JPH11230909A - 改良された化学発光法 - Google Patents
改良された化学発光法Info
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- JPH11230909A JPH11230909A JP5272098A JP5272098A JPH11230909A JP H11230909 A JPH11230909 A JP H11230909A JP 5272098 A JP5272098 A JP 5272098A JP 5272098 A JP5272098 A JP 5272098A JP H11230909 A JPH11230909 A JP H11230909A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 臨床検査薬などに応用可能なより高感度な化
学発光法を提供する。 【構成】 ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を含む検体
と、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合
物と酸化剤を化学発光増強剤の存在下発光反応させ、Ｐ
ＯＤを化学発光量により測定する化学発光法におい
て、ＰＯＤとは別のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の
存在下発光反応させることにより、発光量を増加させ
る。
学発光法を提供する。 【構成】 ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を含む検体
と、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合
物と酸化剤を化学発光増強剤の存在下発光反応させ、Ｐ
ＯＤを化学発光量により測定する化学発光法におい
て、ＰＯＤとは別のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の
存在下発光反応させることにより、発光量を増加させ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査薬などに応用
可能な、化学発光法と化学発光試薬およびそれらを用い
た酵素免疫測定法に関する。
可能な、化学発光法と化学発光試薬およびそれらを用い
た酵素免疫測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ペルオキシダーゼを含む溶液中で、化学
発光増強剤の存在下で、２，３−ジヒドロ−１，４−フ
タラジンジオン化合物と酸化剤を反応させる化学発光法
において、生じる発光量をより増加するために、界面活
性剤やタンパク質を共存する方法が知られている（公開
特許公報平６−２２７９５号、公開特許公報平６−２４
２１１１号など）。
発光増強剤の存在下で、２，３−ジヒドロ−１，４−フ
タラジンジオン化合物と酸化剤を反応させる化学発光法
において、生じる発光量をより増加するために、界面活
性剤やタンパク質を共存する方法が知られている（公開
特許公報平６−２２７９５号、公開特許公報平６−２４
２１１１号など）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
方法ではペルオキシダーゼ量と生じる発光量の関係を示
すグラフは、直線的な比例関係にならなかった。ペルオ
キシダーゼ量が増加すると発光量は徐々に増加し、ペル
オキシダーゼ量があるレベルを越えると対数的に発光量
は増加し、更にペルオキシダーゼ量が増すと初めて直線
比例的に発光量が増すようになる。従って、対数的な発
光量の増加を示す量より少ないペルオキシダーゼ量で
は、発光量が極端に低く、測定感度の向上が困難であっ
た。従来の方法は、発光量を増加する点では種々の改善
が行われてきたが、上記問題は未解決であった。
方法ではペルオキシダーゼ量と生じる発光量の関係を示
すグラフは、直線的な比例関係にならなかった。ペルオ
キシダーゼ量が増加すると発光量は徐々に増加し、ペル
オキシダーゼ量があるレベルを越えると対数的に発光量
は増加し、更にペルオキシダーゼ量が増すと初めて直線
比例的に発光量が増すようになる。従って、対数的な発
光量の増加を示す量より少ないペルオキシダーゼ量で
は、発光量が極端に低く、測定感度の向上が困難であっ
た。従来の方法は、発光量を増加する点では種々の改善
が行われてきたが、上記問題は未解決であった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するため鋭意検討した結果、定量するペルオキシダ
ーゼとは別のペルオキシダーゼの存在下で発光反応を行
う本発明に到達した。すなわち本発明は、ペルオキシダ
ーゼ（ＰＯＤ）を含む検体と、２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン化合物と酸化剤を化学発光増
強剤の存在下発光反応させ、ＰＯＤを化学発光量によ
り測定する化学発光法において、ＰＯＤとは別のペル
オキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在下発光反応させること
により、発光量を増加させることを特徴とする改良され
た化学発光法である。
解決するため鋭意検討した結果、定量するペルオキシダ
ーゼとは別のペルオキシダーゼの存在下で発光反応を行
う本発明に到達した。すなわち本発明は、ペルオキシダ
ーゼ（ＰＯＤ）を含む検体と、２，３−ジヒドロ−
１，４−フタラジンジオン化合物と酸化剤を化学発光増
強剤の存在下発光反応させ、ＰＯＤを化学発光量によ
り測定する化学発光法において、ＰＯＤとは別のペル
オキシダーゼ（ＰＯＤ）の存在下発光反応させること
により、発光量を増加させることを特徴とする改良され
た化学発光法である。
【０００５】本発明において、化学発光増強剤は従来公
知のものが使用できる。例えば、公開特許公報昭５９−
５００２５２号記載の化合物、公開特許公報昭５９−１
７１８３９号記載の化合物、公開特許公報平２−２９１
２９９号記載の化合物などが使用できる。これら文献に
記載の化合物のうち好ましいものは、フェノール誘導体
である。特に増強効果の高い、Ｐ−ヨードフェノール、
４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−シアノメチ
ルチオ−２−クロロフェノールが好ましい。
知のものが使用できる。例えば、公開特許公報昭５９−
５００２５２号記載の化合物、公開特許公報昭５９−１
７１８３９号記載の化合物、公開特許公報平２−２９１
２９９号記載の化合物などが使用できる。これら文献に
記載の化合物のうち好ましいものは、フェノール誘導体
である。特に増強効果の高い、Ｐ−ヨードフェノール、
４−（シアノメチルチオ）フェノール、４−シアノメチ
ルチオ−２−クロロフェノールが好ましい。
【０００６】本発明において、酸化剤としては、過酸化
水素、過ホウ酸ナトリウム、過ホウ酸カリウムなどが挙
げられる。これらのうち好ましいのは過酸化水素であ
る。
水素、過ホウ酸ナトリウム、過ホウ酸カリウムなどが挙
げられる。これらのうち好ましいのは過酸化水素であ
る。
【０００７】本発明において、２，３−ジヒドロ−１，
４−フタラジンジオン化合物としては、ルミノール、イ
ソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソル
ミノール（ＡＨＥＩ）およびＮ−アミノブチル−Ｎ−エ
チルイソルミノール（ＡＢＥＩ）が挙げられる。これら
のうち好ましいものは、ルミノール及びルミノールのナ
トリウム塩である。
４−フタラジンジオン化合物としては、ルミノール、イ
ソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソル
ミノール（ＡＨＥＩ）およびＮ−アミノブチル−Ｎ−エ
チルイソルミノール（ＡＢＥＩ）が挙げられる。これら
のうち好ましいものは、ルミノール及びルミノールのナ
トリウム塩である。
【０００８】本発明において、ＰＯＤとしては、西洋
ワサビ、微生物、牛乳、白血球などから抽出したペルオ
キシダーゼが挙げられる。これらのうち好ましいもの
は、西洋ワサビのペルオキシダーゼである。また、ＰＯ
Ｄは、遊離の状態であっても、ＰＯＤが、免疫測定
において用いられるような配位子（例えば、抗原、抗
体、ハプテン、プロテインＡ、アビジン、ビオチンな
ど）と結合した複合体の状態であってもよい。
ワサビ、微生物、牛乳、白血球などから抽出したペルオ
キシダーゼが挙げられる。これらのうち好ましいもの
は、西洋ワサビのペルオキシダーゼである。また、ＰＯ
Ｄは、遊離の状態であっても、ＰＯＤが、免疫測定
において用いられるような配位子（例えば、抗原、抗
体、ハプテン、プロテインＡ、アビジン、ビオチンな
ど）と結合した複合体の状態であってもよい。
【０００９】本発明において、ＰＯＤとしては、ＰＯ
Ｄと同様、西洋ワサビ、微生物、牛乳、白血球などか
ら抽出したペルオキシダーゼが挙げられ、西洋ワサビの
ペルオキシダーゼが好ましい。又、ＰＯＤは、検体中
のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）と同じ起源のものが好
ましい。すなわち、ＰＯＤが西洋ワサビのペルオキシ
ダーゼであれば、ＰＯＤも西洋ワサビのペルオキシダ
ーゼが好ましい。
Ｄと同様、西洋ワサビ、微生物、牛乳、白血球などか
ら抽出したペルオキシダーゼが挙げられ、西洋ワサビの
ペルオキシダーゼが好ましい。又、ＰＯＤは、検体中
のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）と同じ起源のものが好
ましい。すなわち、ＰＯＤが西洋ワサビのペルオキシ
ダーゼであれば、ＰＯＤも西洋ワサビのペルオキシダ
ーゼが好ましい。
【００１０】本発明の方法において、ＰＯＤの好適な
使用量は、ＰＯＤの量と化学発光量の関係が直線関係
もしくは直線に近い関係となるのに必要な量である。Ｐ
ＯＤの特に好適な使用量は、発光反応中に０．０５ｐ
ｇ〜２ｐｇの範囲の量で存在することである。ＰＯＤ
がこの範囲の量より少ないと、本発明の効果が低下し、
量が多いと本来測定したいＰＯＤ由来の発光の判別が
できなくなることがある。
使用量は、ＰＯＤの量と化学発光量の関係が直線関係
もしくは直線に近い関係となるのに必要な量である。Ｐ
ＯＤの特に好適な使用量は、発光反応中に０．０５ｐ
ｇ〜２ｐｇの範囲の量で存在することである。ＰＯＤ
がこの範囲の量より少ないと、本発明の効果が低下し、
量が多いと本来測定したいＰＯＤ由来の発光の判別が
できなくなることがある。
【００１１】ＰＯＤは、溶液中に遊離の状態で溶解さ
れたものでも良いが、ＰＯＤが、不溶性担体に結合さ
れたものがより好ましい。２，３−ジヒドロ−１，４−
フタラジンジオン化合物、酸化剤および化学発光増強剤
は通常２液の試薬として調整され、発光測定時に個別に
分注使用される。ＰＯＤが溶液の場合、分注する液が
３種となり煩雑な操作が要求される。不溶性担体に結合
された場合では、そのような煩雑さがない。
れたものでも良いが、ＰＯＤが、不溶性担体に結合さ
れたものがより好ましい。２，３−ジヒドロ−１，４−
フタラジンジオン化合物、酸化剤および化学発光増強剤
は通常２液の試薬として調整され、発光測定時に個別に
分注使用される。ＰＯＤが溶液の場合、分注する液が
３種となり煩雑な操作が要求される。不溶性担体に結合
された場合では、そのような煩雑さがない。
【００１２】又、ＰＯＤと、不溶性担体を用いた免疫
測定によって生成される反応物の場合、ＰＯＤは不溶
性担体に結合した形態を取っている。不溶性担体に結合
したペルオキシダーゼと遊離のペルオキシダーゼは、同
じペルオキシダーゼ量が存在しても発光反応で生じる発
光量は異なる場合がある。従って、ＰＯＤが不溶性担
体に結合した反応物である場合、ＰＯＤも不溶性担体
に結合したものが好ましい。
測定によって生成される反応物の場合、ＰＯＤは不溶
性担体に結合した形態を取っている。不溶性担体に結合
したペルオキシダーゼと遊離のペルオキシダーゼは、同
じペルオキシダーゼ量が存在しても発光反応で生じる発
光量は異なる場合がある。従って、ＰＯＤが不溶性担
体に結合した反応物である場合、ＰＯＤも不溶性担体
に結合したものが好ましい。
【００１３】不溶性担体は従来公知の物が使用できる。
すなわち、ポリスチレンなどの高分子で形成された、ビ
ーズ、チューブ、微粒子などである。又、ＰＯＤを不
溶性担体に結合させる方法は、従来公知の物理的又は化
学的方法の何れも使用でき、特に制限はない。
すなわち、ポリスチレンなどの高分子で形成された、ビ
ーズ、チューブ、微粒子などである。又、ＰＯＤを不
溶性担体に結合させる方法は、従来公知の物理的又は化
学的方法の何れも使用でき、特に制限はない。
【００１４】本発明においては、発光反応は、ＰＯＤ
、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合
物及び酸化剤を化学発光増強剤の存在下で行われる。こ
の反応は、アルカリ性の溶液中で行われることが好まし
く、特にｐＨ８〜１０が好適である。
、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合
物及び酸化剤を化学発光増強剤の存在下で行われる。こ
の反応は、アルカリ性の溶液中で行われることが好まし
く、特にｐＨ８〜１０が好適である。
【００１５】用いられる緩衝液は、前記のｐＨを満足す
るものであればどの様な種類の緩衝液を用いることも可
能であるが、リン酸緩衝液、グリシン／ＮａＯＨ緩衝
液、トリス／塩酸緩衝液、トリス／酢酸緩衝液、炭酸緩
衝液、バルビタール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝
液などが好ましいものとして挙げられる。
るものであればどの様な種類の緩衝液を用いることも可
能であるが、リン酸緩衝液、グリシン／ＮａＯＨ緩衝
液、トリス／塩酸緩衝液、トリス／酢酸緩衝液、炭酸緩
衝液、バルビタール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝
液などが好ましいものとして挙げられる。
【００１６】ＰＯＤを溶液状態で添加する場合は、添
加後も上記発光反応の際のｐＨの好ましい範囲８〜１０
に入るような溶液の状態で添加することが好ましい。
加後も上記発光反応の際のｐＨの好ましい範囲８〜１０
に入るような溶液の状態で添加することが好ましい。
【００１７】本発明に用いられる化学発光増強剤、２，
３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物、酸化
剤の各濃度は、用いる化合物の種類、測定法、条件によ
って最適濃度が設定されなければならない。通常、化学
発光増強剤は、１０-4〜１．０（Ｗ／Ｖ％）、２，３−
ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物は、１００
ｎｍｏｌ〜１ｍｏｌ／リットル、酸化剤は１００ｎｍｏ
ｌ〜１ｍｏｌ／リットルの範囲で、設定できる。
３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物、酸化
剤の各濃度は、用いる化合物の種類、測定法、条件によ
って最適濃度が設定されなければならない。通常、化学
発光増強剤は、１０-4〜１．０（Ｗ／Ｖ％）、２，３−
ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物は、１００
ｎｍｏｌ〜１ｍｏｌ／リットル、酸化剤は１００ｎｍｏ
ｌ〜１ｍｏｌ／リットルの範囲で、設定できる。
【００１８】本発明の化学発光法は、従来公知のペルオ
キシダーゼを利用した測定法と測定用キット、特に免疫
測定法と免疫測定用キットに使用することができる。
キシダーゼを利用した測定法と測定用キット、特に免疫
測定法と免疫測定用キットに使用することができる。
【００１９】ペルオキシダーゼを用いる酵素免疫測定法
については広く知られている。例えば、下記免疫測定法
１または２で生成される反応物中のペルオキシダーゼの
活性を測定する事で「測定対象物」を定量することがで
きる。 免疫測定法１：「測定対象物」、「測定対象物に対する
配位子を結合した不溶性担体」、「測定対象物質とペル
オキシダーゼの結合体」の反応物中の測定対象物質を測
定する免疫測定法 免疫測定法２：「測定対象物」、「測定対象物に対する
配位子を結合した不溶性担体」、「測定対象物質に対す
る配位子とペルオキシダーゼの結合体」の反応物質中の
測定対象物を測定する免疫測定法
については広く知られている。例えば、下記免疫測定法
１または２で生成される反応物中のペルオキシダーゼの
活性を測定する事で「測定対象物」を定量することがで
きる。 免疫測定法１：「測定対象物」、「測定対象物に対する
配位子を結合した不溶性担体」、「測定対象物質とペル
オキシダーゼの結合体」の反応物中の測定対象物質を測
定する免疫測定法 免疫測定法２：「測定対象物」、「測定対象物に対する
配位子を結合した不溶性担体」、「測定対象物質に対す
る配位子とペルオキシダーゼの結合体」の反応物質中の
測定対象物を測定する免疫測定法
【００２０】上記免疫測定法に用いられる配位子として
は、抗原、抗体、ハプテン、プロテインＡ、アビジン、
ビオチン、遺伝子断片など通常の免疫測定に使用されて
いる物が使用できる。従って、本発明は従来のペルオキ
シダーゼを用いる全ての化学発光酵素免疫測定法に適応
可能なものである。
は、抗原、抗体、ハプテン、プロテインＡ、アビジン、
ビオチン、遺伝子断片など通常の免疫測定に使用されて
いる物が使用できる。従って、本発明は従来のペルオキ
シダーゼを用いる全ての化学発光酵素免疫測定法に適応
可能なものである。
【００２１】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに説明する
が本発明はこれに限定されるものではない。
が本発明はこれに限定されるものではない。
【００２２】実施例１ 本実施例は、本発明による方法が、免疫測定による検量
線形状を直線化し、測定感度の向上を示すことを例示す
るものである。
線形状を直線化し、測定感度の向上を示すことを例示す
るものである。
【００２３】１）発光試薬Ａの調製 ルミノール（東京化成製）０．１８ｇおよび４−（シア
ノメチルチオ）フェノール０．１ｇを０．１Ｍ（モル／
ｌ）、ｐＨ８．５のトリス／塩酸緩衝液１リットルに溶
解した。使用するまで遮光、冷蔵保存した。 ２）発光試薬Ｂの調製 酸化剤としては、過酸化水素を用いた。２００μｌの３
５％過酸化水素水を脱イオン水１リットルに溶解し、発
光試薬Ｂとした。使用するまで冷蔵保存した。
ノメチルチオ）フェノール０．１ｇを０．１Ｍ（モル／
ｌ）、ｐＨ８．５のトリス／塩酸緩衝液１リットルに溶
解した。使用するまで遮光、冷蔵保存した。 ２）発光試薬Ｂの調製 酸化剤としては、過酸化水素を用いた。２００μｌの３
５％過酸化水素水を脱イオン水１リットルに溶解し、発
光試薬Ｂとした。使用するまで冷蔵保存した。
【００２４】３）ペルオキシダーゼ及び抗ＡＦＰポリク
ローナル抗体結合ビーズの調製 抗ＡＦＰポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製）をｐＨ９
の０．１Ｍ炭酸緩衝液に２０μｇ／ｍｌの濃度で溶解し
た。本溶液に、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋
紡製）を０〜１００ｐｇ／ｍｌの濃度で添加した。直径
６．４ｍｍのポリスチレンビーズを加え、４８時間反応
させたのち、０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝
液でコーティングし、凍結乾燥した。ビーズに結合した
ペルオキシダーゼ量は、ペルオキシダーゼ活性を測定し
算出した。
ローナル抗体結合ビーズの調製 抗ＡＦＰポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製）をｐＨ９
の０．１Ｍ炭酸緩衝液に２０μｇ／ｍｌの濃度で溶解し
た。本溶液に、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ（東洋
紡製）を０〜１００ｐｇ／ｍｌの濃度で添加した。直径
６．４ｍｍのポリスチレンビーズを加え、４８時間反応
させたのち、０．１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝
液でコーティングし、凍結乾燥した。ビーズに結合した
ペルオキシダーゼ量は、ペルオキシダーゼ活性を測定し
算出した。
【００２５】４）ペルオキシダーゼ結合抗ＡＦＰポリク
ローナル抗体の調製 抗ＡＦＰポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製）、西洋ワ
サビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡製）を用い、文献
［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、
エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２（１９８
２）１４１３−１４２４］に記載の方法でペルオキシダ
ーゼ結合抗ＡＦＰポリクローナル抗体を調製した。使用
時に１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液で希釈して
使用した。
ローナル抗体の調製 抗ＡＦＰポリクローナル抗体（ＤＡＫＯ社製）、西洋ワ
サビ由来ペルオキシダーゼ（東洋紡製）を用い、文献
［エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、
エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２（１９８
２）１４１３−１４２４］に記載の方法でペルオキシダ
ーゼ結合抗ＡＦＰポリクローナル抗体を調製した。使用
時に１％牛血清アルブミン含有リン酸緩衝液で希釈して
使用した。
【００２６】５）免疫反応用試薬と免疫反応操作 試験管中で、ＡＦＰを含むサンプル２０μｌと１％牛血
清アルブミン含有リン酸緩衝液３００μｌおよび「ペル
オキシダーゼ及び抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ビー
ズ」１個を３７℃、１時間反応した。ビーズを緩衝液で
洗浄後、ペルオキシダーゼ結合抗ＡＦＰポリクローナル
抗体液３００μｌを加え３７℃、１時間反応した。緩衝
液で洗浄後、酵素活性の測定を行った。
清アルブミン含有リン酸緩衝液３００μｌおよび「ペル
オキシダーゼ及び抗ＡＦＰポリクローナル抗体結合ビー
ズ」１個を３７℃、１時間反応した。ビーズを緩衝液で
洗浄後、ペルオキシダーゼ結合抗ＡＦＰポリクローナル
抗体液３００μｌを加え３７℃、１時間反応した。緩衝
液で洗浄後、酵素活性の測定を行った。
【００２７】６）発光測定操作 酵素活性の測定は、次のように行った。上記のビーズの
入った試験管（１２×７５ｍｍ）をアロカ社製ルミネッ
センスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホルダーに
セットし、発光試薬Ａ２００μｌおよび発光試薬Ｂ２０
０μｌを加え発光反応を開始した。発光反応開始から１
分間の発光量を計測した。
入った試験管（１２×７５ｍｍ）をアロカ社製ルミネッ
センスリーダーＢＬＲ−２０１型のサンプルホルダーに
セットし、発光試薬Ａ２００μｌおよび発光試薬Ｂ２０
０μｌを加え発光反応を開始した。発光反応開始から１
分間の発光量を計測した。
【００２８】７）測定結果 ペルオキシダーゼ結合量が０、０．１、１ｐｇの抗ＡＦ
Ｐポリクローナル抗体結合ビーズを用いて標準ＡＦＰ溶
液０〜４０ｎｇ／ｍｌを測定した場合の、ＡＦＰ濃度と
発光量の関係を表１に示した。図１は、ＡＦＰ濃度が１
０ｎｇ／ｍｌ以下の場合の、ＡＦＰ濃度と発光量の関係
を示す検量線である。 （１）はペルオキシダーゼ結合量が０ｐｇの抗ＡＦＰポ
リクローナル抗体結合ビーズを用いた場合の検量線、
（２）はペルオキシダーゼ結合量が０．１ｐｇの抗ＡＦ
Ｐポリクローナル抗体結合ビーズを用いた場合の検量
線、（３）はペルオキシダーゼ結合量が０．１ｐｇの抗
ＡＦＰポリクローナル抗体結合ビーズを用いた場合の検
量線である。図１のとおり、ペルオキシダーゼ結合量が
０ｐｇの場合、標準ＡＦＰ濃度５ｎｇ／ｍｌ以下では発
光量の増加が少なく、検出感度の低下が認められるが、
ペルオキシダーゼ結合量０．１及び１ｐｇの場合、発光
量は直線的に増加し、測定感度の向上が認められる。
Ｐポリクローナル抗体結合ビーズを用いて標準ＡＦＰ溶
液０〜４０ｎｇ／ｍｌを測定した場合の、ＡＦＰ濃度と
発光量の関係を表１に示した。図１は、ＡＦＰ濃度が１
０ｎｇ／ｍｌ以下の場合の、ＡＦＰ濃度と発光量の関係
を示す検量線である。 （１）はペルオキシダーゼ結合量が０ｐｇの抗ＡＦＰポ
リクローナル抗体結合ビーズを用いた場合の検量線、
（２）はペルオキシダーゼ結合量が０．１ｐｇの抗ＡＦ
Ｐポリクローナル抗体結合ビーズを用いた場合の検量
線、（３）はペルオキシダーゼ結合量が０．１ｐｇの抗
ＡＦＰポリクローナル抗体結合ビーズを用いた場合の検
量線である。図１のとおり、ペルオキシダーゼ結合量が
０ｐｇの場合、標準ＡＦＰ濃度５ｎｇ／ｍｌ以下では発
光量の増加が少なく、検出感度の低下が認められるが、
ペルオキシダーゼ結合量０．１及び１ｐｇの場合、発光
量は直線的に増加し、測定感度の向上が認められる。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【発明の効果】本発明によれば、化学発光によるペルオ
キシダーゼ定量法を、さらに発光量を増強および持続す
ることでより高感度にすることが可能となる。従って、
免疫測定法に適応した場合、より高感度な免疫測定が可
能となる。また、発光試薬を溶液状態で長期間安定に保
存可能であるため、測定時の試薬調製などを簡便化でき
ると共に、安定的な発光測定を可能とする。従って、本
発明を適応することで、より高感度で安定な免疫測定試
薬を作ることが可能である。
キシダーゼ定量法を、さらに発光量を増強および持続す
ることでより高感度にすることが可能となる。従って、
免疫測定法に適応した場合、より高感度な免疫測定が可
能となる。また、発光試薬を溶液状態で長期間安定に保
存可能であるため、測定時の試薬調製などを簡便化でき
ると共に、安定的な発光測定を可能とする。従って、本
発明を適応することで、より高感度で安定な免疫測定試
薬を作ることが可能である。
【図１】 実施例１におけるＡＦＰ濃度が１０ｎｇ／ｍ
ｌ以下の場合の、ＡＦＰ濃度と発光量の関係を示す検量
線である。
ｌ以下の場合の、ＡＦＰ濃度と発光量の関係を示す検量
線である。
（１）ペルオキシダーゼ結合量が０ｐｇの抗ＡＦＰポリ
クローナル抗体結合ビーズを用いた場合の検量線 （２）ペルオキシダーゼ結合量が０．１ｐｇの抗ＡＦＰ
ポリクローナル抗体結合ビーズを用いた場合の検量線 （３）ペルオキシダーゼ結合量が０．１ｐｇの抗ＡＦＰ
ポリクローナル抗体結合ビーズを用いた場合の検量線
クローナル抗体結合ビーズを用いた場合の検量線 （２）ペルオキシダーゼ結合量が０．１ｐｇの抗ＡＦＰ
ポリクローナル抗体結合ビーズを用いた場合の検量線 （３）ペルオキシダーゼ結合量が０．１ｐｇの抗ＡＦＰ
ポリクローナル抗体結合ビーズを用いた場合の検量線
Claims (7)
- 【請求項１】 ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）を含む検
体と、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化
合物と酸化剤を化学発光増強剤の存在下発光反応させ、
ＰＯＤを化学発光量により測定する化学発光法におい
て、ＰＯＤとは別のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）の
存在下発光反応させることにより、発光量を増加させる
ことを特徴とする改良された化学発光法。 - 【請求項２】 ＰＯＤの使用量が、ＰＯＤの量と化
学発光量の関係が直線関係もしくは直線に近い関係とな
るのに必要な量である請求項１記載の化学発光法。 - 【請求項３】 ＰＯＤを、発光反応中に０．０５ｐｇ
〜２ｐｇの範囲で存在させる請求項１または２記載の化
学発光法。 - 【請求項４】 ＰＯＤとして、ＰＯＤが不溶性担体
に結合したものを用いる請求項１〜３のいずれか記載の
化学発光法。 - 【請求項５】 ＰＯＤとＰＯＤが同じ起源のペルオ
キシダーゼである請求項１〜４のいずれか記載の化学発
光法。 - 【請求項６】 ＰＯＤを含む検体が、下記免疫測定法
１または２で生成する反応物である請求項１〜５のいず
れか記載の化学発光法。 免疫測定法１：「測定対象物」、「測定対象物に対する
配位子を結合した不溶性担体」、「測定対象物質とＰＯ
Ｄの結合体」の反応物中の測定対象物質を測定する免
疫測定法 免疫測定法２：「測定対象物」、「測定対象物に対する
配位子を結合した不溶性担体」、「測定対象物質に対す
る配位子とＰＯＤの結合体」の反応物質中の測定対象
物質を測定する免疫測定法 - 【請求項７】 免疫測定法１または２における「測定対
象物に対する配位子を結合した不溶性担体」が、さらに
ＰＯＤを結合させたものである請求項６記載の化学発
光法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5272098A JPH11230909A (ja) | 1998-02-17 | 1998-02-17 | 改良された化学発光法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5272098A JPH11230909A (ja) | 1998-02-17 | 1998-02-17 | 改良された化学発光法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11230909A true JPH11230909A (ja) | 1999-08-27 |
Family
ID=12922764
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5272098A Pending JPH11230909A (ja) | 1998-02-17 | 1998-02-17 | 改良された化学発光法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11230909A (ja) |
-
1998
- 1998-02-17 JP JP5272098A patent/JPH11230909A/ja active Pending
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