JP2024504372A

JP2024504372A - 抗ｐｄ－ｌ１モノクローナル抗体及びインターロイキン１５（ｉｌ－１５）、インターロイキン１５受容体１５アルファまたはインターロイキン２との融合タンパク質

Info

Publication number: JP2024504372A
Application number: JP2023544305A
Authority: JP
Inventors: ジャオ，ケーハオ; チェン，ヤン; ハッサン，サミュエル・クレメント; グエン，ジェナ; ジアン，ニン
Original assignee: エルピス・バイオファーマシューティカルズ
Priority date: 2021-01-22
Filing date: 2022-01-21
Publication date: 2024-01-31
Also published as: WO2022159771A1; KR20230148169A; EP4281186A1; IL304588A; CA3205670A1; AU2022211410A1; CN117083297A

Abstract

本開示は、ペア形成してＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを持つタンパク質を提供する。特定の実施形態では、タンパク質または抗原結合部位は抗体または、例えば、ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２Ｒβ二機能性抗体のような二機能性抗体を形成する。提供されているのはまた、そのようなタンパク質を含む医薬組成物、そのようなタンパク質を使用するための治療方法、及びがんの治療のためのものを含むその医薬組成物である。

Description

配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書で参照によって本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、３０００９６＿４０２ＷＯ＿ＳＥＱＵＥＮＣＥ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔである。テキストファイルは２２０ＫＢであり、２０２１年１月２０日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子提出されている。

ＣＤ２７４またはＢ７ホモログ１（Ｂ７－Ｈ１）としても知られるＰＤ－Ｌ１（プログラムされたデスリガンド１）は、ＰＤ－Ｌ１がＴ細胞上のＰＤ－１に結合すると、ＩＬ－２産生とＴ細胞増殖のＴＣＲが介在する活性化を阻害する１型膜貫通タンパク質である。抗ＰＤ－Ｌ１抗体はがんの治療のための治療薬として使用されている。しかしながら、腫瘍増殖をさらに効果的に調節するバイオ治療剤に対するニーズが依然として存在する。

本開示は、ペア形成してＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成することができる抗体の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインを持つタンパク質を提供する。本開示のタンパク質または抗原結合部位は、抗体または二機能性抗体、例えば、ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２Ｒβ二機能性抗体を形成してもよい。本開示のタンパク質または抗原結合部位は、がん性または感染性の状態及び障害を治療するまたは予防するために使用されてもよい。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているのは、配列番号３、１１、１９、３３、５２または６３の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）配列と；配列番号４、１２、２０、３４、４１、５３、または６４の相補性決定領域２（ＣＤＲ２）配列と；配列番号５、１３、２１、２７、３５、４６、５４、６５、７１、７４、７７、８０、８３、８６、または８９の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）配列とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；及び配列番号６、１４、２２、２８、３６、４７、５５、または６６のＣＤＲ１配列と；配列番号７、１５、２３、２９、３７、４２、４８、５６、６０、または６７のＣＤＲ２配列と；配列番号８、１６、２４、３０、３８、４３、４９、５７、または６８のＣＤＲ３配列とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位である。

いくつかの実施形態では、抗原結合部位は単鎖断片可変断片（ｓｃＦｖ）、抗原結合断片（Ｆａｂ）、抗体、または同様の抗原結合タンパク質に存在する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されているのは、
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位であって、
（ｉ）配列番号３、１１、１９、３３、５２、または６３の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；配列番号４、１２、２０、３４、４１、５３、または６４の相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；及び配列番号５５、１３、２１、２７、３５、４６、５４、６５、７１、７４、７７、８０、８３、８６、または８９の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；
（ｉｉ）配列番号６、１４、２２、２８、３６、４７、５５、または６６のＣＤＲ１配列；配列番号７、１５、２３、２９、３７、４２、４８、５６、６０、または６７のＣＤＲ２配列；及び配列番号８、１６、２４、３０、３８、４３、４９、５７、または６８のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含むＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位と；
（ｂ）インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）ポリペプチド、インターロイキン－１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒα）ポリペプチド、野生型インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチド、または操作されたＩＬ－２ポリペプチド、またはその機能的断片またはその変異型とを含む二機能性タンパク質である。

いくつかの態様では、本開示は疾患の治療をそれを必要とする対象にて行う方法を提供し、該方法は、治療有効量の抗原結合部位、タンパク質または抗体、二機能性タンパク質または抗体、またはその医薬組成物を対象に投与することを含む。特定の態様では、疾患はがんである。

本開示のこれら及び他の態様は、以下の詳細な説明及び添付の図面を参照することによって明らかになるであろう。本明細書に開示されたすべての参考文献は、あたかもそれぞれが個別に組み込まれたかのように、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

特定されたｓｃＦｖのＰＤ－Ｌ１へのＥＬＩＳＡ結合を示す。Ａ～Ｂは、高レベルの細胞表面ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するように操作されたＫ５６２細胞に結合する特定されたｓｃＦｖのＦＡＣＳ解析を示す。Ａ～Ｂは、ＨＴＲＦにおける特定されたｓｃＦｖについてのＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の競合結果を示す。特定されたｓｃＦｖに対するＪｕｒｋａｔ細胞のＮＦＡＴレポーターアッセイの結果を示す。親和性成熟したｓｃＦｖのＰＤ－Ｌ１へのＥＬＩＳＡ結合を示す。高レベルの細胞表面ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するように操作されたＫ５６２細胞に結合する親和性成熟したｓｃＦｖのＦＡＣＳ解析を示す。ＨＴＲＦにおける親和性成熟したｓｃＦｖについてのＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の競合結果を示す。親和性成熟したｓｃＦｖに対するＪｕｒｋａｔ細胞のＮＦＡＴレポーターアッセイを示す。抗体、二機能性抗体、及び代替の分子形式を示す。二機能性形式には、それぞれ、ＰＤ－Ｌ１に結合してＩＬ－２サイトカインを構成するもの、またはＰＤ－Ｌ１に結合してＩＬ－１５サイトカインを構成するものが含まれる。高レベルの細胞表面ヒトＰＤ－Ｌ１を発現するように操作されたＫ５６２細胞に結合する抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧ抗体のＦＡＣＳ解析を示す。抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５融合抗体のＪｕｒｋａｔ細胞ＮＦＡＴレポーターアッセイを示す。抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５融合抗体のｐ－ＳＴＡＴ５活性化の結果を示す。ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３－Ｔ細胞におけるｐ－ＳＴＡＴ５の活性化を示す。抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５融合抗体のｐ－ＳＴＡＴ５活性化の結果を示す。ＮＫ細胞におけるｐ－ＳＴＡＴ５の活性化を示す。抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５融合抗体のｐ－ＳＴＡＴ５活性化の結果を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるｐ－ＳＴＡＴ５の活性化を示す。抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５融合抗体のｐ－ＳＴＡＴ５活性化の結果を示す。制御性Ｔ細胞におけるｐ－ＳＴＡＴ５の活性化を示す。Ａ～Ｂは、ＩＬ－２受容体に対するＩＬ－２－ＦｃクローンのＥＬＩＳＡ結合を示す。Ａは、ＩＬ－２Ｒα受容体に対するＩＬ－２－ＦｃクローンのＥＬＩＳＡ結合を示す。Ｂは、ＩＬ－２Ｒβ受容体に対するＩＬ－２－ＦｃのＥＬＩＳＡ結合を示す。２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来の細胞に対して行われたＩＬ－２－Ｆｃクローンによるｐ－ＳＴＡＴ５活性化アッセイを示す。ドナー１２６由来のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｐ－ＳＴＡＴ５の活性化を示す。２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来の細胞に対して行われたＩＬ－２－Ｆｃクローンによるｐ－ＳＴＡＴ５活性化アッセイを示す。ドナー１２６由来のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるｐ－ＳＴＡＴ５の活性化を示す。２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来の細胞に対して行われたＩＬ－２－Ｆｃクローンによるｐ－ＳＴＡＴ５活性化アッセイを示す。ドナー１２６由来のＮＫ細胞におけるｐ－ＳＴＡＴ５の活性化を示す。２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来の細胞に対して行われたＩＬ－２－Ｆｃクローンによるｐ－ＳＴＡＴ５活性化アッセイを示す。ドナー１２６由来の制御性Ｔ細胞におけるｐ－ＳＴＡＴ５の活性化を示す。２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来の細胞に対して行われたＩＬ－２－Ｆｃクローンによるｐ－ＳＴＡＴ５活性化アッセイを示す。ドナー３５９由来のＣＤ４＋Ｔ細胞におけるｐ－ＳＴＡＴ５の活性化を示す。２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来の細胞に対して行われたＩＬ－２－Ｆｃクローンによるｐ－ＳＴＡＴ５活性化アッセイを示す。ドナー３５９由来のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるｐ－ＳＴＡＴ５の活性化を示す。２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来の細胞に対して行われたＩＬ－２－Ｆｃクローンによるｐ－ＳＴＡＴ５活性化アッセイを示す。ドナー３５９由来のＮＫ細胞におけるｐ－ＳＴＡＴ５の活性化を示す。２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来の細胞に対して行われたＩＬ－２－Ｆｃクローンによるｐ－ＳＴＡＴ５活性化アッセイを示す。ドナー３５９由来の制御性Ｔ細胞におけるｐ－ＳＴＡＴ５の活性化を示す。ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２ＲαまたはＩＬ－２Ｒβ）及びＰＤ－Ｌ１に対するＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖＦｃ変異体のＥＬＩＳＡ結合を示す。ＩＬ－２Ｒαに対するＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖＦｃ変異体のＥＬＩＳＡ結合を示す。ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２ＲαまたはＩＬ－２Ｒβ）及びＰＤ－Ｌ１に対するＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖＦｃ変異体のＥＬＩＳＡ結合を示す。ＩＬ－２Ｒβに対するＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖＦｃ変異体のＥＬＩＳＡ結合を示す。ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２ＲαまたはＩＬ－２Ｒβ）及びＰＤ－Ｌ１に対するＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖＦｃ変異体のＥＬＩＳＡ結合を示す。ＰＤ－Ｌ１に対するＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖＦｃ変異体のＥＬＩＳＡ結合を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖＦｃ変異体のＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１相互作用遮断活性についてのＪｕｒｋａｔ細胞ＮＦＡＴレポーターアッセイを示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖＦｃ変異体による、２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ドナー３５９由来のＣＤ４＋細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５プロファイリング曲線を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖＦｃ変異体による、２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ドナー３５９由来のＣＤ８＋細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５プロファイリング曲線を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖＦｃ変異体による、２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ドナー３５９由来のＮＫ細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５プロファイリング曲線を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖＦｃ変異体による、２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ドナー３５９由来の制御性Ｔ細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５プロファイリング曲線を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖＦｃ変異体による、２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ドナー１２６由来のＣＤ４＋細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５プロファイリング曲線を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖＦｃ変異体による、２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ドナー１２６由来のＣＤ８＋細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５プロファイリング曲線を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖＦｃ変異体による、２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ドナー１２６由来のＮＫ細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５プロファイリング曲線を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖＦｃ変異体による、２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ドナー１２６由来の制御性Ｔ細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５プロファイリング曲線を示す。ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２ＲαまたはＩＬ－２Ｒβ）及びＰＤ－Ｌ１に対するＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体のＥＬＩＳＡ結合を示す。ＩＬ－２Ｒαに対するＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体のＥＬＩＳＡ結合を示す。ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２ＲαまたはＩＬ－２Ｒβ）及びＰＤ－Ｌ１に対するＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体のＥＬＩＳＡ結合を示す。ＩＬ－２Ｒβに対するＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体のＥＬＩＳＡ結合を示す。ＩＬ－２受容体（ＩＬ－２ＲαまたはＩＬ－２Ｒβ）及びＰＤ－Ｌ１に対するＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体のＥＬＩＳＡ結合を示す。ＰＤ－Ｌ１に対するＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体のＥＬＩＳＡ結合を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体のＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１相互作用遮断活性についてのＪｕｒｋａｔ細胞ＮＦＡＴレポーターアッセイを示す。ＰＤ－Ｌ１及びＩＬ－２受容体（ＩＬ－２ＲαまたはＩＬ－２Ｒβ）に同時に結合するＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ二機能性変異体のセンサーグラムを示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体による、２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。Ａはドナー８５７由来のＣＤ４＋細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５プロファイリング曲線を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体による、２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ドナー８５７由来のＣＤ８＋細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５プロファイリング曲線を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体による、２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ドナー８５７由来のＮＫ細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５プロファイリング曲線を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体による、２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ドナー８５７由来の制御性Ｔ細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５プロファイリング曲線を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体による、２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ドナー３５９由来のＣＤ４＋細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５プロファイリング曲線を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体による、２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ドナー３５９由来のＣＤ８＋細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５プロファイリング曲線を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体による、２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ドナー３５９由来のＮＫ細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５プロファイリング曲線を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体による、２人の別々のドナーのヒトＰＢＭＣ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ドナー３５９由来の制御性Ｔ細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５プロファイリング曲線を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体による、マウス脾細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５の活性化を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体による、マウス脾細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５の活性化を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体による、マウス脾細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。ＮＫ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５の活性化を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体による、マウス脾細胞におけるＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。制御性Ｔ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５活性化を示す。操作された抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ（ＥＰ２０５／ＥＰ２０６）Ｑ３Ｄまたはアテゾリズマブで２０日間処理した後のヒト化マウスＭＢ－２３１モデルにおける阻害データからプロットした腫瘍増殖阻害曲線を示す。抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ（ＥＰ２０５／ＥＰ２０６）Ｑ３Ｄまたはアテゾリズマブで２０日間処理した後のヒト化マウスＭＢ－２３１モデルからの血漿におけるヒトＴＮＦα（Ａ）及びＩＦＮγ（Ｂ）のレベルを示す。抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂ（ＥＰ２０５／ＥＰ２０６）Ｑ３Ｄまたはアテゾリズマブで２０日間処理した後のヒト化マウスＭＢ－２３１モデルからの血漿におけるヒトＴＮＦα（Ａ）及びＩＦＮγ（Ｂ）のレベルを示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体で１１日間処理した後のＭＣ３８腫瘍担持マウスの血液免疫細胞プロファイリングを示す。ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－Ｔ細胞（対照）のプロファイリングを示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体で１１日間処理した後のＭＣ３８腫瘍担持マウスの血液免疫細胞プロファイリングを示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞のプロファイリングを示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体で１１日間処理した後のＭＣ３８腫瘍担持マウスの血液免疫細胞プロファイリングを示す。ＮＫ細胞のプロファイリングを示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体で１１日間処理した後のＭＣ３８腫瘍担持マウスの血液免疫細胞プロファイリングを示す。制御性Ｔ細胞のプロファイリングを示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体で１１日間処理した後のＭＣ３８腫瘍担持マウスの脾細胞免疫細胞プロファイリングを示す。ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－Ｔ細胞（対照）のプロファイリングを示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体で１１日間処理した後のＭＣ３８腫瘍担持マウスの脾細胞免疫細胞プロファイリングを示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞のプロファイリングを示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体で１１日間処理した後のＭＣ３８腫瘍担持マウスの脾細胞免疫細胞プロファイリングを示す。ＮＫ細胞のプロファイリングを示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体で１１日間処理した後のＭＣ３８腫瘍担持マウスの脾細胞免疫細胞プロファイリングを示す。制御性Ｔ細胞のプロファイリングを示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体またはアテゾリズマブで２０日間処理したｈＰＤ１トランスジェニックマウスのＢ１６Ｆ１０－ＰＤ－Ｌ１腫瘍における阻害データから得られた経時的な腫瘍体積の阻害データからプロットした腫瘍増殖阻害曲線を示す。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体またはアテゾリズマブで２０日間処理したＭＢ－２３１腫瘍ＮＣＧマウスモデルから得られた経時的な腫瘍体積の阻害データからプロットした腫瘍増殖阻害曲線を示す。Ａ～Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ／ＩＬ－２融合タンパク質によるヒトＰＢＭＣの処理後のＴ細胞におけるＰＤ－１の発現レベルを示す。Ａは、ＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５またはＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５による５日間の処理後のＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＰＤ－１の発現を示す。Ｂは、ＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５またはＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５による５日間の処理後の制御性Ｔ細胞におけるＰＤ－１の発現を示す。Ａ～Ｂは、抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ／ＩＬ－２融合タンパク質のＩＬ－２Ｒβγへの結合を示す。ＡはＨＥＫＢｌｕｅＩＬ－２細胞株におけるＣＤ２５、ＣＤ１２２、及びＰＤ－Ｌ１の発現レベルを示す。Ｂは抗ＣＤ２５抗体の存在下または非存在下でのＩＬ－２Ｒに対するＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５、ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の結合を示す。Ａ～Ｂは、生体内での蛍光標識したＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の腫瘍局在を示す。Ａは蛍光標識したＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の注射から２４時間後のＣ５７ＢＬ／６Ｎ及びＢ６Ｎアルビノの腫瘍担持マウスの代表的な画像を示す。ＢはＭＣ－３８－ｈＰＤ－Ｌ１及びＭＣ－３８の腫瘍部位へのＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の時間依存性濃縮を示す。ヒト化ＮＣＧマウスにおける経時的な腫瘍体積を示し、腫瘍部位に存在する免疫細胞を定量する。ヒト化ＮＣＧマウスにおける抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１応答性がん細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対するＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の腫瘍増殖阻害曲線を示す。ヒト化ＮＣＧマウスにおける経時的な腫瘍体積を示し、腫瘍部位に存在する免疫細胞を定量する。腫瘍部位におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルを示す。ヒト化ＮＣＧマウスにおける経時的な腫瘍体積を示し、腫瘍部位に存在する免疫細胞を定量する。腫瘍部位におけるＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルを示す。ヒト化ＮＣＧマウスにおける経時的な腫瘍体積を示し、腫瘍部位に存在する免疫細胞を定量する。腫瘍部位におけるＮＫ細胞のレベルを示す。ヒト化ＮＣＧマウスにおける経時的な腫瘍体積を示し、腫瘍部位に存在する免疫細胞を定量する。腫瘍部位における制御性Ｔ細胞のレベルを示す。Ａ～Ｂは、コールド腫瘍のマウスモデルにて実施された実験の結果を示す。Ａはヒト化マウスにおけるＣＯＬＯ２０５腫瘍に対するビヒクル対照及び抗ＰＤ－Ｌ１ＥＰ２０５／ＥＰ２０６と比較したＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の腫瘍増殖阻害曲線を示す。Ｂは図３３Ａのマウスの対応する体重変化を示す。抗ＰＤ１抗体耐性腫瘍のマウスモデルで行われた実験の結果を示す。ヒト化マウスにおけるＨ１９７５がん細胞腫瘍に対するＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の腫瘍増殖阻害曲線を示す。抗ＰＤ１抗体耐性腫瘍のマウスモデルで行われた実験の結果を示す。マウスの対応する体重変化を示す。抗ＰＤ１抗体耐性腫瘍のマウスモデルで行われた実験の結果を示す。腫瘍１ｍｍ^３あたりのｈＣＤ４５発現細胞の数を示す。抗ＰＤ１抗体耐性腫瘍のマウスモデルで行われた実験の結果を示す。Ｔｒｅｇ細胞に対するＣＤ８＋Ｔ細胞の比率を示す。抗ＰＤ１抗体耐性腫瘍のマウスモデルで行われた実験の結果を示す。腫瘍１ｍｍ^３あたりのＣＤ８＋Ｔ細胞の数を示す。抗ＰＤ１抗体耐性腫瘍のマウスモデルで行われた実験の結果を示す。ＮＫ細胞の制御性Ｔ細胞に対する比率を示す。カニクイザルモデルにて実施された実験の結果を示す。ＥＬＩＳＡによってサル血漿中で検出され、時間に対してプロットしたＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の濃度を示す。カニクイザルモデルにて実施された実験の結果を示す。０．１ｍｇ／ｋｇのＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５を投与した後のサルの血液中の免疫細胞集団の割合を示す。カニクイザルモデルにて実施された実験の結果を示す。０．５ｍｇ／ｋｇのＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５を投与した後のサルの血液中の免疫細胞集団の割合を示す。

抗ＰＤ－Ｌ１抗体は有望な免疫療法であるが、腫瘍をさらに効果的に調節するためにバイオ治療剤を利用する必要性が残っている。ＩＬ－２及びＩＬ－１５のようなサイトカインを使用した免疫療法はがん治療に効果があることが示されている。したがって、ＰＤ－Ｌ１を標的とする抗体は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５をさらに標的とする場合に有用な免疫調節であることが判明してもよい。本明細書で提供されているのは、新しい抗ＰＤ－Ｌ１抗体、ｓｃＦｖ、及びＦａｂポリペプチドである。加えて、本明細書で提供されているのは、（ａ）抗ＰＤ－Ｌ１抗体、ｓｃＦｖ、またはＦａｂポリペプチドと、（ｂ）（ｉ）ＩＬ－１５、ＩＬ－１５Ｒα、もしくは双方、または（ｉｉ）ＩＬ－２もしくはその操作されたその変異体とを含む二機能性融合タンパク質である。

本開示はヒトＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位を提供する。これらの抗原結合部位はＰＤ－Ｌ１の細胞外ドメインにおける種々のエピトープに結合することができる。そのような抗原結合部位を含有するタンパク質及びタンパク質複合体、例えば、抗体、二機能性抗体、抗体薬物複合体、免疫サイトカイン、及び二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、と同様にそのような抗原結合部位を含有するタンパク質（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））を発現する免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）はＰＤ－Ｌ１に関連するがんのような疾患の治療に有用である。本開示はまた、そのようなタンパク質、タンパク質複合体、免疫エフェクター細胞を含む医薬組成物、と同様にがん治療を含むが、これらに限定されないそのようなタンパク質、タンパク質複合体、免疫エフェクター細胞、及び医薬組成物を使用するための治療法も提供する。本開示に記載されている抗原結合部位の種々の態様は以下のセクションに記載されている；しかしながら、本開示の特定のセクションに記載されている抗原結合部位の態様は、いかなる特定のセクションにも限定されるものとは見なされない。

定義
本開示をさらに詳細に説明する前に、本明細書で使用される特定の用語の定義を提供することが本開示の理解に役立ってもよい。さらなる定義はこの開示の全体を通して示されている。

本明細書にて別途定義されない限り、科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別途要求されない限り、単数形の用語は、複数形の用語を含むものとし、複数形の用語は単数形の用語を含むものとする。

本発明の記載では、任意の濃度範囲、割合範囲、比率範囲または整数範囲は、特に指示されない限り、列挙される範囲内の任意の整数の値を含み、適切な場合、その分数（整数の１／１０及び１／１００など）を含むものと理解される。また、ポリマーサブユニット、サイズまたは厚さのような任意の物理的特徴に関して本明細書に記載されている任意の数値範囲は、別段の指示がない限り、記載された範囲内の任意の整数を含むものと理解されるべきである。本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、別途指示のない限り、示された範囲、値、または構造の±２０％を意味する。本明細書で使用されるとき「ａ」及び「ａｎ」という用語は、列挙された構成成分のうちの「１以上」を指すと理解すべきである。選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢の一方、双方またはその任意の組み合わせのいずれかを意味することを理解すべきである。本明細書で使用されるとき、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する（ｈａｖｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語は同義的に使用され、これらの用語及びその変形は、非限定的であると解釈されるように意図される。

「任意の」または「任意で」とは、続いて記載される要素、構成成分、事象または状況が発生しても発生しなくてもよく、その記載には、その要素、構成成分、事象、または状況が発生する事例と発生しない事例が含まれることを意味する。

加えて、本明細書に記載されている構造及びサブユニットの種々の組み合わせに由来する個々の構築物または構築物群は、あたかも各構築物または構築物群が個々に示されたのと同じ程度まで本出願によって開示されることを理解すべきである。したがって、特定の構造または特定のサブユニットの選択は、本開示の範囲内である。

「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙｏｆ」という用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等ではなく、請求項の特定の材料もしくは工程、または請求項に記載された主題の基本的特徴に実質的に影響を与えないものを指す。例えば、タンパク質のドメイン、領域、またはモジュール（例えば、結合ドメイン、ヒンジ領域、またはリンカー）またはタンパク質（１以上のドメイン、領域、またはモジュールを有してもよい）は、ドメイン、領域、モジュール、またはタンパク質のアミノ酸配列が、組み合わせてドメイン、領域、モジュールまたはタンパク質の長さの多くても２０％（例えば、多くても１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％または１％）に寄与し、ドメイン（複数可）、領域（複数可）、モジュール（複数可）またはタンパク質の活性（例えば、結合タンパク質の標的結合親和性）に実質的に影響を及ぼさない（すなわち、５０％を超えて活性を低下させない、例えば、４０％、３０％、２５％、１５％、１０％、５％または１％以下）伸長、欠失、突然変異、またはそれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端またはカルボキシ末端またはドメイン間のアミノ酸）を含む場合、特定のアミノ酸配列「から本質的に成る」。

本明細書で使用されるとき、「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の形で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、と同様にそれらのアミノ酸が後で修飾されたもの、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメート及びＯ－ホスホセリンである。アミノ酸類似体とは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素と、カルボキシル基と、アミノ基と、Ｒ基に結合しているα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。そのような類似体は、修飾されたＲ基を有する（例えば、ノルロイシン）、または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。アミノ酸模倣体とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の形で機能する化合物を指す。

本明細書で使用されるとき、「突然変異」とは、それぞれ参照または野生型の核酸分子またはポリペプチド分子と比べて核酸分子またはポリペプチド分子の配列の変化を指す。突然変異は、ヌクレオチド（複数可）またはアミノ酸（複数可）の置換、挿入、または欠失を含む配列にいくつかの異なるタイプの変化を生じることができる。

「保存的置換」とは、特定のタンパク質の結合特性に大きな影響を与えない、または変化させないアミノ酸の置換を指す。一般に保存的アミノ酸置換は、置換されるアミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる置換である。保存的置換には、次の群：１群：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）；２群：アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＺ）；３群：アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）；４群：アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）；５群：イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）；６群：フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）の１つに見られる置換が含まれる。さらに、または代わりに、アミノ酸は、類似の機能、化学構造、または組成（例えば、酸性、塩基性、脂肪族、芳香族、または硫黄含有）によって保存的置換群に分類することができる。例えば、脂肪族群には、置換の目的で、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、及びＩｌｅが含まれてもよい。他の保存的置換群には、硫黄含有：Ｍｅｔ及びシステイン（ＣｙｓまたはＣ）；酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、及びＧｌｎ；小さな脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、及びＧｌｙ；極性の負に帯電した残基とそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、及びＧｌｎ；極性の正に荷電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、及びＬｙｓ；大きな脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、及びＣｙｓ。大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐが挙げられる。追加情報はＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，（１９８４），Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙに見いだすことができる。

本明細書で使用されるとき、「タンパク質」または「ポリペプチド」はアミノ酸残基のポリマーを指す。タンパク質は、天然に存在するアミノ酸ポリマー、と同様に１以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマーと、天然に存在しないアミノ酸ポリマーとに適用される。本開示のタンパク質、ペプチド、及びポリペプチドの変異体もまた企図される。特定の実施形態では、変異体のタンパク質、ペプチド、及びポリペプチドは、本明細書に記載されている定義されたまたは参照のアミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る。

本明細書で使用されるとき、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」または「ポリ核酸」は、天然のサブユニット（例えば、プリン塩基またはピリミジン塩基）または非天然のサブユニット（例えば、モルホリン環）で構成され得る、共有結合したヌクレオチドを含むポリマー化合物を指す。プリン塩基にはアデニン、グアニン、ヒポキサンチン、及びキサンチンが含まれ、ピリミジン塩基にはウラシル、チミン、及びシトシンが含まれる。核酸分子には、ｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルスゲノムＲＮＡ、及び合成ＲＮＡを含むポリリボ核酸（ＲＮＡ）と、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを含むポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）とが含まれ、いずれも一本鎖または二本鎖であってもよい。一本鎖の場合、核酸分子はコード鎖であっても非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。アミノ酸配列をコードする核酸分子には、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。ヌクレオチド配列の一部のバージョンには、同時転写時または転写後のメカニズムを介してイントロン（複数可）が除去される範囲でイントロン（複数可）が含まれてもよい。言い換えれば、異なるヌクレオチド配列は、遺伝暗号の冗長性または縮重の結果として、またはスプライシングによって、同じアミノ酸配列をコードしてもよい。

本開示の核酸分子の変異体もまた企図される。変異体核酸分子は、本明細書に記載されているような定義されたポリヌクレオチドもしくは参照ポリヌクレオチドの核酸分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％同一であり、好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％同一である、または約６５～６８℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または約４２℃で０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、及び５０％ホルムアミドのストリンジェントなハイブリッド形成条件下にてポリヌクレオチドとハイブリッド形成するものである。核酸分子変異体は、標的分子との結合のような本明細書に記載されている機能性を有するその結合ドメインをコードする能力を保持している。

本明細書で使用されるとき、「配列同一性パーセント」とは、配列を比較することによって決定されるような、２以上の配列間の関係を指す。配列同一性を決定するための好ましい方法は、比較される配列間で最良の一致が得られるように設計される。例えば、配列を、最適な比較目的のために整列させる（例えば、最適な整列のために第１及び第２のアミノ酸配列または核酸配列の一方または双方にギャップを導入することができる）。さらに、非相同配列は比較の目的で無視されてもよい。本明細書で参照される配列同一性パーセントは、別段の指示がない限り、参照配列の長さにわたって計算される。配列の同一性と類似性を決定する方法は、公的に入手可能なコンピュータープログラムで見つけることができる。配列アラインメント及び同一性パーセントの計算は、ＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ２．０、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、またはＢＬＡＳＴＸ）を使用して実行されてもよい。ＢＬＡＳＴプログラムで使用される数学的アルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９－３４０２，１９９７に見いだすことができる。本開示の文脈内では、配列分析ソフトウェアが分析に使用される場合、分析の結果は参照されるプログラムの「初期設定値」に基づくことが理解されるであろう。「初期設定値」とは、最初に初期化されたときにソフトウェアと共に元々ロードされる値またはパラメーターのセットを意味する。

「単離される」という用語は、材料がその元の環境（例えば、それが天然に存在する場合には自然環境）から取りだされることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然に存在する核酸またはポリペプチドは単離されていないが、自然系の共存物質の一部またはすべてから分離された同じ核酸またはポリペプチドは単離されている。そのような核酸はベクターの一部であってもよく、及び／またはそのような核酸またはポリペプチドは組成物（例えば、細胞溶解物）の一部であってもよく、そのようなベクターまたは組成物が核酸またはポリペプチドについて自然環境の一部ではないという点で依然として単離されていてもよい。

「機能的変異体」とは、本開示の親化合物または参照化合物と構造的に類似している、または実質的に構造的に類似しているが、組成がわずかに異なる（例えば、１つの塩基、原子または官能基が異なっている、付加されている、または除去される）ので、ポリペプチドまたはコードされたポリペプチドは親ポリペプチドの活性の少なくとも５０％の効率、好ましくは少なくとも５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％レベルで親ポリペプチドの少なくとも１つの機能を実行することができる。言い換えれば、本開示のポリペプチドまたはコードされたポリペプチドの機能的変異体は、例えば、結合親和性を測定するためのアッセイ（例えば、会合（Ｋａ）定数または解離（ＫＤ）定数を測定するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）または四量体染色）のような親ポリペプチドまたは参照ポリペプチドと比較する選択されたアッセイにて性能の５０％以下の低下を示さない場合、「同様の結合」、「同様の親和性」または「同様の活性」を有する。

本明細書で使用されるとき、「機能的部分」または「機能的断片」とは、親化合物または参照化合物のドメイン、部分または断片のみを含むポリペプチドまたはポリヌクレオチドを指し、該ポリペプチドまたはコードされたポリペプチドは、親化合物または参照化合物のドメイン、部分または断片と関連する少なくとも５０％の活性、好ましくは親ポリペプチドの活性の少なくとも５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、または１００％のレベルを保持する、または生物学的利益（例えば、エフェクター機能）を提供する。本開示のポリペプチドまたはコードされたポリペプチドの「機能的部分」または「機能的断片」は、機能的部分または機能的断片が親ポリペプチドまたは参照ポリペプチドと比べて、選択されたアッセイにて性能の５０％以下（親和性に関して親または参照と比べて、好ましくは２０％または１０％以下、または対数差以下）の低下を示す場合、「同様の結合」または「同様の活性」を有する。

本明細書で使用されるとき、「操作された」、「組換え」、または「非天然」という用語は、少なくとも１つの遺伝子改変を含むか、または外来性もしくは異種の核酸分子の導入によって修飾されている生物、微生物、細胞、核酸分子、またはベクターを指し、その際、そのような改変または修飾は遺伝子操作（すなわち、ヒトの介入）によって導入される。遺伝子改変には、例えば、機能的ＲＮＡ、タンパク質、融合タンパク質もしくは酵素をコードする発現可能な核酸分子を導入する修飾、または他の核酸分子の付加、欠失、置換、または細胞の遺伝物質の他の機能的破壊が含まれる。追加の修飾には、例えば、修飾によってポリヌクレオチド、遺伝子、またはオペロンの発現が変化する非コード調節領域が含まれる。

本明細書で使用されるとき、「異種」または「非内在性」または「外来性」とは、宿主細胞もしくは対象に本来備わっていない任意の遺伝子、タンパク質、化合物、核酸分子もしくは活性、または改変されている宿主細胞もしくは対象に固有の任意の遺伝子、タンパク質、化合物、核酸分子、または活性を指す。異種、非内在性、または外来性には、構造、活性、またはその双方が天然の遺伝子、タンパク質、化合物、または核酸分子と改変されたそれとの間で異なるように変異させているまたは改変されている遺伝子、タンパク質、化合物、または核酸分子が含まれる。特定の実施形態では、異種の、非内在性、または外来性の遺伝子、タンパク質、または核酸分子（例えば、受容体、リガンドなど）は、宿主細胞または対象にとって内在性でなくてもよいが、その代わりに、そのような遺伝子、タンパク質、または核酸分子をコードする核酸は、結合、形質転換、形質移入、エレクトロポレーションなどによって宿主細胞に加えられていてもよく、加えられた核酸分子は宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよく、または染色体外遺伝物質として存在することができる（例えば、プラスミドまたは他の自己複製ベクターとして）。「相同な」または「ホモログ」という用語は、宿主細胞、種または株にて見いだされる、またはそれらに由来する遺伝子、タンパク質、化合物、核酸分子、または活性を指す。例えば、ポリペプチドをコードする異種または外来性のポリヌクレオチドまたは遺伝子は、天然のポリヌクレオチドまたは遺伝子と相同であってもよく、相同のポリペプチドまたは活性をコードしてもよいが、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは改変された構造、配列、発現レベル、またはそれらの任意の組み合わせを有してもよい。非内在性のポリヌクレオチドまたは遺伝子、と同様にコードされたポリペプチドまたは活性は、同じ種、異なる種、またはそれらの組み合わせに由来してもよい。

特定の実施形態では、宿主細胞に固有の核酸分子またはその一部は、改変されているまたは変異させている場合には宿主細胞にとって異種であるとみなされるであろう、または宿主細胞に固有の核酸分子は、それが異種発現制御配列によって改変されている、もしくは宿主細胞本来の核酸分子に通常は関連付けられていない内在性発現制御配列によって改変されている場合には異種であると見なされてもよい。加えて、「異種」という用語は、宿主細胞とは異なる、変化する、または内在性ではない生物活性を指すことができる。本明細書に記載されているように、１を超える異種核酸分子は、別個の核酸分子として、複数の個別に制御される遺伝子として、ポリシストロン性核酸分子として、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子として、またはそれらの組み合わせとして宿主細胞に導入することができる。

本明細書で使用されるとき「内在性」または「天然」という用語は、宿主細胞または対象に通常存在するポリヌクレオチド、遺伝子、タンパク質、化合物、分子、または活性を指す。

本明細書で使用されるとき「発現」という用語は、遺伝子のような核酸分子のコード配列に基づいてポリペプチドが生成されるプロセスを指す。このプロセスには、転写、転写後制御、転写後修飾、翻訳、翻訳後制御、翻訳後修飾、またはそれらの任意の組み合わせが含まれてもよい。発現される核酸分子は通常、発現制御配列（例えば、プロモーター）に操作可能に連結される。

「操作可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方の機能によって影響を受けるように、単一の核酸断片上で２以上の核酸分子が結合することを指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響を与えることができる場合（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コード配列と操作可能に連結されている。「連結されていない」とは、関連する遺伝要素が互いに密接に結合されておらず、一方の機能が他方に影響を及ぼさないことを意味する。

本明細書に記載されているように、１を超える異種核酸分子は、別個の核酸分子として、複数の個別に制御される遺伝子として、ポリシストロン性核酸分子として、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子として、またはそれらの組み合わせとして宿主細胞に導入することができる。２以上の異種核酸分子が宿主細胞に導入される場合、２以上の異種核酸分子は、別々のベクター上で単一の核酸分子として（例えば、単一のベクター上で）、別々のベクター上で導入することができ、単一部位または複数部位にて宿主染色体に組み込むことができ、またはそれらの任意の組み合わせで導入することができる。参照される異種核酸分子またはタンパク質活性の数は、宿主細胞に導入された別個の核酸分子の数ではなく、コードする核酸分子の数またはタンパク質活性の数を指す。

「構築物」という用語は、組換え核酸分子（または文脈が明確に示す場合には、本開示の融合タンパク質）を含有する任意のポリヌクレオチドを指す。（ポリヌクレオチド）構築物はベクター（例えば、細菌ベクター、ウイルスベクター）中に存在してもよく、またはゲノムに組み込まれてもよい。「ベクター」とは、別の核酸分子を輸送することができる核酸分子である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス、ＲＮＡベクター、または染色体、非染色体、半合成もしくは合成の核酸分子を含んでもよい直鎖もしくは環状のＤＮＡもしくはＲＮＡ分子であってもよい。本開示のベクターにはトランスポゾン系（例えば、ＳｌｅｅｐｉｎｇＢｅａｕｔｙ，例えば、Ｇｅｕｒｔｓｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８：１０８，２００３：Ｍａｔｅｓｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．４１：７５３，２００９）も含まれる。例示的なベクターは、自律複製できるもの（エピソーマルベクター）、ポリヌクレオチドを細胞ゲノムに送達できるもの（例えば、ウイルスベクター）、またはそれらが連結されている核酸分子を発現させることができるもの（発現ベクター）である。

本明細書で使用されるとき、「発現ベクター」とは、好適な宿主にて核酸分子の発現をもたらすことができる好適な制御配列に操作可能に連結される核酸分子を含有するＤＮＡ構築物を指す。そのような制御配列には、転写をもたらすプロモーター、そのような転写を制御する任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写及び翻訳の終結を制御する配列が挙げられる。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、ウイルス、または単に潜在的なゲノム挿入物であってもよい。好適な宿主に形質転換されると、ベクターは複製して宿主ゲノムとは独立して機能してもよく、または場合によっては、ゲノム自体に組み込んでもよく、もしくはベクター配列を伴わずにベクターに含有されるポリヌクレオチドをゲノムに送達してもよい。本明細書では、「プラスミド」、「発現プラスミド」、「ウイルス」及び「ベクター」は相互交換可能に使用されることが多い。

核酸分子を細胞に挿入する文脈における「導入された」という用語は、「形質移入」、「形質転換」、または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸分子の組み込みへの言及を含み、その際、核酸分子は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ、自律レプリコンに変換され、または一時的に発現されてもよい（例えば、形質移入されたｍＲＮＡ）。

特定の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドはベクターの特定の要素に操作可能に連結されてもよい。例えば、連結されるコード配列の発現及びプロセシングに影響を与えるのに必要なポリヌクレオチド配列は、操作可能に連結されてもよい。発現制御配列には、適切な転写開始配列、終結配列、プロモーター及びエンハンサー配列；スプライシングシグナル及びポリアデニル化シグナルのような効率的なＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定させる配列；翻訳効率を高める配列（例えば、コザックコンセンサス配列）；タンパク質の安定性を高める配列；及びタンパク質の分泌を高める考えられる配列が挙げられてもよい。発現制御配列は、目的の遺伝子と連続している場合には操作可能に連結されてもよく、目的の遺伝子を制御するためにトランスでまたは離れた位置で作用する発現制御配列であってもよい。

特定の実施形態では、ベクターは、プラスミドベクターまたはウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクターまたはγ－レトロウイルスベクター）を含む。ウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹、センダイ）のようなマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルス及びアルファウイルスのようなプラス鎖ＲＮＡウイルス、ならびにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタインバーウイルス、サイトメガロウイルス）、及びポックスウイルス（例えば、ワクシニア、鶏痘、及びカナリア痘）のような二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。他のウイルスには、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例には、鳥白血病肉腫、哺乳類のＣ型ウイルス、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、ＨＴＬＶ－ＢＬＶ群、レンチウイルス、スプマウイルス（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅｖｉｒｕｓｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＩｎＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ，ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－ＲａｖｅｎＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６）が挙げられる。

「レトロウイルス」は、逆転写酵素を使用してＤＮＡに逆転写されるＲＮＡゲノムを有するウイルスであり、その後、逆転写されたＤＮＡは宿主細胞ゲノムに組み込まれる。「ガンマレトロウイルス」とはレトロウイルス科の属を指す。ガンマレトロウイルスの例には、マウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、及び鳥網内皮症ウイルスが挙げられる。

「レンチウイルスベクター」には、遺伝子送達のためのＨＩＶベースのレンチウイルスベクターが挙げられ、これは組み込み型または非組み込み型であり、比較的大きなパッケージング能力を有することができ、種々の異なる細胞型に形質導入することができる。レンチウイルスベクターはふつう、３つ（パッケージング、エンベロープ、トランスファー）またはそれ以上のプラスミドを生産株細胞に一時的に形質移入した後に生成される。ＨＩＶと同様に、レンチウイルスベクターは、ウイルス表面の糖タンパク質と細胞表面の受容体との相互作用を介して標的細胞に侵入する。侵入すると、ウイルスＲＮＡはウイルス逆転写酵素複合体が介在する逆転写を受ける。逆転写の産物は二本鎖線状ウイルスＤＮＡあり、これは感染細胞のＤＮＡへのウイルス組み込みの基質である。

特定の実施形態では、ウイルスベクターはガンマレトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）由来ベクターであることができる。他の実施形態では、ウイルスベクターは、さらに複雑なレトロウイルス由来ベクター、例えばレンチウイルス由来ベクターであることができる。ＨＩＶ－１由来のベクターはこのカテゴリーに属する。他の例には、ＨＩＶ－２、ＦＩＶ、ウマ伝染性貧血ウイルス、ＳＩＶ、及びＭａｅｄｉ－Ｖｉｓｎａウイルス（ヒツジレンチウイルス）由来のレンチウイルスベクターが挙げられる。導入遺伝子を含有するウイルス粒子で哺乳類宿主細胞に形質導入するためにレトロウイルス及びレンチウイルスのウイルスベクター及びパッケージング細胞を使用する方法は当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許第８，１１９，７７２号；Ｗａｌｃｈｌｉｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ，６：３２７９３０，２０１１；Ｚｈａｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：４４１５，２００５；Ｅｎｇｅｌｓｅｔａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．１４：１１５５，２００３；Ｆｒｅｃｈａｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１８：１７４８，２０１０；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．５０６：９７，２００９に以前記載されている。レトロウイルス及びレンチウイルスのベクター構築物及び発現システムも市販されている。例えば、アデノウイルスに基づくベクター及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくベクターを含むＤＮＡウイルスベクターを含む他のウイルスベクター；アンプリコンベクター、複製欠損ＨＳＶ及び弱毒化ＨＳＶを含む、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のベクター（Ｋｒｉｓｋｙｅｔａｌ．，ＧｅｎｅＴｈｅｒ．５：１５１７，１９９８）もポリヌクレオチド送達に使用することができる。

本開示の組成物及び方法と共に使用できる他のベクターには、バキュロウイルス及びαウイルス（Ｊｏｌｌｙ，ＤＪ．１９９９．ＥｍｅｒｇｉｎｇＶｉｒａｌＶｅｃｔｏｒｓ．ｐｐ．２０９－４０ｉｎＦｒｉｅｄｍａｎｎＴ．ｅｄ．ＴｈｅＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ．ＮｅｗＹｏｒｋ：ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂ）またはプラスミドベクター（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇｂｅａｕｔｙや他のトランスポゾンベクター）に由来するベクターが挙げられる。

ウイルスベクターゲノムが宿主細胞内で別個の転写物として発現される複数のポリヌクレオチドを含む場合、ウイルスベクターはまた、バイシストロン性またはマルチシストロン性の発現を可能にする２つ（またはそれ以上）の転写物の間に追加の配列も含んでもよい。ウイルスベクターで使用されるそのような配列の例には、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、フリン切断部位、ウイルス２Ａペプチド、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

本明細書で使用されるとき「宿主」という用語は、目的のポリペプチド（例えば、本開示の抗体）を産生するための異種核酸分子による遺伝子操作の標的となる細胞または微生物を指す。

宿主細胞には、ベクターもしくは核酸の組み込みを受容してもよい、またはタンパク質を発現してもよい任意の個々の細胞または細胞培養物が挙げられてもよい。該用語はまた、遺伝的にまたは表現型が同じであるか、または異なるかにかかわらず、宿主細胞の子孫も包含する。好適な宿主細胞はベクターに依存してもよく、それには哺乳類細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞、及び細菌細胞が挙げられてもよい。これらの細胞は、ウイルスベクターの使用、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、または他の方法を介した形質転換によって、ベクターまたは他の物質を組み込むように誘導されてもよい。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２ｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），ｐａｇｅ９．５１を参照のこと。

本明細書で使用されるとき「抗原」または「Ａｇ」は免疫応答を引き起こす免疫原性分子を指す。この免疫応答には、抗体産生、特定の免疫担当細胞の活性化、補体の活性化、抗体依存性細胞傷害性、またはそれらの任意の組み合わせが関与してもよい。抗原（免疫原性分子）は、例えば、ペプチド、糖ペプチド、ポリペプチド、糖ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖、脂質等であってもよい。抗原は合成することができ、組換え生産することができ、または生体試料に由来することができることは容易に明らかである。１以上の抗原を含有することができる例示的な生物試料には、組織試料、糞便試料、細胞、体液、またはそれらの組み合わせが挙げられる。抗原は、抗原を発現するように修飾または遺伝子操作されている細胞によって作り出すことができる。

「エピトープ」または「抗原性エピトープ」という用語には、免疫グロブリン、または他の結合分子、ドメイン、もしくはタンパク質のような同族結合分子によって認識され、特異的に結合される任意の分子、構造、アミノ酸配列、またはタンパク質決定基が含まれる。エピトープ決定基は一般に、アミノ酸または糖側鎖のような分子の化学的に活性がある表面分類を含有し、特定の三次元構造特性と同様に特定の電荷特性を有する。抗原がペプチドまたはタンパク質である、またはそれらを含む場合、エピトープは連続したアミノ酸（例えば、線状エピトープ）から構成され得る、またはタンパク質のフォールディングによって近接したタンパク質の異なる部分または領域由来のアミノ酸から構成され得る（例えば、不連続または立体構造のエピトープ）、またはタンパク質のフォールディングに関係なく近接している非連続アミノ酸から構成され得る。

「抗原結合部位」または「抗原結合部分」という用語は、本明細書では相互交換可能に使用され、抗原及び／またはエピトープへの結合に関与する抗体及び／または免疫グロブリン分子の一部を指す。ヒト抗体では、抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖及び軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」は、相対的に保存された隣接区間である「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）間に差し挟まれた、重鎖及び軽鎖のＶ領域内の３つの高度に多様性の区間である。「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリン内の超可変領域間、及びそれに隣接して天然に見いだされるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域及び重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間にて互いに相対的に配置されて、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面に相補性である。重鎖（「Ｈ」）及び軽鎖（「Ｌ」）のそれぞれの３つの超可変領域は「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。抗原結合部位は、インタクトな抗体に、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合断片に、またはペプチドリンカーを使用して単一ポリペプチドにて重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに接続するｓｃＦｖのような組換えポリペプチドに存在することができる。抗原結合部位は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むことができる。

「抗体」という用語は、本明細書で使用されるとき、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、二機能性抗体）、抗体融合タンパク質、操作したタンパク質におけるヘテロ二量体についての抗体、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない、種々の抗体構造を包含する。

「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外のポリペプチドまたはタンパク質を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。

ＣＤＲ及びフレームワーク領域の番号付けは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＥＵ、ＩＭＧＴ、及びＡＨｏの番号付けスキームのような任意の既知の方法またはスキームに従ってもよい（例えば、Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，”ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳＤｅｐｔ．ＨｅａｌｔｈａｎｄＨｕｍａｎＳｅｒｖｉｃｅｓ，ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，１９９１，５ｔｈｅｄ．；ＣｈｏｔｈｉａａｎｄＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７））；Ｌｅｆｒａｎｃｅｔａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５，２００３；ＨｏｎｅｇｇｅｒａｎｄＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．３０９：６５７－６７０（２００１）を参照のこと）。抗原受容体番号付け及び受容体分類（ＡＮＡＲＣＩ）ソフトウエアツール（２０１６、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１５：２９８－３００）を使用して同等の残基位置に注釈を付けることができ、異なる分子を比較できる。抗原結合部位のＣＤＲは、上記のＫａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＥＵ、ＩＭＧＴ、及びＡＨｏのような既知の方法に従って決定することができる。これらの定義のもとで決定されたＣＤＲには通常、互いに対して比較した場合のアミノ酸残基の重複またはサブセットも含まれる。抗体の重鎖ＣＤＲと軽鎖ＣＤＲは異なる番号付け規則を使用して定義することができる。例えば、特定の実施形態では、重鎖ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａ（前出）に従って定義され、軽鎖ＣＤＲはＫａｂａｔ（前出）に従って定義される。ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３は重鎖ＣＤＲを示し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３は軽鎖ＣＤＲを示す。

本明細書で使用されるとき、ＰＤ－Ｌ１（ヒトでは「プログラムされた死リガンド１」またはＣＤ２７４としても知られる）は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ０ＧＮ７５（ヒト）のタンパク質及び関連するアイソフォーム及びオルソログを指す。

本明細書で使用されるとき「置換」または「残基置換」という用語は天然または野生型の残基を異なる残基で置換することを指す。

「親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、リガンド、抗体、ｓｃＦｖ）とその結合パートナー（例えば、受容体、抗原、エピトープ）の間の非共有結合性の相互作用の合計の強さを指す。別途指示のない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば、受容体及びリガンド）間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（Ｋ_Ｄ）で表すことができ、これは解離速度定数及び会合速度定数（それぞれ、ｋ_ｏｆｆ及びｋ_ｏｎ）の比である。従って、速度定数の比が同じままである限り、同等の親和性は、異なる速度定数を含んでもよい。親和性は、本明細書に記載されているものを含む、当業者らに既知の方法により測定することができる。

本明細書で使用されるとき「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域に由来するポリペプチドを指す。この用語は天然配列Ｆｃ領域を有するポリペプチド、またはその変異体を含む。ＩｇＧ重鎖のＦｃ領域の境界はわずかに異なることがあるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６またはＰｒｏ２３０から重鎖のカルボキシル末端まで伸びると定義されている。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）があっても、なくてもよい。Ｆｃ領域の例は、米国特許第７，３１７，０９１号、米国特許第８，７３５，５４５号、米国特許第７，３７１，８２６号、米国特許第７，６７０，６００号、及びＵＳ９，８０３，０２３に開示され、これらは全て、全体が参照によって組み込まれる。

「免疫グロブリン」は抗体の構造を有するタンパク質を指す。一例として、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、２つの軽鎖及び２つの重鎖がジスルフィド結合によって連結されているヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端に、重鎖はそれぞれ、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）とそれに続く、重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に、軽鎖は、それぞれ、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）とそれに続く、軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、またはμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのクラスのうちの１つに割り当てられてもよく、これらのうちのいくつかはさらに、サブクラス、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）、及びα２（ＩｇＡ２）に分けられてもよい。免疫グロブリンの軽鎖は定常ドメインの配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てられてもよい。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結された２つのＦａｂ分子及びＦｃドメインを含む。

「Ｆａｂ分子」または「抗原結合断片」は、軽鎖の可変ドメイン及び定常ドメイン、ならびに重鎖の可変ドメイン及びＣＨ１ドメインを含む抗体の抗原結合断片である。

「単鎖可変ドメイン」または「ｓｃＦｖ」は、リンカーペプチドで連結される重鎖及び軽鎖の可変領域を含む抗原結合部分を指す。

「二重特異性抗体」、「二機能性タンパク質」、及び「二機能性抗体」は、本開示全体を通して相互交換可能に使用され、２つの異なる抗原結合部位を持つ人工抗体及び／または少なくとも１つの抗原結合部位と少なくとも１つの機能ドメインを含む抗体融合タンパク質を指す。二重特異性抗体は、２つの異なる抗原結合部位を持つ完全な免疫グロブリンタンパク質を指すことができ、または２つのＦａｂもしくは２つのｓｃＦｖを含む融合タンパク質のような２つの抗原結合部分を有する他の分子を指すことができる。特定の実施形態では、二機能性タンパク質及び／または二機能性抗体は、１以上の機能ドメインを含むタンパク質、融合タンパク質、及び／またはヘテロ二量体タンパク質のペアを指すことができる。機能ドメインの例には、抗原結合部位、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖなど）、抗体重鎖及び軽鎖、サイトカイン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５）が挙げられる。二機能性タンパク質または二機能性抗体は、サイトカインのような非抗体ポリペプチドとの融合を含む抗体を指すことができる。例えば、二機能性タンパク質は、抗体重鎖及び軽鎖が含むことができ、重鎖定常領域は、ＩＬ－２、操作されたＩＬ－２、ＩＬ－１５、操作されたＩＬ－１５、ＩＬ－１５受容体、または操作されたＩＬ－１５受容体、またはその機能的断片に融合される。加えて、二機能性タンパク質は、抗体重鎖及び軽鎖を含むことができ、重鎖定常領域は、抗原結合部位を含まないポリペプチドまたはタンパク質とヘテロ二量体を形成することができる。例えば、二機能性タンパク質は、重鎖、軽鎖、及び抗体重鎖のＦｃドメインとヘテロ二量体を形成することができる抗体Ｆｃドメインを含むＩＬ－２または改変ＩＬ－２融合タンパク質を含むことができる。

「免疫応答を調節すること」は、Ｔエフェクター細胞応答の増加（例えば、腫瘍細胞及びウイルス感染細胞に対する細胞傷害性）、Ｂ細胞活性化の増加、リンパ球活性化及び増殖の回復、ＩＬ－２受容体の発現の増加、Ｔ細胞応答性の増加、ナチュラルキラー細胞活性またはリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞活性の増加、他のＴ細胞に対する制御性Ｔ細胞応答の減少などのうち１以上を含んでもよい。

「治療」、「治療すること」または「改善すること」は、対象（例えば、患者）の状態、疾患、または障害の医学的管理を指し、これは治療的であってもよく、１以上の症状の軽減をもたらし、腫瘍のサイズ及び／または重症度の軽減をもたらし、腫瘍の測定可能な増殖もしくは症状の発症を抑制してもよく、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。

「有効量」または「治療有効量」は、免疫調節及び／または抗がん効果のような所望の生理学的変化を提供する治療剤の量を指してもよい。所望の生理学的変化は、例えば、疾患の症状の減少、または疾患の重症度の低下であってもよく、または疾患の進行の軽減であってもよい。がんに関しては、所望の生理学的変化は、例えば、腫瘍退縮、腫瘍進行速度の低減、がんバイオマーカーのレベルの低下、がんに関連する症状の軽減、転移の防止もしくは遅延、または臨床的寛解を含んでもよい。

本明細書で使用されるとき、「阻害する」という用語は特定の活性（例えば、免疫抑制または腫瘍増殖）の低下を指す。特に指定のない限り、本明細書に開示されている、または当該技術分野で知られている方法によって測定されるとき、活性が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％低下していれば、その活性は阻害されたと見なすことができる。

「がん抗原」はがん細胞によって優先的に発現される分子を指す。がん抗原の例には、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＲＯＲ１、線維芽細胞活性化タンパク質α、及びがん胎児性抗原（ＣＥＡ）が挙げられる。

「腫瘍微小環境阻害剤」は、腫瘍成長を促進する、及び腫瘍周囲の局所環境中に存在する１以上の状態または細胞型を抑制する薬剤を指す。例えば、ベバシズマブは、腫瘍微小環境における血管新生を低減させることによって腫瘍微小環境を抑制することができる。

本開示で使用される組み換えＤＮＡ、分子クローニング、及び遺伝子発現の手法は当該技術分野で既知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｒｄＥｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮｅｗＹｏｒｋ，２００１、及びＡｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，１９９９のような参考文献に記載されている。

さらなる定義は詳細な説明の全体を通して提供されている。

ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位
一態様では、本出願はＰＤ－Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１）に結合する抗原結合部位を提供する。ＣＤＲ、ＶＨ、ＶＬ、及びｓｃＦｖ配列のような抗原結合部位内でまたはそれらに対する抗原結合部位として使用できる配列の例を表１に列挙する。アミノ酸位置及びＣＤＲ配列はＩＭＧＴ番号付けスキームに従って特定されている。

特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位は、配列番号１１、３、１９、３３、５２または６３の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）の配列と；配列番号１２、４、２０、３４、４１、５３、または６４の相補性決定領域２（ＣＤＲ２）の配列と；配列番号８９、５、１３、２１、２７、３５、４６、５４、６５、７１、７４、７７、８０、８３、または８６の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）の配列とを含む抗体の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；及び配列番号４７、６、１４、２２、２８、３６、５５、または６６のＣＤＲ１配列と；配列番号４８、７、１５、２３、２９、３７、４２、５６、６０、または６７のＣＤＲ２配列と；配列番号４９、８、１６、２４、３０、３８、４３、５７、または６８のＣＤＲ３配列とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。

特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位は、表１に開示されている抗体のＶＨと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、及び、表１に開示されている同じ抗体のＶＬと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、ＩＭＧＴシステム、ＥＵシステム、Ｋａｂａｔシステム（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，（１９９１），ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ、ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１－３２４２、Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、Ｃｈｏｔｈｉａシステム（例えば、ＣｈｏｔｈｉａＣ＆ＬｅｓｋＡＭ，（１９８７），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７），ＭａｃＣａｌｌｕｍ（ＭａｃＣａｌｌｕｍ，ＲＭ．ｅｔａｌ．，（１９９６），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２－７４５を参照）、または当該技術分野で公知の他の任意のＣＤＲ決定方法の下で決定される、表１に開示されている抗体のＶＨ配列及びＶＬ配列の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、表１に開示されている抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１８ＥＰ１６４－Ｆ０４に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号１及び２のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定方法のもとで決定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号３、４、及び５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、７、及び８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号３、４、及び５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号６、７、及び８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１８ＥＰ１７０－Ｅ０６に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１０と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号９及び１０のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定法のもとで決定される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、１２、及び１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号１４、１５、及び１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、１２、及び１３のアミノ酸配列を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号１４、１５、及び１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１８ＥＰ１６１－Ｇ０８に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１８と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号１７及び１８のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定法のもとで決定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１９、２０、及び２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２２、２３、及び２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１９、２０、及び２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号２２、２３、及び２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１８ＥＰ１６１－Ｆ０８に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号２５のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２６と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号２５及び２６のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定法のもとで決定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１９、２０、及び２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号２８、２９、及び３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１９、２０、及び２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号２８、２９、及び３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１８ＥＰ１６１－Ｆ０４に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号３２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号３１及び３２のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定法のもとで決定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号３３、３４、及び３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号３６、３７、及び３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号３３、３４、及び３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号３６、３７、及び３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１８ＥＰ２８０－Ｅ０４に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４０と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号３９及び４０のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定法のもとで決定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号３、４１、及び５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６、４２、及び４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号３、４１、及び５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号６、４２、及び４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１８ＥＰ１７１－Ｈ０２に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号４４のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号４４及び４５のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定法のもとで決定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、１２、及び４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、１２、及び４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１８ＥＰ１７３－Ｈ１１に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号５０のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５１と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号５０及び５１のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定法のもとで決定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号５２、５３、及び５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号５５、５６、及び５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号５２、５３、及び５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号５５、５６、及び５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１８ＥＰ１７２－Ｆ１０に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号５８及び５９のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定法のもとで決定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、１２、及び４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号４７、６０、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、１２、及び４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号４７、６０、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１８ＥＰ２８０－Ｅ０１に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号６１及び６２のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定法のもとで決定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号６３、６４、及び６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号６６、６７、及び６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号６３、６４、及び６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号６６、６７、及び６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１９ＥＰ６９－Ｅ０２に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号７０と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号６９及び７０のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定法のもとで決定される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、１２、及び７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、１２、及び７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１９ＥＰ６９－Ｅ１０に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号７２のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号７３と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号７２及び７３のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定法のもとで決定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、１２、及び７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、１２、及び７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１９ＥＰ６９－Ｃ０５に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号７５のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号７６と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号７５及び７６のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定法のもとで決定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、１２、及び７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、１２、及び７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１９ＥＰ６９－Ｆ０２に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号７８のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号７９と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号７８及び７９のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定法のもとで決定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、１２、及び８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、１２、及び８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１９ＥＰ６９－Ｂ０１に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号８１のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号８２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号８１及び８２のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定法のもとで決定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、１２、及び８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、１２、及び８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１９ＥＰ６９－Ｈ１０に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号８４のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号８５と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号８４及び８５のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定法のもとで決定される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、１２、及び８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、１２、及び８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は２０１９ＥＰ６９－Ｆ０３に由来する。例えば、特定の実施形態では、本出願に記載されている抗原結合部位は、配列番号８７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号８８と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、それぞれ配列番号８７及び８８のＶＨ配列及びＶＬ配列の、ＩＭＧＴ、ＥＵ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、または当該技術分野で既知の任意の他のＣＤＲ決定法のもとで決定される、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＨは、それぞれ配列番号１１、１２、及び８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）それぞれ配列番号１１、１２、及び８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＨと；（ｂ）それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬとを含む。

特定の実施形態では、本明細書に記載されている抗原結合部位は、配列番号８７のアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号８８と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含み、該ＶＨは配列番号８９と比べて少なくとも１、２、３、４、または５のアミノ酸置換を有する配列番号８９のアミノ酸配列変異体を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨＣＤＲ３は配列番号７１、７４、７７、８０、８３、または８６を含む、またはそれから成る。特定の実施形態では、ＶＨはさらに、それぞれ配列番号１１及び１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む。特定の実施形態では、ＶＬは、それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。特定の実施形態では、抗原結合部位は、（ａ）配列番号１１の配列を有するＣＤＲ１と、配列番号１２の配列を有するＣＤＲ２と、配列番号８９と比べて少なくとも１、２、３、４、または５のアミノ酸置換を有する配列番号８９の変異体を含むＣＤＲ３とを含むＶＨ；及び（ｂ）それぞれ配列番号４７、４８、及び４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むＶＬを含む。

前述の実施形態のそれぞれでは、ＰＤ－Ｌ１に結合するＶＨ配列及び／またはＶＬ配列が、ＰＤ－Ｌ１に結合する能力に影響を与えることなくＶＨ及び／またはＶＬのフレームワーク領域にてアミノ酸の変化（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、または１０のアミノ酸の置換、欠失または付加）を含有してもよいことが本明細書で企図される。例えば、ＰＤ－Ｌ１に結合するＶＨ及びＶＬ配列（例えば、ｓｃＦｖにおける）は、ｓｃＦｖのＶＨとＶＬの間のジスルフィド架橋の形成を促進するシステインのヘテロ二量体化突然変異を含有してもよいことが本明細書で企図される。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている抗原結合部位は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるとき、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．８ｎＭ未満、約０．６ｎＭ未満、約０．４ｎＭ未満、約０．２ｎＭ未満、または約０．１ｎＭ未満のＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている抗原結合部位は酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定されるとき、約１６０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１．５ｎＭ未満、約１．２ｎＭ未満、約１．０ｎＭ未満、約０．８ｎＭ未満、約０．７ｎＭ未満、約０．６ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、または約０．４ｎＭ未満のＥＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１に結合する。

特定の実施形態では、本明細書に開示されている抗原結合部位は、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、または０．５ｎＭ以下のＫＤ値（以上の親和性）でヒトＰＤ－Ｌ１またはその細胞外領域に結合する。特定の実施形態では、本出願の抗原結合部位は、５ｎＭ以下のＫＤ値（親和性以上）でヒトＰＤ－Ｌ１またはその細胞外領域に結合する。特定の実施形態では、本出願の抗原結合部位は、約２．０ｎＭ、２．１ｎＭ、２．２ｎＭ、２．３ｎＭ、２．４ｎＭ、２．５ｎＭ、２．６ｎＭ、２．７ｎＭ、２．８ｎＭ、２．９ｎＭ、３．０ｎＭ、３．１ｎＭ、３．２ｎＭ、３．３ｎＭ、３．４ｎＭ、３．５ｎＭ、３．６ｎＭ、３．７ｎＭ、３．８ｎＭ、３．９ｎＭ、４．０ｎＭ、４．１ｎＭ、４．２ｎＭ、４．３ｎＭ、４．４ｎＭ、４．５ｎＭ、４．６ｎＭ、４．７ｎＭ、４．８ｎＭ、４．９ｎＭまたは５．０ｎＭ以下のＫＤ値（親和性以上）でヒトＰＤ－Ｌ１またはその細胞外領域に結合する。特定の実施形態では、本出願の抗原結合部位は、約１．０～３．５ｎＭ、１．０～４．０ｎＭ、１．０～４．５ｎＭ、１．０～５．０ｎＭ、１．５～３．５ｎＭ、１．５～４．０ｎＭ、１．５～４．５ｎＭ、１．５～５．０ｎＭ、２．０～３．５ｎＭ、２．０～４．０ｎＭ、２．０～４．５ｎＭ、２．０～５．０ｎＭ、２．５～３．５ｎＭ、２．５～４．０ｎＭ、２．５～４．５ｎＭ、２．５～５．０ｎＭ、３．０～３．５ｎＭ、３．０～４．０ｎＭ、３．０～４．５ｎＭ、または３．０～５．０ｎＭの範囲のＫＤ値でヒトＰＤ－Ｌ１またはその細胞外領域に結合する。これらのＫＤ値は、標準的な結合アッセイ、たとえばＳＰＲまたはＥＬＩＳＡを使用して測定される。

特定の実施形態では、本明細書に開示されている抗原結合部位は蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって測定されるとき、約４０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約０．３ｎＭ未満、約０．２ｎＭ未満、または約０．１ｎＭ未満のＥＣ５０でヒトＰＤ－Ｌ１を発現している細胞に結合する。

特定の実施形態では、本明細書に開示されている抗原結合部位は、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、または０．５ｎＭ以下（以上の親和性）のＥＣ５０値で細胞膜（細胞の原形質膜）の表面上に提示されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する。特定の実施形態では、本明細書に開示されている抗原結合部位は１ｎＭ以下（以上の親和性）のＥＣ５０値で膜（細胞の原形質膜）の表面上に提示されるヒトＰＤ－Ｌ１に結合する。これらのＥＣ５０値は、以下の実施例（複数可）に開示されているアッセイのようなＰＤ－Ｌ１を組換え発現するまたは内在性に発現する細胞を使用する結合アッセイで測定することができる。特定の実施形態では、抗体は、対象の体液、組織、及び／または細胞由来のＰＤ－Ｌ１に結合する。

特定の実施形態では、本明細書に開示されている抗原結合部位は、ＰＤ－Ｌ１への結合に関してＰＤ－１と競合する、またはＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する。特定の実施形態では、本明細書に開示されている抗原結合部位は単鎖断片可変断片（ｓｃＦｖ）として存在する。特定の実施形態では、本明細書に開示されている抗原結合部位は抗原結合断片（Ｆａｂ）として存在する。

ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位を持つタンパク質
特定の実施形態では、本開示は、ヒトＰＤ－Ｌ１に結合する、本明細書に開示されている抗原結合部位を含むタンパク質を提供する。特定の実施形態では、本開示のタンパク質は１以上の抗体重鎖定常領域を含む。特定の実施形態では、抗体重鎖定常領域はヒトＩｇＧ重鎖定常領域である。特定の実施形態では、抗体重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である。特定の実施形態では、抗体重鎖定常領域は、配列番号９０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、抗体重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧと比べて、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｗ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ、Ｋ４０９Ａ及びＹ４０７Ｖから選択される１以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧはＩｇＧ１である。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧは、配列番号９０の配列、または配列番号９０に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、重鎖定常領域はＬＡＬＡＰＧ突然変異を含む。ＬＡＬＡＰＧ突然変異は、ヒトＩｇＧ重鎖定常領域、例えばＩｇＧ１のＣＨ２－ＣＨ３領域におけるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇの変化を指す（例えば、Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒｅｔａｌ．，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．２９（１０）：４５７－４６６，２０１６；Ｌｏｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９２（９）：３９００－３９０８，２０１７を参照のこと、参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域はノブ突然変異またはホール突然変異を含む。ノブイントゥホール突然変異は、それぞれノブ突然変異とホール突然変異を含むＦｃドメインのヘテロ二量体化を可能にするＩｇＧ定常ドメインに対する修飾である。ノブまたはホールの突然変異により、低レベルのホモ二量体混入物を伴って試験管内での優先的なヘテロ二量体形成が可能になる。ノブ－イントゥ－ホール突然変異は、Ｍｅｒｃｈａｎｔｅｔａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：６７７－６８１，１９９８；及びＷｅｉｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．８（３１）：５１０３７－５１０４９，２０１７に開示されており、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。ノブ突然変異の例にはＩｇＧ重鎖定常領域におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＫ４０９Ａの突然変異が挙げられる。ホール突然変異の例には、ＩｇＧ重鎖定常領域におけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ及びＹ４０７Ｖの突然変異が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域はＬＡＬＡＰＧ突然変異及びホール突然変異またはノブ突然変異を含む。例えば、いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＫ４０９Ａの突然変異を含むことができる。いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域は、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ、及びＹ４０７Ｖの突然変異を含むことができる。特定の実施形態では、抗体重鎖定常領域は配列番号９１または９２のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、タンパク質は、配列番号９０と比べて、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＫ４０９Ａから選択される１以上の突然変異を含む第１の抗体重鎖定常領域と、配列番号９０と比べて、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ及びＹ４０７Ｖから選択される１以上の突然変異を含む第２の抗体重鎖定常領域とを含む。特定の実施形態では、タンパク質は、配列番号９０と比べて、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＫ４０９Ａから選択される１以上の突然変異を含む第１の抗体重鎖定常領域と、配列番号９０と比べて、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ及びＹ４０７Ｖから選択される１以上の突然変異を含む第２の抗体重鎖定常領域とを含む。

いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位を含むタンパク質は抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は：（ａ）配列番号１４８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る重鎖（ＨＣ）と、配列番号１４９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る軽鎖（ＬＣ）；（ｂ）配列番号１５０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＨＣと、配列番号１５１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＬＣ；（ｃ）配列番号１５２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＨＣと、配列番号１５３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＬＣ；（ｄ）配列番号１５４と少なくとも９０％、％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＨＣと、配列番号１５５と少なくとも９０％、％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＬＣ；（ｅ）配列番号１５６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＨＣと、配列番号１５７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＬＣ；または、（ｆ）配列番号１５９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＨＣと、配列番号１６０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＬＣとを含む。

いくつかの実施形態では、抗体は（ａ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むまたはそれから成るＨＣと、配列番号１４９のアミノ酸配列を含むまたはそれから成るＬＣ；（ｂ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むまたはそれから成るＨＣと、配列番号１５１のアミノ酸配列を含むまたはそれから成るＬＣ；（ｃ）配列番号１５２のアミノ酸配列を含むまたはそれから成るＨＣと、配列番号１５３のアミノ酸配列を含むまたはそれから成るＬＣ；（ｄ）配列番号１５４のアミノ酸配列を含むまたはそれから成るＨＣと、配列番号１５５のアミノ酸配列を含むまたはそれから成るＬＣ；（ｅ）配列番号１５６のアミノ酸配列を含むまたはそれから成るＨＣと、配列番号１５７のアミノ酸配列を含むまたはそれから成るＬＣ；あるいは（ｆ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むまたはそれから成るＨＣと、配列番号１６０のアミノ酸配列を含むまたはそれから成るＬＣとを含む。

ＰＤ－Ｌ１抗原結合部位を持つ例示的なタンパク質のＨＣ配列及びＬＣ配列を以下の表３に列挙する。アミノ酸の位置はＩＭＧＴ番号付けスキームに従って特定する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている抗原結合部位は抗体またはその抗原結合断片として存在することができる。抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、またはＦ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ、二重特異性抗体、二機能性抗体、二重特異性Ｆａｂ２、二重特異性（ｍａｂ）２、ヒト化抗体、人工的に生成されたヒト抗体、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、二重特異性ＮＫ細胞エンゲージャー、単鎖抗体（例えば、単鎖Ｆｖ断片またはｓｃＦｖ）、トリオマブ、共通軽鎖を持つノブイントゥホール（ＫｉＨ）ＩｇＧ、クロスマブ、オルトＦａｂＩｇＧ、ＤＶＤ－Ｉｇ、２機能付き－ＩｇＧ、ＩｇＧ－ｓｃＦｖ、ｓｄＦｖ２－Ｆｃ、バイナノボディ、二重親和性リターゲティング抗体（ＤＡＲＴ）、ＤＡＲＴ－Ｆｃ、ｓｃＦｖ－ＨＳＡ－ｓｃＦｖ（ＨＳＡ＝ヒト血清アルブミン）、またはドックアンドロック（ＤＮＬ）－Ｆａｂ３であることができる。

特定の実施形態では、本明細書に開示されている抗原結合部位は、抗体定常領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、またはＩｇＥの重鎖定常領域；特に、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の（例えば、ヒト）重鎖定常領域から選択される抗体定常領域と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列に連結されている。別の実施形態では、本明細書に開示されている抗原結合部位は、例えば、カッパまたはラムダの（例えば、ヒト）軽鎖定常領域から選択される軽鎖定常領域に連結することができる。定常領域を変化させて、例えば、変異させて、または操作して抗体の特性を修飾することができる（例えば、Ｆｃ受容体結合、抗体のグリコシル化、システイン残基の数、エフェクター細胞機能、及び／または補体機能の１以上を増やすまたは減らす）。いくつかの実施形態では、エフェクター機能を有し、且つ補体を固定することができる。いくつかの実施形態では、抗体はエフェクター細胞を動員しない、または補体を固定しない。いくつかの実施形態では、抗体はＦｃ受容体に結合する能力が低下している、または結合する能力がない。例えば、それは、Ｆｃ受容体への結合をサポートしないアイソタイプまたはサブタイプ、断片または他の突然変異体型であり、例えば、それは変異誘発されたまたは欠失したＦｃ受容体結合領域を有する。

特定の実施形態では、抗原結合部位は、ＣＨ１ドメインの有無にかかわらず、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３のドメインを含むＩｇＧ定常領域に連結される。いくつかの実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒト抗体定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域、ヒトＩｇＧ２定常領域、ヒトＩｇＧ３定常領域、またはヒトＩｇＧ４定常領域と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一である。いくつかの実施形態では、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインまたはその一部は、以下の配列を含む野生型ヒトＩｇＧ１Ｆｃと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含む。
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９０）

いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域と比べて、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１及び／またはＫ４３９にて１以上の突然変異を定常領域に組み込むことができる。例示的な置換には、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、及びＫ４３９Ｅが挙げられる。

特定の実施形態では、抗原結合部位はＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインの一部に連結される。Ｆｃドメイン内では、ＣＤ１６結合にはヒンジ領域とＣＨ２ドメインが介在する。たとえば、ヒトＩｇＧ１内では、ＣＤ１６との相互作用は主にＣＨ２ドメインにおけるアミノ酸残基Ａｓｐ２６５－Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７－Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７－Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４－Ｓｅｒ２３９、及び炭水化物残基Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンに焦点が置かれる（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４０６（６７９３）：２６７－２７３を参照のこと）。既知のドメインに基づいて、例えば、ファージディスプレイライブラリーまたは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリーを使用することによってＣＤ１６への結合親和性を強化または低下させるように突然変異を選択することができ、または、相互作用の既知の三次元構造に基づいて突然変異を設計することができる。

特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込むことができる突然変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１、及び／またはＶ１７３にあってもよい。特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣｋに組み込むことができる突然変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４、及び／またはＴ１６４にあってもよい。

いくつかの実施形態では、抗体定常ドメインは、ＩｇＧ抗体、例えばヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、別の抗体定常ドメインとのヘテロ二量体化を可能にするために、抗体定常ドメインに突然変異が導入される。例えば、抗体定常ドメインがヒトＩｇＧ１の定常ドメインに由来する場合、抗体定常ドメインはヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４～３３２と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一であるアミノ酸配列を含むことができ、且つＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及びＫ４３９から成る群から選択される１以上の位置で異なる。本明細書に開示されているＦｃドメインまたはヒンジ領域におけるすべてのアミノ酸位置はＥＵ番号付けに従って番号付けされる。

いくつかの他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウマのような別の哺乳類由来の抗体定常領域と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一である。

本明細書に記載されているタンパク質は当該技術分野で知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作製することができる。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列を第１の発現ベクターにクローニングすることができ；第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列を第２の発現ベクターにクローニングすることができ；第１の免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列を第３の発現ベクターにクローニングすることができ；第２の免疫グロブリン軽鎖をコードする第４の核酸配列を第４の発現ベクターにクローニングすることができ；第１、第２、第３及び第４の発現ベクターを一緒に宿主細胞に安定に形質移入して、多量体タンパク質を生成することができる。

タンパク質の最高収率を達成するには、第１、第２、第３、及び第４の発現ベクターの異なる比率を調べて、宿主細胞への形質移入の最適な比率を決定することができる。形質移入後、限界希釈法、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡検査のような当該技術分野で知られている方法を使用して細胞バンク生成のために単一クローンを単離することができる。

クローンは、バイオリアクターのスケールアップに好適な条件下で培養し、本明細書に開示されている抗原結合部位を含むタンパク質の発現を維持することができる。タンパク質は、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、均質化、凍結融解、アフィニティー精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、及び混合モードクロマトグラフィーを含む当該技術分野で既知の方法を使用して単離及び精製することができる。

したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されている抗体のいずれか１つの免疫グロブリン重鎖及び／または免疫グロブリン軽鎖の可変領域をコードする配列を含む１以上の単離された核酸を提供する。本開示は、本明細書に開示されている抗体のいずれか１つの免疫グロブリン重鎖及び／または免疫グロブリン軽鎖の可変領域を発現する１以上の発現ベクターを提供する。同様に、本出願は、前述の発現ベクター及び／または単離された核酸のうちの１以上を含む宿主細胞を提供する。

抗体が開示されている抗体と同じエピトープに結合するか、または開示されている抗体との結合について競合するかどうかを決定するための競合アッセイは当該技術分野で知られている。例示的な競合アッセイには、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＩＡアッセイ）、表面プラズモン共鳴（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ分析）、生体層干渉法、及びフローサイトメトリーが挙げられる。

通常、競合アッセイには、固体表面に結合する、または細胞表面に発現される抗原（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質またはその断片）、試験ＰＤ－Ｌ１結合抗体及び参照抗体の使用が含まれる。参照抗体は標識され、試験抗体は標識されない。競合阻害は、試験抗体の存在下で固体表面または細胞に結合した標識参照抗体の量を決定することによって測定される。通常、試験抗体は過剰に存在する（例えば、１×、５×、１０×、２０×、または１００×）。競合アッセイによって特定される抗体（例えば、競合抗体）には、参照抗体と同じエピトープ、または類似の（例えば、重複する）エピトープに結合する抗体、及び参照抗体が結合するエピトープに対して立体障害が発生するのに十分に近い隣接エピトープに結合する抗体が含まれる。

競合アッセイは、標識の存在が結合を妨害しない、またはさもなければ阻害しないことを確認するために、双方向で実施することができる。例えば、第１の方向では、参照抗体が標識され、試験抗体は標識されず、第２の方向では、試験抗体が標識され、参照抗体は標識されない。

競合結合アッセイで測定されるとき、一方の抗体の過剰（例えば、１×、５×、１０×、２０×または１００×）が他方の抗体の結合を、例えば少なくとも５０％、７５％、９０％、９５％または９９％阻害する場合、試験抗体は抗原への特異的結合に関して参照抗体と競合する。

一方の抗体の結合を減らすまたは排除する抗原内の本質的にすべてのアミノ酸突然変異が他方の抗体の結合を減らすまたは排除する場合、２つの抗体は同じエピトープに結合すると判定されてもよい。一方の抗体の結合を減らすまたは排除するアミノ酸突然変異の１つのサブセットだけが他方の抗体の結合を減らすまたは排除する場合、２つの抗体は重複するエピトープに結合すると判定されてもよい。

本明細書に開示されている抗体は、親和性及び／または特異性を含む生化学的特性を改善するために、凝集、安定性、沈殿及び／または非特異的相互作用を含む生物物理学的特性を改善するために、及び／または免疫原性を減らすために、さらに最適化（例えば、親和性成熟）されてもよい。例えば、ＤＮＡシャッフリング、鎖シャッフリング、ＣＤＲシャッフリング、ランダム突然変異誘発及び／または部位特異的突然変異誘発によって、免疫グロブリン重鎖及び／または免疫グロブリン軽鎖に多様性を導入することができる。

特定の実施形態では、単離されたヒト抗体は１以上の体細胞突然変異を含有する。これらの場合、抗体を最適化するために、抗体をヒト生殖系列配列に修飾することができる（例えば、生殖系列化と呼ばれるプロセスによって）。

一般に、最適化された抗体は、その抗原に対して、それが由来した非最適化（または親）抗体と少なくとも同じ、または実質的に同じ親和性を有する。例えば、特定の実施形態では、最適化された抗体は親抗体と比較した場合、抗原に対してさらに高い親和性を有する。

抗体が治療薬として使用される場合、標準的な試験管内コンジュゲート化学を使用して、小分子毒素または放射性核種のようなエフェクター薬剤に抗体をコンジュゲートすることができる。エフェクター薬剤がポリペプチドである場合、抗体はエフェクターに化学的にコンジュゲートされ得る、または融合タンパク質としてエフェクターに連結され得る。融合タンパク質の構築は当該技術分野の通常の技術の範囲内である。

標準的な試験管内コンジュゲート化学を使用して、小分子毒素または放射性核種のようなエフェクター部分に抗体をコンジュゲートすることができる。エフェクター部分がポリペプチドである場合、抗体はエフェクターに化学的にコンジュゲートされ得る、または融合タンパク質としてエフェクターに連結され得る。融合タンパク質の構築は当該技術分野の通常の技術の範囲内である。

いくつかの実施形態では、タンパク質は生体内での腫瘍増殖を阻害する抗体である。

特定の実施形態では、タンパク質は、アテゾリズマブに匹敵する、またはアテゾリズマブと比べてさらに増強されたレベルにて生体内でＩＦＮγ及びＴＮＦαの分泌を誘導する抗体である。

二機能性タンパク質
特定の実施形態では、本明細書に開示されているのは二機能性タンパク質、例えば、二機能性抗体である。二機能性タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１、ＩｇＧＦｃドメイン、及び／または機能ドメインに結合する抗原結合部位を含むことができる。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は単一のタンパク質配列である。他の実施形態では、二機能性タンパク質は、少なくとも２つのタンパク質配列によって形成されるヘテロ二量体である。ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位は、本明細書に開示されている抗ＰＤ－Ｌ１抗原結合部位、抗体、及び／またはｓｃＦｖ配列のいずれかであることができる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位は、抗体の重鎖及び軽鎖によって形成されるＦａｂを含むことができる。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位はｓｃＦｖを含むことができる。ＩｇＧＦｃドメインは、野生型抗体定常領域または修飾された抗体定常領域を含むことができる。修飾された抗体定常領域の例は本明細書に提供されており、例えばノブまたはホールの突然変異、及びＬＡＬＡＰＧ突然変異が挙げられる。機能ドメインは、サイトカイン、サイトカイン受容体、またはそれらの機能的断片を含むことができる。機能ドメインの例には、表４に開示されているＩＬ－２ポリペプチド及び操作されたＩＬ－２ポリペプチドのようなＩＬ－２ポリペプチド、ＩＬ－１５、及びＩＬ－１５Ｒαが挙げられる。二機能性タンパク質の例を図９及び表７に示すが、これらには、ＩＬ－２－Ｆｃ／抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃヘテロ二量体；Ｆｃドメインを欠くＩＬ－２－抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－融合タンパク質；ＩＬ－２－Ｆｃ／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－Ｆｃヘテロ二量体；抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－Ｆｃ－ＩＬ－２－融合／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－Ｆｃヘテロ二量体；抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－Ｆｃ－ＩＬ－２－融合／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－Ｆｃ－ＩＬ－２－融合二量体またはヘテロ二量体；抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＩＬ－２－融合／抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＩＬ－２－融合二量体またはヘテロ二量体；抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＩＬ－２－融合／抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃヘテロ二量体；抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＩＬ－２－融合／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－Ｆｃ－ＩＬ－２－融合ヘテロ二量体；抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃ／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－Ｆｃ－ＩＬ－２－融合ヘテロ二量体；抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＩＬ－２－融合／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－Ｆｃヘテロ二量体；抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－Ｆｃ－ＩＬ－１５－融合／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－Ｆｃ－ＩＬ－１５Ｒα－融合ヘテロ二量体；抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＩＬ－１５－融合／抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＩＬ－１５Ｒα－融合ヘテロ二量体；抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－Ｆｃ－ＩＬ－１５－融合／抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＩＬ－１５Ｒα－融合ヘテロ二量体；及び抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＩＬ－１５－融合／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－Ｆｃ－ＩＬ－１５Ｒα－融合ヘテロ二量体が挙げられる。

特定の実施形態では、二機能性タンパク質は、（ｉ）配列番号１１、３、１９、３３、５２、または６３の配列を含むＣＤＲ１と；配列番号１２、４、２０、３４、４１、５３、または６４の配列を含むＣＤＲ２と；配列番号８９、５、１３、２１、２７、３５、４６、５４、６５、７１、７４、７７、８０、８３、または８６の配列を含むＣＤＲ３とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；及び（ｉｉ）配列番号４７、６、１４、２２、２８、３６、５５、または６６の配列を含むＣＤＲ１と；配列番号４８、７、１５、２３、２９、３７、４２、５６、６０、または６７の配列を含むＣＤＲ２と；配列番号４９、８、１６、２４、３０、３８、４３、５７、または６８の配列を含むＣＤＲ３とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位を含む。特定の実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位は（ａ）～（ｑ）の少なくとも１つを含み、その際、（ａ）ＶＨは配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；（ｂ）ＶＨは配列番号９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号１０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；（ｃ）ＶＨは配列番号１７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号１８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；（ｄ）ＶＨは配列番号２５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号２６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；（ｅ）ＶＨは配列番号３１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号３２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；（ｆ）ＶＨは配列番号３９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号４０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；（ｇ）ＶＨは配列番号４４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号４５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；（ｈ）ＶＨは配列番号５０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号５１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；（ｉ）ＶＨは配列番号５８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号５９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；（ｊ）ＶＨは配列番号６１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号６２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；（ｋ）ＶＨは配列番号６９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号７０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；（ｌ）ＶＨは配列番号７２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号７３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；（ｍ）ＶＨは配列番号７５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号７６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；（ｎ）ＶＨは配列番号７８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号７９と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；（ｏ）ＶＨは配列番号８１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号８２と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；（ｐ）ＶＨは配列番号８４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号８５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；及び／または（ｑ）ＶＨは配列番号８７と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つＶＬは配列番号８８と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む、またはそれから成る。

いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は抗体重鎖定常領域がヒトＩｇＧ重鎖定常領域であることを含む。いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域は配列番号９０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域は配列番号９０と比べて、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｗ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ、Ｋ４０９Ａ及びＹ４０７Ｖから選択される１以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域は配列番号９０と比べて、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＫ４０９Ａから選択される１以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域は配列番号９０と比べて、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ、及びＹ４０７Ｖから選択される１以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質はヘテロ二量体であり、第１と第２の抗体重鎖定常領域を含み、その際、第１の抗体重鎖定常領域は配列番号９０と比べて、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＫ４０９Ａから選択される１以上の突然変異を含み；且つ第２の抗体重鎖定常領域は配列番号９０と比べて、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ及びＹ４０７Ｖから選択される１以上の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、抗体重鎖定常領域はＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇの突然変異を含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗体重鎖定常領域のうちの１つは配列番号９１のアミノ酸配列を含み、第２の抗体重鎖定常領域は配列番号９２のアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、二機能性タンパク質は機能ドメインを含み、機能ドメインはＩＬ－１５またはＩＬ－１５Ｒα、またはその機能的断片である。ＩＬ－１５は、４つのα－ヘリックスバンドルを含有するサイトカインのメンバーである。ＩＬ－１５は通常、Ｔ細胞及びＮＫ細胞上の機能的なＩＬ－１５受容体ベータユニット及びガンマユニットに結合する前に、ＡＰＣ上に発現されているＩＬ－１５受容体アルファと複合体を形成する。ＩＬ－１５は、受容体アルファ鎖の膜形態に結合したサイトカイン自体を発現している細胞によって、ＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ１５ＲＢまたはＣＤ１２２）及びＩＬ－２Ｒγ（ＣＤ１３２）を発現する応答性細胞に対してトランスで提示されてもよい。理論によって限定されることを望まないで、ＩＬ－１５受容体アルファスシドメインは、受容体β及びγと適切に結合する前にＩＬ－１５と複合体を形成する必要があると考えられている。ＩＬ－１５及びＩＬ－１５Ｒα複合体、及びＩＬ－１５／ＩＬ－１５Ｒαスシドメイン融合タンパク質は、ＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞を刺激するのに非常に強力であることが報告された。

特定の実施形態では、本明細書に開示されている二機能性タンパク質は、（ａ）ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位と、第１の抗体重鎖定常領域と、ＩＬ－１５ポリペプチドまたその機能的断片もしくはその変異体とを含む第１のサブユニット；及び（ｂ）ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位と、第２の抗体重鎖定常領域と、ＩＬ－１５Ｒαポリペプチドまたはその機能的断片または変異体とを含む第２のサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドは配列番号９３またはその機能的断片または変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５ポリペプチドは配列番号９３のアミノ酸５０～１６２またはその機能的断片または変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαポリペプチドは配列番号９４またはその機能的断片または変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１５Ｒαポリペプチドは配列番号９４のアミノ酸３１～９７またはその機能的断片または変異体を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている二機能性タンパク質は、抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－Ｆｃ－ＩＬ－１５融合タンパク質及び抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－Ｆｃ－ＩＬ－１５Ｒα融合タンパク質を含むヘテロ二量体である。例えば、いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、配列番号１８６（ＥＰ２０３）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む第１のサブユニットと；配列番号１８７（ＥＰ２０４）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む第２のサブユニットと；配列番号１８１（ＥＰ２０５）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む第３のサブユニットとを含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは配列番号１８６のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、第２のサブユニットは配列番号１８７のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；且つ第３のサブユニットは配列番号１８１のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている二機能性タンパク質は抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＩＬ－１５－融合タンパク質と抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃ－ＩＬ－１５Ｒα－融合タンパク質とを含むヘテロ二量体である。例えば、いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は配列番号１８８（ＥＰ２０７）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む第１のサブユニットと配列番号１８９（ＥＰ２０８）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む第２のサブユニットとを含む。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、配列番号１８８のアミノ酸配列を含むまたはそれから成る第１のサブユニットと配列番号１８９のアミノ酸配列を含むまたはそれから成る第２のサブユニットとを含む。

特定の実施形態では、本明細書に開示されている二機能性タンパク質は機能ドメインを含み、その際、機能ドメインはＩＬ－２、例えば、野生型ＩＬ－２または操作されたＩＬ－２もしくはその機能的断片もしくは変異体である。本明細書で使用されるとき「インターロイキン２」または「ＩＬ－２」という用語は、別途指示のない限り、ヒトまたはマウスのような哺乳類を含む任意の脊椎動物源由来のＩＬ－２を指す。この用語は、前駆体のＩＬ－２、またはプロセシングされていないＩＬ－２、と同様に細胞性プロセシングから生じる任意の形態のＩＬ－２を包含する。該用語はまた、ＩＬ－２の天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体または対立遺伝子変異体も包含する。成熟ヒトＩＬ－２の一例のアミノ酸配列は配列番号１９１に示される。ＩＬ－２に関して使用される場合の「野生型」または「天然の」は成熟ＩＬ－２分子（例えば、配列番号１９１）を意味するように意図される。本明細書で使用されるとき「操作されたＩＬ－２」または「操作されたＩＬ－２ポリペプチド」という用語は、天然のまたは野生型のＩＬ－２とは異なる少なくとも１つの残基を有するＩＬ－２を包含し、完全長ＩＬ－２、ＩＬ－２の切り詰め型、及びＩＬ－２が別のポリペプチドのような別の分子と結合または融合している形態を含む。種々の形態の操作されたＩＬ－２は、ＩＬ－２Ｒβ及び／またはＩＬ－２ＲαとＩＬ－２の相互作用に影響を与える少なくとも１つのアミノ酸置換を有することを特徴とする。本明細書に記載されている種々の操作された形態のＩＬ－２の特定は、例えば、配列番号１９２に示される配列に関して行われる。いくつかの実施形態では、ＩＬ－２はＴ３Ａ置換を含むように修飾される。Ｔ３Ａ置換は野生型配列に対して行われてもよい。加えて、Ｔ３Ａ置換は本明細書に開示されている操作されたＩＬ－２配列に対して行われてもよい。野生型及び操作されたＩＬ－２ポリペプチドの例はＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０４６２４４に記載されており、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

ＩＬ－２はリンパ球の増殖及び活性化を調節する。ＩＬ－２は、最大３つの個別のサブユニットを含むＩＬ－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）に結合することによってその作用に介在する。３つのサブユニット全て、すなわちインターロイキン２受容体アルファ鎖（ＩＬ－２Ｒα、またはＣＤ２５）、インターロイキン２受容体ベータ鎖（ＩＬ－２Ｒβ、またはＣＤ１２２）、及びインターロイキン２受容体ガンマ鎖（ＩＬ－２Ｒγ、またはＣＤ１３２）の会合によって、ＩＬ－２の高親和性受容体である三量体ＩＬ－２Ｒαβγがもたらされる。ＩＬ－２Ｒβサブユニット及びＩＬ－２Ｒγサブユニットの会合は二量体受容体ＩＬ－２Ｒβγが生じ、中間親和性ＩＬ－２Ｒと呼ばれる。ＩＬ－２Ｒαサブユニットは単量体の低親和性ＩＬ－２受容体を形成する。ＩＬ－２Ｒαの発現は、免疫抑制性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖に関与しているのに対して；二量体のＩＬ－２ＲβγはＩＬ－２Ｒαの非存在下で、細胞溶解性ＣＤ８^＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞の増殖及び殺傷を生じることができる。

いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質はＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位を含み、野生型ＩＬ－２（例えば、配列番号１９１）を含む。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質はＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位を含み、且つ操作されたＩＬ－２（例えば、配列番号１９２）を含む。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質はＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位を含み、操作されたＩＬ－２を含み、その際、操作されたＩＬ－２ポリペプチドは
（ａ）野生型ＩＬ－２と比べて、以下から選択される１以上の位置にて１以上の突然変異を含むＩＬ－２受容体α（ＩＬ－２Ｒα）結合領域１：
Ｋ３５Ｇ、Ｋ３５Ｌ、Ｋ３５Ｓ、Ｋ３５Ｖ、Ｋ３５Ｄ、Ｋ３５Ｅ、及びＫ３５Ｃから選択されるＫ３５位での突然変異；
Ｒ３８Ｖ、Ｒ３８Ｄ、Ｒ３８Ｅ、Ｒ３８Ｓ、Ｒ３８Ｉ、Ｒ３８Ａ、Ｒ３８Ｙ、Ｒ３８Ｇ、Ｒ３８Ｃ、またはＲ３８Ｎから選択されるＲ３８位での突然変異；
Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｉ、Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ｐ、及びＦ４２Ｈから選択されるＦ４２位での突然変異；
Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｐ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｖ、Ｙ４５Ｃ、Ｙ４５Ｔ、及びＹ４５Ｆから選択されるＹ４５位の突然変異、及び／または
（ｂ）以下を含むＩＬ－２受容体β（ＩＬ－２Ｒβ）結合領域２モチーフを含み、
Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｄ－Ｘ４－Ｘ－５－Ｘ６－Ｎ－Ｘ７－Ｘ８－Ｘ９－Ｘ１０－Ｘ１１－Ｘ１２－Ｘ１３（配列番号９５）、
式中、
Ｘ１はＣ、Ｔ、Ｇ、Ｗ、Ｉ、Ｓ、Ｅ、及びＫから選択され；
Ｘ２はＹ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｌ、Ａ、及びＧから選択され；
Ｘ３はＳ、Ｔ、Ｑ、Ｇ、Ｍ、Ｅ、Ｒ、及びＫから選択され；
Ｘ４はＡ、Ｖ、Ｓ、及びＴから選択され；
Ｘ５はＩ、Ｌ、Ｔ、及びＶから選択され；
Ｘ６はＳ、Ｔ、Ｅ、Ｄ、及びＲから選択され；
Ｘ７はＩ、Ａ、Ｍ、及びＶから選択され；
Ｘ８はＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｉ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、及びＲから選択され；
Ｘ９はＶ、Ｌ、及びＩから選択され；
Ｘ１０はＮ、Ｔ、Ｉ、及びＬから選択され；
Ｘ１１はＶ、Ａ、及びＩから選択され；
Ｘ１２はＱ、Ｌ、Ｇ、Ｋ、及びＲから選択され、且つ
Ｘ１３はＡ、Ｄ、及びＥから選択される。

いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位を含み、且つ操作されたＩＬ－２を含み、操作されたＩＬ－２ポリペプチドは：（ａ）配列番号１２４～１４７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＩＬ－２Ｒα結合領域１；及び／または（ｂ）配列番号９６～１２３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＩＬ－２Ｒβ結合領域２モチーフを含む。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位を含み、且つ操作されたＩＬ－２を含み、（ａ）ＩＬ－２Ｒα結合領域１は配列番号１２４～１４７から選択されるアミノ酸配列を含み；及び／または（ｂ）ＩＬ－２Ｒβ結合領域２モチーフは配列番号９６～１２３から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位はｓｃＦＶまたはＦａｂである。

特定の実施形態では、二機能性タンパク質は、（ｂ）野生型または操作されたＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは変異体を含む第２のサブユニットに融合される（ａ）ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位を含む第１のサブユニットを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位はｓｃＦｖまたはＦａｂである。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、配列番号１６０～１６４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、配列番号１６０～１６４（それぞれ、ＥＰ１９９、ＥＰ２００、ＥＰ２０１、及びＥＰ４６１）から選択されるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、二機能性タンパク質は、（ａ）ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位と第１の抗体重鎖定常領域とを含む第１のサブユニット；及び（ｂ）野生型または操作されたＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは変異体と第２の抗体重鎖定常領域とを含む第２のサブユニットを含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位はｓｃＦｖまたはＦａｂである。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質はヘテロ二量体を含み、その際、第１のサブユニットは抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃ融合タンパク質であり、第２のサブユニットはＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１７６（ＥＰ３２６）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、第２のサブユニットは、配列番号１６５～１７５（それぞれ、ＥＰ２９０、ＥＰ２９１、ＥＰ２９７、ＥＰ４１２、ＥＰ４１３、ＥＰ４１４、ＥＰ４１５、ＥＰ４１６、ＥＰ４１７、ＥＰ４１８、ＥＰ４１９）から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは配列番号１７６のアミノ酸配列を含むまたはそれから成り、且つ第２のサブユニットは配列番号１６５～１７５から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれから成る。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、（ａ）配列番号１７６と配列番号１６５；（ｂ）配列番号１７６と配列番号１６６；（ｃ）配列番号１７６と配列番号１６７；（ｄ）配列番号１７６と配列番号１６８；（ｅ）配列番号１７６と配列番号１６９；（ｆ）配列番号１７６と配列番号１７０；（ｇ）配列番号１７６と配列番号１７１；（ｈ）配列番号１７６と配列番号１７２；（ｉ）配列番号１７６と配列番号１７３；（ｊ）配列番号１７６と配列番号１７４；または（ｋ）配列番号１７６と配列番号１７５を含むタンパク質のヘテロ二量体を含む。

いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質はヘテロ二量体を含み、その際、第１のサブユニットは抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－Ｆｃ融合タンパク質であり、第２のサブユニットはＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは、配列番号１７７～１８０（それぞれＥＰ３２５、ＥＰ４６２、ＥＰ４６３、ＥＰ４６４）から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、第１のサブユニットはさらに配列番号１８１（ＥＰ２０５）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むＬＣドメインを含み、第２のサブユニットは、配列番号１６５～１７５（それぞれＥＰ２９０、ＥＰ２９１、ＥＰ２９７、ＥＰ４１２、ＥＰ４１３、ＥＰ４１４、ＥＰ４１５、ＥＰ４１６、ＥＰ４１７、ＥＰ４１８、ＥＰ４１９）から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは配列番号１７７～１８０から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれから成り、ＬＣドメインは配列番号１８１のアミノ酸配列を含むまたはそれから成り、且つ第２のサブユニットは配列番号１６５～１７５から選択されるアミノ酸配列を含むまたはそれから成る。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、（ａ）配列番号１７７と配列番号１８１、配列番号１７８と配列番号１８１；配列番号１７９と配列番号１８１；または配列番号１８０及び配列番号１８１を含む第１のサブユニット；及び（ｂ）配列番号１６５～１７５から選択されるアミノ酸配列を含む第２のサブユニットを含むタンパク質のヘテロ二量体を含む。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、（ａ）配列番号１６５、配列番号１７７、及び配列番号１８１；（ｂ）配列番号１６６、配列番号１７７、及び配列番号１８１；（ｃ）配列番号１６７、配列番号１７７、及び配列番号１８１；（ｄ）配列番号１６８、配列番号１７７、及び配列番号１８１；（ｅ）配列番号１６９、配列番号１７７、及び配列番号１８１；（ｆ）配列番号１７０、配列番号１７７、及び配列番号１８１；（ｇ）配列番号１７１、配列番号１７７、及び配列番号１８１；（ｈ）配列番号１７２、配列番号１７７、及び配列番号１８１；（ｉ）配列番号１７３、配列番号１７７、及び配列番号１８１；（ｊ）配列番号１７４、配列番号１７７、及び配列番号１８１；（ｋ）配列番号１７５、配列番号１７７、及び配列番号１８１；（ｌ）配列番号１７１、配列番号１７８、及び配列番号１８１；（ｍ）配列番号１７１、配列番号１７９、及び配列番号１８１；及び（ｎ）配列番号１７１、配列番号１８０、及び配列番号１８１から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むタンパク質のヘテロ二量体を含む。

特定の実施形態では、二機能性タンパク質は、（ａ）ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位と第１の抗体重鎖定常領域とを含む第１のサブユニット；及び（ｂ）ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位と操作されたＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片もしくは変異体と第２の抗体重鎖定常領域とを含む第２のサブユニットを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位はｓｃＦｖまたはＦａｂである。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質はヘテロ二量体を含み、その際、第１のサブユニットは抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－Ｆｃ融合タンパク質であり、第２のサブユニットは抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ－ＩＬ－２－融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは配列番号１８２（ＥＰ３６２）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、且つ第２のサブユニットは配列番号１８３～１８５（ＥＰ３６３、ＥＰ３６４、ＥＰ３６５）とから選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み；任意でその際、第１及び第２のサブユニットはそれぞれ独立してさらに、配列番号１８１（ＥＰ２０５）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のサブユニットは配列番号１８２のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、且つ第２のサブユニットは配列番号１８３～１８５から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれから成り；任意でその際、第１及び第２のサブユニットはそれぞれ独立してさらに、配列番号１８１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、（ａ）配列番号１８２；配列番号１８３；及び配列番号１８１；（ｂ）配列番号１８２；配列番号１８４；及び配列番号１８１；ならびに（ｃ）配列番号１８２；配列番号１８５；及び配列番号１８１から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むタンパク質のヘテロ二量体を含む。

いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、ＳＰＲによって測定されるとき、約１ｎＭ未満のＫＤで、またはＰＤ－Ｌ１に結合する構成される抗原結合部位と比べて同等もしくはさらに低いＫＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、ＳＰＲによって測定されるとき、約６５ｎＭ未満または約５０ｎＭ未満のＫＤでＩＬ－２Ｒβに結合する。

いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、ＳＰＲによって測定されるとき、約４０ｎＭ未満のＫＤでＩＬ－２Ｒαに結合する。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、ＳＰＲによって測定されるとき、約１００ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、または約５ｎＭ未満のＫＤでＩＬ－２Ｒβに結合する。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、ＳＰＲによって測定されるとき、約０．５ｎＭ未満または約０．１ｎＭ未満のＫＤでＰＤ－Ｌ１に結合する。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質はＥＬＩＳＡによって測定されるとき、約１ｎＭ未満のＥＣ５０でＩＬ－２Ｒαに結合する。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質はＥＬＩＳＡによって測定されるとき、約５ｎＭ未満、約２．５ｎＭ未満、約１．５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．６ｎＭ未満のＥＣ５０でＩＬ－２Ｒβに結合する。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質はＥＬＩＳＡによって測定されるとき、約０．４ｎＭ未満のＥＣ５０でＰＤ－Ｌ１に結合する。

いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質はＰＤ－Ｌ１への結合に関してＰＤ－１と競合する、またはＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する。

いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は免疫細胞にてｐ－ＳＴＡＴ５発現を誘導する。いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は、単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）で測定されるとき、約１ｎＭ未満、約０．６ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、または約０．１ｎＭ未満のＥＣ５０で免疫細胞にてｐ－ＳＴＡＴ５発現を誘導し、その際、免疫細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＴｒｅｇである。特定の実施形態では、二機能性タンパク質は、マウス脾細胞で測定されるとき、免疫細胞にてｐ－ＳＴＡＴ５発現を誘導し、その際、免疫細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＴｒｅｇである。

いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は生体内で腫瘍増殖を阻害する。

いくつかの実施形態では、二機能性タンパク質は生体内で免疫細胞の増殖を誘導する。いくつかの実施形態では、免疫細胞はＴ細胞またはＮＫ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。

本開示の種々の抗体、二機能性タンパク質、及び代替形式の例を図９に示し、及び表７に提供する。

ベクターと生産方法
特定の実施形態では、本開示はさらに、本明細書に開示されているような抗原結合部位、タンパク質及び／または抗体、及び／または二機能性タンパク質及び／または抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド、またはそれらの任意の断片、変異体、または組み合わせを含む。特定の実施形態では、本開示はさらに、本開示のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。特定の実施形態では、本開示はさらに、本開示の単離されたポリヌクレオチドまたは本開示の発現ベクターを含む操作された細胞を含む。

いくつかの実施形態では、本開示は、本開示のＰＤ－Ｌ１－抗原結合部位、特異的抗体、抗原結合断片、またはそれらの変異体のいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは宿主細胞における発現のためにコドンが最適化される。コード配列が知られるまたは特定されると、既知の技術及びツール、例えば、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔＯｐｔｉｍｉｕｍＧｅｎｅツールを使用してコドン最適化を実行することができる；Ｓｃｈｏｌｔｅｎｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１９：１３５，２００６）も参照のこと。コドン最適化配列には、部分的にコドン最適化された配列（すなわち、１以上のコドンが宿主細胞での発現のために最適化される）及び完全にコドン最適化された配列が含まれる。

本開示のＰＤ－Ｌ１抗原結合部位、特異的抗体、抗原結合断片、またはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチドは、依然として同じＰＤ－Ｌ１抗原結合部位、特異的抗体、抗原結合断片、またはそれらの変異体をコードしている一方で、例えば、遺伝子コードの縮重、スプライシングなどによって異なるヌクレオチド配列を持ってもよいことも理解されるであろう。

ベクターも提供され、その際、ベクターは本明細書に開示されているようなポリヌクレオチド（すなわち、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部位、特異的抗体、抗原結合断片、またはそれらの変異体をコードするポリヌクレオチド）を含む、または含有する。ベクターは、本明細書に開示されているベクターのいずれか１以上を含むことができる。

さらなる態様では、本開示はまた、本開示に係るＰＤ－Ｌ１抗原結合部位、特異的抗体、抗原結合断片、もしくはそれらの変異体を発現する、または、本開示に係るベクターもしくはポリヌクレオチドを含む、または含有する宿主細胞も提供する。

そのような細胞の例には、真核細胞、例えば、酵母細胞、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞；及びＥ．ｃｏｌｉを含む原核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳類細胞である。特定のそのような実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞（例えば、ＤＨＦＲ－ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，７７：４２１６（１９８０））、ヒト胎児腎臓細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、Ｙ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ヒト肝細胞、例えば、ＨｅｐａＲＧ細胞、骨髄腫細胞、またはハイブリドーマ細胞のような哺乳類細胞株である。哺乳類宿主細胞株の他の例には、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４細胞）；ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；幼若ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；アフリカングリーンモンキー腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；ヒト子宮頸部がん細胞（ＨＥＬＡ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（ＨｅｐＧ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ）；マウス乳腺腫瘍細胞（ＭＭＴ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞、及びＦＳ４細胞が挙げられる。抗体産生に好適な哺乳類宿主細胞株には、例えば、ＹａｚａｋｉａｎｄＷｕ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．），ｐｐ．２５５－２６８（２００３）に記載されているものも挙げられる。

一実施形態では、宿主細胞は、原核細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉである。Ｅ．ｃｏｌｉのような原核細胞におけるペプチドの発現は十分に確立されている（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：５４５－５５１（１９９１）を参照のこと）。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合には、細菌にて産生されてもよい。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号、及び同第５，８４０，５２３号を参照のこと。

特定の実施形態では、細胞は発現ベクターによる本記載に従ってベクターで形質移入されてもよい。「形質移入」という用語は、真核細胞のような細胞へのＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）分子のような核酸分子の導入を指す。本記載の文脈では、「形質移入」という用語は、哺乳類細胞を含む真核細胞のような細胞に核酸分子を導入するための当業者に公知の任意の方法を包含する。そのような方法は、例えば、エレクトロポレーション、例えばカチオン性脂質及び／またはリポソームに基づくリポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づく形質移入、ウイルスに基づく形質移入、またはＤＥＡＥ－デキストランもしくはポリエチレンイミンのようなカチオン性ポリマーに基づく形質移入を包含する。特定の実施形態では、導入は非ウイルス性である。

さらに、本開示の宿主細胞は、例えば、本開示に係るＰＤ－Ｌ１抗原結合部位、ＰＤ－Ｌ１抗原特異的抗体、抗原結合断片、またはそれらの変異体を発現させるために、本開示に係るベクターによって安定してまたは一時的に形質移入されてもよい。そのような実施形態では、細胞は本明細書に記載されているベクターによって安定して形質移入されてもよい。あるいは、細胞は、本明細書に開示されている抗体または抗原結合断片をコードする本開示に係るベクターで一時的に形質移入されてもよい。現在開示されている実施形態のいずれかでは、ポリヌクレオチドは宿主細胞に対して異種であってもよい。

したがって、本開示はまた、本開示のＰＤ－Ｌ１抗原結合部位、特異的抗体、抗原結合断片、またはそれらの変異体を異種発現する組換え宿主細胞も提供する。例えば、細胞は、抗体が完全にまたは部分的に得られた種とは異なる種のものであってもよい（例えば、ヒト抗体または操作されたヒト抗体を発現するＣＨＯ細胞）。いくつかの実施形態では、宿主細胞の細胞型は、自然界ではＰＤ－Ｌ１抗原結合部位、特異的抗体、抗原結合断片、またはそれらの変異体を発現しない。さらに、宿主細胞は、抗体または抗原結合断片の天然状態（または抗体または抗原結合断片が操作されたまたは導出された親抗体の天然状態）には存在しないＰＤ－Ｌ１抗原結合部位、ＰＤ－Ｌ１抗原特異的抗体、抗原結合断片、またはそれらの変異体に対して翻訳後修飾（ＰＴＭ；例えば、グリコシル化またはフコシル化）を付与してもよい。そのようなＰＴＭは能的な差異（例えば、免疫原性の低下）を生じてもよい。したがって、本明細書に開示されている宿主細胞によって産生される本開示のＰＤ－Ｌ１抗原結合部位、特異的抗体、抗原結合断片、またはそれらの変異体は、天然状態の抗体（または親抗体）とは異なる１以上の翻訳後修飾を含んでもよい（例えば、ＣＨＯ細胞によって産生されるヒト抗体は、ヒトから単離されたとき及び／または天然のヒトＢ細胞または形質細胞によって産生されたときの抗体とは異なる、追加の翻訳後修飾を含むことができる）。

関連する態様では、本開示は、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部位、特異的抗体、抗原結合断片、またはそれらの変異体を生成する方法を提供し、その際、該方法は、ＰＤ－Ｌ１抗原結合部位、特異的抗体、抗原結合断片、またはそれらの変異体を生成するのに十分な条件下及び時間にて本開示の宿主細胞を培養することを含む。組換えで生成されたＰＤ－Ｌ１抗原結合部位、特異的抗体、抗原結合断片、またはそれらの変異体を単離及び精製するのに有用な方法には、例えば、組換え抗体を培養培地に分泌する好適な宿主細胞／ベクター系から上清を得ることと、次いで市販のフィルターを使用して培地を濃縮することとを含んでもよい。濃縮後、濃縮物を単一の好適な精製マトリックス、またはアフィニティーマトリックスまたはイオン交換樹脂のような一連の好適なマトリックスに適用してもよい。１以上の逆相ＨＰＬＣ工程を採用して、組換えポリペプチドをさらに精製してもよい。これらの精製法は自然環境から免疫原を単離するときにも採用されてもよい。本明細書に記載されている単離抗体／組換え抗体の１以上の大規模生産方法には、適切な培養条件を維持するためにモニターされ、及び制御されるバッチ細胞培養が含まれる。可溶性のＰＤ－Ｌ１抗原結合部位、ＰＤ－Ｌ１抗原特異的抗体、抗原結合断片、またはそれらの変異体の精製は、本明細書に記載され、且つ当該技術分野で既知であり、国内及び外国の規制当局の法律及びガイドラインに適合する方法に従って実施されてもよい。

医薬組成物
特定の実施形態では、本開示はさらに、本開示の抗原結合部位、本開示のタンパク質及び／または抗体、または本開示の二機能性タンパク質及び／または抗体と、薬学的に許容される希釈剤（複数可）、賦形剤（複数可）、または担体（複数可）とを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は追加の治療剤を含む（例えば、併用療法）。医薬組成物は、本開示の抗原結合部位、本開示のタンパク質及びまたは抗体、または本開示の二官能性タンパク質及び／または抗体の、薬学的に使用可能な製剤への加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含む１以上の薬学的に許容される担体を使用して、従来の方法で製剤化されてもよい。適切な製剤は選択される投与経路に依存する。任意の薬学的に許容可能な手法、担体、及び賦形剤が、本明細書に記載されている医薬組成物の製剤化に適するように使用される：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｏｆＰｈａｒｍａｃｙ，ＮｉｎｅｔｅｅｎｔｈＥｄ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，１９９５）、Ｈｏｏｖｅｒ，ＪｏｈｎＥ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ１９７５、Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．ａｎｄＬａｃｈｍａｎ，Ｌ．，Ｅｄｓ．，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓ，ＭａｒｃｅｌＤｅｃｋｅｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８０、及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＤｏｓａｇｅＦｏｒｍｓａｎｄＤｒｕｇＤｅｌｉｖｅｒｙＳｙｓｔｅｍｓ，ＳｅｖｅｎｔｈＥｄ．（ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＷｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）。ＩＬ－２組成物の例は、米国特許第４，６０４，３７７号及び同第４，７６６，１０６号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される担体」及び「生理学的に許容される担体」は相互交換可能に使用され、当業者に知られているような任意の及びすべての溶媒、緩衝剤、分散媒、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収剤、遅延剤、塩、保存剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル、結合物質、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香料、染料、同様の材料及びそれらの組み合わせを含み、且つ、採用される用量及び濃度にて受容者に対して一般に非毒性である、すなわち、適宜、動物、例えば、ヒトに投与された場合に、有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物である。（例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈＥｄ．ＭａｃｋＰｒｉｎｔｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ．１２８９－１３２９を参照のこと）。従来の担体が活性成分と適合しない場合を除いて、治療用組成物または医薬組成物におけるその使用が企図される。

医薬組成物は、それが固体、液体、またはエアゾールの形態で投与されるかどうか、及び注射のような投与経路のために滅菌である必要があるかどうかに応じて、異なるタイプの担体を含んでもよい。本開示の抗原結合部位、本開示のタンパク質及び／または抗体、または本開示の二機能性タンパク質及び／または抗体（及び任意の追加の治療剤）は、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病変内、頭蓋内、関節内、前立腺内、脾臓内、腎内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、血管内、粘膜的、心膜内、臍内、眼内、経口、局所的に、局所に、吸入（例えば、エアゾール吸入）により、注射、注入、持続注入、標的細胞を直接浸す局所灌流、カテ－テルを介して、洗浄を介して、クリームにて、脂質組成物（例えば、リポソーム）にて、または他の方法もしくは当業者に知られるような上述の任意の組み合わせ（例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈＥｄ．ＭａｃｋＰｒｉｎｔｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ，１９９０を参照のこと）によって投与することができる。非経口投与、特に静脈内注射は、本開示の抗原結合部位、本開示のタンパク質及び／または抗体、または本開示の二機能性タンパク質及び／または抗体のようなポリペプチド分子を投与するために最も一般的に使用される。

治療及び使用の方法
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されているのは、治療有効量の本明細書に開示されている抗原結合部位、本明細書に開示されているタンパク質もしくは抗体、または本明細書に開示されている二機能性タンパク質もしくは抗体を、それを必要とする対象に投与し、それによって免疫反応を調節することを含む、治療または使用の方法である。いくつかの実施形態では、免疫応答の調節はＴ細胞活性の増強またはＮＫ細胞活性の増強のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、治療または使用の方法は、疾患の治療をそれを必要とする対象にて行うことである。特定の実施形態では、疾患はがんである。いくつかの実施形態では、がんは、乳癌、膵臓癌、肺癌、神経膠芽腫、腎細胞癌、または黒色腫を含む。がんの非限定例には、膀胱癌、脳腫瘍、頭頸部癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、食道癌、結腸癌、大腸癌、直腸癌、胃癌、神経膠芽腫、前立腺癌、血液癌、皮膚癌、扁平上皮癌、皮膚癌、黒色腫、骨癌、腎細胞癌、及び腎臓癌が挙げられる。前癌状態または病変及び癌転移も含まれる。他の細胞増殖障害としては、腹部、骨、乳房、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域、及び泌尿生殖器系に位置する新生物が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、他の細胞増殖性障害、例えば、高ガンマグロブリン血症、リンパ増殖性障害、異常蛋白血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球症、及び上記の臓器系に位置する新生物以外の他の任意の細胞増殖性疾患を治療することもできる。

いくつかの実施形態では、免疫応答を治療または調節する使用または方法はさらに、治療有効量の少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、併用療法）を対象に投与することを含む。特定の実施形態では、追加の治療剤は抗癌剤である。抗がん薬の例としては、チェックポイント阻害薬（例えば、抗ＰＤ１抗体）、化学療法薬、腫瘍微小環境を抑制する薬剤、がんワクチン（例えば、Ｓｉｐｕｌｅｕｃｅｌ－Ｔ）、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、タリモジンラヘルパレプベク）、キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞、及び腫瘍浸潤リンパ球が挙げられる。ある特定の実施形態では、追加の治療薬は、抗原結合部分を含む分子である。特定の具体的な実施形態では、抗原結合部分は、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ分子、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ナノボディ、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー、または免疫グロブリンから選択される。特定の実施形態では、抗原結合部分は、腫瘍抗原（例えば、がん胎児性抗原、線維芽細胞活性化タンパク質－α、ＣＤ２０）またはチェックポイントタンパク質（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１）に特異的である。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、キメラ抗原受容体を発現する免疫細胞、操作されたＴ細胞受容体を発現する免疫細胞、または腫瘍浸潤リンパ球を含む。

他の実施形態は以下の開示から明らかになるであろう。

下記の実施例は、例示として提供されており、限定するためのものではない。

実施例１．抗ＰＤ－Ｌ１抗体の開発
この実施例では、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗体の開発と特性評価について説明する。

ｓｃＦｖｍＲＮＡディスプレイのスクリーニングと選択
ｍＲＮＡディスプレイ技術を使用して１０^{１２～１３}の天然ヒトｓｃＦｖライブラリーからＰＤ－Ｌ１結合物質を特定した。手短には、報告された手順（米国特許第６，２５８，５５８号）に類似して、ＤＮＡライブラリーを先ずｍＲＮＡライブラリーに転写し、次に、ピューロマイシンリンカーを介した共有結合によるｍＲＮＡ－ｓｃＦｖ融合ライブラリーに翻訳した。融合ライブラリーを最初にヒトＩｇＧ（陰性タンパク質）で対抗選択して非特異的結合物質を除去し、次に、組換えＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質に対して選択し、その後、プロテインＧ磁気ビーズに捕捉させた。ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の相互作用を阻止するｓｃＦｖを濃縮するために、ＰＤ－１を利用してプロテインＧビーズからＰＤ－Ｌ１結合物質を競合排除し、ライブラリー特異的オリゴを用いたＰＣＲ増幅によって結合物質を濃縮した。合計４回の選択を実行して、スクリーニング用の高度に濃縮されたＰＤ－Ｌ１結合プールを生成した。

抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖの特定と特性評価
４回の選択の後、ＰＤ－Ｌ１を濃縮したｓｃＦｖライブラリーを細菌ペリプラズム発現ベクターｐＥＴ２２ｂにクローニングし、ＴＯＰ１０コンピテント細胞にて形質転換した。精製及びアッセイ検出のためにＣ末端ＦＬＡＧ及び６×ＨＩＳのタグを有するようにｓｃＦｖ分子のそれぞれを操作した。ＴＯＰ１０細胞からのクローンをプールし、ミニプレップＤＮＡを調製し、続いて、発現のために細菌ロゼッタＩＩ株にて形質転換した。単一クローンを選び、増殖させ、発現のために９６ウェルプレートにて０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖを特定するアッセイのために３０℃で１６～２４時間の誘導後に上清を回収した。

個々の抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖを特定するためにＰＤ－Ｌ１結合スクリーニングＥＬＩＳＡを開発した。手短には、１ウェルあたり総量２５μＬの、１×ＰＢＳ中の最終濃度２μｇ／ｍＬのヒトＦｃ及びヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃを３８４ウェルプレートに不動化した。プレートを４℃にて一晩インキュベートし、続いて、１ウェルあたり８０μＬのスーパーブロックで１時間ブロッキングした。ヒトＦｃ及びヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃを不動化したウェルに上清２５μＬを加え、振盪しながら１時間インキュベートした。１×ＰＢＳＴにて１：５０００に希釈した抗ＦＬＡＧＨＲＰ２５μＬを加えることによってＰＤ－Ｌ１の結合を検出した。各工程間では、プレートウォッシャーにてプレートを１×ＰＢＳＴで３回洗浄した。次に、プレートをＴＭＢ基質２０μＬで５分間発色させ、２Ｎの硫酸２０μＬを加えることによって止めた。ＯＤ４５０ｎｍのＢｉｏｔｅｋプレートリーダーでプレートを読み取り、エクセル棒グラフで結合及び選択性を分析した。ヒトＦｃ対照と比べて２倍を超えるＰＤ－Ｌ１標的結合があるクローンをＤＮＡ配列決定に供した。さらなる特性評価のために、優れたクローンを生成し、及び精製した。

Ｅ．ｃｏｌｉでのｓｃＦｖ生成
特定の抗ＰＤ－Ｌ１クローンをグリセロールストックプレートから採取し、通気性膜を備えたＴｈｏｍｓｏｎ２４ウェルプレートにて５ｍＬ培養物で一晩増殖させた。この培養物、及び以下に記載されているその後のすべての培養物は、特に指定されない限り、１：５，０００希釈の消泡剤２０４も加えた、１００μｇ／ｍＬカルベニシリン及び３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを加えたＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈＣｏｍｐｌｅｔｅにて２２５ｒｐｍで振盪しながら３７℃で増殖させた。次いで、この一晩スターター培養物を使用してさらに大きな培養物に播種し、スターター培養物を指定生産培養物に１：１００希釈し、ＯＤ６００が０．５～０．８になるまで増殖させた。この時点で、培養物を最終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧで誘導し、３０℃で一晩インキュベートした。翌日、培養物を５，０００×ｇで３０分間遠心分離して細胞を沈殿させ、次いで上清を０．２μｍの滅菌ＰＥＳ膜を通して濾過滅菌した。

精製には、濾過した上清１ｍＬあたり３μＬのＮｉＳｅｐｈａｒｏｓｅＥｘｃｅｌ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。使い捨ての１０ｍＬまたは２０ｍＬのＢｉｏＲａｄＥｃｏｎｏ－Ｐａｃカラムを使用した。樹脂を少なくとも２０カラム容量（ＣＶ）の緩衝液Ａ（５００ｍＭまで追加のＮａＣｌを添加した１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４）で平衡化した。濾過滅菌した上清を、流量を１ｍＬ／分に制御する、または同じ充填樹脂床に２回に分けて注ぐことによって重力流により精製した。次いで、カラムを緩衝液１０ＣＶの緩衝液Ａ及び２０ＣＶの緩衝液Ｂ（１×ＰＢＳ、５００ｍＭまでの追加のＮａＣｌ及び３０ｍＭのイミダゾールを含むｐＨ７．４）で洗浄した。必要に応じて、任意の工程としてエンドトキシンを除去するのに２つのＤｅｔｏｘ緩衝液を使用した。２５０ｍＬの発現培養物精製については、抗体結合カラムを２０ＣＶの緩衝液Ｃ（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、追加のＮａＣｌを加えて５００ｍＭ、１％ＴＸ１１４）、２０ＣＶの緩衝液Ｄ（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、追加のＮａＣｌを加えて５００ｍＭまで、１％ＴＸ１００＋０．２％ＴＮＢＰ）、及び４０ＣＶの緩衝液Ｅ（１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４、５００ｍＭまで追加のＮａＣｌを含む）で連続的に洗浄した。溶出緩衝液Ｆ（１×ＰＢＳ、５００ｍＭまでの追加のＮａＣｌ及び５００ｍＭイミダゾールを含むｐＨ７．４）を用いて合計６つの画分（０．５ＣＶ前溶出、５×１ＣＶ溶出）でタンパク質を溶出した。画分をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイで分析した（１００μＬの希釈Ｂｒａｄｆｏｒｄ溶液＋１０μＬの試料）。明るい青色の画分をプールした。タンパク質濃度はＡ２８０伸張係数によって測定した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルを使用して精製抗体の純度を分析した。ほとんどの場合、精製抗体の熱安定性を測定するためにサーマルシフトアッセイを実行した。

ＰＤ－Ｌ１結合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡアッセイは抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖのＥＣ５０を決定するために開発された。手短には、３８４ウェルプレートに、１ウェルあたり総量２５μＬの１×ＰＢＳ中の最終濃度２μｇ／ｍＬのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃを不動化した。プレートを４℃で一晩インキュベートし、続いて、１ウェルあたり８０μＬのスーパーブロックで１時間ブロッキングした。精製した抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖを２００ｎＭから２倍連続用量設定した。ヒトＰＤ－Ｌ１を不動化したウェルに２５μＬを添加し、振盪しながら１時間インキュベートした。１×ＰＢＳＴ中１：５０００に希釈した抗ＦＬＡＧＨＲＰを２５μＬ添加することによってＰＤ－Ｌ１の結合を検出した。各工程間では、プレートウォッシャーにて１×ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。次に、プレートをＴＭＢ基質２０μＬで５分間発色させ、２Ｎの硫酸２０μＬを添加することによって止めた。ＯＤ４５０ｎｍのＢｉｏｔｅｋプレートリーダーでプレートを読み取り、次いでＰｒｉｓｍ８．１ソフトウェアにてプロットした。ＥＣ５０を算出し、表８に示した。図１は選択されたｓｃＦｖについてのＰＤ－Ｌ１結合ＥＬＩＳＡの曲線を示す。

ＳＰＲにおけるＰＤ－Ｌ１へのｓｃＦｖの結合
抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖの動態解析は、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術によって評価されている。ＢｉａｃｏｒｅＴ２００制御ソフトウェアバージョン２．０を用いてアッセイを実行した。ＣＭ５センサーチップのフローセル１及び２に抗ヒトＦｃ抗体を不動化した。各サイクルについては、１μｇ／ｍＬのヒトＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質を、抗ｈＦｃセンサーチップ上の１×のＨＢＳＰ緩衝液にてフローセル２上で流速１０μＬ／分にて６０秒間捕捉した。２倍連続希釈したＨＩＳタグ精製した抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖを参照フローセル１及びＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ捕捉フローセル２の双方に流速３０μＬ／分で１５０秒間注入した後、３００秒間洗浄した。次いで、フローセルを抗体再生緩衝液（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して３０μｌ／分の流速で３０秒間再生した。９６ウェルプレートにて抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖごとに３００ｎＭ～０ｎＭの８つの濃度ポイントをアッセイした。ＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価ソフトウェアバージョン３．０を使用して、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合するｓｃＦｖの動態を分析した。特異的結合応答単位は、ＰＤ－Ｌ１捕捉フローセル２から参照フローセル１への結合を差し引くことで得られた。選択されたｓｃＦｖの結合動態（Ｋ_ａ、Ｋ_ｄ、及びＫ_Ｄ）はセンサーグラム分析から決定されたが、それを表９に示す。

ＦＡＣＳにおける細胞表面ＰＤ－Ｌ１へのｓｃＦｖの結合
ｐＣＭＶ６－ＥｎｔｒｙベクターにてＣ末端ＦＬＡＧ及びＭｙｃのタグを持つ完全長ヒトＰＤ－Ｌ１をコードする構築物でＫ５６２細胞（ＡＴＣＣ）に形質移入した。Ｇ４１８薬剤選択プロセスによってＰＤ－Ｌ１標的発現細胞のポリクローナル薬剤耐性プールが得られた。並行して、空のベクターで形質移入した親株を陰性対照として生成した。ＰＤ－Ｌ１標的発現細胞をＦＡＣＳによって選別してＰＤ－Ｌ１標的発現ポリクローナルプールを生成した。このプールをＧ４１８薬剤選択のもとで増殖させた。次いで、単一細胞選別を実施し、その後さらに薬物選択を行ってクローン細胞株を形成した。ＦＡＣＳによってＰＤ－Ｌ１発現についてクローン株をスクリーニングした。次に、高発現ＰＤ－Ｌ１細胞株をスクリーニングとアッセイに使用した。

抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖがＰＤ－Ｌ１発現細胞に結合するかどうかを確認するために、２００ｎＭの精製抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖを完全培地で希釈し、９６ウェルプレートにてＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２細胞及びＫ５６２細胞と共に氷上で１時間インキュベートした。細胞を１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して一次抗体を除去した。次いで、細胞を１ウェルあたり２００μＬの完全培地で１回洗浄した。１００μＬの希釈二次抗体を添加し、暗所にて４℃で３０分間インキュベートすることによって、あらかじめ混合した抗ＨｉｓビオチンストレプトアビジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で試料を検出した。試料を１２００ｒｐｍで４℃にて５分間遠心し、ウェルあたり２００μＬの１×ＰＢＳで２回洗浄した。試料を２００μＬの１×ＰＢＳで再構成し、ＡｔｔｕｎｅＮｘＴサイトメーターで読み取った。分析は、陰性細胞株と標的細胞株の双方に結合する抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖのオーバーレイヒストグラムをプロットするＡｔｔｕｎｅＮｘＴソフトウェアによって行った。選択されたｓｃＦｖについての細胞表面でのＰＤ－Ｌ１結合のＥＣ５０を算出し、表１０に示す。図２Ａ～Ｂは、選択されたｓｃＦｖについてのＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２細胞の表面結合のＦＡＣＳ曲線を示す。

ＨＴＲＦにおけるＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の相互作用とのｓｃＦｖの競合
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１ＴＲ－ＦＲＥＴ（ＨＴＲＦ）アッセイキット（ＢＰＳ、７２０３８）を使用して抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖによるＰＤ－１の中和活性を評価した。手短には、１×Ｉｍｍｕｎｏ緩衝液１を作成した。色素標識アクセプター、ＰＤ－１－Ｅｕ、ＰＤ－Ｌ１ビオチン化及びｓｃＦｖを緩衝液１で希釈した。３８４ウェルプレートの各ウェルに、製造元の推奨容量に従って連続希釈したｓｃＦｖと試薬を加えた。試料を室温で１．５時間インキュベートし、その後、製造元のアッセイ用の機器設定を使用してＢｉｏｔｅｋＮｅｏ２プレートリーダーで蛍光強度を読み取った。データ解析は、６６５ｎｍ発光／６２０ｎｍ発光のＴＲ－ＦＲＥＴ比を使用して実行し、Ｐｒｉｓｍ８．０でプロットした。選択されたｓｃＦｖについてのＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の競合ＩＣ５０を算出したが、それを表１１に示す。図３Ａ～Ｂは、選択されたｓｃＦｖについてのＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の競合結果を示す。

Ｊｕｒｋａｔ細胞でのＮＦＡＴレポーターアッセイにおけるｓｃＦｖ
抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖのＰＤ－１中和活性も、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断バイオアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｊ１２５０）を使用した細胞アッセイで評価した。製造元のプロトコールに従って、ＰＤ－Ｌ１ａＡＰＣ／ＣＨＯＫ１細胞を解凍し、白色平底アッセイプレートに播種した。細胞を３７℃、５％ＣＯ_２で一晩インキュベートした。翌日、培地を各ウェルから除去した。ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖクローンを５００ｎＭから開始して５倍連続希釈し、４０μＬの２×濃度の希釈ｓｃＦｖ及び対照を細胞に添加した。プレートを３７℃で３０分間インキュベートして、ｓｃＦｖを細胞表面のＰＤ－Ｌ１に結合させた。ＰＤ－１エフェクター細胞を製造元のプロトコールに従って解凍し、抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖと共にＰＤ－Ｌ１ａＡＰＣ／ＣＨＯＫ１細胞を含有する各ウェルに４０μＬを加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ_２にて１６時間インキュベートした。次いで、アッセイプレートを１０分間室温に平衡化した。室温のＢｉｏ－Ｇｌｏ試薬８０μＬを各ウェル及び対照ウェルに加えた。プレートを室温で振盪しながら３０分間インキュベートし、光から保護した。発光をＢｉｏｔｅｋＮｅｏ２プレートリーダーで定量し、Ｐｒｉｓｍ８．０ソフトウェアでプロットした。選択されたｓｃＦｖのＮＦＡＴレポーターアッセイのＥＣ５０を算出したが、それを表１２に示す。図４はレポーターアッセイの結果を示す。

抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖ２０１８ＥＰ１７１－Ｈ０２の親和性成熟
抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖの親和性と生物活性をさらに向上させるために、２０１８ＥＰ１７１－Ｈ０２の合理的に設計されたＨＣＤＲ３変異誘発ｓｃＦｖライブラリーを構築し、厳しい選択条件に供した。ＨＣＤＲ３（配列番号４６）の残基を７０％対３０％のＷＴ対変異型の比で変異誘発した、ｇｔｇｔａｔｔａｃｔｇｔｇｃｇａｇａｇａｔａａａｇｇｇｔａｔｇｇｃａｇｔｇｇｃｔｇｇａｇｇｇｇｔｇａｃｔａｃｔｇｇｇｇｃｃａｇｇｇａ（配列番号１９０）。フレームワーク及びＶＬとの重複ＰＣＲによって変異原性ライブラリーを構築した。ｍＲＮＡディスプレイを使用して、２回の選択を介してさらに高い親和性のｓｃＦｖ結合物質を濃縮した。最初の回は、分子がＰＤ－Ｌ１の天然エピトープに結合することを保証するために、ＰＤ－Ｌ１／ＣＨＯＫ１細胞株で選択された。２回目は、１０ｎＭのＰＤ－Ｌ１－Ｆｃタンパク質と結合させ、続いて競合物質として５００ｎＭの不動化ＰＤ－Ｌ１の存在下で１６時間オフレート選択を行った。不動化されたＰＤ－Ｌ１はさらに弱い結合物質と共に除去された。次に、さらに高い親和性のｓｃＦｖ結合物質を持つＰＤ－Ｌ１ＦｃをプロテインＧビーズで捕捉し、溶出して、ＰＣＲ増幅した。

２回目の変異原性ライブラリー選択の後、プールをｐＥＴ２２ｂベクターにクローニングし、上記のようにスクリーニングした。

選択された親和性成熟したｓｃＦｖクローンについての生成、結合、及び特性評価アッセイのすべてを上記のように実施した。データを分析し、ＥＬＩＳＡ結合については表１３、ＳＰＲ動態解析については表１４、ＰＤ－Ｌ１／Ｋ６５６２細胞表面ＦＡＣＳ結合については表１５、及びＪｕｒｋａｔＮＦＡＴレポーターアッセイ表面ＰＤ－Ｌ１結合の結果については表１６に提供した。図５はＥＬＩＳＡ結合の結果を示す。図６はＰＤ－Ｌ１／Ｋ６５６２細胞表面のＦＡＣＳ結合を示す。図７はＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の競合ＨＴＲＦの結果を示す。図８は、選択された最適化されたｓｃＦｖについてのＪｕｒｋａｔＮＦＡＴレポーターアッセイの結果を示す。

実施例２．抗体及び二機能性抗体の構造
２０１９ＥＰ６９－Ｆ０３の可変ＶＨ及びＶＬ配列をヒト重鎖ＩｇＧ１主鎖及び軽鎖ラムダ主鎖（それぞれＥＰ２０６及びＥＰ２０５）の定常フレーム配列に融合して、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体を生成した。

抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５融合二機能性抗体を生成するために、抗ＰＤ－Ｌ１の一方の重鎖のＣ末端を（Ｇ_４Ｓ）_４リンカーによってヒトＩＬ－１５（５０－１６２）［Ｐ４０９３３］に融合した。Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＫ４０９Ａの突然変異（Ｗｅｉｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１７；Ｘｕｅｔａｌ．，ｍＡｂｓ，２０１５）を導入して、ノブ分子（ＥＰ２０３）としての鎖を作成した。抗ＰＤ－Ｌ１の別の重鎖のＣ末端を、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカーによってヒトＩＬ－１５Ｒα（３１－９７）［Ｑ１３２６１］に融合した。Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ、及びＹ４０７Ｖの突然変異（Ｗｅｉｅｔａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，２０１７；Ｘｕｅｔａｌ．，ｍＡｂｓ，２０１５）を導入してホール分子（ＥＰ２０４）としての鎖を作成した。軽鎖ＥＰ２０５を使用して、それぞれノブ抗ＰＤ－Ｌ１鎖及びホール抗ＰＤ－Ｌ１鎖とペア形成した。

別の場合では、２０１９ＥＰ６９－Ｆ０３のｓｃＦｖ鎖全体をヒト重鎖ＩｇＧ１主鎖の定常Ｆｃフレーム配列に融合した。ｓｃＦｖ－Ｆｃ分子の１つのＣ末端を（Ｇ_４Ｓ）_４リンカーによってヒトＩＬ－１５（５０－１６２）［Ｐ４０９３３］に融合した。この分子はノブ分子としてＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＫ４０９Ａの突然変異を保有していた。別のｓｃＦｖ－Ｆｃ分子のＣ末端を（Ｇ_４Ｓ）_４リンカー（ＥＰ２０７）によってヒトＩＬ－１５Ｒα（３１－９７）［Ｑ１３２６１］に融合した。この分子は、ホール分子としてＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ、及びＹ４０７Ｖの突然変異を保有していた（配列ＥＰ２０８）。ノブ分子とホール分子の双方におけるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇの突然変異を導入し、補体結合とＦｃ－γ依存性の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を消失させた（Ｌｏｅｔａｌ．，ＪＢＣ，２０１７）。

別の例では、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＫ４０９Ａの突然変異を抗ＰＤ－Ｌ１配列（例えばＥＰ２０５）の重鎖に導入して、ノブ分子（例えばＥＰ３６２）を生成した。操作されたＩＬ－２ポリペプチドをコードするタンパク質配列を、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカーによって抗ＰＤ－Ｌ１配列（例えば、ＥＰ２０５）の重鎖の定常フレーム配列のＣ末端部位に融合した。Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ、及びＹ４０７Ｖの突然変異を導入してホール分子（例えば、ＥＰ３６３、ＥＰ３６４、ＥＰ３６５）としての鎖を作成した。特定の実施形態では、ＦｃにおけるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇの突然変異を導入して、補体結合及びＦｃ－γ依存性抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を排除した（Ｌｏｅｔａｌ．，ＪＢＣ，２０１７）。

種々の形式では、抗ＰＤ－Ｌ１の一方の重鎖のＣ末端を（Ｇ_４Ｓ）_４リンカーによってＩＬ－１５（５０－１６２）に融合した。Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、及びＫ４０９Ａの突然変異を導入してノブ分子（ＥＰ２０３）としての鎖を作成した。抗ＰＤ－Ｌ１の別の重鎖のＣ末端を、（Ｇ_４Ｓ）_４リンカーによってヒトＩＬ－１５Ｒα（３１－９７）に融合した。Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ、及びＹ４０７Ｖの突然変異を導入してホール分子（例えば、ＥＰ２０４）としての鎖を作成した。ノブ分子及びホール分子双方におけるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇの突然変異を導入して補体結合及びＦｃ－γ依存性抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）効果を排除した（Ｌｏｅｔａｌ．，ＪＢＣ，２０１７）。軽鎖ＥＰ２０５を使用して、それぞれノブ抗ＰＤ－Ｌ１鎖及びホール抗ＰＤ－Ｌ１鎖とペア形成した。

次に、上記で設計された配列全体をコードするＤＮＡを、哺乳類細胞発現のために最適化されたコドンで合成し、ｐＣＤＮＡ３．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。図９は選択された抗ＰＤ－Ｌ１抗体の形式の概略図を示す。

実施例３．ＩＬ－２－Ｆｃ及び抗体の生成
抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体を、重鎖と軽鎖のプラスミドＤＮＡの比１：２で標準プロトコールに従ってフリースタイルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）におけるＥｘｐｉＨＥＫ２９３－Ｆ細胞にて一時的に発現させた。細胞は回収前に５日間増殖させた。上清を遠心分離によって回収し、０．２μｍのＰＥＳ膜に通して濾過した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔＰｒｉｓｍＡプロテインＡ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈ）によって抗体を精製した。タンパク質を１００ｍＭのＧｌｙ（ｐＨ２．５）＋１５０ｍＭのＮａＣｌで溶出させ、２０ｍＭのクエン酸（ｐＨ５．０）＋３００ｍＭのＮａＣｌで素早く中和した。次に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１６／６００カラムを使用して抗体をさらに精製した。単量体のピーク画分をプールして濃縮した。最終精製タンパク質は１０ＥＵ／ｍｇ未満の最終エンドトキシンレベルを有し、２０ｍＭのヒスチジンｐＨ６．０＋１５０ｍＭのＮａＣｌにて保持した。

抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５二機能性融合抗体の生成については、それぞれのＩｇＧ１主鎖形式の「ノブ」及び「ホール」構築物を、標準プロトコールに従ってフリースタイルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でのＥｘｐｉＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に形質移入した。回収前に５日間細胞を増殖させた。上清を遠心分離によって回収し、０．２μｍのＰＥＳ膜に通して濾過した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔＰｒｉｓｍＡプロテインＡ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈ）によって抗体を精製した。タンパク質を１００ｍＭのＧｌｙ（ｐＨ２．５）＋１５０ｍＭのＮａＣｌで溶出させ、２０ｍＭのクエン酸（ｐＨ５．０）＋３００ｍＭのＮａＣｌで素早く中和した。次に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１６／６００カラムによって抗体をさらに精製した。単量体のピーク画分をプールして濃縮した。最終精製タンパク質は１０ＥＵ／ｍｇ未満の最終エンドトキシンレベルを有し、１×ＰＢＳ緩衝液にて保持した。

一価ＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質の生成のために、それぞれのＩｇＧ１主鎖形式での「ノブ」と「ホール」の構築物をＥｘｐｉＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に１：１の割合で形質移入した。細胞を５日間増殖させ、遠心分離により上清を回収し、０．２μｍのＰＥＳ膜で濾過した。最初に、Ｆｃ融合アゴニストを、ＭａｂＳｅｌｅｃｔＰｒｉｓｍＡプロテインＡ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈ）によって精製した。タンパク質を１００ｍＭのＧｌｙ（ｐＨ２．５）＋１５０ｍＭのＮａＣｌで溶出させ、２０ｍＭのクエン酸（ｐＨ５．０）＋３００ｍＭのＮａＣｌで素早く中和した。次に、アゴニストタンパク質を１ｍＬに濃縮し、さらにＳｕｐｅｒｄｅｘ２００１６／６００ゲル濾過カラムによって精製した。単量体のピーク画分をプールして濃縮した。最終精製タンパク質は１０ＥＵ／ｍｇ未満の最終エンドトキシンレベルを有し、１×ＰＢＳにて保持した。精製した一価ＩＬ－２－Ｆｃ融合アゴニストをＳＤＳゲル（４～１２％のＢｉｓ－ＴｒｉｓＢｏｌｔゲル、ＭＥＳランニング緩衝液を含む）上で泳動した。

一価（Ｆａｂ形式）抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２二機能性抗体の生成については、それぞれのＩｇＧ１主鎖形式の「ノブ」及び「ホール」の構築物を対応する軽鎖構築物と共にノブ：ホール：軽鎖の比が１：４：４である標準プロトコールに従ったフリースタイルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にてＥｘｐｉＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に形質移入した。細胞は回収前に５日間増殖させた。上清を遠心分離によって回収し、０．２μｍのＰＥＳ膜に通して濾過した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔＰｒｉｓｍＡプロテインＡ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈ）によって抗体を精製した。タンパク質を１００ｍＭのＧｌｙ（ｐＨ２．５）＋１５０ｍＭのＮａＣｌで溶出させ、２０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ５．０）＋１５０ｍＭのＮａＣｌで素早く中和した。次に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１６／６００カラムによって抗体をさらに精製した。単量体のピーク画分をプールして濃縮した。最終精製タンパク質は１０ＥＵ／ｍｇ未満の最終エンドトキシンレベルを有し、２０ｍＮのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液にて保持した。

一価（ｓｃＦｖ形式）抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２二機能性抗体の生成については、それぞれのＩｇＧ１主鎖形式の「ノブ」及び「ホール」の構築物をノブ：ホールの比が１：２である標準プロトコールに従ったフリースタイルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にてＥｘｐｉＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に形質移入した。細胞は回収前に５日間増殖させた。上清を遠心分離によって回収し、０．２μｍのＰＥＳ膜に通して濾過した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔＰｒｉｓｍＡプロテインＡ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈ）によって抗体を精製した。タンパク質を１００ｍＭのＧｌｙ（ｐＨ２．５）＋１５０ｍＭのＮａＣｌで溶出させ、２０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ５．０）＋１５０ｍＭのＮａＣｌで素早く中和した。次に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１６／６００カラムによって抗体をさらに精製した。単量体のピーク画分をプールして濃縮した。最終精製タンパク質は１０ＥＵ／ｍｇ未満の最終エンドトキシンレベルを有し、２０ｍＮのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液にて保持した。

二価（Ｆａｂ形式）抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２二機能性抗体の生成については、それぞれのＩｇＧ１主鎖形式の「ノブ」及び「ホール」の構築物を対応する軽鎖構築物と共にノブ：ホール：軽鎖の比が１：２：２である標準プロトコールに従ったフリースタイルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にてＥｘｐｉＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に形質移入した。細胞は回収前に５日間増殖させた。上清を遠心分離によって回収し、０．２μｍのＰＥＳ膜に通して濾過した。ＭａｂＳｅｌｅｃｔＰｒｉｓｍＡプロテインＡ樹脂（ＧＥＨｅａｌｔｈ）によって抗体を精製した。タンパク質を１００ｍＭのＧｌｙ（ｐＨ２．５）＋１５０ｍＭのＮａＣｌで溶出させ、２０ｍＭのヒスチジン（ｐＨ５．０）＋１５０ｍＭのＮａＣｌで素早く中和した。次に、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１６／６００カラムによって抗体をさらに精製した。単量体のピーク画分をプールして濃縮した。最終精製タンパク質は１０ＥＵ／ｍｇ未満の最終エンドトキシンレベルを有し、２０ｍＮのヒスチジン、１５０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液にて保持した。

抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２融合抗体の生成については、構築物を、標準プロトコールに従ってフリースタイルシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でのＥｘｐｉＨＥＫ２９３－Ｆ細胞に形質移入した。回収前に５日間細胞を増殖させた。上清を遠心分離で回収し、０．２μｍのＰＥＳ膜に通して濾過した。製造元のプロトコールに従って、Ｎｉ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）アフィニティーカラムによって抗体を精製した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００１６／６００カラムによって抗体をさらに精製した。アゴニストの高度に均質な単量体ピーク画分をそれぞれプールし、濃縮した。最終的なエンドトキシンレベルは１０ＥＵ／ｍｇ未満であった。タンパク質をそれぞれ、結合及び機能分析のために１×ＰＢＳ緩衝液中で保存した。

実施例４．抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＩｇＧの特性評価
ＥＬＩＳＡにおけるＰＤ－Ｌ１に結合する抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧ抗体
ＥＬＩＳＡアッセイは、抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧ抗体のＥＣ５０を決定するために開発された。手短には、３８４ウェルプレートに、１ウェルあたり総量２５μＬの１×ＰＢＳ中の最終濃度２μｇ／ｍＬのヒトＰＤ－Ｌ１ＨＩＳタグ付き組換えタンパク質を不動化した。プレートを４℃で一晩インキュベートし、続いて、１ウェルあたり８０μＬのスーパーブロックで１時間ブロッキングした。精製ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧを２００ｎＭから開始する２倍連続希釈で用量設定し、２５μＬをヒトＰＤ－Ｌ１不動化ウェルに加え、振盪しながら１時間インキュベートした。１×ＰＢＳＴ中１：５０００に希釈した抗ｈＦｃＨＲＰ２５ｕＬを加えることによってＰＤ－Ｌ１の結合を検出した。各工程間では、プレートウォッシャーにて１×ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。次に、プレートをＴＭＢ基質２０μＬで５分間発色させ、２Ｎの硫酸２０μＬを添加することによって止めた。Ｂｉｏｔｅｋプレートリーダーを使用してＯＤ４５０ｎｍでプレートを読み取り、次いでＰｒｉｓｍ８．１ソフトウェアにてプロットした。表１７は、抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧ抗体についてのＥＬＩＳＡ結合のＥＣ５０を示す。

ＳＰＲにおける抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧ抗体のＰＤ－Ｌ１への結合動態
抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧの動態解析はＢｉａｃｏｒｅＴ２００によるＳＰＲ技術によって評価されている。ＢｉａｃｏｒｅＴ２００制御ソフトウェアバージョン２．０を用いてアッセイを実行した。各サイクルでは、１μｇ／ｍＬの抗ｈＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧを、プロテインＡセンサーチップ上の１×ＨＢＳＰ緩衝液中のフローセル２にて流速１０μＬ／分で６０秒間捕捉した。２倍連続希釈のｈＰＤ－Ｌ１－ＨＩＳタグ付きタンパク質を参照フローセル１及び抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧ捕捉フローセル２の双方に流速３０μＬ／分で１５０秒間注入し、その後、３００秒間洗浄した。次いで、フローセルを３０μｌ／分の流速で６０秒間、グリシンｐＨ２で再生した。９６ウェルプレートにて抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧあたり１００ｎＭ－０ｎＭの８濃度ポイントをアッセイした。ＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価ソフトウェアバージョン３．０によって、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合する抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧの動態を分析した。特異的結合応答単位は、抗体捕捉フローセル２から参照フローセル１への結合を差し引くことで得られた。以下の表１８はＳＰＲによる抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧ抗体の結合動態を示す。

ＦＡＣＳにおける細胞表面のＰＤ－Ｌ１に対する抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧ抗体の結合
２００ｎＭの精製抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧ抗体を完全培地で希釈し、９６ウェルプレートにてＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２細胞及びＫ５６２細胞と共に氷上で１時間インキュベートした。細胞を１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心して一次抗体を除去した。次いで、細胞をウェルあたり２００μＬの完全培地で１回洗浄した。１００μＬの希釈二次抗体を加え、暗所にて４℃で３０分間インキュベートすることによって、抗ｈＦｃＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７で試料を検出した。試料を１２００ｒｐｍで４℃にて５分間遠心し、ウェルあたり２００μＬの１×ＰＢＳで２回洗浄した。試料を２００μＬの１×ＰＢＳで再構成し、ＡｔｔｕｎｅＮｘＴサイトメーターで読み取った。分析は、陰性細胞株と標的細胞株の双方に結合する抗ＰＤ－Ｌ１抗体のオーバーレイヒストグラムをプロットするＡｔｔｕｎｅＮｘＴソフトウェアによって行った。

ＨＴＲＦアッセイにおけるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１相互作用に対する抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧ抗体の結合競合、及びＪｕｒｋａｔ細胞ＮＦＡＴレポーターアッセイにおける免疫細胞の活性化はｓｃＦｖの特性評価で記載されたものと同じだった。以下の表１９は、Ｊｕｒｋａｔ細胞レポーターアッセイのＥＣ５０、ＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２細胞表面結合ＥＣ５０及びＩｇＧ抗体に対するＨＴＲＦＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１競合の結果を示す。図１０はＰＤ－Ｌ１／Ｋ５６２細胞表面のＦＡＣＳ結合の結果を示す。

実施例５．抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５融合抗体の特性評価
ＥＬＩＳＡにおけるＰＤ－Ｌ１及びＩＬ－１５受容体への抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５の結合
ＥＬＩＳＡアッセイは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体のＥＣ５０を決定するために開発された。手短には、３８４ウェルプレートに、１ウェルあたり総量２５μＬの１×ＰＢＳ中の最終濃度２μｇ／ｍＬのヒトＩＬ－１５Ｒα－ＨＩＳタグ付きタンパク質またはヒトＰＤ－Ｌ１ＨＩＳタグ付きタンパク質を不動化した。プレートを４℃で一晩インキュベートし、続いて、１ウェルあたり８０μＬのスーパーブロックで１時間ブロッキングした。精製した抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５を２００ｎＭから３倍連続用量設定した。ヒトＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５を不動化したウェルに２５μＬを加え、振盪しながら１時間インキュベートした。１×ＰＢＳＴで１：１００００に希釈した抗ヒトＨＲＰ２５μＬを加えることによってＩＬ－１５またはＰＤ－Ｌ１の結合を検出した。各工程間では、プレートウォッシャーにて１×ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。次に、プレートをＴＭＢ基質２０μＬで５分間発色させ、２Ｎの硫酸２０μＬを加えることによって止めた。プレートをＯＤ４５０ｎｍのＢｉｏｔｅｋプレートリーダーで読み取り、Ｐｒｉｓｍ８．１ソフトウェアにてプロットして、ＥＣ５０を算出した。表２０は、抗体についてのＰＤ－Ｌ１のＥＬＩＳＡ結合のＥＣ５０を示す。

ＳＰＲにおけるＩＬ－２Ｒｂ及びＰＤ－Ｌ１に対する抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５の結合動態
抗ＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧ／ＩＬ－１５及び抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃ／ＩＬ－１５のＩＬ－１５Ｒβ及びＰＤ－Ｌ１に対する二機能性の動態解析はＢｉａｃｏｒｅＴ２００を用いたＳＰＲ技術によって評価されている。ＩＬ－１５受容体はＩＬ－２受容体と同じベータサブユニットを共有していることに留意のこと。したがって、ＩＬ－１５ＲβはＩＬ－２Ｒβ及びＣＤ１２２とも呼ばれる。ＢｉａｃｏｒｅＴ２００制御ソフトウェアバージョン２．０を用いてアッセイを実行した。各サイクルでは、１μｇ／ｍＬの抗ｈＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧ／ＩＬ－１５または抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ－Ｆｃ／ＩＬ－１５を、プロテインＡセンサーチップ上の１×のＨＢＳＰ緩衝液中のフローセル２にて流速１０μｌ／分で６０秒間捕捉した。２倍連続希釈したＩＬ－１５Ｒβ－ＨＩＳまたはｈＰＤ－Ｌ１－ＨＩＳタグ付きタンパク質を参照フローセル１及び抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５二機能性補足フローセル２の双方に流速３０μｌ／分で１５０秒間注入し、その後、３００秒間洗浄した。次いで、フローセルを３０μｌ／分の流速にて６０秒間、グリシンｐＨ２で再生した。９６ウェルプレートにて抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧあたり１００ｎＭ－０ｎＭ（ＩＬ－１５Ｒβ－ＨＩＳ）または３００ｎＭ－０ｎＭ（ＰＤ－Ｌ１－ＨＩＳ）の８濃度ポイントをアッセイした。抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５のＩＬ－１５Ｒβ及びＰＤ－Ｌ１タンパク質への二機能性結合の動態は、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価ソフトウェアバージョン３．０によって解析した。特異的結合応答単位は、抗体を捕捉したフローセル２から参照フローセル１への結合を差し引いて得られた。表２１は、ＩＬ－２Ｒβ及びＰＤ－Ｌ１に対する抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５の結合動態の結果を示す。

ＮＦＡＴレポーターアッセイにおける抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５抗体
Ｊｕｒｋａｔ細胞ＮＦＡＴレポーターアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｊ１２５０）における免疫細胞の活性化はｓｃＦｖの特性評価に記載されたものと同じだった。二機能性抗体についてのＥＣ５０を表２２に示す。図１１はＮＦＡＴレポーターアッセイの結果を示す。

抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５抗体のＰ－ＳＴＡＴ５活性
ヒトＰＢＭＣを、２人の別々のドナーの白血球除去システム（ＬＲＳ）コーンから単離し、９６ウェルプレート中９０μＬの培地に２５０，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を３７℃で１時間静置した。１０μＬ中１０倍濃度での抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－１５抗体で３７℃にて２０分間、細胞を刺激した。刺激したＰＢＭＣを直ちに固定し、透過処理し、細胞系列マーカー（ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦＯＸＰ３）及びｐ－ＳＴＡＴ５について染色し、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーターで可視化した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ５６－ＣＤ４－ＣＤ８＋として定義された。ＮＫ細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋として定義された。制御性Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ５６－ＣＤ４＋ＣＤ８－ＦＯＸＰ３＋として定義された。ｐ－ＳＴＡＴ５＋であった細胞の％を決定し、各抗体またはＩＬ－１５（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）の用量設定に対してグラフ化した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、Ｐ－ＳＴＡＴ５活性化のＥＣ５０値を決定した。Ｐ－ＳＴＡＴ５のＥＣ５０を表２３に示す。図１２は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞におけるｐ－ＳＴＡＴ５活性化の結果を示す。

実施例６．一価ＩＬ－２－Ｆｃの特性評価
ＩＬ－２Ｒα及びＩＬ－２Ｒβ受容体への結合ＥＬＩＳＡ
一価ＩＬ－２Ｆｃ融合タンパク質については、組み換えＨｉｓタグ付きヒトＩＬ－２Ｒα及びＩＬ－２Ｒβを３８４ウェルプレートのウェルに１×ＰＢＳ２５μＬで添加し、４℃で一晩インキュベートしてプレートをコーティングした。プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／１×ＰＢＳで３回洗浄した。１００μＬのＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋで室温にてプレートを１時間ブロックし、次に、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／１×ＰＢＳで３回洗浄した。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／１×ＰＢＳ中で、ＩＬ－２突然変異型を１０００ｎＭから０ｎＭまで希釈し、プレートに室温で２時間添加した。次に、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／１×ＰＢＳで６回洗浄した。抗Ｈｉｓタグ－ＨＲＰを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／１×ＰＢＳ中で１：５０００に希釈し、室温で１時間プレートに添加した。次に、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／１×ＰＢＳで６回洗浄し、ＴＭＢを添加して、青色に発色させた。反応を、２Ｎの硫化水素で停止させ、４５０ｎｍでの光吸光度をＢｉｏＴｅｋプレートリーダーで読み取った。ヒトＩＬ－２Ｒα及びＩＬ－２Ｒβについて、ＩＬ－２濃度に対比させた吸光度をグラフ化する。ＥＬＩＳＡ結合のＥＣ５０値の概要を表２４に示す。図１３Ａ及び図１３Ｂは、それぞれＩＬ－２Ｒα及びＩＬ－２Ｒβ受容体への一価ＩＬ－２Ｆｃタンパク質の結合を示す。

ＩＬ－２Ｒα及びＩＬ－２Ｒβ受容体への結合のＳＰＲ
一価ＩＬ－２Ｒβ Ｆｃ融合タンパク質の結合動態はＢｉａｃｏｒｅＴ２００を使用するＳＰＲ技術によって分析されている。手短には、抗ｈＦｃ抗体をフローセル１及び２に不動化した。各サイクルでは、１μｇ／ｍＬのＩＬ－２Ｆｃ融合タンパク質を、抗ｈＦｃ不動化チップ上の１×ＨＢＳＰ緩衝液中のフローセル２にて流速１０μｌ／分で６０秒間捕捉した。１００ｎＭのＩＬ－２Ｒα－Ｈｉｓタグ付きまたはＩＬ－２Ｒβ－Ｈｉｓタグ付きを２倍連続希釈し、参照フローセル１の双方に注入し、ＩＬ－２Ｆｃ融合タンパク質をフローセル２にて流速３０μｌ／分で１５０秒間補足し、最後の注入後、３００秒の洗浄を行った。９６ウェル形式にて８つの連続希釈濃度ポイントでアッセイを設定した。ＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価ソフトウェア３．０を使用して動態データを分析した。特異的結合応答単位は、標的フローセル２から参照フローセル１への結合を差し引くことで得られた。ＩＬ－２受容体に対する一価ＩＬ－２－Ｆｃ融合タンパク質の結合動態の概要を表２５に示す。

＊定常状態の親和性ＮＤ：検出不能の結合

Ｐ－ＳＴＡＴ５のプロファイル
ヒトＰＢＭＣを、２人の別々のドナーのＬＲＳコーンから単離し、９６ウェルプレート中９０μＬの培地に２５０，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を３７℃で１時間静置した。１０μＬ中１０×濃度のヒトＩＬ－２－ＦｃＷＴ及び操作されたＩＬ－２－Ｆｃ突然変異型で３７℃にて２０分間細胞を刺激した。刺激したＰＢＭＣを直ちに固定し、透過処理し、細胞系列マーカー（ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦＯＸＰ３）及びｐ－ＳＴＡＴ５について染色し、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーターで可視化した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ５６－ＣＤ４－ＣＤ８＋として定義された。ＮＫ細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋として定義された。制御性Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ５６－ＣＤ４＋ＣＤ８－ＦＯＸＰ３＋として定義された。ｐ－ＳＴＡＴ５＋であった細胞の％を決定し、各ＩＬ－２の用量設定に対してグラフ化した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、Ｐ－ＳＴＡＴ５活性化のＥＣ５０値を決定し、表２６に示した。図１４Ａ～Ｄは、ドナー１２６由来のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５のプロファイリング曲線を示す。図１４Ｅ～Ｈは、ドナー３５９由来のＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及び制御性Ｔ細胞についてのｐ－ＳＴＡＴ５のプロファイリング曲線を示す。

実施例７．ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１－ｓｃＦｖ二機能性の特性評価
ＥＬＩＳＡにおけるＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖ抗体のＩＬ－２受容体とＰＤ－Ｌ１への結合活性
３８４ウェルプレートに１ウェルあたり総量２５μＬの１×ＰＢＳ中の最終濃度２μｇ／ｍＬの抗ヒトＦｃを不動化した。プレートを４℃で一晩インキュベートし、続いて、１ウェルあたり８０μＬのスーパーブロックで１時間ブロッキングした。２５μＬの容量で５０ｎＭから開始するＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖの用量設定をウェルに加え、振盪しながら１時間インキュベートした。洗浄後、２５μＬの３０ｎＭビオチン化ＰＤ－Ｌ１を各ウェルに加えた。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖによるＰＤ－Ｌ１結合は、１×ＰＢＳＴで１：１００００に希釈したストレプトアビジンＨＲＰを２５μＬ加えることによって検出した。各工程間では、プレートウォッシャーにて１×ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。次に、プレートをＴＭＢ基質２５μＬで５分間発色させ、２Ｎの硫酸２５μＬを添加することによって止めた。ＯＤ４５０ｎｍのＢｉｏｔｅｋプレートリーダーでプレートをで読み取り、Ｐｒｉｓｍ８．１ソフトウェアによって結合の相関をプロットした。ＩＬ－２Ｒα及びＩＬ－２Ｒβ受容体に対する抗体のＥＬＩＳＡ結合アッセイを実施例６に記載のように行った。ＥＬＩＳＡ結合のＥＣ５０値を表２７に示した。図１５Ａ、図１５Ｂ、及び図１５Ｃは、それぞれ、ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ、及びＰＤ－Ｌ１に対する抗体のＥＬＩＳＡ結合曲線を示す。

ＨＴＲＦアッセイにおけるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１相互作用に対する抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧ抗体の結合競合、及びＪｕｒｋａｔ細胞ＮＦＡＴレポーターアッセイにおける免疫細胞の活性化は、ｓｃＦｖの特性評価で記載されたように実施した。ＨＴＲＦのＩＣ５０及びＮＦＡＴレポーターアッセイのＥＣ５０値を表２８に示した。図１６はＮＦＡＴレポーターアッセイの結果を示す。

ＳＰＲにおけるＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ受容体及びＰＤ－Ｌ１への結合
ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ受容体及びＰＤ－Ｌ１に対する抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２二機能性の動態解析はＢｉａｃｏｒｅＴ２００を使用するＳＰＲ技術によって評価されている。ＢｉａｃｏｒｅＴ２００制御ソフトウェアバージョン２．０を用いてアッセイを実行した。各サイクルでは、１μｇ／ｍＬの抗ｈＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２を、プロテインＡセンサーチップ上の１×ＨＢＳＰ緩衝液中のフローセル２にて流速１０μＬ／分で６０秒間捕捉した。２倍連続希釈したＩＬ－２Ｒα－ＨＩＳまたはＩＬ－２Ｒβ－ＨＩＳまたはｈＰＤ－Ｌ１－ＨＩＳのタグ付きタンパク質を参照フローセル１及び抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２二機能物質捕捉フローセル２の双方に流速３０μＬ／分で１５０秒間注入した後、３００秒間洗浄した。その後、フローセルを３０μｌ／分の流速で６０秒間、グリシンｐＨ２で再生した。９６ウェルプレートにて抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧあたり１００ｎＭ－０ｎＭ（ＩＬ－２Ｒα－ＨＩＳ及びＩＬ－２Ｒβ－ＨＩＳ）または３００ｎＭ－０ｎＭ（ＰＤ－Ｌ１－ＨＩＳ）の８濃度ポイントをアッセイした。抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ及びＰＤ－Ｌ１タンパク質への二機能性結合の動態は、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価ソフトウェアバージョン３．０によって解析した。特異的結合応答単位は、抗体を捕捉したフローセル２から参照フローセル１への結合を差し引いて得られた。ＩＬ－２及びＰＤ－Ｌ１それぞれに対する抗体の結合動態を表２９に示した。

ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖのＰ－ＳＴＡＴ５の活性化
ヒトＰＢＭＣを、２人の別々のドナーのＬＲＳコーンから単離し、９６ウェルプレート中９０μＬの培地に２５０，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を３７℃で１時間静置した。１０μＬ中１０×濃度のヒトＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖＷＴ及び操作されたＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ｓｃＦｖ突然変異型で３７℃にて２０分間細胞を刺激した。刺激されたＰＢＭＣを、直ちに固定し、透過処理し、細胞系列マーカー（ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦＯＸＰ３）及びｐ－ＳＴＡＴ５について染色し、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーターで可視化した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ５６－ＣＤ４－ＣＤ８＋として定義された。ＮＫ細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋として定義された。制御性Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ５６－ＣＤ４＋ＣＤ８－ＦＯＸＰ３＋として定義された。ｐ－ＳＴＡＴ５＋であった細胞の割合を決定し、各ＩＬ－２の用量設定に対してグラフ化した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してＰ－ＳＴＡＴ５活性化のＥＣ５０値を決定し、表３０に示した。図１７Ａ～Ｄは、ドナー３５９由来のＰＢＭＣ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５の結果を示す。図１７Ｅ～Ｈは、ドナー１２６由来のＰＢＭＣ細胞のｐ－ＳＴＡＴ５の結果を示す。

実施例８．ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ二機能性及び抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２融合体の特性評価
ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ＦａｂのＰＤ－Ｌ１結合のＥＬＩＳＡ、ＨＴＲＦ競合及びＪｕｒｋａｔレポーターアッセイ
３８４ウェルプレートに、１ウェルあたり総量２５μＬの１×ＰＢＳ中の最終濃度２μｇ／ｍＬの抗ヒトＦｃを不動化した。プレートを４℃で一晩インキュベートし、続いて、１ウェルあたり８０μＬのスーパーブロックで１時間ブロッキングした。２５μＬの容量で５０ｎＭから開始するＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ＦＡＢの用量設定をウェルに加え、振盪しながら１時間インキュベートした。洗浄後、２５μＬの３０ｎＭビオチン化ＰＤ－Ｌ１を各ウェルに加えた。ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ＦＡＢによるＰＤ－Ｌ１結合は、１×ＰＢＳＴで１：１００００に希釈したストレプトアビジンＨＲＰを２５μＬ加えることによって検出した。各工程間では、プレートウォッシャーにて１×ＰＢＳＴでプレートを３回洗浄した。次に、プレートをＴＭＢ基質２５μＬで５分間発色させ、２Ｎの硫酸２５μＬを添加することによって止めた。ＩＬ－２Ｒα及びＩＬ－２Ｒβ受容体に対する抗体のＥＬＩＳＡ結合アッセイは実施例６に記載したものと同じであった。プレートをＯＤ４５０ｎｍでのＢｉｏｔｅｋプレートリーダーで読み取り、結合相関をＰｒｉｓｍ８．１ソフトウェアでプロットした。ＥＬＩＳＡ結合のＥＣ５０値を表３１に示した。図１８Ａ、図１８Ｂ、及び図１８Ｃはそれぞれ、ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ、及びＰＤ－Ｌ１に対するＩＬ－２Ｆｃ／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ変異体のＥＬＩＳＡ結合曲線を示す。

ＨＴＲＦアッセイにおけるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１相互作用に対する二機能性タンパク質の結合競合、及びＪｕｒｋａｔ細胞ＮＦＡＴレポーターアッセイにおける免疫細胞の活性化は、ｓｃＦｖの特性評価で記載されたものと同じだった。ＨＴＲＦのＩＣ５０及びＮＦＡＴレポーターアッセイのＥＣ５０値を表３２に示した。図１９はＮＦＡＴレポーターアッセイの曲線を示す。

ＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ受容体及びＰＤ－Ｌ１に対する結合のＳＰＲ
ＩＬ－２Ｒα、Ｉ２Ｒβ及びＰＤ－Ｌ１に対する抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２二機能性物質の動態解析はＢｉａｃｏｒｅＴ２００を使用するＳＰＲ技術によって評価されている。ＢｉａｃｏｒｅＴ２００制御ソフトウェアバージョン２．０を用いてアッセイを実行した。各サイクルでは、１μｇ／ｍＬの抗ｈＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２を、プロテインＡセンサーチップ上の１×ＨＢＳＰ緩衝液中のフローセル２にて流速１０μＬ／分で６０秒間捕捉した。２倍連続希釈したＩＬ－２Ｒα－ＨＩＳまたはＩＬ－２Ｒβ－ＨＩＳまたはｈＰＤ－Ｌ１－ＨＩＳのタグ付きタンパク質を、参照フローセル１及び抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２二機能物質捕捉フローセル２の双方に流速３０μＬ／分で１５０秒間注入した後、３００秒間洗浄した。その後、フローセルを３０μｌ／分の流速で６０秒間、グリシンｐＨ２で再生した。９６ウェルプレートにて抗ＰＤ－Ｌ１ＩｇＧあたり１００ｎＭ－０ｎＭ（ＩＬ－２Ｒα－ＨＩＳ及びＩＬ－２Ｒβ－ＨＩＳ）または３００ｎＭ－０ｎＭ（ＰＤ－Ｌ１－ＨＩＳ）の８濃度ポイントをアッセイした。抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２のＩＬ－２Ｒα、ＩＬ－２Ｒβ及びＰＤ－Ｌ１タンパク質への二機能性結合の動態はＢｉａｃｏｒｅＴ２００評価ソフトウェアバージョン３．０によって解析した。特異的結合応答単位は、抗体捕捉フローセル２への結合から参照フローセル１への結合を差し引くことから導き出した。

二機能性抗体がＩＬ－２受容体とＰＤ－Ｌ１を同時に結合できるかどうかを評価するために、抗ＰＤＬ１／ＩＬ２二機能性抗体を、プロテインＡセンサーチップ上の１×ＨＢＳＰ緩衝液中のフローセル２にて１０μＬ／分の流速で６０秒間捕捉した。ｈＰＤ－Ｌ１－ＨＩＳタグ付きタンパク質を参照フローセル１と抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２二機能性物質捕捉フローセル２の双方に６０秒間注入した後、ＩＬ－２Ｒα－ＨＩＳまたはＩＬ－２Ｒβ－ＨＩＳタンパク質を参照フローセル１とｈＰＤ－Ｌ１結合抗ＰＤ－Ｌ１／ＩＬ－２二機能性物質捕捉フローセル２の双方に３０μｌ／分の流速で９０秒間注入し、その後１２０秒間洗浄した。図２０は、単一濃度での抗体へのＰＤ－Ｌ１及びＩＬ－２Ｒα及びＩＬ－２Ｒβの同時結合を示す。ＩＬ－２受容体及びＰＤ－Ｌ１に対する抗ＰＤＬ１／ＩＬ２二機能性物質の結合動態を上記のように測定し、データを表３３に示した。

ヒトＰＢＭＣにおけるＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ＦａｂのＰ－ＳＴＡＴ５活性化
ヒトＰＢＭＣを、２人の別々のドナーのＬＲＳコーンから単離し、９６ウェルプレート中９０μＬの培地に２５０，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を３７℃で１時間静置した。１０μＬ中１０×濃度のヒトＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ＦａｂＷＴ及び操作されたＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ突然変異型で３７℃にて２０分間細胞を刺激した。刺激されたＰＢＭＣを直ちに固定し、透過処理し、細胞系列マーカー（ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦＯＸＰ３）及びｐ－ＳＴＡＴ５について染色し、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーターで可視化した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ５６－ＣＤ４－ＣＤ８＋として定義された。ＮＫ細胞は、ＣＤ３－ＣＤ５６＋として定義された。制御性Ｔ細胞は、ＣＤ３＋ＣＤ５６－ＣＤ４＋ＣＤ８－ＦＯＸＰ３＋として定義された。ｐ－ＳＴＡＴ５＋であった細胞の割合を決定し、各ＩＬ－２の用量設定に対してグラフ化した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してＰ－ＳＴＡＴ５活性化のＥＣ５０値を決定し、表３４に示した。図２１Ａ～Ｄはドナー８５７におけるｐ－ＳＴＡＴ５活性化曲線を示す。図２１Ｅ～Ｈはドナー３５９におけるｐ－ＳＴＡＴ５活性化曲線を示す。

マウス脾細胞におけるＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ＦａｂのＰ－ＳＴＡＴ５活性化
購入したマウス脾細胞を９６ウェルプレート中９０μＬの培地に２５０，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を３７℃で１時間静置した。１０μＬ中１０×濃度のマウスＩＬ－２、ヒトＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ＦａｂＷＴ及び操作されたＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ突然変異型で３７℃にて２０分間細胞を刺激した。刺激したＰＢＭＣを直ちに固定し、透過処理し、細胞系列マーカー（ＣＤ３、ＮＫｐ４６、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦＯＸＰ３）及びｐ－ＳＴＡＴ５について染色し、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーターで可視化した。ＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ３＋ＮＫｐ４６－ＣＤ４－ＣＤ８＋として定義された。ＮＫ細胞はＣＤ３－ＮＫｐ４６＋として定義された。制御性Ｔ細胞はＣＤ３＋ＮＫｐ４６－ＣＤ４＋ＣＤ８－ＦＯＸＰ３＋として定義された。ｐ－ＳＴＡＴ５＋であった細胞の％を決定し、各ＩＬ－２の用量設定に対してグラフ化した。Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してＰ－ＳＴＡＴ５活性化のＥＣ５０値を決定し、表３５に示した。マウスＩＬ２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ｍＩＬ－２）を参照として使用した。図２２Ａ～Ｄはマウス脾細胞におけるｐ－ＳＴＡＴ５活性化曲線を示す。

実施例９．抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂの腫瘍増殖阻害（ＭＢ－２３１腫瘍）
単一ドナー由来のＣＤ３４＋臍帯血でヒト化した７週齢のメスＮＣＧマウスの背部脇腹に、５０％マトリゲル中５００，０００個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を皮下注射した。腫瘍をノギスで測定した。平均体積が１００ｍｍ^３に達したら、マウスを２００μｇのアテゾリズマブまたは操作した抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂＥＰ２０４／ＥＰ２０６によって３日に１回で２０日間処理した。腫瘍体積及びマウスの体重を週に３回測定した。腫瘍体積及び体重をビヒクル処理群と比べて経時的にプロットした。図２３は腫瘍増殖阻害曲線を示す。

サイトカインプロファイリングのために、マウスを放血により屠殺し、血液を直ちに遠心分離して血漿を分離した。血漿中のヒトＩＦＮγ及びＴＮＦαの濃度は、ＤｕｏｓｅｔのヒトＴＮＦα及びＩＦＮγのＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。図２４Ａ及び図２４Ｂはそれぞれ、血漿中のヒトＴＮＦα及びＩＦＮγレベルを示す。

実施例１０．ＭＣ３８腫瘍マウスにおけるＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ候補の血液及び脾細胞の免疫プロファイリング
７週齢メスＣ５７ＢＬ／６マウスの背部脇腹に５０％のマトリゲル中１００，０００個のＭＣ３８細胞を皮下注射した。腫瘍をノギスで測定した。平均体積が１００ｍｍ^３に達したら、マウスを２μｇのヒトＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１ＦａｂＷＴ（ＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５）または操作したＩＬ－２／抗－ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂ突然変異型（ＥＰ４１２／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５；ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５；ＥＰ４１６／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５；ＥＰ４１７／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５；及びＥＰ４１８／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５）によって４日に１回で１１日間処理した。１１日目にマウスを屠殺し、尾静脈採血を介して末梢血を単離した。赤血球を溶解し、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーターを使用して免疫細胞を分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＮＫｐ４６－ＣＤ４＋ＣＤ８－として定義された。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＮＫｐ４６－ＣＤ４－ＣＤ８＋として定義された。ＮＫ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＮＫｐ４６＋として定義された。制御性Ｔ細胞ＮＫ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＮＫｐ４６－ＣＤ４＋ＣＤ８－ＦＯＸＰ３＋として定義された。ＣＤ４５＋集団内の各亜型の割合を各処理群についてプロットした。図２５Ａ～Ｄは血液中の免疫細胞プロファイリングの結果を示す。図２６Ａ～Ｄは脾細胞における免疫細胞プロファイリングの結果を示す。

実施例１１．ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ候補の腫瘍増殖阻害（ｈＰＤ－１トランスジェニックマウスにおけるＢ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍）
以下の実施例は、生体内マウスモデルにおけるＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂによる腫瘍増殖阻害を評価するための実験を記載している。７週齢のメスのｈＰＤ－１トランスジェニックマウスの背部脇腹に５０％マトリゲル中５００，０００個のＢ１６Ｆ１０－ｈＰＤ－Ｌ１細胞を皮下注射した。腫瘍をノギスで測定した。平均体積が７０～９０ｍｍ^３に達した時点で、マウスを２００μｇのアテゾリズマブによって３日に１回で、または１０μｇの操作したＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ二機能性タンパク質（ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５；ＥＰ４１８／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５）によって５日に１回で２０日間処理した。腫瘍体積とマウスの体重を週に３回測定した腫瘍体積及び体重をビヒクル処理群と比べて経時的にプロットした。図２７は腫瘍増殖阻害曲線を示す。

実施例１２．ＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ候補の腫瘍増殖阻害（ＭＢ－２３１腫瘍）
以下の実施例は、生体内マウスモデルにおけるＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂによる腫瘍増殖阻害を評価するための実験を記載している。単一ドナー由来のＣＤ３４＋臍帯血でヒト化した７週齢のメスＮＣＧマウスの背部脇腹に５０％マトリゲル中５００，０００個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を皮下注射した。腫瘍をノギスで測定した。平均体積が８０～１００ｍｍ^３に達した時点で、マウスを２００μｇの操作した抗ＰＤ－Ｌ１ｍＡｂＥＰ２０５／ＥＰ２０６によって３日に１回で、または５μｇのＩＬ－２／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ二機能性タンパク質（ＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５；ＥＰ４１２／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５；ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５；ＥＰ４１８／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５）によって５日に１回で２０日間処理した。腫瘍体積とマウスの体重を週に３回測定した。腫瘍体積及び体重をビヒクル処理群と比べて経時的にプロットした。図２８は腫瘍増殖阻害曲線を示す。

実施例１３．ＩＬ２／抗ＰＤ－Ｌ１－Ｆａｂ抗体によるヒトＰＢＭＣの処理は試験管内でのＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＰＤ－１発現の増加をもたらす。
ヒトＰＢＭＣを単一ドナー由来のＬＲＳコーンから単離し、９６ウェルプレートにて完全培地１８０μＬ中１００，０００細胞／ウェルで播種した。細胞を５％ＣＯ２インキュベーター内にて３７℃で１時間静置した。ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５またはＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の複合成分を含むＩＬ－２Ｆｃ／抗ＰＤ－Ｌ１Ｆａｂを培地で希釈したものを２０μＬ添加し、ウェル内のＩＬ２の最終濃度を１００ｎＭから０．０００１ｎＭの間にして細胞を刺激した。細胞をインキュベーター内に５日間静置した。５日後、ＰＢＭＣをＰＢＳで洗浄し、生存性色素にてインキュベートした。その後洗浄した後、細胞を固定し、透過処理し、次いで細胞系列マーカー（ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦＯＸＰ３）及びＰＤ－１について染色し、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーターで可視化した。ＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ３＋ＣＤ５６－ＣＤ４－ＣＤ８＋として定義され、ＴＲｅｇはＣＤ３＋ＣＤ５６－ＣＤ４＋ＣＤ８－ＦＯＸＰ３＋として定義された。ＰＤ－１を発現するＣＤ８＋Ｔ細胞及びＴＲｅｇの割合を算出し、ＩＬ２濃度に対してプロットした。図２９Ａは、それぞれＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５及びＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の処理後の用量依存性ＰＤ－１陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を示す。図２９Ｂは、それぞれＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５及びＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の処理後のＰＤ－１陽性Ｔｒｅｇ細胞を示す。

実施例１４．ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５は強力なＩＬ２Ｒβ受容体アゴニストである
ＨＥＫ－ＢｌｕｅＩＬ－２細胞をＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入し、製造元の説明書に従って培養した。これらの細胞によるＣＤ２５、ＣＤ１２２、ＰＤ－Ｌ１の表面発現を定量するために、ＨＥＫＢｌｕｅＩＬ２細胞を２００μＬの培地中１ウェルあたり１００，０００細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。細胞をインキュベーター内で少なくとも１時間かけて回復させた。次に細胞を洗浄し、ＣＤ２５、ＣＤ１２２、またはＰＤ－Ｌ１に対する蛍光抗体で染色した。同時に、ＱｕａｎｔｕｍＳｉｍｐｌｙＣｅｌｌｕｌａｒミクロスフェア標準（ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）も同じ抗体で染色した。再び洗浄した後、細胞とマイクロスフェアをＡｔｔｕｎｅフローサイトメーターで視覚化した。適切な蛍光チャネルでの各マイクロスフェアの蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を算出し、抗体結合含量（ＡＢＣ）に対比させたＭＦＩの標準曲線を作成させた。各抗体についての細胞からのＭＦＩを適切な標準と比較し、受容体数の中央値を算出してプロットした。

ＨＥＫ－ＢｌｕｅＩＬ－２細胞を１００μＬの培地中１ウェルあたり１００，０００細胞の密度で９６ウェルプレートに播種した。細胞をインキュベーター内で少なくとも１時間かけて回復させた。プレートを遠心し、培地を除去し、１：１００希釈の抗ＣＤ２５抗体を含有する新鮮な培地または培地のみに細胞を再浮遊させた。細胞を４℃で振盪しながら３０分間インキュベートした。インキュベート後、細胞を遠心し、培地を廃棄し、用量設定したＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５またはＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５を含有する新鮮な培地に再浮遊させた。次いで、細胞を４℃で振盪しながら１時間インキュベートした。次に培地を除去し、ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ６４７と結合した抗ヒトＦｃ抗体を含有する培地と交換した。細胞を４℃で振盪しながら３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーターを使用して、結合したＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５またはＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の存在を判定した。ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５またはＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５が結合したＨＥＫＢｌｕｅＩＬ２細胞の割合をＩＬ２濃度に対してプロットした。図３０Ａは、ＨＥＫＢｌｕｅＩＬ－２細胞上のＣＤ２５、ＣＤ１２２、及びＰＤ－Ｌ１の発現レベルを示す。図３０Ｂは、抗ＣＤ２５抗体の干渉の有無にかかわらず、ＨＥＫ－ＢｌｕｅＩＬ－２細胞に対するＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５及びＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５のＦＡＣＳ結合活性を示す。ＣＤ－２５抗体は、ＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５のＨＥＫ－ＢｌｕｅＩＬ－２細胞への結合を減らしたのに対して、ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の結合には影響を有しない。このデータは、抗ＣＤ２５抗体がＥＰ４１５／３２５／２０５の細胞株との相互作用を妨げないように見えるので、ＥＰ４１５／３２５／２０５がＩＬ２Ｒβγ受容体結合を好むことを示唆している。対照的に、ＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５は、ＩＬ２－ＷＴ配列の存在によりＩＬ２Ｒαβγへの結合レベルが高く、抗ＣＤ２５抗体の干渉により結合が減少している。

実施例１５．ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５は生体内で腫瘍局在性である。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス及びＢ６Ｎアルビノマウスに、２５０，０００個のＭＣ３８細胞（左脇腹）と１，０００，０００個のＭＣ３８－ｈＰＤ－Ｌ１細胞（右脇腹）の双方を両側性で皮下接種した。双方の腫瘍の体積が最小で３００ｍｍ^３に達したら、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０で蛍光標識したＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の１ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射（ＩＰ）によってマウスに投与した。腫瘍部位における蛍光標識したＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の存在はＩＶＩＳＬｕｍｉｎａＩＩＩＬＴ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）システムを使用して判定した。画像撮影の間、内部麻酔連結管に取り付けられたノーズコーンを介して３％イソフルランでマウスを保持し、落射照明画像取得のために画像処理チャンバーの加熱（３７℃）棚上にマウスを載せた。スキャン後、マウスを取り出し、回復のためにそれぞれのケージに戻した。投与後の以下の時点：１５分、１時間、２時間、４時間、６時間、及び２４時間でマウスを画像化した。各腫瘍の総発光量を算出し、時間に対してプロットした。図３１Ａは、ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５注射後２４時間における腫瘍を有するマウスの代表的な画像処理結果を示す。図３１Ｂは、それぞれＭＣ－３８－ｈＰＤ－Ｌ１及びＭＣ－３８の腫瘍部位へのＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の時間依存性濃縮を示す。これらの結果は、ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５がＭＣ－３８－ｈＰＤ－Ｌ１腫瘍部位に優先的に局在するが、ＭＣ－３８腫瘍部位には局在しないことを示している。

実施例１６．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞ホット腫瘍モデルに有効なＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５
２～３人のドナー由来のＣＤ３４＋臍帯血でヒト化した２８～２９週齢のメスＮＣＧマウスの背部脇腹に、５０％マトリゲル中５００，０００個のＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を皮下注射した。腫瘍をノギスで測定した。平均腫瘍体積が１００ｍｍ^３に達したら、マウスを抗ＰＤ－Ｌ１ＥＰ２０５／ＥＰ２０６（２００μｇ、３日に１回）、ＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５ＩＬ２／抗ＰＤ－Ｌ１（５ｕｇ、５日に１回）、またはＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５ＩＬ２／抗ＰＤ－Ｌ１（５ｕｇ、５日に１回）によって腹腔内処理した。腫瘍体積を週に２～３回測定し、ビヒクル対照群と比べて経時的にプロットした。

投与開始後２４日目にマウスを屠殺し、腫瘍を採取した。腫瘍を単個細胞浮遊液に分離し、生存性色素と共にインキュベートした。洗浄後、腫瘍細胞を固定し、透過処理し、細胞系列マーカー（ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ４、ＣＤ８、ＦＯＸＰ３）について染色した。ＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６－ＣＤ４＋ＣＤ８－ＦＯＸＰ３－）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６－ＣＤ４－ＣＤ８＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ３－ＣＤ５６＋）、及びＴＲｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ５６－ＣＤ４＋ＣＤ８－ＦＯＸＰ３＋））の割合を生細胞すべての割合としてＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５処理群及びＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５処理群について算出し、ビヒクル処理マウスと比較した。図３２Ａは、ヒト化ＮＣＧマウスにおける抗ＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１応答性がん細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対するＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の腫瘍増殖阻害曲線を示す。ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びＥＰ２９０／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の双方よりも優れた腫瘍増殖阻害活性を示す。したがって、図３２Ｂ～Ｅは腫瘍部位における免疫細胞のレベルを示す。腫瘍部位におけるＣＤ８Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化は観察された有効性と相関している。

実施例１７．ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５はＣＯＬＯ２０５細胞コールド腫瘍モデルに有効である
２～３人のドナー由来のＣＤ３４＋臍帯血でヒト化した２８～２９週齢のメスＮＣＧマウスの背部脇腹に、５０％マトリゲル中５，０００，０００個のＣＯＬＯ２０５細胞を皮下注射した。腫瘍をノギスで測定した。平均腫瘍体積が１００ｍｍ^３に達したら、マウスを抗ＰＤ－Ｌ１（２００μｇ、ＥＰ２０５／ＥＰ２０６、３日に１回）、ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５（５ｕｇ、５日に１回）、またはＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５（５０ｕｇ、単回用量）によって腹腔内処理した。腫瘍体積を週に２～３回測定し、ビヒクル対照群と比べて経時的にプロットした。マウスの体重を毎日測定し、時間に対してプロットした。図３３Ａは、ヒト化マウスにおけるがん細胞ＣＯＬＯ２０５に対するＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の腫瘍増殖阻害曲線を示す。図３３Ｂはマウスの対応する体重変化を示す。図３３Ａ～Ｄのデータは、ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５が抗ＰＤ－Ｌ１抗体よりも腫瘍増殖の抑制においてさらに有効であることを裏付けている。

実施例１８．抗ＰＤ１耐性ＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞腫瘍に有効であるＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５
２～３人のドナー由来のＣＤ３４＋臍帯血でヒト化した２０～２４週齢のメスＮＯＧマウスの背部右脇腹に、マトリゲルと混合した（ｖ／ｖ１：１）無血清培地１００μＬ中８×１０^６個のＮＣＩ－Ｈ１９７５細胞を皮下注射した。腫瘍をノギスで測定した。平均腫瘍体積が１００ｍｍ^３に達したら、マウスをＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５（１０μｇ、１０日に１回）、ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５（５ｕｇ、６日日に１回）、ペムブロリズマブ（２００ｕｇ、４日に１回）のいずれかによって腹腔内処理した。腫瘍体積を週に２回測定し、ビヒクル対照群と比べて経時的にプロットした。マウスの体重を週に３～５回測定し、時間に対してプロットした。

投与開始後２０日目にマウスを屠殺し、腫瘍を採取した。腫瘍を単個細胞浮遊液に分離し、生存性色素と共にインキュベートした。洗浄後、腫瘍細胞を固定し、透過処理し、細胞系列マーカー（ｍＣＤ４５、ｈＣＤ４５、ｈＣＤ３、ｈＣＤ５６、ｈＣＤ４、ｈＣＤ８、ｈＦＯＸＰ３）について染色した。腫瘍１ｍｍ３あたりのｈＣＤ４５生細胞（ｍＣＤ４５－ｈＣＤ４５＋）及びｈＣＤ８＋生Ｔ細胞（ｍＣＤ４５－ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ３＋ｈＣＤ５６－ｈＣＤ４－ｈＣＤ８＋）の数を各処理群について算出し、ビヒクル対照群と比較した。腫瘍内のｈＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞（ｍＣＤ４５－ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ３－ｈＣＤ５６＋）とｈＴＲｅｇ（ｍＣＤ４５－ｈＣＤ４５＋ｈＣＤ３＋ｈＣＤ５６－ｈＣＤ８－ｈＣＤ４＋ｈＦＯＸＰ３＋）との比率も各処理群について算出し、ビヒクル対照群と比較してプロットした。図３４Ａはヒト化マウスにおけるがん細胞Ｈ１９７５に対するＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の腫瘍増殖阻害曲線を示す。図３４Ｂはマウスの対応する体重変化を示す。図３４Ｃ～Ｆは腫瘍浸潤免疫細胞のプロファイリング結果を示す。ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５は、抗ＰＤ１抗体ペムブロリズマブに耐性のあるＨ１９７５細胞に対する腫瘍増殖阻害活性を保持している。

実施例１９．Ｅｐ４１５／Ｅｐ３２５／Ｅｐ２０５のカニクイザルＰＫ／ＰＤ試験
体重範囲３．０～５．０ｋｇの２～５歳の非ナイーブカニクイザルに、０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．５ｍｇ／ｋｇのＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５のいずれかを単回でＩＶボーラス投与した。投与後、選択された各時点で血液を採取した。血漿中の構築物の濃度をＥＬＩＳＡアッセイによって定量し、ｎｇ／ｍＬで表した。サル血漿にて検出されたＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の濃度を時間に対してプロットした。各動物からの各時点での血漿濃度を薬物動態（ＰＫ）計算に使用した。台形法を使用して曲線下面積（ＡＵＣ）を推定した。確立された方程式を使用して他のパラメーターを推定した。

薬力学（ＰＤ）分析については、血液を毎日（０日目と７日目については投与前）に分離し、免疫細胞系列マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６、ＣＤ４５、ＦＯＸＰ３、ＣＤ２０）について染色し、フローサイトメトリーによって定量した。以下の免疫集団：ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３－Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ１６－ＣＤ４＋ＣＤ８－ＦＯＸＰ３－）、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ１６－ＣＤ４＋ＣＤ８－Ｆｏｘｐ３＋）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ１６－ＣＤ４－ＣＤ８＋）、Ｂ細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ１６－ＣＤ２０＋）、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞（ＣＤ４５＋ＣＤ３－ＣＤ１６＋ＣＤ２０－）を定量した。これらの各集団の生数を、観察された細胞事象の総数に対して基準化し、時間に対してプロットした。図３５Ａは、ＥＬＩＳＡによってサル血漿中で検出され、時間に対してプロットしたＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５の濃度を示す。図３５Ｂ～Ｃは、ＥＰ４１５／ＥＰ３２５／ＥＰ２０５を投与した後のサル血液中の免疫細胞集団の割合を示す。各投与後にＣＤ８＋Ｔ細胞集団の増加が観察された一方で、ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇのレベルはベースラインのままだった。

参照による組み込み
本明細書において参照される特許資料及び科学論文の各々のすべての開示は、あらゆる目的のために参照によって援用される。

均等物
本出願に記載されている抗原結合部位は、その精神または本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化されてもよい。したがって、前述の実施形態は、本明細書に記載されている抗原結合部位を限定するものではなく、あらゆる点において例示的であると見なされるべきである。したがって、本出願の範囲は、前述の説明によってではなく添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の意味及び均等の範囲内に入るすべての変更は、その中に含まれることが意図される。

本出願は、２０２１年１月２２日出願の米国仮特許出願第６３／１４０，７４９号に対する優先権の利益を主張するものであり、その出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims

ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位であって、
配列番号１１、３、１９、３３、５２、または６３の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）；配列番号１２、４、２０、３４、４１、５３、または６４の相補性決定領域２（ＣＤＲ２）；及び配列番号８９、５、１３、２１、２７、３５、４６、５４、６５、７１、７４、７７、８０、８３、または８６の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；
配列番号４７、６、１４、２２、２８、３６、５５、または６６のＣＤＲ１配列；配列番号４８、７、１５、２３、２９、３７、４２、５６、６０、または６７のＣＤＲ２配列；及び配列番号４９、８、１６、２４、３０、３８、４３、５７、または６８のＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む、前記抗原結合部位。
（ａ）それぞれ配列番号１１、１２、及び８９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号４７、４８、及び４９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；
（ｂ）それぞれ配列番号３、４、及び５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号６、７、及び８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；
（ｃ）それぞれ配列番号１１、１２、及び１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号１４、１５、及び１６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；
（ｄ）それぞれ配列番号１９、２０、及び２１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号２２、２３、及び２４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；
（ｅ）それぞれ配列番号１９、２０、及び２７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号２８、２９、及び３０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；
（ｆ）それぞれ配列番号３３、３４、及び３５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号３６、３７、及び３８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；
（ｇ）それぞれ配列番号３、４１、及び５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号６、４２、及び４３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；
（ｈ）それぞれ配列番号１１、１２、及び４６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号４７、４８、及び４９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；
（ｉ）それぞれ配列番号５２、５３、及び５４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号５５、５６、及び５７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；
（ｊ）それぞれ配列番号１１、１２、及び４６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号４７、６０、及び４９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；
（ｋ）それぞれ配列番号６３、６４、及び６５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号６６、６７、及び６８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；
（ｌ）それぞれ配列番号１１、１２、及び７１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号４７、４８、及び４９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；
（ｍ）それぞれ配列番号１１、１２、及び７４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号４７、４８、及び４９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；
（ｎ）それぞれ配列番号１１、１２、及び７７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号４７、４８、及び４９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；
（ｏ）それぞれ配列番号１１、１２、及び８０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号４７、４８、及び４９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；
（ｐ）それぞれ配列番号１１、１２、及び８３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号４７、４８、及び４９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；または
（ｑ）それぞれ配列番号１１、１２、及び８６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨ；ならびにそれぞれ配列番号４７、４８、及び４９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＬ；を含む、請求項１に記載の抗原結合部位。
（ａ）前記ＶＨは配列番号８７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号８８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）前記ＶＨは配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｃ）前記ＶＨは配列番号９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号１０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｄ）前記ＶＨは配列番号１７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号１８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｅ）前記ＶＨは配列番号２５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号２６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｆ）前記ＶＨは配列番号３１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｇ）前記ＶＨは配列番号３９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号４０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｈ）前記ＶＨは配列番号４４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号４５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｉ）前記ＶＨは配列番号５０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号５１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｊ）前記ＶＨは配列番号５８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号５９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｋ）前記ＶＨは配列番号６１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号６２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｌ）前記ＶＨは配列番号６９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号７０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｍ）前記ＶＨは配列番号７２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号７３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｎ）前記ＶＨは配列番号７５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号７６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｏ）前記ＶＨは配列番号７８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号７９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｐ）前記ＶＨは配列番号８１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号８２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；または
（ｑ）前記ＶＨは配列番号８４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号８５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の抗原結合部位。
（ａ）前記ＶＨは配列番号８７のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号８８のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｂ）前記ＶＨは配列番号１のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号２のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｃ）前記ＶＨは配列番号９のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号１０のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｄ）前記ＶＨは配列番号１７のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号１８のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｅ）前記ＶＨは配列番号２５のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号２６のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｆ）前記ＶＨは配列番号３１のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号３２のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｇ）前記ＶＨは配列番号３９のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号４０のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｈ）前記ＶＨは配列番号４４のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号４５のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｉ）前記ＶＨは配列番号５０のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号５１のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｊ）前記ＶＨは配列番号５８のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号５９のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｋ）前記ＶＨは配列番号６１のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号６２のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｌ）前記ＶＨは配列番号６９のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号７０のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｍ）前記ＶＨは配列番号７２のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号７３のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｎ）前記ＶＨは配列番号７５のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号７６のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｏ）前記ＶＨは配列番号７８のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号７９のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｐ）前記ＶＨは配列番号８１のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号８２のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；または
（ｑ）前記ＶＨは配列番号８４のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号８５のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗原結合部位。
前記抗原結合部位が単鎖断片可変断片（ｓｃＦｖ）である、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗原結合部位。
前記抗原結合部位が抗原結合断片（Ｆａｂ）である、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗原結合部位。
前記抗原結合部位が、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるとき、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．８ｎＭ未満、約０．６ｎＭ未満、約０．４ｎＭ未満、約０．２ｎＭ未満、または約０．１ｎＭ未満のＫ_ＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合する、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗原結合部位。
前記抗原結合部位が酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定されるとき、約１６０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１．５ｎＭ未満、約１．２ｎＭ未満、約１．０ｎＭ未満、約０．８ｎＭ未満、約０．７ｎＭ未満、約０．６ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、または約０．４ｎＭ未満のＥＣ_５０でヒトＰＤ－Ｌ１に結合する、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗原結合部位。
前記抗原結合部位が蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって測定されるとき、約４０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、約０．３ｎＭ未満、約０．２ｎＭ未満、約０．１ｎＭ未満のＥＣ_５０でヒトＰＤ－Ｌ１を発現している細胞に結合する、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗原結合部位。
前記抗原結合部位が、ＰＤ－Ｌ１に結合することについてＰＤ－１と競合する、またはＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗原結合部位。
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合部位を含むタンパク質。
１以上の抗体重鎖定常領域を含む、請求項１１に記載のタンパク質。
前記抗体重鎖定常領域がヒトＩｇＧ重鎖定常領域である、請求項１２に記載のタンパク質。
前記抗体重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である、請求項１２または１３に記載のタンパク質。
前記抗体重鎖定常領域が配列番号９０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１２～１４のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記抗体重鎖定常領域が、配列番号９０と比べて、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｗ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ、Ｋ４０９Ａ及びＹ４０７Ｖから選択される１以上の突然変異を含む、請求項１２～１５のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記抗体重鎖定常領域が、配列番号９１または配列番号９２のアミノ酸配列を含む、請求項１２～１６のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記タンパク質が、配列番号９０と比べて、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＫ４０９Ａから選択される１以上の突然変異を含む第１の抗体重鎖定常領域と、配列番号９０と比べてＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ及びＹ４０７Ｖから選択される１以上の突然変異を含む第２の抗体重鎖定常領域とを含む、請求項１２～１７のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記タンパク質が抗体である、請求項１１～１８のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記抗体が：
（ａ）配列番号１４８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖（ＨＣ）及び配列番号１４９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖（ＬＣ）；
（ｂ）配列番号１５０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＨＣ及び配列番号１５１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＬＣ；
（ｃ）配列番号１５２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＨＣ及び配列番号１５３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＬＣ；
（ｄ）配列番号１５４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＨＣ及び配列番号１５５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＬＣ；
（ｅ）配列番号１５６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＨＣ及び配列番号１５７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＬＣ；または
（ｆ）配列番号１５９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＨＣ及び配列番号１６０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＬＣを含む、請求項１９に記載のタンパク質。
前記抗体が：
（ａ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＨＣ及び配列番号１４９のアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＬＣ；
（ｂ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＨＣ及び配列番号１５１のアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＬＣ；
（ｃ）配列番号１５２のアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＨＣ及び配列番号１５３のアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＬＣ；
（ｄ）配列番号１５４のアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＨＣ及び配列番号１５５のアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＬＣ；
（ｅ）配列番号１５６のアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＨＣ及び配列番号１５７のアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＬＣ；または
（ｆ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＨＣ及び配列番号１６０のアミノ酸配列を含む、またはそれから成るＬＣを含む、請求項１９または２０に記載のタンパク質。
前記抗体がＳＰＲによって測定されるとき、約１０ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．４ｎＭ未満のＫ_ＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合する、請求項１９～２１のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記抗体が、ＥＬＩＳＡによって測定されるとき、約０．２ｎＭ未満のＥＣ_５０でヒトＰＤ－Ｌ１に結合する、請求項１９～２２のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記抗体が、ＦＡＣＳによって測定されるとき、約７ｎＭ未満のＥＣ_５０でヒトＰＤ－Ｌ１を発現している細胞に結合する、請求項１９～２３のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記抗体が生体内での腫瘍増殖を阻害する、請求項１９～２４のいずれか１項に記載のタンパク質。
前記抗体が、アテゾリズマブに匹敵する、またはアテゾリズマブと比べてさらに増強されたレベルにて生体内でＩＦＮγ及びＴＮＦαの分泌を誘導する、請求項１９～２５のいずれか１項に記載のタンパク質。
二機能性タンパク質であって、
（ａ）（ｉ）配列番号１１、３、１９、３３、５２、または６３の相補性決定領域１（ＣＤＲ１）と；配列番号１２、４、２０、３４、４１、５３、または６４の相補性決定領域２（ＣＤＲ２）と；配列番号８９、５、１３、２１、２７、３５、４６、５４、６５、７１、７４、７７、８０、８３、または８６の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とを含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）；及び
（ｉｉ）配列番号４７、６、１４、２２、２８、３６、５５、または６６のＣＤＲ１配列と；配列番号４８、７、１５、２３、２９、３７、４２、５６、６０、または６７のＣＤＲ２配列と；配列番号４９、８、１６、２４、３０、３８、４３、５７、または６８のＣＤＲ３配列とを含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、ＰＤ－Ｌ１に結合する抗原結合部位と、
（ｂ）インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）ポリペプチド、インターロイキン－１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒα）ポリペプチド、野生型インターロイキン－２（ＩＬ－２）ポリペプチド、または操作されたＩＬ－２ポリペプチド、またはその機能的断片もしくはその変異体とを含む、前記二機能性タンパク質。
さらに、１以上の抗体重鎖定常領域を含む、請求項２７に記載の二機能性タンパク質。
ＰＤ－Ｌ１に結合する前記抗原結合部位が、
（ａ）前記ＶＨは配列番号８７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号８８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｂ）前記ＶＨは配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｃ）前記ＶＨは配列番号９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号１０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｄ）前記ＶＨは配列番号１７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号１８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｅ）前記ＶＨは配列番号２５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号２６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｆ）前記ＶＨは配列番号３１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｇ）前記ＶＨは配列番号３９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号４０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｈ）前記ＶＨは配列番号４４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号４５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｉ）前記ＶＨは配列番号５０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号５１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｊ）前記ＶＨは配列番号５８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号５９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｋ）前記ＶＨは配列番号６１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号６２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｌ）前記ＶＨは配列番号６９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号７０と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｍ）前記ＶＨは配列番号７２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号７３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｎ）前記ＶＨは配列番号７５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号７６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｏ）前記ＶＨは配列番号７８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号７９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；
（ｐ）前記ＶＨは配列番号８１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号８２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；または
（ｑ）前記ＶＨは配列番号８４と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記ＶＬは配列番号８５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む；ことを含む、請求項２７～２８のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
ＰＤ－Ｌ１に結合する前記抗原結合部位が、
（ａ）前記ＶＨは配列番号８７のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号８８のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｂ）前記ＶＨは配列番号１のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号２のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｃ）前記ＶＨは配列番号９のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号１０のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｄ）前記ＶＨは配列番号１７のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号１８のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｅ）前記ＶＨは配列番号２５のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号２６のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｆ）前記ＶＨは配列番号３１のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号３２のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｇ）前記ＶＨは配列番号３９のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号４０のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｈ）前記ＶＨは配列番号４４のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号４５のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｉ）前記ＶＨは配列番号５０のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号５１のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｊ）前記ＶＨは配列番号５８のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号５９のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｋ）前記ＶＨは配列番号６１のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号６２のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｌ）前記ＶＨは配列番号６９のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号７０のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｍ）前記ＶＨは配列番号７２のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号７３のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｎ）前記ＶＨは配列番号７５のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号７６のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｏ）前記ＶＨは配列番号７８のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号７９のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；
（ｐ）前記ＶＨは配列番号８１のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号８２のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；または
（ｑ）前記ＶＨは配列番号８４のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記ＶＬは配列番号８５のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る；ことを含む、請求項２７～２９のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
（ａ）ＰＤ－Ｌ１、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）ポリペプチドまたはその機能的断片または変異体に結合する前記抗原結合部位と第１の抗体重鎖定常領域とを含む第１のサブユニット；及び
（ｂ）ＰＤ－Ｌ１、インターロイキン－１５受容体アルファ（ＩＬ－１５Ｒα）ポリペプチドまたはその機能的断片または変異体に結合する前記抗原結合部位と第２の抗体重鎖定常領域とを含む第２のサブユニットを含む、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記ＩＬ－１５ポリペプチドが配列番号９３のアミノ酸５０～１６２またはその機能的断片または変異体を含む、請求項２７～３１のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記ＩＬ－１５Ｒαポリペプチドが配列番号９４のアミノ酸３１～９７またはその機能的断片または変異体を含む、請求項２７～３２のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記第１のサブユニットが配列番号１８６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが配列番号１８７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み；任意で、前記第１のサブユニットはさらに、配列番号１８１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２７～３３のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記第１のサブユニットが配列番号１８６のアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが配列番号１８７のアミノ酸配列を含み；任意で、前記第１のサブユニットはさらに、配列番号１８１のアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の二機能性タンパク質。
前記第１のサブユニットが配列番号１８８と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが配列番号１８９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２７～３３のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記第１のサブユニットが配列番号１８８のアミノ酸配列を含む、またはそれから成り、前記第２のサブユニットが配列番号１８９のアミノ酸配列を含む、またはそれから成る、請求項３６に記載の二機能性タンパク質。
前記操作されたＩＬ－２ポリペプチドが：
（ａ）野生型ＩＬ－２と比べて
Ｋ３５Ｇ、Ｋ３５Ｌ、Ｋ３５Ｓ、Ｋ３５Ｖ、Ｋ３５Ｄ、Ｋ３５Ｅ、及びＫ３５Ｃから選択されるＫ３５位における突然変異；
Ｒ３８Ｖ、Ｒ３８Ｄ、Ｒ３８Ｅ、Ｒ３８Ｓ、Ｒ３８Ｉ、Ｒ３８Ａ、Ｒ３８Ｙ、Ｒ３８Ｇ、Ｒ３８Ｃ、またはＲ３８Ｎから選択されるＲ３８位における突然変異；
Ｆ４２Ａ、Ｆ４２Ｒ、Ｆ４２Ｇ、Ｆ４２Ｉ、Ｆ４２Ｌ、Ｆ４２Ｐ、及びＦ４２Ｈから選択されるＦ４２位における突然変異；
Ｙ４５Ｓ、Ｙ４５Ｐ、Ｙ４５Ａ、Ｙ４５Ｖ、Ｙ４５Ｃ、Ｙ４５Ｔ、及びＹ４５Ｆから選択されるＹ４５位における突然変異から選択される１以上の位置にて１以上の突然変異を含むＩＬ－２受容体α（ＩＬ－２Ｒα）結合領域１、及び／または
（ｂ）Ｘ_１－Ｘ_２－Ｘ_３－Ｄ－Ｘ_４－Ｘ－_５－Ｘ_６－Ｎ－Ｘ_７－Ｘ_８－Ｘ_９－Ｘ_１０－Ｘ_１１－Ｘ_１２－Ｘ_１３（配列番号９５）を含むＩＬ－２受容体β（ＩＬ－２Ｒβ）結合領域２モチーフを含み、
式中、
Ｘ_１はＣ、Ｔ、Ｇ、Ｗ、Ｉ、Ｓ、Ｅ、及びＫから選択され；
Ｘ_２はＹ、Ｐ、Ｖ、Ｗ、Ｌ、Ａ、及びＧから選択され；
Ｘ_３はＳ、Ｔ、Ｑ、Ｇ、Ｍ、Ｅ、Ｒ、及びＫから選択され；
Ｘ_４はＡ、Ｖ、Ｓ、及びＴから選択され；
Ｘ_５はＩ、Ｌ、Ｔ、及びＶから選択され；
Ｘ_６はＳ、Ｔ、Ｅ、Ｄ、及びＲから選択され；
Ｘ_７はＩ、Ａ、Ｍ、及びＶから選択され；
Ｘ_８はＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｉ、Ｇ、Ｅ、Ｋ、及びＲから選択され；
Ｘ_９はＶ、Ｌ、及びＩから選択され；
Ｘ_１０はＮ、Ｔ、Ｉ、及びＬから選択され；
Ｘ_１１はＶ、Ａ、及びＩから選択され；
Ｘ_１２はＱ、Ｌ、Ｇ、Ｋ、及びＲから選択され、且つ
Ｘ_１３はＡ、Ｄ、及びＥから選択される、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記操作されたＩＬ－２ポリペプチドが：
（ａ）配列番号１２４～１４７から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＩＬ－２Ｒα結合領域１；及び／または
（ｂ）配列番号９６～１２３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むＩＬ－２Ｒβ結合領域２モチーフを含む、請求項３８に記載の二機能性タンパク質。
（ａ）前記ＩＬ－２Ｒα結合領域１が配列番号１２４～１４７から選択されるアミノ酸配列を含み；及び／または
（ｂ）前記ＩＬ－２Ｒβ結合領域２モチーフが配列番号９６～１２３から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３８～３９のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
配列番号１６０～１６４から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項２７～３０のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
配列番号１６０～１６４から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の二機能性タンパク質。
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に結合する前記抗原結合部位と第１の抗体重鎖定常領域とを含む第１のサブユニット；及び
（ｂ）野生型インターロイキン－２（ＩＬ－２）または操作されたＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片または変異体と第２の抗体重鎖定常領域とを含む第２のサブユニットを含む、請求項２７～３０及び３８～４０のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記第１のサブユニットが配列番号１７６と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが配列番号１６５～１７５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の二機能性タンパク質。
前記第１のサブユニットが配列番号１７６のアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが配列番号１６５～１７５から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４３～４４のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記第１のサブユニットが配列番号１７７～１８０から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが配列番号１６５～１７５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み；任意で、前記第１のサブユニットはさらに、配列番号１８１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の二機能性タンパク質。
前記第１のサブユニットが配列番号１７７～１８０から選択されるアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが配列番号１６５～１７５から選択されるアミノ酸配列を含み；任意で、前記第１のサブユニットはさらに、配列番号１８１のアミノ酸配列を含む、請求項４６に記載の二機能性タンパク質。
前記第１のサブユニットが配列番号１７７及び配列番号１８１のアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが配列番号１７１のアミノ酸配列を含む、請求項４６または４７に記載の二機能性タンパク質。
（ａ）ＰＤ－Ｌ１に結合する前記抗原結合部位と第１の抗体重鎖定常領域とを含む第１のサブユニット；及び
（ｂ）ＰＤ－Ｌ１、野生型インターロイキン－２（ＩＬ－２）または操作されたＩＬ－２ポリペプチドまたはその機能的断片または変異体に結合する抗原結合部位と第２の抗体重鎖定常領域とを含む第２のサブユニットを含む、請求項２７～３０及び３８～４０のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記第１のサブユニットが配列番号１８２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが配列番号１８３～１８５から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み；任意で、前記第１及び前記第２のサブユニットはそれぞれ独立してさらに、配列番号１８１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項４９に記載の二機能性タンパク質。
前記第１のサブユニットが配列番号１８２のアミノ酸配列を含み、前記第２のサブユニットが配列番号１８３～１８５から選択されるアミノ酸配列を含み；任意で、前記第１及び前記第２のサブユニットはそれぞれ独立してさらに、配列番号１８１のアミノ酸配列を含む、請求項４９～５０のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記抗体重鎖定常領域がヒトＩｇＧ重鎖定常領域である、請求項２８～５１のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記抗体重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１重鎖定常領域である、請求項２８～５２のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記抗体重鎖定常領域が配列番号９０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２８～５３のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記抗体重鎖定常領域が、配列番号９０と比べて、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｔ３６６Ｗ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ、Ｋ４０９Ａ及びＹ４０７Ｖから選択される１以上の突然変異を含む、請求項２８～５４のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記第１及び第２の抗体重鎖定常領域の一方が配列番号９０と比べて、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされたＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＫ４０９Ａから選択される１以上の突然変異を含み；且つ他方の抗体重鎖定常領域が配列番号９０と比べてＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ及びＹ４０７Ｖから選択される１以上の突然変異を含む、請求項３１～５５のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記第１及び第２の抗体重鎖定常領域の一方が配列番号９０と比べて、ＥＵ番号付けシステムに従って番号付けされた突然変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＫ４０９Ａを含み；且つ他方の抗体重鎖定常領域が配列番号９０と比べて突然変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｆ４０５Ｋ及びＹ４０７Ｖを含む、請求項３１～５６のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記第１及び第２の抗体重鎖定常領域の一方が配列番号９１のアミノ酸配列を含み、且つ他方の抗体重鎖定常領域が配列番号９２のアミノ酸配列を含む、請求項３１～５７のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記二機能性タンパク質が、ＳＰＲによって測定されるとき、約１ｎＭ未満のＫ_Ｄで、またはＰＤ－Ｌ１に結合する構成される抗原結合部位と比べて同等もしくはさらに低いＫ_ＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合する、請求項２７～５８のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記二機能性タンパク質が、ＳＰＲによって測定されるとき、約０．５ｎＭ未満または約０．１ｎＭ未満のＫ_ＤでＰＤ－Ｌ１に結合する、請求項２７～５９のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記二機能性タンパク質が、ＥＬＩＳＡによって測定されるとき、約０．４ｎＭ未満のＥＣ_５０でＰＤ－Ｌ１に結合する、請求項２７～６０のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記二機能性タンパク質が、ＰＤ－Ｌ１に結合することについてＰＤ－１と競合する、またはＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する、請求項２７～６１のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記二機能性タンパク質がＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する、請求項２７～６２のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記二機能性タンパク質が、ＳＰＲによって測定されるとき、約１００ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、または約５ｎＭ未満のＫ_ＤでＩＬ－２Ｒβに結合する、請求項２７～３０及び３８～６３のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記二機能性タンパク質が、ＳＰＲによって測定されるとき、約６５ｎＭ未満または約５０ｎＭ未満のＫ_ＤでＩＬ－２Ｒβに結合する、請求項２７～３０及び３８～６４のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記二機能性タンパク質が、ＳＰＲによって測定されるとき、約４０ｎＭ未満のＫ_ＤでＩＬ－２Ｒαに結合する、請求項２７～３０及び３８～６５のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記二機能性タンパク質が、ＥＬＩＳＡによって測定されるとき、約１ｎＭ未満のＥＣ_５０でＩＬ－２Ｒαに結合する、請求項２７～３０及び３８～６６のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記二機能性タンパク質が、ＥＬＩＳＡによって測定されるとき、約５ｎＭ未満、約２．５ｎＭ未満、約１．５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、または約０．６ｎＭ未満のＥＣ_５０でＩＬ－２Ｒβに結合する、請求項２７～３０及び３８～６７のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記二機能性タンパク質が免疫細胞にてＰ－ＳＴＡＴ５の発現を誘導する、請求項２７～６８のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記二機能性タンパク質が、単離されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）にて測定されるとき、約１ｎＭ未満、約０．６ｎＭ未満、または約０．１ｎＭ未満のＥＣ_５０で免疫細胞にてｐ－ＳＴＡＴ５の発現を誘導し、その際、前記免疫細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＴｒｅｇである、請求項２７～６９のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記二機能性タンパク質が、単離されたＰＢＭＣにて測定されるとき、約０．５ｎＭ未満、または約０．１ｎＭ未満のＥＣ_５０で免疫細胞にてｐ－ＳＴＡＴ５の発現を誘導し、その際、前記免疫細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＴｒｅｇである、請求項２７～７０のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記二機能性タンパク質が、マウス脾細胞で測定されるとき、免疫細胞にてｐ－ＳＴＡＴ５の発現を誘導し、その際、前記免疫細胞はＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＴｒｅｇである、請求項２７～７１のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記二機能性タンパク質が生体内で腫瘍増殖を阻害する、請求項２７～７２のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記二機能性タンパク質が生体内にて免疫細胞の増殖を誘導する、請求項２７～７３のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質。
前記免疫細胞がＴ細胞またはＮＫ細胞である、請求項７４に記載の二機能性タンパク質。
前記Ｔ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項７５に記載の二機能性タンパク質。
ＶＨ及びＶＬを含む抗体であって、前記ＶＨが配列番号８７のポリペプチド配列を含み、前記ＶＨが配列番号８８のポリペプチド配列を含む、前記抗体。
前記抗体が配列番号１７７及び配列番号１８１のポリペプチド配列を含む、請求項７７に記載の抗体。
請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合部位、請求項１１～２６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２７～７６のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質、または請求項７７もしくは７８に記載の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
請求項７９に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
請求項７９に記載の単離されたポリヌクレオチドまたは請求項８０に記載の発現ベクターを含む、修飾された細胞。
医薬組成物であって、請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合部位、請求項１１～２６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２７～７６のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質、または請求項７７もしくは７８に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、前記医薬組成物。
免疫応答の調節をそれを必要とする対象にて行う方法で使用するための請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合部位、請求項１１～２６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２７～７６のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質、または請求項７７もしくは７８に記載の抗体。
前記免疫応答を調節することが、Ｔ細胞活性の増強、またはＮＫ細胞活性の増強のうちの少なくとも１つを含む、請求項８３に記載の方法。
疾患の治療をそれを必要とする対象にて行う方法で使用するための請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合部位、請求項１１～２６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２７～７６のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質、または請求項７７もしくは７８に記載の抗体。
前記疾患ががんである、請求項８５に記載の使用のための請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合部位、請求項１１～２６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２７～７６のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質、または請求項７７もしくは７８に記載の抗体。
前記がんが乳癌、膵臓癌、肺癌、神経膠芽腫、腎細胞癌、または黒色腫を含む、請求項８６に記載の使用のための請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合部位、請求項１１～２６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２７～７６のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質、または請求項７７もしくは７８に記載の抗体。
前記対象が追加の治療剤で治療される、請求項８３～８７に記載の使用のための請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合部位、請求項１１～２６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２７～７６のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質、または請求項７７もしくは７８に記載の抗体。
免疫応答の調節をそれを必要とする対象にて行う方法であって、前記方法が治療有効量の請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合部位、請求項１１～２６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２７～７６のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質、または請求項７７もしくは７８に記載の抗体、またはその医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
前記免疫応答を調節することが、エフェクターＴ細胞活性の増強、ＮＫ細胞活性の増強、及び制御性Ｔ細胞活性の抑制のうちの少なくとも１つを含む、請求項８９に記載の方法。
疾患の治療をそれを必要とする対象にて行う方法であって、前記方法が治療有効量の請求項１～１０のいずれか１項に記載の抗原結合部位、請求項１１～２６のいずれか１項に記載のタンパク質、請求項２７～７６のいずれか１項に記載の二機能性タンパク質、または請求項７７もしくは７８に記載の抗体、またはその医薬組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
前記疾患ががんである、請求項９１に記載の方法。
前記がんが乳癌、膵臓癌、肺癌、神経膠芽腫、腎細胞癌、または黒色腫を含む、請求項９２に記載の方法。