JPS6131096B2 - - Google Patents
Info
- Publication number
- JPS6131096B2 JPS6131096B2 JP5406684A JP5406684A JPS6131096B2 JP S6131096 B2 JPS6131096 B2 JP S6131096B2 JP 5406684 A JP5406684 A JP 5406684A JP 5406684 A JP5406684 A JP 5406684A JP S6131096 B2 JPS6131096 B2 JP S6131096B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- substrate
- reaction
- serum
- activity
- acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/44—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase
- C12Q1/46—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving esterase involving cholinesterase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は一般式（）
（式中Ｘはハロゲン原子を表わす）で表わされる
新規コリン誘導体３・４−ジヒドロキシベンゾイ
ルコリンハライドに関する。 実施例１に示すごとく、これらの化合物は３・
４−ジヒドロキシ安息香酸を出発原料として合成
された。まず、３・４−ジヒドロキシ基をカルボ
ベンゾキシクロライドを用いて、カルボベンゾキ
シ保護し、次いで塩化チオニルまたは五塩化リン
等を用いる化学合成における一般的な方法で酸ク
ロライドに誘導し、Ｎ・Ｎ−ジメチルアミノエタ
ノールと脱塩酸縮合し、次いで水素還元によつて
保護基を脱離し、Ｎ・Ｎ−ジメチルアミノエチル
３・４−ジヒドロキシベンゾエートを得た。この
化合物をハロゲン化メチルで四級化反応を行い、
本発明の新規な一般式（）で表わされる３・４
−ジヒドロキシベンゾイルコリンハライドを合成
した。 本発明の化合物はコリンエステラーゼ（酵素コ
ード番号3.1.1.8）（以下Ch−Ｅと記述する）の酵
素活性を測定するための合成基質として非常に有
用である。以下それについて詳細に説明する。 従来、合成基質を使用する血液中のCh−Ｅの
酵素活性の測定法は種々報告され、また日常の臨
床検査に実用化されているものもある。しかし、
それらの測定法には一長一短があり、また種々の
問題もあつて測定値の不正確さの原因になつてい
る。それらの測定法の例をあげると、ガス分析
法、PHメーター法、PH指示薬比色法、チオコリン
発色法、酵素法、UV法等がある。 ガス分析法〔R.Ammon：Pflugers Arch.
GesPhysiol.233、487（1933）〕は合成基質として
アセチルコリンを用い、Ch−Ｅの酵素作用で生
成した酢酸により炭酸水素ナトリウムから発生す
る炭酸ガスを定量する方法であるが、操作が煩雑
で多数検体の処理ができないなどの欠点がある。 PHメーター法〔H.O.Michel：J.Lab.＆ Clin.
Med.、34、1564（1949）〕もガス分析法と同様に
Ch−Ｅの酵素活性によつて生じた酢酸によPHの
変化をPHメーターで測定する方法であるが、PHメ
ーターの精度、多数検体の処理が出来ないなどの
問題がある。 PH指示薬比色法はPHメーター法とは異なり、
Ch−Ｅにより生じた酢酸によるPHの変化を指示
薬の分子吸光度を測定する方法で、指示薬として
はフエノールレツド〔高橋浩、柴田進：医学と生
物学；20、96（1951）〕、ブロムチモールブルー
〔H.G.Biggs et al：Amer.J.Clin.Path.、30、181
（1958）〕、ｍ−ニトロフエノール〔佐々木匡秀：
臨床病理、12、555（1964）〕などが使われてい
る。この方法は操作も簡便で多数検体の処理もで
きるが、反応時間が長く、反応中にもPHが変化
し、低値と高値で再現性があまりよくないなどの
欠点が指適されている。 上述したアセチルコリンを基質として用いる方
法では、アセチルコリンは非酵素的加水分解をう
けやすく、また基質特異性もあまりないので、基
質そのものにも問題がある。 チオコリン法〔P.Garry：J.Clin.Chem.、11
(2)．91（1965）〕は基質としてアセチルチオコリ
ン、プロピルチオコリン、ブチルチオコリン等が
使用されている。これらの基質はCh−Ｅの酵素
作用でチオコリンを生成し、それが５・5′−ジチ
オビス−２−ニトロ安息香酸（DTNB）と反応し
て黄色を生じる。この黄色の吸光度を比色計で測
定する方法である。この方法は反応性に優れ、感
度が高く、また操作も簡単で多数検体の処理もで
きるとともに初速度法もできるなど優れた点もあ
るが、呈色が黄色であるため試料（例えば血清、
血漿）中のビリルビンの影響を強く受け、またグ
ルタチオンのようなSH基を有する化合物の影響
もまぬかれないし、さらに基質そのものが不安定
であることも問題になつているなどいくつかの問
題点がある。 酵素法はベンゾイルコリン〔岡部紘明、他：臨
床病理、25、751（1977）〕またはオルソトルオイ
ルコリン〔特開昭54−138533〕などを基質として
用い、Ch−Ｅの酵素作用で生成したコリンをコ
リンオキシダーゼによりベタインに変化させ、そ
の時生成する過酸化水素をペルオキシダーゼの存
在下で４−アミノアンチピリンとフエノールなど
との酸化的縮合反応で発色する方法である。この
方法は呈色が赤色になるので、試料（例えば血
清、血漿）中のビリルビンなどの干渉を受けず、
多数検体の処理もできるが、発色系の試料として
使用するフエノールや４−アミノアンチピリンが
Ch−Ｅに対して拮抗阻害効果があるので、それ
らの使用量が非常に限定され、十分な発色が難し
い。一般に過酸化水素を経由する定量法は、試料
（例えば血清または血漿）中のピリルビンやアス
コルビン酸などの還元物質による影響はまぬがれ
ないし、リン脂質の分解などで生じるコリンの影
響も受ける。ベンゾイルコリンを基質とした場合
は、非酵素的加水分解性も問題になつているなど
種々の問題がある。 UV法には２種類あり、一つはW.Kalowのベン
ゾイルコリン〔W.Kalow and K.Genet：Canad.
J.Biochem.＆ Physiol.、35、339（1957）〕を基
薬とする方法であり、もう一つはヒドロキシベン
ゾイルコリンを基質とする方法である。前者は
Ch−Ｅの酵素活性によつて基質が加水分解し、
その基質が減少していく様子を測定波長、240n
ｍで追跡していく方法である。この方法の測定原
理は直接基質の減少を測定しているので単純明解
であるが、測定波長が短いため血清または血漿成
分の干渉を受けやすいし、基質のベンゾイルコリ
ンが基質阻害を起すため、反応液の基質濃度が限
定され、直線性の範囲が狭い、またベンゾイルコ
リンの非酵素的加水分解性があるので、Ch−Ｅ
の至適PHで反応を行つていないなどの問題があ
る。後者（特開昭57−110198、特開昭58−
152500）は基質としてｐ−ヒドロキシベンゾイル
コリンを使用し、Ch−Ｅの酵素作用によつて生
成するｐ−ヒドロキシ安息香酸を補酵素NADPH
の存在下でｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の
作用により補酵素NADPHが酸化されNADPに変
化する際の吸光度の減少を波長340nｍで測定追
跡する方法である。この方法は至適PHで反応を行
つているし、過酸化水素−発色系における欠点、
即ちビリルビンやアスコルビン酸などの還元物質
による影響やリン脂質の分解で生じるコリンの干
渉を除くことができ、チオコリン法の欠点もなく
更に多数検体処理が可能な自動分析装置に適した
優れたCh−Ｅ活性の測定法である。しかしなが
ら、使用する補酵素NADPHは高価で不安定な試
薬であり、一定の品質に維持及び管理するのがむ
ずかしい。また酵素としてｐ−ヒドロキシ安息香
酸水酸化酵素やプロトカテク酸−３・４ジオキシ
ゲナーゼなどを使用し、測定原理としては前者に
比較して大分複雑であり、測定値の誤差要因が多
い。 以上Ch−Ｅの酵素活性の測定法について述べ
たごとく、従来の測定法または使用する合成基質
には問題が多い。我々は従来法の欠点を解決すべ
く鋭意研究し、新規な３・４−ジヒドロキシベン
ゾイルコリンハライドがCh−Ｅの活性を測定す
るのに非常に有用な基質であることを見い出し、
血中のCh−Ｅ活性を簡便且つ正確に測定する方
法を発明するに至つた。以下この基質の有用性に
ついて述べる。 第１図に３・４−ジヒドロキシベンゾイルコリ
ンアイオダイド（以下DHBCIと記す）と３・４
−ヒドロキシ安息香酸のUVスペクトルを示し
た。DHBCIがCh−Ｅの作用で加水分解するとコ
リンと３・４−ジヒドロキシ安息香酸を生成す
る。前者コリンは波長が340nｍ以上ではUV吸収
は見られない。後者３・４−ジヒドロキシ安息香
酸は波長が340nｍ以下ではUV吸収はほとんどな
い。したがつて、本発明の新規化合物である
DHBCIをCh−Ｅの酵素活性測定用の基質として
使用し、測定波長340〜360nｍで反応を追跡すれ
ば、基質DHBCIの減少を正確に追うことができ
る。前述のW.Kalowの方法では測定波長240nｍ
であるので初期吸収において血液成分の干渉を大
分受けるが、測定波長が340〜360nｍでは非常に
小さいので、測定条件の設定が容易である。この
基質DHBCIは非酵素的加水分解に非常に安定で
あり、1/15Ｍリン酸緩衝液（PH8.20）中37℃の条
件では90分ではほとんど加水分解は起きなかつ
た。この結果は測定中の非酵素的加水分解は無視
できることを示している。Km値はベンゾイルコリ
ンとあまり変らず、50ｍＭトリス−マレイン酸緩
衝液（PH8.20）では2.6×10-5Mであつた。基質
DHBCIのKm値は十分小さいので、反応系では十
分な基質濃度で反応ができ、経時的直線範囲が広
くなり、血液中のCh−Ｅの活性は十分測定可能
である。 以下に更に本発明の新規化合物が有用であるこ
とを参考例により説明する。 参考例 １ タイムコースを第２図に示した。測定法は50ｍ
Ｍトリス−マレイン酸緩衝液（PH8.20）で基質濃
度0.25ｍＭに調整し、その2.0mlを取り37℃にな
るまで予備加温（５分間程度）し、これに血清
200μを加えて、直ちに37℃で340nｍにおける
吸光度の減少を測定した。血清はコンセーラ
（日水製薬社製）を使用した。Ch−Ｅ活性値は下
記の式により計算される。 IU/＝△０．Ｄ．＊×反応液量×１０００／分子
吸光係数＊＊×血清量 ＊△O.D.は測定波長340nｍにおける１分間当
りの吸光度の変化量 ＊＊波長340nｍにおける分子吸光度は2960であ
る。 上式より使用した血清は216（IU/）単位で
あつた。第２図に示したごとく、Ch−Ｅの単位
216（IU/）では６分間経時的に直線であつ
た。これは自動分析装置が使用可能なことを示し
ている。 参考例 ２ 第３図に血清の希釈率と酵素活性の関係を示し
た。測定条件は下記のごとくである。 (イ)基質：DHBCI (ロ)緩衝液：50ｍＭトリス−マレイン酸（PH8.20） (ハ)血清：(1)コンセーラ 100μ (2)コンセーラ 200μ (3)プレチパスＥ 100μ （ベーリンガー・マンハイム社製） 血清希釈は生理食塩水で行つた。基質濃度は緩衝
液で0.25ｍＭに調製した。測定は基質液に血清お
よび希釈血清を(1)、(3)は100μ、(2)は200μを
用いて、参考例１と同様な方法で行つた。第３図
に示したごとく、３種共に、血清の希釈率と酵素
活性は非常に良く直線的な比例関係があつた。 参考例１および２の結果から、DHBCIは単純
な反応機構と簡単な操作により、血液中のCh−
Ｅ活性が低単位から高単位まで幅広く測定できる
ことが明らかになり、本発明の３・４−ジヒドロ
キシベンゾイルコリンが血液中のCh−Ｅ活性測
定用の基質として非常に有用であることが示され
た。 実施例１に本発明の新規な３・４−ジヒドロキ
シベンゾイルコリンアイオダイドの合成を記し
た。必要ならアイオダイドは合成化学の一般的な
方法で他のハロゲンに交換できる。 実施例 １ ３・４−ジヒドロキシ安息香酸10ｇを2.73N
NaOH71mlに溶解し、０〜５℃に氷冷し、はげし
く撹拌しながらカルボベンゾキシクロライド22ml
を滴下した。PHを９〜10に保つように2.73N
NaOHも同時に滴下した。約１時間でPHは一定に
なり、次いで室温で３時間撹拌下反応させ、冷
5NHClでPH２に調製し、酢酸エチル200ml、100ml
で２回順次抽出し、２回の酢酸エチル相を合せ、
食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥
後、溶媒を減圧留去し、油状物25ｇを得た。これ
をシリカゲルクロマトで精製し、Ｏ、O′−ジカ
ルボベンゾキシ−３・４−ジヒドロキシ安息香酸
9.2ｇを得た。この４ｇを防湿下エーテル50mlに
懸濁し、５塩化リン粉末２ｇを加え、室温で撹拌
下５時間反応させた。反応終了後溶媒を減圧留去
し、油状物4.5ｇを得た。これをベンゼン20mlに
溶解した液を、ジメチルアミノエタノール２mlを
ベンゼン30mlに溶解した液に５〜10℃の冷却下で
適下した。適下後室温で一晩撹拌反応を行つた
後、ベンゼン50mlを加え、水、次いで飽和食塩水
で洗浄を行い、ベンゼン相を無水硫酸マグネシウ
ム上で乾燥し、溶媒を減圧留去し、4.9ｇの油状
物を得た。これをエタノール260mlに溶解し、パ
ラジウム−黒２ｇを加え接触還元を５時間行い、
反応後触媒を濾別してエタノールを減圧留去し、
油状物３ｇを得た。これをアセトン90mlに溶解
し、ヨウ化メチル２ｇの酢酸エチル溶液を加え室
温で一晩放置すると結晶が析出した。この結晶を
濾取し、アセトンで良く洗浄後、五酸化リン上で
一晩減圧乾燥し、本発明の新規化合物３・４−ジ
ヒドロキシベンゾイルコリンアイオダイド2.5ｇ
を得た。 融点 205〜209℃ この結晶はシリカゲル薄層クロマトグラフイー
（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２）で単
一のスポツト（Ｒf＝0.31）を与えた。 元素分析値：C12H18N1O4I（M.W.367.166）とし
て 実測値（％）Ｃ：39.34 Ｈ：5.07 Ｎ：3.90 計算値（％）Ｃ：39.25 Ｈ：4.94 Ｎ：3.81 赤外スペクトルは第４図に示した。
新規コリン誘導体３・４−ジヒドロキシベンゾイ
ルコリンハライドに関する。 実施例１に示すごとく、これらの化合物は３・
４−ジヒドロキシ安息香酸を出発原料として合成
された。まず、３・４−ジヒドロキシ基をカルボ
ベンゾキシクロライドを用いて、カルボベンゾキ
シ保護し、次いで塩化チオニルまたは五塩化リン
等を用いる化学合成における一般的な方法で酸ク
ロライドに誘導し、Ｎ・Ｎ−ジメチルアミノエタ
ノールと脱塩酸縮合し、次いで水素還元によつて
保護基を脱離し、Ｎ・Ｎ−ジメチルアミノエチル
３・４−ジヒドロキシベンゾエートを得た。この
化合物をハロゲン化メチルで四級化反応を行い、
本発明の新規な一般式（）で表わされる３・４
−ジヒドロキシベンゾイルコリンハライドを合成
した。 本発明の化合物はコリンエステラーゼ（酵素コ
ード番号3.1.1.8）（以下Ch−Ｅと記述する）の酵
素活性を測定するための合成基質として非常に有
用である。以下それについて詳細に説明する。 従来、合成基質を使用する血液中のCh−Ｅの
酵素活性の測定法は種々報告され、また日常の臨
床検査に実用化されているものもある。しかし、
それらの測定法には一長一短があり、また種々の
問題もあつて測定値の不正確さの原因になつてい
る。それらの測定法の例をあげると、ガス分析
法、PHメーター法、PH指示薬比色法、チオコリン
発色法、酵素法、UV法等がある。 ガス分析法〔R.Ammon：Pflugers Arch.
GesPhysiol.233、487（1933）〕は合成基質として
アセチルコリンを用い、Ch−Ｅの酵素作用で生
成した酢酸により炭酸水素ナトリウムから発生す
る炭酸ガスを定量する方法であるが、操作が煩雑
で多数検体の処理ができないなどの欠点がある。 PHメーター法〔H.O.Michel：J.Lab.＆ Clin.
Med.、34、1564（1949）〕もガス分析法と同様に
Ch−Ｅの酵素活性によつて生じた酢酸によPHの
変化をPHメーターで測定する方法であるが、PHメ
ーターの精度、多数検体の処理が出来ないなどの
問題がある。 PH指示薬比色法はPHメーター法とは異なり、
Ch−Ｅにより生じた酢酸によるPHの変化を指示
薬の分子吸光度を測定する方法で、指示薬として
はフエノールレツド〔高橋浩、柴田進：医学と生
物学；20、96（1951）〕、ブロムチモールブルー
〔H.G.Biggs et al：Amer.J.Clin.Path.、30、181
（1958）〕、ｍ−ニトロフエノール〔佐々木匡秀：
臨床病理、12、555（1964）〕などが使われてい
る。この方法は操作も簡便で多数検体の処理もで
きるが、反応時間が長く、反応中にもPHが変化
し、低値と高値で再現性があまりよくないなどの
欠点が指適されている。 上述したアセチルコリンを基質として用いる方
法では、アセチルコリンは非酵素的加水分解をう
けやすく、また基質特異性もあまりないので、基
質そのものにも問題がある。 チオコリン法〔P.Garry：J.Clin.Chem.、11
(2)．91（1965）〕は基質としてアセチルチオコリ
ン、プロピルチオコリン、ブチルチオコリン等が
使用されている。これらの基質はCh−Ｅの酵素
作用でチオコリンを生成し、それが５・5′−ジチ
オビス−２−ニトロ安息香酸（DTNB）と反応し
て黄色を生じる。この黄色の吸光度を比色計で測
定する方法である。この方法は反応性に優れ、感
度が高く、また操作も簡単で多数検体の処理もで
きるとともに初速度法もできるなど優れた点もあ
るが、呈色が黄色であるため試料（例えば血清、
血漿）中のビリルビンの影響を強く受け、またグ
ルタチオンのようなSH基を有する化合物の影響
もまぬかれないし、さらに基質そのものが不安定
であることも問題になつているなどいくつかの問
題点がある。 酵素法はベンゾイルコリン〔岡部紘明、他：臨
床病理、25、751（1977）〕またはオルソトルオイ
ルコリン〔特開昭54−138533〕などを基質として
用い、Ch−Ｅの酵素作用で生成したコリンをコ
リンオキシダーゼによりベタインに変化させ、そ
の時生成する過酸化水素をペルオキシダーゼの存
在下で４−アミノアンチピリンとフエノールなど
との酸化的縮合反応で発色する方法である。この
方法は呈色が赤色になるので、試料（例えば血
清、血漿）中のビリルビンなどの干渉を受けず、
多数検体の処理もできるが、発色系の試料として
使用するフエノールや４−アミノアンチピリンが
Ch−Ｅに対して拮抗阻害効果があるので、それ
らの使用量が非常に限定され、十分な発色が難し
い。一般に過酸化水素を経由する定量法は、試料
（例えば血清または血漿）中のピリルビンやアス
コルビン酸などの還元物質による影響はまぬがれ
ないし、リン脂質の分解などで生じるコリンの影
響も受ける。ベンゾイルコリンを基質とした場合
は、非酵素的加水分解性も問題になつているなど
種々の問題がある。 UV法には２種類あり、一つはW.Kalowのベン
ゾイルコリン〔W.Kalow and K.Genet：Canad.
J.Biochem.＆ Physiol.、35、339（1957）〕を基
薬とする方法であり、もう一つはヒドロキシベン
ゾイルコリンを基質とする方法である。前者は
Ch−Ｅの酵素活性によつて基質が加水分解し、
その基質が減少していく様子を測定波長、240n
ｍで追跡していく方法である。この方法の測定原
理は直接基質の減少を測定しているので単純明解
であるが、測定波長が短いため血清または血漿成
分の干渉を受けやすいし、基質のベンゾイルコリ
ンが基質阻害を起すため、反応液の基質濃度が限
定され、直線性の範囲が狭い、またベンゾイルコ
リンの非酵素的加水分解性があるので、Ch−Ｅ
の至適PHで反応を行つていないなどの問題があ
る。後者（特開昭57−110198、特開昭58−
152500）は基質としてｐ−ヒドロキシベンゾイル
コリンを使用し、Ch−Ｅの酵素作用によつて生
成するｐ−ヒドロキシ安息香酸を補酵素NADPH
の存在下でｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の
作用により補酵素NADPHが酸化されNADPに変
化する際の吸光度の減少を波長340nｍで測定追
跡する方法である。この方法は至適PHで反応を行
つているし、過酸化水素−発色系における欠点、
即ちビリルビンやアスコルビン酸などの還元物質
による影響やリン脂質の分解で生じるコリンの干
渉を除くことができ、チオコリン法の欠点もなく
更に多数検体処理が可能な自動分析装置に適した
優れたCh−Ｅ活性の測定法である。しかしなが
ら、使用する補酵素NADPHは高価で不安定な試
薬であり、一定の品質に維持及び管理するのがむ
ずかしい。また酵素としてｐ−ヒドロキシ安息香
酸水酸化酵素やプロトカテク酸−３・４ジオキシ
ゲナーゼなどを使用し、測定原理としては前者に
比較して大分複雑であり、測定値の誤差要因が多
い。 以上Ch−Ｅの酵素活性の測定法について述べ
たごとく、従来の測定法または使用する合成基質
には問題が多い。我々は従来法の欠点を解決すべ
く鋭意研究し、新規な３・４−ジヒドロキシベン
ゾイルコリンハライドがCh−Ｅの活性を測定す
るのに非常に有用な基質であることを見い出し、
血中のCh−Ｅ活性を簡便且つ正確に測定する方
法を発明するに至つた。以下この基質の有用性に
ついて述べる。 第１図に３・４−ジヒドロキシベンゾイルコリ
ンアイオダイド（以下DHBCIと記す）と３・４
−ヒドロキシ安息香酸のUVスペクトルを示し
た。DHBCIがCh−Ｅの作用で加水分解するとコ
リンと３・４−ジヒドロキシ安息香酸を生成す
る。前者コリンは波長が340nｍ以上ではUV吸収
は見られない。後者３・４−ジヒドロキシ安息香
酸は波長が340nｍ以下ではUV吸収はほとんどな
い。したがつて、本発明の新規化合物である
DHBCIをCh−Ｅの酵素活性測定用の基質として
使用し、測定波長340〜360nｍで反応を追跡すれ
ば、基質DHBCIの減少を正確に追うことができ
る。前述のW.Kalowの方法では測定波長240nｍ
であるので初期吸収において血液成分の干渉を大
分受けるが、測定波長が340〜360nｍでは非常に
小さいので、測定条件の設定が容易である。この
基質DHBCIは非酵素的加水分解に非常に安定で
あり、1/15Ｍリン酸緩衝液（PH8.20）中37℃の条
件では90分ではほとんど加水分解は起きなかつ
た。この結果は測定中の非酵素的加水分解は無視
できることを示している。Km値はベンゾイルコリ
ンとあまり変らず、50ｍＭトリス−マレイン酸緩
衝液（PH8.20）では2.6×10-5Mであつた。基質
DHBCIのKm値は十分小さいので、反応系では十
分な基質濃度で反応ができ、経時的直線範囲が広
くなり、血液中のCh−Ｅの活性は十分測定可能
である。 以下に更に本発明の新規化合物が有用であるこ
とを参考例により説明する。 参考例 １ タイムコースを第２図に示した。測定法は50ｍ
Ｍトリス−マレイン酸緩衝液（PH8.20）で基質濃
度0.25ｍＭに調整し、その2.0mlを取り37℃にな
るまで予備加温（５分間程度）し、これに血清
200μを加えて、直ちに37℃で340nｍにおける
吸光度の減少を測定した。血清はコンセーラ
（日水製薬社製）を使用した。Ch−Ｅ活性値は下
記の式により計算される。 IU/＝△０．Ｄ．＊×反応液量×１０００／分子
吸光係数＊＊×血清量 ＊△O.D.は測定波長340nｍにおける１分間当
りの吸光度の変化量 ＊＊波長340nｍにおける分子吸光度は2960であ
る。 上式より使用した血清は216（IU/）単位で
あつた。第２図に示したごとく、Ch−Ｅの単位
216（IU/）では６分間経時的に直線であつ
た。これは自動分析装置が使用可能なことを示し
ている。 参考例 ２ 第３図に血清の希釈率と酵素活性の関係を示し
た。測定条件は下記のごとくである。 (イ)基質：DHBCI (ロ)緩衝液：50ｍＭトリス−マレイン酸（PH8.20） (ハ)血清：(1)コンセーラ 100μ (2)コンセーラ 200μ (3)プレチパスＥ 100μ （ベーリンガー・マンハイム社製） 血清希釈は生理食塩水で行つた。基質濃度は緩衝
液で0.25ｍＭに調製した。測定は基質液に血清お
よび希釈血清を(1)、(3)は100μ、(2)は200μを
用いて、参考例１と同様な方法で行つた。第３図
に示したごとく、３種共に、血清の希釈率と酵素
活性は非常に良く直線的な比例関係があつた。 参考例１および２の結果から、DHBCIは単純
な反応機構と簡単な操作により、血液中のCh−
Ｅ活性が低単位から高単位まで幅広く測定できる
ことが明らかになり、本発明の３・４−ジヒドロ
キシベンゾイルコリンが血液中のCh−Ｅ活性測
定用の基質として非常に有用であることが示され
た。 実施例１に本発明の新規な３・４−ジヒドロキ
シベンゾイルコリンアイオダイドの合成を記し
た。必要ならアイオダイドは合成化学の一般的な
方法で他のハロゲンに交換できる。 実施例 １ ３・４−ジヒドロキシ安息香酸10ｇを2.73N
NaOH71mlに溶解し、０〜５℃に氷冷し、はげし
く撹拌しながらカルボベンゾキシクロライド22ml
を滴下した。PHを９〜10に保つように2.73N
NaOHも同時に滴下した。約１時間でPHは一定に
なり、次いで室温で３時間撹拌下反応させ、冷
5NHClでPH２に調製し、酢酸エチル200ml、100ml
で２回順次抽出し、２回の酢酸エチル相を合せ、
食塩水で洗浄後、無水硫酸マグネシウム上で乾燥
後、溶媒を減圧留去し、油状物25ｇを得た。これ
をシリカゲルクロマトで精製し、Ｏ、O′−ジカ
ルボベンゾキシ−３・４−ジヒドロキシ安息香酸
9.2ｇを得た。この４ｇを防湿下エーテル50mlに
懸濁し、５塩化リン粉末２ｇを加え、室温で撹拌
下５時間反応させた。反応終了後溶媒を減圧留去
し、油状物4.5ｇを得た。これをベンゼン20mlに
溶解した液を、ジメチルアミノエタノール２mlを
ベンゼン30mlに溶解した液に５〜10℃の冷却下で
適下した。適下後室温で一晩撹拌反応を行つた
後、ベンゼン50mlを加え、水、次いで飽和食塩水
で洗浄を行い、ベンゼン相を無水硫酸マグネシウ
ム上で乾燥し、溶媒を減圧留去し、4.9ｇの油状
物を得た。これをエタノール260mlに溶解し、パ
ラジウム−黒２ｇを加え接触還元を５時間行い、
反応後触媒を濾別してエタノールを減圧留去し、
油状物３ｇを得た。これをアセトン90mlに溶解
し、ヨウ化メチル２ｇの酢酸エチル溶液を加え室
温で一晩放置すると結晶が析出した。この結晶を
濾取し、アセトンで良く洗浄後、五酸化リン上で
一晩減圧乾燥し、本発明の新規化合物３・４−ジ
ヒドロキシベンゾイルコリンアイオダイド2.5ｇ
を得た。 融点 205〜209℃ この結晶はシリカゲル薄層クロマトグラフイー
（ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：１：２）で単
一のスポツト（Ｒf＝0.31）を与えた。 元素分析値：C12H18N1O4I（M.W.367.166）とし
て 実測値（％）Ｃ：39.34 Ｈ：5.07 Ｎ：3.90 計算値（％）Ｃ：39.25 Ｈ：4.94 Ｎ：3.81 赤外スペクトルは第４図に示した。
第１図は1/15Ｍリン酸緩衝液中（PH8.20）にお
ける(a)３・４−ジヒドロキシベンゾイルコリンア
イオダイドと(b)３・４−ジヒドロキシ安息香酸の
UVスペクトルを示す。第２図および第３図はジ
ヒドロキシベンゾイルコリンアイオダイドを基質
とした場合の血清中のCh−Ｅ活性によるタイム
コースと血清の希釈率とCh−Ｅ活性の関係を示
す。第４図は３・４−ジヒドロキシベンゾイルコ
リンアイオダイドのIRスペクトルを示す。
ける(a)３・４−ジヒドロキシベンゾイルコリンア
イオダイドと(b)３・４−ジヒドロキシ安息香酸の
UVスペクトルを示す。第２図および第３図はジ
ヒドロキシベンゾイルコリンアイオダイドを基質
とした場合の血清中のCh−Ｅ活性によるタイム
コースと血清の希釈率とCh−Ｅ活性の関係を示
す。第４図は３・４−ジヒドロキシベンゾイルコ
リンアイオダイドのIRスペクトルを示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 一般式（） （式中Ｘはハロゲン原子を表わす）で表わされる
３・４−ジヒドロキシベンゾイルコリンハライ
ド。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5406684A JPS60197643A (ja) | 1984-03-21 | 1984-03-21 | 新規コリン誘導体 |
| EP85301793A EP0155825A3 (en) | 1984-03-21 | 1985-03-14 | Novel choline derivatives |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5406684A JPS60197643A (ja) | 1984-03-21 | 1984-03-21 | 新規コリン誘導体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60197643A JPS60197643A (ja) | 1985-10-07 |
| JPS6131096B2 true JPS6131096B2 (ja) | 1986-07-17 |
Family
ID=12960241
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5406684A Granted JPS60197643A (ja) | 1984-03-21 | 1984-03-21 | 新規コリン誘導体 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0155825A3 (ja) |
| JP (1) | JPS60197643A (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60238000A (ja) * | 1984-05-10 | 1985-11-26 | Nitto Boseki Co Ltd | 新規なコリンエステラ−ゼ活性測定法 |
| CA2095495C (en) * | 1992-06-01 | 2002-06-04 | Stephen Carl Hasselberg | Assay for serum cholinesterase |
| IT1271737B (it) * | 1993-12-29 | 1997-06-09 | Aktsionernoe Obschestvo Zakryt | N,n-dimetilamminoetil-beta-(4-idrossi-3,5-di-terzbutilfenil)- propionati |
| US5516616A (en) * | 1994-12-21 | 1996-05-14 | Eastman Kodak Company | Quaternary ammonium salts as charge-control agents for toners and developers |
| US9265736B2 (en) | 2011-02-10 | 2016-02-23 | The Cleveland Clinic Foundation | Treatment of cardiovascular disease and thrombosis |
| AU2013274406B2 (en) | 2012-06-11 | 2017-02-02 | The Cleveland Clinic Foundation | Treatment and prevention of cardiovascular disease and thrombosis |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2096989B (en) * | 1978-04-17 | 1983-04-20 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Choline derivatives and a process for their preparation |
| JPS5721352A (en) * | 1980-07-11 | 1982-02-04 | Shinotesuto Kenkyusho:Kk | Novel substance for measuring cholineesterase activity and method thereof |
-
1984
- 1984-03-21 JP JP5406684A patent/JPS60197643A/ja active Granted
-
1985
- 1985-03-14 EP EP85301793A patent/EP0155825A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0155825A3 (en) | 1986-09-17 |
| JPS60197643A (ja) | 1985-10-07 |
| EP0155825A2 (en) | 1985-09-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Brand et al. | Evidence for binding of rose bengal and anilinonaphthalenesulfonates at the active site regions of liver alcohol dehydrogenase | |
| EP0295034B1 (en) | Hydrolyzable compounds which release electron transfer agents and analytical use of same | |
| EP0159870B1 (en) | Method for the determination of mercapto compounds and reagent for use therein | |
| JPH0764986B2 (ja) | 新規な発色試薬 | |
| JPS6131096B2 (ja) | ||
| Sharma et al. | A method for the sequential colorimetric determination of serum triglycerides and cholesterol | |
| US4824779A (en) | Method for the determination of the reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide | |
| US4717659A (en) | Novel method for determining cholinesterase activity | |
| US4983756A (en) | Novel choline derivative and method for detemining serum cholinesterase activity using the same | |
| JPS5935599B2 (ja) | コリンエステラ−ゼ活性測定法 | |
| US4861713A (en) | Novel method for determining cholinesterase activity | |
| EP0061731B1 (en) | Novel phosphoric ester and a method for quantitative analysis of an alkaline phosphatase using the same as a substrate | |
| US5081274A (en) | 4-acyl-2,6-dihalophenyl-phosphoric acid derivatives useful in the determination of acid phosphatase activity | |
| JPS6121546B2 (ja) | ||
| JPS603839B2 (ja) | コリンエステラ−ゼの活性測定法 | |
| JP4004095B2 (ja) | 新規基質化合物及びコリンエステラーゼ活性測定方法 | |
| US5227291A (en) | Method for determination of acid phosphatase activity using 4-acyl-2, 6-dihalophenyl phosphoric acid derivatives | |
| JPS5854800B2 (ja) | コリン誘導体を用いるコリンエステラ−ゼ活性測定法 | |
| JPS603838B2 (ja) | コリンエステラ−ゼの活性測定法 | |
| JPS62103060A (ja) | チオコリン誘導体およびその用途 | |
| JPH0157A (ja) | 新規コリン誘導体及びそれを用いたコリンエステラ−ゼ活性測定法 | |
| JPS63275579A (ja) | 脂肪酸エステルおよびそれを含有してなるリパ−ゼ活性測定用試薬ならびにこれを用いるリパ−ゼ活性測定方法 | |
| JPH03119997A (ja) | 成分の測定法 | |
| JPS62185084A (ja) | アリ−ルエステラ−ゼ活性測定用基質 | |
| JPH02180892A (ja) | 新規リン酸誘導体及びそれを用いた酸性ホスファターゼ活性測定法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |