JPH0157A - 新規コリン誘導体及びそれを用いたコリンエステラ−ゼ活性測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３．１　　産業上の利用分野 本発明は一般式（Ｉ） （式中Ｘはハロゲン原子を表わす）で表わされる新規コ
リン誘導体及びそれを鼠賀として用いることを特徴とす
るコリンエステラーゼ活性の測定法に関する。

本発明の測定法は、コリンエステラーゼ活性を正確かつ
簡便に測定することができ、血清中のコリンエステラー
ゼを測定するための臨床検査用測定法として極めて有用
である。

３．２　　従来の技術 一般的（、例えば肝ｉＩ陣害を有する患者のｆｆ１Ｉｖ
４中のコリンエステラーゼ１ｌｆｆは低下し、他方、例
えば腎障害を有する患者のコリンエステラーゼ濃度は上
昇することが知られている。従って、これら患者の血清
中のコリンエステラーゼ活性を測定することにより、こ
れら疾患の診断が可能であり、血清中のコリンエステラ
ーゼ活性を正確に測定できる測定法は臨床検査用に使用
し得る。

従来、血清中のコリンエステラーゼ（以下ＣｔｌＥと記
す）活性の測定法としては、合成基質を使用り°る秤々
の方法が報告され、また日常の臨床検査に実用化されて
いるものもある。それら測定法の例をあげると、ガス分
析法、ｐＨメーター法、ｐＨ指示薬比色法、チオコリン
発色法、酵素法、ＵＶ法等がある。

（２）、カス分析法［Ｒ，八−ｗｏｎ；　Ｐｆｌｕｇｅ
ｒｓ　Ａｒｃｈ、　Ｇｅ５Ｐｈｙｓｉｏ１．、２３３．
４８７　（１９３３）　］は合成基質としてアセチルコ
リンを用い、ＣｈＥのＭＡ作用で生成した酢酸より炭酸
水素ナトリウムから発生する炭酸ガスを定量する方法で
ある。

０、ｐＨメーター法［Ｈ，０，Ｈｉｃｈｅｌ：Ｊ、　Ｌ
ａｂ、　＆Ｃｌ１ｎ、　ｌｅｄ、、　３４．１５６４　
（１９４９）　］もガス分析払と同様に、合成基質とし
てアセデルコリンを用い、ＣｈＥの酵素作用によって生
じた酢酸によるＯＮの変化をｐＨメーターで測定する方
法である。

（ＯＤｎｍ指示薬比色決はｐＨメーター法とは異なり、
合成ＩＩとしてアセチルコリンを用い、ＣｈＥに゛より
生じた酢酸によるｐＨの変化を指示薬の分子吸光度によ
り測定する方法で、指示薬としてフェノールレッド［６
橋浩、柴田進；医学と生物学、２Ω、９６（１９５１）
］、ブロムチモールブルー［ｎｍ，Ｇ、　　Ｂｉｏｏｓ
　　ｅｔａｌ：＾−ｅｒ、　　Ｊ、　　Ｃｌ１ｎ、　　
Ｐａｔｈ、、３０゜１８１　（１９５８）］、ｍ−二ト
ロフェノール［佐々木匡秀：臨床病理、二、５５５　（
１９６４）１などが使用されている。

鋳、ブーオフリン法［Ｐ、　Ｇａｒｒｙ；Ｊ、　Ｃｌ１
ｎ、　Ｃｈｃｉｉ、。

上ユ、（２）、９１　（１９６５）１は基質としてアセ
チルチオコリン、プロピルチオコリン、ブチルチオコリ
ン等が使用されている。これら基質はＣｈＥの酵素作用
でチオコリンを生成し、それが５．５１−ジチオビス−
２−・ニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）と反応して黄色を生
じる。この黄色の吸光度を比色語で測定する方法である
。

（２）、酵素法はベンゾイルコリン［岡部紘明他：臨床
病理、■、７５１　（１９７７）］、オルソトルオイル
コリン［特開昭５４−１３８５３３］などをＪｕｌとし
て用い、Ｇ　ｔ＋　Ｅの酵素作用で生成したコリンをコ
リンオキシダーゼによりベタインに変化させ、その時生
成する過酸化水素によりペル１キシダーゼの存在下で４
−７ミノアンチとリンをフェノールなどとの酸化的縮合
反応で発色させる方法である。

（０、ＵＶ法には２種類があり、１つは賛、　Ｋａｌｏ
ａ（７）ベンゾイルコリン［賀、にａｌｏｗ　ａｎｄに
、　ＧＯｎＯｔ　　：Ｃａｎａｄ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ
ｅｓ、　＆　Ｐｈｙｏｉｏｌ、、３５　、　３３９（１
９５７）］を基質とする方法であり、もう１つはｐ−ヒ
ドロキシベンゾイルコリン［５ｆ１開昭５７−ｎｍ０１
９８、特開昭５８−１２９９９９１を基質とする方法で
ある。前者はＣｈＥの酵素作用によって基質が加水分解
し、その基質が減少していく様子を測定波長２４０ｎ−
で追跡していく方法である。後行は、ＣｈＦのＩＩ？索
作用によって生成するｐ−ヒドロキシ安息香酸を補酵素
Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｐ　Ｈの存在下でｐ−ヒトＯキシ安息香酸
水酸化酵素の作用によりＮＡＤＰＨが酸化されＮＡＤＰ
に変化する際の吸光度の減少を波長３４Ｑｎａ＋で測定
追跡する方法である。

３．３　１　　　　Ｌ、　　〜と　るＵ　−これらの測
定法には種々の問題点があり、測定値の不正確さの原因
になっている。即ち、例えばガス分析法（２）、ｐＨメ
ーター法０は、操作が煩雑で多数の検体を処理すること
ができないなど実用上の問題がある。ｐＨ指示薬比色決
幻は、操作も簡便で多数の検体を処理することもできる
が、反応時間が長く、反応中にもｐＨが一定でなく、低
値と高値で再現性があまり良くないなどの欠点がある。

また上述した（２）〜（へ）の方法は、いずれもアセチ
ルコリンを基質として用いる方法であり、これらの方法
では、アセチルコリンは非酵素的加水分解を起しやすく
、また基質特異性もあまりないので、基質そのものにも
問題がある。

チオコリン法ゆは反応性に優れ、９１度が高く、操作も
ａｆで多数の検体を処理することができるとともに初速
度広でも測定できるなど優れた点もあるが、呈色が黄色
であるため血清中のビリルビンの影響を強く受け、また
グルタチオンのようなチオール基を有する化合物の影響
もまぬがれえないし、さらにｎｍそのものが不安定であ
り、測定値の誤差原因になっている。

酵素法（４３）は９色が赤色になるので、血清中のビリ
ルビンなどの干渉を受けず、多数の検体を処理づること
もできるが、発色系の試薬として使用するフェノールや
４−アミノ７ンヂピリンがＣｈＥに対して拮抗阻害作用
を有するので、それらの使用けが非常に限定され、十分
な発色が難しい。またこれら酵素法は過酸化水素を利用
する方法であり、一般に過酸化水素を経由する定量法は
血清中°のビリルビンやアスコルビン酸などの還元性物
質による彰費はまぬがれえないし、リン脂質の分解など
で生じるコリンの影響も受ける。ベンゾイルコリンを基
質として用いた酵素法の場合は、非酵集的加水分解性も
問題になっているなど種々問題がある。

Ｕｖ法（０でベンゾイルコリンを基質として使用するー
、にａｌｏｗの方法は、直接基質の減少を測定している
ので測定原理は単純明解であるが、測定波長が２４Ｏｎ
−であるため血清成分の干渉を受けやすく、ベンゾイル
コリンの非酵素的加水分解が起りやすいので、ＣｈＥの
至適ｐＨで反応が行われていない。また測定波長として
Ｍ’ｌｌの吸収曲線のスロープの所が使われており、こ
れにより波長のずれによる吸光係数のずれが大きくなる
など問題がある。

ｐ−ヒドロキシベンゾイルコリンを１！質と（るＵｖ法
は、はぼ至適ｐＨで反応が行えるし、過酸化水素−発色
系における欠点を除くことができ、チオコリン法の欠点
もなく、さらに多数の検体処理が可能な自動分析装置に
適した優れたＣｈＥ活性測定測定あるが、使用する補酵
素ＮＡＤＰＨ！高価な試薬であり、安定性も悪いので一
定の品質に維持および管理するのが難しいし、また酵素
としてｐ−ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素やプ０トカテ
キュｊ！−３，４−ジオキシゲナーぜなどを使用し、測
定値の誤差要因が多い。

以上に述べたごとく、従来のＣｈＥの酵素活性測定法に
は種々の１Ｆｉｌｆｆｌがあり、測定値の誤差の原因に
なっている。

３．４　　ＩＩ　　を　　するための。

我々は従来法の欠点を解決すべく鋭意研究し本発明に′
ｆｑ達した。即ち、新規化合物である２−ナツトイルコ
リンアイオダイド（以下２−ＮＣｌと略称する）を合成
し、かかる化合物を基質として用いるＵｖ法によるＣｈ
Ｅｈ性測定について検討した所、測定波長として約３３
７〜約３５５ｎ＊の波長を使用することができ、この場
合ＣｈＥｈ外の他のｔｈ清酸成分干渉を受けることが少
なく、また２−ＮＣｌは非酵素的加水分解に対して極め
て安定であり、血清中のＣｈＥ特にプソイドコリンエス
テラーゼと特異的に反応し、従って２−ＮＣｌを用いる
ことにより極めて正確に再現性よく血清中のＣｈＥｈ性
を測定することが可能であり、また、非イオン界面活性
剤などの界面活性剤、ジメチルスルホキシドなどの有機
溶媒の存在下にＣｈＥｈ性を測定することにより高単位
のＣｈＥｈ性を測定することが可能となり、その他種々
の利点を有する測定が可ｌとなることを知見し本発明に
到達した。

即ち、本発明は一般式（１） （式Ｘはハロゲン原子を表わす）で表わされる新規コリ
ン誘導体、及び該新規コリン誘導体を基質として用いる
ことを特徴とするコリンエステラーゼ活性の測定法であ
る。

一般式（１）のＸとしては、例えば沃素、塩素、臭素、
フッ素などのハロゲン原子が挙げられる。

かかる新規コリン誘導体は、２−ナフトイルクロライド
等の２−ナフトイルハライドと２−ジメチルアミノエタ
ノールと反応せしめ、次いで得られる反応生成物と、ヨ
ウ化メチル等のハロゲン化メチルとを反応することによ
り合成できる。かかる反応それ自体は公知であり通常の
反応条件下で合成することが可能である。

次に、新規コリン誘導体として、２−ＮＧ　Ｉを例にと
って本発明のＣｈＥ活伯の測定法について説明する。

第１図に２−ＮＣｌと２−ナフトイック酸のＵｖスペク
トルを示した。２−Ｎ　ＣＩがＣｈＥの作用で加水分解
するとコリンと２−ナフトイック酸を生成する。コリン
は波長３００　ｎｍ以上ではＵＶ吸収はない。２−ナフ
トイック酸は波長３３７ｎｓ以上ではｔＪ　Ｖ吸収はは
とんどない。一方、２−ＮＣＩは波長３５５ｎ−以下で
ＵＶ吸収する。したがって、ＵＶ法によりＣｈＥ活竹を
測定する方法において２−ＮＣｌをＣｈＦ活性を測定す
る基質として使用し、測定波長３３７から３５５　ｎｏ
＋で反応を追跡することができ、この場合他の自消成分
の干渉を受けることが少ない。従って基質の２−ＮＣＩ
の減少を正確に追跡することができ、ＣｈＥ活性を正確
に測定することが可能である。

また、後述する如＜２−ＮＣｌは多くの優れた利点を有
し、２−ＮＣ［以外の伯の一般式（Ｉｌのコリン誘導体
も同様に優れた効果を有する。

従って、一般式ＩＩ）の新規コリン誘導体を用いた好ま
しいＣｈＥ活性測定法として、例えば次の測定法が捉供
される。即ち、ＣｈＥを含む検体と一般式（Ｉ）で表わ
される新規コリン誘導体とを混合し、次いで吸光度、特
に波長約３３７〜約３５５０−での吸光度を測定するこ
とによりＣｈＥ活性を測定する方法である。

前述の賛、にａｌｏｗのＵＶ法では測定波長が２４０ｎ
ｓであるので初期吸収において血清成分の干渉を大きく
受けるが、本発明の測定波長約３３７から約３５５　ｎ
ｍではあまり干渉を受けないので至適な測定条件が容易
である。また賛、　ＫａｌｏｗのＵＶ法で基質として使
用しているベンゾイルコリンは、１／１５ＭＩＪ）１！
１衝液Ｅ）Ｈ７，４０中で２３０　Ｆｉｌ附近に極大吸
収をもち、測定波長である２４０ｎｍではスロープであ
る。これは波長のずれによる吸光係数のずれが大きくな
る。本発明の新規１質の２−ＮＣＩは３３５　ｎｓ附近
に極大吸収をもち、測定波長をピークに設定する事がで
きる。この事は分析装置の波長精度の問題から発生する
分子吸光係数の違いなどが非常に小さくなり測定値の機
種問差などが非常に小さくなることを示している。

更に、この基質２−ＮＣｌは非酵素的加水分解に対して
非常に安定である。たとえばｐｌ＋が８．０の２００ｍ
Ｍトリス−マレイン酸緩衝液中３７℃の条件下で３０分
間ではほとんど加水分解は起きなかった（第６図参照）
。この結果は測定中非酵素的加水分解は無？Ｒ′ｒ−き
、正確にＣｈＥ活竹を測定することができることを示し
ている。

ｐＨを一定に保持するための緩衝剤として、バルビター
ル酸塩、リン酸塩、ビロリンＦｌ塩、グリシン、グリシ
ルグリシン、トリスヒドロキシメチルアミノメタンなど
が使用できる。上記以外の緩衝剤でもｐＨを７．５〜１
０．０の間において緩衝能を輔持できるものであれば用
いることが可能である。

ＣｈＥに対する２−ＮＣｌのに一値はベンゾイルコリン
の約１／８程度で２００＋ｅＨトリス−マレイン酸緩衝
液（１）ｎｍ８．０）では約７．０Ｘ１０−６ｓｏｌ／
Ｊである。２−ＮＣｌのに鴎値が十分小さいので、本発
明の測定法の反応系では十分な基質濃度で反応を行うこ
とができ、経時的直線範囲が広くなり、高甲位の活性ま
で十分測定が可能である。

また、界面活性剤や有機溶媒の存在下で種々条件を検討
した結果、基質８ｉ１度を高くする事ができ、さらにへ
単位のＣｈＥ活性まで測定可能になった。

前者は非イオン界面活性剤であるＮＩＫＫＯＬＮＰ−１
５（日光ケミカルズ利製：ポリオキシエチレンノニルフ
ェニルエーテル）が特によく、測定系全最に対して１〜
１０？ｆｉ＆ｔ％の範囲で使用可能であるが、好ましく
は２〜７重量％を用いるとよい。後者は、ジメチルスル
ホギシド（ＤＭＳＯ）が特によく、測定系全量に対して
１〜１０重開％の範囲で使用可能であるが好ましくは１
〜５重量％を用いるとよい。界面活性剤と有機溶媒を添
加した測定系で、それぞれ直線性を調べたところ、前者
は３０００ｎｍ１／Ｊ（第１６図参照）、後者は２９４
０１０／Ｊ（第１７図参照）まで直線性があり、界面活
性剤や有機溶媒を添加しない測定系が２５００１０／ｌ
までしか直線性がない（第１５図参照）のに比べ反応全
液暴を７０％少なく（実施例９．１０）し反応速麿を早
くしたにもかかわらず直線性は２０％も高く出来る。

２−ＮＯＩを基質として用いた場合、２００−Ｈトリス
−マレイン酸ＩＩ衝液ではＣｈＥの至適ｐＨは８．０１
４４近であった（第４図参照）。前述のごと＜２−ＮＣ
ｌはｐＨ８，０で非醪素的加水分解安定竹があるので、
本発明の測定法はＣｈＥの至適のｐＨで反応を行うこと
ができる。

検体中の共存物質が測定値に影響する場合、測定値の誤
差原因になることは前述の通りである。

本発明の方法は基質そのものがＵｖ吸収をもっており、
それを直接測定する方法であり、測定原理的にみても共
存物質の影響を受は難い。共存物質たとえ−ば、アスコ
ルビンＲ２０ｑ／ｄ１、ＷＦＩＪ２０＃Ｆ／ｄ　１　、
グルコース５００ａｙ／ｄｌヘモグロビン２００＃Ｉ！
Ｆ／ｄＪ！、アルブミン５ｇ／ｄ１、ビリルビン２０Ｍ
３／ｄ　１　、グルタチオン（還元型）５０ｇ９／ｄ１
、までは添加試験では問題はなかった（第７図〜第１３
図参照）。抗凝固剤ＥＤＴＡ・２Ｎａ、クエン酸塩、ヘ
パリン４ｎｍ！塩、二重蓚酸等の添加試験でも問題はな
かった（第１４図参照）。本発明は共存物質の影響を非
常に受は難い方法であり、測定値の誤差原因が大幅に解
消された。

コリンエステラービには血清中に存在するプソイドコリ
ンエステラーゼと赤血球中に存在するツルーコリンエス
テラーゼの二種が知られている。

通常臨床検査で測定されているのは血清中のプソイドコ
リンエステラーゼであるが、血清中にツルーコリンエス
テラーゼが混入している場合があるので、検査目的とし
てはプソイドコリンエステラーゼのみと選択的に反応す
る基質が望ましい。本発明の方法に用いる２−ＮＣＩは
プソイドコリンエステラーゼとは良く反応するが、ツル
ーコリンエステラーゼとはほとんど反応しない非常に特
異性の＾い基質である。

外Ｈおよび精神科領域で麻酔剤とプソイドコリンエステ
ラーゼの関係で異型プソイドコリンエステラーゼ検査が
重要である。即ち、異型プソイドコリンエステラーゼが
多い人は麻酔の際にショック死等を生じる場合があり、
異型プソイドコリン１ステラーゼ活竹を麻酔前に測定す
ることがイセである。本発明の測定方法は反応機構的に
単純明解なのでかかる異型プソイドコリンエステラーゼ
検査法として非常に適している。

また２−ＮＣｌ以外の他の一般式山のコリン誘導体の場
合においても上記した好ましい測定が可能である。

本発明のＣｈＥ測定法の具体的方法は、後述する実施例
２に示されており、通常のＵｖ法の手順を採用づること
ができる。

３．５　　発明の効果 本発明のＣｈＥ活性測定法は種々の点で従来法の問題点
が解決されている。本発明の利点を記すと次のごとくで
ある。

（１）　　測定系の反応機構が単純明解で、測定値の誤
差原因が非常に少い。

（２）　　ピークの＊Ｅｅ（３３５，４ｎ＋ｓ）で測定
可能である。

（３）　　基質に用いる本発明の新規コリン誘導体、例
えば２−ＮＣＩが非酵素的加水分解に対して安定なのｒ
１測定値の再現性が非常に良い。

（４）　　本発明の新規コリン誘導体、例えば２−ＮＣ
ｌはプソイドコリンエステラーゼに対して、基質特異性
が高い。

（５）　　前記のごと（、ビリルビン、アスコルビン酸
等の検体成分や抗凝固剤の影響をほとんど受けない。

（６）　　検体ごとに検体ブランクをたてる必要がない
ので簡易かつ迅速に測定でき、多数の検体を処理するこ
とが可能である。・ （７）　　異型プソイドコリンエステラーゼ検査が可能
である。

（８）本発明の新規コリン誘導体、例えば２−ＮＣｌが
安定なので、至適ｐＨ（８，０〜８．２）での反応が可
能である。

（９）　　高単位まで測定可能である。

（至）界面活性剤や有Ｉｌｌ溶媒の存在下で基質ｎｍ度
を古くする事が出来、さらに高単位まで測定可能である
。また測定時間の大幅な延長が可能になり、これは多種
の自動分析製品に適用でき、測定精度の白子ができる。

以上のごとく、本発明のＣｈＥ活＋ＩＦａｌｌｌ定方法
は従来法の有する問題点を解決し、多くの利点や特徴を
有し、正確かつ簡便にＣｈＥ活性を測定でき、日常の臨
床検査のＣｈＥ活性測定に充分貢献できるものである。

従って本発明のＣｈＥ活竹測定法は、正常人、肝疾患患
者、腎障害を右する患苫等の血清中のＣｈＥ活牲を測定
する方法として、極めて有用である。

３．６　　実施例 以下に実施例により、本発明をさらに詳細に説明−４６
が、本発明はこれによって限定されるものではない。

２−ナフトイル゛クロライド９．５９をベンゼン５ＯＮ
１に溶解した液を、２−ジメチルアミノエタノール１０
ｄｌをベンゼン２００ｄに溶解した液に５〜１０℃に冷
却しながら滴下した。滴下後、室温で一晩攪拌し、反応
させた後、水及び飽和食塩水で洗浄しベンゼン相を無水
硫酸マグネシウム上で乾燥し、？ｎｍ媒を減圧留去し、
１３．７９の油状吻を得た。これをアセトン３００−に
溶解し、ヨウ化メチル７．４ｇの酢酸エチル８０Ｉｄ溶
液を加え室温で一晩放直し、析出した結晶を濾集し、ア
セトンで洗浄後方酸化リン上で真空乾燥し、２−ナフト
イルコリンアイオダイド１７．１ＳＦを得た。

この結晶はシリカゲル１層クロマトグラフィー（ｎ−ブ
タノール：酢酸：水−４：１：２）上で単一スポット（
Ｒ，＝０．３８）を与えた。

融点　２７１〜２７２℃ 元素分析値　０１６Ｈ２ｏＮｏ□Ｉ　（ｍ、ｗ、　３８
５．２４７）実測値（％）Ｃ：４９．８８　　Ｈ：　　
５．３１Ｎ　：　３．５３ 計算値（％）　Ｃ：４９．８８　　Ｈ：　　５．２３Ｎ
：３．６４ Ｕ、■スペクトルおよび１．Ｒスペクトルをそれぞれ第
１図と第２図に示した。

実施例２ 血清ＣｈＥ活性測定方法 Ｉｌｌ　　２００ｍＭトリス−マレイン耐緩耐液ＤＨ８
，０（２５℃） （お　検体 ＋３）　　０．４３３１８基質（２−ＮＣｒ＞ｉ＊（１
）の緩衝液３．０ｄに検体０．０５ｄを加え、２〜１０
分間稈麿３７℃で予加温し、それに（３）のｌ；Ｊ。

質液０．５ｄを加え、同時にストップウォッチをスター
トさせ正確に２０秒、８０秒の３３７　ｎｍにおける吸
光度を測定し１分間当りの吸光度変化を求める。第３図
はタイムコースを示した。

検体はコンセーラＩ（日永製薬社製）を使用した。Ｃｈ
Ｅ活性値は下２の式により８口＞される。

１）Δ０．　Ｄ、　／ｍ１ｌｄよ測定波長３３７ｎｍに
おける１分間当りの吸光度の変化耐。

２）波長３３７０−における分子吸光係数は１４６２で
ある。

上式より使用した血清は、９０２　（Ｉｌｌ／ｊ！　）
中位であった。第３図に示したごとく、ＣｈＥ単位９０
２（ＩＩ／ｊりでは３分ｎｍ１目ｆ時的にタイムラグの
ない直線を示した。これは自動分析製品が使用可能なこ
とを示している。

実施例３ 実施例２の（１）の緩衝液のＤＨを７．８から８．４ま
で変化さＩ！、この方法におけるＣｈＥの至適ｐＨを求
めた。緩衝液のｐｌ＋以外は全て実施例２に従った。そ
の結果を第４図に示した。この条件下では至適ｐｌ＋は
８．０であった。

実施例４ 実施例２の（１）の緩衝液濃度を５０ａＨから３００ｍ
Ｍまで変化させ、この方法における最適緩衝液濃度を求
めた。緩衝液のＳ度以外は全て実施例２に従った。その
結果を第５図に示した。この条件下では最適緩衝液濃度
は２００ｍＭから３００１８であった。

宋Ｊ１九塁 実施例２の（１）のＩ耐液３．　Ｏｊｄ！に（３）の基
質液０．５ａｅを加え、３７℃の保温セルに入れ、波長
３３７　ｒｖにおくｊる吸光度の変化を経時的に追跡し
、ＩＪ質の非Ｍ素的加水分解安定竹を調べた。その結果
は第６図に示したごとく、３０分まではほとんど安定で
あった。基質２−ＮＣＩは至適ｐＨ８，０にａ３いて安
定であるので、検体ごとの試薬ブランクを測定する必要
はない。

実／ｉｆ！ＶＡ６ 実施例２の測定法に従い、基質特異性を調べた。

検体として、プソイドコリンエステラーゼ（シグマ社）
１０ＬＪ／ｄ、ツルーコリンエステラーゼ（シグマ社＞
１０Ｕ／ｍｌ！を使用した。反応性は、吸光度の減少速
度から判断するとプソイドコリンエステラーゼ１に対し
てツルーコリンエステラーゼは０．０２であった。この
ことは、基質２−Ｎ（ｌの特異性の非常に高い事を示し
ている。

実施例７ 実施例２の測定法に従い、反応系での下記の添加物の影
響を調べた。

添加物　　　　　　　　添加量 中　アスコルビン酸　　　０〜２０＃！Ｆ／ｄ　１（Ｊ
　グルコース　　　　　Ｏへ一５００ａｙ／ｄｌ（３）
　　　尿　　酸　　　　　　　　　　　　０〜２　Ｑａ
！Ｆ／ｄ　１（４）　　ヘモグロビン　　　　Ｏ〜５０
０１ｇ／ｄ！（！］）　　アルブミン　　　　　Ｏ〜５
ｇ／ｄＪｔｅｌ　　ビリルビン　　　　　０〜２０＃Ｆ
／ｄ　１（７）　　ゲルタブオン　　　　Ｏ〜５０ｊ１
！Ｆ／ｄＪ（還元型） （０）抗凝固剤 二ｎｍ′１蓚酸　　　　　　　４００ＪＩ！Ｆ／ｄ１酢
　酸　　　　　　　　　　４００Ｊｌｌｆｆ／ｄＪヘパ
リン　　　　　　　２０ＷＩ／ｄｌクエン酸ソーダ　　
　　１び／ｄｉ ＥＤＴΔ−２Ｎａ　　　　２００５ｙ／ｄｊＮａＦ　　
　　　　　　　１ｇ／ｄ１ 測定結果は相対活性（％）で第７図〜第１４図に示した
。ＮａＦはプソイドコリン１ステラーゼの阻害剤である
ので、ＮａＦの存在下では一般にＣｈ　［三ｇ性の測定
はいかなる測定法でも正しい測定法を与えない。従って
、第１４図のＮａＦの結果よりプソイドコリンエステラ
ーゼ活性を測定する場合には、抗凝固剤としてＮａＦは
使用することができない。

１ｍ 実施例２に従い、ｄｎ清の希釈率と酵素活性の関係を調
べた（第１５図）。血清希釈は５％アルブミンを含む生
理食塩水で行った。第１５図に示したごとく、血清希釈
と酵素活性は原点を通過するｉ線内な比例関係にありＧ
ｈＥ活性が低甲位からｎｍｒｎｍ１位まで幅広く測定で
きることが明らかになった。

実施例９ 血清ＣｎｍＥ活　測ｆｌＪ法（ＮＩＫＫＯＬ　　ＮＰ−
１５添加） （１）　　２００ｍＨトリスーマレイン酸！ｌ衝液６％
（ｗ／ｖ）ＮＩＫＫＯＬ　　ＮＰ−１５ｐＨ８，００（
２５℃） （２）　　検体 （３）　　０．６２２ｍＮ基質＜２−ＮＣｌ＞液（１）
の！ｎｍｉ液２．０ＩＩｌに検体０．０５−を加え２〜
１０分間程度３７℃で予加温し、それに（３）の基質液
０．５Ｍ！を加え（測定系全部に対してＮ［ＫＫＯＬ　
　ＮＰ−１５４，フル吊％含有）同時にストップウォッ
チをスタートさせ１確に２０秒、８０秒の３３７ｎｌに
おける吸光度を測定し１分間当りの吸光度変化を求める
。ＣｈＥ活性値は実施例２と同様に求める。

（１）　　２００ｓＨトリス−マレイン酸緩衝液ｐＨ８
，００（２５℃） （２）　　検体 （３）　　　０．　６２２ｇ＊Ｈ基質　（２−ＮＧ！＞
２５．　５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ水溶液測定方法は実施
例９に従う（測定系全部に対してＤＭＳＯ５，０重罎％
含有） 実施例ｎｍ 実施例９．１０に従い、血清の希釈率と酵素活性の関係
を調べた（第１６．１７図）。血清希釈は５％アルブミ
ンを含む生理食塩水で行った。第１６．１７図に示した
ごとく、血清希釈と酵素活性は原点を通過する直線的な
比Ｐ１４ＩＩＩ係にあり（第１６閃ｒＧＪ３０００１Ｕ
／ｌ第１７図ｔ’は２９４０１０／　１まで直線性あり
）　、ＣｈＥ活性が低単位から＾単位まで幅広く測定で
きることが明らかになった。

【図面の簡単な説明】

第１図はａ）２−ナフトイルコリンアイオダイド（濃度
１００μＨｏｔ　）およびｂ）２−ナフトイックＦａ　
（ｎｍｎｍ００μＨｏｆ　）　（７）Ｌｌ、　Ｖ、　ス
ヘ’）　トル［２００１Ｍ　トリス−マレイン酸緩衝液
ｐＨ８，０（２５℃）］を示す。 第２図は２−ナフトイルコリンアイオダイドのＩＲスペ
クトルを示す。 第３図は２−ナフトイルコリンアイオダイドを基質とし
た場合の血清中のＣｈＥｇ竹によるタイムコースを示す
。 第４図はＣｈＥの至適ｐＨを示す。 第５図はＣｈＥ活性におよぼす緩衝液濃度の影響を示す
。 第６図は２−ナフトイルコリンアイオダイドの非酵素的
加水分解安定性を示す。 第７図〜第１４図は添加物の影響を示す。 第１５図は血清希釈と酵素活性との関係を示す。 第１６図は、界面活性剤（ポリオキシエチレンノニルフ
ェニル　エーテル）存在下での血清希釈と酵素活性との
関係を示す。 第１７図は有機溶！！　（ＤＭＳＯ）存在下での血□ 清希釈と酵素活性との関係を示す。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中Ｘはハロゲン原子を表わす）で表わされる新規コ
   リン誘導体。
2. （２）一般式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） （式中Ｘはハロゲン原子を表わす）で表わされる新規コ
   リン誘導体を基質として用いることを特徴とするコリン
   エステラーゼ活性の測定法。
3. （３）コリンエステラーゼを含む検体と一般式（ I ）
   で表わされる新規コリン誘導体とを混合し、次いで紫外
   線（ＵＶ）領域における吸光度を測定することによりコ
   リンエステラーゼ活性を測定する特許請求の範囲第２項
   記載のコリンエステラーゼ活性の測定法。
4. （４）新規コリン誘導体が、２−ナフトイルコリンアイ
   オダイドである特許請求の範囲第３項記載のコリンエス
   テラーゼ活性の測定法。
5. （５）波長約３３７〜約３５５ｎｍでの吸光度を測定す
   る特許請求の範囲第３項又は第４項記載のコリンエステ
   ラーゼ活性の測定法。
6. （６）界面活性剤又は有機溶媒の存在下に測定を行なう
   特許請求の範囲第３項〜第５項のいずれか１項記載のコ
   リンエステラーゼ活性の測定法。