CN103091409A - 一种低聚果糖菊粉纯度的鉴定方法 - Google Patents

一种低聚果糖菊粉纯度的鉴定方法 Download PDF

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一种低聚果糖菊粉纯度的鉴定方法，通过将菊粉用菊粉酶酶解，然后用HPLC法确定低聚果糖菊粉酶解前、酶解后样品中果糖和葡萄糖的含量，分别计算果糖和葡萄糖酶解前后含量差异，果糖酶解前后百分比差值与葡萄糖酶解前后百分比差值之和乘以0.9，折算成菊粉的纯度；具体包括下述步骤：1）配制果糖、葡萄糖对照品溶液；2）色谱条件的设定；3）菊粉样品处理；4）HPLC分析计算果糖和葡萄糖的含量；5）菊粉纯度的鉴别。本发明通过将菊粉用菊粉酶酶解，然后用HPLC分析其酶解前后果糖和葡萄糖的变化，最终准确鉴定出菊粉纯度，并由此判断产品是否合格，比现在传统的方法更加科学，更加合理。

Description

一种低聚果糖菊粉纯度的鉴定方法
技术领域
本发明涉及一种通过HPLC法分析确定酶解前菊粉和酶解后菊粉的果糖和葡萄糖含量差异，并计算出菊粉真实纯度。
背景技术
菊粉( Inulin) 属于线型菊糖型果聚糖，作为一种天然的功能性多糖，具有水溶性膳食纤维和生物活性前提的生理功能，具有超强的增殖双歧杆菌的功能，对于调节机体平衡、恢复胃肠功能、提高免疫力、促进矿物质钙、镁、锌、铜等的吸收、调节血糖、降低血脂、预防肥胖症以及抗癌等生理作用，预防各种疾病、维护身体健康有着极为重要的作用，可广泛用于低热量、低糖、低脂食品中。据文献报导直链结构的果聚糖的纯度在70％以上菊粉在防治高尿酸血症的药物及保健品中也具广泛前途。
菊粉已被世界上多个国家批准作为食品的营养增补剂。日本厚生省批准菊粉为特定保健食品，应用于多种食品中。美国食品和药物管理局批准菊粉为公认的安全级食品配料。欧洲则把它作为控制胆固醇水平的功能性甜味剂广泛应用。我国菊粉的生产也已广泛应用在食品工业。
美国药典等对菊粉的质量控制有许多项，包括溶液澄清度、比旋度、含量、干燥失重、炽灼残渣、硫酸盐、氯化物、重金属等理化检测项目，这些检测项目基本反映了菊粉的特性，可以判断产品是否合格，然而美国药典中含量检测方法中相关试剂不易获得，操作过程繁琐，重现性差。而菊粉含量是反映产品纯度的一个重要指标，对保健功效直接有影响。
目前菊粉常用的测定方法为苯酚-硫酸法，苯酚-硫酸法测定结果为样品总糖含量，菊粉含量等于总糖含量减去还原糖含量所得，无法识别其中的蔗糖、葡聚糖和葡萄糖，即测定结果中菊粉含量有误。国内文献报道菊粉的定量分析方法为高效液相色谱法( High Performance Liquid Chromatography ,HPLC)。用HPLC 法, 以菊粉多糖的某一单体成分作为标准品测定菊粉含量的方法比较复杂, 因为国内菊粉的单体成分不易获得，因此目前的常规分析方法硫酸-苯酚法不能正确检测出产品的纯度。
发明内容
本发明的目的是提供一种低聚果糖菊粉纯度的鉴定方法，通过将菊粉用菊粉酶酶解，然后用HPLC 分析其酶解前后果糖和葡萄糖的变化，由此计算菊粉的纯度，最终准确鉴定出菊粉真实纯度，并由此判断产品是否合格，比现在传统的方法更加科学，更加合理。
本发明是这样实现的：一种低聚果糖菊粉纯度的鉴定方法，其特征在于：通过将菊粉用菊粉酶酶解，然后用HPLC法确定低聚果糖菊粉酶解前、酶解后样品中果糖和葡萄糖的含量，分别计算果糖和葡萄糖酶解前后含量差异，果糖酶解前后百分比差值与葡萄糖酶解前后百分比差值之和乘以0.9，折算成菊粉的纯度；具体包括下述步骤：
    1）、配制果糖、葡萄糖对照品溶液：配制成浓度为10mg/ml的果糖对照品溶液，和浓度为1mg/ml的葡萄糖对照品溶液； 
2）、 色谱条件的设定：检测器：示差折光检测器  检测器温度50℃；
色谱柱：Phenomenex  Rezex  Ca2+ ；柱温：80℃；流动相：纯化水；流速：0.50ml/min；进样量：25μ1；运行时间：30~40min； 
3）、菊粉样品处理：供试品（1）：精密称取菊粉样品1.0g置100ml容量瓶中，加入适量水，加热溶解，冷却至温室，用定容至刻度； 
供试品（2）：向浓度为5～30%的菊粉溶液，按每克菊粉加入菊粉酶1～30U混合，在40～70℃水浴中酶解1～36小时；
4）、HPLC分析计算果糖和葡萄糖的含量： 按色谱条件供试品（1）进样，得到菊粉酶解前果糖、葡萄糖的峰面积，参照对照品的面积，计算菊粉中的果糖、葡萄糖含量；按色谱条件供试品（2）进样，得到菊粉酶解后果糖、葡萄糖的峰面积，参照对照品的面积，计算菊粉中的果糖、葡萄糖含量；
5）、菊粉纯度的鉴别：供试品（2）酶解后样品的果糖和葡萄糖含量减去供试品（1）样品的果糖和葡萄糖含量，再乘以0.9，从而确定菊粉样品的纯度；观察其是否符合正常范围，由此判断供试品菊粉纯度是否合格；所述0.9为菊粉中脱水果糖或脱水葡萄糖与果糖或葡萄糖的分子量的比率。
本发明所述的菊粉酶为：菊粉外切酶 、菊粉内切酶、菊粉混合酶其中的一种或两种、三种的混合物。
本发明通过将菊粉用菊粉酶酶解，然后用HPLC 分析其酶解前后果糖和葡萄糖的变化，由此计算菊粉的纯度，最终准确鉴定出菊粉真实纯度，并由此判断产品是否合格，比现在传统的方法更加科学，更加合理。
附图说明
图1 是本发明实施例1五批菊粉酶解前后果糖、葡萄糖含量变化及菊粉纯度（%）。
图2 是本发明实施例2五批菊粉酶解前后果糖、葡萄糖含量变化及菊粉纯度（%）。
图3 是本发明实施例3五批菊粉酶解前后果糖、葡萄糖含量变化及菊粉纯度（%）。
图4是现有技术五批菊粉酶解前后果糖、葡萄糖含量变化及菊粉纯度（%）。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1：
1）果糖对照品溶液配制：准确称取果糖对照品50mg至5ml容量瓶中，配制成浓度10mg/ml的果糖标准液，过0.45um待测；葡萄糖对照品溶液配制：准确称取葡萄糖对照品10mg至10ml容量瓶中，配制成浓度1mg/ml的葡萄糖标准液，过0.45um待测；
2）色谱条件的设定：检测器：示差折光检测器  检测器温度50℃；色谱柱：Phenomenex  Rezex  Ca2+ ；柱温：80℃；流动相：纯化水；流速：0.50ml/min；进样量：25μ1；运行时间：30min； 
3）菊粉样品处理：供试品（1）：精密称取菊粉样品1.0g置100ml容量瓶中，加入适量水，加热溶解，冷却至温室，用定容至刻度。供试品（2）：精密称取菊粉样品1.0g置100ml容量瓶中，加入10ml水，加热溶解，冷却至温室，分别添加菊粉内切酶菊粉、外切酶入菊粉酶各5U，混合均匀，置60℃水浴振荡器中加热12小时，沸水浴灭活酶，用水定容至100ml，充分摇均，离心，取上清液过滤，进样。
4）HPLC分析计算果糖和葡萄糖的含量： 按色谱条件供试品（1）进样，得到菊粉酶解前果糖、葡萄糖的峰面积，参照对照品的面积，计算菊粉中的果糖、葡萄糖含量；按色谱条件供试品（2）进样，得到菊粉酶解后果糖、葡萄糖的峰面积，参照对照品的面积，计算菊粉中的果糖、葡萄糖含量；
5）菊粉纯度的鉴别：供试品（2）酶解后样品的果糖和葡萄糖含量减去供试品（1）样品的果糖和葡萄糖含量，再乘以0.9，从而确定菊粉样品的纯度；观察其是否符合正常范围，由此判断供试品菊粉纯度是否合格；所述0.9为菊粉中脱水果糖或脱水葡萄糖与果糖或葡萄糖的分子量的比率；结果见图1。
实施例2：
1）果糖对照品溶液配制：准确称取果糖对照品50mg至5ml容量瓶中，配制成浓度10mg/ml的果糖标准液，过0.45um待测；葡萄糖对照品溶液配制：准确称取葡萄糖对照品10mg至10ml容量瓶中，配制成浓度1mg/ml的葡萄糖标准液，过0.45um待测；
2）色谱条件的设定：检测器：示差折光检测器  检测器温度50℃；色谱柱：Phenomenex  Rezex  Ca2+ ；柱温：80℃；流动相：纯化水；流速：0.50ml/min；进样量：25μ1；运行时间：35min； 
3）菊粉样品处理：供试品（1）：精密称取菊粉样品1.0g置100ml容量瓶中，加入适量水，加热溶解，冷却至温室，用定容至刻度。供试品（2）：精密称取菊粉样品0.5g置50ml容量瓶中，加入10ml水，加热溶解，冷却至温室，分别添加菊粉内切酶菊粉、外切酶入菊粉酶各0.5U，混合均匀，置40℃水浴振荡器中加热36小时，沸水浴灭活酶，用水定容至50ml，充分摇均，离心，取上清液过滤，进样。
4）HPLC分析计算果糖和葡萄糖的含量： 按色谱条件供试品（1）进样，得到菊粉酶解前果糖、葡萄糖的峰面积，参照对照品的面积，计算菊粉中的果糖、葡萄糖含量；按色谱条件供试品（2）进样，得到菊粉酶解后果糖、葡萄糖的峰面积，参照对照品的面积，计算菊粉中的果糖、葡萄糖含量；
5）菊粉纯度的鉴别：供试品（2）酶解后样品的果糖和葡萄糖含量减去供试品（1）样品的果糖和葡萄糖含量，再乘以0.9，从而确定菊粉样品的纯度；观察其是否符合正常范围，由此判断供试品菊粉纯度是否合格；所述0.9为菊粉中脱水果糖或脱水葡萄糖与果糖或葡萄糖的分子量的比率；结果见图2。
实施例3：
1）果糖对照品溶液配制：准确称取果糖对照品50mg至5ml容量瓶中，配制成浓度10mg/ml的果糖标准液，过0.45um待测；葡萄糖对照品溶液配制：准确称取葡萄糖对照品10mg至10ml容量瓶中，配制成浓度1mg/ml的葡萄糖标准液，过0.45um待测；
2）色谱条件的设定：检测器：示差折光检测器  检测器温度50℃；色谱柱：Phenomenex  Rezex  Ca2+ ；柱温：80℃；流动相：纯化水；流速：0.50ml/min；进样量：25μ1；运行时间：35min； 运行时间：40min； 
3）菊粉样品处理：供试品（1）：精密称取菊粉样品1.0g置100ml容量瓶中，加入适量水，加热溶解，冷却至温室，用定容至刻度。供试品（2）：精密称取菊粉样品3.0g置100ml容量瓶中，加入10ml水，加热溶解，冷却至温室，分别添加菊粉混合酶30U，混合均匀，置70℃水浴振荡器中加热1小时，沸水浴灭活酶，用水定容至100ml，充分摇均，离心，取上清液过滤，进样。
4）HPLC分析计算果糖和葡萄糖的含量： 按色谱条件供试品（1）进样，得到菊粉酶解前果糖、葡萄糖的峰面积，参照对照品的面积，计算菊粉中的果糖、葡萄糖含量；按色谱条件供试品（2）进样，得到菊粉酶解后果糖、葡萄糖的峰面积，参照对照品的面积，计算菊粉中的果糖、葡萄糖含量；
5）菊粉纯度的鉴别：供试品（2）酶解后样品的果糖和葡萄糖含量减去供试品（1）样品的果糖和葡萄糖含量，再乘以0.9，从而确定菊粉样品的纯度；观察其是否符合正常范围，由此判断供试品菊粉纯度是否合格；所述0.9为菊粉中脱水果糖或脱水葡萄糖与果糖或葡萄糖的分子量的比率；结果见图3。
我们在进行上述试验的时候，同时根据文献《紫外分光光度计法测定菊粉多糖》【安徽农业科学,Journal of Anhui Agri .Sci .2008 ,36(13) :5251 – 5253】中硫酸蒽酮法及硫酸苯酚法对上述5批产品进行了同步进行了测定。结果见图4。
综述上述结果，从图一与图四对比可以发现：我们目前常用的检测方法硫酸蒽酮法、硫酸苯酚法结果于高于真实含量，对于纯度高的样品检测结果均高于酶解法结果3%～4%，结果差值也相对稳定，但对于国产样品1用硫酸蒽酮法、硫酸苯酚法分别为102.75%、91.88%，但用酶解法只有69.31%。硫酸蒽酮法、硫酸苯酚法均由于无法识别其中的蔗糖、葡聚糖、葡萄糖，即由于方法的本身的局限性，测定结果含有一定误差。因此本方案从菊粉的分子结构方面，提出用酶解的方法，折算出菊粉的真实纯度，比现在传统的方法更加科学，更加合理。

Claims (2)

1.一种低聚果糖菊粉纯度的鉴定方法，其特征在于：通过将菊粉用菊粉酶酶解，然后用HPLC法确定低聚果糖菊粉酶解前、酶解后样品中果糖和葡萄糖的含量，分别计算果糖和葡萄糖酶解前后含量差异，果糖酶解前后百分比差值与葡萄糖酶解前后百分比差值之和乘以0.9，折算成菊粉的纯度；具体包括下述步骤：
    1）、配制果糖、葡萄糖对照品溶液：配制成浓度为10mg/ml的果糖对照品溶液，和浓度为1mg/ml的葡萄糖对照品溶液； 
2）、 色谱条件的设定：检测器：示差折光检测器  检测器温度50℃；
色谱柱：Phenomenex  Rezex  Ca2+ ；柱温：80℃；流动相：纯化水；流速：0.50ml/min；进样量：25μ1；运行时间：30~40min； 
3）、菊粉样品处理：供试品（1）：精密称取菊粉样品1.0g置100ml容量瓶中，加入适量水，加热溶解，冷却至温室，用定容至刻度； 
供试品（2）：向浓度为5～30%的菊粉溶液，按每克菊粉加入菊粉酶1～30U混合，在40～70℃水浴中酶解1～36小时；
4）、HPLC分析计算果糖和葡萄糖的含量：按色谱条件供试品（1）进样，得到菊粉酶解前果糖、葡萄糖的峰面积，参照对照品的面积，计算菊粉中的果糖、葡萄糖含量；按色谱条件供试品（2）进样，得到菊粉酶解后果糖、葡萄糖的峰面积，参照对照品的面积，计算菊粉中的果糖、葡萄糖含量；
5）菊粉纯度的鉴别：供试品（2）酶解后样品的果糖和葡萄糖含量减去供试品（1）样品的果糖和葡萄糖含量，再乘以0.9，从而确定菊粉样品的纯度；观察其是否符合正常范围，由此判断供试品菊粉纯度是否合格；所述0.9为菊粉中脱水果糖或脱水葡萄糖与果糖或葡萄糖的分子量的比率。
2.根据权利要求1 所述的一种低聚果糖菊粉纯度的鉴定方法，其特征在于：所述的菊粉酶为：菊粉外切酶 、菊粉内切酶、菊粉混合酶其中的一种或两种、三种的混合物。
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