JP2642165B2

JP2642165B2 - 新規ｄｃ−８９化合物およびその製造法

Info

Publication number: JP2642165B2
Application number: JP63265580A
Authority: JP
Inventors: 恵一高橋; 通朗市村; 健一室井; 茂夫勝亦; 達洋小川; 眞森本; 忠芦沢; 博満斉藤; 政次河西; 浩佐野; 亨安澤
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
Current assignee: KH Neochem Co Ltd
Priority date: 1988-07-22
Filing date: 1988-10-21
Publication date: 1997-08-20
Anticipated expiration: 2012-08-20
Also published as: JPH02119787A; US5138059A; EP0351865B1; EP0351865A3; EP0351865A2; DE68922442D1; DE68922442T2; ATE122045T1

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、DC−89化合物およびその製造法に関する。
本発明のDC−89化合物は、抗菌活性及び抗腫瘍活性を有
し、抗菌剤及び抗腫瘍剤として有用である。

従来の技術従来、抗菌作用および抗腫瘍作用を有する微生物又は
植物由来の低分子物質としては、アンスラサイクリン系
化合物、アンスラキノン系化合物、マイトマイシン系化
合物など多くの化合物が報告されている。

〔シーアールシーハンドブックオブアンタイバイ
オティックコンパウンズ、シーアールシープレス
（CRC Handbook of Antibiotic Compounds,CRC Pres
s）U.S.A.1981〕。

DC89化合物と類似の化合物としてストレプトマイセス
属に属する微生物が生産する抗菌作用及び抗腫瘍活性を
有するDC−88A及びDC−89A1がW087/06265に開示されて
いる。

発明が解決しようとする課題優れた抗生物質および抗腫瘍性化合物は常に求められ
ている。

課題を解決するための手段本発明者らは、天然界より多くの微生物を入手して、
抗生物質の生産性を調べたところ、DC−88A及びDC−89A
1生産菌と同じストレプトマイセス属に属する微生物の
培養物中に抗腫瘍活性も有するDC−88A及びDC−89A1と
は異なる抗生物質を見い出した。この物質を単離，精製
した結果、新規化合物であることがわかり、それぞれを
DC−89A2,DC−89B1,DC−89B2と命名した。下記にDC−89
A2、DC−89B1、DC−89B2及びDC−89A1の構造式を示す。
本明細書ではDC−89B1、DC−89B2をDC−89化合物と総称
する。

DC−89A1:X＝−CH₂−,Y＝Cl DC−89A2:X＝単結合 ,Y＝−CH₂Cl DC−89B1:X＝−CH₂−,Y＝Br DC−89B2:X＝単結合 ,Y＝−CH₂Br DC−89A2,DC−89B1,DC−89B2それぞれの理化学的性質
を以下に示す。

（１） DC−89A2 元素分析:C 57.2％,H 4.9％,N 7.8％分子式:C₂₆H₂₆N₃O₈Cl 分子量:543（マススペクトル法）融点:238〜240℃（分解）紫外部吸収スペクトル（メタノール中）：第１図に示
す。

赤外部吸収スペクトル（KBr打錠）：第２図に示す。

旋光度 ▲〔α〕²⁰ _D▼＝−140.5゜（メタノール溶
液） PMRスペクトル（CDCl₃中、内部標準TMS） 9.59（1H,s）,8.51（1H,s）,6.98（1H,d）,6.83（1H,
s）,4.56（2H,broad dd）,4.13（1H,m）,4.11（3H,s）,
3.95（3H,s）,3.91（3H,s）,3.72（3H,s）,3.70（2H,br
oad dd）,1.70（3H,s） CMRスペクトル（CDCl₃中、内部標準TMS） 196.6,169.6,160.5,150.4,150.1,144.2,140.9,138.7,
137.7,129.1,126.0,123.5,119.5,115.6,112.5,107.9,9
8.0,71.2,61.5,61.2,56.4,55.0,53.4,46.4,42.3,22.0 溶解性：メタノール，エタノール，酢酸エチル，アセ
トン，クロロホルム，ジメチルスルホキシドによく溶け
る。

水,n−ヘキサンにはほとんど溶けない。

（２） DC−89B1 元素分析:C 53.4％,H 4.7％,N 6.5％分子式:C₂₆H₂₆N₃O₈Br 分子量:588（マススペクトル法）融点:148〜149℃ 紫外部吸収スペクトル（メタノール中）：第３図に示
す。

赤外部吸収スペクトル（KBr打錠）：第４図に示す。

旋光度 ▲〔α〕²⁰ _D▼＝−113.5゜（メタノール溶
液） PMRスペクトル（CDCl₃中、内部標準TMS） 9.37（1H,s）,8.06（1H,s）,7.09（1H,s）,6.71（1H,
s）,6.62（1H,d）,4.58（1H,dd）,4.55（1H,m）,4.09
（1H,d）,3.99（3H,s）,3.89（3H,s）,3.81（3H,s）,3.
75（1H,dd）,3.74（3H,s）,3.63（1H,dd）,1.64（3H,
s） CMRスペクトル（CDCl₃中、内部標準TMS） 196.8,169.7,164.5,151.7,150.2,141.6,140.4,138.9,
129.1,128.9,126.1,123.1,117.1,116.6,118.2,108.3,9
7.9,71.1,61.5,61.2,56.3,53.4,44.8,33.9,21.8 溶解性：メタノール，エタノール，酢酸エチル，アセ
トン，クロロホルム，ジメチルスルホキシドによく溶け
る。

水,n−ヘキサンにはほとんど溶けない。

（２） DC−89B2 元素分析:C 53.2％,H 4.5％,N 7.2％分子式:C₂₆H₂₆N₃O₈Br 分子量:588（マススペクトル法）融点:214〜215℃（分解）紫外部吸収スペクトル（メタノール中）：第５図に示
す。

赤外部吸収スペクトル（KBr打錠）：第６図に示す。

旋光度 ▲〔α〕²⁰ _D▼＝−57.5゜（メタノール溶
液） PMRスペクトル（CDCl₃中、内部標準TMS） 9.52（1H,s）,8.51（1H,s）,6.99（1H,d）,6.84（1H,
s）,4.60（1H,dd）,4.51（1H,dd）,4.15（1H,m）,4.13
（3H,s）,4.03（1H,dd）,3.95（3H,s）,3.91（3H,s）,
3.73（3H,s）,3.59（1H,dd）,1.70（3H,s） CMRスペクトル（CDCl₃中、内部標準TMS） 196.6,169.5,160.5,150.4,150.1,144.2,140.9,138.7,
137.6,129.1,126.0,123.5,120.2,115.6,112.5,107.9,9
8.0,71.2,61.5,61.2,56.4,56.1,53.4,42.0,35.6,22.0 溶解性：メタノール，エタノール，酢酸エチル，アセ
トン，クロロホルム，ジメチルスルホキシドによく溶け
る。

水,n−ヘキサンにはほとんど溶けない。

DC−89A2,DC−89B1及びDC−89B2の薄層クロマトグラ
フィー〔シリカゲル（商品名 HPTLC−plates Art.1564
7 E.Merck社西独製）を用い、アセトニトリル：水＝9:
1を展開溶媒として、室温で10分間展開する。〕でのRf
値は第１表の通りである。

展開後のDC−89化合物のスポットはバチルス・ズブチ
リス（Bacillus subtilis）を用いるバイオアッセイ，
熱硫酸，ヨウ素，エールリッヒ試薬および紫外部吸収よ
り検出できる。

次にDC−89化合物の生物学的性質について説明する。

（Ａ）各種細菌に対する抗菌作用抗菌作用はバクト・トリプトン（Difco社製）3g、肉
エキス3g,酵母エキス1g,グルコース1g,寒天16gを１の
水に溶解して作成した培地（pH7）を用いて寒天希釈法
で測定した。第２表に抗菌活性を最少生育阻止濃度（MI
C）で示した。

（Ｂ）急性毒性マウスに対する腹腔内投与における急性毒性の値（LD
₅₀）は、DC−89A2について約3.83mg/kg、DC−89B1につ
いて約0.37mg/kg、DC−89B2について約0.28mg/kgであっ
た。

（Ｃ）抗腫瘍作用（１）サルコーマ180固形型腫瘍に対する治療効果体重約20gのddy雄マウス１群６匹にサルコーマ180固
形型腫瘍細胞５×10⁶個を腋窩部皮下に移植した。移植
後24時間目に第３表に示す濃度のDC−89化合物のリン酸
緩衝液生理食塩水（以下PBSという）溶液0.2mlを１回腹
腔内に投与した。

PBSの組成はNaCl 0.8g/dl、KCl 0.02g/dldl、Na₂HPO₄
1.15g/dl、KH₂PO₄ 0.02g/dl、pH7.2である。

比較として、腫瘍細胞移植24時間目にマイトマイシン
Ｃを含むPBS0.2mlを腹腔内に投与した群を設けた。

移植10日後のT/C〔T:試験例の平均腫瘍体積（mm³）、
C:対照（PBS溶液0.2mlを腹腔内投与したもの）〕を測定
した。

その結果を第３表に示す。

（２）リンホサイティック・リュウケミアＰ−388腫
瘍に対する治療効果体重約22gのCDF₁雄マウス１群５匹に、リンホサイテ
ィック・リュウケミア（Lymphocytic leukemia）Ｐ−38
8腫瘍細胞１×10⁶個を腹腔内移植した。移植後24時間後
にDC−89化合物のPBS溶液0.2mlを１回腹腔内に投与し
た。比較として、腫瘍細胞移植後24時間目にマイトマイ
シンＣのPBS溶液0.2mlを腹腔内投与した群を設けた。移
植後の延命効果（T/C;T:試験例の平均生存日数、C:対照
の平均生存日数）を第４表に示す。

次にDC−89化合物の製造法について説明する。

DC−89化合物は、ストレプトマイセス属に属し、DC−
89化合物を生産する能力を有する微生物を培地に培養
し、DC−89化合物を培養物中に蓄積させ、該培養物から
DC−89化合物を採取することによって得ることができ
る。

本発明において使用する微生物は、ストレプトマイセ
ス属に属し、DC−89化合物を生産する能力を有する微生
物であればいずれの微生物も用いることができる。好適
な微生物としては、WO87/06265公報記載のストレプトマ
イセス・リディカスDO−89株（FERM BP−988）が挙げら
れる次に培養法について述べる。

本発明の培養においては、通常の放線菌の培養法が一
般に用いられる。培地としては、微生物の資化可能な炭
素源、窒素源、無機物及び微生物の生育やDC−89化合物
の生産を促進する物質を程よく含有する培地であれば合
成培地、天然培地いずれでも使用可能である。

炭素源としてはグルコース、澱粉、デキストリン、マ
ンノース、フラクトース、シュクロース、ラクトース、
キシロース、アラビノース、マンニトール、糖蜜などが
単独または組み合わせて用いられる。さらに、菌の資化
能によっては炭化水素、アルコール類、有機酸なども用
いられる。窒素源としては塩化アンモニウム、硫酸アン
モニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、尿素、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、乾燥酵母、コーンス
チープ・リカー、大豆粉、カザミノ酸などが単独または
組み合わせて用いられる。そのほか、必要に応じて食
塩、塩化カリウム、臭化カリウム、硫酸マグネシウム、
炭酸カルシウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二
カリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、硫酸マンガ
ン、硫酸亜鉛、硫酸銅などの無機塩類を加える。さらに
使用菌の生育やDC−89化合物の生産を促進する物質、例
えばビタミンB₁、ビオチンなどを適当に添加することが
できる。

培養法としては、液体培養法、とくに深部攪拌培養法
がもっとも適している。培養温度は25〜40℃、特に28〜
38℃が適当であり、培養中の培地のpHはアンモニア水や
炭酸アンモニウム溶液などを添加して、pH4〜10、特に
６〜８に維持することが望ましい。

液体培養で、通常１〜７日培養すると、目的物質が培
養液中および菌体に生成蓄積される。

培養物中の生成量が最大に達したときに培養を停止
し、培養物中より目的物質を単離精製する。培養物から
のDC−89化合物の単離精製は、微生物代謝生産物をその
培養物から単離精製するために常用される方法に従って
行われる。

例えば培養物を過により培養液と菌体に分け、菌
体をｎ−プロパノール、クロロホルム、アセトン等で抽
出する。ついで、抽出液と培養液とを合わせて、非イ
オン性多孔性樹脂例えばダイヤイオンHP−20（三菱化成
社製）等に通塔して活性成分を吸着させ、ついでメタノ
ール、アセトン等で溶出する。溶出液を濃縮し、濃縮物
にpH5〜６の水と酢酸エチルを加えて振りまぜ、酢酸エ
チル層に活性成分を移行させる。

酢酸エチル層を濃縮乾固してDC−89化合物の粗粉末を
得る。この粗粉末は結晶化、セファデックス、シリカゲ
ル等を用いるクロマトグラフィー等によってさらに純度
を高めることができる。

DC−89化合物は、また、DC−89Aを塩酸あるいは臭化
水素酸で反応させるか又はpH3〜６の緩衝液中で、式 MXn （Ｉ）（式中、Ｍはリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシ
ウム、マグネシウム、アルミニウム、亜鉛、銅を表わ
し、Ｘは塩素または臭素であり、ｎは１〜３の整数であ
る。）で表わされる化合物を反応させることにより製造
することができる。

DC−89A1及びDC−89A2はDC−89Aを不活性溶媒中、塩
酸あるいは有機溶媒中の塩化水素と反応させることによ
り、製造することができる。不活性溶媒としてアセトニ
トリル、塩化メチレン、ジメチルホルムアミド、酢酸エ
チル、テトラヒドロフラン、アセトン、水等が単独もし
くは混合して用いられる。塩酸あるいは塩化水素は通常
DC−89Aに対し１〜50当量用いられる。反応は通常−20
〜30℃で行い、５分〜２時間で終了する。

DC−89B1及びDC−89B2は上記の反応において、塩酸の
かわりに、臭化水素酸を用いて反応を行うことにより、
製造することができる。

またDC−89Aを不活性溶媒とpH3〜６の緩衝液との混合
溶媒中式 MXn （Ｉ）（式中、M,X,nは前記と同義である）で表わされる化合物〔以下化合物（Ｉ）という。〕と反
応させることによりDC−89A1、DC−89A2、DC−89B1また
はDC−89B2を製造することができる。不活性溶媒として
アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロ
フラン、アセトン、塩化メチレン等が単独もしくは混合
して用いられる。

化合物（Ｉ）はDC−88Aに対して通常２〜30当量用い
られる。pH3〜６の緩衝液として0.02M〜1Mの酢酸緩衝
液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液等が用いられる。反
応は通常０〜60℃で行い、１時間〜３日で終了する。

各工程の反応終了後、必要に応じて緩衝液、水等を加
え、酢酸エチル、クロロホルム、エーテル等の非水溶性
溶媒で抽出する。水、食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリ
ウム等で乾燥し、溶媒を留去する。残渣をシリカゲルに
よるカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィ
ー高速液体分取クロマトグラフィー、再結晶等により精
製を行う。

DC−89化合物はそれ自体よりなる、又はその有効量と
医薬補助剤とを含有してなる抗生物質、抗腫瘍剤として
用いることができる。ここに医薬補助剤は常用される希
釈剤、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、基剤等を包含
する。

DC−89化合物は各種の投与形態で用いることができ
る。注射剤として用いる場合には、希釈剤としてこの分
野で常用されているもの、例えばエタノールにDC−89化
合物を溶解後、エタノールを吸引除去するか又はせず
に、注射用蒸留水、生理食塩水又はブドウ糖、フラクト
ース、マンニット等を含有する注射用蒸留水と混合して
製造する。溶解時必要に応じ界面活性剤、可溶化剤を併
用することもできる。

又、エタノール溶液を凍結乾燥した注射剤や塩化ナト
リウムとを混合した粉末注射剤としてもよく、これらの
場合は用時溶解して用いる。これらの注射剤は例えば静
脈内投与に供せられるが、筋肉内投与、動脈内投与、腹
腔内投与、胸腔内投与等も可能である。

経口投与用製剤はDC−89化合物及び適当な賦形剤、崩
壊剤、結合剤、滑沢剤等を常法により混合、成型して錠
剤、粒剤、粉剤とすることにより製造する。

投与量は投与法、DC−89化合物の種類、年齢、症状等
により異なるが、一般的には人を含む哺乳動物に対し１
日あたりDC−89化合物として、0.5〜7.5mg/60kgが適当
である。

次に本発明の実施例をあげる。実施例中のDC−89化合
物の動向は、バチルス・スブチリスNo.10707を用いるバ
イオアッセイ、または薄層クロマトグラフィー又は高速
液体クロマトグラフィーにおける各DC−89化合物の紫外
部吸収を目安にして追跡した。

実施例１種菌としてストレプトマイセス・リディカス DO−89
（FERM BP−988）を用いる。該菌株を２容量の三角フ
ラスコ中の種培地〔可溶性デンプン25g/、グルコース
5g/、酵母エキス1g/、ペプトン−Ａ（極東製薬社
製）10g/、炭酸カルシウム1g/、殺菌前pH7.2〕200m
lに植菌し、28℃で48時間振盪（200rpm）培養した。

かくして得られた種培養液を30容量のジャーファー
メンター中の上記種培地と同一組成の培地15に５％
（容量）の割合で移し、28℃で24時間攪拌方式（回転数
200rpm、通気量15／分）により培養を行った。かくし
て得られた培養液を200容量のタンクファーメンター
中の下記組成の発酵培地150に10％（容量）の割合で
移し、28℃で通気攪拌方式（回転数200rpm、通気量15
／分）により培養を行った。

発酵培地組成：マルトース50g/、ドライイースト15g/
、エビオス（朝日麦酒社製）25g/、KCl 10g/、K
H₂PO₄ 0.5g/、MgSO₄・7H₂O 0.5g/、炭酸カルシウ
ム5g/（殺菌前pH5.0、6NH₂SO₄にて調整）培養中培地のpHは制御しないで、100時間培養した。培
養物より菌体および沈殿物を別し、液100を得
た。一方、菌体および沈殿物は、ｎ−プロパノール50
を加え充分に攪拌後、過し、ｎ−プロパノール抽出液
45を得た。培養液およびｎ−プロパノール抽出液を
合わせて（合計140）、ダイアイオンHP−20（三菱化
成社製）５に通塔して活性物質を吸着させた。水およ
び70％メタノール水溶液で順次洗浄し、ついでメタノー
ルで溶出した。メタノール溶出画分を濃縮し、酢酸エチ
ル10で抽出した。酢酸エチル抽出液を濃縮後、ｎ−ヘ
キサンを加えるとDC−89A2の粗粉末が得られた。DC−89
A2の粗粉末をメタノールから再結晶することにより純粋
なDC−89A2を1g得た。得られたDC−89A2の理化学的性
質、抗菌活性、抗腫瘍活性は前記のとおりである。

実施例２実施例１において発酵培地を次のものに代えて行う以
外は実施例１と同様に培養を行った。

発酵培地組成：マルトース50g/、ドライイースト15g/
、エビオス（朝日麦酒社製）25g/、KBr 10g/、K
H₂PO₄ 0.5g/、MgSO₄・7H₂O 0.5g/、炭酸カルシウ
ム5g/（殺菌前pH5.0、6NH₂SO₄にて調整）得られた培養物を12N−HClでpH4.5に調整後菌体およ
び沈殿物を別し、液100を得た。一方、菌体およ
び沈殿物は、ｎプロパノール50を加え充分に攪拌後、
過し、ｎ−プロパノール抽出液45を得た。溶媒液
およびｎ−プロパノール抽出液を合わせて（合計140
）、ダイアイオンHP−20（三菱化成社製）５に通塔
して活性物質を吸着させた。水および70％メタノールで
順次洗浄し、ついでメタノールで溶出し、DC−89B1を含
むメタノール溶出画分とDC−89B2を含むメタノール溶出
画分を得た。DC−89B1を含むメタノール溶出画分は濃縮
後、ダイアイオンHP−20SS（三菱化成社製）200mlに通
塔し、pH4.0の80％メタノール水溶液で溶出した。DC−8
9B1を含む溶出画分を濃縮し、酢酸エチルで抽出した。
酢酸エチル抽出液を濃縮後、ｎ−ヘキサンを加えて、純
粋なDC−89B1 0.5gを得た。得られたDC−89B1の理化学
的性質、抗菌活性、抗腫瘍活性は前記の通りである。

DC−89B2を含むメタノール溶出画分は濃縮後、ダイア
イオンHP−20SS（三菱化成社製）500mlに通塔し、pH4.0
の85％メタノール溶液で溶出した。DC−89B2を含む溶出
画分を濃縮し、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出
液を濃縮後、ｎ−ヘキサンを加えて、DC−89B2の粗粉末
を得た。得られたDC−89B2の粗粉末をメタノールより再
結晶して、純粋なDC−89B2 1.5gを得た。得られたDC−
89B2の理化学的性質、抗菌活性、抗腫瘍活性は前記の通
りである。

実施例３ DC−88A 30mgをアセトニトリル2mlと0.1Mクエン酸緩
衝液（pH5）2mlに溶解し、塩化カリウム44mgを加え、室
温で７時間40分攪拌した。反応液をそのまま、高速液体
クロマトグラフィー（カラム:Nucleosil C₁₈ φ20mm×2
50mm,50％アセトニトリル−水 10ml/分で溶出）で精製
してDC−89A1 5.3mg（収率16.5％）、DC−89A2 24.2m
g（収率75.3％）を得た。

発明の効果本発明により、抗菌活性及び抗腫瘍活性を有するDC−
89化合物が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図はDC−89A2の紫外部吸収スペクトル（メタノール
溶液）を示す。第２図はDC−89A2の赤外部吸収スペクト
ル（KBr打錠）を示す。第３図はDC−89B1の紫外部吸収
スペクトル（メタノール溶液）を示す。第４図はDC−89
B1の赤外部吸収スペクトル（KBr打錠）を示す。第５図
はDC−89B2の紫外部吸収スペクトル（メタノール溶液）
を示す。第６図はDC−89B2の赤外部吸収スペクトル（KB
r打錠）を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者斉藤博満神奈川県相模原市東渕野辺２―20―10 (72)発明者河西政次神奈川県藤沢市鵠沼松ケ岡３―12―15 (72)発明者佐野浩東京都町田市玉川学園７―19―16 (72)発明者安澤亨神奈川県横浜市緑区十日市場町832 審査官谷口博

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】式で表される化合物、DC−88Aを臭化水素酸と反応させる
か又はpH3〜６の緩衝液中で、MBr_n（式中、Ｍはリチウ
ム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウ
ム、アルミニウム、亜鉛、銅を表わし、ｎは１〜３の整
数である。）で表わされる化合物と反応させることを特
徴とする式（式中、Ｘは単結合または−CH₂−であり、Ｘが単結合
の場合ＹはCH₂Brであり、Ｘが−CH₂−の場合ＹはBrであ
る。）で表わされる新規DC−89化合物の製造法。
【請求項２】式（式中、Ｘは単結合または−CH₂−であり、Ｘが単結合
の場合ＹはCH₂Brであり、Ｘが−CH₂−の場合ＹはBrであ
る。）で表わされる新規DC−89化合物。