TW202233694A - 雙特異性抗體 - Google Patents

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Abstract

提供一種雙特異性抗體，其包含第一抗原結合部分和第二抗原結合部分，其中第一抗原結合部分的配對結構域包含工程化的HLA-I α3的胺基酸序列和工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列。還提供雙特異性抗體的表達方法，編碼所述雙特異性抗體的多核苷酸、含有所述多核苷酸的載體和宿主細胞、包含所述雙特異性抗體的藥物組合物，以及融合蛋白和綴合物。提供的雙特異性抗體，防止或減弱不同特異性的重鏈和輕鏈的錯配。

Description

雙特異性抗體
本發明是有關於一種抗體，且特別是有關於一種改善抗體輕重鏈錯配的雙特異性抗體。
20世紀60年代初，Nisonoff和同事首次描述了具有兩種不同抗原結合位元點的人工抗體分子-雙特異性抗體(BsAb, bispecific antibody)的概念（Nisonoff等, Science 132, 1770–1771(1960)）。他們用輕微的再氧化來偶聯具有不同特異性的兔抗原結合片段(Fab)，顯示這兩種抗原結合片段介導的兩種不同類型的細胞的凝集作用（Fudenberg等, A. J.Exp. Med. 119, 151–166 (1964)）。一系列概念和技術創新之後，隨著抗體工程和抗體生物學的重大進展而發展，雙特異性抗體概念正在被生物技術和製藥公司商業化，以產生新穎和獨特的治療方法。
在雙特異抗體研發設計時，需要以臨床治療目的為基礎，保證兩對不同特異性的輕鏈和重鏈正確配對，還需要保持每個單克隆抗體各自結合域的獨立性，保證結合不同表位時不會產生空間位阻的干擾，同時還要求抗體分子易於用哺乳動物細胞進行表達，不需要複雜的蛋白修飾工藝。其中不對稱性分子設計形式的雙特異性抗體力求盡可能地保留天然抗體的天然結構，以保持相關的功能特徵和有利的品質屬性。透過打破抗體H2L2組件的對稱性，以解決鏈錯配的問題。
雙特異性抗體憑藉其雙靶向性的優勢成為目前腫瘤治療新興藥物研究領域之一，雙特異性抗體的構建和製備技術也經歷了一系列的革新，目的之一是為了解決錯配問題，提高生產效率。一些雙特異性抗體需要透過共表達兩條不同的重鏈和兩條不同的輕鏈，並且還要從多種重組產物中挑選目標性的雙特異性抗體，這也一直是雙抗開發過程中難題之一。為了解決鏈的錯配，近些年科學家已經研發了許多策略和技術平台，可設計和表達不同結構的雙抗。目前雙抗的結構已有數十種之多，出自不同的製備平台，較為成熟的為Genentech/Roche knob-into-hole、Amgen BiTe、Chugai/Roche ART-Ig平台，其中Knob-into-hole是解決重鏈錯配問題的經典技術，還有其他技術平台例如DVD-Ig、TrioMab、DART、FIT-Ig、WuXiBody等。
大多數不對稱形式的雙特異性抗體透過向Fc區中引入突變(Ridgway等, Protein Engineering, Design and Selection, 9(7), 617-621.)，強制矯正並促使重鏈之間配對，實現了兩個不同的重鏈的異源二聚組裝。然後，透過差異化Protein A結合設計純化策略，結合順序親和色譜，分子量差異的色譜純化策略，來分離所需的最終產物。避免輕重鏈錯配策略，通常分開表達雙特異性分子作為半分子，或親本抗體，然後再將抗體半分子進行組裝，可以透過設計重鏈突變來實現重鏈的異源二聚體。然而，單個抗體各自的輕重鏈的選擇性配對仍然具有挑戰性。
本發明提供了改進結構設計的雙特異性抗體，防止或減弱不同特異性的重鏈和輕鏈的錯配。
一方面，本發明提供了雙特異性抗體，其包含第一抗原結合部分和第二抗原結合部分，所述第一抗原結合部分和第二抗原結合部分特異性結合兩種不同抗原或同一種抗原的不同表位，其中所述第一抗原結合部分包含： 第一多肽，所述第一多肽自N端至C端包含第一重鏈可變結構域以及與所述第一重鏈可變結構域可操作連接的第一配對結構域，和 第二多肽，所述第二多肽自N端至C端包含第一輕鏈可變結構域以及與所述第一輕鏈可變結構域可操作連接的第二配對結構域， 其中，所述第一配對結構域和第二配對結構域中的一個配對結構域包含工程化的HLA-I α3的胺基酸序列，另一個配對結構域包含工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述第一配對結構域和第二配對結構域能夠形成二聚體，所述第一配對結構域和第二配對結構域之間能夠形成至少一個非天然鏈間鍵且所述非天然鏈間鍵能夠穩定所述二聚體。
在一些實施方案中，所述工程化的HLA-I α3的胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性，所述工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。
在一些具體的實施方案中，所述工程化的HLA-I α3包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，所述工程化的β2微球蛋白包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，所述工程化的HLA-I α3包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，所述工程化的β2微球蛋白包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述第二抗原結合部分包含第二重鏈可變結構域和第二輕鏈可變結構域。
在一些實施方案中，所述第二抗原結合部分包含Fab。所述Fab包含所述的第二重鏈可變結構域和第二輕鏈可變結構域。
在一些實施方案中，提供了雙特異性抗體，其包含第一抗原結合部分和第二抗原結合部分，所述第一抗原結合部分和第二抗原結合部分特異性結合兩種不同抗原或同一種抗原的不同表位，其中所述第一抗原結合部分包含： 第一多肽，所述第一多肽自N端至C端包含第一重鏈可變結構域以及與所述第一重鏈可變結構域可操作連接的第一配對結構域，和 第二多肽，所述第二多肽自N端至C端包含第一輕鏈可變結構域以及與所述第一輕鏈可變結構域可操作連接的第二配對結構域， 其中，所述第一配對結構域和第二配對結構域中的一個配對結構域包含工程化的HLA-I α3的胺基酸序列，另一個配對結構域包含工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列；所述工程化的HLA-I α3的胺基酸序列、工程化的β2微球蛋白分別與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性；所述第二抗原結合部分包含Fab。在一些這種實施方案中，根據EU編號，所述Fab的CL結構域在F118位置的胺基酸被丙胺酸取代。在一些實施方案中，所述工程化的HLA-I α3包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，所述工程化的β2微球蛋白包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的胺基酸序列。
在一些實施方案中，提供了雙特異性抗體，其包含第一抗原結合部分和第二抗原結合部分，所述第一抗原結合部分和第二抗原結合部分特異性結合兩種不同抗原或同一種抗原的不同表位，其中所述第一抗原結合部分包含： 第一多肽，所述第一多肽自N端至C端包含第一重鏈可變結構域以及與所述第一重鏈可變結構域可操作連接的第一配對結構域，和 第二多肽，所述第二多肽自N端至C端包含第一輕鏈可變結構域以及與所述第一輕鏈可變結構域可操作連接的第二配對結構域， 其中，所述第一配對結構域和第二配對結構域中的一個配對結構域包含工程化的HLA-I α3的胺基酸序列，另一個配對結構域包含工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列；所述第二抗原結合部分包含Fab，根據EU編號，所述Fab的CL結構域在F118位置的胺基酸被丙胺酸取代。在一些這種實施方案中，所述工程化的HLA-I α3的胺基酸序列、工程化的β2微球蛋白分別與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。進一步的，在一些實施方案中，所述工程化的HLA-I α3包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，所述工程化的β2微球蛋白包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的胺基酸序列。
在一些上述實施方案中，所述第一配對結構域包含工程化的HLA-Iα3的胺基酸序列，所述第二配對結構域包含工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列。
在一些上述實施方案中，所述第一配對結構域包含工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列，所述第二配對結構域包含工程化的HLA-Iα3的胺基酸序列。
在一些上述實施方案中，所述雙特異性抗體包含Fc。
一方面，本發明提供了分離的多核苷酸，其編碼本發明所述的雙特異性抗體。
一方面，本發明提供了分離的載體，其包含本發明所述的多核苷酸。
一方面，本發明提供了宿主細胞，其包含本發明所述的分離的多核苷酸，或分離的載體。
另一方面，本發明提供了表達所述的雙特異性抗體的方法，所述方法包括在所述雙特異性抗體被表達的條件下培養所述的宿主細胞。
另一方面，本發明提供了藥物組合物，其包含本發明所述的雙特異性抗體以及藥學上可接受的載體。
另一方面，本發明提供了綴合物，其包含本發明所述的雙特異性抗體以及與所述雙特異性抗體連接或綴合的治療劑。
另一方面，本發明提供了融合蛋白，其包含融合表達的融合組分以及所述的雙特異性抗體。
又一方面，本發明提供了在有需要的受試者中治療疾病的方法，包括向受試者施用治療有效量的本發明所述的雙特異性抗體、藥物組合物、綴合物或融合蛋白。
本發明雙特異性抗體中，第一抗原結合部分中的配對結構域利用工程化的HLA-I α3和工程化的β2微球蛋白可以改善鏈的錯配，如相比於第一和第二抗原結合部分均為天然Fab的對應部分的情況，所述第一抗原結合部分和所述第二抗原結合部分更不容易發生錯配，從而提高目標抗體的產率、純度。
特別的，設計的雙特異性抗體對抗原保持良好的親和力或/和熱穩定性。某些方面，設計的雙特異性抗體降低了免疫原性風險。
術語
術語“抗體”在本文中以最廣泛的含義使用，指的是包含抗原結合位點的蛋白，涵蓋各種結構的天然抗體和人工抗體，包括但不限於單克隆抗體、單特異性抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體、三特異性抗體等)、單鏈抗體等。
術語“多特異性”意指抗體能夠特異性結合至少兩種不同的抗原決定簇。通常，雙特異性抗體包含兩種抗原結合位點，其中每種特異於不同的抗原性決定簇。不同的抗原決定簇可以在相同或不同的細胞上表達。不同的抗原決定簇可以因抗原種類不同而不同（例如結合抗原PDL1和CD47），也可以存在同一種抗原上。抗原決定簇是抗原物質分子表面或其他部位，具有一定組成和結構的特殊化學基團，能與其相應抗體或致敏淋巴細胞發生特異性結合的結構。抗原決定簇一個例子是，抗原決定簇CD47作為一種抗原物質，其具有多種結構已確定或結構未確定的抗原決定簇。一個具體的雙特異性抗體例如可以結合PDL1和CD47。
術語“特異性結合”意為結合對於抗原而言是選擇性的並且可以與不需要或非特異性的相互作用區別開。
術語“…價”抗體指抗體中存在的抗原結合位元點的數目。“二價”抗體指抗體存在兩個抗原結合位點，“三價”指抗體存在三個抗原結合位點。天然的人免疫球蛋白分子通常具有兩個抗原結合位點，Fab通常具有單個抗原結合位點。單可變結構域、ScFv通常具有單個抗原結合位點。
術語“抗原結合部分”指特異性結合抗原決定簇的多肽分子。具體的抗原結合部分可以是Fab、ScFv或單可變結構域等。本文中的抗原決定簇與抗原表位同義。
本發明中關於抗原結合部分、抗原、重鏈可變結構域、輕鏈可變結構域、Fc多肽等所用的術語“第一”、“第二”或“第三”是為了在存在一個以上各類型的部分時方便區分而使用。除非明確說明，這些術語的使用並非旨在賦予雙特異性抗體的具體順序或取向。
術語“可操作連接”或“可操作性的連接”是指兩個或更多個目標生物學序列的以使其處於使其以目的方式作用的關係的方式並列，無論是否存在間隔子或接頭。當用於多肽時，該術語旨在表示多肽序列以使所連接的產物具有目的生物學功能的方式連接。例如，可將抗體可變區可操作地連接至恆定區，以形成具有抗原結合活性的穩定產物。所述術語還可用於多核苷酸。舉例來說，當編碼多肽的多核苷酸可操作地連接至調控序列(例如啟動子、增強子、沉默子序列等)時，該術語旨在表示所述多核苷酸序列以允許所述多肽受所述多核苷酸的調控表達的方式連接。
主要組織相容性複合體（major histocompatibility complex，MHC）是一組編碼動物主要組織相容性抗原的基因群的統稱。小鼠的MHC稱為H-2基因複合體，人類的MHC被稱為HLA（human leukocyte antigen，HLA）基因複合體，其編碼產物稱為HLA分子、HLA抗原或人白細胞抗原。HLA基因複合體位於人類6號染色體的短臂6p21.3處，同時含有220多個不同功能的基因。這些基因多數會編碼免疫系統中的蛋白質。MHC-I類分子表達於幾乎所有有核細胞表面，被CD8+T細胞識別。MHC-II類分子表達於抗原遞呈細胞表面，被CD4+T細胞識別。MHC具有多態性，大部分人群主要包括6種經典的MHC分子：3種經典的MHC-I類分子（HLA-A、HLA-B、HLA-C）和3種經典的MHC-II類分子（HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ）。人的MHC-I類分子（HLA-1）由重鏈（α鏈）和β 2微球蛋白（β 2m，或者β鏈）組成，其中α鏈胞外段有三個結構域（α1、α2、和α3），遠膜端的2個結構域α1和α2構成抗原結合槽，結構域α3與人免疫球蛋白恆定區同源。
術語“可變結構域”或“可變區”是指抗體的涉及該抗體與抗原結合的結構域。例如天然四鏈抗體(例如來源於人、鼠等)具有重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，來源於駱駝科或鯊魚等動物的僅重鏈抗體具有單可變結構域。天然抗體的每個可變結構域基本上由四個“框架區”和三個“互補決定區”組成。四個框架區分別稱為框架區1(或FR1)、框架區2(或FR2)、框架區3(或FR3)、及框架區4(或FR4)；所述框架區由本領域及下文中分別稱為互補決定區1(或CDR1)、互補決定區2(或CDR2)、及互補決定區3(或CDR3)的三個互補決定區(或CDR)間隔開。因此，可變結構域的一般結構可如下表示為：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。可變結構域因具有抗原結合位點而賦予抗體對抗原的特異性。
“CDR”(互補決定區)，也稱為“高變區(HVR)”。天然四鏈抗體通常包含六個 CDR，三個在重鏈可變區中(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，三個在輕鏈可變區中(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。僅重鏈抗體或單可變結構域通常具有三個CDR(CDR1、CDR2和CDR3)。
當前有許多方法來劃分定義CDR。其中，Kabat定義基於序列可變性劃分CDR，並且是最常用的(Elvin A.Kabat, et al，Sequences of Proteins of Immunological Interest , 第5版, Public Health Service , National Institutes of Health , Bethesda , Md .(1991))；而Chothia定義則基於結構環的位置(Cyrus Chothia, et al, Canonical Structures for the Hypervariable Regions of Immunoglobulins, J .Mol .Biol .196:901-917(1987))。AbM 定義是Kabat定義和Chothia定義之間的折衷方案，並且被Oxford Molecular的AbM抗體建模軟體使用。“接觸(contact)”定義CDR的基礎是對可用的複合物晶體結構的分析。然而，應當注意的是，基於不同的方法定義獲得的同一抗體可變區的CDR的邊界可能有所差異，即不同方法定義的同一抗體可變區的CDR序列可能有所不同。因此，在涉及用本發明定義的具體CDR序列限定抗體時，所述抗體的範圍還涵蓋了轉換為其他任意定義(例如Chothia、AbM定義等)的CDR序列限定的抗體。
術語“框架區”或“FR”是除了本文定義的CDR殘基之外的那些可變結構域的胺基酸殘基。
術語“Fab”指由免疫球蛋白的重鏈的VH和CH1以及輕鏈的VL和CL域組成的蛋白。本文中Fab意指處於它的天然型式的或經修飾的Fab，其包含由重鏈可變區和恆定區CH1構成的Fab重鏈(VH-CH1，N至C端方向)，和由輕鏈可變區和恆定區CL構成的Fab輕鏈(VL-CL，N至C端方向)；經修飾的Fab例如可以是在CH1/CL結構域或/和VH/VL結構域引入胺基酸取代的Fab，一個具體的實例，經修飾的Fab可以是在CL結構域引入胺基酸取代的Fab。
術語“Fc結構域”、“Fc”或“Fc域”在本文中用來定義免疫球蛋白重鏈的C端區域，其包含至少部分恆定區。該術語包括天然序列Fc和變體Fc。Fc的C末端賴胺酸(Lys447)可存在或不存在。除非另有說明，Fc中胺基酸殘基的編號是根據EU編號系統，也稱為EU索引，描述於Kabat，E.A等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版， Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD (1991) ,NIH Publication 91-3242。第一配對結構域和第二配對結構域涉及胺基酸位置的描述時，是指按照相應序列的起始胺基酸為第一位進行順序編號，例如SEQ ID NO：1中的R60C取代是指以SEQ ID NO：1中第一個胺基酸為位置1開始進行順序編號，該序列中的第60位R取代為C。本文所用的Fc域的其中一個“Fc多肽”指形成二聚體Fc結構域的兩條多肽之一。例如，IgG Fc域的Fc多肽包含IgG CH2和IgG CH3恆定區。
術語“KD”在用於本文時指平衡解離常數，以摩爾濃度(M)表示。抗體的KD值可以使用本領域公知的方法測定。一種測定抗體KD的方法是使用表面等離子共振(surface plasmon resonance)，如使用生物感測器系統，例如Biacore系統。一種測定抗體KD的方法是使用生物膜層光學干涉（BLI, Bio-Layer Interferometry），例如ForteBio系統。
術語“治療”指試圖改變治療個體中疾病的自然進程，並且可以是為了預防或在臨床病理學的過程期間實施的臨床干預。治療的期望效果包括但不限於預防疾病的發生或復發，緩解症狀，降低疾病的任何直接或間接病理學後果，預防轉移，減緩疾病進展率，改善或減輕疾病狀態，及消退或改善的預後。
術語“受試者”包括任何人類或非人動物。術語“非人動物”包括所有的脊椎動物，例如哺乳動物和非哺乳動物，諸如非人靈長類、綿羊、犬、貓、馬、牛、雞、兩棲動物、爬行動物等。優選地，根據本發明的受試者是人。除非標明，術語“患者”或“受試者”可以互換使用。
術語“分離的”是指已經從其天然環境中分離的目標化合物(例如，VHH、多特異性抗體、抗體或核酸)。
胺基酸序列的“同一性百分數(%)"是指將待比對序列與本文中所示的具體胺基酸序列進行比對並且如有必要的話為達到最大序列同一性百分數而引入空位後，並且不考慮任何保守置換作為序列同一性的一部分時，待比對序列中與本文中所示的具體胺基酸序列的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基百分數。同一性的胺基酸序列比對可以採用本領域範圍內的多種方式進行，例如BLAST，BLAST-2，ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。所屬技術領域中具有通常知識者可決定用於比對序列的適宜參數，包括在比較序列的全長裡獲得最大比對需要的任何演算法。
本發明上下文中，胺基酸取代表示為：原胺基酸-位置-取代的胺基酸，使用三字母碼或單字母碼，包括編碼Xaa和X來表示胺基酸殘基。因此，例如“H435R”意為將位置435處的胺基酸H取代為胺基酸R；對於取代的胺基酸可以包含多於1個，例如T366Y/W意為將位置366處的胺基酸T取代為胺基酸Y或W。
術語“包括”、“含有”或“包含”及其變體應理解為 “包括但不限於”，意味著除所列出的要素、組分和步驟外，還可涵蓋其它未指明的要素、組分和步驟。
在本文中，除非上下文另有明確規定，否則單數術語涵蓋複數指代物，反之亦然。
為了描述和公開的目的，以引用的方式將所有的專利、專利申請和其它已確定的出版物在此明確地併入本文。這些出版物僅因為它們的公開早於本申請的申請日而提供。所有關於這些檔的日期的聲明或這些檔的內容的表述是基於申請者可得的資訊，並且不構成任何關於這些檔的日期或這些檔的內容的正確性的承認。而且，在任何國家，在本文中對這些出版物的任何引用並不構成關於該出版物成為本領域的公知常識的一部分的認可。本發明的各個方面將在下述部分中進一步詳細描述。
本發明的各個方面將在下述分部中進一步詳細描述。
雙特異性抗體
本發明將其中一個抗原結合部分的恆定區進行改造，構建的雙特異性抗體能夠防止或減弱不同特異性的重鏈和輕鏈的錯配，從而提高目標抗體的產率或/和純度。具體的，對人MHC-I分子α3結構域和β2微球蛋白工程化改造，構建第一配對結構域和第二配對結構域以替換抗體的CH1和CL結構域，改善鏈的錯配，例如相比於第一和第二抗原結合部分均為天然Fab的對應部分的情況，所述第一抗原結合部分和所述第二抗原結合部分更不容易發生錯配。
目前生物藥的免疫原性的來源主要分為：內源和外源。內源免疫原性來自非人源的胺基酸序列、非人源的結構形式以及一系列的化學修飾（點突變，結構域融合，糖型改造等）。外源免疫原性主要來源於生產工藝、藥品運輸、患者的遺傳背景、用藥劑量、用藥頻率和方式等相關。隨著生物藥種類和數量的逐漸增多，及其廣泛的應用，與免疫原性相關的問題也逐步引起人們的高度關注。MHC（主要組織相容性複合物）是免疫系統識別的基礎，參與機體的適應性免疫過程。基於MHC分子組成設計雙特異性抗體跟人體免疫環境具有良好的相容性。相對於MHC-II類分子，MHC-I類分子分佈更為廣泛，表達於幾乎所有有核細胞表面，被CD8+T細胞識別。在HLA-I分子中，HLA-I-B類的人的MHC-I的分子的數量最多，因此選用基於HLA-I-B類的人的MHC-I分子的恆定區構建雙特異性抗體的結構元件，可以降低免疫原性風險。
此外，基於HLA-I-B類的人的MHC-I分子的恆定區不含有N-連接和O-連接的糖基化位點，具有良好的可開發性和低免疫原性。
實驗發現，改造構建的雙特異性抗體仍具有良好的抗原結合性能。
本發明提供的雙特異性抗體，其包含第一抗原結合部分和第二抗原結合部分，所述第一抗原結合部分和第二抗原結合部分特異性結合兩種不同抗原或同一種抗原的不同表位，其中所述第一抗原結合部分包含： 第一多肽，所述第一多肽自N端至C端包含第一重鏈可變結構域以及與所述第一重鏈可變結構域可操作連接的第一配對結構域，和 第二多肽，所述第二多肽自N端至C端包含第一輕鏈可變結構域以及與所述第一輕鏈可變結構域可操作連接的第二配對結構域， 其中，所述第一配對結構域和第二配對結構域中的一個配對結構域包含工程化的HLA-I α3的胺基酸序列，另一個配對結構域包含工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述第一配對結構域和第二配對結構域能夠形成二聚體，所述第一配對結構域和第二配對結構域之間能夠形成至少一個非天然鏈間鍵且所述非天然鏈間鍵能夠穩定所述二聚體。
第一配對結構域和第二配對結構域能夠形成二聚體，其在第一抗原結合部分的不同位置取向（如與輕鏈可變區或重鏈可變區連接）均對抗原有良好的結合親和力。
其中一種實施方案，所述第一配對結構域包含工程化的HLA-Iα3的胺基酸序列，所述第二配對結構域包含工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列。
另一種實施方案，所述第一配對結構域包含工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列，所述第二配對結構域包含工程化的HLA-Iα3的胺基酸序列。
非天然鏈間鍵能夠穩定第一配對結構域和第二配對結構域形成的二聚體，形成所述非天然鏈間鍵的胺基酸殘基處於第一配對結構域和第二配對結構域的接觸介面，以有效形成鍵。術語“接觸介面”是指在所述多肽上所述多肽彼此相互作用/締合的特定區域。接觸介面包含一個或多個胺基酸殘基，其能夠在相互作用發生時與接觸或締合的對應的胺基酸殘基相互作用。接觸介面中的胺基酸殘基可處於或可不處於連續的序列中。例如，當所述介面是三維的，所述介面內的胺基酸殘基可以分開位於線性序列上的不同位置。
所述非天然鏈間鍵的數量為1-3個，例如可以為1個、2個或3個，為盡可能與天然抗體相似，非天然鏈間鍵的數量優選為1個。一種實施方案，所述非天然鏈間鍵為二硫鍵。
在一些實施方案中，所述工程化的HLA-I α3的胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性，所述工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。在一些實施方案中，所述工程化的HLA-I α3的胺基酸序列、工程化的β2微球蛋白分別與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。
SEQ ID NO：1所示序列源於多個HLA-I-B類分子的恆定區序列比對生成的一致性序列，利用其或對其改造形成配對結構域具有良好的通用性。
在一些實施方案中，所述工程化的HLA-I α3 包含在SEQ ID NO：1具有胺基酸取代的胺基酸序列，所述工程化的β2微球蛋白包含在SEQ ID NO：2具有胺基酸取代的胺基酸序列。
工程化的HLA-I α3、工程化的β2微球蛋白中的所述胺基酸取代包含形成非天然鏈間鍵（例如二硫鍵）的胺基酸取代或/和提高配對結構域形成的二聚體或雙特異性抗體的胺基酸取代。
在一些實施方案中，所述工程化的HLA-I α3和工程化的β2微球蛋白中的所述胺基酸取代均包含發生在兩者接觸介面且能夠彼此形成二硫鍵的半胱胺酸殘基取代。在一個具體的實施方案中，所述半胱胺酸殘基取代為SEQ ID NO：1中的R60C和SEQ ID NO：2中的Y26C；一個具體的實施方案，所述半胱胺酸殘基取代為SEQ ID NO：1中的A62C和SEQ ID NO：2中的R12C；一個具體的實施方案，所述半胱胺酸殘基取代為SEQ ID NO：1中的G63C和SEQ ID NO：2的Y67C；另一些具體的實施方案，所述半胱胺酸殘基取代可以選自上述R60C/Y26C、A62C/R12C、G63C/Y67C中的兩對或三對。
在一些實施方案中，所述工程化的HLA-I α3或/和工程化的β2微球蛋白中的胺基酸取代包含提高配對結構域形成的二聚體或雙特異性抗體的等電點的胺基酸取代。這些胺基酸取代可以同時發生在兩個配對結構域，或者其中任意一個配對結構域。一般提高配對結構域形成的二聚體或雙特異性抗體的等電點至6.5-9.0，以利於生產工藝開發，改善成藥性。在一些實施方案中，提高配對結構域形成的二聚體或雙特異性抗體的等電點至6.5-8.5、7.0-8.5、7.0-9.0、7.0-7.8、7.0-8.0、7.5-7.8或7.5-8.0。一些具體的實施方案，提高配對結構域形成的二聚體或雙特異性抗體的等電點至6.5、6.7、6.9、7.1、7.3、7.5、7.7、7.8、7.9、8.0、8.2、8.3、8.5、8.7或9.0。等電點可以透過實驗測定或理論計算, 一種理論等電點的計算例如可以使用線上計算分析工具Expasy-Compute pI/Mw tool (http://web.expasy.org/compute_pi/)。
在一些實施方案中，提高等電點的胺基酸取代包含：工程化的HLA-I α3在SEQ ID NO：1序列的E3、D22、E48、D53、E90、E101中的一個或幾個位置被正電胺基酸取代。
在一些實施方案中，提高等電點的胺基酸取代包含：工程化的β2微球蛋白中在SEQ ID NO：2序列的E74、E47、E69、D34、E16、D53、E44、E50、E36中的一個或幾個位置被正電胺基酸取代。
在一些具體的實施方案中，提高等電點的胺基酸取代包含：所述工程化的HLA-I α3在SEQ ID NO：1序列的D22、E48和D53位置被正電胺基酸取代，並且所述工程化的β2微球蛋白在SEQ ID NO：2序列的E69位置被正電胺基酸取代。
在一些實施方案中，所述的正電胺基酸為K或R。
一個更具體的實施方案，提高等電點的胺基酸取代包含：所述工程化的HLA-I α3在SEQ ID NO：1序列包含胺基酸取代D22R、E48K和D53K，並且所述工程化的β2微球蛋白在SEQ ID NO：2序列包含胺基酸取代E69R。
在一些更具體的實施方案中，所述胺基酸取代包含：所述工程化的HLA-I α3在SEQ ID NO：1序列包含胺基酸取代A62C、D22R、E48K和D53K，並且所述工程化的β2微球蛋白在SEQ ID NO：2序列包含胺基酸取代R12C、E69R。進一步的方案，所述工程化的β2微球蛋白包含在SEQ ID NO：2序列的羧基端添加的“GP”。
一個具體的實例，所述工程化的HLA-I α3包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，所述工程化的β2微球蛋白包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列。
另一個具體的實例，所述工程化的HLA-I α3包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，所述工程化的β2微球蛋白包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列。
在一些實施方案中，所述第二抗原結合部分包含第二重鏈可變結構域和第二輕鏈可變結構域。所述第二抗原結合部分不包含本發明所述的第一配對結構域和第二配對結構域。一個具體的實施方案，所述第二抗原結合部分包含Fab。所述第一抗原結合部分和第二抗原結合部分特異性結合兩種不同抗原或同一種抗原的不同表位，在一些實施方案中，所述第一抗原結合部分和第二抗原結合部分均單價結合各自的抗原。
在一些實施方案中，根據EU編號，所述Fab的CL結構域在T/S114、T/F116、F118位置中的一個或多個被疏水胺基酸取代，在一些實施方案中，所述的疏水胺基酸選自非芳香族例如甲硫胺酸、丙胺酸、纈胺酸、異亮胺酸或亮胺酸。在第二抗原結合部分的Fab的CL結構域引入適宜的胺基酸取代，可以進一步降低輕重鏈的錯配。一個具體的實例，根據EU編號，所述Fab的CL結構域在F118位置的胺基酸被丙胺酸（A）取代。在另一些實施方案中，所述Fab的CL結構域在根據EU編號的F118位置被丙胺酸取代，且所述CL結構域還包含其他的取代，例如是進一步降低CL與包含工程化的HLA-Iα3的配對結構域的錯配的取代。
在一些實施方案中，所述CL結構域可以源自人κ輕鏈CL結構域或人λ輕鏈CL結構域。一個具體的實例，含F118A的CL結構域包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列。一個具體的實例，含F118A的CL結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：44所示。
在一些實施方案中，所述Fab的CH1結構域可以是人IgG（IgG1-4）、IgM、IgA、IgD或IgE的CH1結構域，一個具體的實例，所述Fab的CH1結構域為人IgG1的CH1結構域。一個具體的實例，CH1的結構域包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。一個具體的實例，CH1的結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：34所示。一個具體的實例，所述Fab的CH1結構域為人IgG4的CH1結構域。
SEQ ID NO：34所示胺基酸序列如下： ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV
SEQ ID NO：35所示胺基酸序列如下： RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：44所示胺基酸序列如下： RTVAAPSVFIAPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
在一些具體的實施方案中，所述Fab的CL結構域在F118位置的胺基酸被丙胺酸取代，所述Fab的CH1結構域在128位置（EU編號）、141位置（EU編號）、185位置（EU編號）、11位置（IMGT編號）、28位置（IMGT編號）、或139位置（Kabat編號）不含胺基酸取代。在另一些實施方案中，所述Fab的CL結構域在根據EU編號的F118位置被丙胺酸取代，且所述CL結構域還包含其他的取代（例如是進一步降低CL與包含工程化的HLA-Iα3的配對結構域的錯配的取代），所述Fab的CH1結構域在128位置（EU編號）、141位置（EU編號）、185位置（EU編號）、11位置（IMGT編號）、28位置（IMGT編號）、或139位置（Kabat編號）不含胺基酸取代。
在一些具體的實施方案中，所述Fab的CL結構域在F118位置的胺基酸被丙胺酸取代，所述Fab的CH1結構域不含胺基酸取代L128F（EU編號）、A141L位置（EU編號）、V185A/L（EU編號）、L11K/F/W（IMGT編號）、L28N/R（IMGT編號）、或A139W/V/I（Kabat編號）。在另一些實施方案中，所述Fab的CL結構域在根據EU編號的F118位置被丙胺酸取代，且所述CL結構域還包含其他的取代（例如是進一步降低CL與包含工程化的HLA-Iα3的配對結構域的錯配的取代），所述Fab的CH1結構域不含胺基酸取代L128F（EU編號）、A141L位置（EU編號）、V185A/L（EU編號）、L11K/F/W（IMGT編號）、L28N/R（IMGT編號）、或A139W/V/I（Kabat編號）。
在一些具體的實施方案中，所述Fab的CL結構域在F118位置的胺基酸被丙胺酸取代，所述Fab的CH1結構域採用野生型免疫球蛋白的CH1結構域，例如採用人IgG的CH1結構域。在另一些實施方案中，所述Fab的CL結構域在根據EU編號的F118位置被丙胺酸取代，且所述CL結構域還包含其他的取代（例如是進一步降低CL與包含工程化的HLA-Iα3的配對結構域的錯配的取代），所述Fab的CH1結構域採用野生型免疫球蛋白的CH1結構域，例如採用人IgG（IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）的CH1結構域。
在一些具體的實施方案中，所述Fab的CL結構域包含與SEQ ID NO：44所示序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性的胺基酸序列，所述Fab的CH1結構域包含與SEQ ID NO：34所示序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性的胺基酸序列。進一步的，在該實施方案中，所述Fab的CL結構域包含F118A。進一步的，在該實施方案中，所述Fab的CH1結構域為野生型免疫球蛋白的CH1結構域，或者所述Fab的CH1結構域在128位置（EU編號）、141位置（EU編號）、185位置（EU編號）、11位置（IMGT編號）、28位置（IMGT編號）、或139位置（Kabat編號）不含胺基酸取代。
在一些具體的實施方案中，所述Fab的CL結構域包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列，所述Fab的CH1結構域包含SEQ ID NO：34所示的胺基酸序列。
在一些具體的實施方案中，所述Fab的CL結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：44所示，所述Fab的CH1結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：34所示。
在一些實施方案中，所述第一抗原結合部分和第二抗原結合部分中的一個結合T細胞特異性受體分子和/或天然殺傷細胞特異性受體分子，以及另一個抗原結合部分結合腫瘤相關抗原。
T細胞特異性受體分子允許T細胞結合並且如果存在另外的訊號，則由另一種被稱為抗原呈遞細胞或APC的細胞所呈遞的表位/抗原啟動並對其回應。T細胞特異性受體分子可以是TCR、CD3、CD28、CD134(也稱為OX40)、4-1BB、CD5或CD95(也稱為Fas受體)。
NK細胞特異性受體分子的實例包括CD16、低親和力Fc受體和NKG2D，以及CD2。
術語“腫瘤相關抗原”是指呈現於腫瘤細胞表面上或可以呈現於腫瘤細胞表面上並且位於腫瘤細胞上或腫瘤細胞內的抗原。在一些實施方式中，腫瘤相關抗原可以僅由腫瘤細胞呈遞，而不是由正常的即非腫瘤細胞呈遞。在一些其他實施方式中，腫瘤相關抗原可以僅在腫瘤細胞上表達，或者可以代表相較於非腫瘤細胞的腫瘤特異性突變。在一些其他實施方式中，腫瘤相關抗原可以在腫瘤細胞和非腫瘤細胞中發現，但是與非腫瘤細胞相比在腫瘤細胞上過表達，或者由於與非腫瘤組織相比腫瘤組織的不太緊密的結構而可以在腫瘤細胞中結合抗體。在一些實施方式中，腫瘤相關抗原位於腫瘤的脈管系統上。一些示例性的腫瘤相關抗原為CD38、CD47、PD-L1、PD-1等。
在一些實施方案中，所述第一抗原結合部分和第二抗原結合部分中的一個特異性結合CD3，以及另一個特異性結合腫瘤相關抗原。例如第一抗原結合部分特異性結合CD3，第二抗原結合部分特異性結合腫瘤相關抗原；或者，第二抗原結合部分特異性結合CD3，第一抗原結合部分特異性結合腫瘤相關抗原。一些具體的實例，第一抗原結合部分特異性結合CD3，第二抗原結合部分特異性結合CD38；或者所述第一抗原結合部分特異性結合CD38，第二抗原結合部分特異性結合CD3。
在一些實施方案中，所述第一抗原結合部分和第二抗原結合部分均特異性結合腫瘤相關抗原。一些具體的實例，所述第一抗原結合部分特異性結合PD-L1，第二抗原結合部分特異性結合CD47；或者所述第一抗原結合部分特異性結合CD47，第二抗原結合部分特異性結合PD-L1。
在一些實施方案中，所述的雙特異性抗體，其進一步包含能夠穩定締合的兩個Fc多肽構成的Fc域。在一些實施方案中，雙特異性抗體是二價的。
在一些實施方案中，所述第一抗原結合部分在其C端與其中一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第二抗原結合部分在其C端與另一個Fc多肽的N端可操作性的連接。在一些更具體的實施方案中，所述第一抗原結合部分的第一多肽在其C端與其中一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第二抗原結合部分包含Fab，其Fab重鏈在其C端與另一個Fc多肽的N端可操作性的連接。在一些更具體的實施方案中，所述第一抗原結合部分的第一多肽在其C端與其中一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第二抗原結合部分包含Fab，其Fab輕鏈在其C端與另一個Fc多肽的N端可操作性的連接。
在一些實施方案中，所述的雙特異性抗體，其還包含第三抗原結合部分。一些具體的實施方案，所述的雙特異性抗體對抗原的結合是三價的。
在一些實施方案中，所述第三抗原結合部分與第二抗原結合部分結合相同的抗原表位；優選的，所述第三抗原結合部分與第二抗原結合部分相同。在另一些實施方案中，所述第三抗原結合部分與第一抗原結合部分結合相同的抗原表位；優選的，所述第三抗原結合部分與第一抗原結合部分相同。
在一些實施方案中，所述第三抗原結合部分與第一抗原結合部分的N端或C端可操作性的連接。
在另一些實施方案中，所述第三抗原結合部分與第二抗原結合部分的N端或C端可操作性的連接。
在一些實施方案中，所述的雙特異性抗體包含第三抗原結合部分，還進一步包含能夠穩定締合的兩個Fc多肽構成的Fc域。
在一些具體的實施方案中，所述第一抗原結合部分在其C端與其中一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第二抗原結合部分在其C端與另一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第三抗原結合部分在其C端與第一抗原結合部分的N端或第二抗原結合部分的N端可操作性的連接。
在另一些具體的實施方案中，所述第三抗原結合部分在其C端與其中一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第一抗原結合部分在其C端與所述第三抗原結合部分的N端可操作性的連接，第二抗原結合部分在其C端與另一個Fc多肽的N端可操作性的連接。
在另一些具體的實施方案中，所述第三抗原結合部分在其C端與其中一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第二抗原結合部分在其C端與所述第三抗原結合部分的N端可操作性的連接，第一抗原結合部分在其C端與另一個Fc多肽的N端可操作性的連接。
上述第三抗原結合部分與第一抗原結合部分可操作性的連接時，可以為透過肽接頭連接。
上述第三抗原結合部分與第二抗原結合部分可操作性的連接時，可為透過肽接頭連接。肽接頭可以採用任何適宜的，例如可以使用帶電的和/或柔性的接頭多肽。在具體的實施方案中，肽接頭由透過肽鍵連接的1到50個胺基酸組成，其中所述胺基酸可以選自20個天然存在的胺基酸；在更優選的實施方案中，1到50個胺基酸選自甘胺酸、丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、天門冬醯胺、麩醯胺酸和賴胺酸。因此，示例性的肽接頭可以是聚甘胺酸(尤其是(Gly)4、(Gly)5)、聚(Gly-Ser)、(Gly)3AsnGlySer(Gly)2、(Gly)3Cys(Gly)4、GlyProAsnGlyGly，或者專利申請WO2019195535的表4所公開的那些，等等。在一些實施方案中，所述肽接頭可以是由甘胺酸和絲胺酸組成的肽接頭。在一些實施方案中，所述肽接頭包含的胺基酸數目可以是0個、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、或20個以上。
當抗原結合部分與Fc域或Fc多肽可操作性的連接時，典型的是透過鉸鏈區連接。鉸鏈例如包含人IgG的鉸鏈區的胺基酸。
Fc 域
雙特異性抗體的Fc域由一對包含免疫球蛋白分子重鏈結構域的多肽鏈組成。例如，免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚體，其每個Fc多肽包含CH2和CH3 IgG重鏈恆定區。Fc域的兩個Fc多肽能夠彼此穩定締合。例如兩個Fc多肽透過連接子、二硫鍵、氫鍵、靜電相互作用、鹽橋、疏水-親水相互作用中的一種或幾種穩定締合。在一個實施方案中，本發明的雙特異性抗體包含一個Fc域。
在一個實施方案中，雙特異性抗體的Fc域是IgG Fc域。在一個具體的實施方案中，Fc域是IgG1 Fc域。在另一個實施方案中，Fc域是IgG4Fc域。在一個更具體的實施方案中，Fc域是包含位置S228處的胺基酸替代，特別是胺基酸替代S228P的IgG4 Fc域，此胺基酸替代降低IgG4抗體的體內Fab臂交換。在又一個具體的實施方案中，Fc域是人Fc域。在一個更具體的實施方案中，Fc域是人IgG1Fc域。
在一些實施方案中，所述Fc域包含修飾，例如胺基酸取代。所述修飾例如可以是促進異二聚化的修飾、改變效應子功能的修飾、改變與A蛋白結合能力的修飾等。
在一些實施方案中，所述Fc域包含促進異二聚化的修飾。
本發明的雙特異性抗體包含與Fc域中的兩個Fc多肽中的一個或另一個融合的不同抗原結合部分，因此，兩個Fc多肽通常包含在兩條不同的多肽鏈中。這些多肽的重組共表達和隨後的二聚化產生兩種多肽的幾種可能的組合。為了提高重組產生中多特異性抗體的產率和純度，在該雙特異性抗體的Fc域中引入促進希望的多肽結合的修飾將是有利的。因此，在具體實施方案中，所述Fc域包含促進所述Fc域的兩個Fc多肽相締合的胺基酸取代。
人IgG Fc域的兩條Fc多肽之間最廣泛的蛋白質-蛋白質相互作用的部位在Fc域的CH3結構域中。因此，在一個實施方案中，該修飾在Fc域的CH3結構域中。
在具體實施方案中，該修飾是所謂的“杵臼(knob-into-hole)”修飾，其包含Fc域的兩個Fc多肽之一中的“杵”修飾和Fc域的兩個Fc多肽的另一個中的“臼”修飾。通常，該方法涉及在一條Fc多肽的介面引入凸起(“杵”)，而在另一條Fc多肽的介面引入對應的凹陷(“臼”)，使得該凸起可以定位在該凹陷中，以促進異二聚體形成和妨礙同二聚體形成。透過用更大的側鏈(例如酪胺酸或色胺酸等)取代來自一條Fc多肽的介面的小的胺基酸側鏈來構建凸起。透過用更小的胺基酸側鏈(例如丙胺酸或蘇胺酸等)取代大的胺基酸側鏈來在另一條Fc多肽的介面中產生具有與凸起相同或相似的大小的互補凹陷。
因此，在具體實施方案中，在該雙特異性抗體的一個Fc多肽的CH3結構域中，用具有更大側鏈體積的胺基酸殘基取代胺基酸殘基，從而在該Fc多肽的CH3結構域內產生可定位在另一個Fc多肽的CH3結構域內的凹陷中的凸起，在另一個Fc多肽的CH3結構域中，用具有更小側鏈體積的胺基酸殘基取代胺基酸殘基，從而在該Fc多肽的CH3結構域內產生凹陷。
在一些具體實施方案中，Fc域的一個Fc多肽包含T366Y/W或/和S354C，且另一個Fc多肽包含Y407T/V、Y349C、T366S或/和L368A。一個更具體的實例，所述Fc域的其中一個Fc多肽包含胺基酸取代T366Y/W和S354C，另一個Fc多肽包含胺基酸取代Y407T/V、Y349C、T366S和L368A。在更具體的實例中，Fc可以是人IgG1的Fc。
在一些實施方案中，所述Fc域包含減少或消除Fc域中的一個Fc多肽的CH3區與A蛋白(Protein A from Staphylococcus aureus)的結合的修飾。在一些實施方案中，該修飾為胺基酸取代。在一些實施方案中，所述Fc域包含胺基酸取代H435R或/和Y436F，該胺基酸取代僅發生在一個Fc多肽上，而不發生在另一個Fc多肽上。在一個具體的實施方案中，所述Fc域包含僅發生在其中一個Fc多肽的胺基酸取代H435R或/和Y436F。在一個這種具體的實施方案中，該Fc是IgG1Fc，尤其是人IgG1Fc。
組合物
本發明提供了藥物組合物，所述藥物組合物包含雙特異性抗體，並且還包含一種或多種藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體包括，例如，賦形劑、稀釋劑、包封材料、填充劑、緩衝劑或其他試劑。
分離的核酸
本發明提供了分離的多核苷酸，其編碼所述的雙特異性抗體。序列表中示例性的列舉了一些雙特異性抗體的多肽鏈的核酸序列。
載體
本發明提供了分離的載體，其包含所述的多核苷酸。在一些實施方案中，所述的載體為克隆載體；在另一些實施方案中，所述的載體為表達載體，一個具體的例子，表達載體為pcDNA3.1。所述表達載體可選的能夠表達本文所述多特異性抗體的任意表達載體。
宿主細胞
在一些實施方案中，本發明提供包含所述本發明載體或多核苷酸的宿主細胞，宿主細胞為用於克隆或編碼多特異性抗體的適當宿主細胞。在一些實施方案中，宿主細胞為原核細胞。在另一些實施方案中，宿主細胞為真核細胞。在一些實施方案中，宿主細胞選自酵母細胞、哺乳細胞或適用於製備多特異性抗體的其他細胞。哺乳細胞例如為中國倉鼠(CHO)卵巢細胞、CHO-S細胞。
表達雙特異性抗體的方法
本發明提供了表達本發明所述的雙特異性抗體的方法，所述方法包括在所述雙特異性抗體被表達的條件下培養所述的宿主細胞。
為了產生所述的雙特異性抗體，分離編碼所述雙特異性抗體的多核苷酸，並插入一個或多個載體，用於在宿主細胞中進一步克隆或/和表達。所述多核苷酸可以採用基因拼接、化學合成等多種本領域所熟知的方法獲取。
綴合物
本發明提供了一種綴合物，其包含本發明所述的雙特異性抗體以及與所述雙特異性抗體連接或綴合的治療劑。
融合蛋白
本發明提供了一種融合蛋白，其中融合組分與本發明所述的雙特異性抗體融合表達。可以透過基因工程手段實現融合蛋白分子的構建和表達。
用途
本發明提供了在有需要的受試者中治療疾病的方法，包括向受試者施用治療有效量的本發明所述的雙特異性抗體、藥物組合物、綴合物或融合蛋白。
所述疾病例可以是癌症，非限制性的，一些癌症的示例選自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宮內膜癌、結腸癌、直腸癌、腎癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、支氣管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝細胞癌、膽囊癌、膽管癌、食道癌、腎細胞癌、甲狀腺癌、頭頸癌、睾丸癌、內分泌腺癌、腎上腺癌、腦下垂體癌、皮膚癌、軟組織癌、血管癌、腦癌、神經癌、眼癌、腦膜癌、口咽癌、下嚥部癌、宮頸癌、子宮癌、成膠質細胞瘤、成神經管細胞瘤、星形細胞瘤、膠質瘤、腦膜瘤、胃泌素瘤、成神經細胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生異常綜合征以及肉瘤。
本發明還提供以下一些具體實施方式，但並不限於此：
實施方案1. 一種雙特異性抗體，其包含第一抗原結合部分和第二抗原結合部分，所述第一抗原結合部分和第二抗原結合部分特異性結合兩種不同抗原或同一種抗原的不同表位，其中所述第一抗原結合部分包含：
第一多肽，所述第一多肽自N端至C端包含第一重鏈可變結構域以及與所述第一重鏈可變結構域可操作連接的第一配對結構域，和
第二多肽，所述第二多肽自N端至C端包含第一輕鏈可變結構域以及與所述第一輕鏈可變結構域可操作連接的第二配對結構域，
其中，所述第一配對結構域和第二配對結構域中的一個配對結構域包含工程化的HLA-I α3的胺基酸序列，另一個配對結構域包含工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列。
實施方案2. 根據實施方案1所述的雙特異性抗體，其中所述第一配對結構域和第二配對結構域能夠形成二聚體，所述第一配對結構域和第二配對結構域之間能夠形成至少一個非天然鏈間鍵且所述非天然鏈間鍵能夠穩定所述二聚體。
實施方案3. 根據實施方案1或2所述的雙特異性抗體，其中所述第一配對結構域包含工程化的HLA-Iα3的胺基酸序列，所述第二配對結構域包含工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列。
實施方案4. 根據實施方案1或2所述的雙特異性抗體，其中所述第一配對結構域包含工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列，所述第二配對結構域包含工程化的HLA-Iα3的胺基酸序列。
實施方案5. 根據實施方案1-4中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述非天然鏈間鍵為1-3個，優選為1個。
實施方案6. 根據實施方案1-5中任一項所述的雙特異性抗體，其中形成所述非天然鏈間鍵的胺基酸殘基處於第一配對結構域和第二配對結構域的接觸介面。
實施方案7. 根據實施方案1-6中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述非天然鏈間鍵為二硫鍵。
實施方案8. 根據實施方案1-7中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述工程化的HLA-I α3的胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性，所述工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。
實施方案9. 根據實施方案1-8中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述工程化的HLA-I α3 包含在SEQ ID NO：1具有胺基酸取代的胺基酸序列，所述工程化的β2微球蛋白包含在SEQ ID NO：2具有胺基酸取代的胺基酸序列。
實施方案10. 根據實施方案9所述的雙特異性抗體，其中工程化的HLA-I α3和工程化的β2微球蛋白中的所述胺基酸取代均包含發生在兩者接觸介面且能夠彼此形成二硫鍵的半胱胺酸殘基取代。
實施方案11. 根據實施方案10所述的雙特異性抗體，其中所述半胱胺酸殘基取代選自下組中的一對至多對： （1）SEQ ID NO：1中的R60C和SEQ ID NO：2中的Y26C； （2）SEQ ID NO：1中的A62C和SEQ ID NO：2中的R12C； （3）SEQ ID NO：1中的G63C和SEQ ID NO：2中的Y67C。
實施方案12. 根據實施方案9-11中任一項所述的雙特異性抗體，其中工程化的HLA-I α3或/和工程化的β2微球蛋白中的胺基酸取代包含提高配對結構域形成的二聚體或雙特異性抗體的等電點的胺基酸取代。
實施方案13. 根據實施方案12所述的雙特異性抗體，其中提高配對結構域形成的二聚體或雙特異性抗體的等電點至6.5-9.0。
實施方案14. 根據實施方案12-13中任一項所述的雙特異性抗體，其中提高等電點的胺基酸取代包含：工程化的HLA-I α3在SEQ ID NO：1序列的E3、D22、E48、D53、E90、E101中的一個或幾個位置被正電胺基酸取代。實施方案11.
實施方案15. 根據實施方案12-14中任一項所述的雙特異性抗體，其中提高等電點的胺基酸取代包含：工程化的β2微球蛋白中在SEQ ID NO：2序列的E74、E47、E69、D34、E16、D53、E44、E50、E36中的一個或幾個位置被正電胺基酸取代。
實施方案16. 根據實施方案15所述的雙特異性抗體，其中提高等電點的胺基酸取代包含：所述工程化的HLA-I α3在SEQ ID NO：1序列的D22、E48和D53位置被正電胺基酸取代，並且所述工程化的β2微球蛋白在SEQ ID NO：2序列的E69位置被正電胺基酸取代。
實施方案17. 根據實施方案14-16任一項所述的雙特異性抗體，其中所述的正電胺基酸為K或R。
實施方案18. 根據實施方案12-13中任一項所述的雙特異性抗體，其中提高等電點的胺基酸取代包含：所述工程化的HLA-I α3在SEQ ID NO：1序列包含胺基酸取代D22R、E48K和D53K，並且所述工程化的β2微球蛋白在SEQ ID NO：2序列包含胺基酸取代E69R。
實施方案19. 根據實施方案1-18中任一項所述的雙特異性抗體，所述工程化的HLA-I α3包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，所述工程化的β2微球蛋白包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列。
實施方案20. 根據實施方案1-18中任一項所述的雙特異性抗體，所述工程化的HLA-I α3包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，所述工程化的β2微球蛋白包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列。
實施方案21. 根據實施方案1-20中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述第二抗原結合部分包含第二重鏈可變結構域和第二輕鏈可變結構域。
實施方案22. 根據實施方案1-21中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述第二抗原結合部分包含Fab。
實施方案23. 根據實施方案22所述的雙特異性抗體，其中根據EU編號，所述Fab的CL結構域在F118位置的胺基酸被丙胺酸取代。
實施方案24. 根據實施方案23所述的雙特異性抗體，所述CL結構域包含SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列。
實施方案25. 根據實施方案1-24中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合部分和第二抗原結合部分中的一個結合T細胞特異性受體分子和/或天然殺傷細胞特異性受體分子，以及另一個抗原結合部分結合腫瘤相關抗原。
實施方案26. 根據實施方案1-24中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合部分和第二抗原結合部分中的一個特異性結合CD3，以及另一個特異性結合腫瘤相關抗原。
實施方案27. 根據實施方案1-24中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合部分和第二抗原結合部分均特異性結合腫瘤相關抗原。
實施方案28. 根據實施方案25-27中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述腫瘤相關抗原為CD38、CD47、PD-L1或PD-1。
實施方案29. 根據實施方案26所述的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合部分特異性結合CD3，第二抗原結合部分特異性結合CD38；或者，所述第一抗原結合部分特異性結合CD38，第二抗原結合部分特異性結合CD3。
實施方案30. 根據實施方案27所述的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合部分特異性結合PD-L1，第二抗原結合部分特異性結合CD47；或者所述第一抗原結合部分特異性結合CD47，第二抗原結合部分特異性結合PD-L1。
實施方案31. 根據實施方案1-30中任一項所述的雙特異性抗體，所述雙特異性抗體為二價的。
實施方案32. 根據實施方案1-30中任一項所述的雙特異性抗體，其還包含第三抗原結合部分，所述第三抗原結合部分與第二抗原結合部分結合相同的抗原表位；優選的，所述第三抗原結合部分與第二抗原結合部分相同。
實施方案33. 根據實施方案1-30中任一項所述的雙特異性抗體，其還包含第三抗原結合部分，所述第三抗原結合部分與第一抗原結合部分結合相同的抗原表位；優選的，所述第三抗原結合部分與第一抗原結合部分相同。
實施方案34. 根據實施方案32或33所述的雙特異性抗體，其中所述第三抗原結合部分與第一抗原結合部分的N端或C端可操作性的連接。
實施方案35. 根據實施方案32或33所述的雙特異性抗體，其中所述第三抗原結合部分與第二抗原結合部分的N端或C端可操作性的連接。
實施方案36. 根據實施方案32-35中任一項所述的雙特異性抗體，所述雙特異性抗體為三價的。
實施方案37. 根據實施方案1-31中任一項所述的雙特異性抗體，其進一步包含能夠穩定締合的兩個Fc多肽構成的Fc域。
實施方案38. 根據實施方案37所述的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合部分在其C端與其中一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第二抗原結合部分在其C端與另一個Fc多肽的N端可操作性的連接。
實施方案39. 根據實施方案38所述的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合部分的第一多肽在其C端與其中一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第二抗原結合部分包含Fab，其Fab重鏈在其C端與另一個Fc多肽的N端可操作性的連接。
實施方案40. 根據實施方案32-36中任一項所述的雙特異性抗體，其進一步包含能夠穩定締合的兩個Fc多肽構成的Fc域。
實施方案41. 根據實施方案40所述的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合部分在其C端與其中一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第二抗原結合部分在其C端與另一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第三抗原結合部分在其C端與第一抗原結合部分的N端或第二抗原結合部分的N端可操作性的連接。
實施方案42. 根據實施方案40所述的雙特異性抗體，其中所述第三抗原結合部分在其C端與其中一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第一抗原結合部分在其C端與所述第三抗原結合部分的N端可操作性的連接，第二抗原結合部分在其C端與另一個Fc多肽的N端可操作性的連接。
實施方案43. 根據實施方案40所述的雙特異性抗體，其中所述第三抗原結合部分在其C端與其中一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第二抗原結合部分在其C端與所述第三抗原結合部分的N端可操作性的連接，第一抗原結合部分在其C端與另一個Fc多肽的N端可操作性的連接。
實施方案44. 根據實施方案41-43所述的雙特異性抗體，其中所述第三抗原結合部分與第一抗原結合部分可操作性的連接為透過肽接頭連接，或者所述第三抗原結合部分與第二抗原結合部分可操作性的連接為透過肽接頭連接。
實施方案45. 根據實施方案37-44中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述Fc域是IgG Fc域。
實施方案46. 根據實施方案45所述的雙特異性抗體，其中所述IgG Fc域是人IgG Fc域，優選為人IgG1或人IgG4的Fc域。
實施方案47. 根據實施方案37-46中任一項所述的雙特異性抗體，其中兩個Fc多肽透過連接子、二硫鍵、氫鍵、靜電相互作用、鹽橋、疏水-親水相互作用中的一種或幾種穩定締合。
實施方案48. 根據實施方案37-47中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述Fc域包含促進所述Fc域的兩個Fc多肽締合的修飾。
實施方案49. 根據實施方案37-48中任一項所述的雙特異性抗體，其中根據EU編號，其中一個Fc多肽包含T366Y/W和S354C，另一個Fc多肽包含Y407T/V、Y349C、T366S和L368A。
實施方案50. 根據實施方案37-49中任一項所述的雙特異性抗體，所述Fc域包含減少或消除Fc中的一個Fc多肽的CH3區與A蛋白的結合的修飾。
實施方案51. 根據實施方案37-50中任一項所述的雙特異性抗體，其中，根據EU編號，所述Fc域包含僅發生在其中一個Fc多肽的胺基酸取代H435R或/和Y436F。
實施方案52. 一種分離的多核苷酸，其編碼根據實施方案1-51中任意一項所述的雙特異性抗體。
實施方案53. 一種分離的載體，其包含根據實施方案52所述的多核苷酸。
實施方案54. 一種宿主細胞，其包含根據實施方案52所述的分離的多核苷酸，或根據實施方案51所述的分離的載體。
實施方案55. 一種表達根據實施方案1-51中任一項所述的雙特異性抗體的方法，所述方法包括在所述雙特異性抗體被表達的條件下培養根據實施方案52所述的宿主細胞。
實施方案56. 一種藥物組合物，其包含根據實施方案1-51中任一項所述的雙特異性抗體以及藥學上可接受的載體。
實施方案57. 一種綴合物，其包含實施方案1-51中任一項所述的雙特異性抗體以及與所述雙特異性抗體連接或綴合的治療劑。
實施方案58. 一種融合蛋白，其包含融合表達的融合組分以及實施方案1-51中任一項所述的雙特異性抗體。
實施方案59. 一種在有需要的受試者中治療疾病的方法，包括向受試者施用治療有效量的根據實施方案1-51中任一項所述的雙特異性抗體、實施方案56所述的藥物組合物、實施方案57所述的綴合物或實施方案58所述的融合蛋白。
實施例 1 MHC-I 元件序列的設計
根據IPD-IMGT/HLA（https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats.html）資料庫（3.42版本）統計（表1），相對於HLA-II，HLA-I具有更多的等位元基因數目和更加廣泛的分佈，因此選用HLA-I分子設計雙特異性抗體的結構元件，以降低免疫原性風險。
根據IPD-IMGT/HLA資料庫（3.42 版本）統計（表2），在HLA-I分子中，HLA-I-B等位基因的數量最多，因此選用HLA-I-B分子設計雙特異性抗體的結構元件，以進一步降低免疫原性風險。
表1. HLA等位基因數量
等位基因 數目
HLA-I 20,597
HLA-II 7,723
HLA 28,320
表2. HLA-I等位基因和蛋白
類型 A B C E F G
等位基因 6,291 7,562 6,223 256 45 82
蛋白 3,896 4,803 3,618 110 6 22
無效（nulls） 325 253 272 7 0 4
1.1 MHC-I元件初始序列的確定
在Uniprot（https://www.uniprot.org/）資料庫，獲取一系列天然HLA-I-B分子α鏈全長序列（表3）；在Uniprot資料庫，獲取HLA-I分子的β鏈（也稱為β微球蛋白）全長序列（Uniprot ID: P61769）。透過Uniprot資料庫頁面的交叉索引系統，進一步獲得含有HLA-I-B分子α鏈的蛋白質晶體資料資訊，為了確保晶體資料的準確性，選取了高解析度的晶體結構（Resolution＜2 Å）（表4）。
透過序列分析，並結合這些晶體結構的資訊，確定天然HLA-I-B分子α鏈恆定區（此處定義為MHCICα, constant region alpha of MHC I，或簡稱Cα）的相對起始位置。HLA-I-B分子α鏈恆定區存在一定的序列多樣性，透過使用線上比對工具ClustalW2 （https://www.ebi.ac.uk/Tools/phylogeny/simple_phylogeny/）對表3中的序列進行多序列比對，然後將比對結果透過webLogo（http://weblogo.berkeley.edu/）進行分析和展示，根據每個位置上胺基酸出現的頻率，獲得HLA-I-B分子α鏈恆定區的一致性序列（圖1），並將HLA-I-B分子α鏈恆定區一致性序列作為後續操作和改造的初始序列。由於人類的β2微球蛋白沒有序列多樣性，透過分析序列（Uniprot ID: P61769），確定天然β2微球蛋白與MHCICα的配對區域（此處定義為MHCICβ, constant region beta of MHC I，或簡稱Cβ）的序列。
MHC-I元件初始序列如下： ＞ MHCICαori（SEQ ID NO：1） GKETLQRADPPKTHVTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPS ＞MHCICβori （SEQ ID NO：2） IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDR
表3. Uniprot資料庫中含有天然HLA-I-B分子α鏈的序列資訊
序號 Uniprot 登錄號
1 A0A140T9S9
2 A0A140T9G0
3 A0A140T9H3
4 A0A140T9A9
5 A0A140T951
6 A0A1W2PPR8
7 D9J307
8 S6AU73
9 Q2L6G2
10 D5H3J5
11 Q5SS57
12 P30685
13 P01889
表4. 含有HLA-I-B分子α鏈的蛋白質晶體結構
序號 PDB 登錄號 解析度 (Å) 序號 PDB 登錄號 解析度 (Å) 序號 PDB 登錄號 解析度 (Å) 序號 PDB 登錄號 解析度 (Å)
1 1K5N 1.09 31 6PYL 1.52 61 1N2R 1.7 91 4O2C 1.8
2 4U1M 1.18 32 6PZ5 1.53 62 1SYV 1.7 92 4PR5 1.8
3 3CZF 1.2 33 1UXS 1.55 63 1ZSD 1.7 93 5IEK 1.8
4 6MT3 1.21 34 3VFV 1.55 64 2NW3 1.7 94 5VUE 1.8
5 3BWA 1.3 35 6MT4 1.55 65 3DX6 1.7 95 5VWD 1.8
6 3LN4 1.3 36 6MT5 1.55 66 3L3I 1.7 96 5VWF 1.8
7 3SPV 1.3 37 5WMR 1.58 67 3VCL 1.7 97 5WMN 1.82
8 6MT6 1.31 38 6BXQ 1.58 68 4QRQ 1.7 98 5DEG 1.83
9 2BVP 1.35 39 4U1H 1.59 69 5EO0 1.7 99 6D2R 1.83
10 6MTL 1.35 40 6P23 1.59 70 5TXS 1.7 100 3KPQ 1.84
11 4U1J 1.38 41 6P27 1.59 71 5XOS 1.7 101 3BP4 1.85
12 6PYW 1.38 42 1M6O 1.6 72 1UXW 1.71 102 3VFS 1.85
13 2A83 1.4 43 1ZHK 1.6 73 3D18 1.74 103 5EO1 1.85
14 4QRS 1.4 44 3DX7 1.6 74 3BW9 1.75 104 3B3I 1.86
15 4QRT 1.4 45 3KPM 1.6 75 6BJ8 1.75 105 3C9N 1.87
16 5WMQ 1.4 46 3SKO 1.6 76 4U1S 1.76 106 6D29 1.88
17 6P2C 1.4 47 3VRI 1.6 77 5T6Y 1.76 107 1JGD 1.9
18 4XXC 1.43 48 4G8I 1.6 78 4U1N 1.77 108 1M05 1.9
19 5IB2 1.44 49 4G9D 1.6 79 1XR9 1.79 109 2H6P 1.9
20 6PYJ 1.44 50 4LCY 1.6 80 2AXF 1.8 110 3KPP 1.9
21 6BXP 1.45 51 4QRU 1.6 81 3B6S 1.8 111 3LKS 1.9
22 6PYV 1.45 52 5DEF 1.6 82 3BP7 1.8 112 3LN5 1.9
23 1OGT 1.47 53 5WMP 1.6 83 3L3D 1.8 113 3VRJ 1.9
24 1XH3 1.48 54 5WMO 1.62 84 3LKO 1.8 114 4G9F 1.9
25 6P2F 1.48 55 2BVO 1.65 85 3LKP 1.8 115 4JQX 1.9
26 1ZHL 1.5 56 3VFU 1.65 86 3LKQ 1.8 116 4O2F 1.9
27 2HJL 1.5 57 4PRN 1.65 87 3SKM 1.8 117 5T6W 1.9
28 4JQV 1.5 58 5VWH 1.65 88 3VH8 1.8 118 5VUF 1.9
29 5IEH 1.5 59 6P2S 1.65 89 3X12 1.8 119 6BJ3 1.9
30 6AT5 1.5 60 5T6X 1.69 90 3X13 1.8 120 6D2T 1.9
1.2 MHC-I元件初始序列的優化
1.2.1、鏈間二硫鍵的引入以增強MHC-I元件的配對穩定性
將上述MHCICαori和MHCICβori胺基酸序列同時載入MOE（Molecular Operating Environment）軟體，透過MOE的Homology modeling模組對其進行異源二聚體建模，從而獲得MHC-I元件的類比結構。天然狀態下，MHC分子的恆定區之間無二硫鍵存在。為提高MHC-I恆定區的配對穩定性，優化其可開發性，在MHCICα和MHCICβ的結構域接觸介面上，對於MHCICαori，在R60、A62或G63位置可以引入半胱胺酸（Cys）；對於MHCICβori在Y26、R12或Y67位置可以引入半胱胺酸（Cys）。透過MOE的Disulfide scan模組，類比計算二硫鍵引入後的delta Stability，其中在MHCICαori中引入A62C突變，在MHCICβori中引入R12C突變，其delta stability最低，為-1.62 kcal/mol，說明這兩個位置的突變可以在Cα和Cβ的介面形成最穩定的二硫鍵（表5）。
表5. MHCICαori和MHCICβori的介面二硫鍵引入的模擬結果
MHCICαori MHCICβori delta Stability (kcal/mol)
R60C Y26C 1.96
A62C R12C -1.62
G63C Y67C 1.86
1.2.2、等電點優化
初始序列引入二硫鍵（表5中的A62C和R12C）後的MHC-I元件的理論等電點（pI, isoelectric point）為5.80，不利於後期的工藝開發。因此我們對MHC-I元件進行相關電荷改造，以改善其成藥性。透過MOE軟體的Protein-properties模組對MHC-I元件進行溶劑可及性表面（SAS, solvent accessible surface）和帶電胺基酸殘基等分析。MHC-I元件中，胺基酸殘基溶劑暴露程度＞40%且表現出負電荷/酸性的胺基酸殘基見表6。同時結合相關殘基所處的結構環境、化學環境和應用目的，將這些酸性胺基酸殘基中的一個或多個替換成鹼性胺基酸殘基（精胺酸（R）或賴胺酸（K）），將MHC-I元件的理論等電點提高至6.5-9.0。一種具體的方案，在MHCICα，引入D22R, E48K和D53K三個位點的突變；在MHCICβ，引入E69R單點突變，將MHC-I元件的理論等電點提高至7.8。
表6. MHC-I元件SAS和殘基電荷性質分子
亞基序列 胺基酸殘基 位置 酸鹼性 溶劑暴露程度 (%) 酸性解離常數pKa
MHCICαori  ASP 22 酸性 85.17 3.19
MHCICαori  GLU 48 酸性 67.65 3.54
MHCICαori  GLU 3 酸性 53.81 3.72
MHCICαori  GLU 90 酸性 51.81 4.78
MHCICαori  GLU 101 酸性 44.6 2.56
MHCICαori  ASP 53 酸性 43.3 3.37
MHCICβori  GLU 74 酸性 67.85 3.91
MHCICβori  GLU 47 酸性 64.08 3.17
MHCICβori  GLU 69 酸性 49.51 3.84
MHCICβori  ASP 34 酸性 48.31 3.1
MHCICβori  GLU 16 酸性 47.83 3.65
MHCICβori  ASP 53 酸性 47.27 2.31
MHCICβori  GLU 44 酸性 44.71 2.32
MHCICβori  GLU 50 酸性 41.72 3.98
MHCICβori  GLU 36 酸性 40.96 2.81
1.2.3 、其他優化
考慮到Cβ區結尾的4個胺基酸(-KWDR)，它們的側鏈較大，其可能造成潛在的空間位阻效應。如果採用柔性的G4S連接肽會降低蛋白質構象的穩定性。甘胺酸(G)和脯胺酸(P)的結構特點決定這兩個胺基酸都主要位於無規則捲曲或者轉角位置，其次甘胺酸沒有側鏈基團，可以很好地緩解空間位阻效應，而脯胺酸的側鏈是五元環結構，具備一定的剛性，可以提高構象穩定性，因此最終在Cβ區的羧基端添加GP，以平衡潛在的空間位阻效應和構象穩定性。
一種MHC-I元件優化序列如下： ＞ Cα (SEQ ID NO：3) GKETLQRADPPKTHVTHHPISRHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGKDQTQKTELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPS ＞Cβ (SEQ ID NO：4) IQRTPKIQVYSCHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTRFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRGP
實施例 2 MHC-I 元件修飾雙特異性 IgG4 抗體的構建和表徵
為了確保MHC-I元件能夠用於雙特異性抗體，選擇達雷木抗體（daratumumab）和靶向人的CD3抗體SP34構建靶向CD3和CD38的雙特異性抗體進行早期概念驗證和考察Cα和Cβ相對取向對MHC-I元件修飾的抗原結合部分的影響。為了避免或緩解IgG重鏈之間的錯配，後續構建的雙特異性抗體都採用“杵臼”結構（knobs into holes）。SP34 Fab的IgG恆定區結構域CH1/CL分別由對應的Cα/Cβ和Cβ/Cα替換，構建相對不同取向的MHC-I修飾的抗原結合部分，並且SP34臂的重鏈採用“臼”結構，即CH3-hole。達雷木單抗的Fab保持不變，其重鏈採用“杵”結構，即CH3-knob。將MHC-I修飾的靶向CD3的抗原結合部分與達雷木單抗的Fab組合從而產生兩種不同的雙特異性抗體，分別命名為MHI383-1122-IgG4和MHI383-1133-IgG4（分子結構參見圖2），序列如表7。MHC-I元件採用SEQ ID NO：3所示序列的Cα和SEQ ID NO：4所示序列的Cβ。
表7. 雙特異性抗體MHI383-1122-IgG4和MHI383-1133-IgG4序列
名稱 組成多肽鏈 胺基酸序列 核苷酸序列
MHI383-1122-IgG4 H1 SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：7
L1 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：9
H2 SEQ ID NO：10 SEQ ID NO：11
L2 SEQ ID NO：12 SEQ ID NO：13
MHI383-1133-IgG4 H1 SEQ ID NO：6 SEQ ID NO：7
L1 SEQ ID NO：8 SEQ ID NO：9
H3 SEQ ID NO：14 SEQ ID NO：15
L3 SEQ ID NO：16 SEQ ID NO：17
對於每種雙特異性抗體，將編碼組成抗體的各多肽鏈的DNA序列分別插入載體中，獲得表達相應多肽鏈的表達載體。將編碼每種多特異抗體多肽鏈的表達載體各25 µg共轉染ExpiCHO-S細胞（廠家：上海醫藥工業研究院，貨號：127200005），轉染表達體積100 ml，細胞密度為6E+06 cells/ml。
轉染後將細胞於32°C、5% CO 2、130 rpm條件下表達培養，第8天收取細胞上清液，Protein A磁珠（廠家：金斯瑞，貨號：L00695-20）一步純化抗體蛋白。細胞上清液加入4 ml磁珠放入50 ml離心管中，置於迴旋式脫色搖床（廠家：上海智城，型號：ZHWY-304。）上室溫孵育2小時。應用磁力架底座吸附磁珠，棄上清並用緩衝液充分洗滌磁珠，使用pH 3.0的0.1 mol/L的甘胺酸（廠家：國藥集團，貨號：62011516）洗脫抗體蛋白，洗脫液置於超濾管（廠家：Millipore，貨號：UFC501096）中濃縮並用1×PBS（廠家：上海生工，貨號：B040100-0005）進行緩衝液置換，純化獲得MHI383-1122-IgG4和MHI383-1133-IgG4。
2.1 BLI檢測雙特異性抗體與抗原的結合親和力
分別以人的CD38蛋白（北京百普賽斯，貨號：CD8-H5224）和人的CD3E（北京百普賽斯，貨號：CDE-H5223）為抗原，透過生物干涉膜技術（BLI）分別測定MHI383-1122-IgG4和MHI383-1133-IgG4對人的CD38和CD3E蛋白的親和力。具體實驗方法如下：
親和力測定用於評價MHI383-1122-IgG4和MHI383-1133-IgG4對人的CD38和CD3E蛋白的親和力。親和力測定主要透過BLI技術完成。分別將MHI383-1122-IgG4或MHI383-1133-IgG4固化至感測器上，再將感測器分別浸入一定濃度梯度的人的CD38和CD3E蛋白溶液之中，Data Acquisition 11.0.0.64即時採集結合解離曲線，並透過Data Analysis 11.0進行資料分析，得出結合速率常數Ka、解離速率常數Kd和平衡常數KD，平衡常數KD即表示親和力。
表8. MHI383-1122-IgG4和MHI383-1133-IgG4的親和力（BLI）
樣品 抗原 kon(1/Ms) kdis(1/s) KD (M) 抗原 kon(1/Ms) kdis(1/s) KD (M)
MHI383-1122-IgG4 human CD3E 2.05E+05 2.46E-04 1.20E-09 human CD38 2.17E+05 3.69E-03 1.70E-08
MHI383-1133-IgG4 human CD3E 1.43E+05 9.17E-05 6.41E-10 human CD38 2.94E+05 1.80E-03 6.14E-09
實驗結果表明，不同Cα/Cβ取向的雙特異性抗體MHI383-1122-IgG4和MHI383-1133-IgG4都對人的CD38和CD3E蛋白表現出良好的親和力，彼此間的親和力KD數值差異＜3倍，主要是由其解離速率常數Kd損失造成的（表8）。因此，MHC-I元件（Cα和Cβ）可以替換CH1和CL結構域用於構建雙特異性抗體。
實施例 3 MHC-I 元件修飾雙特異性 IgG1 抗體構建和表徵
為了避免或緩解IgG重鏈之間的錯配，構建的雙特異性抗體都採用“杵臼”結構（knobs into holes）。為了測試MHC-I元件（SEQ ID NO：3所示序列的Cα和SEQ ID NO：4所示序列的Cβ）對不同IgG亞型雙特異性抗體的影響，我們將上述MHI383-1122-IgG4改造成IgG1形式，產生新的雙特異性抗體，命名為MHI383-ccff-IgG1（構建結構如圖3）。該抗體的兩條重鏈的CH2結構域均採用LALA（L234A+L235A）雙突變以消除潛在的Fc effector效應。在本實施例中，MHC-I元件修飾重鏈的CH3結構域中，引入了H435R+Y436F（EU編號）雙突變，含有H435R+Y436F雙突變的重鏈錯配產物不與protein A結合，從而在protein A親和色譜純化中被去除，提高目的雙特異性抗體的純度和純化效率。
MHI383-ccff-IgG1具有四條多肽鏈（Hc、Lc、Hf和Lf），序列如下：
Hc：胺基酸序列如SEQ ID NO：18所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示；
Lc：胺基酸序列如SEQ ID NO：20所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示；
Hf：胺基酸序列如SEQ ID NO：22所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；
Lf：胺基酸序列如SEQ ID NO：24所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示；
洗脫的目標蛋白峰使用SuperdexTM 200 Increase 10/300GL柱及GE的AKTA 系統進行製備型分子排阻色譜繼續純化。該純化實驗使用平衡液（50 mM Tris-HAc，150mM L-Arg-HCl，pH 7.5），以0.8 ml/min流速進行。圖4為MHI383-ccff-IgG1分子SEC純化圖譜，收集SEC主峰（保留時間RT=7.174 min），以用於後續質譜分析。透過液質聯用的方法，對上述SEC主峰進行完整分子量鑒定。
採用Waters LC-MS系統(Waters, Singapore, USA, UK)進行完整分子量分析。採用MAbPac RP 4 μm 2.1×50 mm (Thermo, USA)色譜柱；以A相（0.1%甲酸水溶液）、B相（0.1%甲酸乙腈溶液）為流動相，檢測波長為280 nm。取1 μg蛋白注入液質聯用儀，梯度為：5.5分鐘內，5％B~100％B。質譜儀採用正離子模式，掃描範圍：200-4000 m/z。採用MassLynx 4.1採集資料，並透過UNIFI 1.8.2.169進行資料處理。質譜結果表明，149934Da處的峰（圖5）與預期的正確組裝的雙特異性抗體MHI383-ccff-IgG1完整分子量相符合。
基於序列模式分析MHC-I元件的胺基酸序列，我們未發現N-連接的糖基化位點基序（NXS/T，X=任何胺基酸除了脯胺酸）。但是O-連接糖基化位點難以從序列中預測。因此進一步透過使用糖苷酶PNGaseF水解切除上述SEC主峰蛋白中存在的N糖。採用串聯質譜的方法，對N糖切除後的蛋白進行肽圖表徵（蛋白測序），考察是否存在可能的O-糖基化位點。
採用Waters LC-MS系統(Waters, Singapore, USA, UK)進行肽序列覆蓋率分析。採用AdvanceBio Peptide Map 2.1×150 mm 2.7-Micron (Aglient, USA)色譜柱；以A相（0.1%甲酸水溶液）、B相（0.1%甲酸乙腈溶液）為流動相，檢測波長為214 nm。PNGaseF處理後的蛋白經變性、還原和烷基化後，胰蛋白酶酶切過夜。取適量酶切後蛋白注入液質聯用儀檢測。洗脫梯度為，13 min內：0％B~15％B；45 min內：15％B~40％B。質譜儀採用正離子模式，掃描範圍：100-2000 m/z。採用MassLynx 4.1採集資料，並透過UNIFI 1.8.2.169進行資料處理。
肽圖實驗結果同時表明MHI383-ccff-IgG1分子中不存在任何O-連接糖基化的修飾，從而說明MHC-I元件中也不存在任何O-連接糖基化位點。相對於基於TCR修飾的雙特異性抗體，MHC-I元件修飾的雙特異抗體具有更低水準的糖型異質性，更有利於下游的工藝開發和品質控制。
實施例 4 突變位點的設計及鏈錯配驗證
抗體HZ5G11靶向於人PD-L1蛋白的胞外段，以及抗體HZ14A9靶向於人CD47蛋白的胞外段，均為相應抗原免疫小鼠後經雜交瘤篩選、並經人源化後所得到的單克隆抗體。
靶向人的PD-L1單克隆IgG1K抗體HZ5G11由重鏈HZ5G11VH-CH1-IgG1（重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：26所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示）和輕鏈HZ5G11VL-IgK組成（輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：28所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示），靶向人的CD47單克隆IgG1K抗體HZ14A9由重鏈HZ14A9VH-CH1-IgG1（重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：45所示）和輕鏈HZ14A9VL-IgK（輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：46所示）組成。進一步構建基於MHC-I元件的HZ14A9和HZ5G11相關的變體：HZ14A9 抗體重鏈的IgG1恆定區結構域CH1由對應的 MHC-I元件中的MHCICα (SEQ ID NO：3)替換，產生重鏈HZ14A9VH-Cα-IgG1（重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：47所示），HZ14A9 抗體輕鏈的IgK恆定區結構域CL由對應的MHC-I元件中的MHCICβ (SEQ ID NO：4)替換，產生輕鏈HZ14A9VL-Cβ（輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：48所示）；HZ5G11抗體重鏈的IgG1恆定區結構域CH1由對應的MHC-I元件中的MHCICα替換，產生重鏈HZ5G11VH-Cα-IgG1（重鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：30所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示），HZ5G11抗體輕鏈的IgK恆定區結構域CL由對應的MHC-I恆定區元件中的MHCICβ替換，產生輕鏈HZ5G11VL-Cβ（輕鏈胺基酸序列如SEQ ID NO：32所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示）。
為了驗證MHC-I元件MHCICα，MHCICβ與抗體恆定區CH1，輕鏈恆定區CL之間是否存在可能的相互作用，按照表9所示，將分別構建編碼不同重鏈或輕鏈的質粒，組合後進行配對表達純化。具體的：合成DNA序列，將編碼重鏈和輕鏈的DNA序列分別插入載體（例如CN107001463A披露的pcDNA3.1載體，CN109422811A披露的pCHO1.0載體，等），獲得表達相應重鏈或輕鏈的重組表達載體。將表達重鏈和輕鏈的重組表達載體按照品質比1：1的比例共轉染ExpiCHO-S細胞（廠家：上海醫藥工業研究院，貨號：127200005），轉染表達體積0.1~1L，細胞密度為6E+06 cells/ml的ExpiCHO-S（廠家：上海醫藥工業研究院，貨號：127200005）。
轉染後將細胞置於ExpiCHO TM培養基（廠家：Thermo，貨號：A2910001)中，於32°C、5% CO 2、130 rpm條件下表達培養，第10天收取細胞上清液，使用來自GE的AKTA Pure 25 L系統和MabSelect SuRe LX填料對目標蛋白進行proteinA親和層析純化。洗脫後，使用NanoDrop Lite（Thermo Fisher Scientific）測量洗脫收穫的蛋白濃度，SEC-HPLC檢測洗脫的蛋白純度，用於測試的樣品蛋白純度不低於80%。每個樣品取總量為5 mg蛋白進行非還原SDS-PAGE電泳，經考馬斯亮藍染色後觀察電泳結果。
表9. 不同重鏈/輕鏈配對表達組合
組合 重鏈 輕鏈
1 HZ5G11VH-CH1-IgG1 HZ5G11VL-IgK
2 HZ14A9VH-CH1-IgG1 HZ14A9VL-IgK
3 HZ5G11VH-CH1-IgG1 HZ14A9VL-IgK
4 HZ14A9VH-CH1-IgG1 HZ5G11VL-IgK
5 HZ5G11VH-Cα-IgG1 HZ14A9VL-IgK
6 HZ14A9VH-CH1-IgG1 HZ5G11VL-Cβ
7 HZ14A9VH-Cα-IgG1 HZ5G11VL-IgK
8 HZ5G11VH-CH1-IgG1 HZ14A9VL-Cβ
如圖6所示，實驗結果表明基於HZ5G11和HZ14A9單克隆抗體之間分別交換輕重鏈，仍有雜合配對產物生成，且雜合配對產物的分子量介於HZ5G11和HZ14A9單克隆抗體之間。HZ5G11VH-Cα-IgG1與HZ14A9VL-IgK，以及HZ14A9VH-Cα-IgG1與HZ5G11VL-IgK的共表達純化後，均有多種產物生成。其中HZ5G11VH-Cα-IgG1與HZ14A9VL-IgK組合表現為雜合配對產物的分子量位於130-180kDa之間，跟HZ5G11和HZ14A9單克隆抗體接近。而HZ14A9VH-Cα-IgG1與HZ5G11VL-IgK組合表現雜合配對產物的分子量位於100-130kDa之間，跟HZ5G11和HZ14A9單克隆體較易於區分。以上表明CL結構域與MHCICα之間存在某些相互作用，進而促進產生輕重鏈錯配產物。HZ14A9VH-CH1-IgG1與HZ5G11VL-Cβ，以及HZ5G11VH-CH1-IgG1和HZ14A9VL-Cβ的共表達純化後，相應的非還原SDS-PAGE的泳道上，未發現明顯條帶，即沒有明顯的雜合配對產物生成，表明CH1結構域與MHCICβ之間無顯著的相互作用。
為解決含MHCICα重鏈和含CL結構域輕鏈發生錯配的問題，對MHCICα (SEQ ID NO：3)/MHCICβ (SEQ ID NO：4)以及IgG1恆定區CH1 (SEQ ID NO：34)/IgK恆定區CL (SEQ ID NO：35)的結構域接觸介面進行結構分析，並結合序列分析，我們認為CL結構域中114(EU編號)、116(EU編號)、118(EU編號)位點可能涉及MHCICβ和CL結構域在後續雙特異性抗體裝配中的互換過程，從而生成互換錯配產物。為了驗證IgK恆定區CL結構域中的S114(EU編號)、F116(EU編號)、F118(EU編號)單點突變對MHCICα和CL結構域配對過程的影響，在輕鏈HZ5G11VL-IgK的CL結構域中S114(EU編號)、F116(EU編號)或F118(EU編號)位點分別引入為非芳香族的疏水胺基酸（M：甲硫胺酸，A：丙胺酸，V：纈胺酸，I：異亮胺酸，或，L：亮胺酸)，與重鏈HZ14A9VH -Cα-IgG1進行組合表達。部分構建的含突變的抗體輕鏈序列資訊見表10，部分不同重鏈/輕鏈配對表達組合見表11。
表10. 部分構建的含突變的抗體輕鏈序列資訊
質粒 胺基酸序列 核苷酸序列
HZ5G11VL-IgK-S114A SEQ ID NO：36 SEQ ID NO：37
HZ5G11VL-IgK-F116A SEQ ID NO：38 SEQ ID NO：39
HZ5G11VL-IgK-F118A SEQ ID NO：40 SEQ ID NO：41
HZ5G11VL-IgK-F118I SEQ ID NO：42 SEQ ID NO：43
表11. 部分不同重鏈/輕鏈配對表達組合
組合 輕鏈 重鏈
1 HZ5G11VL-IgK HZ14A9VH-Cα-IgG1
2 HZ5G11VL-IgK-S114A HZ14A9VH-Cα-IgG1
3 HZ5G11VL-IgK-F116A HZ14A9VH-Cα-IgG1
4 HZ5G11VL-IgK-F118I HZ14A9VH-Cα-IgG1
5 HZ5G11VL-IgK-F118A HZ14A9VH-Cα-IgG1
就雙特異性抗體開發方面而言，分子量＞100kDa的錯配產物可能與目的產物無法有效分離或增加分離的難度，從而影響雙特異性抗體產品的品質。結果顯示HZ5G11VL-IgK-F118A與HZ14A9VH-Cα-IgG1配對組合能夠顯著降低分子量＞100kDa配對產物的生成（圖7），說明F118A單點突變能夠降低MHCICα和CL結構域之間的作用力，從而進一步解決或緩解MHCICβ和CL結構域在後續雙特異性抗體裝配中的互換過程，從而提高雙特異性抗體產品的品質。
實施例 5  CL 結構域中 F118A 突變對單克隆抗體組裝的影響
為了驗證IgK恆定區CL結構域中的F118A(EU編號)單點突變對單克隆抗體組裝的影響，分別對靶向CD47和PD-L1的單克隆抗體（HZ14A9和HZ5G11）的輕鏈IgK恆定區進行F118A單點突變，將突變後的輕鏈分別與原來各自的重鏈進行配對表達，得到HZ14A9-F118A和HZ5G11-F118A。同時分別表達野生型的靶向CD47和PD-L1的單克隆抗體（HZ14A9和HZ5G11）作為對照。抗體構建和表達方法參考實施例4。
如圖11所示，非還原SDS-PAGE實驗結果表明所有檢測樣品的條帶均位於150 kDa附近。表明IgK恆定區CL結構域中的F118A(EU編號)單點突變不影響單克隆抗體的組裝。
實施例 6  anti-PDL1* CD47 雙特異性抗體的構建及性能表徵
5.1 構建和表達
為了驗證IgK恆定區CL結構域中的F118A(EU編號)單點突變對雙特異性抗體的影響，構建兩種靶向CD47和PD-L1的雙特異性抗體，其中，靶向PD-L1的抗原結合部分為MHC-I元件修飾的抗原結合部分，將抗體HZ5G11的CH1/CL替換為MHCICα/MHCICβ，靶向CD47的抗原結合部分為Fab，基於抗體HZ14A9構建，其中Fab輕鏈的恆定區CL結構域在F118(EU編號)位點不突變和攜帶F118A單點突變。所有抗體的兩條重鏈的CH2結構域均採用LALA（L234A+L235A）雙突變以消除潛在的Fc effector效應，CH3結構域攜帶KIH突變促使異二聚體的形成。從而產生兩種同時靶向CD47和PD-L1雙特異性抗體，分別為MHL147-3322-IgG1-wt（分子結構參見圖8）和MHL147-3322-IgG1-F118A（分子結構參見圖9）。
表12. anti-PDL1*CD47雙特異性抗體的序列
抗體名稱 多肽鏈 胺基酸序列
MHL147-3322-IgG1-wt H2 （SEQ ID NO：49）
L2 （SEQ ID NO：50）
H3 （SEQ ID NO：51）
L3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASENVVSYVSWYQQKPGKAPKLLIYGASNRYTGVPSRFIGSGSSTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSYSYPLTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO：53）
MHL147-3322-F118A H2 QITLKESGPTLVKPTQTLTLTCTVSGFSLSTYGVHWIRQPPGKALEWLGVIWRGVTTDYNAAFMSRLTITKDNSKNQVVLTMNNMDPVDTATYYCARLGFYAMDYWGQGTLVTVSS GKETLQRADPPKTHVTHHPISRHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGKDQTQKTELVETRPCGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWEPS EPKSSDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK （SEQ ID NO：49）
L2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYAANRYTGVPDRFSGSGYGTDFTFTISSLQPEDIATYFCQQDYTSPYTFGQGTKLEIK IQRTPKIQVYSCHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTRFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRGP （SEQ ID NO：50）
H3 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKVSGFNIEDDYIEWVRQAPGQGLEWMGRIDPANDKTKYAQKFQGRVTMTGDTSTNTVYMELSSLRSEDTAVYYCARPGLRRYYSMDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK （SEQ ID NO：51）
L3 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASENVVSYVSWYQQKPGKAPKLLIYGASNRYTGVPSRFIGSGSSTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSYSYPLTFGQGTKLEIK RTVAAPSVFIAPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC （SEQ ID NO：52）
將編碼組成各多肽鏈的DNA序列分別插入載體（例如CN107001463A披露的pcDNA3.1載體，CN109422811A披露的pCHO1.0載體，等），獲得表達相應多肽鏈的表達載體。將編碼每種多肽鏈的表達載體各按照品質比等比例共轉染ExpiCHO-S細胞（廠家：上海醫藥工業研究院，貨號：127200005），轉染表達體積0.1~1L，細胞密度為6E+06 cells/ml的ExpiCHO-S（廠家：上海醫藥工業研究院，貨號：127200005）。轉染後將細胞置於ExpiCHO TM培養基（廠家：Thermo，貨號：A2910001)中，於32°C、5% CO 2、130 rpm條件下表達培養，第10天收取細胞上清液，使用來自GE的AKTA Pure 25 L系統和MabSelect SuRe LX填料對目標蛋白進行proteinA親和層析。洗脫後，使用NanoDrop Lite（Thermo Fisher Scientific）測量洗脫收穫的蛋白濃度，SEC-HPLC檢測洗脫的蛋白純度。
表12. Anti-PDL1*CD47雙特異性抗體的表達量和純度
樣品 純化方式 表達量(mg/L) HPLC-SEC純度 (%)
MHL147-3322-IgG1-wt protein A親和色譜 22 82.94
MHL147-3322-IgG1-F118A protein A親和色譜 38 92.85
一步protein A親和色譜純化結果顯示MHL147-3322-IgG1-F118A比MHL147-3322-IgG1-wt具有更高的表達產量和純度（表12），CL結構域中的F118A(EU編號)單點突變能夠改善雙特異性抗體在細胞內的組裝配對過程，減少錯配產物的形成，從而提高了雙特異性抗體的表達量和純度。
5.2 熱穩定性
透過Nano DSF（Nano Temper）表徵HZ14A9、HZ5G11、MHL147-3322-IgG1-wt和MHL147-3322-IgG1-F118A熱穩定性質。將待測樣品的濃度調整至1.0 mg/ml左右，然後用石英毛細管分別吸取少量樣品，置於Nano DSF樣品懸架之中，以恒定速率1.0°C /min在20.0°C -95.0°C區間程式升溫，收集蛋白質樣品的光學訊號變化，分析蛋白熱穩定性。
表13. Anti-PDL1*CD47雙特異性抗體的熱穩定性
樣品 熔解溫度Tm1(°C)
MHL147-3322-IgG1-wt 66.4
MHL147-3322-IgG1-F118A 67
HZ14A9 68.3
HZ5G11 67
Nano DSF實驗結果顯示HZ14A9、HZ5G11、MHL147-3322-IgG1-wt和MHL147-3322-IgG1-F118A都具有良好的熱穩定性，所有樣品的熔解溫度Tm1均高於65°C（表13）。CL結構域中的F118A(EU編號)單點突變對雙特異性抗體的熱穩定性無顯著影響。
5.3 親和力
透過Biacore表徵HZ5G11單抗、HZ14A9單抗、MHL147-3322-IgG1-wt和MHL147-3322-IgG1-F118A雙抗親和力性質。透過捕獲法分別將HZ5G11單抗、HZ14A9單抗、MHL147-3322-IgG1-wt和MHL147-3322-IgG1-F118A雙抗固定到傳感晶片上，進樣一定濃度梯度的人類PDL1(廠家：百普賽斯，貨號：PD1-H52H3)或人類CD47(廠家：百普賽斯，貨號：CD7-H5227)蛋白抗原溶液，Biacore 8K Control Software 3.0即時採集結合解離曲線，並透過Biacore Insight Evaluation Software 3.0進行資料分析，得出結合速率常數Ka、解離速率常數Kd和平衡常數KD。
表14. Anti-PDL1*CD47雙特異性抗體對人CD47抗原的結合親和力
樣品 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
HZ14A9單抗 2.45E+06 1.43E-02 5.85E-09
MHL147-3322-IgG1-F118A 4.74E+06 2.49E-02 5.26E-09
MHL147-3322-IgG1-wt 3.75E+06 1.24E-02 3.31E-09
表15. Anti-PDL1*CD47雙特異性抗體對人PDL1抗原的結合親和力
樣品 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
HZ5G11單抗 1.51E+06 4.27E-04 2.82E-10
MHL147-3322-IgG1-F118A 1.58E+06 6.06E-04 3.84E-10
MHL147-3322-IgG1-wt 1.85E+06 5.62E-04 3.04E-10
實驗結果表明，雙特異性抗體MHL147-3322-IgG1-wt和MHL147-3322-IgG1-F118A都對人的PDL1和CD47蛋白表現出良好的親和力（表15、表16）。
5.4 紅細胞凝集實驗
透過人紅細胞凝集實驗表徵MHL147-3322-IgG1-wt和MHL147-3322-IgG1-F118A潛在血液安全性質。將紅細胞充分清洗，以除去附著在紅細胞膜表面的血漿。使用等滲的稀釋液將紅細胞洗滌3次，前2次2000 rpm/min離心5 min；末次2000 rpm/min離心10 min，棄上清。使用PBS將紅細胞製成2%細胞懸液，吸取100 μL放入96孔U型板中，1500 rpm/min離心5min，棄上清。將MHL147-3322-IgG1-wt、MHL147-3322-IgG1-F118A以及同型對照hIgG1樣品調整為8個濃度梯度（0，0.1，0.2，0.7，2，6，17，50 μg/ml），96孔U型板加入抗體稀釋液，反應總體積為100μL，重懸混勻後於37°C培養箱靜置2 h，孵育2h後觀察結果。如圖10所示，雙特異性抗體濃度在≥2 μg/ml的條件下，相對於MHL147-3322-IgG1-wt，MHL147-3322-IgG1-F118A表現出更弱的紅細胞凝集能力，從而提示IgK恆定區CL結構域中的F118A(EU編號)突變能夠有效地減少錯配產物的形成，提高雙特異性抗體的均一性。
無
圖1為HLA-I-B分子α鏈恆定區的一致性序列。 圖2為基於MHC-I元件構建的抗CD3/CD38雙特異性抗體結構示意圖。 圖3為MHI383-ccff-IgG1分子結構示意圖。 圖4為MHI383-ccff-IgG1分子SEC純化圖譜。 圖5為MHI383-ccff-IgG1完整分子量質譜圖譜。 圖6為含MHCICα，MHCICβ, CH1, CL結構域的重輕鏈彼此配對組合表達的非還原SDS-PAGE。 圖7為HZ5G11VL-IgK或其引入胺基酸突變後與HZ14A9VH-Cα-IgG1的組合表達產物的非還原SDS-PAGE。 圖8為基於MHC-I元件構建的MHL147-3322-IgG1-wt雙特異性抗體結構示意圖。 圖9為基於MHC-I元件構建的MHL147-3322-IgG1-F118A雙特異性抗體結構示意圖。 圖10為不同濃度的雙特異性抗體MHL147-3322-IgG1-wt和MHL147-3322-IgG1-F118A對紅細胞凝集的影響。 圖11為抗體HZ5G11與HZ14A9在CL引入F118A後的非還原SDS-PAGE。 圖12為本發明雙特異性抗體的一些示例性結構形式圖，其中，（A）分別與Fc多肽N端連接的不同特異性的MHC修飾的抗原結合部分（第一抗原結合部分）與Fab的“1+1”形式，（B）分別與Fc多肽連接的不同特異性的MHC修飾的抗原結合部分（第一抗原結合部分，Cα與Cβ取向與（A）不同）與Fab的“1+1”形式，（C）“2+1”形式，第一抗原結合部分與一個Fab分別與Fc多肽連接，另一個Fab與第一抗原結合部分的N端連接，（D）“2+1”形式，與（C）不同，兩個Fab串連，（E）“2+1”形式，兩個Fab分別與Fc多肽連接，第一抗原結合部分與一個Fab的N端連接，（F）“2+1”形式，與（E）不同，第一抗原結合部分與Fc多肽的C端連接，（G）“2+2”形式，抗原結合部分與Fc的N端連接，（H）“2+2”形式，第一抗原結合部分均與Fc的C端連接；Fc域還可以攜帶胺基酸取代，例如KIH等，CL可以攜帶F118A，該圖例中未顯示胺基酸取代。 
                         序列表
          <![CDATA[<110>  正大天晴藥業集團股份有限公司]]>
          <![CDATA[<120>  雙特異性抗體]]>
          <![CDATA[<160>  53]]>
          <![CDATA[<170>  SIPOSequenceListing 1.0]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  103]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHCICαori胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr 
          1               5                   10                  15      
          His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu 
                      20                  25                  30          
          Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Glu 
                  35                  40                  45              
          Asp Gln Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Ala Gly Asp 
              50                  55                  60                  
          Arg Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser 
                      100             
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  97]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHCICβori胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu 
          1               5                   10                  15      
          Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro 
                      20                  25                  30          
          Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys 
                  35                  40                  45              
          Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu 
              50                  55                  60                  
          Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp 
                          85                  90                  95      
          Arg 
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  103]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Cα優化胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr 
          1               5                   10                  15      
          His His Pro Ile Ser Arg His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu 
                      20                  25                  30          
          Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Lys 
                  35                  40                  45              
          Asp Gln Thr Gln Lys Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Cys Gly Asp 
              50                  55                  60                  
          Arg Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser 
                      100             
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211>  99]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Cβ優化胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Cys His Pro Ala Glu 
          1               5                   10                  15      
          Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro 
                      20                  25                  30          
          Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys 
                  35                  40                  45              
          Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu 
              50                  55                  60                  
          Leu Tyr Tyr Thr Arg Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp 
                          85                  90                  95      
          Arg Gly Pro 
          <![CDATA[<210>  5]]>
          <![CDATA[<211>  97]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  Cβ另一種實施方式的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Cys His Pro Ala Glu 
          1               5                   10                  15      
          Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro 
                      20                  25                  30          
          Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys 
                  35                  40                  45              
          Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu 
              50                  55                  60                  
          Leu Tyr Tyr Thr Arg Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp 
                          85                  90                  95      
          Arg 
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  448]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-1122-IgG4的多肽鏈H1的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr 
              210                 215                 220                 
          Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 
                          245                 250                 255     
          Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp 
                      260                 265                 270         
          Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 
                  275                 280                 285             
          Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val 
              290                 295                 300                 
          Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys 
                          325                 330                 335     
          Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 
                      340                 345                 350         
          Leu Pro Pro Cys Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp 
                  355                 360                 365             
          Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 
              370                 375                 380                 
          Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 
          385                 390                 395                 400 
          Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys 
                          405                 410                 415     
          Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 
                      420                 425                 430         
          Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 
                  435                 440                 445             
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  1344]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-1122-IgG4的多肽鏈H1的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  7]]>
          gaggtgcagc tgctggagag cggaggagga ctggtgcagc caggaggcag cctgagactg        60
          tcttgcgccg tgtccggctt cacctttaac agcttcgcca tgtcttgggt gcgccaggct       120
          cctggcaagg gactggagtg ggtgtctgcc atctctggat ccggaggagg aacatactat       180
          gctgactccg tgaagggcag gttcaccatc tcccgggata acagcaagaa tacactgtac       240
          ctgcagatga attctctgag ggccgaggac accgccgtgt acttttgtgc taaggataag       300
          atcctgtggt tcggcgagcc agtgtttgac tactggggcc agggcaccct ggtgacagtg       360
          tccagcgcct ctacaaaggg cccttccgtg ttcccactgg ctccttgctc tcgctccaca       420
          agcgagtcta ccgccgctct gggctgtctg gtgaaggact acttccccga gcctgtgacc       480
          gtgtcttgga attccggcgc cctgacaagc ggagtgcaca cctttcctgc tgtgctgcag       540
          tcttccggcc tgtactctct gagctctgtg gtgacagtgc cttccagctc tctgggcacc       600
          aagacatata cctgcaacgt ggaccataag ccatctaata ccaaggtgga taagagagtg       660
          gagagcaagt acggaccacc atgccctcca tgtcctgctc cagagttcct gggaggacca       720
          tccgtgttcc tgtttccacc taagcctaag gacacactga tgatcagccg gacaccagag       780
          gtgacctgcg tggtggtgga cgtgtctcag gaggatcccg aggtgcagtt caactggtac       840
          gtggatggcg tggaggtgca caatgctaag accaagccta gagaggagca gtttaattcc       900
          acataccgcg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcatcagg actggctgaa cggcaaggag       960
          tataagtgta aggtgtccaa taagggcctg ccatccagca tcgagaagac catcagcaag      1020
          gccaagggcc agccaagaga gccccaggtg tacacactgc caccctgcca ggaggagatg      1080
          accaagaacc aggtgtccct gtggtgtctg gtgaagggct tctatcccag cgacatcgct      1140
          gtggagtggg agtctaatgg ccagcctgag aacaattaca agaccacacc tccagtgctg      1200
          gacagcgatg gctctttctt tctgtattct aggctgacag tggataagtc ccggtggcag      1260
          gagggcaacg tgttttcttg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaatca ttacacccag      1320
          aagagcctgt ctctgtccct gggc                                             1344
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-1122-IgG4的多肽鏈L1的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  642]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-1122-IgG4的多肽鏈L1的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          gagatcgtgc tgacccagtc tcctgccaca ctgagcctgt ctccaggaga gagggccacc        60
          ctgtcctgca gggcttccca gagcgtgtcc agctacctgg cctggtatca gcagaagcca       120
          ggccaggctc ccaggctgct gatctacgac gccagcaaca gagctaccgg catccccgct       180
          cgcttctctg gatccggaag cggcacagac tttaccctga caatctcttc cctggagcct       240
          gaggatttcg ccgtgtacta ttgtcagcag agatctaatt ggccccctac ctttggccag       300
          ggcacaaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgctcctt ccgtgttcat ctttccaccc       360
          tctgacgagc agctgaagtc tggcaccgct tccgtggtgt gcctgctgaa caacttctac       420
          ccacgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgctc tgcagtccgg caatagccag       480
          gagtctgtga cagagcagga ctccaaggat agcacctatt ctctgtcttc caccctgaca       540
          ctgtctaagg ccgattacga gaagcacaag gtgtatgctt gcgaggtgac acatcagggc       600
          ctgagctctc ccgtgaccaa gtccttcaac agaggcgagt gt                          642
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  456]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-1122-IgG4的多肽鏈H2的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Lys Glu 
                  115                 120                 125             
          Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro 
              130                 135                 140                 
          Ile Ser Arg His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Lys Asp Gln Thr 
                          165                 170                 175     
          Gln Lys Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Cys Gly Asp Arg Thr Phe 
                      180                 185                 190         
          Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr 
                  195                 200                 205             
          Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg 
              210                 215                 220                 
          Trp Glu Pro Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 
                          245                 250                 255     
          Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 
                      260                 265                 270         
          Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr 
                  275                 280                 285             
          Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 
              290                 295                 300                 
          Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 
                          325                 330                 335     
          Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 
                      340                 345                 350         
          Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met 
                  355                 360                 365             
          Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro 
              370                 375                 380                 
          Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 
          385                 390                 395                 400 
          Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 
                          405                 410                 415     
          Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val 
                      420                 425                 430         
          Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 
                  435                 440                 445             
          Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly 
              450                 455     
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  1371]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-1122-IgG4的多肽鏈H2的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          gaggtgcagc tggtggagtc tggaggagga ctggtgcagc caggaggaag cctgaggctg        60
          tcttgcgccg cttccggctt cacctttaac acatacgcca tgaattgggt gagacaggct       120
          cctggcaagg gactggagtg ggtggctagg atccggtcca agtacaacaa ttatgccacc       180
          tactatgctg acagcgtgaa ggatagattc accatcagcc gcgacgattc taagaacaca       240
          gcctatctgc agatgaacaa tctgaagacc gaggacacag ctatgtacta ttgcgtgagg       300
          cacggcaact tcggcaattc ttacgtgtcc tggtttgctt attggggcca gggcaccctg       360
          gtgacagtgt ccagcggcaa ggagaccctg cagagagctg acccccctaa gacccacgtg       420
          acacaccatc ccatctctag acatgaggcc acactgaggt gctgggctct gggcttctac       480
          cctgccgaga tcaccctgac atggcagcgc gacggcaagg atcagaccca gaagacagag       540
          ctggtggaga ccaggccttg cggcgatcgg acatttcaga agtgggctgc tgtggtggtg       600
          ccatccggag aggagcagag gtatacctgt cacgtgcagc atgagggcct gccaaagccc       660
          ctgacactgc ggtgggagcc aagcgagagc aagtacggac caccttgccc accatgtcca       720
          gctcctgagt tcctgggagg accatccgtg ttcctgtttc ctccaaagcc caaggacaca       780
          ctgatgatct ctcggacacc agaggtgacc tgcgtggtgg tggacgtgtc ccaggaggat       840
          cccgaggtgc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcacaatgc caagaccaag       900
          cccagagagg agcagtttaa ttccacatac cgcgtggtga gcgtgctgac cgtgctgcat       960
          caggattggc tgaacggcaa ggagtataag tgcaaggtga gcaataaggg cctgccttcc      1020
          agcatcgaga agaccatctc taaggctaag ggccagccta gggagccaca ggtgtgcaca      1080
          ctgcccccta gccaggagga gatgaccaag aaccaggtgt ccctgagctg tgccgtgaag      1140
          ggcttctacc ccagcgacat cgctgtggag tgggagtcta atggccagcc tgagaacaat      1200
          tataagacca caccacccgt gctggacagc gatggctctt tctttctggt gtctaggctg      1260
          acagtggata agtcccggtg gcaggagggc aacgtgtttt cttgttccgt gatgcatgag      1320
          gccctgcaca atcattacac ccagaagagc ctgtctctgt ccctgggctg a               1371
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  208]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-1122-IgG4的多肽鏈L2的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          Glu Leu Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Thr Ser Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Val 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 
                          85                  90                  95      
          Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ile Gln Arg 
                      100                 105                 110         
          Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Cys His Pro Ala Glu Asn Gly Lys 
                  115                 120                 125             
          Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile 
              130                 135                 140                 
          Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr 
                          165                 170                 175     
          Thr Arg Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn 
                      180                 185                 190         
          His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Gly Pro 
                  195                 200                 205             
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  624]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-1122-IgG4的多肽鏈L2的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          gagctggtgg tgacacagga gcctagcctg accacatctc caggcggcac cgtgacactg        60
          acctgcagat ccagcaccgg cgccgtgacc acatccaact acgctaattg ggtgcagcag       120
          aagccaggac aggctccaag gggactgatc ggaggaacaa acaagagggc tccaggaacc       180
          cctgctcggt tctctggatc cctgctggga ggcaaggccg ctctgacaat caccggagtg       240
          cagccagagg acgaggctga gtactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttt       300
          ggcggcggca caaagctgac cgtgctgatc cagagaaccc ccaagatcca ggtgtacagc       360
          tgccaccctg ccgagaacgg caagtctaac ttcctgaatt gttacgtgtc cggctttcat       420
          ccttccgaca tcgaggtgga tctgctgaag aatggcgagc gcatcgagaa ggtggagcac       480
          tccgacctgt ccttcagcaa ggattggagc ttttacctgc tgtactatac caggttcacc       540
          ccaacagaga aggacgagta tgcttgccgg gtgaaccatg tgacactgtc tcagccaaag       600
          atcgtgaagt gggatagggg cccc                                              624
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  452]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-1133-IgG4的多肽鏈H3的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ile Gln Arg 
                  115                 120                 125             
          Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Cys His Pro Ala Glu Asn Gly Lys 
              130                 135                 140                 
          Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His 
                          165                 170                 175     
          Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr 
                      180                 185                 190         
          Thr Arg Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Gly Pro 
              210                 215                 220                 
          Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 
                          245                 250                 255     
          Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 
                      260                 265                 270         
          Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 
                  275                 280                 285             
          Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 
              290                 295                 300                 
          Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 
                          325                 330                 335     
          Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 
                      340                 345                 350         
          Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 
                  355                 360                 365             
          Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 
              370                 375                 380                 
          Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu 
                          405                 410                 415     
          Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 
                      420                 425                 430         
          Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Leu Ser Leu Gly 
              450         
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  1359]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-1133-IgG4的多肽鏈H3的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          gaggtgcagc tggtggagtc tggaggagga ctggtgcagc caggaggaag cctgaggctg        60
          tcttgcgccg cttccggctt cacctttaac acatacgcca tgaattgggt gagacaggct       120
          cctggcaagg gactggagtg ggtggctagg atccggtcca agtacaacaa ttatgccacc       180
          tactatgctg acagcgtgaa ggatagattc accatcagcc gcgacgattc taagaacaca       240
          gcctatctgc agatgaacaa tctgaagacc gaggacacag ctatgtacta ttgcgtgagg       300
          cacggcaact tcggcaattc ttacgtgtcc tggtttgctt attggggcca gggcaccctg       360
          gtgacagtgt ccagcatcca gagaaccccc aagatccagg tgtacagctg ccaccctgcc       420
          gagaacggca agtctaactt cctgaattgt tacgtgtccg gctttcatcc ttccgacatc       480
          gaggtggatc tgctgaagaa tggcgagcgc atcgagaagg tggagcactc cgacctgtcc       540
          ttcagcaagg attggagctt ttacctgctg tactatacca ggttcacccc aacagagaag       600
          gacgagtatg cttgccgggt gaaccatgtg acactgtctc agccaaagat cgtgaagtgg       660
          gataggggcc ccgagagcaa gtacggacca ccttgcccac catgtccagc tcctgagttc       720
          ctgggaggac catccgtgtt cctgtttcct ccaaagccca aggacacact gatgatctct       780
          cggacaccag aggtgacctg cgtggtggtg gacgtgtccc aggaggatcc cgaggtgcag       840
          ttcaactggt acgtggatgg cgtggaggtg cacaatgcca agaccaagcc cagagaggag       900
          cagtttaatt ccacataccg cgtggtgagc gtgctgaccg tgctgcatca ggattggctg       960
          aacggcaagg agtataagtg caaggtgagc aataagggcc tgccttccag catcgagaag      1020
          accatctcta aggctaaggg ccagcctagg gagccacagg tgtgcacact gccccctagc      1080
          caggaggaga tgaccaagaa ccaggtgtcc ctgagctgtg ccgtgaaggg cttctacccc      1140
          agcgacatcg ctgtggagtg ggagtctaat ggccagcctg agaacaatta taagaccaca      1200
          ccacccgtgc tggacagcga tggctctttc tttctggtgt ctaggctgac agtggataag      1260
          tcccggtggc aggagggcaa cgtgttttct tgttccgtga tgcatgaggc cctgcacaat      1320
          cattacaccc agaagagcct gtctctgtcc ctgggctga                             1359
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  212]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-1133-IgG4的多肽鏈L3的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          Glu Leu Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Thr Ser Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Val 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 
                          85                  90                  95      
          Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Lys Glu 
                      100                 105                 110         
          Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro 
                  115                 120                 125             
          Ile Ser Arg His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr 
              130                 135                 140                 
          Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Lys Asp Gln Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Gln Lys Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Cys Gly Asp Arg Thr Phe 
                          165                 170                 175     
          Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr 
                      180                 185                 190         
          Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg 
                  195                 200                 205             
          Trp Glu Pro Ser 
              210         
          <![CDATA[<210>  17]]>
          <![CDATA[<211>  636]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-1133-IgG4的多肽鏈L3的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          gagctggtgg tgacacagga gcctagcctg accacatctc caggcggcac cgtgacactg        60
          acctgcagat ccagcaccgg cgccgtgacc acatccaact acgctaattg ggtgcagcag       120
          aagccaggac aggctccaag gggactgatc ggaggaacaa acaagagggc tccaggaacc       180
          cctgctcggt tctctggatc cctgctggga ggcaaggccg ctctgacaat caccggagtg       240
          cagccagagg acgaggctga gtactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttt       300
          ggcggcggca caaagctgac cgtgctgggc aaggagaccc tgcagagagc tgacccccct       360
          aagacccacg tgacacacca tcccatctct agacatgagg ccacactgag gtgctgggct       420
          ctgggcttct accctgccga gatcaccctg acatggcagc gcgacggcaa ggatcagacc       480
          cagaagacag agctggtgga gaccaggcct tgcggcgatc ggacatttca gaagtgggct       540
          gctgtggtgg tgccatccgg agaggagcag aggtatacct gtcacgtgca gcatgagggc       600
          ctgccaaagc ccctgacact gcggtgggag ccaagc                                 636
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  452]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-ccff-IgG1的Hc的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Asn Ser Phe 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 
              50                  55                  60                  
          Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Lys Asp Lys Ile Leu Trp Phe Gly Glu Pro Val Phe Asp Tyr Trp 
                      100                 105                 110         
          Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 
              130                 135                 140                 
          Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 
                          165                 170                 175     
          Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 
                      180                 185                 190         
          Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 
                  195                 200                 205             
          His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser 
              210                 215                 220                 
          Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 
                          245                 250                 255     
          Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 
                      260                 265                 270         
          His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 
                  275                 280                 285             
          Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 
              290                 295                 300                 
          Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 
                          325                 330                 335     
          Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 
                      340                 345                 350         
          Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val 
                  355                 360                 365             
          Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 
              370                 375                 380                 
          Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 
                          405                 410                 415     
          Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 
                      420                 425                 430         
          Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 
                  435                 440                 445             
          Ser Pro Gly Lys 
              450         
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  1356]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-ccff-IgG1的Hc的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          gaggtgcagc tgctggagag cggaggagga ctggtgcagc caggaggcag cctgagactg        60
          tcttgcgccg tgtccggctt cacctttaac agcttcgcca tgtcttgggt gcgccaggct       120
          cctggcaagg gactggagtg ggtgtctgcc atctctggat ccggaggagg aacatactat       180
          gctgactccg tgaagggcag gttcaccatc tcccgggata acagcaagaa tacactgtac       240
          ctgcagatga attctctgag ggccgaggac accgccgtgt acttttgtgc taaggataag       300
          atcctgtggt tcggcgagcc agtgtttgac tactggggcc agggcaccct ggtgacagtg       360
          tccagcgcct ctaccaaggg accatccgtg ttcccactgg ctccatccag caagtccacc       420
          agcggaggaa cagccgctct gggatgcctg gtgaaggact acttcccaga gcccgtgaca       480
          gtgagctgga actctggcgc cctgaccagc ggagtgcaca catttccagc tgtgctgcag       540
          tcttccggcc tgtactctct gagctctgtg gtgaccgtgc cctccagctc tctgggcacc       600
          cagacatata tctgcaacgt gaatcacaag ccaagcaata caaaggtgga caagaaggtg       660
          gagcccaagt cttgtgataa gacccataca tgcccccctt gtcctgctcc agaggctgct       720
          ggaggaccat ccgtgttcct gtttccaccc aagcctaagg acaccctgat gatctccagg       780
          acccccgagg tgacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aggatcctga ggtgaagttt       840
          aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcat aatgctaaga ccaagcctag ggaggagcag       900
          tacaacagca cctatcgggt ggtgtctgtg ctgacagtgc tgcaccagga ctggctgaac       960
          ggcaaggagt ataagtgtaa ggtgtctaat aaggccctgc ccgctcctat cgagaagacc      1020
          atctccaagg ccaagggcca gcctagagag ccacaggtgt acaccctgcc tccatgccgc      1080
          gacgagctga caaagaacca ggtgagcctg tggtgtctgg tgaagggctt ctatccttct      1140
          gatatcgctg tggagtggga gtccaatggc cagccagaga acaattacaa gaccacaccc      1200
          cctgtgctgg actccgatgg cagcttcttt ctgtattcca agctgaccgt ggataagagc      1260
          agatggcagc agggcaacgt gttttcttgt tccgtgatgc atgaggccct gcacaatcat      1320
          tatacacaga agagcctgtc tctgtcccca ggcaag                                1356
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-ccff-IgG1的Lc的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  642]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-ccff-IgG1的Lc的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          gagatcgtgc tgacccagtc tcctgccaca ctgagcctgt ctccaggaga gagggccacc        60
          ctgtcctgca gggcttccca gagcgtgtcc agctacctgg cctggtatca gcagaagcca       120
          ggccaggctc ccaggctgct gatctacgac gccagcaaca gagctaccgg catccccgct       180
          cgcttctctg gatccggaag cggcacagac tttaccctga caatctcttc cctggagcct       240
          gaggatttcg ccgtgtacta ttgtcagcag agatctaatt ggccccctac ctttggccag       300
          ggcacaaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgctcctt ccgtgttcat ctttccaccc       360
          tctgacgagc agctgaagtc tggcaccgct tccgtggtgt gcctgctgaa caacttctac       420
          ccacgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gataacgctc tgcagtccgg caatagccag       480
          gagtctgtga cagagcagga ctccaaggat agcacctatt ctctgtcttc caccctgaca       540
          ctgtctaagg ccgattacga gaagcacaag gtgtatgctt gcgaggtgac acatcagggc       600
          ctgagctctc ccgtgaccaa gtccttcaac agaggcgagt gt                          642
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  460]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-ccff-IgG1的Hf的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 
                  35                  40                  45              
          Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp 
              50                  55                  60                  
          Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr 
                          85                  90                  95      
          Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe 
                      100                 105                 110         
          Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Lys Glu 
                  115                 120                 125             
          Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro 
              130                 135                 140                 
          Ile Ser Arg His Glu Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Lys Asp Gln Thr 
                          165                 170                 175     
          Gln Lys Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro Cys Gly Asp Arg Thr Phe 
                      180                 185                 190         
          Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr 
                  195                 200                 205             
          Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg 
              210                 215                 220                 
          Trp Glu Pro Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 
                          245                 250                 255     
          Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 
                      260                 265                 270         
          Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 
                  275                 280                 285             
          Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 
              290                 295                 300                 
          Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 
          305                 310                 315                 320 
          Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 
                          325                 330                 335     
          Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 
                      340                 345                 350         
          Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg 
                  355                 360                 365             
          Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly 
              370                 375                 380                 
          Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 
                          405                 410                 415     
          Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 
                      420                 425                 430         
          Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg 
                  435                 440                 445             
          Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
              450                 455                 460 
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  1380]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-ccff-IgG1的Hf的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          gaggtgcagc tggtggagtc tggaggagga ctggtgcagc caggaggaag cctgaggctg        60
          tcttgcgccg cttccggctt cacctttaac acatacgcca tgaattgggt gagacaggct       120
          cctggcaagg gactggagtg ggtggctagg atccggtcca agtacaacaa ttatgccacc       180
          tactatgctg acagcgtgaa ggatagattc accatcagcc gcgacgattc taagaacaca       240
          gcctatctgc agatgaacaa tctgaagacc gaggacacag ctatgtacta ttgcgtgagg       300
          cacggcaact tcggcaattc ttacgtgtcc tggtttgctt attggggcca gggcaccctg       360
          gtgacagtgt ccagcggcaa ggagaccctg cagagagctg acccccctaa gacccacgtg       420
          acacaccatc ccatctctag acatgaggcc acactgaggt gctgggctct gggcttctac       480
          cctgccgaga tcaccctgac atggcagcgc gacggcaagg atcagaccca gaagacagag       540
          ctggtggaga ccaggccttg cggcgatcgg acatttcaga agtgggctgc tgtggtggtg       600
          ccatccggag aggagcagag gtatacctgt cacgtgcagc atgagggcct gccaaagccc       660
          ctgacactgc ggtgggagcc aagcgagcca aagtccagcg acaagaccca cacatgccca       720
          ccttgtccag ctccagaggc tgctggagga ccatccgtgt tcctgtttcc acccaagccc       780
          aaggataccc tgatgatctc taggaccccc gaggtgacat gcgtggtggt ggacgtgtcc       840
          cacgaggatc ctgaggtgaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc       900
          aagacaaagc ccagggagga gcagtacaac tctacctatc gggtggtgtc cgtgctgaca       960
          gtgctgcatc aggattggct gaacggcaag gagtataagt gtaaggtgag caataaggcc      1020
          ctgcctgctc caatcgagaa gaccatctct aaggctaagg gccagcccag agagcctcag      1080
          gtgtgcaccc tgcctccatc ccgcgacgag ctgacaaaga accaggtgtc tctgtcctgt      1140
          gccgtgaagg gcttttaccc ttccgatatc gctgtggagt gggagagcaa tggccagcca      1200
          gagaacaatt ataagaccac accccctgtg ctggactccg atggcagctt ctttctggtg      1260
          agcaagctga ccgtggacaa gtctaggtgg cagcagggca acgtgttcag ctgctctgtg      1320
          atgcacgagg ctctgcataa taggttcacc cagaagtccc tgagcctgtc tcccggcaag      1380
          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  208]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-ccff-IgG1的Lf的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Glu Leu Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Thr Ser Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser 
                      20                  25                  30          
          Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly 
                  35                  40                  45              
          Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Val 
          65                  70                  75                  80  
          Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn 
                          85                  90                  95      
          Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ile Gln Arg 
                      100                 105                 110         
          Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Cys His Pro Ala Glu Asn Gly Lys 
                  115                 120                 125             
          Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile 
              130                 135                 140                 
          Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr 
                          165                 170                 175     
          Thr Arg Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn 
                      180                 185                 190         
          His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Gly Pro 
                  195                 200                 205             
          <![CDATA[<210>  25]]>
          <![CDATA[<211>  624]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHI383-ccff-IgG1的Lf的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          gagctggtgg tgacacagga gcctagcctg accacatctc caggcggcac cgtgacactg        60
          acctgcagat ccagcaccgg cgccgtgacc acatccaact acgctaattg ggtgcagcag       120
          aagccaggac aggctccaag gggactgatc ggaggaacaa acaagagggc tccaggaacc       180
          cctgctcggt tctctggatc cctgctggga ggcaaggccg ctctgacaat caccggagtg       240
          cagccagagg acgaggctga gtactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttt       300
          ggcggcggca caaagctgac cgtgctgatc cagagaaccc ccaagatcca ggtgtacagc       360
          tgccaccctg ccgagaacgg caagtctaac ttcctgaatt gttacgtgtc cggctttcat       420
          ccttccgaca tcgaggtgga tctgctgaag aatggcgagc gcatcgagaa ggtggagcac       480
          tccgacctgt ccttcagcaa ggattggagc ttttacctgc tgtactatac caggttcacc       540
          ccaacagaga aggacgagta tgcttgccgg gtgaaccatg tgacactgtc tcagccaaag       600
          atcgtgaagt gggatagggg cccc                                              624
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  446]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈HZ5G11VH-CH1-IgG1的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Gly Val Ile Trp Arg Gly Val Thr Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Met Asn Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Leu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 
                      100                 105                 110         
          Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala 
                  115                 120                 125             
          Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 
              130                 135                 140                 
          Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser 
                          165                 170                 175     
          Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu 
                      180                 185                 190         
          Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 
                  195                 200                 205             
          Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 
              210                 215                 220                 
          Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 
                          245                 250                 255     
          Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 
                      260                 265                 270         
          Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 
                  275                 280                 285             
          Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 
              290                 295                 300                 
          Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 
                          325                 330                 335     
          Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 
                      340                 345                 350         
          Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 
                  355                 360                 365             
          Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 
              370                 375                 380                 
          Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 
                          405                 410                 415     
          Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 
                      420                 425                 430         
          Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
                  435                 440                 445     
          <![CDATA[<210>  27]]>
          <![CDATA[<211>  1338]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈HZ5G11VH-CH1-IgG1的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  27]]>
          caaatcactc taaaggaaag tggtccaact ctggtgaaac ccacccagac cctgacactg        60
          acctgtaccg tgtctggctt tagcctgtct acctacggcg tgcactggat cagacagcct       120
          cctggcaagg ccctcgagtg gctgggagtg atctggcggg gcgtgaccac cgactataat       180
          gctgccttca tgtcccggct gaccatcacc aaggacaact ccaagaacca agtggtgctg       240
          accatgaaca acatggatcc tgtggacaca gctacctact actgcgccag actgggcttc       300
          tacgccatgg actactgggg ccagggcacc ctggtcacag tgtcctctgc tagcacaaag       360
          ggcccttccg tgttcccact ggctccctct tccaagtcta catccggagg aaccgccgct       420
          ctgggatgcc tggtgaagga ttatttccca gagcccgtga ccgtgtcttg gaactccggc       480
          gccctgacaa gcggagtgca tacctttcct gctgtgctgc agagctctgg cctgtattct       540
          ctgtccagcg tggtgacagt gccatcttcc agcctgggca cccagacata catctgcaac       600
          gtgaatcaca agcctagcaa taccaaggtg gacaagaagg tggagccaaa gtcttgtgat       660
          aagacccata catgcccccc ttgtcctgct ccagagctgc tgggaggacc atccgtgttc       720
          ctgtttccac ccaagcccaa ggacaccctg atgatctccc gcacaccaga ggtgacctgc       780
          gtggtggtgg acgtgagcca cgaggatccc gaggtgaagt ttaactggta cgtggatggc       840
          gtggaggtgc ataatgctaa gaccaagcca agagaggagc agtataacag cacataccgc       900
          gtggtgtctg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc       960
          aaggtgtcta ataaggccct gcccgctcct atcgagaaga caatctccaa ggccaagggc      1020
          cagcctaggg agccacaggt gtataccctg cctccatctc gggacgagct gacaaagaac      1080
          caggtgtccc tgacctgtct ggtgaagggc ttctacccca gcgatatcgc tgtggagtgg      1140
          gagtctaatg gccagcctga gaacaattat aagaccacac cccctgtgct ggacagcgat      1200
          ggctctttct ttctgtactc taagctgaca gtggataagt ccaggtggca gcagggcaac      1260
          gtgtttagct gctctgtgat gcatgaggct ctgcacaatc attacaccca gaagtccctg      1320
          agcctgtctc ccggcaag                                                    1338
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          <![CDATA[<223>  輕鏈HZ5G11VL-IgK的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Tyr Ala Ala Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  642]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈HZ5G11VL-IgK的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          gatatccaaa tgactcaaag tccaagtagt ctgtccgctt ctgtcggcga cagagtgacc        60
          atcacctgta aggcctctca gtccgtgtcc aacgacgtgg cttggtacca gcagaagcct       120
          ggcaaggctc ctaagctgct gatctactac gccgccaacc ggtacaccgg cgtgcccgat       180
          agattctccg gctctggcta cggcaccgac ttcaccttta caatctccag cctgcagcct       240
          gaggatatcg ccacctactt ctgccagcag gactacacct ctccatatac cttcggccaa       300
          ggaacaaaac tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctcctt ccgtgttcat ctttccccct       360
          tccgatgagc agctgaagag cggcacagct tctgtggtgt gcctgctgaa caacttctac       420
          ccaagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgctc tgcagagcgg caattctcag       480
          gagtccgtga ccgagcagga cagcaaggat tctacatatt ccctgtccag caccctgaca       540
          ctgtccaagg ccgattacga gaagcacaag gtgtatgctt gcgaggtgac ccatcagggc       600
          ctgtcttccc ccgtgacaaa gagctttaat agaggcgagt gt                          642
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  451]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈HZ5G11VH-Cα-IgG1的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Gly Val Ile Trp Arg Gly Val Thr Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Met Asn Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Leu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 
                      100                 105                 110         
          Thr Val Ser Ser Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys 
                  115                 120                 125             
          Thr His Val Thr His His Pro Ile Ser Arg His Glu Ala Thr Leu Arg 
              130                 135                 140                 
          Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Arg Asp Gly Lys Asp Gln Thr Gln Lys Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Cys Gly Asp Arg Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu 
                  195                 200                 205             
          Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Glu Pro Lys Ser Cys 
              210                 215                 220                 
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                          245                 250                 255     
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                      260                 265                 270         
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                  275                 280                 285             
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
              290                 295                 300                 
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                      340                 345                 350         
          Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                  355                 360                 365             
          Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
              370                 375                 380                 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 
                          405                 410                 415     
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                      420                 425                 430         
          His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Gly Lys 
              450     
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  1353]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  重鏈HZ5G11VH-Cα-IgG1的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          caaatcactc taaaggaaag tggtccaact ctggtgaaac ccacccagac cctgacactg        60
          acctgtaccg tgtctggctt tagcctgtct acctacggcg tgcactggat cagacagcct       120
          cctggcaagg ccctcgagtg gctgggagtg atctggcggg gcgtgaccac cgactataat       180
          gctgccttca tgtcccggct gaccatcacc aaggacaact ccaagaacca agtggtgctg       240
          accatgaaca acatggatcc tgtggacaca gctacctact actgcgccag actgggcttc       300
          tacgccatgg actactgggg ccagggcacc ctggtcacag tgtcctctgg caaggagacc       360
          ctgcagagag ctgacccccc taagacccac gtgacacacc atcccatctc tagacatgag       420
          gccacactga ggtgctgggc tctgggcttc taccctgccg agatcaccct gacatggcag       480
          cgcgacggca aggatcagac ccagaagaca gagctggtgg agaccaggcc ttgcggcgat       540
          cggacatttc agaagtgggc tgctgtggtg gtgccatccg gagaggagca gaggtatacc       600
          tgtcacgtgc agcatgaggg cctgccaaag cccctgacac tgcggtggga gccaagcgag       660
          ccaaagtctt gtgataagac ccatacatgc cccccttgtc ctgctccaga gctgctggga       720
          ggaccatccg tgttcctgtt tccacccaag cccaaggaca ccctgatgat ctcccgcaca       780
          ccagaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg agccacgagg atcccgaggt gaagtttaac       840
          tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataat gctaagacca agccaagaga ggagcagtat       900
          aacagcacat accgcgtggt gtctgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc       960
          aaggagtaca agtgcaaggt gtctaataag gccctgcccg ctcctatcga gaagacaatc      1020
          tccaaggcca agggccagcc tagggagcca caggtgtata ccctgcctcc atctcgggac      1080
          gagctgacaa agaaccaggt gtccctgacc tgtctggtga agggcttcta ccccagcgat      1140
          atcgctgtgg agtgggagtc taatggccag cctgagaaca attataagac cacaccccct      1200
          gtgctggaca gcgatggctc tttctttctg tactctaagc tgacagtgga taagtccagg      1260
          tggcagcagg gcaacgtgtt tagctgctct gtgatgcatg aggctctgca caatcattac      1320
          acccagaagt ccctgagcct gtctcccggc aag                                   1353
          <![CDATA[<210>  32]]>
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          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈HZ5G11VL-Cβ的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Tyr Ala Ala Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ile Gln Arg Thr Pro 
                      100                 105                 110         
          Lys Ile Gln Val Tyr Ser Cys His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn 
                  115                 120                 125             
          Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val 
              130                 135                 140                 
          Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Arg 
                          165                 170                 175     
          Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val 
                      180                 185                 190         
          Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Gly Pro 
                  195                 200                 205     
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  618]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  輕鏈HZ5G11VL-Cβ的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          gatatccaaa tgactcaaag tccaagtagt ctgtccgctt ctgtcggcga cagagtgacc        60
          atcacctgta aggcctctca gtccgtgtcc aacgacgtgg cttggtacca gcagaagcct       120
          ggcaaggctc ctaagctgct gatctactac gccgccaacc ggtacaccgg cgtgcccgat       180
          agattctccg gctctggcta cggcaccgac ttcaccttta caatctccag cctgcagcct       240
          gaggatatcg ccacctactt ctgccagcag gactacacct ctccatatac cttcggccaa       300
          ggaacaaaac tggaaatcaa gatccagaga acccccaaga tccaggtgta cagctgccac       360
          cctgccgaga acggcaagtc taacttcctg aattgttacg tgtccggctt tcatccttcc       420
          gacatcgagg tggatctgct gaagaatggc gagcgcatcg agaaggtgga gcactccgac       480
          ctgtccttca gcaaggattg gagcttttac ctgctgtact ataccaggtt caccccaaca       540
          gagaaggacg agtatgcttg ccgggtgaac catgtgacac tgtctcagcc aaagatcgtg       600
          aagtgggata ggggcccc                                                     618
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  98]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<400>  34]]>
          Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 
          1               5                   10                  15      
          Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 
                      20                  25                  30          
          Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 
              50                  55                  60                  
          Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 
                          85                  90                  95      
          Lys Val 
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  IgK恆定區CL野生型胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
                      100                 105         
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HZ5G11VL-IgK-S114A的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
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          Tyr Tyr Ala Ala Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ala Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
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              130                 135                 140                 
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          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
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          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  37]]>
          gatatccaaa tgactcaaag tccaagtagt ctgtccgctt ctgtcggcga cagagtgacc        60
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          gaggatatcg ccacctactt ctgccagcag gactacacct ctccatatac cttcggccaa       300
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          ccaagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgctc tgcagagcgg caattctcag       480
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  38]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Tyr Ala Ala Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Ala Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
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          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
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          gaggatatcg ccacctactt ctgccagcag gactacacct ctccatatac cttcggccaa       300
          ggaacaaaac tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctcctt ccgtggccat ctttccccct       360
          tccgatgagc agctgaagag cggcacagct tctgtggtgt gcctgctgaa caacttctac       420
          ccaagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgctc tgcagagcgg caattctcag       480
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          ctgtcttccc ccgtgacaaa gagctttaat agaggcgagt gt                          642
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          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
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          Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Ala Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  642]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HZ5G11VL-IgK-F118A的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          gatatccaaa tgactcaaag tccaagtagt ctgtccgctt ctgtcggcga cagagtgacc        60
          atcacctgta aggcctctca gtccgtgtcc aacgacgtgg cttggtacca gcagaagcct       120
          ggcaaggctc ctaagctgct gatctactac gccgccaacc ggtacaccgg cgtgcccgat       180
          agattctccg gctctggcta cggcaccgac ttcaccttta caatctccag cctgcagcct       240
          gaggatatcg ccacctactt ctgccagcag gactacacct ctccatatac cttcggccaa       300
          ggaacaaaac tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctcctt ccgtgttcat cgctccccct       360
          tccgatgagc agctgaagag cggcacagct tctgtggtgt gcctgctgaa caacttctac       420
          ccaagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgctc tgcagagcgg caattctcag       480
          gagtccgtga ccgagcagga cagcaaggat tctacatatt ccctgtccag caccctgaca       540
          ctgtccaagg ccgattacga gaagcacaag gtgtatgctt gcgaggtgac ccatcagggc       600
          ctgtcttccc ccgtgacaaa gagctttaat agaggcgagt gt                          642
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HZ5G11VL-IgK-F118I的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Tyr Ala Ala Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Ile Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  642]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HZ5G11VL-IgK-F118I的核苷酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          gatatccaaa tgactcaaag tccaagtagt ctgtccgctt ctgtcggcga cagagtgacc        60
          atcacctgta aggcctctca gtccgtgtcc aacgacgtgg cttggtacca gcagaagcct       120
          ggcaaggctc ctaagctgct gatctactac gccgccaacc ggtacaccgg cgtgcccgat       180
          agattctccg gctctggcta cggcaccgac ttcaccttta caatctccag cctgcagcct       240
          gaggatatcg ccacctactt ctgccagcag gactacacct ctccatatac cttcggccaa       300
          ggaacaaaac tggaaatcaa gcgtacggtg gccgctcctt ccgtgttcat cattccccct       360
          tccgatgagc agctgaagag cggcacagct tctgtggtgt gcctgctgaa caacttctac       420
          ccaagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgctc tgcagagcgg caattctcag       480
          gagtccgtga ccgagcagga cagcaaggat tctacatatt ccctgtccag caccctgaca       540
          ctgtccaagg ccgattacga gaagcacaag gtgtatgctt gcgaggtgac ccatcagggc       600
          ctgtcttccc ccgtgacaaa gagctttaat agaggcgagt gt                          642
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  107]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  含F118A的CL結構域的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Ala Pro Pro Ser Asp Glu 
          1               5                   10                  15      
          Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 
                      20                  25                  30          
          Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 
                  35                  40                  45              
          Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 
              50                  55                  60                  
          Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 
                          85                  90                  95      
          Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
                      100                 105    
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  450]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HZ14A9VH-CH1-IgG1的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Asp 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Lys Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Gly Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Pro Gly Leu Arg Arg Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
              290                 295                 300                 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
          Gly Lys 
              450 
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HZ14A9VL-IgK的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ile Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Ser Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  455]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HZ14A9VH-Cα-IgG1的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Asp 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Lys Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Gly Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Pro Gly Leu Arg Arg Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala 
                  115                 120                 125             
          Asp Pro Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Ile Ser Arg His Glu 
              130                 135                 140                 
          Ala Thr Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Thr Trp Gln Arg Asp Gly Lys Asp Gln Thr Gln Lys Thr Glu Leu 
                          165                 170                 175     
          Val Glu Thr Arg Pro Cys Gly Asp Arg Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala 
                      180                 185                 190         
          Val Val Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln 
                  195                 200                 205             
          His Glu Gly Leu Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Glu 
              210                 215                 220                 
          Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 
                          245                 250                 255     
          Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 
                      260                 265                 270         
          Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 
                  275                 280                 285             
          Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 
              290                 295                 300                 
          Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 
                          325                 330                 335     
          Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 
                      340                 345                 350         
          Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 
                  355                 360                 365             
          Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 
              370                 375                 380                 
          Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 
          385                 390                 395                 400 
          Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 
                          405                 410                 415     
          Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 
                      420                 425                 430         
          Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 
                  435                 440                 445             
          Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 
              450                 455 
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  206]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  HZ14A9VL-Cβ的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ile Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Ser Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ile Gln Arg Thr Pro 
                      100                 105                 110         
          Lys Ile Gln Val Tyr Ser Cys His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn 
                  115                 120                 125             
          Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val 
              130                 135                 140                 
          Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Arg 
                          165                 170                 175     
          Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val 
                      180                 185                 190         
          Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Gly Pro 
                  195                 200                 205     
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  451]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHL147-3322-IgG1-wt/MHL147-3322-F118A的H2的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          Gln Ile Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln 
          1               5                   10                  15      
          Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr 
                      20                  25                  30          
          Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 
                  35                  40                  45              
          Gly Val Ile Trp Arg Gly Val Thr Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Met 
              50                  55                  60                  
          Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Val Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Thr Met Asn Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 
                          85                  90                  95      
          Arg Leu Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 
                      100                 105                 110         
          Thr Val Ser Ser Gly Lys Glu Thr Leu Gln Arg Ala Asp Pro Pro Lys 
                  115                 120                 125             
          Thr His Val Thr His His Pro Ile Ser Arg His Glu Ala Thr Leu Arg 
              130                 135                 140                 
          Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Arg Asp Gly Lys Asp Gln Thr Gln Lys Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg 
                          165                 170                 175     
          Pro Cys Gly Asp Arg Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu 
                  195                 200                 205             
          Pro Lys Pro Leu Thr Leu Arg Trp Glu Pro Ser Glu Pro Lys Ser Ser 
              210                 215                 220                 
          Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 
                          245                 250                 255     
          Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 
                      260                 265                 270         
          Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 
                  275                 280                 285             
          His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 
              290                 295                 300                 
          Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 
          305                 310                 315                 320 
          Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 
                          325                 330                 335     
          Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 
                      340                 345                 350         
          Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 
                  355                 360                 365             
          Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 
              370                 375                 380                 
          Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val 
                          405                 410                 415     
          Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 
                      420                 425                 430         
          His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 
                  435                 440                 445             
          Pro Gly Lys 
              450     
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  206]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHL147-3322-IgG1-wt/MHL147-3322-F118A的L2的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 
                      20                  25                  30          
          Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Tyr Ala Ala Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Tyr 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ile Gln Arg Thr Pro 
                      100                 105                 110         
          Lys Ile Gln Val Tyr Ser Cys His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn 
                  115                 120                 125             
          Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val 
              130                 135                 140                 
          Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Arg 
                          165                 170                 175     
          Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val 
                      180                 185                 190         
          Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp Arg Gly Pro 
                  195                 200                 205     
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  450]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHL147-3322-IgG1-wt/MHL147-3322-F118A的H3的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Glu Asp Asp 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 
                  35                  40                  45              
          Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Asp Lys Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 
              50                  55                  60                  
          Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Gly Asp Thr Ser Thr Asn Thr Val Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Pro Gly Leu Arg Arg Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 
                      100                 105                 110         
          Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 
                  115                 120                 125             
          Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 
              130                 135                 140                 
          Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 
                          165                 170                 175     
          Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 
                  195                 200                 205             
          Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 
              210                 215                 220                 
          Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 
                          245                 250                 255     
          Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 
                      260                 265                 270         
          Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 
                  275                 280                 285             
          Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 
              290                 295                 300                 
          Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 
                          325                 330                 335     
          Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 
                      340                 345                 350         
          Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 
              370                 375                 380                 
          Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 
          385                 390                 395                 400 
          Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 
                          405                 410                 415     
          Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 
                      420                 425                 430         
          Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 
                  435                 440                 445             
          Gly Lys 
              450 
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  MHL147-3322-F118A的L3的胺基酸序列]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ile Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Ser Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Ala Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210                 
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  214]]>
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          <![CDATA[<400>  53]]>
          Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 
          1               5                   10                  15      
          Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Ser Tyr 
                      20                  25                  30          
          Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 
                  35                  40                  45              
          Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ile Gly 
              50                  55                  60                  
          Ser Gly Ser Ser Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu 
                          85                  90                  95      
          Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 
                      100                 105                 110         
          Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 
              130                 135                 140                 
          Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 
                          165                 170                 175     
          Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 
                      180                 185                 190         
          Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 
                  195                 200                 205             
          Phe Asn Arg Gly Glu Cys 
              210
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Claims (17)

  1. 一種雙特異性抗體，其包含第一抗原結合部分和第二抗原結合部分，所述第一抗原結合部分和第二抗原結合部分特異性結合兩種不同抗原或同一種抗原的不同表位，其中所述第一抗原結合部分包含： 第一多肽，所述第一多肽自N端至C端包含第一重鏈可變結構域以及與所述第一重鏈可變結構域可操作連接的第一配對結構域；以及 第二多肽，所述第二多肽自N端至C端包含第一輕鏈可變結構域以及與所述第一輕鏈可變結構域可操作連接的第二配對結構域， 其中，所述第一配對結構域和所述第二配對結構域中的一個配對結構域包含工程化的HLA-I α3的胺基酸序列，另一個配對結構域包含工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列。
  2. 如請求項1所述的雙特異性抗體，其中所述第一配對結構域和所述第二配對結構域能夠形成二聚體，所述第一配對結構域和所述第二配對結構域之間能夠形成至少一個非天然鏈間鍵且所述非天然鏈間鍵能夠穩定所述二聚體。
  3. 如請求項1或請求項2所述的雙特異性抗體，其中所述第一配對結構域包含工程化的HLA-Iα3的胺基酸序列，所述第二配對結構域包含工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列；或， 所述第一配對結構域包含工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列，所述第二配對結構域包含工程化的HLA-Iα3的胺基酸序列。
  4. 如請求項1至請求項3中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述工程化的HLA-I α3的胺基酸序列與SEQ ID NO：1所示序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性，所述工程化的β2微球蛋白的胺基酸序列與SEQ ID NO：2所示序列具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的同一性。
  5. 如請求項1至請求項4中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述工程化的HLA-I α3包含在SEQ ID NO：1具有胺基酸取代的胺基酸序列，所述工程化的β2微球蛋白包含在SEQ ID NO：2具有胺基酸取代的胺基酸序列。
  6. 如請求項5所述的雙特異性抗體，其中工程化的HLA-I α3和工程化的β2微球蛋白中的所述胺基酸取代均包含發生在兩者接觸介面且能夠彼此形成二硫鍵的半胱胺酸殘基取代； 所述半胱胺酸殘基取代選自下組中的一對至多對： （1）SEQ ID NO：1中的R60C和SEQ ID NO：2中的Y26C； （2）SEQ ID NO：1中的A62C和SEQ ID NO：2中的R12C； （3）SEQ ID NO：1中的G63C和SEQ ID NO：2中的Y67C。
  7. 如請求項5至請求項6中任一項所述的雙特異性抗體，其中工程化的HLA-I α3或/和工程化的β2微球蛋白中的胺基酸取代包含提高配對結構域形成的二聚體或雙特異性抗體的等電點的胺基酸取代； 其中提高等電點的胺基酸取代包含：工程化的HLA-I α3在SEQ ID NO：1序列的E3、D22、E48、D53、E90、E101中的一個或幾個位置被正電胺基酸取代或/和 提高等電點的胺基酸取代包含：工程化的β2微球蛋白中在SEQ ID NO：2序列的E74、E47、E69、D34、E16、D53、E44、E50、E36中的一個或幾個位置被正電胺基酸取代；優選的， 提高等電點的胺基酸取代包含：所述工程化的HLA-I α3在SEQ ID NO：1序列包含胺基酸取代D22R、E48K和D53K，並且所述工程化的β2微球蛋白在SEQ ID NO：2序列包含胺基酸取代E69R。
  8. 如請求項1至請求項7中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述工程化的HLA-I α3包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，所述工程化的β2微球蛋白包含SEQ ID NO：4的胺基酸序列；或， 所述工程化的HLA-I α3包含SEQ ID NO：3的胺基酸序列，所述工程化的β2微球蛋白包含SEQ ID NO：5的胺基酸序列。
  9. 如請求項1至請求項8中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述第二抗原結合部分包含Fab；優選的， 根據EU編號，所述Fab的CL結構域在F118位置的胺基酸被丙胺酸取代。
  10. 如請求項1至請求項8中任一項所述的雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體為二價的。
  11. 如請求項1至請求項8中任一項所述的雙特異性抗體，其還包含第三抗原結合部分，所述第三抗原結合部分與所述第二抗原結合部分結合相同的抗原表位；或， 所述第三抗原結合部分與所述第一抗原結合部分結合相同的抗原表位。
  12. 如請求項10所述的雙特異性抗體，其中所述雙特異性抗體為三價的。
  13. 如請求項1至請求項10中任一項所述的雙特異性抗體，其進一步包含能夠穩定締合的兩個Fc多肽構成的Fc域。
  14. 如請求項13所述的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合部分在其C端與其中一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第二抗原結合部分在其C端與另一個Fc多肽的N端可操作性的連接；或， 所述第一抗原結合部分的所述第一多肽在其C端與其中一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第二抗原結合部分包含Fab，其Fab重鏈在其C端與另一個Fc多肽的N端可操作性的連接。
  15. 如請求項11至請求項12中任一項所述的雙特異性抗體，其進一步包含能夠穩定締合的兩個Fc多肽構成的Fc域。
  16. 如請求項15所述的雙特異性抗體，其中所述第一抗原結合部分在其C端與其中一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第二抗原結合部分在其C端與另一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第三抗原結合部分在其C端與所述第一抗原結合部分的N端或所述第二抗原結合部分的N端可操作性的連接；或， 所述第三抗原結合部分在其C端與其中一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第一抗原結合部分在其C端與所述第三抗原結合部分的N端可操作性的連接，所述第二抗原結合部分在其C端與另一個Fc多肽的N端可操作性的連接；或， 所述第三抗原結合部分在其C端與其中一個Fc多肽的N端可操作性的連接，所述第二抗原結合部分在其C端與所述第三抗原結合部分的N端可操作性的連接，所述第一抗原結合部分在其C端與另一個Fc多肽的N端可操作性的連接。
  17. 一種在有需要的受試者中治療疾病的方法，包括向受試者施用治療有效量的如請求項1至請求項16中任一項所述的雙特異性抗體；優選，所述疾病包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宮內膜癌、結腸癌、直腸癌、腎癌、膀胱癌、尿路上皮癌、肺癌、支氣管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、肝細胞癌、膽囊癌、膽管癌、食道癌、腎細胞癌、甲狀腺癌、頭頸癌、睾丸癌、內分泌腺癌、腎上腺癌、腦下垂體癌、皮膚癌、軟組織癌、血管癌、腦癌、神經癌、眼癌、腦膜癌、口咽癌、下嚥部癌、宮頸癌、子宮癌、成膠質細胞瘤、成神經管細胞瘤、星形細胞瘤、膠質瘤、腦膜瘤、胃泌素瘤、成神經細胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生異常綜合征或肉瘤。
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