CN1877309A

CN1877309A - 铁氰化钾－鲁米诺化学发光体系定量甜叶菊糖苷的方法

Info

Publication number: CN1877309A
Application number: CN 200610010277
Authority: CN
Inventors: 郝再彬; 杨丹; 苍晶; 王贵民; 一井真比古
Original assignee: 郝再彬
Current assignee: Jining Aoxing Stevia Products Co., Ltd.
Priority date: 2006-07-12
Filing date: 2006-07-12
Publication date: 2006-12-13
Anticipated expiration: 2026-07-12
Also published as: CN100476410C

Abstract

本发明提供了铁氰化钾－鲁米诺化学发光体系定量甜叶菊糖苷的方法。配制不同浓度的Fe(CN)^3－ ₆溶液、3－氨基苯二甲酰环肼(Luminol)溶液和甜叶菊糖苷标准溶液；用分光光度计在190～1100nm下对甜叶菊糖苷标准溶液进行全波长扫描；在主动泵分别将载流Luminol和甜叶菊糖苷溶液以45r/min的流速通过相应的管道进行三通混合，输入分析系统；副动泵将Fe(CN)^3－ ₆溶液以35r/min的流速通过十六通注射阀注入于载流中，与其混合；K₃Fe(CN)₆－Luminol为空白发光体系(I₀)，样品增强信号(I_S)，取峰值(ΔI＝I_S－I₀)进行定量，发光强度以计数表示。本发明将物理学的流动注射和化学的化学发光相结合，利用化学物质在氧化还原反应过程中有荧光或磷光，对该部分光信号转变成电信号，再进一步信号放大，依据发光强度达到定量分析的目的。

Description

铁氰化钾-鲁米诺化学发光体系定量甜叶菊糖苷的方法

一、技术领域：

本发明设计的是一种检测方法，具体地说是一种甜叶菊糖苷的检测方法。

二、背景技术：

目前糖尿病患者逐渐增加，另外正常人过量摄取可吸收性糖也不利于身体健康，为此具有与蔗糖口感相近，同时为非吸收性糖的甜味剂开发利用是今后的发展方向。

在世界上许可添加的几大类甜味剂中，一半来自化工合成，另一半来自于天然植物。随着人们生活水平的不断提高，越来越倾向于使用天然植物无能量甜味剂。

在天然植物无能量甜味剂中甜度比较高的有甜叶菊植物，其糖作为甜味剂应用也是近十几年的事。甜叶菊植物中有7种甜味成分，但主要含量是蔗糖甜度300倍的St(Stevioside)和450倍的RA(Rebaudioside A，或称为甜菊A₃：Stevioside A₃)。由于其甜度高、无能量等特性而被广泛地应用于食品、保健品、药品、化妆品、抗氧化食用商品、饲料添加剂等行业。

随着甜菊糖应用范围不断地扩大，快速检测手段也越来越受重视。目前分析检测方法有(1)分光光度计比色(黄海水，林静1990；付宝忠，史立华1995；项秀珠，郭秀珠1996)、(2)薄层色谱(黄雨三2003)、(3)高压液相色谱紫外检测(黄晓兰，倪尔葭1990；坂牧成恵等2004)、(4)毛细管电泳紫外检测(邵寒娟，胡涌刚2001)等方法。薄层色谱法的化学试剂比较多，适合于小样品的纯化。高压液相色谱法和毛细管电泳法仪器比较贵，同时要有该专业技术人员，一般甜叶菊糖苷加工厂不易实现。此外高压液相色谱法和毛细管电泳法等仪器不方便携带，在农业甜叶菊的育种和栽培生产中的随时监控等实际应用比较困难。这4种方法都适合于大学及研究所对甜叶菊糖苷的研究。

化学发光分析法由于其灵敏度高，线性范围宽，仪器设备简单，越来越受人们青睐。到目前为止(2006年4月28日黑龙江省科技情报局信息中心查新)，未见化学发光测定甜叶菊糖苷的报道。我们发表了“流动注射化学发光法测定甜叶菊糖苷”为题的文章，2005年刊载于“化学工程师”04：23～25。在此基础之上，我们对甜叶菊糖苷的定量测定又增加了Luminol进行深入研究，结果表明在NaOH碱性介质中，甜叶菊糖苷可以增敏Luminol-Fe(CN)₆ ³-体系产生化学发光这一现象，为此提出一种测定甜叶菊糖苷的化学发光体系，即：铁氰化钾-鲁米诺化学发光体系，并结合流动注射技术，建立起了一种简单、快速测定甜叶菊糖苷的新方法。该方法比发表过的文章内容更加灵敏，而且有很好的选择性。

三、发明内容：

本发明的目的在于提供一种操作简单，检测成本低，适合于做常规性测定、易于被生产厂家所应用的铁氰化钾-鲁米诺化学发光体系定量甜叶菊糖苷的方法。

本发明的目的是这样实现的：

用NaOH溶液作为溶剂，配制不同浓度的Fe(CN)^3- ₆；3-氨基苯二甲酰环肼(Luminol)用pH值为8.0-12.0的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液配制成溶液；称取甜叶菊糖苷溶于无水乙醇，用水定容，配制成甜叶菊糖苷标准溶液(10mg/mL)储存于棕色容量瓶中；用分光光度计在190～1100nm下对甜叶菊糖苷标准溶液进行全波长扫描；调控MPI-B型测定仪器的载流：在主动泵分别将载流Luminol和甜叶菊糖苷溶液以45r/min的流速通过相应的管道进行三通混合，输入分析系统；待基线平稳后，副动泵将Fe(CN)₆ ^3-溶液以35r/min的流速通过十六通注射阀注入于载流中，与其混合；K₃Fe(CN)₆-Luminol为空白发光体系(I₀)，样品增强信号(I_S)，取峰值(ΔI＝I_S-I₀)进行定量，发光强度以计数表示。

本发明还可以包括这样一些特征：

1、所述的Fe(CN)₆ ^3-的浓度为1mol/L～1×10^-6mol/L；

2、所述的NaOH溶液的浓度为1mol/L～0.01mol/L；

3、所述的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液的pH值为8.0～10.0；

4、甜叶菊糖苷在0.05～10mg/mL的浓度范围内与化学发光强度呈线性关系，其回归方程为ΔI＝360.8×(mg/mL)+286.3，r²＝0.9941。

本发明采用流动注射化学发光法，操作简单，检测成本低，适合于做常规性测定易于被生产厂家所应用。本发明所使用的仪器是MPI-B型多参数化学发光测试分析系统。它是具有独特电化学发光检测功能的“毛细管电泳电化学发光检测仪”，由中国科学院长春应用化学所与西安瑞迈电子科技有限公司合作研制成功，并通过鉴定。有关专家认为，这种具有我国自主知识产权的仪器，创新性显著，设计制作新颖，达到国际领先水平。该电化学分析仪器可用于药物、氨基酸、多肽、蛋白质及核酸等的检测分析，并可适用于蛋白质与药物、核酸相互作用的研究，在生化、医药、临床，免疫等方面有着广阔的应用前景。它与相关领域通常应用的进口“毛细管电泳激光诱导荧光分析仪”相比，大大降低了成本。因此由该仪器进行分析、测定建立起来的技术平台也将具有我国独立自主的知识产权。该方法具有国际先进水平。

本发明将物理学的流动注射和化学的化学发光相结合，利用化学物质在氧化还原反应过程中有荧光或磷光，对该部分光信号转变成电信号，再进一步信号放大，依据发光强度达到定量分析的目的。

本发明的方法应用领域广泛，可以应用于：

1)工业：甜叶菊糖苷的提取、纯化等工业化生产的随时监控；

2)农业：在甜叶菊栽培和育种的种植中，甜叶菊糖苷含量质量监控；

3)原料收购：收购甜叶菊叶片(或茎秆)时，其中的甜叶菊糖苷含量测定；

4)相关终端产品：在食品、保健品、药品、化妆品、添加甜叶菊糖苷的抗氧化商品以及饲料添加剂中，甜叶菊糖苷被浓缩之后用该方法测定等。

五、附图说明

图1是两种主要的甜叶菊糖苷分子结构，R为H时是st；R为葡萄糖时是RA。

四、具体实施方式：

1仪器设备：

1.1MPI-B型多参数化学发光分析测试系统(西安瑞迈电子有限公司)。整个分析过程中采样、注样、实验数据采集及处理，均由Windows XP系统下MPI-B型多参数化学发光分析测试系统软件完成。

1.2UV-1600紫外可见分光光度计：北京瑞利分析仪器公司。

2材料与试剂：

2.1材料：新鲜甜叶菊叶片，本实验室栽培；甜叶菊糖苷，哈尔滨市绿叶科技有限公司。

2.2试剂：(1)用0.1mol/L NaOH作为溶剂，配制不同浓度的Fe(CN)^3- ₆。3-氨基苯二甲酰环肼(Luminol)为Sigma公司产品(用pH值为9.2的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液配制)。(2)甜叶菊糖苷标准溶液(10mg/mL)：称取甜叶菊糖苷溶于无水乙醇，用水定容，储存于棕色容量瓶中备用。其余试剂均为分析纯，水为二次去离子水。

3操作方法

3.1定性分析：用分光光度计在190～1100nm下对甜叶菊糖苷标准溶液进行全波长扫描。

3.2MPI-B型的载流调控：在主动泵分别将载流Luminol和甜叶菊糖苷溶液以45r/min的流速通过相应的管道进行三通混合，输入分析系统。待基线平稳后，副动泵将Fe(CN)₆ ^3-溶液以35r/min的流速通过十六通注射阀(注样时间：10秒)注入于载流中，与其混合。K₃Fe(CN)₆-Luminol为空白发光体系(I₀)，样品增强信号(I_S)，取峰值(ΔI＝I_S-I₀)进行定量，发光强度以计数表示。

4结果与分析

4.1氧化剂的选择

在酸性介质(1mol/L H₂SO₄)中KMnO₄和碱性介质(0.4mol/L NaOH)中Fe(CN)₆ ^3-、H₂O₂分别做氧化剂进行直接氧化甜叶菊糖苷的化学发光研究。结果表明，仅有KMnO₄和Fe(CN)^3- ₆做氧化剂时，产生化学发光，而Fe(CN)₆ ^3-在该体系中表现出最好的发光特性。本文选择碱性的Fe(CN)₆ ^3-作为氧化剂来测定甜叶菊糖苷。

4.2Fe(CN)₆ ^3-浓度影响

Fe(CN)₆ ^3-的用量对该体系的化学发光强度有很大的影响。本文在固定了甜叶菊糖苷和碱的浓度下，详细考察了不同浓度的Fe(CN)₆ ^3-(0～1×10^-3mol/L)对该化学发光反应的影响。结果表明，当Fe(CN)₆ ^3-的浓度为5×10^-4mol/L时，发光强度最大。

4.3NaOH浓度的影响

Fe(CN)₆ ^3-只有在碱性介质中，才能氧化甜叶菊糖苷产生化学发光。试验表明，NaOH的最佳浓度为0.1mol/L。

4.4Luminol浓度及pH值的影响

固定其它试验条件，随Luminol浓度的升高，ΔI增加越大，反应越灵敏。从灵敏度及节省溶剂角度考虑，选用0.03mmol/l的Luminol溶液。

Luminol的化学发光反应需要在碱性介质中进行，介质的pH值会影响化学发光强度。本文选用Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液为Luminol的介质，考察了缓冲溶液pH值在8.0-12.0范围内对ΔI的影响，结果表明，当缓冲液pH值为9.2时，ΔI达到最大，由于实验中K₃Fe(CN)₆用0.1mol/LNaOH溶液配制，实际经管道混合后检测流出废液的pH值为9.8。

4.5表面活性剂的影响

表面活性剂对许多化学发光体系有影响(Alwarthan 1996)，能显著地改变化学发光强度。研究了1种非离子型表面活性剂(Tween80)，1种阳离子型表面活性剂(碘化四甲胺)，1种阴离子表面活性剂(十二烷基磺酸钠：SDS)，对该化学发光体系的影响。结果表明，这些表面活性剂对该化学发光体系均不产生显著的影响。

4.6流速的影响

在流动注射分析中，流速是影响分析特性的一个很重要的因素。在该化学发光流动体系中，流速太慢会导致最大发光在流通池之前；流速太快会导致最大发光在流通池之后。主动泵和副动泵的每分钟转数为0～99，对它们的转数进行了组合设定，发现该体系的最佳转数分别为45r/min和35r/min。此时，最大发光在流通池中，恰好能被光电倍增管完全检测。

4.7该化学发光体系的特性分析

在上述选定的最佳实验条件下，甜叶菊糖苷在0.05～10mg/mL的浓度范围内与化学发光强度呈线性关系，其回归方程为ΔI＝360.8×(mg/mL)+286.3，r²＝0.9941，检出限为0.05mg/mL。对5mg/mL甜叶菊糖苷溶液连续测定，每次得5个峰值，重复7次，相对标准差为1.7％，回收率为98％～108％。

4.8标准溶液甜叶菊糖苷的扫描

甜叶菊糖苷在全波长(190～1100nm)扫描的研究结果表明，223nm、231nm的紫外有最大吸收峰。哈尔滨市绿叶科技有限公司生产的甜叶菊糖苷和本实验室栽培的甜叶菊叶片提取物都有相同的紫外最大吸收峰。坂牧成恵等(2004)利用高压液相色谱紫外检测法，在210nm波长下检测出了St和RA[食品卫生志(日文)，45(2)：81～86]。

4.9干扰实验

甜叶菊糖苷来源于叶片，在提取过程中共存其他组分，它们可能对该化学发光体系测定甜叶菊糖苷有一定的影响。为此，研究了1000倍的Na⁺、Cl^-、K⁺、Br^-、CO₃ ^2-、SO₄ ^2-和NO₃ ^-；100倍的淀粉、糊精以及无水乙醇等分别对1mg/mL的甜叶菊糖苷进行干扰测定实验。结果表明，它们不干扰测定，因此可以用无水乙醇或水溶解甜叶菊糖苷。100倍蔗糖、葡萄糖、麦芽糖对测定无干扰。

4.10该化学发光方法测定叶片中的甜叶菊糖苷含量

该方法已经成功地用于甜叶菊叶片中糖苷含量的测定。取本实验室栽培的甜叶菊叶片，105℃下干燥30min后80℃下干燥5h，称重研细，用无水乙醇提取、振荡过夜。次日10000rpm离心10min，取出上清用无水乙醇定溶到100mL。用该化学发光方法在线性范围内测定，重复三次。测定结果表明，干叶片中甜叶菊糖苷含量为9.28％。

Claims

1、一种铁氰化钾-鲁米诺化学发光体系定量甜叶菊糖苷的方法，其特征是：

(1)用NaOH溶液作为溶剂，配制不同浓度的Fe(CN)^3- ₆；

(2)3-氨基苯二甲酰环肼(Luminol)用pH值为8.0-12.0的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液配制成溶液；

(3)称取标准甜叶菊糖苷溶于无水乙醇，用水定容，配制成甜叶菊糖苷标准溶液(10mg/mL)储存于棕色容量瓶中；

(4)用分光光度计在190～1100nm下对甜叶菊糖苷标准溶液进行全波长扫描；

(5)MPI-B型测定仪器的载流调控：在主动泵分别将载流Luminol和甜叶菊糖苷溶液以45r/min的流速通过相应的管道进行三通混合，输入分析系统；待基线平稳后，副动泵将Fe(CN)₆ ^3-溶液以35r/min的流速通过十六通注射阀注入于载流中，与其混合；K₃Fe(CN)₆-Luminol为空白发光体系(I₀)，样品增强信号(I_S)，取峰值(ΔI＝I_S-I₀)进行定量，发光强度以计数表示。

2、根据权利要求1所述的铁氰化钾-鲁米诺化学发光体系定量甜叶菊糖苷的方法，其特征是：所述的Fe(CN)₆ ^3-的浓度为1mol/L～1×10^-6mol/L。

3、根据权利要求2所述的铁氰化钾-鲁米诺化学发光体系定量甜叶菊糖苷的方法，其特征是：所述的NaOH溶液的浓度为1mol/L～0.01mol/L。

4、根据权利要求3所述的铁氰化钾-鲁米诺化学发光体系定量甜叶菊糖苷的方法，其特征是：所述的Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液的pH值为8.0～10.0。

5、根据权利要求4所述的铁氰化钾-鲁米诺化学发光体系定量甜叶菊糖苷的方法，其特征是：甜叶菊糖苷在0.05～10mg/mL的浓度范围内与化学发光强度呈线性关系，其回归方程为ΔI＝360.8x(mg/mL)+286.3，r²＝0.9941。