JP2000178550A - 新規化学発光試薬 - Google Patents
新規化学発光試薬Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ペルオキシダーゼ酵素量に依存して過酸
化物により化学発光し、ペルオキシダーゼ酵素活性の測
定が可能であり、ペルオキシダーゼ標識により各種物質
の検出及び定量分析等に利用できる新規化学発光試薬を
提供する。 【解決手段】 Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアク
リジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カル
ボン酸アミド化合物を主成分とするかまたはＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動
錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び特定
アミノアルコール化合物を主成分とし、ペルオキシダー
ゼ酵素量に依存して過酸化物により化学発光する新規化
学発光試薬。
化物により化学発光し、ペルオキシダーゼ酵素活性の測
定が可能であり、ペルオキシダーゼ標識により各種物質
の検出及び定量分析等に利用できる新規化学発光試薬を
提供する。 【解決手段】 Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアク
リジニウム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カル
ボン酸アミド化合物を主成分とするかまたはＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動
錯体、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び特定
アミノアルコール化合物を主成分とし、ペルオキシダー
ゼ酵素量に依存して過酸化物により化学発光する新規化
学発光試薬。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、制御された化学発
光が可能な化学発光試薬であり、化学発光分析による種
々の物質の検出及び定量等に用いられる化学発光試薬に
関する。
光が可能な化学発光試薬であり、化学発光分析による種
々の物質の検出及び定量等に用いられる化学発光試薬に
関する。
【０００２】
【従来の技術】化学発光試薬として、古くから用いられ
ているルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビ
スアクリジニウムジナイトレート）は、アルカリ性水溶
液中で微光を呈し、過酸化水素を加えると強く発光する
ことが知られており、種々の微量分析に利用されてい
る。しかしながら、ルシゲニンは過酸化水素とアルカリ
の存在で定量的に発光するので、過酸化水素の定量には
利用することができるが、この反応による発光を制御し
て発光量で酵素活性を測定する化学発光酵素免疫測定法
（以下、必要に応じ「ＣＬＥＩＡ」と略称する。）等に
は利用し難いと云う問題点がある。この問題点を解決す
る手段として、標識酵素にグルコースオキシダーゼを用
いて、グルコースの酸化反応により生成する過酸化水素
をアルカリ存在下にルシゲニンに作用させることによ
り、測定対象物質の濃度に依存した化学発光を行なう方
法等が行なわれている。
ているルシゲニン（Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビ
スアクリジニウムジナイトレート）は、アルカリ性水溶
液中で微光を呈し、過酸化水素を加えると強く発光する
ことが知られており、種々の微量分析に利用されてい
る。しかしながら、ルシゲニンは過酸化水素とアルカリ
の存在で定量的に発光するので、過酸化水素の定量には
利用することができるが、この反応による発光を制御し
て発光量で酵素活性を測定する化学発光酵素免疫測定法
（以下、必要に応じ「ＣＬＥＩＡ」と略称する。）等に
は利用し難いと云う問題点がある。この問題点を解決す
る手段として、標識酵素にグルコースオキシダーゼを用
いて、グルコースの酸化反応により生成する過酸化水素
をアルカリ存在下にルシゲニンに作用させることによ
り、測定対象物質の濃度に依存した化学発光を行なう方
法等が行なわれている。
【０００３】しかしながら、グルコースオキシダーゼを
標識酵素とするＣＬＥＩＡは、試薬の調製及び発光系の
操作が煩雑である。また、安定性にも優れ、取り扱いが
比較的に容易なペルオキシダーゼを標識酵素とするＣＬ
ＥＩＡに利用できる化学発光試薬としてルミノールが用
いられているが、発光促進剤を併用しても感度の点で必
ずしも充分とは云えない。従って、化学発光試薬の調製
及び発光系の操作が容易であり、かつ高感度測定が可能
な、ペルオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡに利
用できる化学発光試薬の開発が望まれていた。
標識酵素とするＣＬＥＩＡは、試薬の調製及び発光系の
操作が煩雑である。また、安定性にも優れ、取り扱いが
比較的に容易なペルオキシダーゼを標識酵素とするＣＬ
ＥＩＡに利用できる化学発光試薬としてルミノールが用
いられているが、発光促進剤を併用しても感度の点で必
ずしも充分とは云えない。従って、化学発光試薬の調製
及び発光系の操作が容易であり、かつ高感度測定が可能
な、ペルオキシダーゼを標識酵素とするＣＬＥＩＡに利
用できる化学発光試薬の開発が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、過酸
化水素等の過酸化物を基質とするペルオキシダーゼのモ
ル数に依存して化学発光する新規な化学発光試薬を提供
する。
化水素等の過酸化物を基質とするペルオキシダーゼのモ
ル数に依存して化学発光する新規な化学発光試薬を提供
する。
【０００５】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは、
上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、特
定のＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスジアクリジニウ
ム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボンアミ
ド化合物を含む混合物またはこれに特定のアミノアルコ
ール化合物を添加した混合物が、特定ｐＨ条件下におい
て、過酸化水素とは反応せず、過酸化水素とペルオキシ
ダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼのモル数に依存し
て化学発光することを見い出し、これらの知見に基づい
て本発明に到達したものである。従って、本発明の第一
は、下記一般式（１）
上記課題を達成するために鋭意検討を行なった結果、特
定のＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスジアクリジニウ
ム塩類の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジ置換カルボンアミ
ド化合物を含む混合物またはこれに特定のアミノアルコ
ール化合物を添加した混合物が、特定ｐＨ条件下におい
て、過酸化水素とは反応せず、過酸化水素とペルオキシ
ダーゼの存在下に、ペルオキシダーゼのモル数に依存し
て化学発光することを見い出し、これらの知見に基づい
て本発明に到達したものである。従って、本発明の第一
は、下記一般式（１）
【０００６】
【化４】 （上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、それぞ
れアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、それぞれ水素
原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリー
ロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互
いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｘ・は前駆体ビ
スアクリジニウム塩の対アニオンから電子が移動した残
基である酸ラジカルを示す。）で表わされるＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動
錯体、及び下記一般式（２）
れアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、それぞれ水素
原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリー
ロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互
いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｘ・は前駆体ビ
スアクリジニウム塩の対アニオンから電子が移動した残
基である酸ラジカルを示す。）で表わされるＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動
錯体、及び下記一般式（２）
【０００７】
【化５】 （上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数
１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基
及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択さ
れ、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、ア
ミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ
2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ
3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のア
ルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群
より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、
水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていて
もよく、また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合して、それ
ぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド
基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。）で表わ
されるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分
とする、ペルオキシダーゼ酵素量に依存して過酸化物に
より化学発光することを特徴とする化学発光試薬に関す
るものである。
１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基
及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択さ
れ、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、ア
ミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ
2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ
3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のア
ルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群
より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、
水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていて
もよく、また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合して、それ
ぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド
基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。）で表わ
されるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分
とする、ペルオキシダーゼ酵素量に依存して過酸化物に
より化学発光することを特徴とする化学発光試薬に関す
るものである。
【０００８】また、本発明の第二は、第一の発明の化学
発光試薬にアミノアルコール化合物を添加することによ
りペルオキシダーゼ酵素量に依存して過酸化物により化
学発光することを特徴とする化学発光試薬に関するもの
である。
発光試薬にアミノアルコール化合物を添加することによ
りペルオキシダーゼ酵素量に依存して過酸化物により化
学発光することを特徴とする化学発光試薬に関するもの
である。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下、本発明につき更に詳しく説
明する。第一の発明の化学発光試薬の主成分の一つであ
るＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩
類の電荷移動錯体は、次の一般式（１）
明する。第一の発明の化学発光試薬の主成分の一つであ
るＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩
類の電荷移動錯体は、次の一般式（１）
【００１０】
【化６】 で表わされる化合物である。
【００１１】上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2
は、それぞれアルキル基、アリール基及びハロゲン化ア
リール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は
異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロ
ゲン化アリール基は、それぞれ炭素数１〜２０を有する
ものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のも
のである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、
ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オク
チル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又
はこれらの分岐状アルキル基を挙げることができる。ま
た、アリール基は炭素数６〜２０のものが好ましく、例
えば、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げる
ことができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよ
い。アリール基としては、特にフェニル基が好ましい。
ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、
ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げる
ことができ、特にクロロフェニル基が好ましい。
は、それぞれアルキル基、アリール基及びハロゲン化ア
リール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は
異なるものでもよい。アルキル基、アリール基及びハロ
ゲン化アリール基は、それぞれ炭素数１〜２０を有する
ものであり、好ましいアルキル基は炭素数１〜１０のも
のである。例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、
ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オク
チル基、ノニル基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又
はこれらの分岐状アルキル基を挙げることができる。ま
た、アリール基は炭素数６〜２０のものが好ましく、例
えば、フェニル基、トリール基、キシリル基等を挙げる
ことができ、さらにアルキル基で置換されたものでもよ
い。アリール基としては、特にフェニル基が好ましい。
ハロゲン化アリール基としてはハロゲン化フェニル基、
ハロゲン化トリル基、ハロゲン化キシリル基等を挙げる
ことができ、特にクロロフェニル基が好ましい。
【００１２】一般式（１）において、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5
及びＲ6 は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール
基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２
０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。
例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル
基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリ
ーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロ
キシ基にはアルキル基が置換されたものでもよい。ま
た、一般式（１）において、Ｘ・は前駆体ビスアクリジ
ニウム塩の対アニオンから電子が移動した残基である酸
ラジカルを示す。
及びＲ6 は、それぞれ水素原子、アルキル基、アリール
基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でよい。これらの炭化水素基としては、炭素数１〜２
０、好ましくは１〜１０のものを挙げることができる。
例えば、炭素数１〜２０の直鎖状又は分岐状アルキル
基、アルコキシ基、炭素数６〜２０のアリール基、アリ
ーロキシ基を挙げることができ、アリール基、アリーロ
キシ基にはアルキル基が置換されたものでもよい。ま
た、一般式（１）において、Ｘ・は前駆体ビスアクリジ
ニウム塩の対アニオンから電子が移動した残基である酸
ラジカルを示す。
【００１３】Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩類の電荷移動錯体は、紫外吸収スペクトルに
おける５５０ｎｍ付近に出現する極大を有する巾広い吸
収帯を分光光度計を用いて測定することができる。上記
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
の電荷移動錯体の具体的な例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメ
チル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ
エチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−
ジプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，
Ｎ’−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム
塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクリジニウ
ム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスア
クリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−
９，９’−ビスアクリジニウム塩等の電荷移動錯体が挙
げられるが、これらのなかで、特にＮ，Ｎ’−ジメチル
−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシ
ゲニン）の電荷移動錯体が好適に用いられる。
ジニウム塩類の電荷移動錯体は、紫外吸収スペクトルに
おける５５０ｎｍ付近に出現する極大を有する巾広い吸
収帯を分光光度計を用いて測定することができる。上記
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
の電荷移動錯体の具体的な例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメ
チル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ
エチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−
ジプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，
Ｎ’−ジイソプロピル−９，９’−ビスアクリジニウム
塩、Ｎ，Ｎ’−ジブチル−９，９’−ビスアクリジニウ
ム塩、Ｎ，Ｎ’−ジイソブチル−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスア
クリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−
９，９’−ビスアクリジニウム塩等の電荷移動錯体が挙
げられるが、これらのなかで、特にＮ，Ｎ’−ジメチル
−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシ
ゲニン）の電荷移動錯体が好適に用いられる。
【００１４】Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリ
ジニウム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の対イオン
としては、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、硝酸
イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン及びカ
ルボン酸イオン等が非限定的に挙げられる。第一の発明
の化学発光試薬の主成分の一つであるＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物は、次の一般式（２）
ジニウム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の対イオン
としては、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、硝酸
イオン、炭酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン及びカ
ルボン酸イオン等が非限定的に挙げられる。第一の発明
の化学発光試薬の主成分の一つであるＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物は、次の一般式（２）
【００１５】
【化７】 で表わされる化合物である。
【００１６】上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原
子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のア
ルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群
より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、
水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていて
もよい。Ｒ2 はメチル基及びエチル基からなる群より選
択され、Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２
〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基
からなる群より選択される。該アリール基はアルキル
基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で
置換されていてもよい。また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに
結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素
原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していても
よい。
子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のア
ルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群
より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、
水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されていて
もよい。Ｒ2 はメチル基及びエチル基からなる群より選
択され、Ｒ3 は炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２
〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基
からなる群より選択される。該アリール基はアルキル
基、ニトロ基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で
置換されていてもよい。また、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに
結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素
原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していても
よい。
【００１７】上記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合
物の具体的な例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル
アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロ
リドン等を非限定的に挙げることができる。第二の発明
に関する化学発光試薬の成分の一つであるアミノアルコ
ール化合物は、次の一般式（３）
物の具体的な例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル
アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロ
リドン等を非限定的に挙げることができる。第二の発明
に関する化学発光試薬の成分の一つであるアミノアルコ
ール化合物は、次の一般式（３）
【００１８】
【化８】 で表わされる化合物である。
【００１９】上記一般式（３）において、Ｒは炭素数１
〜５の二価の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは１〜３の整
数を表わす。上記アミノアルコール化合物の具体的な例
としては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミ
ン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミ
ン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノール
アミン等を非限定的に挙げることができる。
〜５の二価の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは１〜３の整
数を表わす。上記アミノアルコール化合物の具体的な例
としては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミ
ン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミ
ン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノール
アミン等を非限定的に挙げることができる。
【００２０】第一の発明になる化学発光試薬は、Ｎ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電
荷移動錯体及び特定のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド
化合物を必須成分とするものであるが、その成分の一つ
であるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウ
ム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるＮ，Ｎ’−ジ置換
−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、もう一つの成
分であるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在
下において自然光等により容易に電荷移動錯体に転化す
る現象が認められる。また、このＮ，Ｎ−ジ置換カルボ
ン酸アミド化合物は、生成した電荷移動錯体のラジカル
の安定性にも寄与していると考えられ、求核性の弱い酸
からなるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニ
ウム塩類の電荷移動錯体の形成及び安定化の必須成分と
して作用している。また、第一の発明になる化学発光試
薬に対し特定のアミノアルコール化合物を添加すること
により得られる第二の発明になる化学発光試薬におい
て、このアミノアルコール化合物を添加することによ
り、発光反応のブランク値を低下させると共に、より廣
いペルオキシダーゼ濃度範囲において安定した化学発光
反応を実現することが可能になる。このアミノアルコー
ル化合物の添加効果については必ずしもはっきりはして
いないが、対イオンからアクリジン環への電荷移動に関
与してその反応を促進すると共に、生成する電荷移動錯
体の有するラジカルを一層安定化して発光反応時におけ
る溶存酸素との反応を阻止してブランク値を高める要因
を排除することにより、ブランク値の低い安定した高感
度測定を可能にしているものと考えられる。
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電
荷移動錯体及び特定のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド
化合物を必須成分とするものであるが、その成分の一つ
であるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウ
ム塩類の電荷移動錯体の前駆体であるＮ，Ｎ’−ジ置換
−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、もう一つの成
分であるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在
下において自然光等により容易に電荷移動錯体に転化す
る現象が認められる。また、このＮ，Ｎ−ジ置換カルボ
ン酸アミド化合物は、生成した電荷移動錯体のラジカル
の安定性にも寄与していると考えられ、求核性の弱い酸
からなるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニ
ウム塩類の電荷移動錯体の形成及び安定化の必須成分と
して作用している。また、第一の発明になる化学発光試
薬に対し特定のアミノアルコール化合物を添加すること
により得られる第二の発明になる化学発光試薬におい
て、このアミノアルコール化合物を添加することによ
り、発光反応のブランク値を低下させると共に、より廣
いペルオキシダーゼ濃度範囲において安定した化学発光
反応を実現することが可能になる。このアミノアルコー
ル化合物の添加効果については必ずしもはっきりはして
いないが、対イオンからアクリジン環への電荷移動に関
与してその反応を促進すると共に、生成する電荷移動錯
体の有するラジカルを一層安定化して発光反応時におけ
る溶存酸素との反応を阻止してブランク値を高める要因
を排除することにより、ブランク値の低い安定した高感
度測定を可能にしているものと考えられる。
【００２１】本発明の化学発光試薬の製造方法は任意で
あるが、第一の発明の化学発光試薬の調製は、Ｎ，Ｎ’
−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を等モル
以上のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物と混合し
て自然光の下に放置することにより得られるが、電荷移
動錯体の生成は光により触媒されるので、光照射下に反
応を行なうのが好ましい。この光照射に用いる光源とし
ては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可
視部が用いられ、特に約４００〜８００ｎｍの範囲の可
視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、
低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的
に用いることができるが、白熱電灯が好ましく用いられ
る。
あるが、第一の発明の化学発光試薬の調製は、Ｎ，Ｎ’
−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類を等モル
以上のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物と混合し
て自然光の下に放置することにより得られるが、電荷移
動錯体の生成は光により触媒されるので、光照射下に反
応を行なうのが好ましい。この光照射に用いる光源とし
ては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可
視部が用いられ、特に約４００〜８００ｎｍの範囲の可
視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、
低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的
に用いることができるが、白熱電灯が好ましく用いられ
る。
【００２２】また、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビス
アクリジニウム塩類の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物との混合比は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換
−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に
対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を１〜１
万倍モル、好ましくは１〜５千倍モルの割合で採用する
ことができる。
アクリジニウム塩類の電荷移動錯体とＮ，Ｎ−ジ置換カ
ルボン酸アミド化合物との混合比は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換
−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動錯体に
対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を１〜１
万倍モル、好ましくは１〜５千倍モルの割合で採用する
ことができる。
【００２３】第二の発明になる化学発光試薬は、第一の
発明の化学発光試薬に特定のアミノアルコール化合物を
添加すことにより得られるが、その添加はＮ，Ｎ’−ジ
置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動反
応時及び／又は反応後でよいが、電荷移動反応後に添加
するのが好ましい。尚、ここで、電荷移動反応時の添加
には電荷移動反応前の添加も含む。アミノアルコール化
合物の添加量は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の電荷移動錯体に対して１〜１万倍モ
ル、好ましくは１〜２千倍モルでよい。
発明の化学発光試薬に特定のアミノアルコール化合物を
添加すことにより得られるが、その添加はＮ，Ｎ’−ジ
置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動反
応時及び／又は反応後でよいが、電荷移動反応後に添加
するのが好ましい。尚、ここで、電荷移動反応時の添加
には電荷移動反応前の添加も含む。アミノアルコール化
合物の添加量は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の電荷移動錯体に対して１〜１万倍モ
ル、好ましくは１〜２千倍モルでよい。
【００２４】本発明の新規化学発光試薬は、ｐＨ７．５
〜１３の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存
在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する
という特性を有する。
〜１３の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存
在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する
という特性を有する。
【００２５】この発光は、フェノール性化合物等の発光
促進剤を添加することによって増強することが認められ
る。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒド
ロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−ク
ロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニ
ル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノー
ル、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ
−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ
−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナ
フトール、ホタルルシフェリン等を非限定的に挙げるこ
とができる。
促進剤を添加することによって増強することが認められ
る。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒド
ロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−ク
ロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニ
ル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノー
ル、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ
−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ
−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナ
フトール、ホタルルシフェリン等を非限定的に挙げるこ
とができる。
【００２６】上記新規化学発光試薬を用いて化学発光分
析を行なう場合には、化学発光試薬は１０-8〜１Ｍ、好
ましくは１０-6〜１０-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、そ
の使用量は１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００
μｌの範囲で採用される。また、発光促進剤の使用量
は、化学発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましく
は０．１〜１０倍モルの範囲であり、その濃度として
は、１０-6〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲
でよい。
析を行なう場合には、化学発光試薬は１０-8〜１Ｍ、好
ましくは１０-6〜１０-2Ｍの範囲の濃度で用いられ、そ
の使用量は１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００
μｌの範囲で採用される。また、発光促進剤の使用量
は、化学発光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましく
は０．１〜１０倍モルの範囲であり、その濃度として
は、１０-6〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲
でよい。
【００２７】また、化学発光反応に用いる過酸化物は、
無機過酸化物及び有機過酸化物を任意に選択できるが、
特に過酸化水素が好ましい。過酸化物は、化学発光試薬
に対して充分に過剰な量が必要であり、その使用量とし
ては、化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ましく
は１０〜１０００倍モルの範囲が採用される。また、ペ
ルオキシダーゼを標識物質として抗体、核酸等を標識し
て種々の物質を定量する場合には、特に限定されるもの
ではないが、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
無機過酸化物及び有機過酸化物を任意に選択できるが、
特に過酸化水素が好ましい。過酸化物は、化学発光試薬
に対して充分に過剰な量が必要であり、その使用量とし
ては、化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、好ましく
は１０〜１０００倍モルの範囲が採用される。また、ペ
ルオキシダーゼを標識物質として抗体、核酸等を標識し
て種々の物質を定量する場合には、特に限定されるもの
ではないが、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
【００２８】化学発光反応に用いる塩基性緩衝液として
は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸
緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に
挙げることができる。これらの緩衝液の濃度としては、
１ｍＭ〜１Ｍの範囲が好ましい。また、反応時に界面活
性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることもでき
る。
は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝液、炭酸
緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に
挙げることができる。これらの緩衝液の濃度としては、
１ｍＭ〜１Ｍの範囲が好ましい。また、反応時に界面活
性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることもでき
る。
【００２９】
【実施例】以下、実施例等を示し、本発明を具体的に説
明するが、本発明は実施例等により限定されるものでは
ない。
明するが、本発明は実施例等により限定されるものでは
ない。
【００３０】［実施例１］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
沃化水素酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセ
トアミドを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モル
の固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌する
ことにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反
応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレータ
ーを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固さ
せ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物
を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を
得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に
９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してか
ら、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾
燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，
９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の
収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採
り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加え
て溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコ
ピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメ
チル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の
電荷移動錯体を含有する化学発光試薬を得た。尚、電荷
移動錯体の生成は、紫外吸収スペクトルにおける５５０
ｎｍ付近に極大をもつ幅広い吸収帯の出現を分光光度計
を用いる方法により測定して確認した。
沃化水素酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセ
トアミドを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モル
の固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌する
ことにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反
応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレータ
ーを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固さ
せ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物
を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を
得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に
９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してか
ら、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾
燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，
９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の
収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採
り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加え
て溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコ
ピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメ
チル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩の
電荷移動錯体を含有する化学発光試薬を得た。尚、電荷
移動錯体の生成は、紫外吸収スペクトルにおける５５０
ｎｍ付近に極大をもつ幅広い吸収帯の出現を分光光度計
を用いる方法により測定して確認した。
【００３１】［実施例１−１］ペルオキシダーゼ活性の測定方法 実施例１で調製した化学発光試薬５０μｌを採り、これ
を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混
合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノール
を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μ
ｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。ま
た、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水
準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ
ずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試
薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００
μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノ
メーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００
Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表１に示すような発光
強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍ
ｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH8.4) ２．９５ｍｌと混
合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノール
を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μ
ｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。ま
た、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水
準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ
ずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試
薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００
μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノ
メーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００
Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表１に示すような発光
強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍ
ｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
【００３２】
【表１】
【００３３】［実施例２］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
塩酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ドを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モル
の固体の塩化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌する
ことにより橙赤色沈殿が生成した。この橙赤色沈殿を含
む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレ
ーターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾
固させ、橙赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して
副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生
成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮
光下に９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻
してから、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾
別、乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−
９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩を約７５％の収
率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採
り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１ｍｌを加え
て溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコ
ピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメ
チル−９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩の電荷移
動錯体を含有する化学発光試薬を得た。
塩酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミ
ドを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モル
の固体の塩化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌する
ことにより橙赤色沈殿が生成した。この橙赤色沈殿を含
む反応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレ
ーターを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾
固させ、橙赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して
副生物を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生
成物を得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮
光下に９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻
してから、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾
別、乾燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−
９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩を約７５％の収
率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採
り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１ｍｌを加え
て溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコ
ピーランプを７時間照射することによりＮ，Ｎ’−ジメ
チル−９，９’−ビスアクリジニウムジ塩酸塩の電荷移
動錯体を含有する化学発光試薬を得た。
【００３４】［実施例２−１］ペルオキシダーゼ活性の測定方法 実施例２で調製した化学発光試薬５０μｌを採り、これ
を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ２．９５ｍｌと混
合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノール
を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μ
ｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。ま
た、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水
準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ
ずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試
薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００
μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノ
メーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００
Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表２に示すような発光
強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍ
ｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ２．９５ｍｌと混
合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノール
を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μ
ｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。ま
た、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水
準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ
ずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試
薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００
μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノ
メーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００
Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表２に示すような発光
強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍ
ｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
【００３５】
【表２】
【００３６】［実施例３］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
硝酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ドを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３
０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間
照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビ
スアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体を含有する化
学発光試薬を得た。
硝酸塩の電荷移動錯体及びＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミ
ドを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３
０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間
照射することによりＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビ
スアクリジニウムジ硝酸塩の電荷移動錯体を含有する化
学発光試薬を得た。
【００３７】［実施例３−１］ペルオキシダーゼ活性の測定方法 実施例３で調製した上記化学発光試薬５０μｌを採り、
これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ２．９５ｍｌ
と混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノ
ールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μ
ｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。ま
た、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水
準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ
ずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試
薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００
μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノ
メーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００
Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表３に示すような発光
強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍ
ｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
これを０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ２．９５ｍｌ
と混合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノ
ールの０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μ
ｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。ま
た、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水
準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ
ずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試
薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００
μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノ
メーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００
Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表３に示すような発光
強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍ
ｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
【００３８】
【表３】
【００３９】［実施例４］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
沃化水素酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセト
アミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の
調製 ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モル
の固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌する
ことにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反
応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレータ
ーを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固さ
せ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物
を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を
得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に
９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してか
ら、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾
燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，
９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の
収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採
り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加え
て溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコ
ピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミ
ン０．５ｍｌを添加し混合することによりＮ，Ｎ’−ジ
メチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩
の電荷移動錯体及びトリエタノールアミンを含有する化
学発光試薬を得た。
沃化水素酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセト
アミド及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の
調製 ルシゲニンの１×１０-2モル／ｌの水溶液に、２倍モル
の固体の沃化カリウムを添加し、室温で１時間攪拌する
ことにより赤色沈殿が生成した。この赤色沈殿を含む反
応液をナス型フラスコに入れ、ロータリーエバポレータ
ーを用いて減圧下に６０℃で溶媒の水を蒸発して乾固さ
せ、赤色沈殿からなる残渣をベンゼンで洗浄して副生物
を除去し、ベンゼン不溶分を濾別し乾燥して粗生成物を
得た。次に、この粗生成物に少量の水を加え、遮光下に
９５℃の湯浴上で加熱して溶解した後、室温に戻してか
ら、更に、４℃に冷却放置し、生成した沈殿を濾別、乾
燥して未反応物を除去してＮ，Ｎ’−ジメチル−９，
９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩を約７０％の
収率で得た。次に、この化合物１．５ｍｇを試験管に採
り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド１ｍｌを加え
て溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコ
ピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミ
ン０．５ｍｌを添加し混合することによりＮ，Ｎ’−ジ
メチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ沃化水素酸塩
の電荷移動錯体及びトリエタノールアミンを含有する化
学発光試薬を得た。
【００４０】［実施例４−１］ペルオキシダーゼ活性の測定方法 実施例４で調製した化学発光試薬５０μｌを採り、これ
を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ２．９５ｍｌと混
合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノール
を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μ
ｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。ま
た、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水
準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ
ずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試
薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００
μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノ
メーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００
Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表４に示すような発光
強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍ
ｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ２．９５ｍｌと混
合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノール
を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μ
ｌを添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。ま
た、化学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水
準の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌ
ずつを充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試
薬溶液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００
μｌを順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノ
メーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００
Ｄ）で０〜５秒間積算した結果、表４に示すような発光
強度が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍ
ｏｌ／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
【００４１】
【表４】
【００４２】［実施例５］Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジ
硝酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３
０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間
照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加
し混合することにより化学発光試薬を得た。
硝酸塩の電荷移動錯体、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド
及びトリエタノールアミンを含む化学発光試薬の調製 ルシゲニン１．５ｍｇを試験管に採り、これにＮ，Ｎ−
ジメチルアセトアミド１ｍｌを加えて溶解させた後、３
０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間
照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加
し混合することにより化学発光試薬を得た。
【００４３】［実施例５−１］ペルオキシダーゼ活性の測定方法 実施例５で調製した化学発光試薬５０μｌを採り、これ
を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ２．９５ｍｌと混
合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノール
の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌを
添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化
学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の
０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌずつ
を充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試薬溶
液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌ
を順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメー
ター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）
で０〜５秒間積算した結果、表５に示すような発光強度
が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍｏｌ
／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
を０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ２．９５ｍｌと混
合した後、この溶液に１０ｍＭのｐ−ヨードフェノール
の０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌを
添加し混合して化学発光試薬溶液を調製した。また、化
学発光測定用マイクロプレートの複数のウェルに西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の種々の濃度水準の
０．１Ｍトリス塩酸緩衝液(pH7.8) 溶液１００μｌずつ
を充填し、これに溶液注入装置から上記化学発光試薬溶
液及び０．００１７重量％過酸化水素水溶液１００μｌ
を順次注入して発光反応させ、この発光量をルミノメー
ター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）
で０〜５秒間積算した結果、表５に示すような発光強度
が得られ、ペルオキシダーゼ活性を１×１０-13 ｍｏｌ
／ｌの濃度まで測定できることが認められた。
【００４４】
【表５】
【００４５】
【発明の効果】本発明により提供される新規化学発光試
薬は、安価な製造原料を用いて比較的短時間で容易に製
造でき、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペ
ルオキシダーゼの濃度に依存して化学発光する性質を有
するのでこれを利用して、ペルオキシダーゼ酵素を高感
度で検出することができる。更に、ペルオキシダーゼを
標識物質として抗原、抗体、核酸等を標識した酵素標識
物を用いて、酵素免疫測定法により抗原、抗体等を、ウ
ェスタンブロット法により蛋白質を、サザーン及びノー
ザンブロット法によりＤＮＡ及びＲＮＡを、そして酵素
標識核酸プローブを用いて核酸をそれぞれ特異的に且つ
高感度で測定することができる。
薬は、安価な製造原料を用いて比較的短時間で容易に製
造でき、過酸化水素とペルオキシダーゼの存在下に、ペ
ルオキシダーゼの濃度に依存して化学発光する性質を有
するのでこれを利用して、ペルオキシダーゼ酵素を高感
度で検出することができる。更に、ペルオキシダーゼを
標識物質として抗原、抗体、核酸等を標識した酵素標識
物を用いて、酵素免疫測定法により抗原、抗体等を、ウ
ェスタンブロット法により蛋白質を、サザーン及びノー
ザンブロット法によりＤＮＡ及びＲＮＡを、そして酵素
標識核酸プローブを用いて核酸をそれぞれ特異的に且つ
高感度で測定することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 荒谷 弦一郎 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 葛城 寿史 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 細越 未央 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 Ｆターム(参考） 2G054 AB03 AB10 CA28 CE01 EA01 4C034 BA07
Claims (4)
- 【請求項１】 下記一般式（１） 【化１】 （上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、それぞ
れアルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基か
らなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるもの
でもよく、Ｒ3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、それぞれ水素
原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリー
ロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互
いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｘ・は前駆体ビ
スアクリジニウム塩の対アニオンから電子が移動した残
基である酸ラジカルを示す。）で表わされるＮ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の電荷移動
錯体、及び下記一般式（２） 【化２】 （上記一般式（２）において、Ｒ1 は水素原子、炭素数
１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基
及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択さ
れ、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、ア
ミノ基又はハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ
2 はメチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ
3 は炭素数１〜１０のアルキル基、該炭素数２〜１０の
アルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる
群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ
基、水酸基、アミノ基又はハロゲン原子等で置換されて
いてもよく、Ｒ1 及びＲ3 は、互いに結合して、それぞ
れが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基
の窒素原子と共に環を形成していてもよい。）で表わさ
れるＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を主成分と
する、ペルオキシダーゼ酵素量に依存して過酸化物によ
り化学発光することを特徴とする化学発光試薬。 - 【請求項２】 請求項１に記載の化学発光試薬に、下
記一般式（３） 【化３】 （上記一般式（３）において、Ｒは炭素数１〜５の二価
の脂肪族炭化水素を表わし、ｍは１〜３の整数を表わ
す。）で表わされるアミノアルコール化合物を添加する
ことによりペルオキシダーゼ酵素量に依存して過酸化物
により化学発光することを特徴とする化学発光試薬。 - 【請求項３】 前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビ
スアクリジニウム塩類がＮ，Ｎ’−ジメチル−９，９’
−ビスアクリジニウムジナイトレートである請求項１又
は２に記載の化学発光試薬。 - 【請求項４】 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド
化合物がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルアセトアミド及びＮ−メチル−２−ピロリドンから
なる群より選択される少なくとも一種の化合物である請
求項１〜３のいずれかの請求項に記載の化学発光試薬。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36157198A JP4212698B2 (ja) | 1998-12-18 | 1998-12-18 | 新規化学発光試薬 |
| US09/529,546 US6395503B1 (en) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Chemiluminescent reagents and chemiluminescence analysis methods with the use of the same |
| EP99937071A EP1038939B1 (en) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Chemiluminescent reagents and chemiluminescence analysis methods with the use of the same |
| DE69933850T DE69933850T2 (de) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Chemilumineszenzmittel und chemilumineszenzanalyseverfahren mit deren verwendung |
| CA002306752A CA2306752C (en) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Chemiluminescent reagent and chemiluminescent analysis using the same |
| PCT/JP1999/004401 WO2000009626A1 (fr) | 1998-08-14 | 1999-08-13 | Reactifs chimioluminescents et procedes d'analyse par chimioluminescence dans lesquels on utilise lesdits reactifs |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP36157198A JP4212698B2 (ja) | 1998-12-18 | 1998-12-18 | 新規化学発光試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000178550A true JP2000178550A (ja) | 2000-06-27 |
| JP4212698B2 JP4212698B2 (ja) | 2009-01-21 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP36157198A Expired - Fee Related JP4212698B2 (ja) | 1998-08-14 | 1998-12-18 | 新規化学発光試薬 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4212698B2 (ja) |
-
1998
- 1998-12-18 JP JP36157198A patent/JP4212698B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JP4212698B2 (ja) | 2009-01-21 |
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