CN118103405A

CN118103405A - 可激活多肽复合物

Info

Publication number: CN118103405A
Application number: CN202280069525.3A
Authority: CN
Inventors: L·M·布斯塔尼; M·M·帕德洪加特; E·A·M·福克斯; S·米特拉; W·M·卡瓦诺; R·布里安特; J·L·史蒂文斯
Original assignee: Emgen Ltd; Cytomx Therapeutics Inc
Current assignee: Emgen Ltd; Cytomx Therapeutics Inc
Priority date: 2021-10-15
Filing date: 2022-10-14
Publication date: 2024-05-28

Abstract

本公开涉及可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽复合物(HBPC)及其制备和使用方法。

Description

可激活多肽复合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2021年10月15日提交的美国临时申请号63/256,410以及2022年8月9日提交的美国临时申请号63/370,895的优先权权益，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。

对经由EFS-WEB以电子方式提交的序列表的引用

在本申请中提交的以电子方式提交的序列表(4681_001PC02_Seq listing_ST26.xml；大小：179,444字节；和创建日期：2022年10月13日)的内容以引用的方式整体并入本文。

技术领域

背景技术

肿瘤抗原特异性T细胞的产生和激活参与免疫介导的发育和抗肿瘤活性的控制。这需要多个T细胞共刺激受体和T细胞负调控因子或共抑制受体协同作用，以控制T细胞激活、增殖以及效应功能的获得或丧失。由于肿瘤细胞的多种免疫逃逸机制，所以肿瘤特异性T细胞反应在癌症患者中难以建立和维持。然而，人们已经尝试利用T细胞进行癌症治疗。此类方法包括使用T细胞接合双特异性抗体，所述抗体结合癌细胞上的表面靶抗原和T细胞上的T细胞表面抗原(如CD3)两者。一般来说，通过结合每个靶标，T细胞接合双特异性抗体(bispecifics)使T细胞与癌细胞保持紧密物理接近，并允许T细胞蛋白和酶攻击肿瘤细胞并引起细胞凋亡，从而杀死癌细胞。

表皮生长因子受体(EGFR)(一种表现出内在酪氨酸激酶活性的受体和跨膜糖蛋白)调控许多细胞过程，包括但不限于控制细胞增殖、分化、细胞存活、细胞凋亡、血管生成、有丝分裂发生和转移的信号转导途径的激活(Atalay等人,Ann.Oncology 14:1346-1363(2003)；Tsao和Herbst,Signal 4:4-9(2003)；Herbst和Shin,Cancer 94:1593-1611(2002)；Modjtahedi等人,Br.J.Cancer 73:228-235(1996))。EGFR的过表达与多种人类癌症相关，包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌。EGFR在正常组织细胞中的表达水平也低于在恶性细胞中的表达水平。

接合EGFR和CD3的双特异性抗体具有缺点，包括T细胞介导的毒性(即细胞因子释放)和由于脱肿瘤(offtumor)结合所致的EGFR相关毒性。此外，由于双特异性抗体的复杂结构以及制造和放大过程中的高水平聚集，带来了制造挑战。因此，需要具有改进的安全性特征以及改进的可制造性的免疫治疗选择。

发明内容

本公开提供了一种可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽复合物(HBPC)，其包含：(a)第一多肽，所述第一多肽包含(i)单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含第一重链可变结构域(VH1)和第一轻链可变结构域(VL1)，其中所述VH1和所述VL1一起形成特异性结合CD3多肽的T细胞分化簇(CD3)靶向结构域，(ii)第一掩蔽部分(MM1)，(iii)第一可裂解部分(CM1)，(iv)第二重链可变结构域(VH2)，和(v)第一单体Fc结构域(Fc1)；(b)第二多肽，所述第二多肽包含(i)第二轻链可变结构域(VL2)，其中所述VH2和所述VL2一起形成特异性结合EGFR的EGFR靶向结构域，(ii)第二掩蔽部分(MM2)，和(iii)第二可裂解部分(CM2)；以及(c)第三多肽，所述第三多肽(i)包含第二单体Fc结构域(Fc2)，并且(ii)不包含免疫球蛋白可变结构域。在一些方面，CD3多肽是CD3的ε链。

在本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，VH1包含：(i)包含氨基酸序列KYAMN(SEQ ID NO:3)的VH CDR1，(ii)包含氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:4)的VH CDR2，和(iii)包含氨基酸序列HGNFGNSYISYWAY(SEQ ID NO:5)的VH CDR3；并且其中VL1包含：(i)包含氨基酸序列GSSTGAVTSGNYPN(SEQ IDNO:6)的VL CDR1，(ii)包含氨基酸序列GTKFLAP(SEQ ID NO:7)的VL CDR2，和(iii)包含氨基酸序列VLWYSNRWV(SEQ ID NO:8)的VL CDR3。

在一些方面，scFv包含具有与SEQ ID NO:9至少90％同一的氨基酸序列的VH1和/或具有与SEQ ID NO:10至少90％同一的氨基酸序列的VL1。在一些方面，scFv包含具有SEQID NO:9的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL1。

在本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，VH2包含：(i)包含氨基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:15)的VH CDR1，(ii)包含氨基酸序列VIWSGGNTDYNTPFTS(SEQ ID NO:16)的VHCDR2，和(iii)包含氨基酸序列ALTYYDYEFAY(SEQID NO:17)的VH CDR3。在一些方面，VH2包含与SEQ ID NO:21至少90％同一的氨基酸序列。在一些方面，VH2包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

在本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，Fc1包含与SEQ ID NO:23至少90％同一的氨基酸序列。在一些方面，Fc1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。

在本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，第一多肽还包含在VH2与Fc1之间的重链CH1结构域。在一些方面，第一多肽还包含在VH2与Fc1之间的免疫球蛋白铰链区。在一些方面，第一多肽从氨基末端至羧基末端包含以下结构排列：MM1-CM1-scFv-VH2-CH1-铰链区-Fc1，其中每个“-”独立地为直接或间接键联。

在本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，第一多肽包含一个或多个接头。在一些方面，接头包含约1至约20个氨基酸。

在本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，VL2包含(i)包含氨基酸序列RASQSIGTNIH(SEQ ID NO:18)的VL CDR1，(ii)包含氨基酸序列YASESIS(SEQ ID NO:19)的VL CDR2，和(iii)包含氨基酸序列QQNNNWPTT(SEQ ID NO:20)的VL CDR3。在一些方面，VL2包含与SEQ ID NO:22至少90％同一的氨基酸序列。在一些方面，VL2包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。

在本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，第二多肽从氨基末端至羧基末端包含以下结构排列：MM2-CM2-VL2，其中每个“-”独立地为直接或间接键联。在一些方面，第二多肽包含一个或多个接头。在一些方面，接头包含约1至约20个氨基酸。

在本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，Fc2结合至Fc1。在一些方面，Fc2包含与SEQ ID NO:28至少90％同一的氨基酸序列。在一些方面，Fc2包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一些方面，Fc2包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列。

在本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，第一多肽和第三多肽中的至少一个还包含免疫球蛋白铰链区。在一些方面，第一多肽和第三多肽包含免疫球蛋白铰链区。在一些方面，第一多肽的免疫球蛋白铰链区和第三多肽的免疫球蛋白铰链区包含相同的氨基酸序列。在一些方面，第一多肽的免疫球蛋白铰链区和第三多肽的免疫球蛋白铰链区包含不同的氨基酸序列。

在本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，第三多肽包含从氨基末端至羧基末端呈以下结构排列的免疫球蛋白铰链区：铰链区-Fc2。

在本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，第一、第二和/或第三多肽包含一个或多个接头。在一些方面，MM1经由接头L1连接至CM1。在一些方面，MM2经由接头L2连接至CM2。在一些方面，L1和L2的氨基酸序列相同。在一些方面，L1和L2的氨基酸序列不同。

在本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，CM1和CM2各自包含存在于患有癌症的受试者的肿瘤微环境中的蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM1和CM2各自包含相同蛋白酶的底物。在一些实施方案中，CM1和CM2包含不同蛋白酶的底物。在一些方面，CM1和CM2各自独立地包含选自表2中所示的蛋白酶的组的蛋白酶的底物。在一些方面，CM1和CM2中的至少一个包含丝氨酸蛋白酶或基质金属肽酶(MMP)的底物。在一些方面，CM1包含氨基酸序列SEQ ID NO:2和/或CM2包含氨基酸序列SEQ ID NO:14。在一些方面，CM1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些方面，CM2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。

在本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，MM1和/或MM2包含约5个氨基酸至约40个氨基酸。在一些方面，MM1选自由以下组成的组：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71或SEQ IDNO:72。在一些方面，MM2包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些方面，其中MM1包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列。

在本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，一个或多个接头中的至少一个选自由以下组成的组：(i)选自由以下组成的组的基于甘氨酸-丝氨酸的接头：(GS)n，其中n是至少1的整数，(GGS)n，其中n是至少1的整数(例如，约1至约20或约1至约10的整数)，(GGGS)n(SEQ ID NO:40)，其中n是至少1的整数(例如，约1至约20或约1至约10的整数)，(GGGGS)n(SEQ ID NO:126)，其中n是至少1的整数(例如，约1至约20或约1至约10的整数)，(GSGGS)n(SEQ ID NO:41)，其中n是至少1的整数(例如约1至约20或约1至约10的整数),GSSGGSGGSG(SEQ ID NO:12)，GGSG(SEQ ID NO:42)，GGSGG(SEQ ID NO:43)，GSGSG(SEQ ID NO:44)，GSGGG(SEQ ID NO:45)，GGGSG(SE Q ID NO:46)和GSSSG(SEQ IDNO:47)，GGGGSGGGGSGGGGS GS(SEQ ID NO:48)，GGGGSGS(SEQ ID NO:49)，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:50)，GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:51)，GGGGS(SEQ ID NO:52)，GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:53)，GGGS(SEQ ID NO:54)，GGGSGGGS(SEQ ID NO:55)，GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:56)，GSSGGSGGSGG(SEQ ID N O:57)，GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:58)，GG GSSGGS(SEQ ID NO:127)和GS；(ii)选自由以下组成的组的包含甘氨酸和丝氨酸以及赖氨酸、苏氨酸或脯氨酸中的至少一者的接头：G STSGSGKPGSSEGST(SEQ ID NO:59)、SKYGPPCPPCPAPEFLG(SEQ ID NO:60)、GGSLDPKGGGGS(SEQ ID NO:61)、PKSCDKT HTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO:62)、GKSSGSGSESKS(SEQ ID N O:63)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:64)、GSTSGSGKSSEGS GSTKG(SEQ ID NO:65)和GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID N O:66)。

在本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，(1)第一多肽包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，(2)第二多肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，并且(3)第三多肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。

在本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，(1)第一多肽包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列，(2)第二多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且(3)第三多肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。

本文公开了一种药物组合物，所述药物组合物包含本文公开的可激活双特异性多肽复合物和药学上可接受的载体。

本文还公开了一种包含药物组合物的药盒，所述药物组合物包含本文公开的可激活双特异性多肽复合物和药学上可接受的载体。

本文还公开了一种核酸，所述核酸包含编码本文所述的可激活双特异性多肽的第一多肽、第二多肽和第三多肽的核苷酸序列。本文进一步提供了包含所述核酸的载体和包含所述载体的宿主细胞。

本文还公开了一种产生可激活双特异性多肽复合物的方法，所述方法包括：(a)在足以产生所述可激活双特异性多肽复合物的条件下在液体培养基中培养宿主细胞；和(b)回收所述可激活双特异性多肽复合物。

本文还公开了一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的可激活双特异性多肽复合物或本文所述的药物组合物。在一些方面，受试者是人。在一些方面，疾病是癌症。在一些方面，可激活双特异性多肽或药物组合物用于抑制有需要的受试者中的肿瘤生长。

本文还公开了本文所述的可激活双特异性多肽复合物或本文所述的药物组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。

附图说明

图1是本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽复合物(HBPC)的示意图。

图2A示出CI106(可激活双臂、二价抗CD3、抗EGFR双特异性抗体对照)、复合物-57(可激活HBPC)和复合物-67(可激活HBPC)以及激活的CI106、激活的复合物-57和激活的复合物-67与EGFR的结合。

图2B示出CI106(对照)、复合物-57(可激活HBPC)、复合物-67(可激活HBPC)以及激活的CI106、激活的复合物-57和激活的复合物-67与CD3的结合。

图3A示出用激活的CI106(对照)、复合物-57和复合物-67、以及CI106(双臂、二价双特异性对照构建体)和复合物-57治疗后对HT29细胞的细胞毒性。

图3B示出用CI106(对照)、复合物-67、激活的CI106(对照)和激活的复合物-67治疗后对HT29细胞的细胞毒性。

图4示出用媒介物、1.0mg/kg CI106(对照)以及0.2、0.6和1.8mg/kg复合物-67治疗后，HT29-luc2异种移植肿瘤模型中随时间变化的肿瘤体积。

图5示出用媒介物、0.3mg/kg和1mg/kg激活的复合物-67和复合物-67治疗后，HCT116异种移植肿瘤模型中随时间变化的肿瘤体积。

图6示出CI106(对照)、复合物-57和复合物-67的单体百分比(％)对比浓度。

图7A-7C示出CI107与在HT29细胞(A)、HCT116细胞(B)或Jurkat细胞(C)表面上表达的EGFR和CD3的结合的流式细胞术评估。表观Kd是通过HT29细胞中的一式两份实验和Jurkat细胞中的一式三份实验计算的。

图8A-8D示出HCT116-Luc2细胞(A，C)和HT29-Luc2细胞(B，D)中由CI107介导的细胞毒性百分比。培养48小时后，测量相对于未处理的对照(A，B)的HCT116-Luc2或HT29Luc2细胞活力和细胞毒性。培养16小时后，通过流式细胞术测量CD69表达。MFI，平均荧光强度(C，D)。

图9A-9E示出培养16小时后测量的用CI107处理后的细胞因子释放。(A)IFN-γ，(B)IL-2，(C)IL-6，(D)MCP-1和(E)TNF-α。

图10A-10B示出在携带HT29-Luc2肿瘤并移植有人PBMC的小鼠中，用测试TCB治疗后的肿瘤体积。(A)用媒介物(PBS)或0.3mg/kg CI020、CI011、CI040或CI048每周一次治疗小鼠，持续3周(每组n＝8)。每周两次测量肿瘤体积。(B)用媒介物或1mg/kg的CI020、CI011、CI040或CI048治疗携带HT29-Luc2肿瘤并移植有人PBMC的NSG小鼠。给药后7天收获肿瘤，并进行CD3的免疫组织化学。深色染色指示CD3+细胞。

图11A-11B示出在HT29(A)和HCT116(B)异种移植肿瘤中，用CI107每周一次治疗持续3周后的肿瘤体积。每周两次测量肿瘤体积。*p<0.5；**p<0.01；****p<0.0001。

图12A-12B示出在给予CI107后8小时测量的IL-6(A)和IFN-γ(B)的水平。

图12C示出在给予CI107后48小时通过血清化学分析测量的天冬氨酸转氨酶(AST)的水平(C)。

图12D示出使用抗独特型捕获和抗人Fc检测通过ELISA测量的Act-CI107和CI107的血浆浓度。CI107线代表来自给予2.0mg/kg CI107的3只个体动物的数据；Act-TCB线代表给予0.06mg/kg或0.18mg/kg Act-TCB的单个动物。

具体实施方式

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所用，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下文所述的含义。另外的定义在整个本申请中阐述。

定义

如本文所用，术语“异源多聚体双特异性多肽复合物”和“HBPC”可互换使用，是指一起形成复合物的一组多肽，所述复合物具有能够结合至两个不同的生物靶标的结合结构域。

当与术语“异源多聚体双特异性多肽复合物”或“HBPC”结合使用时，术语“可激活”在本文中是指其结合活性因附加于HBPC的结构的掩蔽部分的存在而受损的HBPC。术语“激活的”和“act-”均可用来指激活的HBPC。术语“激活的”和“未掩蔽的”在本文中可互换使用。

如本文所用，术语“EGFR”是指受体和跨膜糖蛋白以及蛋白激酶超家族的成员。人表皮生长因子受体是由c-erb B-1原癌基因编码的170kDa跨膜受体，并且表现出内在酪氨酸激酶活性(Modjtahedi等人,Br.J.Cancer 73:228-235(1996)；Herbst和Shin,Cancer94:1593-1611(2002))。还存在EGFR的已知同种型和变体(例如，替代RNA转录物、截短型式、多态性等)，它们预期用于本文。EGFR通过酪氨酸激酶介导的信号转导途径调控许多细胞过程，包括但不限于控制细胞增殖、分化、细胞存活、细胞凋亡、血管生成、有丝分裂发生和转移的信号转导途径的激活(Atalay等人,Ann.Oncology 14:1346-1363(2003)；Tsao和Herbst,Signal 4:4-9(2003)；Herbst和Shin,Cancer 94:1593-1611(2002)；Modjtahedi等人,Br.J.Cancer 73:228-235(1996))。EGFR的过表达与多种人类癌症相关，包括膀胱癌、脑癌、头颈癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌和肾癌。EGFR在正常组织细胞中的表达水平也低于在恶性细胞中的表达水平。示例性抗EGFR抗原结合蛋白包括但不限于人野生型EGFR(NCBI登录号NG_007726.E)、人野生型EGFR转录物变体1(NCBI登录号NP_005219.2)、人野生型EGFR转录物变体2(NCBI登录号NP_958439.1)、人野生型EGFR转录物变体3(NCBI登录号NP_958440.1)、人野生型EGFR转录物变体4(NCBI登录号NP_958441.1)、人野生型EGFR转录物变体5(NCBI登录号NP_001333826.1)、人野生型EGFR转录物变体6(NCBI登录号NP_001333827.1)、人野生型EGFR转录物变体7(NCBI登录号NP_001333828.1)、人野生型EGFR转录物变体8(NCBI登录号NM_001346941.2)、人野生型EGFR转录物变体EGFRvIII(NCBI登录号NP_001333870.1)等。

如本文所用的术语“CD3”或“分化簇3”是指作为T细胞受体复合物的亚基的六条链的蛋白质复合物。(Janeway等人,第166页,第9版)TCRα:β异二聚体与CD3亚基缔合以完成TCR细胞表面抗原受体。两条CD3ε链、一条CD3γ链和一条CD3δ链以及多条CD3ζ链的同二聚体构成T细胞受体复合物，所述复合物参与识别与I和II类主要组织相容性复合物结合的肽，并涉及T细胞激活。CD3抗原由成熟T淋巴细胞和胸腺细胞亚群表达。本文公开的特异性结合CD3多肽的CD3靶向结构域可来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。所述术语涵盖“全长”未加工的CD3(例如，未加工的或未修饰的CD3ε或CD3γ)以及由细胞中的加工产生的任何形式的CD3。所述术语还涵盖CD3的天然存在的变体，包括例如剪接变体或等位基因变体。本文所述的抗CD3靶向结构域可特异性结合至人野生型CD3E(NCBI登录号NM_000733.3)。

如本文所用的术语“T细胞”被定义为参与多种细胞介导的免疫反应的胸腺来源的淋巴细胞。如本文所用的术语“调控性T细胞”

是指CD4⁺CD25⁺FoxP3⁺细胞。“Treg”是本文中使用的调控性T细胞的缩写。

如本文所用的术语“辅助T细胞”是指CD4⁺T细胞；辅助T细胞识别与MHC II类分子结合的抗原。存在至少两种类型的辅助T细胞：Th1和Th2，它们产生不同的细胞因子。辅助T细胞在激活时变成CD25⁺，但仅短暂地变成FoxP3⁺。

如本文所用的术语“细胞毒性T细胞”是指CD8⁺T细胞；细胞毒性T细胞识别与MHC I类分子结合的抗原。

术语“可变区”或“可变结构域”是指参与抗原结合蛋白(例如抗体)与抗原结合的抗原结合蛋白(例如抗体)重链或轻链的结构域。抗原结合蛋白如抗体的重链和轻链的可变区或结构域(分别VH和VL)可进一步细分为高变区(regions of hypervariability)(或高变区(hypervariable region)，其在序列方面可以是高变的和/或形成结构上确定的环)，如高变区(HVR)或互补决定区(CDR)，其间散布着更保守的区域，称为框架区(FR)。一般而言，每个重链可变区中存在3个HVR(HVR-H1、HVR-H2、HVR-H3)或CDR(CDRH1、CDR-H2、CDR-H3)，并且每个轻链可变区中存在3个HVR(HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3)或CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本领域已知“框架区”和“FR”是指重链和轻链的可变区的非HVR或非CDR部分。一般而言，每个全长重链可变区中存在4个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且每个全长轻链可变区中存在4个FR(FR-L1、FR-L2、FRL3和FR-L4)。在每个VH和VL内，三个HVR或CDR和四个FR通常按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列：在HVR的情况下FR1、HVR1、FR2、HVR2、FR3、HVR3、FR4，或在CDR的情况下FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(还参见Chothia和LeskJ.Mot.Biol.,195,901-917(1987))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可使用来自结合所述抗原的抗体的VH或VL结构域来分离以分别筛选互补VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。

如本文所用的术语“重链可变区”(VH)是指包含重链HVR-H1、FR-H2、HVR-H2、FR-H3和HVR-H3的区域。例如，重链可变区可包含重链CDR-H1、FR-H2、CDR-H2、FRH3和CDR-H3。在一些方面，重链可变区还包含FR-H1的至少一部分和/或FR-H4的至少一部分。

如本文所用的术语“重链恒定区”是指包含至少三个重链恒定结构域C_H1、C_H2和C_H3的区域。非限制性的示例性重链恒定区包括γ、δ和α。非限制性的示例性重链恒定区还包括ε和μ。

如本文所用的术语“轻链可变区”(VL)是指包含轻链HVR-L1、FR-L2、HVR-L2、FR-L3和HVR-L3的区域。在一些方面，轻链可变区包含轻链CDR-L1、FR-L2、CDR-L2、FR-L3和CDR-L3。在一些方面，轻链可变区还包含FR-L1和/或FR-L4。

如本文所用的术语“轻链恒定区”是指包含轻链恒定结构域C_L的区域。非限制性的示例性轻链恒定区包括λ和κ。

如本文所用的术语“轻链”(LC)是指包含至少轻链可变区的有或无前导序列的多肽。在一些方面，轻链包含轻链恒定区的至少一部分。如本文所用的术语“全长轻链”是指包含轻链可变区和轻链恒定区的有或无前导序列的多肽。

术语“抗体”是指免疫球蛋白分子或免疫球蛋白(IG)分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原(与抗原免疫反应)的抗原结合位点的分子。抗体或多肽的“抗原结合部分”(也称为“抗原结合片段”)是指特异性结合至靶抗原的抗体或多肽的一个或多个部分。抗体和抗原结合部分包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、结构域抗体、单链抗体、Fab和F(ab′)₂片段、scFv、Fd片段、Fv片段、单结构域抗体(sdAb)片段、双重亲和力重靶向抗体(DART)、双重可变结构域免疫球蛋白；分离的互补决定区(CDR)，和可任选地通过合成接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合，以及Fab表达文库。非人抗体(例如骆驼科抗体)可通过重组方法人源化以降低其在人中的免疫原性。

本文指定的CDR序列根据如Abhinandan,K.R.和Martin,A.C.R.(2008)"Analysisand improvements to Kabat and structurally correct numbering of antibodyvariabledomains",Molecular Immunology,45,3832-3839中所描述的Kabat编号系统(即，“Kabat CDR”)确定，所述文献以引用的方式整体并入本文。Kabat CDR被定义为CDR-L1：残基L24-L34；CDR-L2：残基L50-L56；CDR-L3：残基L89-L97；CDR-H1：残基H31-H35；CDR-H2：残基H50-H65；和CDR-H3：残基H95-H102，其中“L”是指轻链可变结构域，并且“H”是指重链可变结构域。

“特异性结合”或“免疫特异性结合”意指靶向结构域、抗体或抗原结合片段与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应，并且不与其它多肽反应或以低得多的亲和力结合(Kd>10^-6)，其中较小的Kd表示较大的亲和力。可使用本领域中熟知的方法来定量选定多肽的免疫结合性质。一种这样的方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合配偶体的浓度、相互作用的亲和力以及在两个方向上同等地影响速率的几何参数。因此，可通过计算浓度以及缔合和解离的实际速率来确定“缔合速率常数”(k_on)和“解离速率常数”(k_off)。(参见Nature 361:186-87(1993))。k_off/k_on的比率能够取消与亲和力无关的所有参数，并且等于解离常数Kd。(总体上参见，Davies等人(1990)AnnualRev Biochem 59:439-473)。在一些方面，特异性结合至其相应抗原的抗原靶向结构域、抗体或抗原结合片段相对于靶抗原表现出小于约10μM、并且在一些方面小于约100μM的Kd。

免疫球蛋白可源自任何公知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员众所周知的，并且包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别或亚类(例如IgM或IgG1)。

“抗抗原”抗体或多肽是指特异性结合至抗原的抗体或多肽。例如，抗CD3多肽特异性结合至CD3。

如本文所用，术语“MM”和“掩蔽部分”可互换使用，是指干扰靶向结构域与其相应抗原的结合的肽。例如，MM1是干扰第一靶向结构域与第一靶标的结合的肽，并且MM2是干扰第二靶向结构域与第二靶标的结合的肽。掩蔽部分干扰靶向结构域与其相应靶标的结合的程度通过其“掩蔽效率”来定量。术语“掩蔽效率”和“ME”在本文中可互换使用，是指如下确定的比率：

如本文所用，术语“CM”和“可裂解部分”可互换使用，是指易于被肿瘤细胞中上调的蛋白酶裂解的肽底物。蛋白酶介导的CM裂解导致MM从可激活HBPC的结构中释放，从而生成“激活的”(即，未掩蔽的)产物，其中每个相应的“激活的”(即，未掩蔽的)第一和/或第二靶向结构域自由结合至其各自的靶标。

如本文所用的术语“分离的多核苷酸”是指重组多核苷酸或合成来源的多核苷酸，所述“分离的多核苷酸”根据其来源(1)不与“分离的多核苷酸”见于自然界中所处的多核苷酸的全部或一部分缔合，(2)可操作地连接至其在自然界中不连接的多核苷酸，或(3)不作为较大序列的一部分存在于自然界中。根据本公开的多核苷酸包括编码第一、第二和第三多肽的核酸分子。

如本文所用的术语“可操作地连接”是指所描述的组分的位置处于允许它们以其预期的方式起作用的关系。“可操作地连接”至编码序列的控制序列是以使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达的方式连接。

如本文所论述，本文所述的氨基酸序列(即，每个参考序列)中的微小变化被认为涵盖在本公开中，条件是所得的类似物序列保持与参考序列的至少75％、更优选至少80％、90％、95％且最优选99％序列同一性。特别地，考虑保守性氨基酸置换。保守性置换是在就其侧链的性质而言相关的氨基酸家族内发生的那些置换。氨基酸可分成以下家族：(1)酸性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸；(2)碱性氨基酸是赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性氨基酸是丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；并且(4)不带电荷的极性氨基酸是甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。亲水性氨基酸包括精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸以及苏氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。其它氨基酸家族包括(i)丝氨酸和苏氨酸，它们是脂肪族-羟基家族；(ii)天冬酰胺和谷氨酰胺，它们是含有酰胺的家族；(iii)丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸，它们是脂族家族；以及(iv)苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，它们是芳香族家族。例如，在本文所述的HBPC多肽和多肽复合物中，合理地预期用异亮氨酸或缬氨酸分离置换亮氨酸、用谷氨酸分离置换天冬氨酸、用丝氨酸分离置换苏氨酸或用结构上相关的氨基酸类似地置换氨基酸将不会对所得分子的结合或性质具有重大影响，特别是在置换不涉及CDR或框架区内的氨基酸的情况下。氨基酸变化是否产生功能性多肽复合物可通过测定所得分子(即所得类似物序列)的特异性活性容易地确定。测定在本文中详细描述。类似物的优选的氨基和羧基末端出现在功能结构域的边界附近。可通过将核苷酸和/或氨基酸序列数据与公开或专有序列数据库进行比较来鉴定结构性和功能性结构域。优选地，计算机化的比较方法用于鉴定在具有已知结构和/或功能的其它蛋白质中出现的序列基序或预测的蛋白质构象结构域。用于鉴定折叠成已知三维结构的蛋白质序列的方法是已知的。Bowie等人Science 253:164(1991)。因此，前述实例证明，根据本公开，本领域的技术人员可识别可用于定义结构性和功能性结构域的序列基序和结构构象。

保守性氨基酸取代不应实质上改变参考序列的结构特征(例如，置换氨基酸不应倾向于打断参考序列中存在的螺旋，或破坏表征参考序列的其它类型的二级结构)。本领域公认的多肽二级结构和三级结构的实例描述于Proteins,Structures and MolecularPrinciples(Creighton编辑,W.H.Freeman and Company,New York(1984))；Introductionto Protein Structure(C.Branden和J.Tooze编辑,Garland Publishing,New York,N.Y.(1991))；和Thornton等人Nature 354:105(1991)中。

示例性氨基酸取代还包括以下的那些：(1)降低可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽中除包含CM的可裂解接头中以外的区域中对蛋白水解的易感性，(2)降低对氧化的易感性，(3)改变用于形成蛋白质复合物的结合亲和力，(4)改变与抗原的结合亲和力，以及(4)赋予或修改此类类似物的其它物理化学或功能性质。此类氨基酸取代可使用已知的诱变方法和/或定向分子进化方法使用本文所述的测定来鉴定。参见例如，国际公布号WO 2001/032712、美国专利号7,432,083、美国公布号2004/0180340和美国专利号6,297,053，其各自以引用的方式并入本文。类似物可通过在可激活HBPC内的参考序列中引入一个或多个突变来制备。例如，单个或多个氨基酸取代可在参考序列中进行(优选在形成分子间接触的结构域外部的多肽部分中进行)。

如本文所用，“药学上可接受的”或“药理学上相容的”意指不是生物学上或其它方面不希望的材料，例如，所述材料可掺入施用于个体或受试者的药物组合物中而不会引起任何显著的不希望的生物作用或以有害的方式与含有其的组合物的任何其它组分相互作用。药学上可接受的载体或赋形剂例如满足了毒理学和制造测试所要求的标准，和/或包括在由美国食品与药品管理局制定的非活性成分指南(Inactive Ingredient Guide)中。

如本文所用的“患者”包括患有癌症的任何患者。术语“受试者”和“患者”可在本文中互换使用。

术语“癌症”、“癌性”或“恶性”是指或描述哺乳动物中通常特征在于细胞生长不受调控的生理疾患。癌症的实例包括例如黑素瘤如不可切除的或转移性黑素瘤、白血病、淋巴瘤、母细胞瘤、癌和肉瘤。此类癌症的更具体实例包括慢性髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、费城染色体阳性急性淋巴母细胞性白血病(Ph+ALL)、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性胶质母细胞瘤、宫颈癌、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、和头颈癌、胃癌、生殖细胞肿瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤细胞、多发性骨髓瘤、急性髓细胞性白血病(AML)和慢性淋巴细胞性白血病(CML)。

如本文所用的术语“肿瘤”是指由过度细胞生长或增殖产生的任何组织块，良性(非癌性)或恶性(癌性)，包括癌前病变。

“施用”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将包含治疗剂的组合物物理引入至受试者。本文公开的制剂的施用途径包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。如本文所用的短语“肠胃外施用”意指除经肠和局部施用以外的施用模式，通常通过注射进行，并且包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴管内、病灶内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注以及体内电穿孔。在一些方面，制剂通过非肠胃外途径施用，在一些方面口服施用。其它非肠胃外途径包括局部、表皮或粘膜施用途径，例如鼻内、经阴道、经直肠、舌下或局部施用。施用还可一次、多次、和/或在一个或多个延长时间段内进行。

受试者的“治疗”或“疗法”是指对受试者进行的任何类型的干预或处理或向受试者施用活性剂，目的为逆转、缓解、改善、抑制、减慢与疾病相关的症状、并发症或疾患或生化指标的进展、发展、严重程度或复发。

如本文所用，“有效治疗”是指产生有益作用，例如改善疾病或病症的至少一种症状的治疗。有益作用可呈相对于基线的改善的形式，即，相对于在根据方法开始治疗之前所得的测量值或观察结果的改善。有益作用还可呈以下形式：遏制、减缓、延迟或稳定肿瘤标志物的不良进展。有效治疗可指缓解与癌症相关的至少一种症状。这种有效治疗可例如减轻患者疼痛，减小病灶的尺寸和/或数量，可减少或预防肿瘤的转移，和/或可减缓肿瘤生长。

术语“有效量”是指提供所需的生物、治疗和/或预防结果的剂的量。结果可以是疾病的病征、症状或病因中的一个或多个的减少、改善、缓和、减轻、延迟和/或缓解，或生物系统的任何其它所需的改变。关于实体瘤，有效量包括足以引起肿瘤收缩和/或使肿瘤的生长速率降低(诸如抑制肿瘤生长)或延迟其它不希望的细胞增殖的量。在一些方面中，有效量是足以预防或延迟肿瘤复发的量。有效量可以一次或多次施用来施用。有效量的药物或组合物可：(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤尺寸；(iii)抑制、延迟、在一定程度上减缓并且可停止癌细胞浸润到外周器官中；(iv)抑制、在一定程度上减缓并且可停止肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)预防或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。

“免疫反应”是指免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞)以及由任何这些细胞或肝脏、脾脏和/或骨髓产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用导致侵入病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或其它异常细胞、或者在自身免疫性或病理性炎症的情况下正常人细胞或组织的选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或从脊椎动物体内清除。

替代方案(例如“或”)的使用应理解为表示替代方案中的一个、两个或其任何组合。如本文所用，不定冠词“一个/种(a/an)”应理解为指任何所叙述或列举的组分中的“一个/种或多个/种”。

当在本文中使用时术语“和/或”应被视为在有或没有另一者的情况下，对两种指定特征或组分中的每一者的具体公开。因此，如本文中诸如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”意图涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

应了解，本文无论在何处使用措辞“包含”来描述方面，均还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的其它类似方面。

术语“约”是指特定值或组合物的如由本领域普通技术人员所确定在可接受误差范围内的值或组合物，其将部分取决于如何测量或测定所述值或组合物，即测量系统的限制。举例而言，“约”或“基本上包含”可意指根据本领域中的惯例在1个或多于1个标准偏差以内。可替代地，“约”或“基本上包含”可意指至多10％或20％(即±10％或±20％)的范围。举例而言，约3mg可包括2.7mg与3.3mg(对于10％)之间或2.4mg与3.6mg(对于20％)之间的任何数字。此外，特别是关于生物系统或方法，所述术语可意指至多一个数量级或值的至多5倍。当本申请和权利要求书中提供特定值或组合物时，除非另外说明，否则“约”的含义应被假定为在所述特定值或组合物的可接受误差范围内。

如本文所述，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所叙述范围内的任何整数值以及，在适当时，其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)，除非另有说明。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本公开所相关领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。举例来说，the Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；TheDictionary of Cell and Molecular Biology,第5版,2013,Academic Press；以及theOxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,2006,OxfordUniversity Press为技术人员提供本公开中使用的许多术语的综合词典。

单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)接受的形式来表示。数值范围包括界定范围的数字。本文提供的标题不限制本公开的各种方面，所述方面可通过参考整个说明书得出。因此，通过参考说明书全文，更充分地定义了上文定义的术语。

本公开的可激活多肽的示意图(例如图1)不意图具有排他性。其它序列元件(诸如接头、间隔区和信号序列)可存在于此类示意图中列出的序列元件之前、之后或之间。还应了解，MM和CM可连接至抗体或多肽的VH而不是连接至抗体或多肽的VL，反之亦然。

本公开的多个方面更详细地描述于以下小节中。

可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽复合物

本公开提供了一种可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽(HBPC)，其包含：(a)第一多肽，所述第一多肽包含(i)单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含第一重链可变结构域(VH1)和第一轻链可变结构域(VL1)，其中所述VH1和所述VL1一起形成特异性结合CD3多肽的T细胞分化簇(CD3)靶向结构域，(ii)第一掩蔽部分(MM1)，(iii)第一可裂解部分(CM1)，(iv)第二重链可变结构域(VH2)，和(v)第一单体Fc结构域(Fc1)；(b)第二多肽，所述第二多肽包含(i)第二轻链可变结构域(VL2)，其中所述VH2和所述VL2一起形成特异性结合EGFR的EGFR靶向结构域，(ii)第二掩蔽部分(MM2)，和(iii)第二可裂解部分(CM2)；以及(c)第三多肽，所述第三多肽(i)包含第二单体Fc结构域(Fc2)，并且(ii)不包含免疫球蛋白可变结构域，并且其中所述MM1是干扰所述CD3靶向结构域与CD3多肽的结合的肽，并且MM2是干扰所述EGFR靶向结构域与EGFR的结合的肽。如本文实施例中所证明的，本公开的可激活HBPC提供优于本领域已知的可激活或掩蔽分子的优点，包括抗聚集性、低水平的浓度依赖性聚集(这在纯化期间特别有益，其中可产生相对高浓度的可激活HBPC产物)、激活时的高效力和改善的抗肿瘤活性(激活时)。

如本文上文所述，在可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的第一多肽中存在的组分中是T细胞CD3靶向结构域，所述T细胞CD3靶向结构域包含特异性结合CD3多肽的单链可变片段(scFv)。在一些方面，CD3多肽是CD3的ε链。在一些方面，本文采用的scFv(抗CD3 scFv)包含重链可变结构域(VH1)和轻链可变结构域(VL1)。

VH1包含可变重链CDR1(VH CDR1，本文也称为CDRH1)、可变重链CDR2(VH CDR2，本文也称为CDRH2)和可变重链CDR3(VH CDR3，本文也称为CDRH3)，VL1包含可变轻链CDR1(VLCDR1，本文也称为CDRL1)、可变轻链CDR2(VL CDR2，本文也称为CDRL2)和可变轻链CDR3(VLCDR3，本文也称为CDRL3)。

本文提供的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC包含掩蔽部分(MM)。如本文所用，术语“掩蔽部分”和“MM”可互换使用，是指当位于靶向结构域附近时干扰靶向结构域与其靶标的结合的肽。在一些方面，MM是与可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC偶联或以其它方式连接的氨基酸序列，并且连接至可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC，使得每个MM降低可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC特异性结合至其靶标的能力。在一些方面，MM1防止或降低可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC特异性结合至CD3的能力。在一些方面，MM2防止或降低可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC特异性结合至EGFR的能力。在一些方面，MM特异性结合至抗原靶向结构域。可使用多种已知技术中的任一种来鉴定适合的MM。

例如，适合与多种抗体结合结构域结合用于本公开的实践中的抗EGFR掩蔽部分包括本领域中已知的任何抗EGFR掩蔽部分，包括例如PCT公布号WO 2013/163631、WO 2015/013671、WO 2016/014974、WO 2019/075405和WO 2019/213444中描述的那些，其各自以引用的方式整体并入本文。适合用于本公开的实践中的抗CD3掩蔽部分包括本领域中已知的那些中的任一种，包括例如WO2013/163631、WO 2015/013671、WO 2016/014974、WO 2019/075405和WO 2019/213444中描述的那些，其各自以引用的方式整体并入本文。

在本文提供的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的一些方面，MM1和/或MM2包含5个氨基酸至约40个氨基酸或其间的任何范围，并且包括5个氨基酸和40个氨基酸两者。如本文所用，术语“MM1”表示CD3靶向结构域的掩蔽部分。如本文所用，术语“MM2”表示EGFR靶向结构域上的掩蔽部分。

在本文提供的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的一些方面，MMI选自由SEQ ID NO:1、67、68、69、70、71和72组成的组。在一些方面，MM1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。在一些方面，MM2包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些方面，MM1包含SEQ ID NO:1，并且MM2是SEQID NO:13。在一些方面，MM1包含SEQ ID NO:72，并且MM2包含SEQ ID NO:13。

在本公开的一些方面，单链可变片段包含重链可变结构域(VH1)，所述重链可变结构域包含：(i)包含氨基酸序列KYAMN(SEQ ID NO:3)的VH CDR1，(ii)包含氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:4)的VH CDR2，和(iii)包含氨基酸序列HGNFGNSYISYWAY(SEQ ID NO:5)的VH CDR3；和轻链可变结构域(VL1)，所述轻链可变结构域包含(i)包含氨基酸序列GSSTGAVTSGNYPN(SEQ ID NO:6)的VL CDR1，(ii)包含氨基酸序列GTKFLAP(SEQ IDNO:7)的VL CDR2，和(iii)包含氨基酸序列VLWYSNRWV(SEQ ID NO:8)的VL CDR3。

在本公开的一些方面，VH1包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在本公开的一些方面，VL1包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在本公开的一个具体方面，scFv包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列(其包含SEQ ID NO:9和10)。

在本公开的一些方面，VH1包含与SEQ ID NO:9至少90％同一、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。在本公开的一些方面，VL1包含与SEQ ID NO:10至少90％同一、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。

在本公开的一些方面，第一多肽单链可变片段包含重链可变结构域(VH1)，所述重链可变结构域包含：(i)包含氨基酸序列KYAMN(S EQ ID NO:3)的VH CDR1，(ii)包含氨基酸序列RIRSKYNNYATYY ADSVKD(SEQ ID NO:4)的VH CDR2，(iii)包含氨基酸序列HGNFGNSYISYWAY(SEQ ID NO:5)的VH CDR3；并且包含与SEQ ID NO:9至少90％同一、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链可变结构域。

在本公开的一些方面，VL1包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含(i)包含氨基酸序列GSSTGAVTSGNYPN(SEQ ID NO:6)的VL CDR1，(ii)包含氨基酸序列GTKFLAP(SEQ ID NO:7)的VL CDR2，(iii)包含氨基酸序列VLWYSNRWV(SEQ ID NO:8)的VL CDR3，其中VL1的氨基酸序列与SEQ ID NO:10至少90％同一、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一。

在一些方面，当VH1包含：(i)包含氨基酸序列KYAMN(SEQ ID NO:3)的VH CDR1，(ii)包含氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:4)的VH CDR2，和(iii)包含氨基酸序列HGNFGNSYISYWAY(SEQ ID NO:5)的VH CDR3；并且VL1包含(i)包含氨基酸序列GSSTGAVTSGNYPN(SEQ ID NO:6)的VL CDR1，(ii)包含氨基酸序列GTKFLAP(SEQ ID NO:7)的VL CDR2，和(iii)包含氨基酸序列VLWYSNRWV(SEQ ID NO:8)的VL CDR3时，MM1包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列。

在替代性方面，单链可变片段包含重链可变结构域(VH1)，所述重链可变结构域包含：(i)包含氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:128)的VH CDR1，(ii)包含氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:129)的VH CDR2和(iii)包含氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:130)的VH CDR3；和轻链可变结构域(VL1)，所述轻链可变结构域包含：(i)包含氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:131)的VL CDR1，(ii)包含氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:132)的VL CDR2，(iii)包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:133)的VL CDR3。

在本公开的这些方面中的一些方面中，VH1包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列。在本公开的某些方面，VL1包含SEQ ID NO:135的氨基酸序列。在本公开的一个具体方面，scFv包含SEQ ID NO:122的氨基酸序列(其包含SEQ ID NO:134和135)。

在本公开的一些方面，VH1包含与SEQ ID NO:134至少90％同一、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。在本公开的一些方面，VL1包含与SEQ ID NO:135至少90％同一、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。

在本公开的一些方面，第一多肽单链可变片段包含重链可变结构域(VH1)，所述重链可变结构域包含：(i)包含氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:128)的VH CDR1，(ii)包含氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:129)的VH CDR2，(iii)包含氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:130)的VH CDR3；并且包含与SEQ ID NO:135至少90％同一、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的重链可变结构域。

在本公开的一些方面，VL1包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含(i)包含氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:131)的VL CDR1，(ii)包含氨基酸序列GTNKRAP(SEQ IDNO:132)的VL CDR2，(iii)包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:133)的VL CDR3，其中VL1的氨基酸序列与SEQ ID NO:135至少90％同一、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一。

在这些方面中的一些方面中，当VH1包含(i)包含氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:128)的VH CDR1，(ii)包含氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:129)的VH CDR2和(iii)包含氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:130)的VH CDR3；并且VL1包含(i)包含氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:131)的VL CDR1，(ii)包含氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:132)的VL CDR2，(iii)包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:133)的VL CDR3时，MM1包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。

EGFR靶向结构域包含VH2(设置在第一多肽内)和VH1(设置在第二多肽内)。VH2包含可变重链CDR1(VH CDR1，本文也称为CDRH1)、可变重链CDR2(VH CDR2，本文也称为CDRH2)和可变重链CDR3(VH CDR3，本文也称为CDRH3)，VL2包含可变轻链CDR1(VL CDR1，本文也称为CDRL1)、可变轻链CDR2(VL CDR2，本文也称为CDRL2)和可变轻链CDR3(VL CDR3，本文也称为CDRL3)。

在本公开的一些方面，EGFR靶向重链可变结构域(VH2)包含：(i)包含氨基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:15)的VH CDR1，(ii)包含氨基酸序列VIWSGGNTDYNTPFTS(SEQ ID NO:16)的VH CDR2，和(iii)包含氨基酸序列ALTYYDYEFAY(SEQ ID NO:17)的VH CDR3。

在本公开的一些方面，VH2包含：(i)包含氨基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:15)的VHCDR1，(ii)包含氨基酸序列VIWSGGNTDYNTPFTS(SEQ ID NO:16)的VH CDR2，和(iii)包含氨基酸序列ALTYYDYEFAY(SEQ ID NO:17)的VH CDR3，其中VH2的氨基酸序列与SEQ ID NO:21至少90％同一、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一

在本公开的一些方面，VH2包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

在本公开的某些具体方面，可激活HBPC包含第一多肽，所述第一多肽包含MM1，所述MM1具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列；VH1，所述VH1具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VH CDR2和包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的VHCDR3；VL1，所述VL1具有含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:8的氨基酸序列的VL CDR3；以及VH2，所述VH2包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH CDR2、含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH CDR3。在这些可激活HBPC中的一些中，第二多肽包含MM2，所述MM2具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和VL2，所述VL2包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL CDR2和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL CDR3。

在本公开的另一具体方面，可激活HBPC包含第一多肽，所述第一多肽包含MM1，所述MM1具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列；VH1，所述VH1具有包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:129的氨基酸序列的VH CDR2和包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列的VH CDR3；VL1，所述VL1具有含有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的VL CDR1、包含SEQID NO:132的氨基酸序列的VL CDR2和具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的VL CDR3；以及VH2，所述VH2包含含有SEQ ID NO:15的氨基酸序列的VH CDR1、含有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH CDR2、含有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VH CDR3。在这些可激活HBPC中的一些中，第二多肽包含MM2，所述MM2具有SEQ ID NO:13的氨基酸序列；和VL2，所述VL2包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VL CDR2和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL CDR3。

如上所述，第一多肽还包含单体Fc结构域(Fc1)。本领域已知的Fc结构域适用于本公开的可激活HBPC并且在下文中更详细地描述。

在本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，Fc1包含与SEQ ID NO:23至少90％同一、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。在一些方面，Fc1包含SEQ IDNO:23的氨基酸序列。在某些方面，Fc1包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列。

在本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的一些方面，第一多肽还包含设置在VH2与Fc1之间的重链CH1结构域。

在本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的一些方面，第一多肽还包含布置在VH2与Fc1之间的免疫球蛋白铰链区。在存在CH1结构域的一些方面，免疫球蛋白铰链区设置在CH1结构域与Fc1结构域之间。

在本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的一些方面，第一多肽从氨基末端至羧基末端包含以下结构排列：MM1-CM1-scFv-V H2-CH1-铰链区-Fc1，其中每个“-”独立地为直接或间接(例如，通过接头)键联。

在本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的一些方面，第一多肽还包含一个或多个任选的接头，所述接头在本文下文更详细地描述。

在本公开的一些方面，可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC包含第一多肽，所述第一多肽包含具有SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:24中所示的氨基酸序列的Fc1。在本公开的一些方面，可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC包含第一多肽，所述第一多肽包含具有铰链-1(SEQ ID NO:34)或铰链-2(SEQ ID NO:35)的序列的铰链区。

在本公开的一些方面，可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽包含第二多肽，所述第二多肽包含EGFR靶向轻链可变结构域(VL2)，所述VL2包含VL CDR1、VL CDR2和VLCDR3。

在一些方面，本公开提供了包含第二多肽的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC，所述第二多肽包含EGFR靶向轻链可变结构域(VL2)，所述VL2包含：(i)包含氨基酸序列RASQSIGTNIH(SEQ ID NO:18)的CDR1，(ii)包含氨基酸序列YASESIS(SEQ ID NO:19)的CDR2，和(iii)包含氨基酸序列QQNNNWPTT(SEQ ID NO:20)的CDR3。

在本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，第二多肽包含VL2，所述VL2具有与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少90％同一、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。

在本公开的一些方面，VL2包含SEQ ID NO:22中所示的氨基酸序列。

在本公开的上述方面中的某些方面中，MM2包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。

在本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，第二多肽从氨基末端至羧基末端可包含以下结构排列：MM2-CM2-VL2，其中每个“-”独立地为直接或间接(例如经由接头)键联。

在本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的一些方面，第二多肽包含一个或多个接头。在一些方面，MM2经由接头连接至CM2。

在一些方面，本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的第二多肽还包含含有约1至约20个氨基酸的接头。下面更详细地论述适合在本公开中使用的接头。

在一些方面，第二多肽还包含恒定轻链结构域(CL)。示例性CL包括本领域已知的任何CL。在一些方面，第二多肽包含具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CL。在这些方面中的某些方面中，第二多肽从氨基末端至羧基末端包含以下结构排列：MM2-CM2-VL2-CL，其中每个“-”独立地为直接或间接(例如，经由接头)键联。

在一些方面，本文所述的可激活HBPC的第三多肽包含单体Fc结构域(Fc2)并且不包含免疫球蛋白可变结构域。

在一些方面，本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC包含第三多肽，所述第三多肽从氨基末端至羧基末端包含以下结构排列：铰链区-Fc2，其中每个“-”独立地为直接或间接(例如，经由接头)键联。在一些方面，第三多肽包含Fc2，所述Fc2具有包含SEQ ID NO:28(任选地，具有C末端赖氨酸，即SEQ ID NO:29)的氨基酸序列。在一个方面，第三多肽包含铰链，所述铰链包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；和Fc2，所述Fc2包含SEQ ID NO:28(任选地，具有C末端赖氨酸，即SEQ ID NO:29)的氨基酸序列。在某些方面，第一多肽包含铰链，所述铰链包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列；和Fc1，所述Fc1包含SEQ ID NO:23(任选地，具有C末端赖氨酸，即SEQ ID NO:24)的氨基酸序列。

如上文所提供，在一些方面，第三多肽可包含例如在铰链区与第二Fc结构域之间的接头。接头可包含本文论述的任何接头。

当可裂解部分被蛋白酶裂解时，本公开的可激活抗EGFR、抗C D3 HBPC被激活，从而产生能够结合至EGFR和CD3的激活的(即，未掩蔽的)抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽复合物(HBPC)。通过比较，与激活的异源多聚体双特异性多肽相比，可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC表现出大大降低的与EGFR和CD3的结合，因为可激活HBPC保持掩蔽直到被肿瘤环境中的蛋白酶激活。不希望受理论或机制的束缚，健康组织中的典型蛋白酶活性水平可能由于内源性抑制剂和/或不利的蛋白酶pH条件的存在而降低，而在肿瘤环境中蛋白酶活性通常通过蛋白酶表达的上调、酶原的激活、抑制剂表达的下调或这些效应的组合而上调(参见Desnoyers等人,ScienceTranslationalMe dicine.org,第5卷,第207期(2013年10月)，特此以引用的方式并入)。

这些可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC因此可用于治疗患有癌症的受试者，其中肿瘤微环境中的蛋白水解活性相对于正常组织被上调并且在正常组织中受到控制。正常组织中可激活HBPC与EGFR和CD3的结合大大减少可允许减少与肿瘤外的抗EGFR和抗CD3接合相关的副作用。在一些方面，可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC包含第一CM和第二CM(分别CM1和CM2)。

在一些方面，CM包含在肿瘤细胞中上调的蛋白酶的底物。在本文公开的HBPC的一些方面，CM可包含在肿瘤细胞中上调的两种或更多种蛋白酶(即，第一蛋白酶、第二蛋白酶、第三蛋白酶等)的底物。在文献中有关于在许多癌症(例如液体瘤或实体瘤)中蛋白酶水平增加的报道。参见例如，La Rocca等人,(2004)British J.of Cancer 90(7):1414-1421。大量研究已经证明实体瘤中异常蛋白酶水平，例如uPA、豆荚蛋白酶(legumain)、MT-SP1、基质金属蛋白酶(MMP)的相关性。(参见例如，Murthy R V,等人“Legumain expression inrelation to clinicopathologic and biological variables in colorectal cancer,”Clin Cancer Res.11(2005):2293-2299；Nielsen B S,等人“Urokinase plasminogenactivator is localized in stromal cells in ductal breast cancer,”Lab Invest81(2001):14851501；Look O R,等人“In situ localization of gelatinolyticactivity in the extracellular matrix of metastases of colon cancer in ratliver using quenched fluorogenic DQ-gelatin,”J Histochem Cytochem.51(2003):821-829)。CM可包含多种蛋白酶的底物，例如丝氨酸蛋白酶的底物和第二不同的蛋白酶(例如MMP)的底物。在一些方面，CM可包含多于一种丝氨酸蛋白酶(例如蛋白裂解酶(matriptase)和/或uPA)的底物。在一些方面，CM可包含多于一种MMP(例如MMP9和MMP14)的底物。

在某些实施方案中，CM1和CM2各自独立地包含作为下表1中列出的蛋白酶的底物的氨基酸序列。

表1.示例性蛋白酶

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在本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的一些方面，CM1和/或CM2包含约3个氨基酸至约15个氨基酸。在一些方面，CM1和/或CM2可包含两个或更多个裂解位点。在一些方面，CM1上的两个或更多个裂解位点可包含一种蛋白酶的底物。在一些方面，CM2上的两个或更多个裂解位点可包含两种或更多种蛋白酶的底物。在一些方面，第一蛋白酶和第二蛋白酶是相同的蛋白酶。在一些实施方案中，CM1和CM2包含相同蛋白酶的不同底物。在一些实施方案中，CM1和CM2包含相同的氨基酸序列。在一些方面，CM1和CM2包含不同的氨基酸序列。在一些方面，CM1包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在一些方面，CM1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在一些方面，CM2包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在某些方面，本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC包含含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的CM1和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CM2。在一些方面，本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽复合物包含含有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的CM1和含有SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CM2。

适用于本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC中的示例性CM包括本领域中已知的那些。示例性CM包括但不限于例如表2以及国际公布号：WO 2009/025846、WO 2010/081173、WO 2015/013671、WO 2015/048329、WO 2015/116933、WO 2016/014974和WO 2016/118629中描述的那些，其各自以引用的方式整体并入本文。

在一些方面，CM1和/或CM2包含下表2中列出的氨基酸序列。在某些方面，CM1和CM2各自独立地包含下表2中列出的氨基酸序列。

表2.可裂解部分

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在本公开的一些方面，当可激活HBPC包含(i)重链可变结构域(VH1)，所述VH1包含含有氨基酸序列KYAMN(SEQ ID NO:3)的VH CDR1、含有氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:4)的VH CDR2和含有氨基酸序列HGNFGNSYISYWAY(SEQ ID NO:5)的VH CDR3；以及VL1，所述VL1包含含有氨基酸序列GSSTGAVTSGNYPN(SEQ ID NO:6)的VL CDR1、含有氨基酸序列GTKFLAP(SEQ ID NO:7)的VL CDR2和含有氨基酸序列VLWYSNRWV(SEQ ID NO:8)的VLCDR3时，CM1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在这些可激活HBPC中的某些中，MM1包含SEQID NO:1的氨基酸序列。

在本公开的一些方面，当可激活HBPC包含(i)重链可变结构域(VH1)，所述VH1包含含有氨基酸序列KYAMN(SEQ ID NO:3)的VH CDR1、含有氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:4)的VH CDR2和含有氨基酸序列HGNFGNSYISYWAY(SEQ ID NO:5)的VH CDR3；和VL1，所述VL1包含含有氨基酸序列GSSTGAVTSGNYPN(SEQ ID NO:6)的VL CDR1、含有氨基酸序列GTKFLAP(SEQ ID NO:7)的VL CDR2和含有氨基酸序列VLWYSNRWV(SEQ ID NO:8)的VLCDR3时，CM1包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在这些可激活HBPC中的某些中，MM1包含SEQID NO:1的氨基酸序列。在这些可激活HBPC中的一些中，MM1包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且CM1包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。

在本公开的一个具体方面中，可激活HBPC包含：

(a)第一多肽，所述第一多肽包含第一重链可变结构域(VH1)、第一轻链可变结构域(VL1)和第二重链可变结构域(VH2)、第一掩蔽部分(MM1)、第一可裂解部分(CM1)以及第一Fc结构域(Fc1)，

其中所述VH1包含：

(i)包含氨基酸序列KYAMN(SEQ ID NO:3)的VH CDR1，

(ii)包含氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:4)的VH CDR2，和

(iii)包含氨基酸序列

HGNFGNSYISYWAY(SEQ ID NO:5)的VH CDR3，其中所述VL1包含：

(i)包含氨基酸序列GSSTGAVTSGNYPN(SEQ ID NO:6)的VL CDR1，

(ii)包含氨基酸序列GTKFLAP(SEQ ID NO:7)的VL CDR2，和

(iii)包含氨基酸序列VLWYSNRWV

(SEQ ID NO:8)的VL-CDR3；其中所述VH2包含：

(i)包含氨基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:15)的VH CDR1，

(ii)包含氨基酸序列

VIWSGGNTDYNTPFTS(SEQ ID NO:16)的VH CDR2，和

(iii)包含氨基酸序列ALTYYDYEFAY(SEQ ID NO:17)的VH CDR3；

(b)第二多肽，所述第二多肽包含第二轻链可变结构域(VL2)和第二掩蔽部分(MM2)以及第二可裂解部分(CM2)，

其中所述VL2包含：

(i)包含RASQSIGTNIH(SEQ ID NO:18)的VL CDR1，

(ii)包含YASESIS(SEQ ID NO:19)的VL CDR2，和

(iii)包含QQNNNWPTT(SEQ ID NO:20)的VL CDR3；以及

(c)第三多肽，所述第三多肽包含第二Fc结构域(Fc2)，

其中所述Fc1结合至Fc2，

其中所述VH1和所述VL1一起形成特异性结合CD3多肽的靶向结构域，

其中所述VH2和所述VL2一起形成特异性结合EGFR的靶向结构域，

其中所述第三多肽不包含免疫球蛋白可变结构域，

其中MM1是干扰第一靶向结构域与第一靶标的结合的肽，

其中MM2是干扰第二靶向结构域与第二靶标的结合的肽，并且

其中CM1和CM2各自独立地包含蛋白酶的底物，并且其中所述第三多肽不包含免疫球蛋白可变结构域。在本公开的某些方面，VH1和VL1设置在scFv内。在这些方面中的一些方面中，MM1包含SEQ ID NO:1，CM1包含SEQ ID NO:73，MM2包含SEQ ID NO:13，并且CM2包含SEQ ID NO:14。在这些方面中的一些方面中，第二多肽还包含恒定轻结构域(CL)，并且第三多肽还包含铰链(HR)。

在本公开的一些方面，当可激活HBPC包含(i)VH1，所述VH1包含含有氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:128)的VH CDR1，含有氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:129)的VH CDR2和含有氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:130)的VH CDR3；和(ii)VL1，所述VL1包含含有氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID NO:131)的VL CDR1，含有氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:132)的VL CDR2，含有氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:133)的VL CDR3时，CM1包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。在这些可激活HBPC中的一些中，MM1包含SEQ ID NO:72的氨基酸序列。

在上述可激活HBPC中的一些中，第一多肽还包含VH2，所述VH2具有包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列的VH CDR1、包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH CDR2、包含SEQ IDNO:17的氨基酸序列的VH CDR3。在这些可激活HBPC中的某些中，第二多肽包含VL2，所述VL2包含含有SEQ ID NO:18的氨基酸序列的VL CDR1、含有SEQ ID NO:19的氨基酸序列的VLCDR2和含有SEQ ID NO:20的氨基酸序列的VL CDR3。在这些HBPC中的一些中，第三多肽包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列(并且没有免疫球蛋白可变结构域)。

在本公开的一个具体方面，可激活HBPC包含：

(i)第一多肽，所述第一多肽包含第一重链可变结构域(VH1)、第一轻链可变结构域(VL1)和第二重链可变结构域(VH2)、第一掩蔽部分(MM1)、第一可裂解部分(CM1)和第一Fc结构域(Fc1)，

其中所述VH1包含：

(i)包含氨基酸序列TYAMN(SEQ ID NO:128)的VH CDR1，

(ii)包含氨基酸序列RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:129)的VH CDR2，

(iii)包含氨基酸序列HGNFGNSYVSWFAY(SEQ ID NO:130)的VH CDR3；

其中所述VL1包含

(i)包含氨基酸序列RSSTGAVTTSNYAN(SEQ ID No:131)的VL CDR1，

(ii)包含氨基酸序列GTNKRAP(SEQ ID NO:132)的VL CDR2，和

(iii)包含氨基酸序列ALWYSNLWV(SEQ ID NO:133的VL CDR3

其中所述VH2包含：

(ii)包含氨基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:15)的VH CDR1，

(ii)包含氨基酸序列VIWSGGNTDYNTPFTS(SEQ ID NO:16)的VH CDR2，和

(iii)包含氨基酸序列ALTYYDYEFAY(SEQ ID NO:17)的VH CDR3

(b)第二多肽，所述第二多肽包含第二轻链可变结构域(VL2)和第二掩蔽部分(MM2)以及第二可裂解部分(CM2)，其中所述VL2包含：

(i)包含RASQSIGTNIH(SEQ ID NO:18)的VL CDR1，

(ii)包含YASESIS(SEQ ID NO:19)的VL CDR2，和

(iii)包含QQNNNWPTT(SEQ ID NO:20)的VL CDR3；以及

(c)第三多肽，所述第三多肽包含第二Fc结构域(Fc2)，

其中所述Fc1结合至Fc2，

其中所述VH2和所述VL2一起形成特异性结合EGFR的靶向结构域，

其中所述第三多肽不包含免疫球蛋白可变结构域，其中MM1是干扰第一靶向结构域与第一靶标的结合的肽，

其中MM2是干扰第二靶向结构域与第二靶标的结合的肽，并且

其中CM1和CM2各自独立地包含蛋白酶的底物，并且

其中所述第三多肽不包含免疫球蛋白可变结构域。在本公开的某些方面，VH1和VL1设置在scFv内。在这些方面中的一些方面中，MM1包含SEQ ID NO:72，CM1包含SEQ IDNO:73，MM2包含SEQ ID NO:13，并且CM2包含SEQ ID NO:22。在这些方面中的一些方面中，第二多肽还包含恒定轻结构域(CL)，并且第三多肽还包含铰链(HR)。

在本公开的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的一些方面，第一多肽包含在MM与CM之间的一个或多个接头。在一些方面，MM1经由接头连接至CM1。在一些方面，第一多肽包含在CM1与VH2之间的接头。在某些方面，第一多肽包含在VH2与Fc1之间的接头。在一些方面，第一多肽包含设置在选自由以下组成的组的一对元件之间的至少一个接头：MM1和CM1；CM1和scFv；scFv和VH2；以及VH2和Fc1。适用于本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC中的接头通常是提供可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的柔性以促进对可激活多肽与靶标的结合的抑制的接头。此类接头通常被称为柔性接头。适合的接头可容易地选择并且可具有不同长度，诸如1个氨基酸(例如，Gly)至20个氨基酸、2个氨基酸至15个氨基酸、3个氨基酸至12个氨基酸，包括4个氨基酸至10个氨基酸、5个氨基酸至9个氨基酸、6个氨基酸至8个氨基酸或7个氨基酸至8个氨基酸，并且长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。

示例性柔性接头包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n和(GGGS)n(分别SEQ ID NO:41和SEQ ID NO:40)，其中n是至少1的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和本领域已知的其它柔性接头。甘氨酸和甘氨酸丝氨酸聚合物是相对非结构化的，并且因此可能能够充当组分之间的中性系链。甘氨酸比甚至丙氨酸获得显著更多的phi-psi空间，并且比具有更长侧链的残基限制少的多(参见Scheraga,Rev.Computational Chem.11173-142(1992))。普通技术人员将认识到，HBPC的多肽可被设计为包括全部或部分柔性的接头，以使得接头可包括柔性接头以及赋予较少柔性结构以提供所需结构的一个或多个部分。

在一些方面，可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC包含设置在第一多肽、第二多肽和/或第三多肽中的一个或多个接头序列。例如，在第一多肽中，接头设置在MM1与CM1之间、重链可变结构域与CH1结构域之间、CH1结构域与铰链区(如果两者均存在)之间和/或铰链区(如果存在)与第一Fc结构域之间。在本文别处描述的第二多肽中，接头可存在于例如MM2与CM2之间、CM2与轻链可变结构域之间和/或轻链可变结构域与CL之间。在本文别处描述的第三多肽中，接头可存在于例如CH1结构域与第二Fc结构域之间、CH1结构域与铰链区之间和/或铰链区与第二Fc结构域之间。

在本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的一些方面，MM 1经由接头L1连接至CM1。在一些方面，MM2经由接头L2连接至CM2。在一些方面，L1和L2的氨基酸序列相同。在一些方面，接头选自由以下组成的组：(i)选自由以下组成的组的基于甘氨酸-丝氨酸的接头：(GS)n，其中n是至少1的整数，(GGS)n，其中n是至少1的整数(例如，约1至约20或约1至约10的整数)，(GGGS)n(SEQ ID NO:40)，其中n是至少1的整数(例如，约1至约20或约1至约10的整数)，(GGGGS)n(SEQ ID NO:126)，其中n是至少1的整数(例如，约1至约20或约1至约10的整数)，(GSGGS)n(SEQ ID N O:41)，其中n是至少1的整数(例如，约1至约20或约1至约10的整数)，GSSGGSGGSG(SEQ ID NO:12)，GGSG(SEQ ID NO:42)，GGSGG(SEQ ID NO:43)，GSGSG(SEQ ID NO:44)，GSGGG(SE Q ID NO:45)，GGGSG(SEQ ID NO:46)和GSSSG(SEQ ID NO:47)，GGGGSGGGGSGGGGSGS(SEQ ID NO:48)，GGGGSGS(SEQ ID NO:49)，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:50)，GGGGSG GGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:51)，GGGGS(SEQ ID NO:52)，GGGGSGGGGS(SEQID NO:53)，GGGS(SEQ ID NO:54)，GGGS GGGS(SEQ ID NO:55)，GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:56)，GS SGGSGGSGG(SEQ ID NO:57)，GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGG GGS(SEQ ID NO:58)，GGGSSGGS(SEQ ID NO:127)和GS；和(i i)选自由以下组成的组的包含甘氨酸和丝氨酸以及赖氨酸、苏氨酸或脯氨酸中的至少一者的接头：GSTSGSGKPGSSEGST(SEQ ID NO:59)、SKYGPPCPPCPAPEFLG(SEQ ID NO:60)、GGSLDPKGGGGS(SEQ ID NO:61)、PKSCDKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO:62)、GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO:63)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:64)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:65)和GSTSGSG KPGSGEGSTKG(SEQ IDNO:66)。

在本公开的一些方面，可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽可包含除上述那些之外的组分。此类组分可包括间隔区。术语“间隔区”在本文中是指并入第一、第二和/或第三多肽的游离末端的氨基酸残基或肽。适合用于本公开的实践中的间隔区包括任何单个氨基酸残基或任何肽。合适的间隔区包括例如国际公布号：WO 2016/014974、WO2019/075405和WO 2019/213444中描述的那些中的任一种，其各自以引用的方式整体并入本文。

在一些方面，间隔区可包含约1个氨基酸至约10个氨基酸(例如，约1、2、3、4、5、6、7、8或9个氨基酸)或之间的任何数字。在本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的一些方面，间隔区相对于MM1和/或MM2位于N末端。在一些方面，间隔区具有QGQSGS(SEQ ID NO:116)的序列。在一些方面，间隔区具有QGQSGQG(SEQ ID NO:117)的序列。在一些方面，间隔区具有QGQSGS(SEQ ID NO:118)的序列。在一些方面，间隔区具有QGQSGQG(SEQ ID NO:117)的序列。

在一些方面，用作Fc1和/或Fc2的Fc结构域是天然Fc结构域(例如，人IgG1 Fc结构域或人IgG4 Fc结构域)。在本公开的一些方面，用作Fc1和/或Fc2的Fc结构域是天然Fc氨基酸序列的突变形式。突变可赋予可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽(以及相应地激活的HBPC)所需的有益特性。例如，已知FcRn结合位点中的某些突变可调节效应子功能(参见例如，Petkova等人,Intl.Immunol.18:1759-1769,2006；Deng等人,MAbs 4:101-109,2012；和Olafson等人,Methods Mol.Biol.907:537-556,2012。)在Fc结构域中包含可调节效应子功能的任何已知突变都是适合的。例如，Fc氨基酸序列中的N297A或N297G突变可用于降低IgG效应子功能(例如ADCC和CDC)，其可降低靶标独立性毒性(参见例如，Lund等人,Mol.Immunol.29:35-39,1992)。适合在本公开的上下文中使用的Fc结构域包括本领域中已知的任何Fc结构域，包括但不限于任何已知的异二聚体Fc，诸如例如孔中钮(knob inholes)等。

在一些方面，本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC还包含免疫球蛋白铰链区。合适的铰链区包括任何已知的铰链区。例如，来自免疫球蛋白的任何五种主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM或其亚类(同种型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)的铰链区适合用于本公开中。不同类别的免疫球蛋白具有不同且众所周知的亚基结构和三维构型。

在一些方面，第一多肽Fc1和第三多肽Fc2铰链区包含相同的序列。在一些方面，本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的第一和第二Fc结构域(分别Fc1和Fc2)是IgG1 Fc结构域或IgG4 Fc结构域(例如，人IgG1 Fc结构域或人IgG4 Fc结构域)或其变体。在一些方面，Fc1和/或Fc2是天然(例如人)IgG1 Fc结构域的经修饰变体。在一些方面，Fc1和/或Fc2是天然(例如人)IgG4 Fc结构域的经修饰变体。

在本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的一些方面，Fc1包含与SEQ ID NO:23至少90％同一、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。在一些方面，Fc1包含SEQ ID NO:23(任选地具有C末端赖氨酸(即SEQ ID NO:24))的氨基酸序列。

在一些方面，第三多肽还包含结合至Fc1的单体Fc结构域(Fc2)。在一些方面，Fc2包含与SEQ ID NO:28至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列。在一些方面，Fc2包含SEQ ID NO:28(任选地具有末端赖氨酸(即SEQ ID NO:29))。

在一些方面，第三多肽包含铰链区，所述铰链区具有选自由SEQ ID NO:34和35组成的组的氨基酸序列。

如本文别处所提供，本文公开的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的形式或结构可包括任何数量的任选的额外组分，包括接头和间隔区。仅作为举例，下文阐述的结构属于预期的方面。然而，下文所示的方面并不意味着以任何方式限制本公开。

在一些方面，可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽包含具有结构(I)的第一多肽。

第一多肽结构(I)：

(S1)–MM1–(L1)–CM1–L2–VH1–L3–VL1–(L4)–VH2–(L5)

–(CH11)–(L6)–

(铰链1)–-(L7)–Fc1

其中

·(S1)是任选的间隔区；

·(L1)、(L4)、(L5)、(L6)和(L7)各自独立地为任选的接头，

·L2和L3是接头，

·(CH11)是任选的CH1结构域，

·(铰链1)是任选的铰链区，

·Fc1如上文所述。

在一些方面，可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽包含具有结构(II)的第二多肽。

第二多肽结构(II)：

(S2)–(L8)-MM2–(L9)–CM2–(L10)–VL2–(CL)

其中

·(S2)是任选的间隔区，

·(L8)、(L9)和(L10)各自独立地为任选的接头，

·MM2是抗EGFR掩蔽部分，并且

·VL2如上文所述；并且

·(CL)是任选的轻链恒定结构域。

在一些方面，可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽包含具有结构(III)的第三多肽。

第三多肽结构(III)：

(S3)–(CH12)–(L11)–(铰链2)–(L12)–Fc2

其中，

·(S3)是任选的间隔区，

·(CH12)是任选的CH1结构域，

·(L11)和(L12)各自独立地为任选的接头，并且

·Fc2如上文所述。

适合用于结构(I)、(II)和(III)中的接头、间隔区、MM、CM、Fc结构域、CH1(即CH11和CH12)结构域、铰链区和CL包括本领域中已知的或本文所述的任一者。

在本公开的一些方面，可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC包含第一、第二和第三多肽，其中(1)所述第一多肽包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列(任选地具有C末端赖氨酸和/或任选地没有间隔区(例如，SEQ ID NO:120(具有末端赖氨酸并且没有间隔区))，(2)所述第二多肽包含SEQ ID NO:31(或SEQ ID NO:37(没有间隔区))的氨基酸序列，并且(3)所述第三多肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列(任选地具有C末端赖氨酸(即SEQ ID NO:36)(并且不包含免疫球蛋白可变结构域)。在本公开的一些方面，可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽包含第一、第二和第三多肽，其中：(1)所述第一多肽包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列，(2)所述第二多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且(3)所述第三多肽包含SEQ IDNO:32的氨基酸序列(并且不包含免疫球蛋白可变结构域)，如以下序列中所提供。

在本公开的一些方面，可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC包含第一、第二和第三多肽，其中(1)所述第一多肽包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，(2)所述第二多肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，并且(3)所述第三多肽由或基本上由SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成。在本公开的一些方面，可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽包含第一、第二和第三多肽，其中：(1)所述第一多肽包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列，(2)所述第二多肽包含SEQID NO:37的氨基酸序列，并且(3)所述第三多肽由或基本上由SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成并且不包含免疫球蛋白可变结构域，如以下序列中所提供。

在本公开的一些方面，可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽包含第一、第二和第三多肽，其中：(1)所述第一多肽包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列，(2)所述第二多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且(3)所述第三多肽由或基本上由SEQ ID NO:32的氨基酸序列组成并且不包含免疫球蛋白可变结构域，如下文序列中所提供。

在下文所示的第一多肽中，间隔区序列在括号中，掩蔽序列加下划线，接头为粗体，(scFv内的接头也为斜体并加下划线)，底物(即可裂解部分)为斜体，并且scFv(其结合CD3多肽)为斜体并加下划线。

第一多肽

任选地具有C末端赖氨酸和/或没有间隔区(例如SEQ ID NO:137)。在一些方面，第一多肽具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列(没有间隔区，但具有C末端赖氨酸)或SEQ ID NO:144的氨基酸序列(没有间隔区并且没有C末端赖氨酸)。

在下文所描绘的第二多肽中，间隔区序列在括号中，掩蔽序列加下划线，接头为粗体，并且底物(即可裂解部分)为斜体。

第二多肽

任选地没有间隔区(SEQ ID NO:37)。

在下文描绘的第三多肽中，铰链区为粗体并加下划线，并且序列的其余部分是Fc2。

第三多肽

任选地具有C末端赖氨酸(SEQ ID NO:36)。

药盒

本文提供了包含本文所述的一种或多种可激活抗EGFR、抗CD3HBPC或其HBPC的药盒，其中所述药盒用于诊断或用于治疗。在某些方面，本文提供了包装或药盒，其包含一个或多个容器，所述容器填充有本文所述的组合物的一种或多种成分，诸如本文提供的一种或多种可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC或其抗原结合片段，任选的使用说明书。在一些方面中，药盒含有本文所述的组合物和任何诊断剂、预防剂或治疗剂，诸如本文所述的那些。

治疗用途和方法

在一些方面，本文呈现了用于治疗疾病(例如癌症)的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC或其HBPC或如本文所述的其药物组合物。在一些方面，本文呈现了抑制有需要的受试者中的肿瘤生长的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如本文所述的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC或其HBPC或如本文所述的其药物组合物。在一些方面，本公开涉及本文提供的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC或其HBPC或药物组合物，其用作药物。通常，受试者是人，但是也可治疗非人哺乳动物，包括转基因哺乳动物。

将有效治疗疾患的可激活HBPC或其HBPC或其组合物的量将取决于疾病的性质。组合物中待采用的精确剂量还将取决于施用途径和疾病的严重性。

疾病的非限制性实例包括：癌症、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、SLE、心血管损伤、缺血等。例如，适应症可包括白血病，包括T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)、淋巴母细胞性疾病(包括多发性骨髓瘤)和实体瘤，包括肺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌，包括三阴性乳腺癌。例如，适应症可包括骨病或癌症转移，无论原发肿瘤起源如何；乳腺癌，包括作为非限制性实例，ER/PR+乳腺癌、Her2+乳腺癌、三阴性乳腺癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌；胃癌；胶质母细胞瘤；头颈癌，诸如头颈鳞状细胞癌；食道癌；肺癌，诸如作为非限制性实例，非小细胞肺癌；多发性骨髓瘤卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；肉瘤，诸如骨肉瘤；肾癌，诸如作为非限制性实例，肾细胞癌；和/或皮肤癌，诸如作为非限制性实例，鳞状细胞癌、基底细胞癌或黑素瘤。

多核苷酸

在一些方面，本文提供了包含编码本公开的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的第一、第二和/或第三多肽的核苷酸序列的多核苷酸(在本文中相应地分别称为“第一多核苷酸”、“第二多核苷酸”和“第三多核苷酸”)。合适的多核苷酸包括编码本文所述的第一、第二和/或第三多肽或其部分中的任一者的任何多核苷酸。本文在下文中提供了编码第一、第二和第三多肽的示例性多核苷酸序列组。

可对本公开的多核苷酸进行序列优化，以从选择用于表达的宿主生物体中进行最佳产生，例如通过密码子/RNA优化、用异源信号序列置换以及消除mRNA不稳定性元件。产生编码可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽或其抗原结合片段(例如重链、轻链、VH结构域或VL结构域)的优化的核酸以用于通过引入密码子变化(例如，由于遗传密码的简并性而编码相同氨基酸的密码子变化)和/或消除mRNA中的抑制性区域进行重组表达的方法可通过相应地改编例如美国专利号5,965,726；6,174,666；6,291,664；6,414,132；和6,794,498中描述的优化方法来进行。

核酸

编码第一多肽的多核苷酸(SEQ ID NO:112)

CAAGGACAATCTGGCTCTGTGTCCACCACCTGTTGGTGGGACCCTCCATGCACACCTAATACCGGCAGCTCTGGTGGCTCTGGCGGAAGCGGAGGACTGTCTGGCAGATCCGATGATCACGGCGGAGGATCTGAGGTGCAGCTGGTTGAATCTGGTGGCGGACTGGTTCAGCCTGGCGGATCTCTGAAACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAACAAATACGCCATGAACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGCAAAGGCCTTGAATGGGTCGCCAGAATCAGAAGCAAGTACAACAACTATGCCACCTACTACGCCGACAGCGTGAAGGACAGATTCACCATCAGCCGGGACGACAGCAAGAACACCGCCTACCTGCAGATGAACAACCTGAAAACCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGTGCGGCACGGCAACTTCGGCAACAGCTACATCAGCTACTGGGCCTATTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTTTCTAGTGGCGGAGGCGGATCTGGCGGCGGTGGAAGTGGCGGCGGAGGTTCTCAAACAGTGGTCACCCAAGAGCCTAGCCTGACCGTTTCTCCTGGCGGAACCGTGACACTGACATGCGGATCTTCTACAGGCGCCGTGACCAGCGGCAACTACCCTAATTGGGTGCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCTCCTAGAGGACTGATCGGCGGCACAAAGTTTCTGGCTCCCGGAACACCAGCCAGATTCAGCGGTTCTCTGCTCGGAGGAAAGGCCGCTCTGACACTTTCTGGCGTGCAGCCTGAGGATGAGGCCGAGTACTATTGCGTGCTGTGGTACAGCAACAGATGGGTGTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGACAGTTCTTGGAGGTGGCGGTAGCCAGGTCCAGCTGAAACAATCTGGACCCGGACTCGTGCAGCCAAGCCAGAGCCTGTCTATCACCTGTACCGTGTCCGGCTTCAGCCTGACCAATTACGGCGTGCACTGGGTTCGACAATCTCCCGGCAAGGGACTCGAATGGCTGGGAGTGATTTGGAGCGGCGGCAACACCGACTACAACACCCCATTCACCAGCAGACTGAGCATCAACAAGGACAACAGCAAGTCCCAGGTGTTCTTCAAGATGAACTCCCTGCAGAGCCAGGATACCGCCATCTATTACTGCGCTCGGGCCCTGACCTACTATGACTACGAGTTTGCCTACTGGGGACAGGGAACCCTCGTGACAGTGTCTGCTGCTAGCACAAAGGGCCCTAGCGTTTTCCCACTGGCTCCCAGCAGCAAGTCTACATCCGGTGGAACAGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGATTACTTTCCCGAGCCAGTGACCGTGTCCTGGAATAGCGGAGCACTGACATCTGGCGTGCACACATTTCCAGCCGTGCTGCAGTCTAGCGGCCTGTACTCTCTGTCCAGCGTTGTGACAGTGCCCAGCAGCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAATGTGAACCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAG AAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGATAAGACACACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAGCTGCTCGGAGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTCCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTCGACGGCGTGGAAGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTTGCGAGGAACAGTACGGCAGCACCTACAGATGCGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAACCCCAGGTGTACACACTGCCTCCAAGCCGGAAAGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGACAGCCCGAGAACAACTACAAGACAACCCCTCCTGTGCTGAAGTCCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCAAGCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCTCTGAGCCCCGGCAAA

无论基因中存在或不存在末端赖氨酸，纯化的蛋白质中可能都不存在末端赖氨酸。在此示例性多核苷酸的变体中，编码C末端赖氨酸的密码子可以不存在(即SEQ ID NO:139)。

编码第二多肽的多核苷酸(SEQ ID NO:113)

CAAGGCCAGTCTGGCCAAGGTCTTAGTTGTGAAGGTTGGGCGATGAATAGAGAACAATGTCGAGCCGGAGGTGGCTCGAGCGGCGGCTCTATCTCTTCCGGACTGCTGTCCGGCAGATCCGACCAGCACGGCGGAGGATCCCAAATCCTGCTGACACAGTCTCCTGTCATACTGAGTGTCTCCCCCGGCGAGAGAGTCTCTTTCTCATGTCGGGCCAGTCAGTCTATTGGGACTAACATACACTGGTACCAGCAACGCACCAACGGAAGCCCGCGCCTGCTGATTAAATATGCGAGCG AAAGCATTAGCGGCATTCCGAGCCGCTTTAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGAGCATTAACAGCGTGGAAAGCGAAGATATTGCGGATTATTATTGCCAGCAGAACAACAACTGGCCGACCACCTTTGGCGCGGGCACCAAACTGGAACTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

第二多肽也由具有SEQ ID NO:115的序列的多核苷酸编码。

编码第三多肽的多核苷酸(SEQ ID NO:114)

GATAAGACCCACACCTGTCCTCCATGTCCTGCTCCAGAACTGCTCGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCAGAACCCCTGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGATCCCGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACAAAGCCCTGCGAGGAACAGTACGGCAGCACCTACAGATGCGTGTCCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCTCCTATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGAGAACCCCAGGTGTACACACTGCCTCCAAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGCAATGGACAGCCCGAGAACAACTACGACACCACACCTCCAGTGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCTGTACAGCGACCTGACCGTGGACAAGAGCAGATGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCTCCTGGCAAA

在此示例性多核苷酸的变体中，编码C末端赖氨酸的密码子可以不存在(即SEQ IDNO:141)。

本公开的另一示例性可激活HBPC在实施例1中进行了描述，其包含具有SEQ IDNO:30的氨基酸序列的第一多肽(由包含SEQ ID NO:139或112的多核苷酸序列的多核苷酸序列编码(无论基因中存在或不存在末端赖氨酸，纯化的蛋白质中都不存在末端赖氨酸)；具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的第二多肽(由SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的多核苷酸序列编码；和具有SEQ ID NO:32(由SEQ ID NO:114的多核苷酸序列编码(无论基因中存在或不存在末端赖氨酸，纯化的蛋白质中都不存在末端赖氨酸)或SEQ ID NO:141的氨基酸序列的第三多肽。

在实施例1中描述的本公开的另一示例性可激活HBPC中，所述可激活HBPC包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的第一多肽(由包含SEQ ID NO:142或143的多核苷酸序列的多核苷酸序列编码(无论基因中存在或不存在末端赖氨酸，纯化的蛋白质中都不存在末端赖氨酸)；具有SEQ ID NO:31的氨基酸序列的第二多肽(由SEQ ID NO:113或SEQ ID NO:115的多核苷酸序列编码；和具有SEQ ID NO:32(由SEQ ID NO:114的多核苷酸序列编码(无论基因中存在或不存在末端赖氨酸，纯化的蛋白质中都不存在末端赖氨酸)或SEQ ID NO:141(无论基因中存在或不存在末端赖氨酸，纯化的蛋白质中都不存在末端赖氨酸)的氨基酸序列的第三多肽。

编码本文所述的多肽或其抗原结合片段或其结构域的多核苷酸可使用本领域众所周知的方法(例如，PCR和其它分子克隆方法)从来自合适来源(例如杂交瘤)的核酸产生，使用本领域众所周知的技术合成等。可将编码第一、第二和第三多肽的多核苷酸克隆到一个或多个载体中以在宿主细胞中表达并进一步克隆，例如以产生嵌合和人源化抗体或其抗原结合片段。

本文提供的多核苷酸可以是RNA或DNA。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA，并且DNA可以是双链的或单链的。如果是单链，则DNA可以是编码链或非编码(反义)链。在一些方面，多核苷酸是缺少一个或多个内源性内含子的cDNA或DNA。在一些方面，多核苷酸是非天然存在的多核苷酸。在一些方面，多核苷酸是重组产生的。在一些方面，多核苷酸是分离的。在一些方面，多核苷酸是基本上纯的。在一些方面，多核苷酸是从天然组分中纯化的。

在一些方面，本文所述的多核苷酸编码可激活抗EGFR、抗CD3HBPC或其抗原结合片段，并且包含本文提供的重链(VH)和轻链(VL)以及CDR。

载体、宿主细胞和产生方法

本文提供了一种或多种载体，其包含编码本公开的第一、第二和/或第三多肽的多核苷酸(分别对应于第一多核苷酸、第二多核苷酸和第三多核苷酸)。在一些方面，此类载体可用于从宿主细胞重组产生HBPC的多肽，如下文更详细地描述。在一些方面，载体包含可操作地连接至一个或多个启动子序列的第一、第二和/或第三多核苷酸。在某些方面，本公开提供了共同包含编码第一、第二和第三多肽的多核苷酸(即，第一、第二和第三多核苷酸)的多个载体，其中所述多个载体包含至少一个包含第一、第二和第三多核苷酸中的不超过两者或不超过一者的载体。在这些方面，多个载体中的第一、第二和第三多核苷酸序列通常可操作地连接至一个或多个启动子序列。

本文还提供了重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含用于重组表达编码本公开的可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的多肽的多核苷酸的上述多核苷酸和/或载体中的任一者。可使用多种宿主表达载体系统来表达本文所述的多肽(参见例如，美国专利号5,807,715)。此类宿主表达系统代表可通过其产生并随后纯化目标编码序列的媒介物，而且还代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时可原位表达本文所述的抗体或其抗原结合片段的细胞。适合用作上述多核苷酸的重组表达宿主的示例性宿主细胞包括哺乳动物细胞系统(例如，COS(例如COS1或COS)、CHO、BHK、MDCK、HEK 293、NS0、PER.C6、VERO、CRL7O3O、HsS78Bst、HeLa和NIH 3T3、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10细胞等)。用于构建重组哺乳动物宿主细胞的载体可包含源自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)。在一些方面，重组宿主细胞是CHO细胞或NS0细胞。

在一些方面，本文所述的多肽(例如第一、第二和/或第三多肽)的重组表达涉及构建含有编码可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC的多核苷酸的表达载体。包含编码HBPC的多核苷酸的载体可使用本领域中众所周知的技术通过重组DNA技术容易地产生。本领域技术人员众所周知的方法可用于构建表达载体，所述表达载体含有编码本文所述的多肽(例如第一、第二和/或第三多肽)的一种或多种多核苷酸以及适当的转录和翻译控制信号。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术以及体内基因重组。还提供了包含可操作地连接至启动子的核苷酸序列的可复制载体。此类载体可例如包含编码本文所述的多肽(例如第一、第二和/或第三多肽)的恒定区的核苷酸序列(参见例如，国际公布号WO 86/05807和WO 89/01036；和美国专利号5,122,464)，并且可将所述多肽的可变结构域克隆到这种载体中以表达完整VH、完整VL、或完整VH和VL两者。

可通过常规技术将表达载体转移至细胞(例如，宿主细胞)，且然后可通过常规技术培养所得细胞以产生本文所述的HBPC你(例如，本文提供的可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的CDR、VH1、VH2、VL1和VL2)。因此，本文提供了含有编码本文所述的HBPC的多核苷酸的宿主细胞，所述多核苷酸可操作地连接至用于在宿主细胞中表达此类序列的启动子。在一些方面，宿主细胞含有载体，所述载体包含编码本文所述的HBPC或其结构域的多核苷酸。在一些方面，宿主细胞含有三种不同的载体，包含编码本文所述的第一多肽的第一多核苷酸的第一载体、包含编码本文所述的第二多肽的第二多核苷酸的第二载体以及包含编码本文所述的第三多肽的第三多核苷酸的第三载体。

在一些方面，本文提供了共同包含编码第一、第二和第三多肽的多核苷酸的载体群体，其中每个载体仅包含编码第一、第二和第三多肽的多核苷酸中的一个或两个。在某些方面，本文提供了包含编码第一、第二和第三多肽的多核苷酸(即，分别第一、第二和第三多核苷酸)的单一载体。

在一些方面，本公开提供了产生可激活HBPC的方法，所述方法包括：(a)在足以产生可激活HBPC的条件下在液体培养基中培养包含编码本公开的多肽的一种或多种多核苷酸(例如，第一多核苷酸、第二多核苷酸和/或第三多核苷酸，以及包含前述多核苷酸的载体)的宿主细胞；以及(b)回收所述可激活HBPC。

在一个具体方面，本文提供了用于产生可激活抗EGFR、抗CD3HBPC的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达其这样的多肽。更具体地，本文提供了产生可激活HBPC的方法，所述方法包括：(a)在足以产生所述HBPC的条件下在液体培养基中培养包含编码本公开的多肽的一种或多种多核苷酸的宿主细胞；以及(b)回收所述可激活HBPC。

在另一方面，所述方法还包括纯化可激活HBPC或其它加工中组合物的生物收获物(无细胞表达产物)，包括使包含可激活HBPC的水性组合物经受单元操作，诸如例如亲和色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、陶瓷羟基磷灰石色谱等。在某些方面，单元操作是陶瓷羟基磷灰石色谱。

组合物

在一些方面，本公开的可激活HBPC或其HBPC能够用于可用于本文公开的任何治疗应用的药物组合物中。在某些方面，药物组合物包含治疗有效量的一种或多种可激活HBPC以及药学上可接受的稀释剂或载体。在另一方面，药物组合物包含治疗有效量的一种或多种可激活HBPC、药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。可接受的配制材料在所用剂量和浓度下对接受者无毒。药物组合物可被配制为液体、冷冻或冻干组合物。

在某些方面，药物组合物可含有用于调节、维持或保持例如组合物的pH、摩尔渗透压浓度、粘度、澄清度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的配制材料。合适的配制材料包括但不限于氨基酸；抗菌剂；抗氧化剂；缓冲剂；填充剂；螯合剂；络合剂；填料；碳水化合物如单糖或二糖；蛋白质；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物；低分子量多肽；成盐抗衡离子(如钠)；防腐剂；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇；助悬剂；表面活性剂或润湿剂；稳定性增强剂；张力增强剂；递送媒介物；和/或药物佐剂。可掺入药物组合物中的合适剂的额外细节和选项提供于例如，Remington'sPharmaceutical Sciences,第22版,(Loyd V.Allen编)Pharmaceutical Press(2013)；Ansel等人,Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems,第7版,Lippencott Williams and Wilkins(2004)；以及Kibbe等人,Handbook ofPharmaceutical Excipients,第3版,Pharmaceutical Press(2000)中。

药物组合物的组分根据例如预期的施用途径、递送形式和所需的剂量来加以选择。参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第22版,(Loyd V.Allen编辑)Pharmaceutical Press(2013)。选择组合物以影响所公开的抗原结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。药物组合物中的主要媒介物或载体在性质上可以是水性或非水性的。举例来说，适合的媒介物或载体可以是注射用水或生理盐水溶液。在某些方面，可通过混合具有所需纯度的所选组合物与任选的配制剂以冻干饼或水溶液形式制备抗原结合蛋白组合物以供储存。此外，在某些方面，可使用适当的赋形剂将抗原结合蛋白配制成冻干物。

在某些制剂中，可激活HBPC浓度是至少2mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml、100mg/ml、110mg/ml、120mg/ml、130mg/ml、140mg/ml或150mg/ml。在其它制剂中，可激活HBPC具有10-20mg/ml、20-40mg/ml、40-60mg/ml、60-80mg/ml或80-100mg/ml的浓度。

一些组合物包含缓冲剂或pH调节剂。代表性缓冲剂包括但不限于：有机酸盐(如柠檬酸盐、乙酸盐、抗坏血酸盐、葡萄糖酸盐、碳酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐或邻苯二甲酸盐)；Tris；磷酸盐缓冲剂；以及在一些情况下，如下所述的氨基酸。在某些方面，缓冲剂用于将组合物维持在生理pH或稍低的pH下，通常在约5至约8的pH范围内。一些组合物具有约5-6、6-7或7-8的pH。在其它方面，pH是5.5-6.5、6.5-7.5或7.5-8.5。

游离氨基酸或蛋白质在一些组合物中用作填充剂、稳定剂和/或抗氧化剂。作为实例，赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于稳定制剂中的蛋白质。甘氨酸可用于冻干中以确保恰当饼结构和特性。精氨酸可用于抑制液体制剂和冻干制剂两者中的蛋白质聚集。甲硫氨酸可用作抗氧化剂。在一些方面中包括谷氨酰胺和天冬酰胺。氨基酸由于其缓冲能力而被包括在一些制剂中。此类氨基酸包括例如丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。某些制剂还包含蛋白质赋形剂，如血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA)和重组人白蛋白(rHA))、明胶、酪蛋白等。

一些组合物包含多元醇。多元醇包括糖(例如甘露醇、蔗糖、海藻糖和山梨醇)和多元醇例如甘油和丙二醇，以及聚乙二醇(PEG)和相关物质。多元醇是低离液序列(kosmotropic)的。它们是液体制剂和冻干制剂两者中用于保护蛋白质免遭物理和化学降解过程的有用稳定剂。多元醇还适用于调整制剂的张力。

某些组合物包含甘露醇作为稳定剂。它通常与例如蔗糖的冻干保护剂一起使用。山梨醇和蔗糖可用于调整张力并且可用作稳定剂以在运输期间保护免受冻-融应力或在制造过程期间防止大块产物。PEG可用于使蛋白质稳定并且可用作低温保护剂，并且就此而言可用于本公开中。

糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生化糖如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物可包含于一些制剂中。例如，合适的碳水化合物赋形剂包括单糖，如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及醛醣醇，如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡萄糖醇)、肌醇等。

表面活性剂可包含在某些制剂中。表面活性剂通常用于防止、最小化或减少蛋白质吸附至表面以及随后在气-液、固-液和液-液界面处的聚集，并控制蛋白质构象稳定性。合适的表面活性剂包括例如聚山梨酯20、聚山梨酯80、脱水山梨糖醇酯的其它脂肪酸酯、Triton表面活性剂、卵磷脂、泰洛沙泊(tyloxapal)和泊洛沙姆188。

在一些方面，一种或多种抗氧化剂包含于药物组合物中。抗氧化剂赋形剂可用于防止蛋白质的氧化降解。还原剂、氧/自由基清除剂和螯合剂在这方面是有用的抗氧化剂。抗氧化剂通常是水溶性的，并且在产品的整个保质期内维持其活性。EDTA是另一种有用的抗氧化剂。

某些制剂包含作为蛋白质辅因子并且是形成蛋白质配位复合物所必需的金属离子。金属离子也可抑制一些使蛋白质降解的过程。例如，镁离子(10-120mM)可用于抑制天冬氨酸异构化成异天冬氨酸。

张力增强剂也可包含在某些制剂中。此类剂的实例包括碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾、甘露醇和山梨醇。

一种或多种防腐剂可包含在某些制剂中。当开发涉及从同一容器抽取一次以上的多剂量肠胃外制剂时，防腐剂是必需的。它们的主要功能在于在药物产品的整个保质期或使用条款期间抑制微生物生长并确保产品无菌性。合适的防腐剂包括苯酚、间甲酚、对甲酚、邻甲酚、氯甲酚、苯甲醇、亚硝酸苯汞、苯氧乙醇、苯醇、甲醛、氯丁醇、氯化镁(例如六水合物)、对羟基苯甲酸烷基酯(对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯等)、苯扎氯铵、苄索氯铵、脱氢乙酸钠、硫柳汞、苯甲酸、水杨酸、氯己定或其在水性稀释剂中的混合物。

将本公开的药物组合物配制成与其预期的施用途径相容。施用途径的实例是静脉内(IV)、皮内、吸入、经皮、局部、经粘膜以及直肠施用。

适合于肠胃外施用(例如，静脉内、皮下、眼内、腹膜内、肌内)的制剂组分包括无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗细菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如EDTA；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调节张力的剂，如氯化钠或右旋糖。

对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。载体应该在制造条件下稳定并且应该抗微生物保存。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)以及其合适混合物的溶剂或分散介质。

关于取决于递送形式的适当制剂的进一步指导例如提供于Remington'sPharmaceutical Sciences,第22版,(Loyd V.Allen编)Pharmaceutical Press(2013)中。

药物制剂可以是无菌的。灭菌可通过任何合适的方法，例如通过无菌过滤膜过滤来完成。在组合物被冻干的情况下，过滤灭菌可在冻干和复原之前或之后进行。如实施例7和8中所示，本文所述的可激活HBPC即使在相对高浓度下也表现出相对抗聚集性。因此，在另一方面，本文提供了包含本文所述的任何可激活HBPC和水的组合物，其中可激活HBPC以至少1mg/mL的浓度存在，并且其中所述组合物包含至少约95％单体可激活HBPC、或至少约96％单体可激活HBPC、或至少约97％单体可激活HBPC、或至少约98％单体可激活HBPC、或至少约99％单体可激活HBPC。如本文所用，术语“单体可激活HBPC”是指呈非聚集形式的可激活HBPC。在这些方面的某些方面中，组合物包含至少约2mg/ml和至少约95％单体可激活HBPC、或至少约96％单体可激活HBPC、或至少约97％单体可激活HBPC、或至少约98％单体可激活HBPC、或至少约99％单体可激活HBPC。在一些方面，组合物包含至少约3mg/ml和至少约95％单体可激活HBPC、或至少约96％单体可激活HBPC、或至少约97％单体可激活HBPC、或至少约98％单体可激活HBPC、或至少约99％单体可激活HBPC。在一些方面，组合物包含至少约4mg/ml和至少约95％单体可激活HBPC、或至少约96％单体可激活HBPC、或至少约97％单体可激活HBPC、或至少约98％单体可激活HBPC、或至少约99％单体可激活HBPC。单体可激活HBPC的百分比可通过例如尺寸排阻(SE)-HPLC容易地确定，如实施例7中所示，其中单体可激活HBPC百分比被确定为基于总峰面积，对应于单体可激活HBPC的峰面积百分比。

实施例

此实施例章节中的实施例以举例说明而不是限制的方式提供。实施例1：可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽的构建和表达

在此实施例中，制备了具有图1中所示结构的两种示例性可激活抗EGFR、抗CD3HBPC，即复合物-57和复合物-67。参考图1，每种可激活抗EGFR、抗CD3 HBPC均以如下所述的三种多肽构建：

(a)第一多肽，所述第一多肽包含CD3掩蔽部分(MM1)100、第一可裂解部分(CM1)101、抗CD3 scFv 102(包括通过接头连接的VH1和VL1序列)、抗EGFR重链可变结构域(VH2)(顶部)和CH1结构域(底部)(一起表示为103)，所述103通过铰链区109连接至第一Fc结构域(Fc1)104；和

(b)第二多肽，所述第二多肽包含EGFR掩蔽部分(MM2)105、第二可裂解部分(CM2)106、以及抗EGFR轻链可变结构域(VL2)(顶部)和恒定轻链结构域(CL)(底部)(一起表示为107)；和

(c)第三多肽，所述第三多肽包含铰链区110和第二Fc结构域(Fc2)108。如图1所示，第一和第二Fc结构域彼此结合，并且抗EGFR重链和轻链可变结构域形成特异性结合至EGFR的EGFR靶向结构域。复合物-57和复合物-67包含相同的抗EGFR靶向结构域，但包含不同的抗CD3 scFv。复合物-67的组分列于表4A-4C中，并且复合物-57的组分列于表5A-5C中。

表4A.复合物-67第一多肽组分

*相应的多核苷酸序列是SEQ ID NO:112(无论基因中存在或不存在末端赖氨酸，纯化的蛋白质中都不存在末端赖氨酸)或SEQ ID NO:139。

⁺⁺含有N末端间隔区，SEQ ID NO:33。

^ΔFc1位于CH1(SEQ ID NO:26)-铰链(SEQ ID NO:34)序列的C末端。

表4B.复合物-67第二多肽组分

*相应的多核苷酸序列是SEQ ID NO:113或替代地SEQ ID NO:115。

⁺⁺含有N末端间隔区，SEQ ID NO:117。

表4C.复合物-67第三多肽组分

^*相应的多核苷酸序列是SEQ ID NO:114(无论基因中存在或不存在末端赖氨酸，纯化的蛋白质中都不存在末端赖氨酸)或SEQ ID NO:141。

⁺⁺含有位于Fc2的N末端的铰链(SEQ ID NO:35)。

表5A.复合物-57第一多肽

^*相应的多核苷酸序列是SEQ ID NO:143(无论基因中存在或不存在末端赖氨酸，纯化的蛋白质中都不存在末端赖氨酸)或SEQ ID NO:142。

⁺⁺含有N末端间隔区(SEQ ID NO:117)。

^ΔFc1位于CH1(SEQ ID NO:26)-铰链(SEQ ID NO:34)序列的C末端。

表5B.复合物-57第二多肽

*相应的多核苷酸序列是SEQ ID NO:113或替代地SEQ ID NO:115。

⁺⁺含有N末端间隔区，SEQ ID NO:117。

表5C.复合物-57第三多肽组分

^*相应的多核苷酸序列是SEQ ID NO:114(无论是否存在于基因中，纯化的蛋白质中都不存在末端赖氨酸)或SEQ ID NO:141。

⁺⁺含有位于Fc2的N末端的铰链(SEQ ID NO:35)。

对照可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性抗体的构建多肽

对照可激活双特异性构建体，本文称为“CI106”，如国际专利申请公布号WO 2019/075405中所述制备，其以引用的方式并入本文。CI106是可激活双臂二价双特异性构建体，其由对应于两条相同的重链(两个第一多肽)和相同的轻链(两个第二多肽)的四个多肽组成，其中每条重链和轻链形成双特异性构建体的一个臂。CI106是“二价的”，因为它具有每种类型的两个结合结构域(即，两个EGFR结合结构域和两个CD3结合结构域)。轻链的氨基酸序列与复合物-67和复合物-57的第二多肽的氨基酸序列同一。CI106的重链和复合物-67的第一多肽具有相同的间隔基、可裂解部分、抗EGFR VH、可裂解部分组分。CI106的重链和复合物-57的第一多肽具有相同的间隔区、抗CD3MM/MM1、可裂解部分、以及抗CD3 VL/VH(和相同的抗CD3 scFv)和抗EGFR VH组分。对于CI106，所有四个靶向结构域(两个抗CD3结合结构域和两个抗EGFR结合结构域)均被掩蔽。表6A-6B中提供了CI106的组分。

表6A.CI106重链组分

*相应的多核苷酸序列是SEQ ID NO:125(蛋白质在表达/纯化过程中似乎丢失末端赖氨酸)。

⁺⁺含有N末端间隔区(SEQ ID NO:116)。

^ΔFc结构域位于CH1(SEQ ID NO:26)-铰链(SEQ ID NO:34)序列的C末端。

表6B.CI106轻链组分

*相应的多核苷酸序列是SEQ ID NO:113或替代地SEQ ID NO:115。

++含有N末端间隔区，SEQ ID NO:117。

实施例2.可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽与

EGFR⁺HT-29细胞和CD3ε⁺Jurkat细胞的结合

为了评估所描述的抗EGFR和抗CD3掩蔽肽是否能够抑制可激活异源多聚体双特异性多肽与EGFR和CD3的结合，进行了基于流式细胞术的结合测定。

将HT-29-luc2(Perkin Elmer,Inc.,Waltham,MA(先前Caliper Life Sciences,Inc.)和Jurkat(克隆E6-1、ATCC、TIB-152)细胞在补充有10％热灭活胎牛血清(HI-FBS,Life Technologies，目录号10438-026)的RPMI1640+glutamax(Life Technologies，目录号72400-047)中培养。如所指示，“激活的”(本文中记为“act”)分子作为掩蔽的HBPC产生并且被蛋白水解裂解以产生激活的形式。产生了可激活HBPC，但在实验前未进行蛋白水解裂解。对以下多肽复合物进行了测试：act-CI106(二价双臂双特异性构建体)、act-复合物-57(HBPC)和act-复合物-67(HBPC)以及可激活(掩蔽的)HBPC复合物-57、(掩蔽的)HBPC复合物-67和双重掩蔽的二价双臂双特异性构建体CI106。如实施例1中所述，在CI106和复合物57中使用了CD3结合剂(抗CD3 scFv v16)和掩模(MM H20GG)的一种组合，并且在复合物-67中使用了CD3结合剂(抗CD3 scFv I2C)和掩模(ML15)的不同组合。

将HT29-luc2细胞用Versene^TM(Life Technologies,Catalog15040066)脱离，洗涤，以约150,000个细胞/孔涂铺于96孔板中，并重悬于50μL激活的或可激活(掩蔽的)HBPC中。如针对HT29-luc2细胞所描述对Jurkat细胞进行计数和涂铺。激活的(未掩蔽的)或可激活(掩蔽的)HBPC的滴定从图2A和图2B中所示的浓度开始，随后在FACS染色缓冲液+2％ FBS(BD Pharmingen，目录号554656)中进行3倍连续稀释。将细胞在4℃下振荡孵育约1小时，收获并用2x200μL的FACS染色缓冲液洗涤。将细胞重悬于50μL的Alexa Fluor 488缀合的抗人IgG Fc(10μg/ml，Jackson ImmunoResearch)中，并在4℃下振荡孵育约1小时。将细胞收获、洗涤并重悬于最终体积为200μL的含有2.5μg/mL 7AAD(BD Biosciences，目录号559925)的FACS染色缓冲液中。单独用第二抗体染色的细胞用作阴性对照。在Attune NxT流式细胞仪上采集数据，并使用V10(Treestar)计算活细胞的中值荧光强度(MFI)。使用曲线拟合分析在GraphPad Prism中绘制减去背景的MFI数据。

如图2A-2B所示，两种可激活HBPC(复合物-57和复合物-67)以及对照CI106相对于激活的(未掩蔽的)复合物-57、激活的复合物-67和激活的CI106表现出与EGFR和CD3靶标两者的结合减少。结合曲线的右移表示结合的减少。在此细胞上结合实验中，EGFR掩蔽效率对于复合物57而言为105，对于复合物-67而言为338，并且对于CI106而言为594。

实施例3.可激活和激活的HBPC的生物活性

使用细胞毒性测定来测定可激活(掩蔽的)和激活的(未掩蔽的)HBPC的生物活性。人PBMC购自Stemcell Technologies(Vancouver,Canada)，并与表达EGFR的癌细胞系HT29-luc2(Perkin Elmer,Inc.,Waltham,MA(先前Caliper Life Sciences,Inc.))一起在补充有5％热灭活人血清(Sigma，目录H3667)的RPMI-1640+glutamax中以5:1的E(CD3+):T比率共培养。测试了act-CI106、act-复合物-57和act复合物-67以及可激活(掩蔽的)CI106、复合物-57和复合物-67的滴定。48小时后，使用ONE-GloTM荧光素酶测定系统(Promega,Madison,WI目录E6130)评价细胞毒性。在M200 Pro(Tecan Trading AG,Switzerland)上测量发光。通过曲线拟合分析在GraphPad PRISM中计算并绘制细胞毒性百分比。通过计算EC50来比较激活的分子的效力。掩蔽效率计算为每个分子的完整的与激活的EC50的比率。

如图3A和3B所示，可激活(掩蔽的)HBPC相对于激活的(未掩蔽的)双特异性抗体具有偏移的剂量反应曲线。在此测定中，图3A中的数据表明CI106的掩蔽效率为29,650，并且复合物-57的掩蔽效率为1,034。图3B中的数据表明CI106的掩蔽效率为26,537，并且复合物-67的掩蔽效率为7,141。基于使用此测定的多项实验，与复合物-67相比，复合物-57通常表现出降低10-42倍的效力。

实施例4.HBPC诱导小鼠中已建立的HT29肿瘤的消退

在此实施例中，分析了可激活(掩蔽的)HBPC复合物-67和对照CI106在移植人PBMC的NSG小鼠中诱导已建立的HT29异种移植肿瘤的消退或减少所述肿瘤的生长的能力。

根据确立的程序培养人结肠癌细胞系HT29-luc2(Perkin Elmer,Inc.,Waltham,MA))。纯化、冷冻的人PBMC获自Hemacare,Inc.(Van Nuys,CA)。NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠获自The Jackson Laboratories(Bar Harbor,ME)。

在第0天，在每只小鼠的右侧腹皮下接种100μL RPMI+Glutamax无血清培养基中的2x10⁶个HT29-luc2细胞。在第3天，以1:1的CD3+T细胞与肿瘤细胞比率施用(腹膜内(i.p.))来自单个供体的先前冷冻的PBMC。当肿瘤体积达到150-200mm³(大约第12天)时，将小鼠随机分到治疗组中并根据表7静脉内给药。每周两次测量肿瘤体积和体重。调整复合物-67的剂量水平以将CI106与复合物-67之间的分子量差异考虑在内。

表7.HT29-luc2异种移植研究的组和剂量。

如图4所示，其描绘肿瘤体积对比初始治疗剂量后天数(第0天)的图，存在复合物-67对HT29-luc2异种移植肿瘤的生长的剂量依赖性效应。在等效剂量(1mg/kg的CI106和0.6mg/kg的复合物-67)下，复合物-67表现出比对照CI106更有效的抗肿瘤活性；p＝0.0099RMNOVA与邓尼特(Dunnett's))。

实施例5.在用可激活HBPC治疗后小鼠中已建立的HCT116肿瘤的肿瘤消退

分析了激活的(未掩蔽的)HBPC act-复合物-67和可激活的(掩蔽的)HBPC复合物-67在移植人T细胞的NSG小鼠中诱导已建立的HCT116异种移植肿瘤的消退或减少所述肿瘤的生长的能力。根据确立的程序，将人结肠癌细胞系HCT116(ATCC)在RPMI+Glutamax+10％FBS中培养。肿瘤模型如实施例4中所述进行。小鼠根据表8给药。

表8.HCT116异种移植研究的组和剂量。

实施例6：用陶瓷羟基磷灰石色谱(CHT)纯化后单体百分比的评价

使用陶瓷羟基磷灰石色谱柱纯化双重掩蔽的CI106对照和可激活(掩蔽的)HBPC复合物-67，以比较纯化过程中高浓度下的二聚化的量。这是通过分析纯化过程中每个步骤的单体百分比来评估的。

将样品负载到以20g/L树脂负载的CHT I型、40μm珠柱(Biorad目录：157-0040和#157-0041)上。用平衡缓冲液10mM NaPO4、100mM组氨酸缓冲液pH 6.5洗涤柱，然后用10mMNaPO4、100mM组氨酸200mM赖氨酸-HCl缓冲液(pH 6.5)(对于CI106)和10mM NaPO4、100mM组氨酸100mM赖氨酸-HCl缓冲液(pH 6.5)(对于复合物-67)以2mL级分洗脱。以2mL级分收集CI106，然后合并五个级分以形成洗脱液。对于CI106，峰值收集在25mAU左右开始，并且在300mAU左右停止。复合物-67被收集在一个管中，其中峰值收集从100mAU开始并且在500mAU停止。随后进行500mM NaPO4(pH 7.0)的剥离缓冲液步骤。通过280nm波长下的UV吸收来定量每个级分的蛋白质浓度。每个级分中的单体百分比通过SE-HPLC(分析规模尺寸排阻色谱)基于总峰面积来确定。

在色谱的结合阶段，蛋白质首先结合至柱的顶部部分，并且仅当上部部位变满时才沿着柱向下移动。这导致分子在柱上处于高浓度。多聚体形式的CI106和复合物-67以比单体形式更强的结合力与柱结合，并且因此需要更强的缓冲液才能从柱中完全去除。因此，当用较弱的缓冲液洗脱柱、然后用较强的缓冲液剥离时，洗脱液具有比剥离液更低的二聚体百分(更高的单体百分比)。如表10所示，复合物-67(可激活HBPC)运行导致洗脱液中7.6％的单体百分比增加，从而将高分子量材料留在柱上，直至剥离步骤，其导致洗脱液中77％的回收率。将其与CI106运行进行比较，CI106运行导致洗脱液中单体百分比下降5.4％至65.0％，尽管更多二聚体材料(仅30.6％单体)留在柱上直到剥离，导致洗脱液中81％回收率。

表9：CHT色谱结果

这些结果表明，当在柱上处于高浓度时，复合物-67不会经历额外的二聚化，从而导致洗脱液中几乎所有高分子物质的去除，具有98.5％单体，相比之下对于CI106仅为65％。对于CI106，与原始负载相比，洗脱液池中存在更多的高分子物质。复合物-67的改进的行为使得能够通过CHT 1型色谱纯化高单体复合物-67。然而，由于当CI106在柱上经受高浓度时会发生二聚化，因此无法通过这种方法或任何评估的结合/洗脱色谱方法来纯化CI106。

实施例7：通过在离心浓缩器中浓缩评估浓度依赖性二聚化

在离心浓缩和以最高浓度过夜孵育后，比较复合物-67、复合物-57和双重掩蔽的对照CI106的蛋白质A和SEC纯化的制剂的单体百分比。

用蛋白质A和SEC纯化复合物-67、复合物-57和CI106，然后在低pH缓冲液(10mM乙酸盐、100mM赖氨酸，pH 6)中配制。将样品1:15稀释到PBS(753-45-01)中，并使用Pierce^TM蛋白质浓缩器PES 10K MWCO 0.5ml(Thermo Fisher目录号88513)通过在每个浓度下以14,000RPM离心2分钟进行浓缩。将最高浓度的样品储存过夜并评估单体百分比。所得浓度和单体量百分比显示在表10和图8中。

表10.单体可激活HBPC百分比对比总蛋白质浓度

图6和表10显示随着浓度增加，复合物-67在溶液中保持在高百分比的单体(98％-99％)和非常低的聚集。将这与CI106进行比较，CI106随着浓度增加显示出明显的浓度依赖性二聚化。复合物-57随着浓度增加显示出非常小的浓度依赖性二聚化，保持稳定的单体百分比。复合物-67在最高浓度下过夜孵育期间也保持了单体百分比，证明了单体百分比在较高浓度下的稳定性。

实施例8：可激活抗EGFR、抗CD3 TCB构建体CI107的安全性和功效

在此研究中，在临床前模型评价了CI107(一种具有CI106对照(如上所述)的相同结构形式的抗EGFR、抗CD3 TCB构建体)的安全性和功效以评估用于治疗表达EGFR的肿瘤的治疗潜力。CI107如国际专利申请公布号WO 2019/075405中所述进行制备，其以引用的方式并入本文。CI107 TCB构建体在此实施例中替代地称为“T细胞接合双特异性抗体”或“TCB”。

方法

动物研究

所有动物研究均根据管理进行每项研究的设施的机构动物护理和使用委员会条例进行。小鼠异种移植研究由CytomX Therapeutics,Inc(CytomX)进行，并且食蟹猴研究由Altasciences(Everett,WA)进行。所有动物研究均遵循USDA动物福利法案和实验室动物护理和使用指南规定的法规。

材料

本研究中描述的所有TCB和其它构建体(包括CI107、CI128、CI020、CI011、CI040、CI048和CI104)均由CytomX Therapeutics,Inc.产生(参见WO 2016/014974和WO 2019/075405)。CI107、CI128、CI020、CI011、CI040和CI104具有与CI106相同的结构形式。CI048对应于激活的CI011。通过用尿激酶型纤溶酶原激活因子(uPA)在体外处理、然后进行SEC纯化而产生了激活的TCB(Desnoyers 2013)。HT29-Luc2细胞获自Caliper Life Sciences(Hopkinton,MA)，并且HCT116和Jurkat细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。人外周血单核细胞(PBMC)作为来自HemaCare Corporation(Northridge,CA)、AllCells(Alameda,CA)或STEMCELL Technologies(Seattle,WA)的个体供体的细胞的冷冻保存小瓶获得。NOD.Cg-Prkcdscid Il2rg tm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠获自Jackson Laboratories(Sacramento,CA)。

细胞结合测定

HT29和Jurkat细胞维持在完全培养基中。使用Versene^TM细胞解离缓冲液收获HT29细胞。将细胞以250x g离心510分钟并重悬于含有2％ FBS(BD Pharminogen)的FACS缓冲液中。将细胞以150,000/孔涂铺在V形底96孔板中，并用通过在FACS缓冲液中的3倍连续稀释获得的各种浓度的复合物-07或体外蛋白酶激活的CI104处理，对于HT29和Jurkat细胞两者以1.5μM CI107开始，对于HT29细胞以0.05μM激活的CI104开始，并且对于Jurkat细胞以0.5μM激活的CI104开始。将细胞在4℃下孵育1小时，用FACS缓冲液洗涤两次，并重悬于10μg/mlAlexa Fluor 647抗人Fc第二抗体中。然后将细胞避光在4℃下孵育30-60分钟，用FACS缓冲液洗涤两次，重悬于含有7-AAD的FACS缓冲液中，并在MACSQuant流式细胞仪(MiltenyiBiotech)上进行分析。将平均荧光强度数据针对第二抗体背景信号进行校正，在GraphpadPrism中绘制，并计算EC50值。

细胞毒性测定

将HCT116-Luc2或HT29-Luc2以10,000个细胞/孔在RPMI+5％人血清中涂铺到96孔白色平底组织培养处理板(Costar#3917)中。将人PBMC新鲜解冻并用RPMI+5％人血清洗涤两次，并将100,000个PBMC在RPMI+5％人血清中添加至含有HCT116-Luc2或HT29-Luc2的孔中。然后将蛋白酶激活的TCB或CI107以通过3倍连续稀释获得的不同浓度添加至孔中。对照孔含有未处理的靶细胞+效应细胞、仅靶细胞、仅效应细胞或仅培养基。然后将板在37℃和5％ CO2下孵育约48小时。使用ONE-Glo荧光素酶测定系统(Promega，#E6120)和Tecan酶标仪测量细胞活力。细胞毒性百分比计算如下：(1-(实验RLU/未处理的平均RLU))*100。

体外T细胞激活和细胞因子分析

通过在与HT29-Luc2或HCT116-Luc2细胞共培养的PBMC中诱导CD69表达来测量T细胞激活。将HT29-Luc2或HCT116-Luc2细胞以10,000个细胞/孔涂铺在U形底非贴壁板中。将人PBMC新鲜解冻并用含有血清的RPMI洗涤两次，并将100,000个PBMC/孔添加至含有肿瘤细胞的板中。将仅含有PBMC的重复板接种用于流式细胞术补偿对照。在培养基中制备CI107、激活的CI107或CI128的三倍连续稀释液，并将其添加至涂铺的细胞中。将细胞在37℃和5％CO₂下孵育16小时。为了准备流式细胞术分析，将板以250x g离心10-15分钟。去除上清液用于细胞因子分析，将Fc封闭液(Fc block)(Human TruStain FcX,BioLegend)添加至每个孔中，并将板孵育10分钟。将含有抗CD45-FITC(BioLegend)、抗CD3-太平洋蓝(BioLegend)、抗CD8a-APC(BioLegend)和抗CD69-PE-Cy7(BioLegend)的抗体混合物或适当的补偿对照添加至孔中，并将板在4℃下避光振荡下孵育30-60分钟。然后用FACS缓冲液洗涤板并重悬于含有7-AAD的FACS缓冲液中。使用Attune流式细胞仪测量荧光，并收集了代表PBMC的15,000个事件。

对于细胞因子分析，使用了Meso Scale Discovery U-PLEX板测定(Meso ScaleDiagnostics,Rockville,MA)。U-PLEX板按照制造商的方案制备，以评价MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-2和IFN-γ的水平。将从与PBMC共培养并用掩蔽的(可激活)CI107、激活的(本文也称为“act-”)CI107或CI128处理的HT29-Luc2或HCT116-Luc2收集的上清液样品稀释，添加至板中，并按照制造商的说明书进行加工。

体内功效研究

对于体内实验，在携带HT29-Luc2或HCT116肿瘤并移植有由腹膜内(IP)注射人PBMC产生的人T细胞的小鼠中测量TCB对肿瘤生长的影响。在第0天，将200万个HT29-Luc2或HCT116细胞在100μl无血清RPMI中皮下注射到雌性NSG小鼠的侧腹中。将来自单个供体的冷冻PBMC新鲜解冻，并在第3天在100-200μL RPMI+Glutamax无血清培养基中通过腹膜内注射施用。先前对PBMC的CD3+T细胞百分比进行了表征，并且待用于体内施用的PBMC的数量是基于1:1的CD3+T细胞与肿瘤细胞比率。在静脉内(IV)给予TCB、对照物品或媒介物之前，使用大约第12天的肿瘤测量值对小鼠进行随机分组。将动物每周一次给予测试物品持续3周，并且每周两次记录肿瘤体积和体重。激活的TCBCI104用于体内研究。CI104构建体与CI107的不同之处仅在于用于将CD3掩模栓系至scFv的可裂解接头。在体外蛋白酶激活以完全去除掩模后，激活的CI104与激活的CI107相同，并且可用于评估激活的CI107的活性，并且随后的体外细胞毒性研究证实，激活的CI104的活性与激活的CI107的活性相同。

非人灵长类动物安全性研究

取决于测试物品，雄性食蟹猴在第1天接受测试物品的缓慢静脉内推注，或者在第1天和第15天接受一次。施用测试物品后，每天两次进行临床观察。在给药后的不同时间点收集血液样品以用于分析细胞因子释放、血清化学、血液学和毒代动力学。使用LifeTechnologies Monkey Magnetic 29-Plex Panel试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)对血清样品进行细胞因子分析。对于毒代动力学分析，将样品在装运前加工成血浆并储存在-60℃至-86℃下，以供AIT Bioscience(Indianapolis IN)或CytomX进行分析。使用抗独特型捕获抗体和抗人IgG(Fc)捕获抗体通过ELISA测量测试物品的血浆浓度。毒代动力学分析由Northwest PK Solutions利用Phoenix WinNonlin v6.4(Certara,Princeton,NJ)使用非隔室分析进行。

结果

CI107被设计为含有抗EGFR和抗CD3结构域的双重掩蔽(可激活)双臂二价双特异性分子。CI107是使用西妥昔单抗衍生的抗体与融合至重链N末端的SP34衍生的抗CD3εscFv生成的。CI107具有人IgG1 Fc结构域，具有可使Fc功能沉默的突变。为了生成CI107，使用侧翼为柔性富含Gly-Ser的肽接头的蛋白酶可裂解底物接头，将抗EGFR抗体组分的特定掩蔽肽融合至轻链的N末端，如前所述(Desnoyers 2013)。类似地，使用蛋白酶可裂解底物接头将对抗CD3组分具有特异性的掩蔽肽添加到scFv中。CI107损害Fc效应子功能，以最小化与表达FcγR的细胞的交联。所述设计旨在使富含蛋白酶的肿瘤微环境中的靶标结合和活性最大化，同时使正常组织中的结合和活性最小化。此实施例中使用的所有比较TCB均含有EGFR和CD3结合结构域、掩模和具有不同程度的可裂解性的接头肽。CI011和CI040是CI104和CI107的第一代型式。CI104和CI107分子含有优化的CD3 scFv、下一代可裂解接头和额外的Fc沉默突变。CI104和CI107具有相同的掩模以及EGFR和CD3结合结构域，但CD3蛋白酶接头不同；然而，蛋白酶激活后，激活的TCB是相同的。CI128用作非靶向对照，其中EGFR结合剂被不相关的抗体(抗RSV)替代。

掩蔽损害与细胞表面上EGFR的结合。

为了评估EGFR结合结构域的掩蔽是否损害与细胞表面上表达的EGFR的结合，测量了CI107和比较激活的TCB构建体(即，act-TCB)与表达EGFR的HT29和HCT116细胞的结合。

将靶细胞与递增浓度的CI107或比较激活的构建体一起孵育，并通过流式细胞术评价结合。如图7A和7B所示，与激活的TCB CI107相比，CI107中EGFR掩模的存在显著减弱了与细胞表面上表达的EGFR的结合。激活的TCB构建体与HT29细胞结合的计算Kd为0.17nM，而CI107的结合的Kd为91.28nM，代表与激活的TCB相比，结合减少大于500倍。使用HCT116细胞获得了类似的结果。还评价了CI128的结合，CI128是一种非靶向对照TCB，其含有与CI107相同的抗CD3分子，但缺乏EGFR靶向。此对照不结合至HT29或HCT116细胞(参见图7A和7B)。

掩蔽损害与淋巴细胞表面上CD3的结合。

为了确定抗CD3结合结构域的掩蔽是否损害CI107与淋巴细胞表面上的CD3的结合，测量了CI107和激活的CI107(即激活的TCB)与Jurkat细胞的结合。如图7C中所示，激活的TCB与Jurkat细胞结合的Kd为0.62nM。然而，没有检测到CI107的结合，并且无法计算Kd。激活的对照CI128以与激活的TCB相似的亲和力结合Jurkat细胞。

总之，这些数据表明CI107中抗EGFR和抗CD3结合结构域的双重掩蔽减弱了与表达EGFR或CD3的细胞的结合。

掩蔽减弱PBMC共培养中的细胞毒性和T细胞激活。

为了确定用CI107靶向EGFR是否能够导致抗肿瘤细胞作用，进行了体外细胞毒性测定。将表达荧光素酶的HT29或HCT116细胞与人PBMC共培养，并与递增浓度的CI107、激活的TCB或非靶向对照CI128一起孵育。在48小时培养后，通过荧光素酶测定测量HCT116-Luc2或HT29-Luc2细胞的活力。如图8A所示，用对照CI128处理对与PBMC共培养的HCT116-Luc2细胞产生最小的细胞毒性，表明细胞毒性活性需要EGFR和CD3两者的接合。相比之下，掩蔽的CI107和激活的CI107(即act-TCB)对HCT116-Luc2细胞具有细胞毒性作用。然而，与掩蔽形式相比，激活的TCB在低得多的浓度下产生细胞毒性，EC50值分别为0.44pM和7297pM。在HT29-Luc2细胞中观察到类似的结果，激活的TCB的EC50值为0.25pM，相比之下CI107的EC50值为3678pM(图8B)。因此，在没有蛋白酶激活的情况下，CI107中抗EGFR和抗CD3结构域的双重掩蔽导致由PBMC介导的细胞毒性活性降低大约15,000倍。

用CI107治疗诱导CD69表达，CD69是T细胞激活的标志物。

为了确定CI107是否导致T细胞激活，在用掩蔽的CI107、激活的CI107(即，act-TCB)和对照CI128处理后，测量了与HCT116-Luc2或HT29-Luc2细胞共培养的PBMC中的CD69水平。CD69充当T细胞激活的标志物；在TCR/CD3接合后，T淋巴细胞表面上迅速诱导CD69表达，并充当T细胞激活和增殖的共刺激分子。将与HCT116-Luc2或HT29-Luc2细胞共培养的人PBMC用递增浓度的CI107、激活的TCB(即激活的CI107)或对照CI128处理16小时，并通过流式细胞术测量CD69表达水平。如图8C所示，CI107导致与HCT116-Luc2细胞共培养的CD8+T细胞上CD69表达的诱导，EC50为14178pM。相比之下，用激活的CI107处理导致CD69诱导，EC50为7.65pM，反映了与CI107相比T细胞激活曲线的约18,000倍偏移。使用非EGFR靶向对照CI128未观察到T细胞激活，表明仅CD3的接合不足以激活T细胞。类似地，处理来自与HT29-Luc2细胞共培养的同一供体的PBMC导致CD69诱导，掩蔽CI107的EC50值为65971pM，相比之下激活的TCB的EC50值为8.75pM，反映了CD69诱导能力的大约7500倍差异(图8D)。

用CI107治疗导致细胞因子释放。

为了进一步评估用TCB处理后与表达EGFR的癌细胞共培养的PBMC中的T细胞激活，在用CI107、激活的TCB(即，激活的CI107)或对照CI128处理后评价细胞因子释放。用递增浓度的TCB处理后16小时，测量了IFN-γ、IL-2、IL6、MCP-1和TNF-α的水平。如图9A-9E所示，用浓度在104pM范围内的CI107处理导致所测量的每种细胞因子的释放。相比之下，在用1-100pM范围内的浓度处理后，激活的TCB导致细胞因子释放。这些结果在不同的PBMC供体细胞与癌细胞系(HCT116-Luc2对比HT29-Luc2)之间通常一致。

总之，这些数据表明，CI107中EGFR和CD3结合结构域的双重掩蔽在不存在蛋白酶激活的情况下减弱T细胞激活。

TCB对蛋白酶裂解的敏感性与体内抗肿瘤功效和肿瘤内T细胞相关。

在体内评价TCB的抗肿瘤功效。将携带HT29-Luc2肿瘤并移植有人PBMC的免疫功能低下小鼠每周一次用媒介物(PBS)或0.3mg/kg TCB治疗持续3周，所述TCB含有具有不同蛋白酶敏感性的接头(CI011、CI040)、不可裂解的接头(CI020)或未掩蔽的双特异性治疗性CI048。由于不可裂解的接头，CI020预计具有最小的抗肿瘤活性，而未掩蔽的CI048预计具有最大功效。CI011和CI040两者均含有EGFR和CD3掩模，由于不同接头肽而具有不同的蛋白酶敏感性；CI040的蛋白酶敏感性高于CI011。

如图10A所示，用未掩蔽的TCB CI048治疗导致治疗开始后一周内肿瘤消退。类似地，用掩蔽CI011和CI040治疗也导致肿瘤消退或停滞；与CI011相比，在CI040情况下观察到的回归与此分子中接头的更高可裂解性相关。相比之下，用含有不可裂解接头的CI020治疗不会影响肿瘤生长，表明蛋白酶可裂解性是TCB体内抗肿瘤活性所必需的。

为了确定由所测试的TCB介导的抗肿瘤功效是否与肿瘤中的T细胞存在相关，在动物接受1mg/kg剂量的掩蔽TCB或激活的TCB后一周收获肿瘤，并进行针对CD3的免疫组织化学。如图10B所示，在用媒介物或不可裂解的CI020处理后，在肿瘤组织中观察到极少量的T细胞。相比之下，用TCB CI040或体外蛋白酶激活的TCB CI048处理后观察到T细胞数量增加。同样，具有较高蛋白酶敏感性(CI040)的TCB导致肿瘤中更多数量的T细胞。

总而言之，这些数据表明TCB可产生肿瘤内T细胞和体内抗肿瘤功效，其与EGFR和CD3结合结构域掩模的蛋白酶裂解的敏感性相关。

治疗诱导已建立的异种移植肿瘤的剂量依赖性消退。

评价了CI107对体内肿瘤生长的影响。将NSG小鼠皮下植入HT29细胞，然后腹膜内注射PBMC，并且允许PBMC植入大约11天。然后用媒介物、0.5mg/kg CI107或1.5mg/kg CI107每周一次治疗动物，持续3周。如图11A所示，用0.5mg/kg CI107治疗导致肿瘤停滞，并且1.5mg/kg CI107在治疗开始后大约一周开始导致肿瘤消退。

还在HCT116肿瘤中评价了CI107的体内功效。在肿瘤和PBMC植入后，用媒介物、0.3mg/kg CI107、1mg/kg CI107或0.3mg/kg激活的TCB治疗动物。如图11B所示，0.3mg/kgCI107延迟HCT116肿瘤生长，而1mg/kg CI107和0.3mg激活的TCB在治疗期间导致相似水平的肿瘤消退和停滞。

这些数据证明CI107诱导HT29和HCT116异种移植肿瘤中肿瘤生长和消退的剂量依赖性抑制，并且高3倍剂量的CI107的抗肿瘤活性与激活的TCB的抗肿瘤活性相似。

相对于激活的CI107，掩蔽的CI107在食蟹猴中提供增加的安全性。

在食蟹猴研究中评价了CI107的临床前耐受性。动物接受了0.06mg/kg或0.18mg/kg激活的CI107(即act-TCB)和0.6mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或6.0mg/kg CI107的单次施用，并且动物随后进行临床观察。用0.18mg/kg激活的TCB治疗的动物经历了严重临床效果，包括呕吐、食欲不振、面色苍白、驼背姿势和瘦弱的外表，不良反应早在给药后2小时至长达10天就可观察到。用0.06mg/kg激活的TCB治疗的动物经历了中度和短暂的临床效果，包括给药后第1天的呕吐和驼背姿势；基于这些效应的快速消退，0.06mg/kg被定义为激活的TCB的最大耐受剂量(MTD)。相比之下，用2.0mg/kg CI107治疗的动物仅经历短暂且轻微的临床效果(第2天呕吐)，并且用0.6mg/kg CI107治疗的动物没有经历任何不良反应。用4.0mg/kgCI107治疗的动物经历了中度临床效果(包括给药后4、8和24小时的呕吐以及第2天食欲不振)。用6.0mg/kg CI107治疗的动物在第2天被发现死亡。死亡前注意到的临床体征包括给药后的驼背姿势、面色苍白、呕吐和液体粪便。因此，4.0mg/kg被认为是CI107的MTD。总体而言，与激活的TCB相比，掩蔽的CI107实现了耐受性的大于60倍提高。

用激活的CI107或掩蔽的CI107治疗后还检查了细胞因子水平。如图12所示，在给药后8小时用激活的TCB治疗的动物中IL-6(12A)和IFN-γ(12B)的水平升高。相比之下，用0.6mg/kg或2.0mg/kg CI107治疗后，观察到IL-6或IFN-γ的变化最小；仅在用4.0mg/kgCI107治疗后观察到这些细胞因子的水平升高。与临床观察结果一致，CI107使细胞因子释放剂量-反应变化超过60倍。

血清化学的分析还证明了激活的TCB与CI107之间的差异。如图12C所示，在给药后48小时，用激活的TCB治疗导致天冬氨酸转氨酶(AST)(肝细胞损伤的标志物)的剂量依赖性增加。相比之下，在任何耐受剂量水平下用CI107治疗后，没有观察到AST的变化，表明在这种掩蔽的TCB的情况下耐受性有所改善。

为了确定EGFR和CD3结合结构域的掩蔽是否影响药代动力学，测量了给药后激活的TCB(即，激活的CI107)和掩蔽的CI107的血浆浓度。如图12D所示，激活的TCB在给药后24小时内迅速从循环中清除。相比之下，CI107在给药后在血浆中维持长达7天，这表明掩蔽可增加相对于激活的TCB的暴露。单次施用0.06mg/kg激活的TCB后的AUC(0-7)为0.04天*nM(n＝1)，而施用2mg/kg CI107后的AUC(0-7)为331.7天*nM(n＝3的平均值)，表明耐受暴露量增加大于8,000倍。

这表明用掩蔽的CI107观察到的耐受性和药代动力学的改善与正常组织环境中与EGFR和CD3的结合的预期减弱一致。

表11.序列表

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本公开的范围不受本文所述的方面的限制。实际上，除所描述的那些以外，根据前述描述和附图，本公开的多种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。此类修改旨在处于所附权利要求书的范围内。

本文引用的所有参考文献(例如，公布或专利或专利申请)均以引用的方式整体并入本文，并且出于所有目的，所述引用的程度就好像具体地且单独地出于所有目的将每个单独的参考文献(例如，公布或专利或专利申请)以引用的方式整体并入一般。

一些方面在以下权利要求之内。

Claims

1.一种可激活抗EGFR、抗CD3异源多聚体双特异性多肽复合物(HBPC)，其包含：

(a)第一多肽，所述第一多肽包含(i)单链可变片段(scFv)，所述单链可变片段包含第一重链可变结构域(VH1)和第一轻链可变结构域(VL1)，其中所述VH1和所述VL1一起形成特异性结合CD3多肽的T细胞分化簇(CD3)靶向结构域，(ii)第一掩蔽部分(MM1)，(iii)第一可裂解部分(CM1)，(iv)第二重链可变结构域(VH2)，和(v)第一单体Fc结构域(Fc1)；

(b)第二多肽，所述第二多肽包含(i)第二轻链可变结构域(VL2)，其中所述VH2和所述VL2一起形成特异性结合EGFR的EGFR靶向结构域，(ii)第二掩蔽部分(MM2)，和(iii)第二可裂解部分(CM2)；和

(c)第三多肽，所述第三多肽(i)包含第二单体Fc结构域(Fc2)，并且(ii)不包含免疫球蛋白可变结构域。

2.如权利要求1所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述CD3多肽是CD3的ε链。

3.如权利要求1所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述VH1包含：

(i)包含氨基酸序列KYAMN(SEQ ID NO:3)的VH CDR1，

(ii)包含氨基酸序列

RIRSKYNNYATYYADSVKD(SEQ ID NO:4)的VH CDR2，和

(iii)包含氨基酸序列HGNFGNSYISYWAY(SEQ ID NO:5)的VH CDR3；并且其中所述VL1包含：

(i)包含氨基酸序列GSSTGAVTSGNYPN(SEQ ID NO:6)的VL CDR1，

(ii)包含氨基酸序列GTKFLAP(SEQ ID NO:7)的VL CDR2，和

(iii)包含氨基酸序列VLWYSNRWV(SEQ ID NO:8)的VL CDR3。

4.如权利要求3所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述scFv包含具有与SEQ IDNO:9至少90％同一的氨基酸序列的VH1和/或具有与SEQ ID NO:10至少90％同一的氨基酸序列的VL1。

5.如权利要求4所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述scFv包含具有SEQ IDNO:9的氨基酸序列的VH1和具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的VL1。

6.如权利要求1-5中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述VH2包含：

(i)包含氨基酸序列NYGVH(SEQ ID NO:15)的VH CDR1，

(ii)包含氨基酸序列VIWSGGNTDYNTPFTS(SEQ ID NO:16)的VH CDR2，和

(iii)包含氨基酸序列ALTYYDYEFAY(SEQ ID NO:17)的VH CDR3。

7.如权利要求1-6中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述VL2包含：

(i)包含RASQSIGTNIH(SEQ ID NO:18)的VL CDR1，

(ii)包含YASESIS(SEQ ID NO:19)的VL CDR2，和

(iii)包含QQNNNWPTT(SEQ ID NO:20)的VL CDR3。

8.如权利要求6所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述VH2包含与SEQ ID NO:21至少90％同一的氨基酸序列。

9.如权利要求6所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述VH2包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。

10.如权利要求1-9中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述Fc1包含与SEQ ID NO:23至少90％同一的氨基酸序列。

11.如权利要求10所述的可激活双特异性多肽复合物，其中Fc1包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。

12.如权利要求1-11中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述第一多肽还包含在所述VH2与所述Fc1之间的重链CH1结构域。

13.如权利要求1-12中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述第一多肽还包含在所述VH2与所述Fc1之间的免疫球蛋白铰链区。

14.如权利要求1-13中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述第一多肽从氨基末端至羧基末端包含以下结构排列：MM1-CM1-scFv-VH2-CH1-铰链区-Fc1，其中每个“-”独立地为直接或间接键联。

15.如权利要求1-14中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述第一多肽包含一个或多个接头。

16.如权利要求15所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述接头包含约1至约20个氨基酸。

17.如权利要求1-16中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述VL2包含：

(i)包含氨基酸序列RASQSIGTNIH(SEQ ID NO:18)的VL CDR1，

(ii)包含氨基酸序列YASESIS(SEQ ID NO:19)的VL CDR2，和

(iii)包含氨基酸序列QQNNNWPTT(SEQ ID NO:20)的VL CDR3。

18.如权利要求17所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述VL2包含与SEQ ID NO:22至少90％同一的氨基酸序列。

19.如权利要求18所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述VL2包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。

20.如权利要求1-19中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述第二多肽从氨基末端至羧基末端包含以下结构排列：MM2-CM2-VL2，其中每个“-”独立地为直接或间接键联。

21.如权利要求1-20中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述第二多肽包含一个或多个接头。

22.如权利要求21所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述接头包含约1至约20个氨基酸。

23.如权利要求1-22中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述Fc2结合至所述Fc1。

24.如权利要求1-23中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述Fc2包含与SEQ ID NO:28至少90％同一的氨基酸序列。

25.如权利要求24所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述Fc2包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列。

26.如权利要求1-25中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述第一多肽和所述第三多肽中的至少一个还包含免疫球蛋白铰链区。

27.如权利要求26所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述第一多肽和所述第三多肽中的每一个均包含免疫球蛋白铰链区。

28.如权利要求27所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述第一多肽的所述免疫球蛋白铰链区和所述第三多肽的免疫球蛋白铰链区包含相同的氨基酸序列。

29.如权利要求27所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述第一多肽的所述免疫球蛋白铰链区和所述第三多肽的免疫球蛋白铰链区包含不同的氨基酸序列。

30.如权利要求1-29中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述第三多肽包含从氨基末端至羧基末端呈以下结构排列的免疫球蛋白铰链区：铰链区-Fc2。

31.如权利要求1-29中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述第一多肽、所述第二多肽和/或所述第三多肽包含一个或多个接头。

32.如权利要求1-31中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中MM1经由接头L1连接至CM1。

33.如权利要求1-32中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中MM2经由接头L2连接至CM2。

34.如权利要求1-31中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中L1和L2的氨基酸序列相同。

35.如权利要求1-31中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中L1和L2的氨基酸序列不同。

36.如权利要求1-35中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述CM1和所述CM2各自包含存在于患有癌症的受试者的肿瘤微环境中的蛋白酶的底物。

37.如权利要求1-36中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述CM1和所述CM2各自包含相同蛋白酶的底物。

38.如权利要求1-36中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述CM1和所述CM2包含不同蛋白酶的底物。

39.如权利要求32-38中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中CM1和CM2各自独立地包含选自表2中所示的蛋白酶的组的蛋白酶的底物。

40.如权利要求1-39中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述CM1和所述CM2中的至少一个包含丝氨酸蛋白酶或基质金属肽酶(MMP)的底物。

41.如权利要求1-40中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述CM1包含氨基酸序列SEQ ID NO:2，并且/或者CM2包含氨基酸序列SEQ ID NO:14。

42.如权利要求41所述的可激活双特异性多肽复合物，其中CM1包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。

43.如权利要求41或42中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中CM2包含SEQID NO:14的氨基酸序列。

44.如权利要求1-40中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述CM1包含氨基酸序列SEQ ID NO:73，并且/或者CM2包含氨基酸序列SEQ ID NO:14。

45.如权利要求44所述的可激活双特异性多肽复合物，其中CM1包含SEQ ID NO:73的氨基酸序列。

46.如权利要求44或45中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中CM2包含SEQID NO:14的氨基酸序列。

47.如权利要求1-46中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述MM1和/或所述MM2包含约5个氨基酸至约40个氨基酸。

48.如权利要求1-46中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述MM1选自由以下组成的组：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71或SEQ ID NO:72。

49.如权利要求1-48中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中MM2包含SEQ IDNO:13的氨基酸序列。

50.如权利要求1-49中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中MM1包含SEQ IDNO:1的氨基酸序列。

51.如权利要求15-50中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中所述一个或多个接头中的至少一个选自由以下组成的组：

(i)选自由以下组成的组的基于甘氨酸-丝氨酸的接头：(GS)_n，其中n是至少1的整数，(GGS)_n，其中n是至少1的整数(例如，约1至约20或约1至约10的整数)，(GGGS)_n(SEQ ID NO:40)，其中n是至少1的整数(例如，约1至约20或约1至约10的整数)，(GGGGS)n(SEQ ID NO:126)，其中n是至少1的整数(例如，约1至约20或约1至约10的整数)，(GSGGS)n(SEQ ID NO:41)，其中n是至少1的整数(例如，约1至约20或约1至约10的整数)，GSSGGSGGSG(SEQ ID NO:12)，GGSG(SEQ ID NO:42)，GGSGG(SEQ ID NO:43)，GSGSG(SEQ ID NO:44)，GSGGG(SEQ IDNO:45)，GGGSG(SEQ ID NO:46)和GSSSG(SEQ ID NO:47)，GGGGSGGGGSGG GGSGS(SEQ ID NO:48)，GGGGSGS(SEQ ID NO:49)，GGGGSG GGGSGGGGS(SEQ ID NO:50)，GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:51)，GGGGS(SEQ ID NO:52)，GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:53)，GGGS(SEQ ID NO:54)，GGGSGGGS(SEQ ID NO:55)，GGGSGGGSGGGS(SEQ ID NO:56)，GSSGGSGGSGG(SEQ ID NO:57)，GGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:58)，GGGSSGGS(SEQ ID NO:127)和GS；和

(ii)选自由以下组成的组的包含甘氨酸和丝氨酸以及赖氨酸、苏氨酸或脯氨酸中的至少一者的接头：GSTSGSGKPGSSEGST(SEQ ID NO:59)、SKYGPPCPPCPAPEFLG(SEQ ID NO:60)、GGSLDPKG GGGS(SEQ ID NO:61)、PKSCDKTHTCPPCPAPELLG(SEQ ID NO:62)、GKSSGSGSESKS(SEQ ID NO:63)、GSTSGSGKSSEGKG(SEQ ID NO:64)、GSTSGSGKSSEGSGSTKG(SEQ ID NO:65)和GST SGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:66)。

52.如权利要求1-51中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中：(1)所述第一多肽包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列，(2)所述第二多肽包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列，并且(3)所述第三多肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。

53.如权利要求1-51中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中：(1)所述第一多肽包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列，(2)所述第二多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且(3)所述第三多肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。

54.如权利要求1-51中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物，其中：(1)所述第一多肽包含SEQ ID NO:144的氨基酸序列，(2)所述第二多肽包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列，并且(3)所述第三多肽包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列。

55.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-54中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物和药学上可接受的载体。

56.一种药盒，所述药盒包含如权利要求55所述的药物组合物。

57.一种核酸，所述核酸包含编码如权利要求1-54中任一项所述的可激活双特异性多肽的所述第一多肽、所述第二多肽和所述第三多肽的核苷酸序列。

58.一种载体，所述载体包含如权利要求57所述的核酸。

59.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求58所述的载体。

60.一种产生可激活异源多聚体双特异性多肽复合物(HBPC)的方法，所述方法包括：

(a)在足以产生所述HBPC的条件下在液体培养基中培养如权利要求59所述的宿主细胞；以及

(b)回收所述HBPC。

61.一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-54中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物或如权利要求55所述的药物组合物。

62.如权利要求61所述的方法，其中所述受试者是人。

63.如权利要求61或62所述的方法，其中所述疾病是癌症。

64.如权利要求1-54中任一项所述的可激活双特异性多肽或如权利要求55所述的药物组合物，所述可激活双特异性多肽或所述药物组合物用于抑制有需要的受试者中的肿瘤生长。

65.根据权利要求1-54中任一项所述的可激活双特异性多肽复合物或如权利要求55所述的药物组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。