leuとドキソルビシンとのカップリングは、オリゴペプチド結合方法のいずれか一つにより実施できる。
【0138】
また、アリル−スクシニル−βAla−Ile−Ala−Leu−ドキソルビシンは、公知の方法(Casimir,J.R.等、Tet.Lett.36/19 3409(1995))で調製したアリルヘミスクシネートを、βAla−Ile−Ala−Leu−ドキソルビシンと、図5に示すように、以前の方法で説明されている保護されたテトラペプチド前駆体のドキソルビシンとのカップリングのようにして、反応させることによっても合成できる。好適な不活性溶媒は、THF、ジクロロメタン、酢酸エチル、トルエンであり、好ましくはTHFである。この溶媒から、反応が進行するにつれて、酸の形態の生成物が沈殿する。単離された酸を、上記した方法でそのナトリウム塩に転換する。反応時間は、10〜180分間、有利には10〜60分間、温度は、0〜60℃、好ましくは15〜30℃である。
【0139】
アリル基又はアルキル基の除去は、当該技術分野において周知であり且つ科学文献(Genet,J−P等、Tet.Lett.,50,497,1994;Bricout,H.,等、Tet.Lett.,54:1073(1998),Genet,J−P等Synlett,680(1993);Waldmann,H.等、Bioorg.Med.Chem.7:749(1998);Shaphiro,G.,Buechler,D.,Tet.Lett,35:5421(1994))で裏付けられている、アリル基又はアルキル基のアクセプター分子へのPd(0)又はNi(0)、有利にはPd(0)促進移動によりおこなうことができる。触媒の量は、基質に対して、0.5〜25モル%であることができる。
【0140】
一般的なトリチル又は置換トリチル法
また、プロドラッグは、図7に示す方法で合成してもよい。この方法では、R’−オリゴペプチド(ここで、R’は、トリチル又は置換トリチルである)を利用する。R’−オリゴペプチドと治療剤とのカップリングは、保護されたオリゴペプチドと治療剤とを0〜20℃で30〜120分間で結合させることについて、上記で説明した方法のいずれか一つにより、実施できる。
【0141】
トリチル基又は置換トリチル基の除去は、酸性条件下でおこなって正に帯電したプロドラッグを得ることができる。この正に帯電したプロドラッグは、図4に示したようなNキャップ型であり、上記したようなものである。トリチル脱保護は、酢酸、ギ酸及び希薄塩酸を用いておこなうことができる。
【0142】
プロドラッグは、無水コハク酸又は無水グルタル酸と反応させることにより、(スクシニル又はグルタリル)−オリゴペプチド−治療剤に転換でき、さらにいずれかの薬学的に許容される塩に転換できる。カップリング工程の溶媒は、DMF、DMSO、CH3CN、NMP又は当該技術分野において公知の他の好適な溶媒でよい。
【0143】
一般的な逆方向固相結合法
本発明のプロドラッグ化合物は、「段階的」逆(N末端からC末端)方向法を用いた固相化学反応を用いることにより、合成できる。
【0144】
一つの方法として、スクシニル半エステル、例えば、スクシニル−モノ−ベンジルエステル又は−アリルエステルを固定化するのに樹脂を用いることが挙げられる。選択できる樹脂として、例えば、「Wang Resins(Wang樹脂)」(Wang,S.S.,J.Am.Chem.Sco.,95:1328(1973);Zhang,C.,Mjaili,A.M.M.,Tet.Lett.,37:5457(1996))、「Rink Resins(Rink樹脂)」(Rink,H.Tet.Lett.,28:3787(1987))、「Trityl−, or substituted−trityl Resins(トリチル樹脂又は置換トリチル樹脂)」(Chen,C.等、J.Am.Chem.Soc.,116:2661(1994);Bartos,K.等、Peptides,Proc.22nd European Peptide Symposium(1992);Schneider,C.H.;Eberle,A.N.(Eds.),ESCOM,Leiden,pp.281(1993))がある。次に、固定化したエステルを、脱保護し、例えば、同様にC末端保護β−アラニンと反応させる。次に、これらの工程を、イソロイシン、アラニン及び最後にロイシンエステルを用いて反復した後、固定化スクシニル−テトラペプチドにドキソルビシンをカップリングする。次に、この分子を、穏やかな酸性条件を用いることにより樹脂から遊離させて遊離プロドラッグ、例えば、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxを形成する。この方法は、図9のスキームにより表される。別の種類の相合成では、固定化スクシニルオリゴペプチドエステルを利用する。これを、次にC末端脱保護した後、ドキソルビシン又は他の治療剤へのカップリング工程をおこない、最後に図9のスキームにより表すように樹脂から遊離させる。次に、酸型のプロドラッグ分子を、最後に上記したようにしてそのナトリウム塩に転換できる。
【0145】
一般的な大規模化合物合成
プロドラッグ化合物は、本発明の簡単で効率的な3工程プロセスを用いて合成できる:(1)アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチドと治療剤とを、活性化剤の存在下でカップリングしてアルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド−治療剤複合体を調製する工程、(2)カップリング工程後に残存する未カップリング治療剤を除去する工程、及び(3)アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド−治療剤複合体を脱保護して安定化基−オリゴペプチド−治療剤プロドラッグ化合物を調製する工程。
【0146】
第一の工程では、治療剤に、アルキルエステル保護オリゴペプチドフラグメントをカップリングする。この第一工程の好ましい態様では、アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基オリゴペプチド、例えば、MeOSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−OHを、治療剤、例えば、ドキソルビシン(図27)と、活性化剤、例えば、HATUを用いて、カップリングして、アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基オリゴペプチド治療剤複合体、例えば、MeOSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxを得る。この工程の着目点は、加水分解工程は純度には影響しないことが判明したので、純度とメチルエステルの収率にある。好ましくは、アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基オリゴペプチドの治療剤に対するモル比は、2:1〜1:1である。より好ましくは、モル比は、1.75:1〜1.5:1である。最も好ましくは、モル比は、1.66:1である。
【0147】
アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基オリゴペプチドと治療剤とのカップリングは、好ましくは(a)アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基オリゴペプチドと治療剤とを、DMF中で混ぜること、(b)DIEAを添加すること、(c)アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基オリゴペプチドと治療剤とを、活性化剤の存在下で反応させて複合体を形成すること、及び(d)食塩溶液を添加することにより複合体を沈殿させて沈殿物を得ることにより、実施される。好ましくは、DIEAとアルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチドとのモル比は、3:1〜1.5:1である。より好ましくは、モル比は、2.5:1〜2:1である。最も好ましくは、モル比は、2.18:1である。反応工程は、好ましくは0℃で30分間実施する。好ましくは、活性化剤とアルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチドのモル比は、1.5:1〜1:1である。より好ましくは、モル比は、1.1:1である。食塩溶液は、好ましくはNaClを水に20%(w/v)〜40%(w/v)添加したものである。より好ましくは、食塩水溶液は、NaClを水に25%(w/v)〜35%(w/v)添加したものである。最も好ましくは、食塩水溶液は、NaClを水に30%(w/v)添加したものである。複合体を、好ましくは食塩水で沈殿させる。この際のpHは、5.0〜7.0(5.0と7.0を含む)である。最も好ましくは、複合体を、pH5.8〜6.0で沈殿させる。
【0148】
数多くの治療剤は毒性物質であるので、カップリング生成物から遊離の治療剤を除去することが、好ましい。この除去工程は、(a)複合体をDMFに溶解すること、(b)スカベンジャー樹脂を無水DMFに溶解すること、(c)カップリング工程で形成されたアルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基オリゴペプチド治療剤複合体を、スカベンジャー樹脂に添加して複合体−樹脂混合物を形成すること、(d)得られた混合物を、0℃〜30℃で2〜24時間維持して未カップリング治療剤を樹脂と反応させること、(e)樹脂を混合物から除去すること、及び(f)食塩溶液を添加することにより残部を沈殿させてアルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基オリゴペプチド治療剤複合体の沈殿物を形成することにより、実施するのが好ましい。好ましくは、スカベンジャー樹脂は、ポリスチレン−イソシアネート(PS−イソシアネート)、PS−メチルイソシアネート、PS−チオイソシアネート、PS−メチルチオイソシアネート、PS−スルホニルクロリド、PS−メチルスルホニルクロリド又はPS−ベンズアルデヒドである。最も好ましくは、スカベンジャー樹脂は、PS−イソシアネートである。好ましくは、除去工程を実施して遊離治療剤(アントラサイクリン)を除去する。
【0149】
第三工程は、アルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド−治療剤複合体を、好ましくは酵素による加水分解か、より好ましくはエステラーゼによる加水分解により脱保護して、良好な収率で少なくとも90%の最終純度のプロドラッグ化合物が直接得られる。例えば、第三工程では、酵素、例えば、CLEC CAB(架橋Candida Antarctica Bリパーゼ)により、MeOSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxにおけるメチルエステル基の加水分解をおこない、定量的収率で高純度のSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxのナトリウム塩を直接得ることができる。
【0150】
酵素は、好ましくは固体支持体上に架橋又は固定化される。エステラーゼは、ブタ肝臓エステラーゼ、Candida AntarcticaBリパーゼ、Candida rugosaリパーゼ、Pseudomonas cepaciaリパーゼ、セファロースに固定化したブタ肝臓エステラーゼ、セファロースに固定化したCandida antarcticaBリパーゼ、CLEC−PC(商標)(Pseudomonas cepaciaリパーゼ)、CLEC−CAB(Candida AntarcticaBリパーゼ)又はCLEC−CR(Candida rugosaリパーゼ)であることができる。酵素による加水分解を用いた脱保護は、好ましくは(a)酵素を洗浄して遊離酵素を除去し、(b)洗浄された酵素をアルキルエステル又はアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド−治療剤複合体に添加し、(c)この酵素を複合体と、15〜40℃(15℃と40℃を含む)、pH5.0〜8.0(5.0と8.0を含む)、少なくとも18時間の条件で反応させて、安定化基−オリゴペプチド−治療剤プロドラッグ化合物を得、(d)酵素をプロドラッグ化合物から分離することにより、実施される。最も好ましくは、追加の洗浄した架橋又は固定化酵素を、酵素と複合体とを反応させる工程の後で添加してから、プロドラッグ化合物から酵素を分離する。
【0151】
遊離治療剤の除去
未結合治療剤は、プロドラッグの製造プロセスの後の段階で存在することがある。例えば、(安定化基)−(オリゴペプチド)複合体を治療剤としてのドキソルビシンとカップリング中、ある場合には、反応が完全には進行しないことが判明した。このカップリング生成物には、約2〜4%の残留ドキソルビシンがあった。最初に酸性洗浄により生成物からドキソルビシンを完全に除去することを試みたときには、完全には除去されなかった。遊離治療剤の完全除去は、スカベンジャー樹脂又はビーズを利用する、実施例47及び図11に概略示したプロセスによりおこなった。
【0152】
中間体と残留ドキソルビシンを含有する粗生成物を、DMFに溶解し、ポリスチレンメチルイソシアネート又はポリスチレンスルホニルクロリド樹脂又はビーズを添加した。反応液を、60分間攪拌した。ドキソルビシンの遊離アミノ基は、ビーズ上のイソシアネート基又は塩化スルホニル基と反応して尿素又はスルホンアミド誘導体を形成する。次に、ドキソルビシンを結合した固体ビーズを、濾過により所望の生成物から分離した。所望の生成物は、DMF溶液に残存している。この方法は、生成物から残留治療剤を除去するための、極めて穏やかで且つ効果的な方法であると思われる。
【0153】
したがって、本発明によれば、化合物の製造方法であって、
(1)式
Fmoc−(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるFmoc保護オリゴペプチドを選択する工程と、
(2)Fmoc保護オリゴペプチドを、治療剤の存在下で活性化剤で活性化することにより、Fmoc保護オリゴペプチドを治療剤にカップリングしてFmoc保護オリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
(3)前記Fmoc保護オリゴペプチド−治療剤複合体を塩基と接触させることにより、Fmoc保護オリゴペプチド−治療剤複合体を脱保護してオリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
(4)前記オリゴペプチド−治療剤複合体を安定化基にカップリングして前記化合物を形成する工程と、
を含む方法が提供される。
【0154】
好ましくは、nは、0〜3であり、mは、0〜3であり、m+nは3以下である。
【0155】
別法として、化合物の製造方法であって、
(1)式
(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドを選択する工程と、
(2)前記オリゴペプチドを、アルキルエステル保護安定化基にカップリングしてアルキルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を形成する工程と、
(3)前記アルキルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を、治療剤の存在下で活性化剤により活性化することにより、前記アルキルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を治療剤にカップリングしてアルキルエステル保護安定化基−オリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
(4)前記アルキルエステル保護安定化基−オリゴペプチド治療剤複合体を脱保護して前記化合物を形成する工程と、
を含む方法が提供される。
【0156】
好ましくは、nは、0〜3であり、mは、0〜3であり、m+nは3以下である。
【0157】
本発明の化合物は、以下の工程によって製造することもできる:
(1)式
(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドを選択する工程と、
(2)前記オリゴペプチドを、アリルエステル保護安定化基にカップリングしてアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を形成する工程と、
(3)前記アリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を、治療剤の存在下で活性化剤により活性化することにより、前記アリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド複合体を治療剤にカップリングしてアリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
(4)前記アリルエステル保護安定化基−オリゴペプチド治療剤複合体を脱保護して前記化合物を形成する工程。
【0158】
好ましくは、nは、0〜3であり、mは、0〜3であり、m+nは3以下である。
【0159】
本発明の化合物を製造するためのさらに別の方法は、以下の工程を含む:
(1)式
トリチル−(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるトリチル保護オリゴペプチドを選択する工程と、
(2)トリチル保護オリゴペプチドを、治療剤の存在下で活性化剤で活性化することにより、トリチル保護オリゴペプチドを治療剤にカップリングしてトリチル保護オリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
(3)酸性条件下でトリチル保護オリゴペプチド−治療剤複合体を脱保護してオリゴペプチド−治療剤複合体を形成する工程と、
(4)前記オリゴペプチド−治療剤複合体を安定化基にカップリングして前記化合物を形成する工程。
【0160】
好ましくは、nは、0〜3であり、mは、0〜3であり、m+nは3以下である。
【0161】
これらの方法のいずれかとの関連における別の可能な工程として、スカベンジャー樹脂又はビーズを使用することにより、未カップリング治療剤を除去する工程が挙げられる。さらに、化合物を、必要に応じて、薬学的に許容される塩で中和してもよい。
【0162】
具体的化合物
本発明の化合物の具体例を、以下に示す:
【0163】
Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−Met−Ala−Leu−Dox及びSuc−Phe−Ala−Leu−Dox。
【0164】
CD10により切断されることができるが、TOPによる切断には耐性を有する化合物の例として、以下のものが挙げられる:Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox及びSuc−Ile−Ala−Leu−Dox。
【実施例】
【0165】
実施例1:
細胞ホモジェネートのタンパク質特異的活性
種々の培養ヒト細胞ペレットを、pH7.2の100mM HEPES緩衝液に添加して均一化し、得られたホモジェネートを、12.5μg/mLのSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Tyr−Leu−Dox、Suc−βAla−Leu−Tyr−Leu−Doxとともに、37℃で1時間インキュベーションした。さらに、CD10阻害剤としての1μMホスホラミドンを、LNCaP細胞ホモジェネートとともにインキュベーションに含ませた。特異的活性を推定するために、ホモジェネートの可溶性部分におけるタンパク質含量を推定した。タンパク質特異的活性として表した結果(図12)から、CD10を含有することが知られているLNCaP細胞が、最大のSuc−Ile−Ala−Leu−Dox加水分解活性を示すことが明らかである。この活性は、ホスホラミドンにより阻害される。CD10を発現しないPC−3細胞は、他の3種の基質を加水分解するが、Suc−Ile−Ala−Leu−Doxを加水分解しない。
【0166】
種々のソースからのマウス腫瘍異種移植片を、外科的に取り出し、pH7.2の100mM HEPES緩衝液に添加して均一化し、得られたホモジェネートを、12.5μg/mLのSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Ile−Ala−Leu−Dox及びSuc−Leu−Tyr−Leu−Doxとともに、37℃で1時間インキュベーションした。可溶性タンパク質を測定し、結果を、タンパク質特異的活性として報告する。結果を、図13に示す。結果から、LNCaP細胞が、最高のSuc−Ile−Ala−Leu−Dox加水分解活性を示し、一方、HL−60細胞がSuc−Ile−Ala−Leu−Dox加水分解活性を示さないことが明らかである。
【0167】
実施例2:
精製CD10による加水分解
ブタ腎臓CD10(Elastin Products社)の精製品の等量を、種々のペプチジルドキソルビシン化合物12.5μg/mLとともに、pH7.4の50mM TrisHCl、150mM NaCl、0.1%Triton X−100中、37℃、10時間の条件で、インキュベーションした。反応生成物を、蛍光検出を用いたHPLCにより分析した。速度は、インキュベーション中、実質的に直線状であった。得られた生成物は、Leu−ドキソルビシンであった。表1に、10時間で加水分解された各試験化合物のパーセントを示す。さらに、これらの結果を、標準試験化合物であるSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxに対して表す。
【0168】
【表1】
【0169】
実施例3:
ペプチドに結合した薬剤が、CD10による切断に及ぼす影響
プロドラッグの「トキシン」位置での構造のCD10触媒速度効果を試験するために、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの加水分解速度を、ドキソルビシンをパラニトロアニリド(pNA)に置換した類似物、すなわち、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−pNAの加水分解速度と比較した。ブタ腎臓CD10(Elastin Products社)を、2種の基質とともに、同一条件(37℃、pH7.4、50mM TrisHCl、150mM NaCl、0.01%Triton X−100)下でインキュベーションし、Leu−Doxの放出速度を、Leu−pNAの放出速度と比較した。得られた結果から、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−pNAは、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxよりも、590倍速く切断されることが分かる。このことは、これらの腫瘍活性化プロドラッグ化合物におけるトキシンの構造(又は結合部位)が、切断速度に影響することがあることを示している。
【0170】
実施例4:
潜在的プロドラッグのスクリーニング
trouase又はチメットオリゴペプチダーゼによっては切断されないが、CD10によって切断されるプロドラッグ化合物が、本発明にとって好ましい。すなわち、trouaseによる切断性の欠如について化合物をスクリーニングすることが、好ましい。癌細胞trouaseの3種の異なる試料を使用して、種々の試験化合物をスクリーニングした。これらの3種の試料は、以下に示すものであった:
(a)MCF7/6(乳癌)細胞ホモジェネート、
(b)MCF7/6(乳癌)ならし培地、
(c)HeLa(子宮頸癌)細胞抽出物アニオン交換画分プール。
【0171】
a.MCF7/6細胞ホモジェネートの調製
MCF7/6細胞を、DMEM:F12(1:1)、50mg/L牛血清アルブミン、ITS−X(10mg/Lインスリン、5.5mg/Lトランスフェリン、6.7μg/L亜セレン酸ナトリウム、2mg/Lエタノールアミン)を含有する、無血清培地で、密集状態となるまで増殖させ、4℃、10,000xg、20分間の条件で遠心分離し、デカントすることにより、細胞の脂質濃縮物(Gibco#21900−030)100mLを採取した。得られたペレットを、リン酸緩衝生理食塩水(Gibco社)2mLに再懸濁し、18,000xg、10分間の条件で遠心分離した。デカントした後、細胞(湿潤物約300μL)を、1.7mLの10mM pH7.2 HEPES緩衝液(ナトリウム塩)中で、粉砕することにより均一化した。得られたホモジェネートを、18,000xg、4℃、5分間の条件で遠心分離し、上清を、等分し、つづいての化合物のスクリーニングに使用するために、−20℃以下の温度で保存した。
【0172】
b.MCF7/6ならし培地の調製
MCF7/6細胞を、10%ウシ胎児血清、0.05%(w/v)L−グルタミン、250IU/mLペニシリン及び100μg/mLストレプトマイシンを含有するDMEM/F12(1:1)培地で、密集状態となるまで増殖させた。次に、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、DMEM/F12(1:1)、0.02%BSA、ITS−X(10mg/Lインスリン、5.5mg/Lトランスフェリン、6.7μg/L亜セレン酸ナトリウム、2mg/Lエタノールアミン)中、5%CO2、37℃、24時間の条件でインキュベーションした。次に、ならし培地を、デカントし、YM10(分画MW10,000)限外濾過膜(Millipore社)を備えた攪拌型セル装置を用いて、pH7.2の10mM HEPES緩衝液と一旦交換した後20倍に濃縮した。この溶液を、化合物のスクリーニングに使用するために、等分して、−20℃の温度で保存した。
【0173】
c.HeLa細胞アニオン交換画分プールの調製
300億個の工業生産したHeLa細胞(ヒト子宮頸癌、ベルギー国のSeneffeに所在するComputer Cell Culture Centerより入手)を、溶菌水溶液108mLに添加し、超音波処理器及びダウンスホモジェナイザーを用いて、均一化した。溶菌液は、0.02%w/v Triton X−100、0.04%w/vアジ化ナトリウム、及びプロテアーゼ阻害剤混合物(2タブレット/50mL Complete(商標)、無EDTAタブレット、Roche Molecular Biochemicals社製)を含有していた。細胞ホモジェネートを、4℃、5000xg、30分の条件で遠心分離し、得られたペレットを、溶菌液108mL(2回目)に添加し、ダウンスホモジェナイザーを用いて均一化し、上記と同様にして遠心分離した。得られた上清を、混合し、145,000xg、4℃、90分間の条件で遠心分離した。
【0174】
超遠心分離上清の一部分を、0.01%(w/v)Triton X−100と0.02%(w/v)アジ化ナトリウムとを含有する20mMトリエタノールアミン−HCl pH7.2緩衝液(平衡緩衝液)により、2倍希釈した。得られた溶液の30mL(タンパク質約180mgに相当)を、2.6×9.4cm Source(商標)15Q(Amersham Pharmacia Biotech社)低圧アニオン交換クロマトグラフィーカラム(1ml/分)に4℃で供給した。次に、このカラムを、平衡緩衝液250mlを流量1mL/分で流して洗浄した。タンパク質を、NaCl線状濃度勾配(NaClを平衡緩衝液に添加して0〜0.5Mとしたもの、勾配の総容積は1000ml)で、流量3ml/分で溶離した。2分間の画分を集め、基質としてβAla−Leu−Ala−Leu−Doxを使用した酵素活性測定に使用した。そのAla−Leu−Doxへの転換を、アントラサイクリン部分の蛍光検出を利用した逆相高速液体クロマトグラフィーにより定量した。最高活性レベルの画分をプールし(画分#43〜46;ほぼ0.13M NaCl)、プロテアーゼ阻害剤(Complete(商標)、無EDTAタブレット、Roche Molecular Biochemicals社製)を補充し、アリコットとして−80℃で保存した。
【0175】
d.切断アッセイ
試験化合物を、12.5μg/mLの濃度で、癌細胞酵素の3種の異なる試料の各々とともに、37℃、2時間の条件でインキュベーションした。インキュベーション後、3容のアセトニトリルを添加して、反応を停止し、タンパク質を混合物から取り出した。試料を、18,000g、5分間の条件で遠心分離し、上清100μLを、水300μLと混合してから、HPLCにより分析した。HPLC分析については、試料50μLを、4.6×50mm 2μ TSK Super−ODSクロマトグラフィーカラムに40℃で注入し、3分間線状勾配で溶離をおこなった(アセトニトリルを、水性20mM酢酸アンモニウムpH4.5緩衝液に添加して26〜68%の勾配としたもの;流量2mL/分)。検出は、励起波長235nm、発光波長560nmでの蛍光によりおこなった。
【0176】
一定の条件下で酵素試料により切断されなかった(切断率<5%、2時間)試験化合物を、以下の表2に示す。いくつかの例外はあるが、癌細胞酵素切断についての結果は、HeLa細胞、MFC7/6細胞ホモジェネート、MCF7/6ならし培地からの部分精製画分について、同一であった。
【0177】
【表2】
【0178】
実施例5:
細胞系でのCD10発現
CD10(CD10)は、高い割合(61%)の前立腺腫瘍を含む、多数の腫瘍の種類(Chu及びArber、Am.J.Clin.Pathol.113:374−382(2000))において、広く発現される。また、CD10は、生体外で培養したある種のヒト前立腺腫瘍由来細胞系で発現することも、分かった。したがって、本発明のペプチドプロドラッグが、前立腺だけでなく、表面でCD10を発現する他の腫瘍の種類から得た腫瘍系に対して細胞障害性であるかどうかを測定することは、重要である。前立腺腫瘍系であるLNCaPは、高レベルのCD10を発現する(Krongrad等、Urol.Res.25:113−116(1997);Liu、Cancer Res.60:3429−3434(2000))。また、培養におけるいくつかの前立腺腫瘍系は、別の十分に特徴付けされた細胞表面関連エンドプロテアーゼである前立腺特異抗原(PSA)を、発現する。表3に示す前立腺腫瘍系は、American Type Culture Collection(ATCC)から得られ、CD10特異的モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーにより、CD10発現についてスクリーニングした(Caltagクローン5−1 B4)。
【0179】
【表3】
【0180】
フローサイトメトリー分析を、CD10の発現を測定するための細胞系のパネルを用いておこなった。図14は、CD10は、PSAを発現しないある種のB細胞リンパ腫系でも高レベルで発現するということを示す。このようなB細胞系には、Ramos及びNamalwa細胞などがある。LNCaP前立腺癌細胞も、高レベルのCD10を発現することが判明した。一方、HT29細胞、PC−3細胞及びBALL−1細胞は、この抗原を検出可能なレベルでは発現せず、負の対照として続いての検討に用いた。結腸癌LS174T及び乳癌MCF−7で、低レベルのCD10の発現が見られた。
【0181】
実施例6:
LNCaP細胞、HT−29細胞及びPC−3細胞での腫瘍活性化プロドラッグ活性
粘着細胞であるLNCaP(前立腺癌)、HT−29(結腸癌)及びPC−3(前立腺癌)を、10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)を含有するDMEM培地で培養した。検討する日に、細胞をトリプシン溶液でプレートから分離した。集めた細胞を洗浄し、10%FCS含有DMEMに細胞0.25×106/mlになるように再懸濁した。細胞懸濁液100μLを、96ウエルプレートに添加し、3時間インキュベーションして細胞を接着させた。このインキュベーションの後、ドキソルビシン又は試験化合物を階段希釈(3倍づつ)し、ウエル一つあたり、化合物100μLを添加した。次に、プレートを、24時間インキュベーションし、100μCi/ml 3H−チミジン10μLでパルシングし、さらに24時間(総インキュベーション時間:48時間)インキュベーションした。プレートを、96ウエルハーベスター(Packard Instruments社)を用いて採取し、Packard Top Count Counterにより、カウントした。4つのパラメータロジスティック曲線を、Prismソフトウェアを用いて3H−チミジンの取り込みと、薬剤モル濃度との関係に適合させて、IC50値を求めた。
【0182】
陽性対照(ドキソルビシン)IC50は、使用した細胞系において0.02〜0.08μMであった。LNCaP細胞に対して最高の選択性を示した化合物は、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Ile−NMeAla−Leu−Dox及びSuc−Ile−Ala−Leu−Doxであった(表4)。これらの3種のプロドラッグの共通の特徴は、これらがアミノ酸の3位にイソロイシンを含むことである。アミノ酸の3位にロイシンを含むSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Ala−Leu−Dox及びSuc−Leu−NMe−Ala−Leu−Dox等の化合物も、選択性を示す。但し、この場合、選択性の程度は、イソロイシン類似物よりも小さい。
【0183】
【表4】
【0184】
実施例7:
Ball−1細胞、Ramos細胞及びNamalwa細胞での腫瘍活性化プロドラッグ活性
LNCaPの他に、Ramos細胞やNamalwa細胞等の多数のB細胞系がCD10(CD10pos細胞)を発現する。しかしながら、別のB細胞系であるBALL−1細胞は、CD10を発現せず、CD10陰性B細胞系(CD10neg細胞)としての役割を果たす。
【0185】
浮遊細胞であるBALL−1細胞、Ramos細胞及びNamalwa細胞を、10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)を含有するRPMI培地で培養した。検討する日に、細胞を集め、洗浄し、10%FCS含有RPMIに細胞0.5×106/mlになるように再懸濁した。細胞懸濁液100μLを、96ウエルプレートに添加した。ドキソルビシン又は試験化合物を階段希釈(3倍づつ)し、ウエル一つあたり、化合物100μLを添加した。最後に、ウエル一つあたり10μLの100μCi/ml 3H−チミジンを添加し、プレートを、24時間インキュベーションした。プレートを、96ウエルハーベスター(Packard Instruments社)を用いて採取し、Packard Top Count Counterにより、カウントした。4つのパラメータロジスティック曲線を、Prismソフトウェアを用いて3H−チミジンの取り込みと、薬剤モル濃度との関係に適合させて、IC50値を求めた。
【0186】
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxが、最大の選択性を示した。この選択性は、CD10negBALL−1細胞と比較して、Ramos細胞とNamalwa細胞についてそれぞれ120〜172倍であった(表5)。2番目に選択性が高かった類似物は、Suc−Leu−Ala−Leu−Doxであった。この場合、CD10pos細胞とCD10neg細胞との間の差はほぼ30〜35倍であった。
【0187】
【表5】
【0188】
実施例8:
粘着細胞であるLNCaP(前立腺癌)、PC−3(前立腺癌)及び22RVI(前立腺癌)を、10%熱不活化ウシ胎児血清(FCS)を含有するDMEM培地で培養した。検討する日に、細胞をトリプシン溶液でプレートから分離した。集めた細胞を洗浄し、10%FCS含有DMEMに細胞0.25×106/mlになるように再懸濁した。細胞懸濁液100μLを、96ウエルプレートに添加し、3時間インキュベーションして細胞を接着させた。このインキュベーションの後、ドキソルビシン又は試験化合物を階段希釈(3倍づつ)し、ウエル一つあたり、化合物100μLを添加した。次に、プレートを、24時間インキュベーションし、100μCi/ml 3H−チミジン10μLでパルシングし、さらに24時間(総インキュベーション時間:48時間)インキュベーションした。プレートを、96ウエルハーベスター(Packard Instruments社)を用いて採取し、Packard Top Count Counterにより、カウントした。4つのパラメータロジスティック曲線を、Prismソフトウェアを用いて3H−チミジンの取り込みと、薬剤モル濃度との関係に適合させて、IC50値を求めた。
【0189】
【表6】
【0190】
表6は、22RV1等のPSA陽性でありCD10陰性である細胞が、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox又はSuc−Ile−Ala−Leu−Doxを容易に切断しないということを示している。これらのデータは、CD10が、これらの化合物の切断に関与しているが、PSAでは切断されないことを、示唆している。
【0191】
実施例9:
CD10の阻害により、Ramos細胞及びLNCaP細胞(BALL−1細胞ではない)についてのSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの効力が減少する。
CD10の2つの公知の阻害剤の、Ramos細胞、LNCaP細胞及びBall−1細胞におけるプロドラッグ活性に及ぼす影響を評価した。Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−DoxのIC50は、CD10阻害剤であるホスホラミドンとチオルファンの濃度を増加させて測定した。ホスホラミドンの濃度を増加させると、Ramos細胞とLNCaP細胞でのSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの効力の損失が生じたが、一方、BALL−1細胞は、影響されなかった(表7)。同様に、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−DoxのIC50は、100nMホスホラミドンで処理したLNCaP細胞では、7倍変化した(データは図示せず)。図15は、300nMホスホラミドンの不存在下又は存在下でSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxを用いた場合の、ある種の滴定曲線の一例である。
【0192】
【表7】
【0193】
第2のCD10阻害剤であるチオルファンも、CD10+細胞でSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−DoxのIC50をシフトする(表8)。しかしながら、チオルファンは、Ramos細胞と比較して、LNCaPでの阻害活性がもっと大きかった。
【0194】
【表8】
【0195】
実施例10:
標的細胞に関連したCD10の検出
ヌードマウスで増殖させた後ホルマリンで固定した異種移植片から採取した、LNCaP及びPC3組織の試料について、免疫組織化学分析を実施した。組織切片を、調製し、CD10又はイソタイプマッチド陰性対照に特異的な抗体で免疫染色した後、ヘモトキシリンで対比染色した。LNCaP試料は、全てのLNCaP細胞の腫瘍組織試料における全ての細胞の周囲に比較的均一に分布した、CD10特異的抗体による染色の強い細胞表面膜関連パターンを示した。これに対して、PC3組織については、免疫反応性は、観察されなかった。CD10により切断されることができるが、TOPによっては切断されることができない化合物、例えば、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、マウスにおけるLNCaP腫瘍の増殖を阻害するのに効果的であったが、これらは、PC3細胞に対しては活性ではなかった(実施例6参照)。したがって、CD10免疫組織化学的性質は、CD10切断可能なプロドラッグに反応する腫瘍を選択するのに有用である。
【0196】
実施例11:
Suc−Ile−Ala−Leu−Doxは、健康なマウスにおいて良好な耐容性を有する。
本発明の典型的なトリペプチドプロドラッグであるSuc−Ile−Ala−Leu−Doxは、マウスにおいて、十分許容される。単回投与最大耐性量(MTD)試験において、5つの正常マウス群に、Suc−Ile−Ala−Leu−Doxの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、28日間、毎日観察し、体重を、1週間に2回測定した。試験投与量レベルは、0mg/kg、23mg/kg、47mg/kg、70mg/kg、93mg/kg及び117mg/kgであった(それぞれ1kg当たりドキソルビシン0mg、14mg、28mg、42mg、56mg及び70mgに相当する)。急性毒性がなく、観察された唯一の毒性の兆候は、最高投与量群についての群平均体重(試験全体を通じて媒質対照群よりも低かった)が減少したことであった。しかしながら、死亡がなく、どの動物も、病的状態を示さなかった。28日のSuc−Ile−Ala−Leu−Doxの単回投与最大耐性量(MTD)は、この実験では得られず、したがって、試験した最高投与量(117mg/kg)よりも大きい。このMTD(ドキソルビシン66mg/kgに等しい)は、ドキソルビシン単独の場合(4mg/kgよりも大きな投与量で、死亡が生じる)よりも少なくとも16倍大きい。
【0197】
実施例12:
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、健康マウスにおいて良好な耐容性を有する。
本発明の典型的なテトラペプチドプロドラッグであるSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、マウスにおいて、十分許容される。単回投与最大耐性量(MTD)試験において、5つの正常マウス群に、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、28日間、毎日観察し、体重を、1週間に2回測定した。試験投与量レベルは、0mg/kg、25mg/kg、50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg及び125mg/kgであった(それぞれ1kg当たりドキソルビシン0mg、14mg、28mg、42mg、56mg及び70mgに相当する)。投与後、何ら急性毒性は観察されなかった。麻痺及び顕著な体重損失(>初期重量の20%)を含む毒性が、2つの最高投与量群に観察された。14日目に、125mg/kg投与量群における4匹の動物を、処置に関連した毒性のため、安楽死させた。21日目に、次に大きな投与量(100mg/kg)群における2匹の動物を、同様に安楽死させた。次の投与量群(75mg/kg)では、病的状態は観察されず、且つ群平均体重は、試験中に増加した。
【0198】
28日目の生存動物に基づいて、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxについての、単回投与MTD値を推定したところ、75mg/kg(投与量ドキソルビシン40mg/kgに等しい)であった。したがって、MTDは、ドキソルビシン単独のMTD(標準安全有効投与量(4〜8mg/kg)に基づいて4mg/kgと推定)よりも、約10倍高かった。
【0199】
実施例13:
Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、ドキソルビシンよりも生体内での優れた耐容性を有する。
本発明の典型的なテトラペプチドプロドラッグであるSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、マウスにおいて、十分許容される。第二単回投与最大耐性量(SD−MTD)試験において、5つの正常ICRマウス群に、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、49日間、毎日観察し、体重を、1週間に2回測定した。試験投与量レベルは、0mg/kg、50mg/kg、75mg/kg又は100mg/kgであった(それぞれ1kg当たりドキソルビシン0mg、28mg、42mg又は56mgに相当する)。いずれの投与量レベルでも、24時間以内で急性毒性はなかった。投与量と時間に依存する毒性の兆候が、試験中に観察された。部分的な尻の麻痺及び顕著な体重損失(>初期重量の20%)を含む毒性が、75mg/kg投与量群及び100mg/kg投与量群において観察された。35日までに、75mg/kg投与量群の40%に死亡が観察された。49日目の生存動物及び毒性の兆候がないことに基づいて、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−DoxについてのSD−MTDを求めたところ、50mg/kg(ドキソルビシン28mg/kgに等しい)であった。この投与量は、極めてよく許容され、悪影響は観察されなかった。したがって、SD−MTDは、ドキソルビシン単独(16mg/kg)についてのSD−MTDよりも、モル基準で、約1.8倍高かった(表9参照)。これは、試験範囲にわたる14mg/kgドキソルビシン当量増分での投与量範囲に基づく、近似SD−MTD測定である。
【0200】
【表9】
【0201】
実施例14:
Suc−Leu−Ala−Leu−Doxは、ドキソルビシンよりも生体内での優れた耐容性を有する。
本発明の典型的なトリペプチドプロドラッグであるSuc−Leu−Ala−Leu−Doxは、マウスにおいて、十分許容される。第二単回投与最大耐性量(SD−MTD)試験において、5つの正常ICRマウス群に、Suc−Leu−Ala−Leu−Doxの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、49日間、毎日観察し、体重を、1週間に2回測定した。試験投与量レベルは、0mg/kg、47mg/kg、59mg/kg、71mg/kg、94mg/kg、117mg/kg、140mg/kg、又は164mg/kg(それぞれ1kg当たりドキソルビシン0mg、28mg、35mg、42mg、56mg、70mg、84mg又は98mgに相当する)。いずれの投与量レベルでも、24時間以内で急性毒性はなかった。投与量と時間に依存する毒性の兆候が、試験中に観察された。部分的な尻の麻痺及び顕著な体重損失(>初期重量の20%)を含む毒性が、94mg/kg投与量群及びそれより多い投与量群において観察された。49日目の生存動物及び毒性の兆候がないことに基づいて、Suc−Leu−Ala−Leu−DoxについてSD−MTDを求めたところ、71mg/kg(ドキソルビシン42mg/kgに等しい)であった。したがって、SD−MTDは、ドキソルビシン単独(16mg/kg)についてのSD−MTDよりも、モル基準で、約2.6倍高かった(表10参照)。これは、試験範囲にわたる7又は14mg/kgドキソルビシン当量増分での投与量範囲に基づく、近似SD−MTD測定である。
【0202】
【表10】
【0203】
実施例15:
Suc−Ile−Ala−Leu−Doxは、ドキソルビシンよりも生体内での優れた耐容性を有する。
本発明の典型的なトリペプチドプロドラッグであるSuc−Ile−Ala−Leu−Doxは、マウスにおいて、十分許容される。第二単回投与最大耐性量(SD−MTD)試験において、5つの正常ICRマウス群に、Suc−Ile−Ala−Leu−Doxの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、49日間、毎日観察し、体重を、1週間に2回測定した。試験投与量レベルは、0mg/kg、94mg/kg、117mg/kg、140mg/kg又は164mg/kgであった(それぞれ1kg当たりドキソルビシン0mg、56mg、70mg、84mg又は98mgに相当する)。いずれの投与量レベルでも、24時間以内で急性毒性はなかった。投与量と時間に依存する毒性の兆候が、試験中に観察された。部分的な尻の麻痺及び顕著な体重損失(>初期重量の20%)を含む毒性が、最高投与量群において観察された。毒性の兆候は、14日目までに164mg/kgで部分的な尻の麻痺、1匹の動物において14日目までに140mg/kg及びここでも1匹の動物において21日目までに117mg/kgで重量損失であった。49日目の生存動物及び毒性の兆候がないことに基づいて、Suc−Ile−Ala−Leu−DoxについてSD−MTDを求めたところ、94mg/kg(ドキソルビシン56mg/kgに等しい)であった。このSD−MTDは、ドキソルビシン単独(16mg/kg)についてのSD−MTDよりも、モル基準で、3.5倍高かった(表11参照)。これは、試験範囲にわたる14mg/kgドキソルビシン当量増分での投与量範囲に基づく、近似SD−MTD測定である。
【0204】
【表11】
【0205】
実施例16:
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、ドキソルビシンよりも生体内での優れた耐容性を有する。
本発明の典型的なテトラペプチドプロドラッグであるSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、マウスにおいて、十分許容される。第二単回投与最大耐性量(SD−MTD)試験において、5つの正常ICRマウス群に、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、49日間、毎日観察し、体重を、1週間に2回測定した。試験投与量レベルは、0mg/kg、50mg/kg、75mg/kg又は100mg/kgであった(それぞれ1kg当たりドキソルビシン0mg、28mg、42mg又は56mgに相当する)。いずれの投与量レベルでも、24時間以内で急性毒性はなかった。投与量と時間に依存する毒性の兆候が、試験中に観察された。部分的な尻の麻痺及び顕著な体重損失(>初期重量の20%)を含む毒性が、最高投与量群において観察された。21日までに、100mg/kg投与量における3匹の動物が、重量損失又は麻痺のため、安楽死させた。75mg/kg投与量群には、病的状態も死亡も、観察されなかった。49日目の生存動物及び毒性の兆候がないことに基づいて、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−DoxについてのSD−MTDを求めたところ、75mg/kg(ドキソルビシン42mg/kgに等しい)であった。このSD−MTDは、ドキソルビシン単独(16mg/kg)についてのSD−MTDよりも、モル基準で、2.6倍高かった(表12参照)。これは、試験範囲にわたる14mg/kgドキソルビシン当量増分での投与量範囲に基づく、近似SD−MTD測定である。
【0206】
【表12】
【0207】
実施例17:
Suc−Ile−Ala−Leu−Doxの代謝
Suc−Ile−Ala−Leu−Doxの代謝及びクリアランスを、正常マウスで試験した。マウスに、Suc−Ile−Ala−Leu−Doxを、単回静脈内ボーラス投与(117mg/kg)した。1時間目及び4時間目に、血漿試料を採取した。血漿試料100μlを、ミクロ遠心分離管(1.5mL)に移し、ダウノルビシン(0.5mg/mlを20μL)の内部標準を、アセトニトリル(400μl)と一緒に添加した。ミクロ遠心分離管にキャップをつけて、短く回転させた後、14,000rpmで遠心分離した。各管から420μlを取り出し、真空乾燥した。各試料を、アセトニトリル(20%)を含有する20mM水性ギ酸アンモニウムpH4.5緩衝液(AF)の65μlで戻してから、逆相液体クロマトグラフィーとタンデム質量分光分析(LCMS/MS)とを組み合わせて分析した。
【0208】
尿を、代謝ケージに入れた各対のマウスから、投与から2時間目及び24時間目に採取した。尿試料を、アセトニトリル(20%)含有AFで希釈して、LC MS/MSアッセイの実用範囲内の標的検体濃度とした。各希釈試料30μlを、エッペンドルフチューブ(1.5ml)に入れ、ダウノルビシン(0.5mg/mlで20μL)の内部標準を、アセトニトリル(20%)含有AF50μLと一緒に、添加した。次に、各試料を、LC MS/MSにより分析した。
【0209】
DAD検出器及びChemstationソフトウェアを備えたAgilent HP1100HPLCを、エレクトロスプレーイオンソースを備えたPE Sciex API365質量分光分析器に連結した。HPLCを、HAIGUARD C18ガードディスク(Higgins Analytical社)とステンレススチールフリット(Upchurch Scientific社)とを備えたTSK−Gel Super ODS、2mm、4.6×50mm(TosoHaas社)逆相カラムにより実施した。クロマトグラフィーを室温で実施した。流量は、0.5ml/分であった。注入容積は、50μLであった。20mM水性AFpH4.5緩衝液からなる移動相(アセトニトリルの量を増加していく)を用いて、勾配溶離を実施した。API365を、特定の検体親−娘イオン対を観察するようにセットされた、マルチプル反応観察モードにおいて、365℃で操作し、クロマトグラムの積分を、MacQuantソフトウェア(PE Sciex社)により実施し、予め得られた校正曲線と比較することにより、各検体を計量した。ダウノルビシンを、全ての場合において、内部標準として使用した。
【0210】
表13及び図16から明らかなように、Suc−Ile−Ala−Leu−Doxが、循環から極めて迅速に除去され、投与量の約1.1%が1時間で検出され、4時間までにほとんど検出できなくなった。投与量%の算出のために、血漿容積は、血液容積の40%であると推定した。これは、動物の体重の7%にあたる。2時間及び24時間で、親化合物が、投与量の3.9%及び15.0%が尿に検出された。このことは、腎臓が、プロドラッグが排出される主要な臓器であることを示している(図17)。
【0211】
【表13】
【0212】
Ala−Leu−Doxは、血漿又は尿中に検出されなかった。主要なペプチド代謝産物は、Leu−Doxであった。ドキソルビシンは、血漿中にはほとんど検出されなかったが、尿中、2時間及び24時間で低レベルで見出された。親と代謝産物の両方のレベルは、2時間時点よりも、24時間で、尿におけるレベルが高かった。このことは、初期の尿の採取時間(2時間)に対して、マウスのあとでの排尿から生じた可能性が最も高い。尿値は、0〜2時間の蓄積と、2〜24時間の蓄積を表すので、あとの排尿(2時間後)は、2〜24時間試料に蓄積される。
【0213】
Suc−Ile−Ala−Leu−Doxプロドラッグの低レベルの切断及び活性化が、正常マウスの血液において生じた。高投与量試験レベルのSuc−Ile−Ala−Leu−Doxで最小毒性が観察された(実施例11)。このことは、全身に存在すると正常組織に毒性がある、活性代謝産物ドキソルビシンの全身産生がほとんどないことを示している。
【0214】
実施例18:
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの代謝
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの代謝及びクリアランスを、正常マウスに、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxを、単回静脈内ボーラス投与(117mg/kg)して試験した。別々のマウスから、1時間目及び4時間目に、血漿試料を採取した。尿を、代謝ケージに入れた各対のマウスから、投与から2時間目及び24時間目に採取した。血漿試料及び尿試料を、調製し、実施例17に記載のようにして分析した。
【0215】
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、循環から極めて迅速に除去され、1時間目で、投与量の約1.0%が血漿中に検出されることができたが、4時間目ではほとんど検出できなかった(表14及び図18)。2時間目及び24時間目では、尿は、投与量の12.7%及び4.81%を含有していた。このことは、腎臓が、プロドラッグが排出される主要な臓器であることを示している(図19)。
【0216】
【表14】
【0217】
代謝産物Ala−Leu−Doxは、血漿中にほとんど検出されず、2時間目で、尿中に極めて低レベルでみられた。主要なペプチド代謝産物は、Leu−Doxであり、これは、1時間目で血漿中に低レベルで検出でき、さらには、2時間目及び24時間目で尿中に検出された。血漿には、遊離ドキソルビシンがほとんど存在しなかったが、尿中には比較的高レベルで検出された。このことは、多少の完全代謝が生じていることを示している。
【0218】
これらの試料において、尿中の親と代謝産物の両方のレベルが、2時間目で、24時間目でよりも高かった。0〜2時間及び2〜24時間で採取したSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxと代謝産物の合計量は、Suc−Ile−Ala−Leu−Dox(実施例17参照)と同様であった。このように、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−DoxのクリアランスとSuc−Ile−Ala−Leu−Doxのクリアランスとの間には、顕著な生理学的差異がない。
【0219】
実施例19:
未共役治療剤に対するプロドラッグの利点
本発明のプロドラッグには、未共役形態の治療剤に対して治療上の利点がある。
【0220】
単回最大耐性量(MTD)試験において、正常マウス群に、プロドラッグを、静脈内ボーラス投与した。マウスを、28日間、毎日観察し、体重を1週間に2回測定した。MTDは、28日後にマウスの死亡がなかった最高投与量に等しいと、推定した。表15に示すように、プロドラッグを含有するイソロイシンの単回投与SD−MTDは、ドキソルビシン単独よりも、1.6倍〜2.5倍高い範囲である。
【0221】
腫瘍を有するマウスにおける反復投与試験において、10匹マウス群に、種々の量のプロドラッグを、5日間隔又は1週間間隔で、合計5回投与した。60日間、頻繁に観察した後、許容毒性限界内であることが分かった投与量を、最大耐性反復量として確認した。表15から明らかなように、プロドラッグのRD−MTDは、ドキソルビシン単独よりも、約6.5倍高い。RD−MTD又はそれよりも低い投与量でプロドラッグを反復投与すると、LS174t腫瘍を有するマウスの生存率が顕著に増加するが、一方、ドキソルビシンは、生存日数には全く効果がない。このように、プロドラッグでは、はるかに多量の治療剤を全体として体及び標的細胞付近に排出できることと同様であると言える。
【0222】
【表15】
【0223】
実施例20:
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、腫瘍を有するマウスにおいて良好な耐容性を有する。
プロドラッグSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤は、反復投与条件下、ドキソルビシンよりも耐性が顕著によい。予想されるように、単回MTD(75mg/kg)(実施例16参照)と同様の投与量を反復投与したとき、耐性が低下した。腫瘍を有するマウスにおける反復投与試験では、各群がマウス10匹からなる3つの群に、0mg/kg、53mg/kg又は68mg/kgのSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox(1kg当たりドキソルビシン0mg、30mg及び38mgに相当)を、合計5回の同一の投与量(Q5DX5)で投与し、60日間、頻繁に観察した。全ての処置した動物は、試験全体を通して徐々に重量が減少したが、一方、媒質対照群の重量は、平均初期体重よりも12%まで増加した(図20)。高投与量群における2匹の処置動物が、体重がそれらの初期重量の20%超の重量損失が生じた毒性の兆候が生じたため、試験を終了した。毒性の兆候は、単回高投与(実施例16参照)した後に観察されたものと同様であり、げっし動物におけるドキソルビシンの公知の毒性プロファイルと一致した。このように、蓄積毒性が、比較的高投与レベルでの反復投与から生じた。しかしながら、5回投与後の2つの投与群における動物のドキソルビシンへの最大総暴露量は、それぞれ150mg/kg及び190mg/kgであった。これらの値は、ドキソルビシンの耐性反復投与レベル(5回投与後の総暴露量:4mg/kg又は20mg/kg)よりも、顕著に高い(8〜10倍)。しかしながら、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−DoxのRD−MTDは、ドキソルビシンの耐容要求投与レベル(4mg/kgを5回投与した後の総暴露量20mg/kgから成る標準安全RD有効投与量)よりも、少なくとも6〜5倍高い、約150mg/kgドキソルビシン当量であった。
【0224】
実施例21:
Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、ドキソルビシンよりも生体内での耐容性がよい。
本発明の典型的なテトラペプチドプロドラッグであるSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、マウスにおいて、十分許容される。第二単回投与最大耐性量(SD−MTD)試験において、5つの正常ICRマウス群に、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの静脈内ボーラス投与をおこなった。マウスを、49日間、毎日観察し、体重を、1週間に2回測定した。試験投与量レベルは、0mg/kg、50mg/kg、75mg/kg又は100mg/kgであった(それぞれ1kg当たりドキソルビシン0mg、28mg、42mg又は56mgに相当する)。いずれの投与量レベルでも、24時間以内で急性毒性はなかった。投与量と時間に依存する毒性の兆候が、試験中に観察された。部分的な尻の麻痺及び顕著な体重損失(>初期重量の20%)を含む毒性が、75mg/kg投与量群及び100mg/kg投与量群において観察された。35日までに、75mg/kg投与量群の40%に死亡が観察された。49日目の生存動物及び毒性の兆候がないことに基づいて、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−DoxについてのSD−MTDを求めたところ、50mg/kg(ドキソルビシン28mg/kgに等しい)であった。この投与量は、極めてよく許容され、悪影響は観察されなかった。したがって、SD−MTDは、ドキソルビシン単独(16mg/kg)についてのSD−MTDよりも、モル基準で、約1.8倍高かった(表16参照)。これは、試験範囲にわたる14mg/kgドキソルビシン当量増分での投与量範囲に基づく、近似SD−MTD測定である。
【0225】
【表16】
【0226】
実施例22:
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、腫瘍を有するマウスに効果的である。
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤は、ドキソルビシン耐性結腸直腸癌LS174tを用いたマウス異種移植片モデルにおける、マウスの寿命を延ばし、ヒト腫瘍の増殖を阻害するのに有効であることが分かった。例えば、ヌードマウス10匹からなる群に、約50mgまで増殖させたLS174t塊を皮下移植し、0mg/kg、53mg/kg又は68mg/kgのSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox(1kg当たりドキソルビシン0mg、30mg及び38mgに相当)を、5日間隔で、合計5回の同一の投与量(Q5DX5)で静脈内投与した。腫瘍と体重を、60日間、1週間に2回測定した。図21から明らかなように、両方の投与量とも、媒質対照動物と比較して、腫瘍の増殖を減少するのに有効であった。長期生存マウスが、媒質対照群では0匹であったのに対して、低投与量群及び高投与量群では、それぞれ4匹及び2匹であった。腫瘍が、60日前に1.5gに達した動物の平均生存日数(MDS)は、媒質対照群(18.2日)よりも、低投与量群(29.7日)及び高投与量群(23.4日)が、顕著によかった。このように、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、この投与処方下でのドキソルビシン単独での許容投与量(耐性投与量)(3mg/kg)ではこれまで効果がない、この積極的ヒト腫瘍モデルにおいて有効であった。
【0227】
実施例23:
ヌードマウスにおけるLNCaP腫瘍に対するSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの効力
Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox治療剤は、前立腺癌LNCaPを用いたマウス異種移植片モデルにおける、ヒト腫瘍の増殖を阻害するのに有効であることが分かった。ヌードマウス6匹又は7匹からなる群に、4000000個のLNCaP細胞を皮下注射し、生理食塩水、ドキソルビシン5mg/kg又はSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox59mg/kg(1kg当たりドキソルビシン33mgに相当)を、7日間隔で、合計5回の同一の投与量(Q7DX5)で静脈内投与した。マウスの重量と腫瘍の測定(キャリパにより)を、投与開始前(0日目)に1週間に少なくとも一度おこない、それから試験中は1週間に2度おこなった。投与開始直前(試験日:−2日目〜0日目)に、マウスを、ランダムに、腫瘍重量を基準として種々の群に分けた。平均腫瘍重量は、0日目で約250mgであった。腫瘍の重量が、カットオフ重量である1.5g(癌エンドポイント)に到達したときか、又はマウスの重量損失が25%超(毒性エンドポイント)となったときに、マウスを安楽死させた。60日目で、試験を終了した。ドキソルビシンを投与した1匹のマウスは、腫瘍が潰瘍化したので、評価から除いた。
【0228】
ヌードマウスにおいて、媒質対照群腫瘍は、比較的ゆっくりと増殖し(図22)、腫瘍は、不均一な増殖特性を示した。29日目〜60日目の腫瘍重量エンドポイント範囲(データは図示せず)で試験を終了した。対照マウスでは、体重の損失が徐々に生じ、試験中に平均重量が15%減少した(図23)。このような悪液質重量損失は、LNCaP異種移植片によるものと思われる。これについては、他にも報告されている(DeFeo−Jones等、「A peptide−doxorubicin ‘prodrug’ activated by prostate−specific antigen selectively kills prostate tumor cells positive for prostate−specific antigen in vivo(前立腺特異的抗原により活性化したペプチド−ドキソルビシン「プロドラッグ」は、生体内における前立腺特異的抗原について陽性の前立腺腫瘍細胞を選択的に殺生する)」、Nature Medicine 6(11):1248−1252(2000))。同じ発送品からの非腫瘍マウスは、重量を維持し、前哨マウスは、コロニー健康調査では正常であった。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox及びドキソルビシンを投与したマウスは、平均重量損失が20%超であった(図23)。腫瘍による腫瘍を有するマウスにおけるベースライン重量損失と試験化合物による重量損失の複合効果により、許容重量損失を超える重量損失が、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxとドキソルビシンの両方において生じ、試験した比較的高投与量処方で許容のできないほどの毒性であり、それぞれマウス7匹中7匹及び5匹中4匹について、これらの処置群における過剰の重量損失のため、試験を終了した(表17)。
【0229】
【表17】
【0230】
Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、LNCaP腫瘍の増殖を、完全に阻害した(図22、表17)。この試験では、腫瘍の増殖特性がゆっくりであり、対照群における動物が、指定の試験の最終日(60日目)まで生存し続けたため、生存エンドポイントは測定しなかった。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox群において試験を終了した全てのマウスの平均腫瘍重量は、ドキソルビシンを単独で投与した群よりも顕著に小さかった(それぞれ232mg及び967mg;計算値、図示せず)。全体として、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、ドキソルビシンより、腫瘍増殖阻害の面で優れていた。
【0231】
実施例24:
SCIDマウスにおけるLNCaP腫瘍に対する効力
次に、LNCaP異種移植片の試験を、次のように変更して実施した:SCIDマウスを使用し、ドキソルビシンとSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの両方についてより低い投与量を試験して、良好な耐容の投与量反応を得るとともに、投与回数を2回に制限し、これを6日間間隔をあけて実施して、化合物のベースライン腫瘍関連重量損失に対する相加的影響を最小限に抑制した。したがって、10匹のCB17.SCIDマウスからなる群に、2500000個のLNCaP細胞を皮下注射し、生理食塩水、ドキソルビシン3若しくは4mg/kg又はSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox40、50若しくは62mg/kg(それぞれ1kg当たりドキソルビシン22、28及び35mgに相当)を、6日間隔で、合計2回の同一の投与量(Q6DX2)で静脈内投与した。マウスの重量と腫瘍の測定(キャリパにより)を、投与開始前(0日目)に1週間に少なくとも一度おこない、それから試験中は1週間に2度おこなった。投与開始直前(試験日:−2日目〜0日目)に、マウスを、ランダムに、腫瘍重量を基準として種々の群に分けた。平均腫瘍重量は、0日目で約200mgであった。腫瘍の重量が、カットオフ重量である1.5g(癌エンドポイント)に到達したときか、又はマウスの重量損失が25%超(毒性エンドポイント)となったときに、マウスを安楽死させた。60日目で、試験を終了した。
【0232】
LNCaP腫瘍を移植した媒質対照群マウスは、ここでも移植時から徐々に重量を減少し、22日までに、平均重量損失が約19%となった(図24)。約12日目で、試験における全てのマウスの体重損失が平坦となった。これは、観察される腫瘍関連悪液質を制御するためにおこなった、標準げっし動物の食事から高脂肪げっし動物の食事に食事を変更した場合と一致した。
【0233】
Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、3つの全ての投与レベルで、12日目で腫瘍の増殖を顕著に阻害し、測定の最後の日に、全てのマウスが生存していた。投与量の増加とともに効力が増加する傾向がみられた。但し、効力は、50mg/kgで最高であった。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox(40mg/kg)は、ドキソルビシン(3又は4mg/kg)(これらの両方とも、統計的有意性が得られなかった)よりも、腫瘍増殖阻害の程度がよかった(図25及び表18)。
【0234】
40mg/kgSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxを投与したマウスは、対照投与の開始からの平均重量損失%とほぼ同じであり、両方のドキソルビシン群よりも小さかった(図24)。
50mg/kgSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox及び62mg/kgSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxを投与したいくつかのマウスは、重量損失が22日目で20%超であり、許容できないレベルであった(図24及び表18)。
【0235】
【表18】
【0236】
全般的に、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、効果的であり、1週間に2回の処置後のLNCaP腫瘍増殖の阻害において、ドキソルビシンよりも優れていた。
【0237】
実施例25:
Suc−Leu−Ala−Gly−Dox及びSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−DoxのLNCaP異種移植片に対する効力
LNCaPヒト前立腺癌細胞は、表面上で高レベルのCD10を発現する。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox及びSuc−Leu−Ala−Gly−Doxを、単回投与レベルQ7Dx5で試験した。8匹の雄NCrヌードマウスからなる群に、4000000個のLNCaP細胞を皮下注射し、生理食塩水、ドキソルビシン5mg/kg、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox59mg/kg(1kg当たりドキソルビシン33mgに相当)又はSuc−Leu−Ala−Gly−Dox73mg/kg(1kg当たりドキソルビシン47mgに相当;又は1kg当たりSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox81mgに相当)を、7日間隔で、合計5回の同一の投与量(Q7DX5)で静脈内投与した(表19)。マウスの重量と腫瘍の測定(キャリパにより)を、投与開始前(0日目)に1週間に少なくとも一度おこない、それから試験中は1週間に2度おこなった。投与開始直前(試験日:−2日目〜0日目)に、マウスを、ランダムに、腫瘍重量を基準として種々の群に分けた。平均腫瘍重量は、0日目で約250mgであった。腫瘍の重量が、カットオフ重量である1.5g(癌エンドポイント)に到達したときか、又はマウスの重量損失が25%超(毒性エンドポイント)となったときに、マウスを安楽死させた。60日目で、試験を終了した。ドキソルビシンを投与した1匹のマウスは、腫瘍が潰瘍化したので、評価から除いた。
【0238】
【表19】
【0239】
Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、LNCaP腫瘍の増殖を完全に停止させ、全ての処理したマウスの腫瘍の緩解を誘起し、ドキソルビシンよりも効果的であった(表19)。興味深いことに、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxよりも37%高いモル濃度で投与した
Suc−Leu−Ala−Gly−Doxは、全く効果的でなかった。この試験では、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、他の腫瘍モデル(LS174T及びMX−1)におけるほぼそのRD−MTDで投与した。しかしながら、この投与量は、LNCaP腫瘍を有する媒質対照マウスでさえ、平均体重損失が約15%であり、LNCaP腫瘍を有するマウスに大き過ぎることが分かった。このような悪液質(通常慢性疾患と関連している一般的な身体的消耗及び栄養失調)重量損失は、LNCaP異種移植片によるものと思われる。これについては、他にも報告されている(DeFeo−Jones等、Nature Medicine 6(11):1248−1252(2000))。驚くべきことに、Suc−Leu−Ala−Gly−Doxを、HT−29モデル(実施例26)において試験した効力のある投与量よりも10%多く投与したとき、LNCaPモデルでは有効ではなかったが、まだ耐容性があった。それにもかかわらず、Suc−Leu−Ala−Glyが効力を相対的に欠いていることと、比較的高投与量で毒性があることは、CD10が、腫瘍活性化プロドラッグの生体内切断に重要な役割を果たしているということと一致する。
【0240】
実施例26:
CD10neg細胞系であるHT−29に対するSuc−Leu−Ala−Gly−Doxの効力
マウスの異種移植片試験では、Suc−Leu−Ala−Gly−Doxがヒト結腸癌(HT−29)の増殖に対して効力があることと、長期生存の効果があることが明らかとなった。健康な若い雄ヌードマウスに、5000000個のHT−29細胞を皮下注射した。腫瘍の重量が約100mgに達したとき、8匹のマウスからなる群、10匹のマウスからなる群又は12匹のマウスからなる群に対して、7日ごとに5回、媒質、ドキソルビシン4mg/kg、Suc−Leu−Ala−Gly−Dox40若しくは67mg/kg投与することを、開始した。腫瘍のサイズと体重を、1週間に2回、60日間、測定した。
【0241】
マウスの生存日数が投与量を増加とともに増加することが、観察された。 Suc−Leu−Ala−Gly−Doxを40mg/kg及び67mg/kg(42mg/kg及び70mg/kgドキソルビシン当量濃度)で投与したとき、耐容性が極めてよく、腫瘍を有するマウスの生存率が大きく延びた。ドキソルビシンで処置したマウスのMDSは、30日であった。平均生存日数が、Suc−Leu−Ala−Gly−Doxで処置した群で、39日及び41日に増加し、これに対して、媒質対照群では26日であった(表20)。Suc−Leu−Ala−Gly−Doxを高投与量で投与した場合、媒質対照群に対して、腫瘍増殖速度が顕著に減少した(表20)。化合物の耐容性が極めてよかった。このことは、投薬量が、両方とも反復投与MTD未満であったことを示唆している。
【0242】
したがって、本発明者等は、HT−29モデルにおけるSuc−Leu−Ala−Gly−Doxについての用量反応及び大きな治療濃度域を確定した。HT−29細胞は、生体外でCD10を発現せず、他の酵素、例えば、チメットオリゴペプチダーゼは、HT−29異種移植片におけるSuc−Leu−Ala−Gly−Dox切断に関与していると思われる。
【0243】
【表20】
【0244】
実施例27:
チメットオリゴペプチダーゼ及びCD10による切断性と、効力との比較
腫瘍活性化プロドラッグ化合物の切断におけるCD10の生体内での役割をさらに評価するために、チメットオリゴペプチダーゼ及びCD10についての明確な切断プロファイルを有するドキソルビシン含有プロドラッグ化合物を、C.B−17.SCIDマウスにおいて増殖するLNCaP異種移植片で試験した。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−Ile−Ala−Leu−Dox及びSuc−Leu−Ala−Gly−Doxを、評価した。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox(3レベル)を除く全ての化合物は、2つのレベルで投与して、全ての化合物についての用量反応を得る試験をおこなった。試験化合物の各々についての切断プロファイルを、表21に示す。
【0245】
【表21】
【0246】
LNCaP腫瘍を有するヌードマウスが重量損失を生じることが分かったので、本発明者等は、各化合物について、以前の研究及びSD−MTDの結果に基づいて、良好な耐容等毒性投薬量であると推定される極めて控えめの投薬量レベルを選択した。反復投与についての高投与レベルは、通常それらのSD−MTDの80%であり、低投与量レベルは、高投与量レベルの80%である。したがって、10匹の雄CD17.SCIDマウスからなる群に、2500000個のLNCaP細胞を皮下注射し、化合物を表22で示すレベルで、6日間隔で、合計2回の同一投与量(Q6DX2)で静脈内投与した。
【0247】
【表22】
【0248】
LNCaP腫瘍は、SCIDマウスにおいて十分に増殖したが、LNCaP腫瘍異種移植片を有するSCIDマウスは、試験終了時点での対照マウスの80%の重量損失が25%超であり、重量損失が大きかった。それにもかかわらず、ほぼ等毒性レベルでの異なる処置の効力を、マウスの50%が毒性重量損失に到達するのに要する時間と、試験の終了時点で毒性重量損失を示したマウスの合計数に基づいて、比較した。この比較の結果を、表23に示す。
【0249】
【表23】
【0250】
これらの化合物を、最も効果的なものから最も効果のないものまでを順に示すと、以下の通りである:Suc−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox。Suc−Leu−Ala−Gly−Doxは、ドキソルビシンよりも効果的であり、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxよりも効果が小さい。CD10がSuc−Leu−Ala−Gly−Doxを切断することができないこと(実施例2参照)及び生体内での効力がないこと(実施例25参照)から予測されるように、Suc−Leu−Ala−Gly−DoxはLNCaP腫瘍に対してそれほど活性がなかった。
【0251】
実施例28:
薬物動態学的/代謝試験
ICR正常雌マウスの6つ群に、単回IVボーラス投与により、約100μモル/kgのSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Ala−Gly−Dox又は10μモル/kgのドキソルビシン(Dox)を投与した。血漿を、5分、1時間、2時間、4時間又は6時間の時点で、各群において3匹の個々の動物から得た。親濃度、ジペプチジル−ドキソルビシン(Ala−Leu−Dox、Ala−Gly−Dox)濃度、α−アミノアシル−ドキソルビシン(Leu−Dox又はGly−Dox)濃度及びドキソルビシン濃度を、蛍光検出(λex=480nm、λem=560)を利用した逆相勾配HPLC法を用いて、血漿試料の抽出物について分析した。標準を入手できなかったため、Ala−Gly−Doxのピーク保持時間は、確認しなかった。マウス血漿中における10〜2000ng/mLドキソルビシン溶液の測定に適合させた直線状標準曲線を用いて、量を求めた。
【0252】
濃度の経時的変化(図26)から明らかなように、CD10により切断されないSuc−Leu−Ala−Gly−Doxを除くすべての化合物について、代謝パターンが同様であった。特に、Suc−Leu−Ala−Gly−Doxを除いて、Leu−Doxは、最初の2時間にわたって主要な代謝産物であり、一方、ジペプチジル複合体Ala−Leu−Doxは、Leu−Doxとほぼ同時に形成したより少量の生成物であった。このことは、CD10についての切断パターンと一致している。ドキソルビシンが後で現れ、血漿濃度が、現在及び以前測定されたドキソルビシン薬物動態学(Van der Vijgh、「Comparative metabolism and pharmacokinetics of doxorubicin and 4‘−epidoxorubicin in plasma,heat and tumor of tumorbearing mice(血漿、心臓及び腫瘍を有するマウスにおけるドキソルビシン及び4’−エピドキソルビシンの比較代謝及び薬物動態学)」、Cancer Chemother Pharmacol 26(1) 9−12 (1990);及びTabrizi−Frad等、「Evaluation of the Pharmacokinetic Properties of a Doxorubicin Prodrug in Female ICR(CD1(登録商標)) Mice Following Intravenous Administration(静脈内投与後の雌ICR(CD1(登録商標))マウスにおけるドキソルビシンプロドラッグの薬物動態学的特性の評価)」、Proc.Amer.Assoc.Cancer Res.42:324(2001))から、及びドキソルビシン対照基により予想される他の代謝産物よりも、経時的にもっとゆっくりと減少した。血漿濃度時間曲線(表24)の下の領域は、CD10により切断されることが予想されない唯一のペプチジル複合体であり、4種のCD10切断可能なペプチジル−ドキソルビシン化合物よりもかなりDox暴露が少ない、Suc−Leu−Ala−Gly−Doxの投与を示している。CD10切断性化合物のうち、チメットオリゴペプチダーゼ(Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox及びSuc−Leu−Ala−Leu−Dox)によっても切断されることができるものは、P1位のロイシンをイソロイシンに置換した対応の非化合物(それぞれSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox及びSuc−Ile−Ala−Leu−Dox)よりも、ドキソルビシン暴露(AUC)が約2倍大きかった。これらのイソロイシン置換化合物は、TOPによる切断が小さいか、生じなかった。また、トリペプチドが、それらの対応のテトラペプチド物と比較して、Doxに対するAUC暴露が、2倍減少した(Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox対Suc−Leu−Ala−Leu−Dox及びSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox対Suc−Ile−Ala−Leu−Dox)。これらの化合物を投与した後の相対ドキソルビシン暴露は、マウスの安全性試験における最大耐量として表される相対的安全性ににている。このように、ドキソルビシンへの暴露についてよりよいプロファイルが得られる。
【0253】
【表24】
【0254】
これらの結果は、身体で通常生じているTOPが、CD10基質でもある特定の化合物についての非腫瘍活性機構であるという仮説と一致している。腫瘍関連CD10により活性化されるべき化合物について、データから、化合物がTOP基質でないときには、Dox暴露が約2倍少ないことから、オリゴペプチドを、TOPによる消化を制限するように設計するのが好ましいと思われる。このような化合物として、例えば、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox及びSuc−Ile−Ala−Leu−Doxが挙げられる。
【0255】
実施例29:
CD10をトランスフェクションしたチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞系の分析
CD10が、ペプチド前駆体薬剤を切断できること示す直接の確証を得るために、CD10トランスフェクション体細胞系を、分析した。
【0256】
CD10cDNAを、3組の重複プライマーを用いて、PCRにより、ヒト胎児cDNAライブラリーからクローニングした:
a5HindCD10 AAGCTTGCCGCCACCATGGGCAAGTCAGAAAGTCAGATG
a3XbaCD10 TCTAGAAGGGAGGCCAAGTCGAGGTTGGTC
b5XbaCD10 TCTAGAGATTACTATGAATGCACTGGAATC
b3XhoCD10 CTCGAGGTACTCATTATTCAGTTTGTTATC
c5XhoCD10 CTCGAGTTGAACTACAAAGAAGATGAATAC
c3PacCD10 TTAATTAATCACCAAACCCGGCACTTCTTTTC
【0257】
完全組み立てコード領域を、hCMV−MIEプロモータの下流の哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。DNA配列解析により、ヒトCD10(Genbank寄託番号Y00811)のコード配列との配列の同一性を確認した。発現プラスミドを、線状化し、CHO−S細胞に安定的にトランスフェクションした。CD10発現トランスフェクション体クローンを、500μg/mLのハイグロマイシン下で選択し、市販の抗CD10−FITC抗体を用いて、細胞表面CD10発現についてフローサイトメトリーによりスクリーニングした。図29は、トランスフェクション体CHO細胞クローンの幾何平均蛍光強度(Geo MFI)を示す。
【0258】
続いて、クローンを、ドキソルビシン(Dox)、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox又はSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの存在下で、3Hチミジン増殖アッセイで試験した。CHO細胞は、Doxについての平均IC50値が、LnCAP細胞とRamos細胞がそれぞれ130nM及び10nMであるのに対して、570nMであったので、ドキソルビシンに対する感度がより小さいと思われる(表25)。表26では、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの活性をDoxと比較している。LnCaP(CD10陽性)でのDoxとSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−DoxについてのIC50が、3倍異なるので、親CHO細胞で、49の差があった。この数であると、CD10をトランスフェクションしたCHO細胞では、ほぼ16倍となる。
【0259】
【表25】
【表26】
【0260】
CD10発現細胞がプロドラッグを切断できるかどうかを直接確認するために、化合物で処理したCD10トランスフェクション又は親CHO細胞からの上清を、集めた。親CHO及びCD10トランスフェクション体(クローン8)を、10μM Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox(CD10の基質)又はSuc−Leu−Ala−Gly−Dox(CD10の基質ではない)とともに、37℃でインキュベーションした。1時間、4時間及び24時間のインキュベーションの後、各上清のアリコットを、96ウエルプレートに移し、−20℃で凍結した。続いて、試料を、解凍し、3容のアセトニトリルで希釈し、遠心分離で沈殿物を除去し、さらに3容の水で希釈した後、蛍光検出を用いた逆相HPLC(4.6×50mm 2μ TSK Super−ODSカラム)により分析した。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxとともにインキュベーションしたとき、親細胞系で観察されるLeu−Doxへの検出可能な代謝がなく、一方、クローン8(CD10トランスフェクションした)は、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox(表27)から、顕著なレベルのLeu−Doxを生成した。CD10をトランスフェクションしたCHO細胞は、非トランスフェクションCHO細胞と比較して、Suc−Leu−Ala−Gly−Doxの切断速度を顕著には増加しなかった。このことは、このペプチド前駆体薬剤は、CD10の基質としてはよくないという示唆と一致している。
【0261】
【表27】
【0262】
CD10発現CHO細胞が、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxを切断できることを確認するために、以下の化合物の各々に暴露してから24時間後に、上清を集めた:Dox、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox及びSuc−Leu−Ala−Gly−Dox。これらの上清を、Dox感受性HL60細胞(CD10陰性)に移し、24時間後に、細胞増殖を測定した。3Hチミジン増殖データから、親CHO又はCD10陰性CHO細胞からの上清は、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの存在下で増殖を阻害しないのに対して、2つの代表的なCD10陽性CHO細胞は、増殖を阻害することが、明らかである(表28)。追加の対照として、新鮮なDox、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox及びSuc−Leu−Ala−Gly−Doxを、HL60に添加し、24時間後に、IC50測定をおこなった。化合物を、新たにHL60細胞(CD10陰性)に添加しても、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの切断が生じない。ここでも、切断にはCD10が必要であることを示している。データの確認から、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−DoxをSuc−Leu−Ala−Gly−Doxと比較したところ、得られた結果が、Suc−βAla−Leu−Ala−LeuがCD10がトランスフェクションされた細胞により切断され且つ親細胞系によっては切断されないことと一致することが、明らかである。
【0263】
【表28】
【0264】
ようするに、データから、CD10は、プロドラッグSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox又はSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxを切断してLeu−Doxを放出できることが、明らかである。
【0265】
実施例30:
ドキソルビシン感受性LNCaP前立腺癌モデルにおける、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox及びドキソルビシンによる腫瘍増殖阻害の比較
CD10陽性腫瘍細胞系(LNCaP)におけるSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox対ドキソルビシンの腫瘍阻害の相対的効力の比較を実施して、匹敵する用量反応及び治療指数を確定した。
【0266】
このモデルでは、リン酸緩衝生理食塩水0.1ml及びMatrigel(Becton Dickinson社)0.1mlに再懸濁した7500000個のLNCaP細胞を、高脂肪食で飼育した雄のヌードマウスの側部に注射投与した。平均腫瘍重量が約200mgに達したときに、投与を開始した。その投与処方を、表29に示す。
【0267】
効力
3つの全ての投与量レベル(モル当量:18、22、28mgドキソルビシン/kg)でSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、22日目で腫瘍の増殖を顕著に阻害し、測定の最終日時点で、全てのマウスが生存していた(図30及び表29)。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの効力においては、投与量に関連した増加傾向はみられず、最大効力は、18mg/kgDox当量で得られた(図30)。さらに、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの3つの全ての投与量では、腫瘍増殖阻害が顕著であり、4mg/kgで投与したドキソルビシンよりも大きかった。この投与量でのドキソルビシンでは、対照からの統計的有意性は得られなかった(表29)。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの3つの全ての投与群では、腫瘍は、所定の癌エンドポイント(>1g)に達しなかった(図31)。したがって、ドキソルビシンではなく、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxでは、対照群に対して、腫瘍を有するマウスの生存日数が、顕著に増加した(表29)。
【0268】
毒性
さらに、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、3つの全ての投与量で、極めて良好な耐容性があり、試験を36日目で終了したときには毒性エンドポイントに達するものがなく、群平均補正体重(腫瘍重量を引いた値)の最大損失は、3%であった(図32)。ドキソルビシン4mg/kgを投与したマウスは、22日目で一匹が毒性エンドポイント(重量損失>20%)となり、22日目での群平均補正体重損失は、約7%であった。また、対照群マウスでも、わずかに重量損失が生じ(群平均補正体重損失:最大5%)、腫瘍増殖によると思われる2匹が毒性エンドポイントに達した(表29)。
【0269】
【表29】
【0270】
ようするに、この増殖の遅いドキソルビシン感受性LNCaPモデルでは、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、3つの全ての投与量で、腫瘍の増殖を顕著に阻害し、マウスの生存日数を延長し、且つ耐容性が極めて良好であった(図30〜32)。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxは、増殖が遅い比較的ドキソルビシンに感受性のある前立腺腫瘍の増殖阻害の面で、ドキソルビシンのほぼ等毒性の投与量よりも、顕著によい。ドキソルビシンをその最大耐量(22日目で、8匹のうちの1匹のマウスに重量損失があり、毒性エンドポイントに達した)付近の投与量で投与したとき、腫瘍については効果的であったが、腫瘍増殖阻害又は生存日数の延長の面で、対照からの統計的有意性は得られなかった。その結果、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxが、3つの全てのレベルで、ドキソルビシンよりも良好に顕著にLNCaP腫瘍増殖を阻害し、且つLNCaPヒト前立腺腫瘍モデルにおけるSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxについての治療濃度域が、比較的広いことが確認された。さらに、そのドキソルビシンに対する感受性のため、この例に記載のモデルは、プロドラッグ分子の残部からのドキソルビシンの放出の良好な指標として役立つ。
【0271】
実施例31:
ドキソルビシン感受性LNCaP前立腺癌モデルにおけるSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox及びトリペプチドであるSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−DoxとSuc−Leu−Ala−Gly−Doxによる腫瘍増殖阻害の比較
腫瘍活性化プロドラッグ化合物の切断における細胞外CD10対TOP(チメットオリゴペプチダーゼ)の生体内の役割をさらに評価するために、CD10に対して明瞭な切断プロファイルを有するドキソルビシン含有プロドラッグ化合物を、ヌードマウス中で増殖させたCD10positiveLNCaP異種移植片で試験した。
【0272】
TOPとCD10の両方の基質であるSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、及びCD10の基質であるが、TOPについてはより弱い基質であるSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxを、等モル量、22mg/kgDox当量Q7Dx3で投与した。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxよりも比較的弱い基質であるけれども、TOPの基質であるSuc−Leu−Ala−Gly−Doxを、単独で、70mg/kgDox当量Q7Dx3で投与した(Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox及びSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxのモル濃度投与量よりも3倍多いレベル)。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox及びSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxは、腫瘍増殖を大きく阻害し(図33)、対照群に対して22日目で70%超のTGI(腫瘍増殖阻害率)が得られ(表30)、阻害率が統計的に有意に増加した。Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの3倍のモル濃度で投与したSuc−Leu−Ala−Gly−Doxは、腫瘍増殖阻害が、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox(TGI D22:39.7±29.5%対77.5±27.5%)よりも小さく、対照からの統計的有意性は得られなかった(表30)。さらに、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox群とSuc−Leu−Ala−Gly−Dox群の両方において、いずれの腫瘍も、所定の癌エンドポイント(>1g)には達しなかった(図34)。3つの全ての化合物は、耐容性が極めて良好で、36日で試験を終了した時点で毒性エンドポイントには達しなかった(図35)。
【0273】
【表30】
【0274】
Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox対Suc−Leu−Ala−Gly−Doxの投与効力反応の差異は、CD10が、CD10+LNCaP腫瘍における腫瘍活性化プロドラッグ化合物切断において生体内で極めて重要な役割を果すことを強く裏付けている。Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−DoxとSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxが、LNCaP異種移植片に対して同様な効力を有することは、CD10が、CD10+LNCaP腫瘍において、腫瘍活性化プロドラッグ化合物切断において、TOPよりも支配的な役割を果たすことを示唆している。
【0275】
残りの例についての分析方法
固相法又は液相法を用いて合成したペプチド配列を、HPLC(A法、B法及びD法)分析の結果、粗生成物の純度が80%超である場合には、さらに精製することなく使用した。粗生成物の純度が80%以下の場合には、生成物を、さらに分取HPLCのC法を用いて精製した。
【0276】
HPLCのA法
HPLC分析を、C−18カラム(4μm、3.9×150mm ID、流量1mL/分)を用いたWaters2690によりおこなった(溶媒A(0.1%TFA/H2O)及び溶媒B(0.1%TFA/ACN)の勾配で溶離)。得られたデータを、Waters Millenniumシステムを用いて、λ254nmで処理した。HPLC分析での勾配は、溶媒A90%から開始し、14分かけて最後に溶媒B100%とした(直線的に)。この方法及び以下の方法についての化合物の純度を、ピーク曲線下の相対面積%で評価した。
【0277】
HPLCのB法
HPLC分析を、C−8カラム(3.5μm、4.6×150mm ID、流量1mL/分)を用いたWaters2690によりおこなった(溶媒A(80% 20mMギ酸アンモニウム及び20%アセトニトリル)及び溶媒B(20% 20mMギ酸アンモニウム及び80%アセトニトリル)の勾配を用いて溶離)。得られたデータを、Waters Millenniumシステムを用いて、λ254nmで処理した。HPLC分析での勾配は、溶媒A100%から開始し、30分かけて溶媒B100%とした(直線的に)。
【0278】
HPLCのC法
粗生成物の分取精製を、C−4カラム(15μm、40×100mm ID、流量30mL/分)を用いたWaters Delta Prep4000システムにより実施した。溶離は、溶媒A(H2O)及び溶媒B(MeOH)の勾配によりおこなった。分取HPLCの勾配は、溶媒A80%から開始し、70分かけて溶媒B100%とした(直線的に)。UV検出は、λ254nmでおこなった。
【0279】
HPLCのD法
HPLC分析を、TSK superODSカラム(TosoHaas社)を用いたHewlett Packard装置によりおこなった:溶媒A(TFA0.1%水溶液);溶媒B(TFA0.1%アセトニトリル溶液);勾配:2分間でB30%→36%、10分間でB36%→41%、3分間でB41%→90%、B90%で5分間、検出波長λ254nm。
【0280】
NMR及びMS
さらなる構造測定をNMR法及びMS法でおこない、得られた結果は、請求の範囲に記載の化合物を裏付けるものであった。
【0281】
TLC法
TLC分析を、シリカゲル60F−254nm−0.25mmプレート(Merck社)を用い、DCM/MeOH/H2O/ギ酸88% 85/15/1/2の条件で溶離して、実施した。
【0282】
ニンヒドリン試験
数ミリグラムの生成物を試験管に入れ、2滴の溶液A(ニンヒドリンの50mg/mLエタノール溶液)、2滴の溶液B(フェノールの4mg/mLエタノール溶液)、そして2滴の溶液C(2mL 0.01M KSCN、ピリジン100mL、水性液)を添加した。得られた混合物を沸騰水浴に5分間入れた。遊離アミンの存在下では溶液は紫色になる。
【0283】
オリゴペプチドの具体的合成例
市販試薬のソース
ドキソルビシン及びダウノルビシンは明治製菓株式会社(日本)製、Pd(PPh3)4はStrem chem社(マサチューセッツ州Newburyport)製、PEGはShearwater社(アラバマ州Huntsville)製、溶媒、HATUはAldrich社(ウィスコンシン州Milwaukee)製、全ての樹脂及びアミノ酸はABI社(カリフォルニア州Foster City)製、Novabiochem社(カリフォルニア州San Diego)製、Advanced Chem Tech社(ケンタッキー州Louisville)製、Peptide International社(ケンタッキー州Louisville)製又はSynPep社(カリフォルニア州Dublin)製であった。
【0284】
実施例32:
Fmoc−Ile−Ala−Leu−OHの合成
トリペプチド(Fmoc−Ile−Ala−Leu−OH)を、標準的Fmoc化学的性質を用いた固相法により合成した。合成は、典型的にはWangアルコキシ樹脂(添加量0.60ミリモル/g)を使用した。Fmoc保護アミノ酸を、固相ペプチド合成に使用した。
【0285】
樹脂に1mMペプチドとなるように、3当量のアミノ酸を、活性剤としてのHBTUで5分間予備活性化した後、2当量のDIEAとともに、樹脂に添加した。カップリング反応を2時間実施した後、DMF(25mL×3)及びDCM(25mL×3)で洗浄した。このカップリング反応を、同様の条件下で、2当量のアミノ酸を用いて反復した。反応の進行を、ニンヒドリン試験で観察し、ニンヒドリン試験での確認で、2時間後で反応が不完全である場合には、3回目のカップリング工程を、反復した。脱保護は、ピペリジンをDMFに20%添加して調製した溶液を用いて、15〜20分間おこなった。カップリング工程を、次のアミノ酸を用いて、所望のペプチドが樹脂上にアセンブリされるまで反復した。ペプチドの樹脂からの最終的な切断は、樹脂を95%TFAと5%水からなる溶液で処理することによりおこなった。反応混合物を、室温(rt)で2時間攪拌した後、樹脂を、減圧濾過し、TFAで2回洗浄した。濾液を混合し、冷エーテル400mLを添加することにより、ペプチドを沈殿させた。ペプチドを、減圧濾過し、乾燥してFmoc−Ile−Ala−Leu−OH(A法で求めたHPLC純度:92%)を得た。粗ペプチドを、LC/MSにより特徴付けし、さらなる精製をおこなうことなく、次の工程に使用した。
【0286】
実施例33:
Fmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−OHの合成
テトラペプチド(Fmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−OH)を、標準的Fmoc化学的性質を用いた固相法により合成した。合成は、典型的にはWangアルコキシ樹脂(添加量0.60ミリモル/g)を使用した。Fmoc保護アミノ酸を、固相ペプチド合成に使用した。樹脂に1mMペプチドとなるように、3当量のアミノ酸を、活性化剤としてのHBTUで5分間予備活性化した後、2当量のDIEAとともに、樹脂に添加した。カップリング反応を2時間実施した後、DMF(25mL×3)及びDCM(25mL×3)で洗浄した。このカップリング反応を、同様の条件下で、2当量のアミノ酸を用いて反復した。反応の進行を、ニンヒドリン試験で観察し、ニンヒドリン試験での確認で、2時間後で反応が不完全である場合には、3回目のカップリング工程を、反復した。脱保護は、ピペリジンをDMFに20%添加して調製した溶液を用いて、15〜20分間おこなった。カップリング工程を、次のアミノ酸を用いて、所望のペプチドが樹脂上にアセンブリされるまで反復した。ペプチドの樹脂からの最終的な切断は、樹脂を95%TFAと5%水からなる溶液で処理することによりおこなった。反応混合物を、室温(rt)で2時間攪拌した後、樹脂を、減圧濾過し、TFAで2回洗浄した。濾液を混合し、冷エーテル400mLを添加することにより、ペプチドを沈殿させた。ペプチドを、減圧濾過し、乾燥してFmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−OH(A法で求めたHPLC純度:92%)を得た。粗ペプチドを、MSにより特徴付けし、さらなる精製をおこなうことなく、次の工程に使用した。
【0287】
実施例34:
Fmoc−Ile−Ala−Leu−Doxの合成
ドキソルビシン・HCl(2.34g、4.03ミリモル)及びFmoc−Ile−Ala−Leu−OH(2.4g、4.48ミリモル)を、室温で無水DMF(150mL)に溶解した。得られた溶液を、高速攪拌し、これにDIEA(1.56mL、8.96ミリモル)を一度に加え、反応混合物を室温で15分間攪拌した。反応混合物を、氷浴を用いて0℃に冷却し、HATU1.87g(4.92ミリモル)を、10分かけてゆっくりと添加した。この反応混合物を、室温でさらに60分間攪拌した。氷冷水(200mL)を、反応混合物に添加したところ、赤色沈澱が生じた。沈殿物を、粗フリット上に集め、水3×50mL及びジエチルエーテル3×50で洗浄し、減圧乾燥してFmoc−Ile−Ala−Leu−Dox(収率89%、A法で求めたHPLC純度:94%)を得た。この生成物を、MSにより特徴付けし、さらなる精製をおこなうことなく、次の工程に使用した。
【0288】
実施例35:
Fmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−Doxの合成
ドキソルビシン・HCl(1.43g、2.5ミリモル)及びFmoc−βAla−Ile−Ala−Leu−OH(1.6g、2.6ミリモル)を、室温で無水DMF(150mL)に溶解した。得られた溶液を、高速攪拌し、これにDIEA(1mL、5.7ミリモル)を一度に加え、反応混合物を室温で15分間攪拌した。反応混合物を、氷浴を用いて0℃に冷却し、HATU1.07g(2.8ミリモル)を、10分かけてゆっくりと添加した。この反応混合物を、室温でさらに60分間攪拌した。氷冷水(200mL)を、反応混合物に添加したところ、赤色沈澱が生じた。沈殿物を、粗フリット上に集め、水3×50mL及びジエチルエーテル3×50で洗浄し、減圧乾燥してFmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−Dox(収率88%、A法で求めたHPLC純度:92%)を得た。この生成物を、MSにより特徴付けし、さらなる精製をおこなうことなく、次の工程に使用した。
【0289】
実施例36:
Fmoc−Ile−Ala−Leu−DoxからのSuc−Ile−Ala−Leu−Doxの合成
乾燥DMF20mLにFmoc−Ile−Ala−Leu−Dox(4.4g、4.13ミリモル)を添加して調製した溶液に、ピペリジン(20.4mL、206ミリモル)を一度に添加したところ、色が赤色から紫色に変化した。反応混合物を、室温で5分間攪拌した後、乾燥氷/アセトン浴を用いて−20℃に冷却した。次に、無水コハク酸21.2g(210ミリモル)を、冷却した反応混合物に一度に添加した。反応液を、−5℃で5分間高速攪拌した後、室温でさらに90分間攪拌した。無水ジエチルエーテル750mLを、反応混合物に添加したところ、赤色沈殿が生じた。この沈殿を、中ガラスフリット上に単離し、ジエチルエーテル2×50mLで洗浄し、減圧乾燥してSuc−Ile−Ala−Leu−Doxを得た(収率80%、B法によるHPLC純度88%)。最終生成物を、分取HPLCのC法を用いて精製し、LC/MSにより特徴付けした。その結果、分子量が、939(予想分子量940)であった。
【0290】
実施例37:
Fmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−DoxからのSuc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−Doxの合成
Fmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−Dox(4g、3.53ミリモル)を、乾燥DMF40mL添加して調製した溶液に、ピペリジン(17.4mL、176ミリモル)を一度に添加したところ、色が赤色から紫色に変化した。反応混合物を、室温で5分間攪拌した後、乾燥氷/アセトン浴を用いて−20℃に冷却した。次に、無水コハク酸18g(180ミリモル)を、冷却した反応混合物に一度に添加した。反応液を、−5℃で5分間高速攪拌した後、室温でさらに90分間攪拌した。無水ジエチルエーテル750mLを、反応混合物に添加したところ、赤色沈殿が生じた。この沈殿を、中ガラスフリット上に単離し、ジエチルエーテル2×50mLで洗浄し、減圧乾燥してSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxを得た(収率78%、B法によるHPLC純度86%)。最終生成物を、分取HPLCのC法を用いて精製し、LC/MSにより特徴付けした。その結果、分子量が、1011(予想分子量1012)であった。
【0291】
実施例38:
Fmoc−βAla−Ile−Ala−Leu−OBnの合成
Fmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu(24.34g、0.04モル)を、DMF(350mL)とマグネチックスターラを入れた丸底フラスコに添加する。テトラペプチドを溶解後、溶液に、攪拌しながら臭化ベンジル(4.76mL、0.04ミリモル)を添加し、その後炭酸セシウム(13.04g、0.04モル)を添加する。得られた反応混合物を室温で1.5時間攪拌する。次に、反応混合物を、氷水450mLを入れたフラスコにゆっくりと注ぐ。その結果、多量の白色固体が沈殿し、それを吸引濾過により集める。この生成物を、水(2×200mL)で洗浄し、減圧デシケーターに入れる。
【0292】
実施例39:
β−Ala−Ile−Ala−Leu−OBnの合成
丸底フラスコ(25mL)において、Fmoc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−OBn(0.7g、1.0ミリモル)を、無水DMFを5mLに溶解する。ピペリジン(1.2mL、12.1ミリモル)を溶液に添加し、得られた混合物を室温で25分間攪拌する。反応を、水(6mL)で停止し、酢酸エチル(2×10mL)で抽出する。混合した有機層を、さらに水(2×5mL)、食塩水(5mL)で洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥する。溶媒を除去すると、白色固体(0.8g)が得られる。
【0293】
実施例40:
MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−OBnの合成
丸底フラスコ(250mL)で、メチルヘミスクシネート(3.19g、24.2ミリモル)を、無水DMF(50mL)に溶解する。DIEA(4.22mL、24.2ミリモル)、続いてHBTU(9.17g、24.2ミリモル)を、溶液に添加する。得られた混合物を、室温で45分間攪拌する。この混合物に、無水DMF(150mL)にβAla−Ile−Ala−Leu−OBn(粗生成物、10.14g含有、21.3ミリモル)を添加して調製した溶液を、添加する。混合物を、室温で2.5時間連続して攪拌する。次に、反応混合物を、氷水200mLを入れたフラスコに、攪拌しながらゆっくりと注ぐ。その結果、多量の白色固体が沈殿し、それを酢酸エチル(3×200mL)で抽出する。有機層を混合し、混合した有機層を、水(2×200mL)、食塩水(200mL)でさらに洗浄し、硫酸ナトリウムにより乾燥する。
【0294】
実施例41:
MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leuの合成
MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−OBn(1.0g、1.46ミリモル)を、メタノール100mLを入れたエルレンマイヤーフラスコに添加する。50mLのメタノールを加える。この溶液を水素添加反応容器に移す。この容器に、Pd−C(90mg、10%湿潤、50%水;0.042ミリモル)を添加する。室温で2時間水素添加した後、反応を停止、触媒を濾過する。
【0295】
実施例42:
「尿素法」を用いた、MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu及びドキソルビシンのカップリング
乾燥窒素雰囲気下、MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu26.04g(52.0ミリモル)及びドキソルビシン塩酸塩23.26g(40.2ミリモル)とを、乾燥尿素飽和(ほぼ30%w/v)DMF800mL及びDIEA19.948mLに懸濁/溶解する。この混合物を、ほぼ25分間かけて0〜3℃に冷却する。この時点で、HATU21.2g(56.0ミリモル)を、10分間かけて、ほぼ100mLの尿素飽和DMFに添加した溶液として添加する(この溶液の容積は、最小限に保たなければならない)。反応混合物を、−2〜2℃で10分間攪拌し、2%(v/v)酢酸を含有する氷冷食塩水4000mLに、激しく攪拌しながら、約5分間かけて注ぐ。生成物を、中多孔度フリットガラスフィルター上に濾取し、水で十分に洗浄し、減圧乾燥する。
【0296】
実施例43:
MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤の合成
丸底フラスコ(50mL)で、MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu(0.25g、0.5ミリモル)及びドキソルビシン(0.29g、0.5ミリモル)を、無水DMF(20mL)に溶解する。得られた混合物を、5分間攪拌後、DIEA(0.17mL、1.0ミリモル)、続いてHBTU(0.19g、0.5ミリモル)を、溶液に添加する。得られた混合物を、室温で4時間攪拌する。DMFを、ロータリーエバポレーターにより除去し、残留物を、1:1塩化メチレン:メタノール4.0mLに溶解する。この溶液に、エーテル40mLを、攪拌しながら、ゆっくりと添加する。沈殿物が形成し、これを吸引濾過により集める。得られた固体を、エーテル(2×10mL)で洗浄し、真空デシケータに入れて乾燥する。
【0297】
実施例44:
MeOSuc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−Doxからの遊離ドキソルビシンの除去
MeOSuc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−Dox(200mg、0.194ミリモル)、DIEA(0.068mL、0.388ミリモル)及び無水DMF(10mL)を、磁気攪拌棒を備えた50mLフラスコに入れる。MeOSuc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−Doxが完全に溶解したら、イソシアネート樹脂(390mg(0.582)をジクロロメタン5mLに5分間予備膨潤したもの)を、添加し、得られた溶液を、定期的にHPLCで観察しながら、室温で2時間攪拌する。次に、Doxが完全に除去されたことをHPLCにより確認したら、反応混合物をフリットにより濾過して樹脂を除去する。この樹脂を、DMF10mlで洗浄し、DMF洗浄液を、濾過した反応混合物と混ぜる。次に、濾過反応混合物洗浄液を、高真空ポンプと30℃の水浴とを備えたロータリーエバポレーターにより濃縮する。残留物を、DMF5mLに懸濁し、次に、溶液を、高速攪拌した無水ジエチルエーテル溶液にゆっくりと添加する。次に、生成物を、フリット上に濾取し、ジエチルエーテルで洗浄し、減圧乾燥してMeOSuc−β−Ala−Ile−Ala−Leu−Doxを得る。
【0298】
実施例45:
架橋酵素を用いた、MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤の加水分解
MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤(1.0g、0.975ミリモル)及びDMF100mLを、500mLフラスコに入れる。得られた懸濁液を、マグネチックスターラーで激しく攪拌する。MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤が完全に溶解したら、脱イオン水400mLを添加し、得られた溶液を、35℃で攪拌する。洗浄したCLEC−PC(Altus Biologics社)固定化酵素の1gのスラリーを3アリコットの脱イオン水中ですすいだ後、20%DMF水溶液10mLに再懸濁してから、使用する。得られた懸濁液を、定期的にHPLCで観察しながら35℃で攪拌する。MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤の全てが消費されたら、反応混合物を、0.45μMナイロンメンブレンフィルターで濾過してCLEC−PC酵素を除去する。CLEC−PCケーキを、メタノール3×10mLで洗浄し、メタノール洗浄液を濾過した反応混合物と混ぜる。次に、濾過した反応混合物+メタノール洗浄液を、高真空ポンプと30℃水浴を備えたロータリーエバポレーターにより濃縮して赤色ガム状物を得る。次に、この赤色ガム状物を、室温で、脱イオン水50mLに懸濁し、メカニカルスターラーで高速攪拌する。この懸濁液に、脱イオン水100mLに重炭酸ナトリウム77.8mg(0.926ミリモル、0.95当量)に添加して調製した溶液を、2分間かけて添加する。得られた懸濁液を、室温で20分間攪拌する。反応混合物を、0.45μMナイロンメンブレンフィルターにより濾取し、凍結乾燥する。
【0299】
実施例46:
可溶性酵素を用いた、MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤の加水分解
MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤11.0g(10.72ミリモル)を、HPLCグレード水800mLに懸濁し、Ultraturrax T8ホモジナイザーにより、60分間均一化して微細懸濁液を得る。この懸濁液を、35℃で攪拌(500rpm)し、76mM NaHCO3水溶液を添加してpH6.05に調整する。次に、1.0g C.Antarctica「B」リパーゼ(Altus Biologics社)を添加し、反応混合物を、35℃で48時間攪拌する。この48時間の反応時間の間、76mM NaHCO3を定期的に添加することにより、pHを5.3〜6.2に維持し、反応を定期的にHPLCで観察する。反応がほぼ完了したら、次に反応混合物に、76mM NaHCO3水溶液を添加してpH7に調整し、Celite521パッドにより濾過する。次に、清澄反応混合物に、氷酢酸5mLを添加して酸性化(pH約3)する。生じた沈殿物を、Celite521で濾過して単離した後、Celiteパッドをメタノールですすぐ。メタノール溶液を、10〜20μMフリットガラスフィルターで濾過し、ロータリーエバポレーターにて乾燥する。得られた生成物を、76mM NaHCO3(0.95当量)70mLに溶解することにより、ナトリウム塩に転換し、凍結乾燥する。この生成物は、実施例45の生成物と同一である。
【0300】
実施例47:
固定化Candida Antarctica「B」リパーゼによる、MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤の加水分解
Candida Antarctica「B」リパーゼ(Altus Biologics社)30.0gを、水300mLに溶解し、50mM NaHCO3水溶液(pH=6.4)3×4リットルに対して透析する。ファーマシア(Pharmacia)NHS−活性化セファロース4ファーストフロー(Sepharose 4 Fast Flow)360mLを、粗ガラスフリット漏斗に入れ、それを氷冷1mM HCl水溶液5×450mLですすぐ。次に、すすいだNHS−活性化セファロースを、透析した酵素溶液と混ぜる。得られた懸濁液を、周囲温度(約22℃)で2.0時間攪拌する。次に、セファロース/酵素複合体を、粗フリットガラスフィルター上に単離した後、100mM TRIS水溶液(pH=7.45)1000mLに添加して、15分間攪拌する。この懸濁液を、濾過し、別の100mM水性TRIS緩衝液(pH=7.45)1000mLとともに、4℃で一晩インキュベーションする。朝に、固定化酵素を、濾取し、水洗後、2000mLの3つ口丸底フラスコに入れる。MeOSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox治療剤43gを添加し、固体を、脱イオン水800mLに懸濁する。フラスコに、オーバーヘッドスターラーを取り付け、シリンジポンプを制御することにより、反応混合物のpHが5.9〜6.2に保たれるようにpHシュタット設定する。シリンジポンプに、0.1M NaHCO3をチャージする。反応の進行を、HPLCにて追跡する。反応がほぼ完了したら、固定化酵素を濾去し、液相を凍結乾燥する。次に、乾燥固体を、乾燥THF約11mLに懸濁し、濾過する。
【0301】
実施例48:
メチルスクシニル−N−Cap型βAla−Leu−Ala−Leu−Dox治療剤の大規模合成
ドキソルビシン・HCl69.6g(120ミリモル)とMeOSuc−bAla−Leu−Ala−Leu100g(199ミリモル)とを、窒素下、無水DMF(10L)に溶解した。DIEA76mL(434ミリモル)を、反応混合物に添加し、この反応混合物を、窒素下、室温で10分間攪拌した。次に、反応混合物を、10分間かけて、0℃に冷却した。別個のフラスコに、HATU864g(220ミリモル)をDMF(500mL)に添加して、溶液を調製した。このHATU溶液を、反応混合物に、反応混合物を0℃に維持しながら、20分間かけてゆっくりと添加した。反応混合物を、0℃で30分間攪拌した。
【0302】
水(25L)にNaCl(7.5kg、少なくとも30%w/v)を添加して、溶液を調製し、その溶液を、0℃に冷却した。次に、この反応混合物を、激しく攪拌しながら、冷却した食塩溶液に、120分間かけてゆっくりと添加した。溶液の色は、赤色のままであった。溶液の色が青色の場合、酢酸を直ちに添加することにより、pHを5.8〜6.0に調整する必要がある。温度を、約5℃に維持した。赤色沈殿物を、中多孔度フリットガラスフィルター上に濾取し、水洗し、減圧下P2O5により乾燥してMeOSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox115gを得た。
【0303】
実施例49:
微量のドキソルビシンを除去するための、Ps−イソシアネートビーズを用いたMeOSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの処理
PS−イソシアネートビーズ146.4g(240ミリモル、カリフォルニア州San CarlosにあるArgonaut Lab社製)を、無水DMF1.5Lに溶解し、得られた溶液を、室温で5〜10分間膨潤させた。膨潤ビーズを、ガラスフリット漏斗により濾過し、追加の無水DMF500mLで洗浄した。MeOSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox115g(112ミリモル)を、無水DMF1000mLに溶解し、DIEA2.1mL(12ミリモル)を添加後、膨潤PS−イソシアネートビーズを添加した。反応混合物を、室温で攪拌し、ドキソルビシンピークの量が0.1%未満となるまで、HPLCを用いて観察した。これには、バッチのサイズによって、2〜12時間かかる。HPLC分析は、Water2690カラム:Waters Symmetry Shield C83.5μM 4.6×150mm(カタログ番号WAT094269)、溶媒A:20mMギ酸アンモニウム水溶液(pH=4.5)80%、アセトニトリル20%、溶媒B:20mMギ酸アンモニウム水溶液(pH=4.5)20%、アセトニトリル80%によりおこなった。カラム温度:制御室温、試料温度:4℃、試験時間:37.5分、検出:254nm、流量:1.0mL/分、注入量:10μg(0.5mg/mL×0.02mL)、移動相A及びB。勾配:7.5分間平衡遅延による、移動相A100%から移動相B100%までの、37.5分間直線状勾配。
【0304】
6時間の時点で、ドキソルビシンピークの量は、0.1%未満であった。反応混合物を、粗焼結ガラス漏斗により濾過して、ビーズを除去した。水3.5LにNaCl 1.1kgを添加して食塩水(少なくとも30%(w/v))を調製し、0℃に冷却した。次に、濾過した反応混合物を、45分間かけて、冷却した食塩溶液に、激しく攪拌しながらゆっくりと添加した。溶液の色は、赤色のままであった。溶液の色が青色の場合、酢酸を直ちに添加することにより、pHを5.8〜6.0に調整する必要がある。赤色沈殿物を、中焼結ガラス漏斗により濾取し、水洗し、減圧下P2O5により乾燥して、残留ドキソルビシンのないMeOSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxを得た。
【0305】
MeOSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−DoxをMeOH 1Lに溶解し、次に、得られたメタノール溶液を、激しく攪拌しながら、冷却したエチルエーテル14Lに、60分間かけてゆっくりと添加した。赤色沈殿物を、中焼結ガラス漏斗により濾過し、エーテル(1L)で洗浄し、真空乾燥してMeOSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox110gを得た。純度を、実施例37と同様にHPLCにより測定したところ、96.5%であった。MS m/z:(C50H67N5O18)理論値1025、実測値1048(M++Na)。
【0306】
実施例50:
Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxを得るための、MeOSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの酵素加水分解
CLEC−CAB(Candida Antarctica「B」リパーゼ)酵素を、溶液の形態で購入した(マサチューセッツ州ボストンにあるAltus Biologics社製)。ここで、酵素濃度は、溶液1ミリリットル当たりの乾燥酵素の重量として定義される。粗酵素懸濁液を、数分間震盪して均一溶液を得た。この均一溶液の504mL(328ミリモル)アリコットを、フラスコに入れた。脱イオン水2.5Lを添加し、得られたスラリーを、マグネチックスターラーを用いて、10分間攪拌した。酵素溶液を、酵素を乾燥させずに、粗ガラスフリット漏斗を用いて濾過した。この酵素を、フラスコに戻した。酵素を、水に懸濁し、3回以上濾過した。
【0307】
酵素ケーキを、脱イオン水550mLに再懸濁し、RBフラスコに移した。この懸濁液に、MeOSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox109g(106ミリモル)を添加し、反応混合物を、室温(25℃)で攪拌した。1N NaHCO3溶液をチャージしたシリンジポンプを備えたpHシュタットにより、反応混合物のpHを、5.8〜6.1に維持した。反応の進行を、実施例49に記載したようにして、定期的にHPLCモニタリングで追跡した。24時間後、HPLCで測定したところ、反応が94%完了したように思われる。
【0308】
反応を加速するために、24時間後には、追加のCLEC酵素が必要であった。CLEC酵素(均一溶液)168mLを、上記したような構成のカラムで洗浄した。酵素ケーキを、脱イオン水1.1Lに再懸濁し、反応混合物に添加した。反応混合物を、定期的にHPLCで観察しながら、室温で攪拌し、pHを、5.8〜6.1に維持した。60時間後、HPLCで確認したところ、反応が99.9%完了した。
【0309】
0.2μMフィルターによる濾過により、CLEC酵素を、反応混合物から除去し、脱イオン水500mLですすいだ。次に、濾液を、凍結乾燥してSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox・Naを得た(95.2g、物理収率87%、MS m/z:(C49H65N5O18)理論値1011、実測値1034(M++Na))。
【0310】
プロドラッグ化合物であるSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxを、質量スペクトル分析FTIR、NMRによって十分に特徴付けした。
【0311】
Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの質量スペクトル分析から、1033でのSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox(C49H65N5O18Na)の理論値m/zと一致する1034(M++Na)に分子イオンピーク(m/z)があることが明らかである。
【0312】
また、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの試料も、FTIRにより分析した。得られたスペクトルは、上記した材料の基準のスペクトルと一致した。主要吸収の帰属を、以下に示す:
ヒドロキシル 3379cm-1
C−H 3000〜2700
カルボニル 1650〜1725
【0313】
最後に、試料を、NMR分析した。化学シフトと帰属を、表31と図28に示す。ケトン領域には、215.2ppm、187.7ppm、187.4ppmに3個の炭素があり、この構造は、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxと一致する。後者の2つは、同様の化学シフトを有し、したがって、187.7ppm及び187.4ppmで(2)及び(3)に帰属する。したがって、残りのケトンは、(1)である。これらの帰属のさらなる確証が、HMQC及びHMBCスペクトルから得られ、これらの3つのいずれも、HMQCピークを示さず、したがって、非プロトン化状態であり、(1)のみが、4.77ppmでプロトンに対して長範囲C−Hカップリング(HMBC)を有し、これは、2プロトンシングレットであり、したがって、(4)である。HMQCスペクトルから明らかなように、65.7ppmの炭素は、これらのプロトンに結合している。
【0314】
3.96ppmでの1H NMRシグナルは、化学シフトを示し、メトキシ基の領域を有する。これらのプロトンは、57.2ppmの炭素にカップリングしており、構造(5)におけるメトキシのみに帰属している。13C化学シフトも、メトキシと一致する。プロトンの長範囲C−Hカップリングは、162.3ppmの炭素に対してであり、(6)と思われる。
【0315】
HMQCスペクトルから、120.5ppm、120.3ppm及び137.2ppmに3つのプロトン化芳香族炭素があることが明らかであり、芳香族プロトンは、長範囲C−Hカップリングも、隣接プロトン間のカップリングも示さなかった。芳香族プロトンシグナルは、極めてブロードであり、T2緩和時間が短いことが分かる。このことは、カップリングがないことを示している。カップリングがないとすると、これらの3つの部位を一義的に帰属させることはできず、まとめて(7)、(8)及び(9)に帰属する。
【0316】
157.2ppmと156.1ppmでの2つの非プロトン化芳香族炭素は、(10)と(11)、すなわち、酸素に結合する芳香族炭素と一致する化学シフトを有する。長範囲カップリングは、観察されない。
【0317】
112.3ppm及び112.0ppmでの13CNMRシグナルは、酸素置換に対してオルト位の芳香族炭素と一致し、(12)及び(13)に帰属する。また、121.3での13C NMRシグナルからも、この効果が明らかであり、(14)に帰属する。残りの3つの非プロトン化芳香族炭素は、この領域における最後の3つの炭素、(15)、(16)及び(17)に帰属する。
【0318】
芳香族炭素に対する長範囲C−Hカップリングがないことは、予想されないことであり、短T2緩和時間又はプラナー構成のために、カップリングが、極めて小さいか、又は存在しないことを示している。
【0319】
181〜174ppmに6つのカルボニル炭素がある。これらのうち、180.6ppmの炭素は、ナトリウム塩と一致する化学シフトを有する唯一のものであり、したがって、(18)に帰属する。このピークは、2.4ppmでのプロトン(未分割)に長範囲C−Hカップリングしていることを示している。残りの5つのカルボニル炭素は、全て一つのppm化学シフト範囲内であり、(19)、(20)、(21)、(22)、(23)の可能性はない。
【0320】
102.3ppmでの炭素は、2つの別個の酸素に結合した炭素と一致する化学シフトを有するので、(24)と思われる。これは、1.74ppmでのプロトンに長範囲C−Hカップリングしており、(25)に帰属される。このプロトンは、30.6ppmの3炭素にカップリングしている。C−O領域(80〜60ppm)における炭素のうち、一つのみが、77.4ppmでプロトン化され、(26)であると思われる。これは、プロトン又は炭素に対して長範囲C−Hカップリングしていない。
【0321】
80〜60ppm領域においてまだ帰属していない3つの炭素がある。これらは、全て、酸素に結合したメチンである。これらは、全て、同様の化学シフト(71.2ppm、69.9ppm及び68.8ppm)を有するが、68.8ppmでの炭素が(28)でのメチルに長範囲カップリングしていることが明らかであると思われる。また、69.9での炭素も、(28)でのメチルに長範囲カップリングしている。したがって、(27)に隣接していると思われ、(29)に帰属する。したがって、残りのメチンは、(30)である。
【0322】
3.6ppm(29)のプロトンは、47.3ppmで一つの炭素のみに対して長範囲C−Hカップリングしている。唯一の隣接未帰属炭素は、(31)と思われる。(31)のプロトンは、他のプロトンとオーバーラップし、長範囲の相関は、可能ではない。
【0323】
残りの4つのメチルは、イソプロピル領域にあり、そのうちの一つが、1.25/1.34ppmにあり、最後の残りのメチル(32)に相当すると思われる。このメチルのプロトンは、51.3ppmで、一つの炭素のみに対して長範囲カップリングしており、(33)であると思われる。(33)のプロトンは、他のプロトンと大きくオーバーラップし、いずれの長範囲相関にも、使用できない。
【0324】
残りの4つのメチルは、全て、まとめた(34)とした、イソプロピルのメチルからのものと思われる。(34)のプロトンは、メチル対間で、25.9/25.8ppm及び41.6/41.7ppmの炭素に長範囲カップリングしている。これらのメチンは、(35)/(36)に帰属され、メチレンは、(37)/(38)に帰属する。これらのプロトンの全ては、1.5〜1.8ppmでオーバーラップしているが、54.7/53.5ppmでのメチンに長範囲カップリングしており、アミドに隣接するものと思われ、(39)/(40)に帰属する。
【0325】
残りの5つの炭素(全てメチレン)は、カルボニルに長範囲カップリングしており、そのようなものに隣接していると思われ、(41)、(42)及び(43)に帰属する。1H NMRの化学シフト、全て、2.4ppmでオーバーラップし、37.2ppm、34.4ppm及び33.8ppmの炭素に相当する。37.2での炭素は、最も異なるので、ナトリウム塩カルボニル(41)に帰属し、他の2つは、アミドカルボニル(42)、(43)に帰属する。残りの2つのメチレンは、類似しすぎて、具体的な帰属(44)、(45)ができない。
【0326】
帰属されていない一つの部位がある。5.5〜1.5ppmの領域には、30のプロトンがあり、
この帰属部位を含む構造と一致する。したがって、炭素シグナルが、約50ppmでの溶媒シグナルの下に隠れており、窒素に隣接するメチレンに場合と一致すると思われる。
【0327】
【表31】
【0328】
本明細書で述べた全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が、具体的且つ個々に記載された場合と同程度にまで、引用することにより本明細書の内容とする。
【0329】
本発明を、詳細に説明したが、当業者には、添付の請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく、数多くの変更及び修正ができることは、明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【0330】
【図1A】略語、名前及び構造を示した表である。
【図1B】略語、名前及び構造を示した表である。
【図1C】略語、名前及び構造を示した表である。
【図1D】略語、名前及び構造を示した表である。
【図2】標的細胞の細胞外付近及び標的細胞内における本発明のプロドラッグの典型的な切断スキームである。
【図3】本発明の典型的な中間体である、Fmoc−βAla−Ile−Ala−Leuの合成を示す。
【図4】本発明の典型的な中間体である、メチル−スクシニル−βAla−Ile−Ala−Leuの「Fmocルート」合成を示す。
【図5】本発明の典型的な化合物である、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−DOXの塩の「Fmocルート」合成を示す。
【図6】本発明の典型的な化合物である、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−DOXの塩の「エステルルート」合成を示す。
【図7】本発明の典型的な中間体である、アミノで保護されたβAla−Ile−Ala−Leu−DOXの合成を示す。
【図8】本発明の典型的な化合物である、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−DOXの塩の「アリルエステルルート」合成を示す。
【図9】本発明の典型的な化合物である、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−DOXの「樹脂ルート」合成を示す。
【図10】本発明のプロドラッグに有用であるオリゴペプチドについての表である。
【図11】スキャベンジャー樹脂又はビーズを使用することによる、遊離治療剤の除去を示す。
【図12】種々の培養ヒト細胞系のホモジネートによる、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Tyr−Leu−Dox及びSuc−βAla−Leu−Tyr−Leu−Doxの特定の加水分解速度についての表である。
【図13】種々の異種移植片組織のホモジネートによる、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Tyr−Leu−Dox及びSuc−βAla−Leu−Tyr−Leu−Doxの特定の加水分解速度についての表である。
【図14】細胞系のパネルについてのフローサイトメトリー分析により測定したCD10の発現を示す。
【図15】300nMホスホラミドンの不存在下又は存在下におけるCD10によるSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxの切断の一部の滴定曲線を示すグラフである。
【図16】プロドラッグの単回静脈内ボーラス投与の1時間後及び4時間後における、Suc−Ile−Ala−Leu−Doxとその代謝産物の血漿レベルを示すグラフである。
【図17】プロドラッグの単回静脈内ボーラス投与の0〜2時間後及び2〜24時間後に採取した尿に存在する、Suc−Ile−Ala−Leu−Doxとその代謝産物の量を示すグラフである。
【図18】プロドラッグの単回静脈内ボーラス投与の1時間後及び4時間後における、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxとその代謝産物の血漿レベルを示すグラフである。
【図19】プロドラッグの単回静脈内ボーラス投与の0〜2時間後及び2〜24時間後に採取した尿に存在する、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxとその代謝産物の量を示すグラフである。
【図20】Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox又は媒質対照を投与した、マウスの体重変化率を示すグラフである。
【図21】Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox又は媒質対照を投与した、LS174T異種移植片マウスの腫瘍増殖率を示すグラフである。
【図22】媒質、ドキソルビシン又はSuc−βAla−Ile−Ala−Leu−Doxにより処理した、ヌードマウスのLNCaPの増殖を示すグラフである。
【図23】異種移植片LNCaP腫瘍を有するヌードマウスの体重を示すグラフである。
【図24】異種移植片LNCaP腫瘍を有するヌードマウスの体重を示すグラフである。
【図25】媒質、ドキソルビシン又はSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxにより処理したヌードマウスのLNCaP腫瘍の増殖を示すグラフである。
【図26】血漿中の、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Ala−Gly−Dox及びドキソルビシンにおける、代謝産物の濃度を経時的に示すグラフである。
【図27】本発明の典型的な中間体であるMeOSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−Doxの大規模な合成を示す。
【図28】本発明の典型的な化合物であるMeOSuc−βAla−Leu−Ala−Leu−DoxのNMR帰属を示す。
【図29】トランスフェクションしたCHO細胞についてのCD10の発現を示す。
【図30】Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、ドキソルビシン又は媒質により処理したヌードマウスのLNCaP腫瘍の増殖を示すグラフである。
【図31】Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、ドキソルビシン又は媒質により処理した異種移植LNCaP腫瘍を有するヌードマウスの生存率を示すグラフである。
【図32】Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、ドキソルビシン又は媒質により処理した異種移植LNCaP腫瘍を有するヌードマウスの群平均補正体重を示すグラフである。
【図33】Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Ala−Gly−Dox又は媒質により処理したヌードマウスのLNCaP腫瘍の増殖を示すグラフである。
【図34】Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Ala−Gly−Dox又は媒質により処理した異種移植LNCaP腫瘍を有するヌードマウスの生存率を示すグラフである。
【図35】Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Ala−Gly−Dox又は媒質により処理した異種移植LNCaP腫瘍を有するヌードマウスの群平均補正体重を示すグラフである。
Claims (90)
- 以下の:
(1)標的細胞に侵入できる治療剤と、
(2)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドと、
(3)安定化基と、
(4)場合によりリンカー基と、
を含む化合物であって、
上記オリゴペプチドが当該オリゴペプチドの第一結合部位で上記安定化基に直接結合しており、上記オリゴペプチドが当該オリゴペプチドの第二結合部位で上記治療剤に直接結合しているか又は上記治療剤に上記リンカー基を介して間接的に結合しており、
上記安定化基が、全血に存在する酵素による当該化合物の切断を阻害し、
当該化合物が、CD10により切断されることができ、そして
上記オリゴペプチドがLeu−Ala−Leuであるとき、上記安定化基がスクシニル若しくはβAlaではないか、又は上記治療剤がドキソルビシン及びダウノルビシンのうちの一方ではなく、
上記オリゴペプチドがβAla−Leu−Ala−Leuであるとき、前記安定化基がスクシニルではないか、又は上記治療剤がドキソルビシン及びダウノルビシンのうちの一方ではなく、
上記オリゴペプチドがβAla−Leu−Ala−Leuであるとき、上記安定化基がグルタリルではないか、又は前記治療剤がドキソルビシンではなく、
当該化合物が、Succ−Ala−Leu−Ala−Leu−Dnr、pGlu−Ala−Leu−Ala−Leu−Dox、D−Ala−Leu−Ala−Leu−Dnr、D−Leu−Ala−Leu−Ala−Leu−Dnr、D−Leu−D−Ala−Leu−Ala−Leu−Dnr、アセチル−His−Ser−Ser−Lys−Leu−Gln−Dox、モルホリノカルボニル−His−Ser−Ser−Lys−Leu−Gln−Leu−Dox、N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド−Gly−Phe−Leu−Gly−Dox、N−グルタリル−(4−ヒドロキシプロリル)−Ala−Ser−シクロヘキシルグリシン−Gln−Ser−Leu−Dox、N−Cbz−Gly−Phe−Ala−Leu−Dox及びN−Cbz−Gly−Phe−Ala−Leu−PABC−Doxからなる群から選択されたものではない前記化合物。 - 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、nは0〜3であり、mは0〜3であり、そしてm+nが3以下である、請求項1に記載の化合物。
- 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、AAP1が、アルギニン、アラニン、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、グルタミン、バリン及びセリンからなる群から選択されたものである、請求項1に記載の化合物。
- 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、AAP1 ’が、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン及びプロリンからなる群から選択されたものである、請求項1に記載の化合物。
- 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、AAP1−AAP1 ’が、Arg−Leu、Gly−Trp、Arg−Ile、Arg−Phe、Arg−Val、Ala−Phe、Asp−Phe、Ala−Leu、Gly−Phe、Gly−Leu、Leu−Phe、Leu−Try、Met−Leu、Pro−Phe、Pro−Tyr、Pro−Leu、Phe−Leu、Phe−Phe、Tyr−Ile、Try−Pro、Tyr−Leu、Gln−Phe、Val−Tyr、Val−Phe及びSer−Leuからなる群から選択されるものである、請求項1に記載の化合物。
- 前記オリゴペプチドが、βAla−Leu−Ala−Leu、Ile−Ala−Leu、βAla−Ile−Ala−Leu、Leu−Ala−Leu、Met−Ala−Leu及びPhe−Ala−Leuからなる群から選択された配列を含む、請求項1に記載の化合物。
- 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、AAP1 ’が、疎水性アミノ酸である、請求項1に記載の化合物。
- 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、AAP2が、疎水性アミノ酸である、請求項1に記載の化合物。
- 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、AAP2が、イソロイシンである、請求項1に記載の化合物。
- m=1であるとき、
(AA)mは、AAm=1を表し、
AAm=1は、AAP1 ’に結合しており、そして
AAm=1は、疎水性アミノ酸である、
請求項1に記載の化合物。 - m=2であるとき、
(AA)mは、AAm=1−AAm=2を表し、
AAm=1は、AAP1 ’に結合しており、そして
AAm=1は、疎水性アミノ酸である、
請求項1に記載の化合物。 - m=3であるとき、
(AA)mは、AAm=1−AAm=2−AAm=3を表し、
AAm=1は、AAP1 ’に結合しており、そして
AAm=1は、疎水性アミノ酸である、
請求項1に記載の化合物。 - 前記標的細胞が、腫瘍細胞又は炎症細胞である、請求項1に記載の化合物。
- 前記標的細胞が、B細胞リンパ芽球性白血病、T細胞リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫や非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、メラノーマ、眼メラノーマ、皮膚メラノーマ、直腸腺癌、肝細胞癌、腎細胞癌、卵巣癌、前立腺癌、肝臓癌、移行上皮癌、膵臓腺癌、肺癌、乳癌及び結腸癌からなる群から選択された組織に由来するものである、請求項1に記載の化合物。
- 前記CD10が、前記標的細胞又は前記標的細胞と関連した白血球細胞と関連するものである、請求項1に記載の化合物。
- 前記CD10が、少なくとも前記標的細胞のライフサイクルの一部分に存在する、請求項1に記載の化合物。
- CD10活性部位が、前記標的細胞の細胞外周辺に存在する、請求項1に記載の化合物。
- 前記CD10が、式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドのAAP1とAAP1 ’との間の結合を切断する、請求項1に記載の化合物。
- 当該化合物が活性部分を有するプロドラッグであり、上記プロドラッグの活性部分が、CD10による切断前よりも、CD10による切断後のほうが前記標的細胞に侵入しやすく、上記活性部分が、少なくとも前記治療剤を含む、請求項1に記載の化合物。
- 前記安定化基が、ジカルボン酸又は高次カルボン酸である、請求項1に記載の化合物。
- 前記安定化基が、コハク酸、アジピン酸、グルタミン酸、フタル酸、ジグリコール酸、フマル酸、ナフタレンジカルボン酸、ピログルタミン酸、酢酸、1−ナフチルカルボン酸、2−ナフチルカルボン酸、1,8−ナフチルジカルボン酸、アコニット酸、カルボキシケイ皮酸、トリアゾールジカルボン酸、グルコン酸、4−カルボキシフェニルボロン酸、イソニペコチン酸、ニペコチン酸、ポリエチレングリコール酸、ブタンジスルホン酸及びマレイン酸からなる群から選択されたものである、請求項1に記載の化合物。
- 前記安定化基が、遺伝子にコードされていないアミノ酸である、請求項1に記載の化合物。
- 前記安定化基が、β−アラニン、チアゾリジン−4−カルボン酸、2−チエニルアラニン、2−ナフチルアラニン、D−アラニン、D−ロイシン、D−メチオニン、D−フェニルアラニン、3−アミノ−3−フェニルプロピオン酸、γ−アミノ酪酸、3−アミノ−4,4−ジフェニル酪酸、テトラヒドロイソキノリン−3−カルボン酸、4−アミノメチル安息香酸及びアミノイソ酪酸からなる群から選択されたものである、請求項1に記載の化合物。
- 前記安定化基が、当該アスパラギン酸のβ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合しているアスパラギン酸と、当該グルタミン酸のγ−カルボキシ基で前記オリゴペプチドに結合しているグルタミン酸とのうちの一方である、請求項1に記載の化合物。
- 前記安定化基が、負に帯電しているか、中性である、請求項1に記載の化合物。
- 前記安定化基が、患者に静中投与したときに、前記化合物と、血管の内側を覆う内皮細胞との間の相互作用を減少するように選択されたものである、請求項1に記載の化合物。
- 前記治療剤が、アルキル化剤、増殖防止剤、チューブリン結合剤、ビンカアルカロイド類、エネジイン、ポドフィロトキシン又はポドフィロトキシン誘導体、プテリジン薬剤群、タキサン類、アントラサイクリン類、ドラスタチン、トポイソメラーゼ阻害剤、メイタンシノイド及び白金錯体化学療法剤からなる群から選択されたものである、請求項1に記載の化合物。
- 前記治療剤が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、カリーチアマイシン、エトポシド、リン酸エトポシド、CC−1065、デュオカルマイシン、KW−2189、メトトレキサート、メトプテリン、アミノプテリン、ジクロロメトトレキサート、ドセタキセル、パクリタキセル、エピチオロン、コンブレタスタチン、コンブレタスタチンA4リン酸塩、ドラスタチン10、ドラスタチン11、ドラスタチン15、トポテカン、カンプトテシン、マイトマイシンC、ポルフィロマイシン、5−フルオロウラシル、6−メルカプトプリン、フルダラビン、タモキシフェン、シトシンアラビノシド、アデノシンアラビノシド、コルヒチン、ハリコンドリンB、シスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンC、ブレオマイシン、メルファラン、クロロキン、シクロスポリンA、メイタンシン、前記治療剤のいずれかの誘電体及び前記治療剤のいずれかの類似物からなる群から選択されたものである、請求項1に記載の化合物。
- 前記治療剤が、細胞内活性部位を有する、請求項1に記載の化合物。
- 前記オリゴペプチドが、前記治療剤に直接結合している、請求項1に記載の化合物。
- 前記オリゴペプチド配列が、リンカー基を介して、前記オリゴペプチドの第二結合部位で前記治療剤に間接的に結合しており、前記リンカー基が、アミノカプロン酸、ヒドラジド基、エステル基、エーテル基及びスルフィドリル基からなる群から選択されたものである、請求項1に記載の化合物。
- 前記化合物が、Suc−Ile−Ala−Dox、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Met−Ala−Leu−Dox及びSuc−Phe−Ala−Leu−Doxからなる群から選択されたものである、請求項1に記載の化合物。
- 前記化合物が、TOPによる切断に対して耐性がある、請求項1に記載の化合物。
- 前記化合物が、PSAによる切断に対して耐性がある、請求項1に記載の化合物。
- 以下の:
式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは、独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドを含み、
上記オリゴペプチドが、CD10により切断されることができる複合体。 - 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、nは0〜3であり、mは0〜3であり、そしてm+nが3以下である、請求項35に記載の複合体。
- 前記オリゴペプチドが、安定化基に結合されている、請求項35に記載の複合体。
- 前記オリゴペプチドが、治療剤に結合されている、請求項35に記載の複合体。
- 前記オリゴペプチドが、βAla−Leu−Ala−Leu、Ile−Ala−Leu、βAla−Ile−Ala−Leu、Leu−Ala−Leu、Met−Ala−Leu、Arg−Leu、Gly−Trp、Arg−Ile、Arg−Phe、Arg−Val、Ala−Phe、Asp−Phe、Ala−Leu、Gly−Phe、Gly−Leu、Leu−Phe、Leu−Tyr、Met−Leu、Pro−Phe、Pro−Tyr、Pro−Leu、Phe−Leu、Phe−Phe、Tyr−Ile、Tyr−Pro、Tyr−Leu、Gln−Phe、Val−Tyr、Val−Phe及びSer−Leuからなる群から選択されたものである、請求項38に記載の複合体。
- 前記オリゴペプチドがさらに安定化基に結合されており、前記オリゴペプチドがβAla−Leu−Ala−Leu、Ile−Ala−Leu、βAla−Ile−Ala−Leu、Leu−Ala−Leu、Met−Ala−Leu、Arg−Leu、Gly−Trp、Arg−Ile、Arg−Phe、Arg−Val、Ala−Phe、Asp−Phe、Ala−Leu、Gly−Phe、Gly−Leu、Leu−Phe、Leu−Tyr、Met−Leu、Pro−Phe、Pro−Tyr、Pro−Leu、Phe−Leu、Phe−Phe、Tyr−Ile、Tyr−Pro、Tyr−Leu、Gln−Phe、Val−Tyr、Val−Phe及びSer−Leuからなる群から選択されたものである、請求項38に記載の複合体。
- 前記オリゴペプチドがLeu−Ala−Leuであるとき、前記安定化基がスクシニル又はβAlaではないか、又は前記治療剤がドキソルビシン及びダウノルビシンのうちの一方ではなく、
前記オリゴペプチドがβAla−Leu−Ala−Leuであるとき、前記安定化基がスクシニルではないか、又は前記治療剤がドキソルビシン及びダウノルビシンのうちの一方ではなく、
前記オリゴペプチドがβAla−Leu−Ala−Leuであるとき、前記安定化基がグルタリルではないか、又は前記治療剤がドキソルビシンではなく、
前記化合物が、Succ−Ala−Leu−Ala−Leu−Dnr、pGlu−Ala−Leu−Ala−Leu−Dox、D−Ala−Leu−Ala−Leu−Dnr、D−Leu−Ala−Leu−Ala−Leu−Dnr、D−Leu−D−Ala−Leu−Ala−Leu−Dnr、アセチル−His−Ser−Ser−Lys−Leu−Gln−Dox、モルホリノカルボニル−His−Ser−Ser−Lys−Leu−Gln−Leu−Dox、N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド−Gly−Phe−Leu−Gly−Dox、N−グルタリル−(4−ヒドロキシプロリル)−Ala−Ser−シクロヘキシルグリシン−Gln−Ser−Leu−Dox、N−Cbz−Gly−Phe−Ala−Leu−Dox及びN−Cbz−Gly−Phe−Ala−Leu−PABC−Doxからなる群から選択されたものではない請求項38に記載の複合体。 - 以下の:
式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、
各AAは、独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドを含み、
上記オリゴペプチドが、サーモリシン様酵素により切断されることができる複合体。 - 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、nは0〜3であり、mは0〜3であり、そしてm+nが3以下である、請求項42に記載の複合体。
- 前記オリゴペプチドが、安定化基に結合されている、請求項42に記載の複合体。
- 前記オリゴペプチドが、治療剤に結合されている、請求項42に記載の複合体。
- 以下の:
(1)(a)標的細胞に侵入できる治療剤と、
(b)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドと、
(c)安定化基と、
(d)場合によりCD10により切断されることのないリンカー基と、
を含む化合物であって、
上記オリゴペプチドが当該オリゴペプチドの第一結合部位で上記安定化基に直接結合しており、上記オリゴペプチドが当該オリゴペプチドの第二結合部位で上記治療剤に直接結合しているか、又は上記治療剤に上記リンカー基を介して間接的に結合しており、
上記安定化基が、全血に存在する酵素による当該化合物の切断を阻害し、
当該化合物が、CD10により切断されることができる化合物と、
(2)薬学的に許容される担体と、
を含む医薬組成物。 - 前記化合物の式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、nは0〜3であり、mは0〜3であり、そしてm+nが3以下である、請求項46に記載の医薬組成物。
- 前記オリゴペプチドがLeu−Ala−Leuであるとき、前記安定化基がスクシニル又はβAlaではないか、又は前記治療剤がドキソルビシン及びダウノルビシンのうちの一方ではなく、
前記オリゴペプチドがβAla−Leu−Ala−Leuであるとき、前記安定化基がスクシニルではないか、又は前記治療剤がドキソルビシン及びダウノルビシンのうちの一方ではなく、
前記オリゴペプチドがβAla−Leu−Ala−Leuであるとき、前記安定化基がグルタリルではないか、又は前記治療剤がドキソルビシンではなく、
前記化合物が、Succ−Ala−Leu−Ala−Leu−Dnr、pGlu−Ala−Leu−Ala−Leu−Dox、D−Ala−Leu−Ala−Leu−Dnr、D−Leu−Ala−Leu−Ala−Leu−Dnr、D−Leu−D−Ala−Leu−Ala−Leu−Dnr、アセチル−His−Ser−Ser−Lys−Leu−Gln−Dox、モルホリノカルボニル−His−Ser−Ser−Lys−Leu−Gln−Leu−Dox、N−(2−ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド−Gly−Phe−Leu−Gly−Dox、N−グルタリル−(4−ヒドロキシプロリル)−Ala−Ser−シクロヘキシルグリシン−Gln−Ser−Leu−Dox、N−Cbz−Gly−Phe−Ala−Leu−Dox及びN−Cbz−Gly−Phe−Ala−Leu−PABC−Doxからなる群から選択されたものではない、
請求項46に記載の医薬組成物。 - CD10関連標的細胞を含む疾患の治療方法であって、以下の:
(1)標的細胞に侵入できる治療剤と、
(2)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドと、
(3)安定化基と、
(4)場合によりCD10により切断されないリンカー基と、
を含む化合物であって、
上記オリゴペプチドが当該オリゴペプチドの第一結合部位で上記安定化基に直接結合しており、上記オリゴペプチドが当該オリゴペプチドの第二結合部位で上記治療剤に直接的に結合しているか又は上記治療剤に上記リンカー基を介して間接的に結合しており、
上記安定化基が、全血に存在する酵素による当該化合物の切断を阻害し、
CD10により切断されることができる、
当該化合物を治療に効果的な量で患者に投与することを含む前記治療方法。 - 前記化合物の式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、nは0〜3であり、mは0〜3であり、そしてm+nが3以下である、請求項49に記載の方法。
- 前記化合物を、静脈内投与する、請求項49に記載の方法。
- 前記患者が、癌、腫瘍性疾患、腫瘍、炎症性疾患及び感染症からなる群から選択される病状について治療を受ける、請求項49に記載の方法。
- 前記化合物が、TOPによる切断に対して耐性がある、請求項49に記載の方法。
- 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、AAP1が、アルギニン、アラニン、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、グルタミン、バリン及びセリンからなる群から選択されたものである、請求項49に記載の方法。
- 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、AAP1 ’が、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン及びプロリンからなる群から選択されたものである、請求項49に記載の方法。
- 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、AAP1−AAP1 ’が、Arg−Leu、Arg−Ile、Arg−Phe、Arg−Val、Ala−Phe、Ala−Leu、Gly−Phe、Gly−Leu、Leu−Phe、Leu−Tyr、Met−Leu、Pro−Phe、Pro−Tyr、Pro−Leu、Phe−Leu、Phe−Phe、Tyr−Ile、Tyr−Pro、Tyr−Leu、Gln−Phe、Val−Tyr、Val−Phe、Gly−Trip、Asp−Phe及びSer−Leuからなる群から選択されるものである、請求項49に記載の方法。
- 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、AAP2が、疎水性アミノ酸である、請求項49に記載の方法。
- 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、AAP2が、イソロイシンである、請求項49に記載の方法。
- 前記化合物が、Suc−βAla−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−βAla−Ile−Ala−Leu−Dox、Suc−Leu−Ala−Leu−Dox、Suc−Met−Ala−Leu−Dox及びSuc−Phe−Ala−Leu−Doxからなる群から選択されたものである、請求項49に記載の方法。
- 腫瘍の治療方法であって、CD10切断性プロドラッグを前記腫瘍に投与することを含む方法。
- 前記CD10切断性プロドラッグが、以下の:
(1)標的細胞に侵入できる治療剤と、
(2)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドと、
(3)安定化基と、
(4)場合によりリンカー基と、
を含み、
上記オリゴペプチドが当該オリゴペプチドの第一結合部位で上記安定化基に直接結合しており、上記オリゴペプチドが当該オリゴペプチドの第二結合部位で上記治療剤に直接結合しているか又は上記治療剤に上記リンカー基を介して間接的に結合しており、
上記安定化基が、全血に存在する酵素による当該プロドラッグの切断を阻害する、
請求項60に記載の方法。 - 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、nは0〜3であり、mは0〜3であり、そしてm+nが3以下である、請求項61に記載の方法。
- 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、AAP1が、アルギニン、アラニン、グリシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、グルタミン、バリン及びセリンからなる群から選択されたものである、請求項61に記載の方法。
- 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、AAP1 ’が、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン及びプロリンからなる群から選択されたものである、請求項61に記載の方法。
- 患者の前立腺癌を治療する方法であって、前記患者にCD10により切断されることのできるプロドラッグを投与することを含む上記方法。
- 前記CD10切断性プロドラッグが、以下の:
(1)標的細胞に侵入できる治療剤と、
(2)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドと、
(3)安定化基と、
(4)場合によりリンカー基と、
を含み、
上記オリゴペプチドが当該オリゴペプチドの第一結合部位で上記安定化基に直接結合しており、上記オリゴペプチドが当該オリゴペプチドの第二結合部位で上記治療剤に直接結合しているか又は上記治療剤に上記リンカー基を介して間接的に結合しており、
上記安定化基が、全血に存在する酵素による当該プロドラッグの切断を阻害する、
請求項65に記載の方法。 - 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、nは0〜3であり、mは0〜3であり、そしてm+nが3以下である、請求項66に記載の方法。
- 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、AAP1−AAP1 ’が、Arg−Leu、Gly−Trp、Arg−Ile、Arg−Phe、Arg−Val、Ala−Phe、Asp−Phe、Ala−Leu、Gly−Phe、Gly−Leu、Leu−Phe、Leu−Tyr、Met−Leu、Pro−Phe、Pro−Tyr、Pro−Leu、Phe−Leu、Phe−Phe、Tyr−Ile、Tyr−Pro、Tyr−Leu、Gln−Phe、Val−Tyr、Val−Phe及びSer−Leuからなる群から選択されるものである、請求項66に記載の方法。
- プロドラッグを設計する方法であって、以下の:
(1)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドを準備する工程と、
(2)上記オリゴペプチドを当該オリゴペプチドの第一結合部位で、全血に存在する酵素による当該オリゴペプチドの切断を阻害する安定化基に結合させる工程と、
(3)上記オリゴペプチドを当該オリゴペプチドの第二結合部位で、治療剤に直接的又は間接的に結合させる工程であって、
工程(2)及び工程(3)を、いずれの順序で実施してもよいし、同時に実施してもよく、さらに、工程(1)〜(3)を実施することにより複合体が形成され、
(4)CD10により前記複合体を切断できるかどうかを試験する工程と、
(5)前記複合体がCD10により切断されることができる場合には、前記複合体をプロドラッグとして選択する工程と、
を含む前記方法。 - 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、nは0〜3であり、mは0〜3であり、そしてm+nが3以下である、請求項69に記載の方法。
- 前記第一結合部位が、前記オリゴペプチドのN末端である、請求項69に記載の方法。
- 前記第二結合部位が、前記オリゴペプチドのC末端である、請求項69に記載の方法。
- 前記第一結合部位が、前記オリゴペプチドのC末端である、請求項69に記載の方法。
- 前記第二結合部位が、前記オリゴペプチドのN末端である、請求項69に記載の方法。
- 請求項69に記載の方法により設計された、プロドラッグ。
- プロドラッグを設計するのに有用なオリゴペプチドを同定するための、スクリーニング方法であって、以下の:
(1)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドを準備する工程と、
(2)CD10により上記オリゴペプチドを切断できるかどうかを試験する工程であって、CD10による切断性が、プロドラッグを設計するための候補としての上記オリゴペプチドの目安である工程と、
を含む前記方法。 - 患者に投与することを意図している治療剤の毒性を減少させる方法であって、
CD10により切断可能なオリゴペプチドを、前記オリゴペプチドの第一結合部位で安定化基に結合させ、前記オリゴペプチドの第二結合部位で前記治療剤を直接又は間接的に結合させて、CD10により切断可能なプロドラッグを共有結合で形成することを含み、それにより、前記プロドラッグが、前記治療剤を前記患者に投与したときに前記治療剤の毒性を減少させることができる前記方法。 - 前記プロドラッグにより、前記プロドラッグ形態の治療剤の患者への投与量を、前記未複合形態の治療剤の投与量よりも増加できる、請求項77に記載の方法。
- 前記CD10により切断可能なオリゴペプチドが、以下の:
式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは、独立してアミノ酸を表す。}
で表されるものである、請求項77に記載の方法。 - 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、nは0〜3であり、mは0〜3であり、そしてm+nが3以下である、請求項79に記載の方法。
- 患者の疾患の治療方法であって、以下の:
標的細胞に関連したCD10を検出する工程と、
CD10が上記標的細胞と関連している場合には、CD10切断性プロドラッグを上記患者に投与する工程、
を含む前記方法。 - 前記疾患が、B細胞リンパ芽球性白血病、T細胞リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫や非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、メラノーマ、眼メラノーマ、皮膚メラノーマ、直腸腺癌、肝細胞癌、腎細胞癌、卵巣癌、前立腺癌、肝臓癌、移行上皮癌、膵臓腺癌、肺癌、乳癌及び結腸癌からなる群から選択されたものである、請求項81に記載の方法。
- 前記検出工程が、以下の:
組織の試料を得る工程と、
上記試料を、CD10特異的抗体と混ぜる工程と、
上記CD10特異的抗体の前記試料への結合を測定する工程と、
を含む、請求項81に記載の方法。 - 前記CD10切断性プロドラッグが、以下の:
(1)標的細胞に侵入できる治療剤と、
(2)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドと、
(3)安定化基と、
(4)場合によりリンカー基と、
を有する化合物であって、
上記オリゴペプチドが当該オリゴペプチドの第一結合部位で上記安定化基に直接結合しており、上記オリゴペプチドが当該オリゴペプチドの第二結合部位で上記治療剤に直接結合しているか又は上記治療剤に上記リンカー基を介して間接的に結合しており、
上記安定化基が、全血に存在する酵素による当該化合物の切断を阻害する、化合物
を含む、請求項81に記載の方法。 - 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、nは0〜3であり、mは0〜3であり、そしてm+nが3以下である、請求項84に記載の方法。
- 式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、AAP1−AAP1 ’が、Arg−Leu、Arg−Ile、Arg−Phe、Arg−Val、Ala−Phe、Ala−Leu、Gly−Phe、Gly−Leu、Leu−Phe、Leu−Tyr、Met−Leu、Pro−Phe、Pro−Tyr、Pro−Leu、Phe−Leu、Phe−Phe、Tyr−Ile、Tyr−Pro、Tyr−Leu、Gln−Phe、Val−Tyr、Val−Phe、Gly−Trp、Asp−Phe及びSer−Leuからなる群から選択されるものである、請求項84に記載の方法。
- 診断又はアッセイ用物品であって、以下の:
(1)(a)マーカーと、
(b)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドと、
(c)安定化基と、
(d)場合によりCD10により切断されないリンカー基と、
を含む化合物であって、
上記オリゴペプチドが当該オリゴペプチドの第一結合部位で上記安定化基に直接結合しており、上記オリゴペプチドが当該オリゴペプチドの第二結合部位で上記治療剤に直接的に結合しているか又は上記治療剤に上記リンカー基を介して間接的に結合しており、
上記安定化基が、全血に存在する酵素による当該化合物の切断を阻害し、
CD10により切断されることができる当該化合物と、
(2)場合により前記マーカーの検出に有用な少なくとも一種の試薬と、
を含む前記物品。 - プロドラッグの製造方法において、遊離の治療剤を除去する方法であって、以下の:
(1)場合により保護された安定化基−オリゴペプチド複合体を、前記遊離の治療剤とカップリングさせる工程であって、前記場合により保護された安定化基−オリゴペプチド複合体が、式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドを含むものである工程と、
(2)上記工程(1)の反応剤と高分子樹脂とを接触させて、工程(1)の後に残存する遊離の治療剤を結合させることにより治療剤−高分子樹脂複合体を形成する工程と、
(3)上記高分子樹脂がポリスチレンメチルイソシアネート又はポリスチレンスルホニルクロリドである、上記治療剤−高分子樹脂複合体を除去する工程と、
を含む前記方法。 - 以下の:
(1)標的細胞に侵入できる治療剤と、
(2)式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)m
{式中、
nとmは整数であり、
AAP2は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1は、いずれかのアミノ酸を表し、
AAP1 ’は、いずれかのアミノ酸を表し、そして
各AAは独立してアミノ酸を表す。}
で表されるオリゴペプチドと、
(3)安定化基と、
(4)場合によりCD10により切断されないリンカー基と、
を含む化合物であって、
上記オリゴペプチドが当該オリゴペプチドの第一結合部位で上記安定化基に直接結合しており、上記オリゴペプチドが当該オリゴペプチドの第二結合部位で上記治療剤に直接的に結合しているか又は上記治療剤に上記リンカー基を介して間接的に結合しており、
上記安定化基が、全血に存在する酵素による当該化合物の切断を阻害し、
CD10により切断されることができる当該化合物の、CD10関連標的細胞を含む疾患を有する患者の治療薬の製造のための使用。 - 前記化合物の式(AA)n−AAP2−AAP1−AAP1 ’−(AA)mで表される前記オリゴペプチドにおいて、nは0〜3であり、mは0〜3であり、そしてm+nが3以下である、請求項89に記載の使用。
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