WO2012147822A1 - 油劣化の判定方法およびこれを用いる装置 - Google Patents

油劣化の判定方法およびこれを用いる装置 Download PDF

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WO2012147822A1
WO2012147822A1 PCT/JP2012/061149 JP2012061149W WO2012147822A1 WO 2012147822 A1 WO2012147822 A1 WO 2012147822A1 JP 2012061149 W JP2012061149 W JP 2012061149W WO 2012147822 A1 WO2012147822 A1 WO 2012147822A1
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WO
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enzyme
acid
formic acid
fdh
measuring
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PCT/JP2012/061149
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徳林 程
早出　広司
若子 津川
隆 飯野
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国立大学法人東京農工大学
大生工業株式会社
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/77—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
    • G01N21/78—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour

Definitions

  • the present invention relates to a highly sensitive, rapid and simple biosensing system for measuring various organic acids produced by oxidative degradation of oil such as lubricating oil and biodiesel fuel (BDF).
  • oil such as lubricating oil and biodiesel fuel (BDF).
  • the content of various organic acids generated by oxidation is used as an index of deterioration of oil such as lubricating oil and BDF.
  • an acid value is used as an index of oxidative degradation of oil. This is expressed as the number of mg of KOH required to neutralize 1 g of oil. That is, the content of organic acid is an indicator of deterioration. It is desirable to determine the deterioration of oil such as lubricating oil and BDF by measuring the total acid number of the oil at the site where it is used and immediately dealing with it.
  • Biosensor is a collective term for selective and highly sensitive chemical measurement technology and devices by combining the excellent molecular recognition function of living organisms with detection technology such as chemical sensors or physical sensors. An analysis system using such technology.
  • Molecules to be measured by biosensors include biologically related organic compounds such as glucose, inorganic compounds, proteins, and not single compounds, but also toxic substances or mutagenic and environmental hormones.
  • Various categories of molecules depending on the recognition function of the living body such as a group of compounds having specific physiological activities, are targeted.
  • organic acid measurement there are already reports on organic acid measurement.
  • Biosensors targeting organic acids are microbial sensors developed in the early days of biosensor research in the 1980s (microorganisms are used as molecular recognition elements, and many are based on respiratory activity).
  • Microbial sensors can achieve high-sensitivity analysis, but there are many problems such as difficulty in ensuring reproducibility in selectivity and sensor creation technology, and its application range is analysis of group-specific molecular species in environmental measurement, etc. Currently, it is in practical use. Acetic acid and formic acid sensors have been reported as organic acid measuring microorganism sensors, but they were not suitable for practical use in both sensitivity and reproducibility.
  • Patent Document 1 discloses a substrate quantification method using a reaction reagent comprising a dehydrogenase, a coenzyme, an electron mediator, and a tetrazolium salt.
  • this method is not a method for quantifying formic acid or the like as an organic acid produced by oil degradation.
  • formic acid dehydrogenase, Methoxy PMS (mPMS), which is an electron transfer substance, and WST1, which is a redox coloring indicator are added, and yellow formazan is measured by absorbance at a wavelength of 438 nm.
  • mPMS Methoxy PMS
  • WST1 which is a redox coloring indicator
  • Patent Document 3 describes a method for quantifying propionic acid using propionyl CoA transferase and acyl CoA oxidase.
  • this method is not a method for quantifying propionic acid as an organic acid generated by oil degradation.
  • the present invention is a new method that is quick, simple, and highly sensitive, replacing conventional methods that involve complicated methods, procedures, and operations for analyzing formic acid, acetic acid, and propionic acid, which are indicators of oxidative degradation of lubricating oils and oils such as BDF.
  • the task is to develop analytical methods.
  • the present inventor can easily measure the formic acid concentration by subjecting the enzymatic reaction product of formic acid and formate dehydrogenase to color detection or electrochemical detection, Acetic acid concentration can be easily measured by subjecting the enzyme reaction product of acetic acid and acetate kinase to color detection or electrochemical detection, and the enzyme reaction product of propionic acid and propionyl CoA transferase is subjected to color detection or electrochemical detection
  • the propionic acid concentration can be easily measured, and by combining these, the deterioration of the oil can be measured by using at least one of the concentrations of formic acid, acetic acid and propionic acid as an index, and the present invention is completed. It came to.
  • the present invention is as follows. (1) (i) at least one of an enzyme using formic acid as a substrate, an enzyme using acetic acid as a substrate, and an enzyme using propionic acid as a substrate, and a sample containing oil or a sample containing an organic acid extracted from oil And (ii) measuring the amount of the enzyme reaction product and measuring the concentration of at least one of formic acid, acetic acid, and propionic acid to determine the deterioration of the oil. (2) The step (ii) is a step of measuring the concentration of at least one of formic acid, acetic acid, and propionic acid by subjecting the enzyme reaction product to a color reaction and measuring the color reaction spectroscopically. The method according to (1).
  • the step (ii) is a step of measuring the concentration of at least one of formic acid, acetic acid, and propionic acid by electrochemically measuring the amount of the enzyme reaction product. the method of. (7) In the step of electrochemically measuring the amount of the reaction product of the enzyme reaction, DCIP, WST-1, potassium ferricyanide, tetrathiafulvalene, ferricyanide, quinone derivative, ferrocenylboronic acid derivative, p-amino
  • the method according to (6) wherein phenyl phosphate ester, ruthenium complex, or Prussian blue / white is used as a mediator.
  • the amount of the enzyme reaction product is indirectly measured using pyruvate kinase and pyruvate oxidase to measure the concentration of acetic acid, (10) Or the method as described in (11).
  • the amount of the enzyme reaction product is indirectly measured using a short-chain acyl-CoA oxidase, and the concentration of propionic acid is measured. (13) The method described.
  • a reagent layer is included on a substrate having an electrode system and a reaction layer.
  • the electrode system includes a measurement electrode and a counter electrode.
  • the reagent layer contains an enzyme having formic acid as a substrate, an enzyme having acetic acid as a substrate, and propionic acid.
  • Formic acid, acetic acid, and an amount of the enzyme reaction product between the substrate and the enzyme in the sample containing oil or the sample containing the organic acid extracted from the oil containing at least one enzyme as a substrate A biosensor for measuring oil deterioration by measuring at least one concentration of propionic acid.
  • the concentration of various organic acids (formic acid, acetic acid and propionic acid), which are indicators of oxidative deterioration of lubricating oils and oils such as BDF, can be analyzed quickly, simply and with high sensitivity.
  • A NADH production by Mv-FDH in pH7 (black circle), pH8 (grey circle), or pH9 (white circle) is shown. Also shown is the reduction of WST-1 by diaphorase at pH 7 (black squares), pH 8 (grey squares), or pH 9 (white squares).
  • the vertical axis represents the absorbance change rate, and the horizontal axis represents the formic acid concentration (mM).
  • B S—V plots up to 2 mM sodium formate are shown.
  • C Enzyme activity at pH 8 (gray) and pH 9 (white) compared to activity at pH 7 (black). The vertical axis represents relative activity (%), and the horizontal axis represents the type of enzyme added and the amount of sodium formate.
  • (D) shows the influence of NaCl in formic acid measurement using Mv-FDH.
  • the vertical axis represents residual activity (%), and the horizontal axis represents NaCl concentration (mM).
  • the black (circle) broken line is measured when 40 mM formic acid is measured using NADH
  • the black (circle) solid line is measured when 90 mM formic acid is measured using NADH
  • the white (square) broken line is When 3 mM formic acid is measured using diaphorase and WST-1
  • the solid white line (square) indicates the case where 10 mM formic acid is measured using diaphorase and WST-1.
  • Figure 2 shows the effect of WST-1 concentration on formic acid measurement using Mv-FDH and diaphorase.
  • the WST-1 concentration is 1 mM, 2.5 mM, 5 mM, and 10 mM in order from the top of the graph.
  • A The color development after 2 hours of WST-1 in formic acid measurement using Mv-FDH and diaphorase is shown (photograph).
  • B The color development after 24 hours of WST-1 in the formic acid measurement using Mv-FDH and diaphorase is shown (photograph).
  • C A plot of the absorbance at 438 nm of the 100-fold diluted sample against the formic acid concentration is shown.
  • FIG. 4 shows the purification of PD-FDH.
  • the four lanes from the left are SDSPAGE of samples from cell disruption to the NTA column, ie, CE (cell lysate cell extract), P (Pellet), S (Soluble), and U (unsoluble).
  • CE cell lysate cell extract
  • P Pellet
  • S Soluble
  • U unsoluble
  • W wash
  • the fractions that have been adsorbed on a Ni-NTA column using 10 mM PPB (potassium phosphate buffer) and eluted with imidazole buffer are the sixth to ninth fractions 1A to 4A from the left.
  • the fraction eluted under the condition of 10 mM SPB is 1A to 7A in the right half of (A).
  • M represents a marker.
  • (B) The enzyme activity of each fraction adsorbed on the column and desorbed with imidazole buffer is shown.
  • the activities of 1A-4A from the 6th to 9th from the left in (A) correspond to P1-1 to P1-4 in (B), and the activities of 1A-7A in the right half of (A) are in (B) This corresponds to P2-1 to P2-7.
  • FIG. 5 shows the purification of PD-FDH.
  • the fraction eluted under the condition of 10 mM SPB is 1A to 5A in the right half of (A).
  • M represents a marker.
  • B The enzyme activity of each fraction adsorbed on the column and desorbed with imidazole buffer is shown.
  • the activities of 1A-5A from the 6th to the 10th from the left in (A) correspond to B1-4 to B1-8 in (B), and the activities of 1A-3A, 5A in the right half of (A) are (B ) B2-4 to B2-7.
  • C SDS-PAGE for B1-4 to B1-8 and B2-3 to B2-8 in (B) is shown (photograph).
  • A Enzyme activity when NAD (4 mM) and BC-FDH or NAD (4 mM), WST-1 (1 mM) and BC-FDH are used to measure the formic acid concentration is shown.
  • Black is a system using NAD (4 mM), WST-1 (1 mM) and BC-FDH, indicated by WST-1 (B1-5), gray (B1-6) and white (B2-5) Is a system using NAD (4 mM) and BC-FDH, and is indicated by NAD.
  • B SV plots up to 2 mM formic acid for WST-1 (B1-5) are shown.
  • C S-V plots up to 2 mM formic acid for NAD (B1-6) are shown.
  • (B) shows the linearity of the SV plot (calibration curve) when the formic acid concentration is measured using NAD (4 mM) and Ps-FDH.
  • (C) shows the substrate specificity of Ps-FDH.
  • D Shows the thermal stability of Ps-FDH.
  • Ps-FDH: Diaphorase 1: 1,1: 5,1: 10,1: 20: 1: 40,1: 80 (unit ratio) Show.
  • A The relationship between the formic acid concentration and the current value when the formic acid concentration is measured by an electrochemical method is shown.
  • (B) Confirmation of substrate specificity of Mv-FDH.
  • (C) shows the results of examining the effect of salt concentration on response current.
  • (D) A plot of current values versus formic acid concentration when potassium ferricyanide is used.
  • (E) The plot of the electric current value with respect to the formic acid concentration at the time of using a hexaammineruthenium complex is shown. The activity of AcK derived from E. coli is shown (photo).
  • (A) The result of visual determination of acetic acid concentration using AcK derived from Bacillus stearothermophilus is shown (photograph).
  • (B) A plot of absorbance versus acetic acid concentration when the acetic acid concentration is measured by a spectroscopic method.
  • (C) A plot of the current value versus the acetic acid concentration when the acetic acid concentration is measured by an electrochemical method is shown.
  • A Absorbance when various concentrations of propionic acid are measured using PCT and SCAOx.
  • B S-V plots up to 100 ⁇ M propionic acid are shown.
  • A shows the relationship between formic acid standard solution (STD) and enzyme activity, and the relationship between formic acid concentration added to 100% BDF and enzyme activity.
  • B shows the result of subtracting the enzyme activity detected in the sample without formic acid from the enzyme activity with respect to formic acid added to 100% BDF.
  • STD formic acid standard solution
  • B shows the result of subtracting the enzyme activity detected in the sample without formic acid from the enzyme activity with respect to formic acid added to 100% BDF.
  • the structure of the biosensor of an Example is shown. Each reagent part of the biosensor of an example is shown. The structure of the electrode-type biosensor of an Example is shown.
  • the method for judging the deterioration of the oil of the present invention comprises (i) at least one of an enzyme using formic acid as a substrate, an enzyme using acetic acid as a substrate, and an enzyme using propionic acid as a substrate, and a sample or oil containing oil. Reacting with the sample containing the extracted organic acid, and (ii) measuring the concentration of at least one of formic acid, acetic acid, and propionic acid by measuring the amount of the enzyme reaction product.
  • the steps (i) and (ii) may be performed simultaneously or separately.
  • the process of pre-processing the sample containing an organic acid extracted from the sample containing oil or oil may be further included.
  • oils such as lubricating oil and biodiesel fuel (BDF)
  • formic acid, acetic acid, and propionic acid are generated due to the deterioration of the oil. Therefore, it is necessary to control and analyze these concentrations. For example, when the concentration of formic acid, acetic acid, and propionic acid exceeds a predetermined value, it is determined that the oil has deteriorated. Specifically, when the total concentration of formic acid, acetic acid, and propionic acid is 30 ppm or more, it is determined that the oil has deteriorated.
  • the ratio of the short-chain organic acid in the deteriorated lubricating oil and oil such as BDF is formic acid, acetic acid, and propionic acid in descending order.
  • these are determined by measuring the concentration of formic acid, preferably by measuring the concentration of formic acid and acetic acid, more preferably by measuring the concentration of formic acid, acetic acid and propionic acid.
  • the deterioration of the oil can be detected using the concentration of oil as an index (that is, depending on whether the sum of these concentrations is less than 30 ppm).
  • the method of the present invention also includes a method for measuring formic acid concentration using only an enzyme having formic acid as a substrate.
  • subjects using the formic acid concentration measurement method of the present invention include foods such as fruits, vegetables, bread, vinegar, honey, wine, fish and meat, living bodies such as paper, and urine. Samples, as well as formic acid produced by formaldehyde oxidation.
  • the enzyme used for the measurement of formic acid of the present invention is an enzyme using formic acid as a substrate, preferably formic acid using NAD as a coenzyme. It is a dehydrogenase.
  • the reaction when using formate dehydrogenase in the formic acid measurement method of the present invention is, for example, as follows.
  • Formate dehydrogenase (FDH) used in the present invention includes formate dehydrogenase (Mv-FDH) derived from Mycobacterium vaccae , Pseudomonas sp. Formate dehydrogenase (Ps-FDH) derived from Paracoccus denitrificans (PD-FDH), and formate dehydrogenase (BC-FDH) derived from Burkholderia cepacia . Examples of the formate dehydrogenase derived from Burkholderia cepacia include formate dehydrogenase derived from Burkholderia cepacia NBRC 5507 or NBRC 5508.
  • NBRC 5507 and NBRC 5508 are stored in the Biological Genetic Resource Department (NBRC), National Institute of Technology and Evaluation.
  • the amino acid sequence of MvFDH is SEQ ID NO: 2
  • the nucleotide sequence is SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of PD-FDH is SEQ ID NO: 4
  • the nucleotide sequence is SEQ ID NO: 3
  • the amino acid sequence of Burkholderia cepacia NBRC 5507 BC-FDH is SEQ ID NO: 6, base.
  • the sequence is shown in SEQ ID NO: 5
  • the amino acid sequence of Pseudomonas sp. 101 Ps-FDH is shown in SEQ ID NO: 16
  • the base sequence is shown in SEQ ID NO: 15.
  • formate dehydrogenase as described above is used.
  • SEQ ID NO: It may be a protein having an amino acid sequence in which 1 to 10, or 1 to 5 amino acid residues are substituted, deleted, inserted, or added in 2, 4, 6, 16 amino acid sequences.
  • the formate dehydrogenase of the present invention has the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 16 as long as the NAD binding region and the formate binding region as shown in the alignment of Example 7 are conserved.
  • it may be a protein having at least 80%, 85%, 90%, 95% or 99% amino acid identity.
  • Formate dehydrogenase (Mv-FDH) derived from Mycobacterium vaccae was provided by Unitika, but can also be cloned from the genome by PCR.
  • Pseudomonas sp. 101-derived formate dehydrogenase (Ps-FDH) synthesizes all genes with sequences optimized for E. coli, and Paracoccus denitrificans- derived formate dehydrogenase (PD-FDH) is obtained by PCR.
  • the formate dehydrogenase (BC-FDH) derived from Burkholderia cepacia NBRC 5507 was cloned from the genome by PCR. The cloning of BC-FDH is specifically shown in Example 7 below.
  • the synthesis of formate dehydrogenase (Ps-FDH) derived from Pseudomonas sp. 101 is shown in Example 9 below.
  • diaphorase used in combination with a mediator for indirectly measuring an enzyme reaction product is commercially available from Unitika.
  • the enzyme reaction product of a formic acid dehydrogenase and a sample containing oil or a sample containing an organic acid extracted from oil is subjected to a color reaction, and the color reaction is analyzed.
  • the amount of formic acid is determined by measuring automatically.
  • the NAD + ⁇ NADH system is used as a coenzyme.
  • NAD + can take two states, oxidized (NAD + ) and reduced (NADH), and formate dehydrogenase reduces NAD + to NADH and oxidizes formate ions to carbon dioxide.
  • the formic acid concentration may be measured based on the change in absorbance associated with NADH production at this time.
  • the present invention is coupled with an enzyme reaction using NADH such as diaphorase, and preferably oxidized with formate dehydrogenase by a color reaction using a mediator having a different color in an oxidized state or a reduced state. Measure the amount of formic acid.
  • NADH such as diaphorase
  • mediators examples include DCIP and WST-1. Since these mediators have different colors depending on the oxidation state or reduction state, the amount of NADH oxidized indirectly by formate dehydrogenase can be measured by a color development reaction. As a result, oil such as lubricating oil and biodiesel can be measured. The amount of formic acid as a short-chain organic acid generated by deterioration can be measured.
  • the concentration is preferably 1 mM to 10 mM, preferably 5 mM to 10 mM.
  • the ratio of the number of units of formate dehydrogenase and diaphorase is preferably 1:40 to 1:80.
  • the color reaction can be measured spectrophotometrically using a spectrophotometer. When mediators having different colors in the oxidized state or reduced state are used, the reaction can be confirmed by visual observation.
  • the formic acid measurement can be performed in a buffer such as potassium phosphate buffer and Tris-HCl, pH 7-9, preferably pH 8-9. When Mv-FDH is used, a pH of 8 to 9 is preferable, and when Ps-FDH is used, a pH of 6.5 to 7.5 is preferable.
  • the amount of the enzyme reaction product between a formate dehydrogenase and a sample containing oil or a sample containing an organic acid extracted from oil is measured by electrochemically measuring a mediator reduced by diaphorase.
  • the amount of formic acid can also be measured.
  • mediators used with diaphorase include DCIP, WST-1, potassium ferricyanide, tetrathiafulvalene, ferricyanide, ferrocenylboronic acid derivatives, quinone derivatives, p-aminophenyl phosphate esters, Ru (II) , Ru (III), Ru (IV) and other ruthenium complexes, and Prussian blue / white, and the concentration of these mediators is 1 mM to 50 mM, preferably 5 mM to 50 mM.
  • the amount of formic acid can be measured by electrochemically measuring the reduced potassium ferricyanide.
  • Acetic acid measurement method of the present invention 2.1 Outline of reaction of acetic acid measurement of the present invention
  • the acetic acid measurement of the present invention can be performed using an enzyme having acetic acid as a substrate, for example, acetate kinase can be used.
  • the reaction when acetate kinase is used in the method for measuring acetic acid of the present invention is as follows.
  • acetate kinase (AcK) used in the present invention examples include acetate kinase derived from B. stearothermophilus and acetate kinase derived from E. coli .
  • Acetate kinase derived from B. stearothermophilus is commercially available from Unitika, and acetate kinase derived from E. coli is commercially available from SIGMA.
  • the pyruvate kinase (Pyruvate kinase) used in the present invention is commercially available as SIGMA (FLUKA) 83328 / rabbit muscle, and pyruvate oxidase is commercially available as TOYOBO P311 / microorganism.
  • an enzyme reaction product of acetate kinase and a sample containing oil or a sample containing an organic acid extracted from oil is subjected to a color reaction to separate the color reaction.
  • the amount of acetic acid is determined by optical measurement.
  • pyruvate kinase involved in phosphorylation of ADP is preferably used together with acetate kinase. ATP is generated by phosphorylation of ADP by pyruvate kinase, and phosphoenolpyruvate is dephosphorylated to pyruvate.
  • the amount of acetic acid phosphorylated by acetic acid kinase can be indirectly measured by a chromogenic reaction, preferably using mediators that differ in color in the oxidized or reduced state.
  • mediators include substances whose reduced form is water-soluble, such as DCIP and WST-1.
  • a mediator When a mediator is used, it can be combined with diaphorase as in the formic acid measurement.
  • the mediator combined with diaphorase is preferably a quinone compound such as vitamin K or phenanthroline quinone.
  • the color reaction can be measured spectrophotometrically using a spectrophotometer. When mediators having different colors in an oxidized state or a reduced state are used, the reaction can be confirmed by visual observation.
  • acetate kinase can also be used to measure the amount of acetic acid by the following reaction.
  • Acetate kinase is allowed to act in the presence of ATP, and is the same as the previous reaction until phosphoenolpyruvate is dephosphorylated to pyruvate, but pyruvate is converted by pyruvate oxidase (Pyox). Oxidation yields hydrogen peroxide, which is generated along with 4-aminoantipyrine (4-AA) and N, N-bis (4-sulfobutyl) -3-methylaniline (TODB) peroxidase (POD). ), And as a result, the absorbance of the quinoneimine dye as the acetic acid concentration can be measured at a wavelength of 546 nm.
  • the amount of acetic acid can also be measured by electrochemically measuring the amount of enzyme reaction product between a sample containing acetate kinase and oil or a sample containing organic acid extracted from oil. .
  • the amount of enzyme reaction product between a sample containing acetate kinase and oil or a sample containing organic acid extracted from oil.
  • it is the same as the previous reaction until acetate kinase acts in the presence of ATP and then dephosphorylates phosphoenolpyruvate to pyruvate, but pyruvate is converted to oxygen by pyruvate oxidase.
  • the amount of enzyme reaction product between acetate kinase and a sample containing oil or a sample containing an organic acid extracted from oil is converted into a mediator reduced by pyruvate oxidase.
  • the amount of acetic acid can also be measured by chemical measurement.
  • Mediators used include potassium ferricyanide, tetrathiafulvalene, quinone derivatives, phenazine methosulfate, methoxyphenazine methosulfate, ferrocenylboronic acid derivatives, p-aminophenyl phosphate ester, Ru (II), Ru (III) Ruthenium complexes such as Ru (IV), Prussian blue / white and the like.
  • Propionic acid measurement method of the present invention 3.1 Outline of reaction of propionic acid measurement of the present invention
  • the propionic acid measurement of the present invention can be carried out using an enzyme having propionic acid as a substrate, preferably with propionyl CoA transferase. is there.
  • the reaction using propionyl CoA transferase in the method for measuring propionic acid of the present invention is as follows.
  • the propionyl CoA transferase (PCT) used in the present invention includes propionyl CoA transferase derived from Clostridium propionicum .
  • the amino acid sequence of PCT derived from Clostridium propionicum used in the present invention is represented by SEQ ID NO: 12, and the base sequence is represented by SEQ ID NO: 11.
  • SEQ ID NO: 12 differs from the wild-type sequence registered in GenBank as registration number AJ276553 in the second and third amino acids. In the wild-type sequence, the second and third amino acids are R and K, respectively. And A and S in the mutant sequence of the present invention.
  • Examples of the short chain acyl CoA oxidase (SCAOx) used in the present invention include Arabidopsis thaliana- derived short chain acyl CoA oxidase.
  • the amino acid sequence of SCAOx derived from Arabidopsis thaliana used in the present invention is represented by SEQ ID NO: 14 (GenBank accession code NM_115043), and the base sequence is represented by SEQ ID NO: 13.
  • SEQ ID NO: 13 differs from the wild-type sequence (GenBank accession code NM_115043) in which the 3 ′ end is TGA and the 3 ′ end is TAA.
  • propionyl CoA transferase and short chain acyl CoA oxidase as described above are used.
  • one or more, 2 to 10, or It may be a protein having an amino acid sequence in which 2 to 5 amino acid residues are substituted, deleted, inserted, or added.
  • Propionyl CoA transferase (PCT) from Clostridium propionicum and short chain acyl CoA oxidase from Arabidopsis thaliana were recombinantly produced in E. coli and purified as shown in Example 13 below.
  • PCT Propionyl CoA transferase
  • SCAOx the ratio of the number of units of PCT and SCAOx is 1: 1 to 1: 3, more preferably 1: 1.5 to 1: 2.5, most preferably 1: 2. It is.
  • an enzyme reaction product of propionyl-CoA transferase and a sample containing oil or a sample containing an organic acid extracted from oil is subjected to a color reaction, and a color reaction is performed. Is measured spectrophotometrically to determine the amount of propionic acid.
  • the amount of ester produced by propionyl CoA transferase is measured by a color development reaction using mediators having different colors in an oxidized state or a reduced state. Examples of mediators include DCIP and WST-1.
  • the amount of ester produced by propionyl-CoA transferase is measured by a color development reaction, resulting in a short time caused by degradation of oils such as lubricants and biodiesel.
  • the amount of propionic acid as a chain organic acid can be measured.
  • phenazine methosulfate and methoxyphenazine methosulfate are preferable.
  • the color reaction can be measured spectrophotometrically using a spectrophotometer. When mediators having different colors in an oxidized state or a reduced state are used, the reaction can be confirmed by visual observation.
  • the amount of propionic acid can also be measured by the following reaction using propionyl CoA transferase. Until the reaction of propionyl-CoA transferase in the presence of acetyl-CoA, it is the same as the previous reaction, but the short-chain acyl-CoA oxidase oxidizes propionyl-CoA to produce hydrogen peroxide, and the peroxidation produced. Hydrogen can be converted into a quinoneimine dye by peroxidase (POD) together with 4-aminoantipyrine and N, N-bis (4-sulfobutyl) -3-methylaniline, resulting in the absorbance of the quinoneimine dye as a propionic acid concentration.
  • POD peroxidase
  • the number of units of peroxidase is 0.1 U or more, more preferably 0.15 U or more, and most preferably 0.15 to 0.2 U.
  • the amount of the enzyme reaction product of propionyl CoA transferase (PCT) and a sample containing oil or a sample containing an organic acid extracted from oil was determined as a short-chain acyl CoA oxidase ( The amount of propionic acid can also be measured by electrochemically measuring the mediator reduced by SCAOx).
  • Mediators used include potassium ferricyanide, tetrathiafulvalene, ferricyanide, phenazine methosulfate, methoxyphenazine methosulfate, ferrocenylboronic acid derivatives, p-aminophenyl phosphate ester, Ru (II), Ru (III) , Ru (IV) and other ruthenium complexes, and Prussian blue / white.
  • the amount of propionic acid is also measured by electrochemically measuring the amount of the enzyme reaction product between propionyl-CoA transferase and a sample containing oil or a sample containing an organic acid extracted from oil. Can do. For example, until the reaction of propionyl CoA transferase in the presence of acetyl CoA is the same as the previous reaction, but the short hydrogen acyl CoA oxidase reacts propynyl CoA with oxygen to generate hydrogen peroxide. It can also be detected electrochemically with a hydrogen peroxide electrode.
  • the method for measuring a short-chain organic acid uses an enzyme using formic acid, acetic acid or propionic acid as a substrate and an enzyme and a mediator for quantifying an enzyme reaction product as components of the kit.
  • a sensor and an assay kit using a dehydrogenase of Burkholderia cepacia are described in, for example, International Publication No. WO2006 / 137283.
  • Various enzymes of the present invention can be used in the same manner.
  • the biosensor using at least one enzyme based on formic acid, acetic acid, or propionic acid of the present invention has a working electrode (measuring electrode) on an electrically insulating substrate by a method such as screen printing. It can be produced by forming an electrode system having a counter electrode and forming a reagent layer containing the enzyme and mediator on the electrode system.
  • a biosensor manufacturing method is described, for example, in JP-A-1-291153 and International Publication WO2005 / 043146.
  • the sample containing the oil of the present invention or the sample containing the organic acid extracted from the oil is preferably a sample containing lubricating oil or biodiesel, more preferably an extract of the organic acid extracted from these oils It is.
  • the organic acid extraction from the deteriorated oil can be performed with water or an aqueous solvent.
  • a sample containing deteriorated oil extracted with water is reacted with an enzyme using formic acid as a substrate, an enzyme using acetic acid as a substrate, and / or an enzyme using propionic acid as a substrate, respectively. Or the concentration of propionic acid.
  • sodium chloride when sodium chloride is used at the time of organic acid extraction, the activities of formate dehydrogenase and diaphorase are reduced, so it is preferable to pay attention to the use of sodium chloride.
  • Example 1 Effect of pH during measurement of formic acid concentration Using formic acid dehydrogenase (Mv-FDH) manufactured by Unitika Ltd., the reaction volume was 160 mL and the sodium formate concentration was 0.1; 0.2; 0.3; 0.4 0.5; 0.6; 0.8; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 8; 10; 12; 14; 16; 18; 20; 30; 40; 60; 80; 100; 150; 200; 300; 400 Formic acid was measured spectroscopically at 600; 900 mM.
  • Mv-FDH formic acid dehydrogenase
  • FDH (NADH; a method for measuring the increase in absorbance at 340 nm)
  • the composition of the reaction solution was 500 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 500 mM Tris-HCl (pH 8.0), or 500 mM Tris-HCl (pH 9.0), 16 mL (final concentration 50 mM); 40 mM b-NAD + , 16 mL (final concentration 4 mM); 10 U / mL Mv-FDH, 10 mL (final concentration 0.1 U); Mili-Q, 102 mL; sodium formate 16 mL (concentration is 0.1-900 mM above) ).
  • FDH-Diaphorase (1:10) (Method for measuring the increase in absorbance at 438 nm using WST-1)
  • the composition of the reaction solution was 16 mL (final concentration 50 mM) of 500 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), 500 mM Tris-HCl (pH 8.0), or 500 mM Tris-HCl (pH 9.0); 40 mM b-NAD + , 16 mL (final concentration 4 mM); 10 U / mL Mv-FDH, 10 mL (final concentration 0.1 U); 50 U / mL Diaphorase I, 20 mL (final concentration 1 U); ultrapure Water 66 mL; 14 mM WST-1, 16 mL (final concentration 1.4 mM); sodium formate 16 mL (concentration is 0.1 to 900 mM above).
  • Mv-FDH alone shows maximum activity at pH 7.0 (FIG. 1A), pH 8.0, 9.0 against 40 mM and 90 mM sodium formate. Was 80% activity at pH 7.0 (left half of FIG. 1C).
  • the sensitivity in the Mv-FDH-Diaphorase system showed the maximum at pH 8.0 and 9.0 (FIGS. 1A and B). With 8 mM and 20 mM sodium formate, the sensitivity in the Mv-FDH-Diaphorase system was 180% at pH 7.0. This difference is thought to be due to the difference in optimum pH between Mv-FDH and Diaphorase.
  • Unitika's protocol states that the optimum pH for Mv-FDH is 6.0-8.0 and the optimum pH for Diaphorase is 8.0, suggesting the possibility of increased sensitivity when measured at pH 8.0-9.0. It was. Good linearity was observed when the S-V plot in the low concentration range up to 2 mM sodium formate was expanded (R 2 > 0.9) (FIG. 1B). Based on the above, organic acids extracted from degraded oil are best measured at pH 8-9, so pH 8-9 is considered good when extracted from degraded oil.
  • Example 2 Effect of NaCl concentration on pH 9.0
  • the total amount of the reaction solution was 160 mL, and the sodium formate concentration was 0; 250; 500; 1000; 1500; 2000; 2500; 3000; 4000 mM.
  • FDH (NADH; a method for measuring the increase in absorbance at 340 nm)
  • the composition of the reaction mixture was 16 mL of 500 mM Tris-HCl pH 9.0 (final concentration 50 mM); 40 mM b-NAD + , 16 mL (final concentration 4 mM); 10 U / mL Mv-FDH, 10 mL ( Final concentration 0.1 U); ultrapure water 70 mL; NaCl, 32 mL; sodium formate 16 mL (concentration is 0 to 4000 mM above).
  • FDH-Diaphorase (1:10) (Method for measuring the increase in absorbance at 438 nm using WST-1)
  • the composition of the reaction solution was 500 mM Tris-HCl pH 9.0, 16 mL (final concentration 50 mM); 40 mM b-NAD + , 16 mL (final concentration 4 mM); 10 U / mL Mv-FDH, 10 mL ( Final concentration 0.1 U); 50 U / mL Diaphorase I, 20 mL (final concentration 1 U); Ultrapure water 34 mL; NaCl, 16 mL; 14 mM WST-1, 16 mL (final concentration 1.4 mM); Sodium formate 16 mL (concentration was 0 to 4000 mM above). After incubating the reaction solution at room temperature for 20 min, WST-1 was added, and then sodium formate was added to start the reaction.
  • Example 3 Influence of Mediator Type DCIP and WST-1 were compared as redox dyes (Table 1). When comparing items 4 and 7, 5 and 8, Vmax was higher when DCIP was used, and Km value was also larger. It was found that DCIP can also be used in this measurement system, and the sensitivity is higher than WST-1. However, since DCIP is a compound whose absorbance decreases with the progress of the reaction, it is thought that the background is high and the dynamic range is narrow, suggesting that WST-1 is preferable.
  • Example 6 End-point measurement (pH 8.0) The same sample as that of Example 4 was used. A sample was placed in a 96-well microplate, and the microplate was photographed with a digital camera (FIGS. 3A and 3B). At this time, 10 mL of the sample was added in parallel to 990 mL of buffer (diluted 1/100), and the absorbance at 438 nm was measured.
  • Example 4 The sample of Example 4 was incubated as it was for a long time, and the color tone of the reaction solution was observed when the sample was lengthened.
  • the color tone after incubation with aluminum foil for 2 hours (FIG. 3A) or 24 hours (FIG. 3B) is shown as a photograph.
  • a concentration of 2 mM or less a clear color change according to the formic acid concentration was visually observed.
  • the sample was diluted 100-fold and the absorbance at 438 nm was plotted against the formic acid concentration, good linearity was shown at a WST-1 concentration of 2.5 mM (FIG. 3C). From the above, it was shown that a low concentration of formic acid can be easily and accurately measured by this method.
  • OPTIMIZER and Gene Design 3.0 consider only the codon frequency and were 96% similar to the Mv-FDH gene.
  • GeneOptimum TM is a program that considers the GC content and mRNA secondary structure, and has 80% similarity to the DNA sequence of Mv-FDH.
  • the amino acid sequence of Ps-FDH has been published (Dokl. Akad. Nauk. SSSR 317: 745-748 (1991)
  • the DNA sequence is not registered in the data bank and is predicted by OPTIMIZER and Gene Design 3.0 Requested the synthesis of the sequence.
  • the amino acid sequence of the Mv-FDH sequence was searched with PSI-BLAST. This allows searching farther sequences than BLAST.
  • Aspartic acid at position 126 in the Mv-FDH sequence serine at position 148, valine at position 198, arginine at position 202, isoleucine at position 203, aspartic acid at position 222, arginine at position 223, histidine at position 259, position 381 Serine and tyrosine at position 382 indicate the NAD binding site.
  • asparagine at position 147, valine at position 151, threonine at position 283, arginine at position 285, aspartic acid at position 309, histidine at position 333, serine at position 335, and glycine at position 336 are formic acid binding sites. Indicates.
  • FDH bacteria high catalytic activity k cat, it optimum reaction temperature is high, K m value (Biochemistry (Moscow) 69: 1252-1267 (2004)) was considered to be suitable for measurement and the like.
  • Paracoccus denitrificans and Burkholderia cepacia were moderately homologous with the amino acid sequence of Mv-FDH at 80% and 69%, respectively, so we decided to clone the target sequence by PCR.
  • Burkholderia stabilis FDH which is closely related, is known to have high specificity for NADP + (Enzyme Microbiol. Technol. 46: 557-561 (2010)).
  • FDH gene Amplification of FDH gene by PCR was performed as follows. Composition: GoTaq, 25 mL; 10 mL forward or reverse primer 2 mL, sterile ultrapure water 21 mL; template DNA, cell pellet (total volume, 50 mL). Template DNA was prepared as follows: 10 mL Paracoccus denitrificans glycerol stock or Burkholderia cepacia IFO 5507 was cultured overnight at 37 ° C. in 1 mL LB medium. A pellet obtained by centrifuging 100 mL of medium at 10,000 rp, m, 3 min., 4 ° C. was used as a PCR template as it was. Primer sequence: P.
  • PCR conditions 95 o C, 2 min .; [(95 o C, 30 sec.); (55 o C or 60 o C, 30 sec); (72 o C, 2 min. 30 sec)] x 40; 72 o C, 10 min.
  • 10 mL of the PCR product was electrophoresed on a 1% agarose gel, a band corresponding to the FDH gene was detected.
  • PD-FDH Paracoccus denitrificans
  • BC-FDH Burkholderia cepacia NBRC 5507
  • FDH gene PCR products were purified using GeneCleanII and cleaved with NdeI and HindIII. After electrophoresis, the gel was cut out, purified with GeneCleanII, ligated with pET28a-SCAox cleaved with the same restriction enzyme using Takara ligation kit, transformed into E. coli BL21, and then in LB medium containing 50 mg / mL Kanamycin. Selected.
  • Example 8 Measurement of formic acid using BC-FDH (color development reaction) Formic acid was measured by measuring the absorbance of NADH and measuring the absorbance of WST-1 in combination with diaphorase by the end point method for substrate specificity and thermal stability. Formic acid concentration and enzyme activity were measured using NAD (4 mM) or WST-1 (1 mM) and BC-FDH, and a Michaelis-Menten type saturation curve was drawn (FIG. 6A).
  • B1-5 corresponds to a black circle
  • B1-6 to a gray circle
  • B2-5 to a white circle.
  • the absorbance (only WST-1) of the reaction solution after 2 hours of reaction was similar (FIG. 7B), and had good linearity in the 0-2 mM range (FIG. 7C).
  • a change in color tone according to the formic acid concentration was also observed visually (FIG. 7A).
  • the substrate specificity and thermal stability of the measurement system using BC-FDH are as good as those of Mv-FDH (Fig. 8), and BC-FDH can be used in the same way as Mika-Mitchi manufactured by Unitika. It was judged that there was.
  • Ps-FDH gene preparation method Ps-FDH was chemically synthesized from GenScript, US, based on the previously reported amino acid sequence, a gene whose codon was optimized for production in E. coli. The Ps-FDH gene was inserted into the pET28 (a) vector to prepare a pET28aPs-FDH vector, which was transformed into E. coli BL21 (DE3) strain. (Preparation of Ps-FDH: Culture) BL21 (DE3) / pET28Ps-FDH was inoculated into a 100 mL LB medium containing 50 ⁇ g / mL Kanamycin in a 500 mL flask and pre-cultured overnight at 37 ° C.
  • Example 10 Measurement of formic acid using Ps-FDH (coloring reaction) For the evaluation of Ps-FDH, measure the formic acid concentration using “NAD (4 mM) and WST-1 (1.4 mM) and Ps-FDH” or “NAD (4 mM) and Ps-FDH”, and use the SV plot (calibration curve). ) was confirmed. The measurement methods and results are shown below (Table 4, FIGS. 10A and B).
  • Example 11 Mixing ratio of Ps-FDH and diaphorase Reagents were prepared at the ratios shown in the table below, and the activity of Ps-FDH in each concentration of formic acid was measured.
  • Example 12 Measurement of formic acid using Mv-FDH (electrochemical) ⁇ -NAD 4mM, Mv-FDH 0.1U, potassium ferricyanide 40mM, Diaphorase 0.5U, 50mM phosphate buffer (pH7) containing 9.5 ⁇ L, so that formic acid has various concentrations from 0 to 4mM After addition, a potential of 400 mV vs (Ag / AgCl) was applied after 1 minute or 5 minutes, and the current value after 20 seconds was measured and plotted against the formic acid concentration. The results are shown in FIG. 12A.
  • the formic acid concentration could be measured even with a reaction time of 1 minute.
  • the sensitivity increased further when the reaction time was 5 minutes.
  • the measurement by the electrochemical method was examined, it was found that the measurement can be performed with sufficient sensitivity in 5 minutes.
  • the method for studying the effect of salt concentration was the same as the above measurement conditions. However, the reaction time was 5 minutes and the final NaCl concentration was 0,400,800 mM. The results are shown in FIG. 12C. It was understood that a lower NaCl concentration is desirable.
  • Example 13 Measurement of acetic acid The acetic acid was measured by adding acetate kinase (Sigma) derived from E. coli with the following pyruvate kinase-pyruvate oxidase-peroxidase system.
  • acetate kinase Sigma
  • Pyruvate + O 2- Pyruvate oxidase)-> Acetyl phosphate + H 2 O 2 .
  • Example 14 Measurement of acetic acid Measurement was performed using acetate kinase derived from Bacillus stearothermophilus , and calibration curve data was obtained. Chromogenic reaction 0,16U Acetate kinase, 1mM ATP, 0.25mM phosphoenolpyruvate, 3.2U Pyruvate oxidase, 1.5mM 4-aminoantipyrine, 1.5mM TODB 0.32U Acetic acid mixed to a peroxidase solution to 0-0.8mM 96 A sample was put in the hole microplate, and after 90 minutes, the microplate was photographed with a digital camera.
  • FIG. 14A shows the result taken with a digital camera.
  • Line A is the result of 0.0-0.09 mM acetic acid
  • line B is the result of 0.1-1.0 mM acetic acid
  • line C is the result of 2-8 mM acetic acid.
  • acetic acid concentration range of 1 mM or less a difference in the concentration was recognized visually.
  • a calibration curve is shown in FIG. 14B. It was found that the acetic acid could be quantified in the concentration range of 1 mM or less.
  • Electrochemical measurement method 3.2 U Acetate kinase, 1 mM ATP, 0.25 mM phosphoenolpyruvate, 1.6 U pyruvate oxidase, 10 mM MgCl 2 , 3.5 U pyruvate kinase, 0.2 mM TPP, 0.01 mM FAD, 20 mM phosphate buffer containing 40 mM potassium ferricyanide (pH 7.0) Acetic acid was mixed with the solution, and after 5 minutes, a potential of 400 mV vs (Ag / AgCl) was applied, and the current value after 20 seconds was measured and plotted against the acetic acid concentration. The results are shown in FIG. 14C.
  • the reaction time can be 5 minutes, which can be measured in the same time as formic acid measurement. Sensitivity was also sufficient. As described above, 1 mM acetic acid (AA) could be measured in 5 minutes, and measurement was possible in the same time as formic acid measurement.
  • Example 15 Measurement of propionic acid After confirming that the sequences on the plasmids of PCT and SCAOx were correct, they were cultured in an auto induction system, purified by HisTag, and used for the enzyme reaction. The measurement wavelength of propionic acid was compared between 500 nm (wavelength when phenol and 4AA were used) and 546 nm (wavelength when 4AA and TODB were used) (Rajashekara et al., 2006). The reaction was performed with buffer 100 mM SPB pH 7.
  • the total volume of the reaction solution is 160 mL, and the composition is as follows: 0.1 mM Acetyl Coenzyme A (Wako), 0.05 mM FAD (Wako), 0.28 U Peroxidase (Amano), 1.5 mM 4-aminoantipyrine (Wako), 1.5 mM TODB (Dojindo), 16 mg SCAOx enzyme, 8 mg PCT enzyme, and Various concentrations of propionic acid (Kanto). Specific activity (U / mg) was calculated based on the extinction coefficient at 500 nm of quinoneimine (6.4 mM -1 cm -1 ).
  • Example 16 Measurement of formic acid from biodiesel A 98% formic acid solution was diluted stepwise with 100% BDF to prepare 100% BDF (SA dilution system) containing 0.01% formic acid as a sample. Similarly, a dilution system was prepared by stepwise diluting a 98% formic acid solution with milli-Q water, and this was used as a standard (STD) sample.
  • SA dilution system 100% BDF dilution system
  • the procedure for measuring formic acid activity was as follows. SA dilution system 1.5mL and MilliQ 1.5mL were mixed (1: 1 by vol.) And allowed to stand for 1 hour. Thereafter, the BDF part (upper part) was removed with a pipetter, and 1 mL was collected from the lower part of the remaining aqueous layer part (lower part) as an extraction sample for measurement. The activity was immediately measured with a Ps-FDH-diaphorase system by a spectroscopic method. The results are shown in FIG.
  • the concentration dependence of the enzyme reaction rate was observed at formic acid concentrations up to 100 ppm. In particular, linearity from 0 to 25 ppm was observed.
  • the concentration dependence of the enzyme reaction rate was observed at a formic acid concentration of up to 100 ppm, linearity from 0 to 25 ppm was observed, and activity was also observed at 0 ppm (FIG. 16A). This seems to be formic acid contained in the original BDF, and the two series were in good agreement when subtracting the activity value at 0 ppm for comparison with the standard sample (FIG. 16B). From this, it was shown that the formic acid concentration can be measured spectroscopically by using the method of the present invention.
  • Example 17 Preparation of a colorimetric biosensor using formate dehydrogenase A biosensor was prepared using Burkholderia cepacia- derived formate dehydrogenase having excellent specific activity.
  • a biosensor having the basic configuration shown in FIG. 17 was produced. That is, the biosensor has a form in which a transparent cover 4 (material PET) is laminated on a transparent substrate 2 via a spacer 3, and a capillary 5 is defined by each element 2 to 4. The dimensions of the capillary 5 are 1.3 mm ⁇ 9 mm ⁇ 50 ⁇ m (FIG. 17).
  • the transparent substrate 2 and the transparent cover 4 were formed of PET having a thickness of 250 ⁇ m, and the spacer 3 was composed of a black double-sided tape.
  • the biosensor has a first reagent part to a third reagent part shown in FIG. 18, and the components and application amounts are shown in Table 2, respectively.
  • SWN represents Lithium Magnesium Sodium Silicate.
  • the measurement sample was supplied to the capillary of the biosensor, and the absorbance at the end point after 5 seconds was plotted.
  • the third reagent part was irradiated with light along the height direction of the capillary, and the light transmitted through the biosensor at that time was received.
  • Light irradiation was performed by irradiating light of 630 nm using a light emitting diode.
  • the transmitted light was received by a photodiode.
  • Example 18 Production of electrode biosensor using formate dehydrogenase An electrode biosensor was produced using formate enzyme having excellent specific activity.
  • a method for manufacturing an electrode-type biosensor will be described below with reference to FIG.
  • a substrate made of PET (length 28 mm, width 7 mm, thickness 250 ⁇ m) is prepared as an insulating substrate 1, and a working electrode 4 and a counter electrode 5 each having leads 2 and 3 by screen printing of carbon ink on one surface thereof.
  • the method of the present invention can be suitably used for measurement of various organic acids produced by oxidative degradation of oil such as lubricating oil.

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Abstract

（ｉ）ギ酸を基質とする酵素、酢酸を基質とする酵素、およびプロピオン酸を基質とする酵素の少なくとも１種と、油を含む試料または油から抽出された有機酸を含む試料とを反応させる工程、並びに（ｉｉ）酵素反応生成物の量を測定して、ギ酸、酢酸、およびプロピオン酸の少なくとも１種の濃度を測定する工程を含む、油の劣化を判定する方法。

Description

油劣化の判定方法およびこれを用いる装置
　本発明は、潤滑油およびバイオディーゼル燃料（BDF）等の油の酸化劣化によって産生される各種有機酸を計測するための高感度、迅速、かつ簡便なバイオセンシングシステムに関する。
　潤滑油およびBDFなどの油の劣化の指標として酸化によって生じる各種有機酸の含量が用いられている。一般に油の酸化劣化の指標は酸価が用いられている。これは1g の油を中和するために必要なKOH のmg 数としてあらわされる。すなわち、有機酸の含量が劣化の指標である。潤滑油およびBDFなどの油の劣化の判定は、使用しているその場で油の全酸価を計測し、すぐに対処できることが望ましい。全酸価の測定機としては中和滴定の原理で酸価を自動計測する自動滴定装置が平沼やメトローム社などから市販されているが、一台数十万円から百万円台で高価な据え置き型の機器である。このため現場での計測はできない。一方、簡易型の測定キットも市販されるようになっている。電気絶縁油用の全酸価簡易判定試薬がユニチェックとしてユニケミー社から販売されており、これは試料油をスポイトで試薬の入ったバイヤルに添加し付属のカラーチャートと比較するもので計測範囲によって3 種類のキットが用意され、0.01-0.08、0.10-0.25、0.3-0.5 の酸価を計測できるものである。
　しかしながら、現在市販されているいずれの方法においても、各種有機酸の種類ごとの定量は不可能であり、潤滑油およびBDFなどの油の劣化度をセンシングするための、短鎖有機酸を種類別に定量でき、しかも現場で使用できる計測法の開発が望まれている。
　バイオセンサとは生体の有する優れた分子認識機能と化学センサあるいは物理センサなどの検出技術とを組み合わせることで、選択的かつ高感度な化学物質の計測技術・装置の総称であり、バイオセンシングとはそのような技術を活用した分析システムをさす。バイオセンサの測定の対象となる分子は、グルコースなどの生体関連の有機化合物をはじめとして、無機化合物、蛋白質、さらには単一の化合物としてではなく、毒性を有する物質あるいは変異原性や環境ホルモンといった特定の生理活性を有する化合物のグループなど、生体の認識機能に依存した様々なカテゴリーの分子が対象となっている。
　このようなバイオセンサ技術開発において、既に有機酸計測についても報告がある。有機酸を対象としたバイオセンサは主に80年代のバイオセンサ研究の黎明期に開発された微生物センサ（微生物を分子認識素子に用いており、呼吸活性を指標とするものが多い）である。微生物センサでは高感度な分析が達成できるが、選択性やセンサ作成技術において再現性を確保することが困難であるといった課題も多く、その応用範囲は環境計測における群特異的な分子種の分析などに限定して、現在、実用化されている。有機酸計測微生物センサとしては、酢酸およびギ酸センサが報告されているが、感度・再現性両面において実用性に見合っていなかった。
　特許文献１には、脱水素酵素と補酵素と電子メディエータおよびテトラゾリウム塩類からなる反応試薬を用いた基質の定量方法が開示されている。しかしながら、この方法は、油の劣化により生じた有機酸としてのギ酸などを定量する方法ではない。
　特許文献２には、ギ酸脱水素酵素と、電子伝達物質であるMethoxy PMS (mPMS)と、酸化還元発色指示薬であるWST1とを加え、波長４３８ｎｍの吸光度で黄色ホルマザンを測定することにより、ギ酸の定量を行うことが記載されている。しかしながら、この方法は、油の劣化により生じた有機酸としてのギ酸を定量する方法ではない。
　特許文献３には、プロピオニルCoAトランスフェラーゼおよびアシルCoAオキシダーゼを用いて、プロピオン酸を定量する方法が記載されている。しかしながら、この方法は、油の劣化により生じた有機酸としてのプロピオン酸を定量する方法ではない。
国際公開ＷＯ００／５７１６６号パンフレット 特開２０１０－４１９７１号公報 特開２００６－１５８２９７号公報
　本出願人である大生工業株式会社のＲ＆Ｄセンターの調査では、潤滑油の酸化劣化による全酸価上昇の一番重要な原因は短鎖有機酸であること、数十ppm でも短鎖有機酸は金属腐食のおそれがあること、金属腐食に対する影響に関しては酸価とともに特定の酸濃度を組み合わせる必要があることが指摘されている。そして同社の検討結果から、この短鎖有機酸がギ酸、酢酸、プロピオン酸であることが明らかにされ、その比率も計測されている。バイオディーゼル燃料の酸価は、燃料が変質したとき、燃料が適正に製造されていないときに高くなるため、品質管理上、酸価分析が必要となる。
　本発明は、潤滑油およびBDFなどの油の酸化劣化の指標であるギ酸、酢酸、プロピオン酸を分析する方法・手順・操作などが煩雑な従来法に代わり、迅速、簡便、かつ高感度な新しい分析方法を開発することを課題とする。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、ギ酸とギ酸脱水素酵素との酵素反応生成物を発色検出または電気化学検出に供することによりギ酸濃度を簡便に測定できること、酢酸と酢酸キナーゼとの酵素反応生成物を発色検出または電気化学検出に供することにより酢酸濃度を簡便に測定できること、プロピオン酸とプロピオニルCoAトランスフェラーゼとの酵素反応生成物を発色検出または電気化学検出に供することによりプロピオン酸濃度を簡便に測定できること、そして、これらを組み合せて、ギ酸、酢酸およびプロピオン酸の濃度の少なくとも１つを指標とすることにより油の劣化を測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）（ｉ）ギ酸を基質とする酵素、酢酸を基質とする酵素、およびプロピオン酸を基質とする酵素の少なくとも１種と、油を含む試料または油から抽出された有機酸を含む試料とを反応させる工程、並びに（ｉｉ）酵素反応生成物の量を測定して、ギ酸、酢酸、およびプロピオン酸の少なくとも１種の濃度を測定する工程を含む、油の劣化を判定する方法。
（２）前記工程（ｉｉ）は、酵素反応生成物を発色反応に供し、発色反応を分光学的に測定して、ギ酸、酢酸、およびプロピオン酸の少なくとも１種の濃度を測定する工程である、（１）に記載の方法。
（３）前記工程（ｉｉ）において、酵素反応生成物の量を、ジアフォラーゼを用いて間接的に測定することを特徴とする、（２）に記載の方法。
（４）前記ギ酸を基質とする酵素がギ酸脱水素酵素であり、ギ酸脱水素酵素とジアフォラーゼのユニット数の比が、１：４０～１：８０であることを特徴とする、（３）に記載の方法。
（５）前記酵素反応の反応物の量を分光学的に測定する工程において、ＷＳＴ－１をメディエータとして使用し、その濃度が１ｍＭ～１０ｍＭである、（２）～（４）に記載の方法。
（６）前記工程（ｉｉ）は、酵素反応生成物の量を電気化学的に測定して、ギ酸、酢酸、およびプロピオン酸の少なくとも１種の濃度を測定する工程である、（１）に記載の方法。（７）前記酵素反応の反応物の量を電気化学的に測定する工程において、ＤＣＩＰ、ＷＳＴ－１、フェリシアン化カリウム、テトラチアフルバレン、フェリシアニド、キノン誘導体、フェロセニルボロン酸誘導体、ｐ－アミノフェニルリン酸エステル、ルテニウム錯体、またはプルシアンブルー／ホワイトがメディエータとして使用される、（６）に記載の方法。
（８）前記ギ酸を基質とする酵素として、ギ酸脱水素酵素を用いることを特徴とする、（１）～（７）に記載の方法。
（９）前記ギ酸脱水素酵素が、BC-FDH、Ps-FDH、Mv-FDHまたはPD-FDHである、（８）に記載の方法。
（１０）前記酢酸を基質とする酵素として、酢酸キナーゼを用いることを特徴とする、（１）～（３）に記載の方法。
（１１）前記酢酸キナーゼが、E. coliまたはBacillus stearothermophilus由来である、（１０）に記載の方法。
（１２）前記工程（ｉｉ）において、酵素反応生成物の量を、ピルビン酸キナーゼおよびピルビン酸オキシダーゼを用いて間接的に測定して、酢酸の濃度を測定することを特徴とする、（１０）または（１１）に記載の方法。
（１３）前記プロピオン酸を基質とする酵素として、プロピオニルCoAトランスフェラーゼを用いることを特徴とする、（１）～（３）に記載の方法。
（１４）前記工程（ｉｉ）において、酵素反応生成物の量を、短鎖アシルCoAオキシダーゼを用いて間接的に測定して、プロピオン酸の濃度を測定することを特徴とする、（１３）に記載の方法。
（１５）前記プロピオニルCoAトランスフェラーゼと短鎖アシルCoAオキシダーゼのユニット数の比が、１：１～１：３であることを特徴とする、（１４）に記載の方法。
（１６）前記試料は潤滑油またはバイオディーゼルを含む、（１）～（１５）に記載の方法。
（１７）（１）～（１６）のいずれか１項に記載の方法に用いられる、ギ酸脱水素酵素、ジアフォラーゼ、ＷＳＴ－１、酢酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、プロピオニルCoAトランスフェラーゼ、および短鎖アシルCoAオキシダーゼからなる群より選択される１つ以上を含む、油劣化を測定するためのキット。
（１８）電極系と反応層を有する基板上に試薬層を含み、電極系は測定極と対極とを備え、試薬層はギ酸を基質とする酵素、酢酸を基質とする酵素、およびプロピオン酸を基質とする酵素の少なくとも１種を含み、油を含む試料または油から抽出された有機酸を含む試料中の基質と当該酵素との酵素反応生成物の量を測定して、ギ酸、酢酸、およびプロピオン酸の少なくとも１種の濃度を測定して、油劣化を測定するためのバイオセンサ。
（１９）（ｉ）ギ酸脱水素酵素とギ酸を含む試料とを反応させる工程、並びに（ｉｉ）ジアフォラーゼを用いて酵素反応生成物の量を間接的に測定して、ギ酸の濃度を測定する工程を含み、前記ギ酸脱水素酵素とジアフォラーゼのユニット数の比が、１：４０～１：８０である、ギ酸の測定方法。
　本発明の方法により、潤滑油およびBDFなどの油の酸化劣化の指標である各種有機酸（ギ酸、酢酸およびプロピオン酸）の濃度を、迅速、簡便、かつ高感度に分析することができる。
(A)ｐH７（黒丸）、ｐH８（灰色丸）、またはｐH９（白丸）におけるMv-FDHによるNADHの生成を示す。また、ｐH７（黒四角）、ｐH８（灰色四角）、またはｐH９（白四角）におけるジアフォラーゼによるWST-1の還元を示す。縦軸は吸光度変化速度、横軸はギ酸濃度（ｍM）を示す。（B）ギ酸ナトリウム2mMまでのS～Vプロットを示す。（C）ｐH７（黒）における活性と比較した、ｐH８（灰）およびｐH９（白）における酵素活性を示す。縦軸は相対活性（％）、横軸は添加した酵素の種類およびギ酸ナトリウムの量を示す。(D)Mv-FDHを使用したギ酸測定におけるNaClの影響を示す。縦軸は残留活性（％）、横軸はNaClの濃度（ｍM）を示す。黒色（丸）の破線は、NADHを使用して４０ｍMのギ酸を測定した場合、黒色（丸）の実線は、NADHを使用して９０ｍMのギ酸を測定した場合、白色（四角）の破線は、ジアフォラーゼおよびWST-1を使用して３ｍMのギ酸を測定した場合、白色（四角）の実線は、ジアフォラーゼおよびWST-1を使用して１０ｍMのギ酸を測定した場合を示す。 Mv-FDHおよびジアフォラーゼを使用するギ酸測定に対するWST-1濃度の影響を示す。WST-1濃度は、グラフの上から順に、１ｍM、２．５ｍM、５ｍM、および１０ｍMである。 （A）Mv-FDHおよびジアフォラーゼを使用するギ酸測定におけるWST-1の２時間後における発色を示す（写真）。（B）Mv-FDHおよびジアフォラーゼを使用するギ酸測定におけるWST-1の２４時間後における発色を示す（写真）。（C）１００倍希釈した試料の４３８ｎｍでの吸光度の、ギ酸濃度に対するプロットを示す。 図４はＰD－ＦＤＨの精製を示す。（A）左から4つのレーンは、細胞を破砕してNTAカラムにかけるまでのサンプル、すなわち、CE(細胞破砕液cell extract),P(Pellet), S(Soluble), U(unsoluble) のSDSPAGEを示す（写真）。左から6番目～右端は、PD-FDHのS(Soluble)を２通りの緩衝液でNi-NTAカラムに吸着、脱着させたもののSDSPAGEを示す。W(wash)はカラム素通り画分を示す。１０ｍＭ　ＰＰＢ（リン酸カリウム緩衝液）を使ってNi-NTAカラムに吸着させ、イミダゾール緩衝液で溶出してきたフラクションが左から6番目～9番目の１Ａ～４Ａである。１０ｍＭ　ＳＰＢの条件下で溶出してきたフラクションが（A）の右半分の１Ａ～７Ａである。Mはマーカーを示す。（B）カラムに吸着、イミダゾール緩衝液で脱着させた各フラクションの酵素活性を示す。（A）の左から6番目～9番目の１Ａ～４Ａの活性が（B）のＰ１－１～Ｐ１－４に対応し、（A）の右半分の１Ａ～７Ａの活性が（B）のＰ２－１～Ｐ２－７に対応する。 図５はＰD－ＦＤＨの精製を示す。（A）左から4つのレーンは、細胞を破砕してNTAカラムにかけるまでのサンプル、すなわち、CE(細胞破砕液cell extract),P(Pellet), S(Soluble), U(unsoluble) のSDSPAGEを示す（写真）。左から6番目～右端は、PD-FDHのS(Soluble)を２通りの緩衝液でNi-NTAカラムに吸着、脱着させたもののSDSPAGEを示す。W(wash)はカラム素通り画分を示す。１０ｍＭ　ＰＰＢ（リン酸カリウム緩衝液）を使ってNi-NTAカラムに吸着させ、イミダゾール緩衝液で溶出してきたフラクションが左から6番目～10番目の１Ａ～５Ａである。１０ｍＭ　ＳＰＢの条件下で溶出してきたフラクションが（A）の右半分の１Ａ～５Ａである。Mはマーカーを示す。（B）カラムに吸着、イミダゾール緩衝液で脱着させた各フラクションの酵素活性を示す。（A）の左から6番目～10番目の１Ａ～５Ａの活性が（B）のB１－４～B１－８に対応し、（A）の右半分の１Ａ～３Ａ、５Aの活性が（B）のB２－４～B２－７に対応する。（C）（B）におけるB1-4～B1-8およびB2-3～B2-8についてのSDS-PAGEを示す（写真）。 （A）NAD(４ｍM)とBC-FDHまたはNAD(４ｍM)とWST-1（１ｍM）とBC-FDHを用いてギ酸濃度を計測した場合の酵素活性を示す。黒色が、NAD(４ｍM)とWST-1（１ｍM）とBC-FDHを用いた系であり、WST-1（B1-5）で示され、灰色（B1-6）および白色（B2-5）が、NAD(４ｍM)とBC-FDHを用いた系であり、NADで示される。（B）WST-1（B1-5）についてのギ酸２ｍMまでのS-Vプロットを示す。（C）NAD（B1-6）についてのギ酸２ｍMまでのS-Vプロットを示す。 （A）反応２時間後の発色を示す（写真）。（B）ギ酸濃度に対する吸光度を示す。（C）ギ酸２ｍMまでのS-Vプロットを示す。 （A）BC-FDHの熱安定性を示す。（B）BC-FDHの基質特異性を示す。 (A) Mv-FDHと比較したPs-FDHの比活性を示す。(B) SDSPAGEによるPs-FDHの精製度の確認を示す（写真）。 （A）NAD(4ｍM)とWST-1(1.4ｍM)とジアフォラーゼとPs-FDHを用いてギ酸濃度を計測した場合のS-Vプロット(検量線)の直線性を示す。(B)NAD(4ｍM) とPs-FDHを用いてギ酸濃度を計測した場合のS-Vプロット(検量線)の直線性を示す。（C）Ps-FDHの基質特異性を示す。（D）Ps-FDHの熱安定性を示す。 Ps-FDH：ジアフォラーゼ(Diaphorase)＝1:1,1:5,1:10,1:20:1:40,1:80（ユニット比）と変えた場合のWST-1の発色の大きさを示す。 （A）電気化学的方法によりギ酸濃度を測定した場合のギ酸濃度と電流値の関係を示す。（B）Mv-FDHの基質特異性の確認を示す。（C）応答電流に対する塩濃度の影響を調べた結果を示す。（D）フェリシアン化カリウムを用いた場合のギ酸濃度に対する電流値のプロットを示す。（E）ヘキサアンミンルテニウム錯体を用いた場合のギ酸濃度に対する電流値のプロットを示す。 E. coli由来のAcKの活性を示す（写真）。 （A）Bacillus stearothermophilus由来のAcKを用いて酢酸濃度を目視で判定した結果を示す（写真）。（B）分光光学的方法により酢酸濃度を測定した場合の酢酸濃度に対する吸光度のプロットを示す。（C）電気化学的方法により酢酸濃度を測定した場合の酢酸濃度に対する電流値のプロットを示す。 （A）PCTおよびSCAOｘを用いて各種濃度のプロピオン酸を測定した場合の吸光度を示す。（B）プロピオン酸100μMまでのS-Vプロットを示す。 （A）ギ酸標準液（STD）と酵素活性の関係、および100%BDFに添加されたギ酸濃度と酵素活性の関係を示す。（B）100%BDFに添加されたギ酸に対する酵素活性から、ギ酸を添加していない試料で検出された酵素活性を差し引いて表示した結果を示す。 実施例のバイオセンサの構造を示す。 実施例のバイオセンサの各試薬部を示す。 実施例の電極式バイオセンサの構造を示す。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明の油の劣化を判定する方法は、（ｉ）ギ酸を基質とする酵素、酢酸を基質とする酵素、およびプロピオン酸を基質とする酵素の少なくとも１種と、油を含む試料または油から抽出された有機酸を含む試料とを反応させる工程、並びに（ｉｉ）酵素反応生成物の量を測定して、ギ酸、酢酸、およびプロピオン酸の少なくとも１種の濃度を測定する工程を含む。
　本発明の判定方法においては、上記工程（ｉ）および（ｉｉ）は同時に行われても、別々に行われてもよい。
　また、前記工程（ｉ）の前に、油を含む試料または油から抽出された有機酸を含む試料を前処理する工程をさらに含んでいてもよい。
　上述のように、潤滑油およびバイオディーゼル燃料（BDF）などの油においては、油の劣化により、ギ酸、酢酸、プロピオン酸が生じるため、これらの濃度を管理・分析することが必要である。例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸の濃度が所定の値を超えると油が劣化したと判断される。具体的には、ギ酸、酢酸、およびプロピオン酸の濃度の合計が３０ｐｐｍ以上となると油が劣化したと判定される。また、劣化した潤滑油およびBDFなどの油における短鎖有機酸の割合としては、大きい順に、ギ酸、酢酸、プロピオン酸となっている。
　従って、本発明の方法を用いて、ギ酸の濃度を測定することにより、好ましくはギ酸および酢酸の濃度を測定することにより、より好ましくはギ酸、酢酸およびプロピオン酸の濃度を測定することにより、これらの濃度を指標として（すなわち、これらの濃度の合計が３０ｐｐｍ未満であるかにより）、油の劣化を検出することができる。
　また、本発明の方法においては、ギ酸を基質とする酵素のみを用いたギ酸濃度測定方法も含まれる。本発明のギ酸濃度測定方法を用いる対象としては、潤滑油およびBDFなどの油以外には、果物、野菜、パン、酢、はちみつ、ワイン、魚、肉などの食品、紙、および尿などの生体試料、並びにホルムアルデヒドの酸化によって生じたギ酸が挙げられる。
１．本発明のギ酸測定法
１．１　本発明のギ酸測定の反応の概略
　本発明のギ酸測定に使用される酵素としては、ギ酸を基質とする酵素であり、好ましくは、NADを補酵素とするギ酸脱水素酵素である。
　本発明のギ酸測定法における、ギ酸脱水素酵素を用いる場合の反応は、例えば、以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
１．２　本発明のギ酸測定で使用される酵素
　本発明において使用されるギ酸脱水素酵素(Formate dehydrogenase; FDH)としては、Mycobacterium vaccae由来のギ酸脱水素酵素(Mv-FDH)、Pseudomonas sp.101由来のギ酸脱水素酵素(Ps-FDH)、Paracoccus denitrificans由来のギ酸脱水素酵素(PD-FDH)、およびBurkholderia cepacia由来のギ酸脱水素酵素(BC-FDH)が挙げられる。Burkholderia cepacia由来のギ酸脱水素酵素としては、Burkholderia cepacia NBRC 5507またはNBRC 5508由来のギ酸脱水素酵素が挙げられる。NBRC 5507およびNBRC 5508は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（NBRC）に保存されている。MvFDHのアミノ酸配列を配列番号２、塩基配列を配列番号１、PD-FDHのアミノ酸配列を配列番号４、塩基配列を配列番号３、Burkholderia cepacia NBRC 5507　BC-FDH　のアミノ酸配列を配列番号６、塩基配列を配列番号５、Pseudomonas sp. 101　Ps-FDHのアミノ酸配列を配列番号１６、塩基配列を配列番号１５に示す。
　本発明のギ酸測定においては、上記のようなギ酸脱水素酵素が使用されるが、実施例７のアライメントに示されるようなNAD結合領域およびギ酸結合領域が保存されている限り、例えば、配列番号２，４，６，１６のアミノ酸配列において、１～１０個、または１～５個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。同様に、本発明のギ酸脱水素酵素は、実施例７のアライメントに示されるようなNAD結合領域およびギ酸結合領域が保存されている限り、配列番号２，４，６，１６に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９９％のアミノ酸同一性を有するタンパク質であってもよい。
　Mycobacterium vaccae由来のギ酸脱水素酵素(Mv-FDH)は、ユニチカ社より供与されたが、PCR法によりゲノムからクローニングすることもできる。また、Pseudomonas sp.101由来のギ酸脱水素酵素(Ps-FDH)は、大腸菌に最適化した配列で全遺伝子を合成し、Paracoccus denitrificans由来のギ酸脱水素酵素(PD-FDH)は、PCR法によりゲノムからクローニングし、Burkholderia cepacia NBRC 5507由来のギ酸脱水素酵素(BC-FDH)については、PCR法によりゲノムからクローニングした。なお、BC-FDHのクローニングについては、以下の実施例７において具体的に示す。また、Pseudomonas sp.101由来のギ酸脱水素酵素(Ps-FDH)の合成については、以下の実施例９に示す。
　本発明の工程（ｉｉ）において、酵素反応生成物を間接的に測定するために、メディエータと組み合わせて使用されるジアフォラーゼは、ユニチカ社より市販されている。
１．３　本発明のギ酸測定
　本発明においては、ギ酸脱水素酵素と油を含む試料または油から抽出された有機酸を含む試料との酵素反応生成物を発色反応に供し、発色反応を分光学的に測定することにより、ギ酸の量を測定する。
　本発明においては、補酵素として、NAD+→NADH系が使用される。具体的には、NAD+は、酸化型 (NAD+) および還元型 (NADH) の２つの状態を取り得、ギ酸脱水素酵素により、NAD+はNADHに還元され、ギ酸イオンを二酸化炭素に酸化する。このときのNADH産生に伴う吸光度変化に基づいて、ギ酸濃度を測定してもよい。
　また、本発明において、ジアフォラーゼなどのNADHを利用する酵素反応とカップリングさせて、好ましくは、酸化状態または還元状態で色が異なるメディエータを使用して、発色反応により、ギ酸脱水素酵素により酸化されたギ酸の量を測定する。
　メディエータとしては、ＤＣＩＰおよびＷＳＴ－１などが挙げられる。これらのメディエータは、酸化状態または還元状態で色が異なるので、発色反応により、間接的にギ酸脱水素酵素により酸化されたNADHの量が測定でき、結果として、潤滑油およびバイオディーゼルなどの油の劣化により生じた短鎖有機酸としてのギ酸の量を測定できる。
　なお、ＤＣＩＰまたはＷＳＴ－１を用いる場合には、その濃度を１ｍM～１０ｍM、好ましくは５ｍM～１０ｍMとすることが好ましい。また、ギ酸脱水素酵素とジアフォラーゼとのユニット数の比は、１：４０～１：８０が好ましい。
　発色反応は、分光光度計を用いて、分光学的に計測することができる。酸化状態または還元状態で色が異なるメディエータを使用する場合には、目視によっても反応を確認できる。
　ギ酸測定は、ｐＨ７～９、好ましくはｐＨ８～９の、リン酸カリウム緩衝液およびＴｒｉｓ－ＨＣｌなどの緩衝液中で行うことができる。なお、Mv-FDHを使用する場合には、ｐH８～９が好ましく、Ps-FDHを使用する場合には、ｐH６．５～７．５が好ましい。
　本発明においては、ギ酸脱水素酵素と油を含む試料または油から抽出された有機酸を含む試料との酵素反応生成物の量を、ジアフォラーゼによって還元されるメディエータを電気化学的に測定することによってもギ酸の量を測定することができる。この場合、ジアフォラーゼと共に使用されるメディエータとしては、ＤＣＩＰ、ＷＳＴ－１、フェリシアン化カリウム、テトラチアフルバレン、フェリシアニド、フェロセニルボロン酸誘導体、キノン誘導体、ｐ－アミノフェニルリン酸エステル、Ru(II)、Ru(III)、Ru(IV)などのルテニウム錯体、およびプルシアンブルー／ホワイトが挙げられ、これらのメディエータの濃度としては、１ｍＭ～５０ｍＭであり、好ましくは５ｍＭ～５０ｍＭである。
　例えば、ギ酸脱水素酵素及びジアフォラーゼをカーボン電極上に固定し、メディエータのフェリシアン化カリウムおよびＮＡＤを含むリン酸カリウム緩衝液中に電極を浸し、銀／塩化銀電極に対して電位を印加することにより、還元されたフェリシアン化カリウムを電気化学的に計測することにより、ギ酸の量を測定することができる。
２．本発明の酢酸測定法
２．１　本発明の酢酸測定の反応の概略
　本発明の酢酸測定は、酢酸を基質とする酵素を用いて行うことができ、例えば、酢酸キナーゼを使用することができる。
　本発明の酢酸測定法における、酢酸キナーゼを用いる場合の反応は、以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
２．２　本発明の酢酸測定で使用される酵素
　本発明において使用される酢酸キナーゼ(Acetate kinase; AcK)としては、B. stearothermophilus由来の酢酸キナーゼおよびE. coli由来の酢酸キナーゼが挙げられる。
　B. stearothermophilus由来の酢酸キナーゼは、ユニチカ社より市販され、E. coli由来の酢酸キナーゼはSIGMA社より市販されている。
　本発明において使用されるピルビン酸キナーゼ(Pyruvate kinase)は、SIGMA(FLUKA) 83328 / rabbit muscleとして市販され、ピルビン酸オキシダーゼ(Pyruvate oxidase)は、TOYOBO P311 /microorganismとして市販されている。
２．３　本発明の酢酸測定
　本発明においては、好ましくは、酢酸キナーゼと油を含む試料または油から抽出された有機酸を含む試料との酵素反応生成物を発色反応に供し、発色反応を分光学的に測定することにより、酢酸の量を測定する。
　本発明においては、酢酸キナーゼと共に、好ましくは、ADPのリン酸化に関与するピルビン酸キナーゼが使用される。ピルビン酸キナーゼによる、ADPのリン酸化によりATPが生じるとともに、ホスホエノールピルビン酸はピルビン酸へ脱リン酸化される。このピルビン酸を、好ましくは、酸化状態または還元状態で色が異なるメディエータを使用して、発色反応により、酢酸キナーゼによりリン酸化された酢酸の量を間接的に測定することができる。
　メディエータとしては、DCIPおよびWST-1など還元型が水溶性である物質が挙げられる。メディエータを使用する場合には、ギ酸測定の場合と同様に、ジアフォラーゼと組み合わせることもできる。ジアフォラーゼと組み合わせるメディエータとしては、ビタミンK、フェナンスロリンキノンなどのキノン系化合物が好ましい。
　発色反応は、分光光度計を用いて、分光学的に計測することができる。酸化状態または還元状態で色が異なるメディエータを使用する場合には、目視によっても反応を確認できる。
　また、本発明においては、酢酸キナーゼを使用して、以下の反応によっても酢酸の量を計測することができる。ATPの存在下で、酢酸キナーゼを作用させ、その後、ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に脱リン酸化するまでは、先の反応と同一であるが、ピルビン酸酸化酵素(Pyox)によって、ピルビン酸を酸化して、過酸化水素を生じさせ、生成した過酸化水素を、４－アミノアンチピリン(4-AA)およびN,N-ビス（４－スルホブチル）－３－メチルアニリン(TODB)とともにペルオキシダーゼ(POD)により、キノンイミン色素とすることができ、結果として、酢酸濃度としてキノンイミン色素の吸光度を５４６ｎｍの波長で測定することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　本発明においては、酢酸キナーゼと油を含む試料または油から抽出された有機酸を含む試料との酵素反応生成物の量を電気化学的に測定することによっても酢酸の量を測定することができる。
　例えば、ATPの存在下で、酢酸キナーゼを作用させ、その後、ホスホエノールピルビン酸をピルビン酸に脱リン酸化するまでは、先の反応と同一であるが、ピルビン酸酸化酵素によって、ピルビン酸を酸素と反応させて、生じた過酸化水素を、過酸化水素電極で電気化学的に検出することもできる。
　また、ギ酸を測定する場合と同様にして、酢酸キナーゼと油を含む試料または油から抽出された有機酸を含む試料との酵素反応生成物の量を、ピルビン酸オキシダーゼによって還元されるメディエータを電気化学的に測定することによっても酢酸の量を測定することができる。使用されるメディエータとしては、フェリシアン化カリウム、テトラチアフルバレン、キノン誘導体、フェナジンメトサルフェート、メトキシフェナジンメトサルフェート、フェロセニルボロン酸誘導体、ｐ－アミノフェニルリン酸エステル、Ru(II)、Ru(III)、Ru(IV)などのルテニウム錯体、およびプルシアンブルー／ホワイト等が挙げられる。
３．本発明のプロピオン酸測定法
３．１　本発明のプロピオン酸測定の反応の概略
　本発明のプロピオン酸測定は、プロピオン酸を基質とする酵素を用いて行うことができ、好ましくは、プロピオニルCoAトランスフェラーゼである。
　本発明のプロピオン酸測定法における、プロピオニルCoAトランスフェラーゼを用いる反応は、以下のとおりである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
３．２　本発明のプロピオン酸測定で使用される酵素
　本発明において使用されるプロピオニルCoAトランスフェラーゼ(Acyl CoA transferase; PCT)としては、Clostridium propionicum由来のプロピオニルCoAトランスフェラーゼが挙げられる。本発明において使用したClostridium propionicum由来のPCTのアミノ酸配列を配列番号１２、塩基配列を配列番号１１で示す。配列番号１２は、登録番号AJ276553としてGenBankに登録されている野生型配列と、２番目および３番目のアミノ酸が異なっており、野生型配列では、２番目および３番目のアミノ酸が、それぞれＲおよびＫであり、本発明の変異型配列では、ＡおよびＳとなっている。
　本発明において使用される短鎖アシルCoAオキシダーゼ(Short chain acyl CoA oxidase; SCAOx)としては、Arabidopsis thaliana由来の短鎖アシルCoAオキシダーゼが挙げられる。本発明において使用したArabidopsis thaliana由来のSCAOxのアミノ酸配列を配列番号１４(GenBank accession code NM_115043)、塩基配列を配列番号１３で示す。配列番号１３は、3'末端がTGA となっている点で、3'末端がTAAである野生型配列(GenBank accession code NM_115043)と異なっている。
　本発明のプロピオン酸測定においては、上記のようなプロピオニルCoAトランスフェラーゼおよび短鎖アシルCoAオキシダーゼが使用されるが、例えば、配列番号１２，１４のアミノ酸配列において、１又は複数、２～１０個、または２～５個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
　Clostridium propionicum由来のプロピオニルCoAトランスフェラーゼ(PCT)およびArabidopsis thaliana由来の短鎖アシルCoAオキシダーゼは、以下の実施例１３に示されるように、大腸菌で組み換え生産し、精製した。
　本発明において使用される場合、PCTとSCAOｘとのユニット数の比は、１：１～１：３であり、より好ましくは１：１．５～１：２．５、最も好ましくは１：２である。
３．３　本発明のプロピオン酸測定
　本発明においては、好ましくは、プロピオニルCoAトランスフェラーゼと油を含む試料または油から抽出された有機酸を含む試料との酵素反応生成物を発色反応に供し、発色反応を分光学的に測定することにより、プロピオン酸の量を測定する。
　本発明において、好ましくは、酸化状態または還元状態で色が異なるメディエータを使用して、発色反応により、プロピオニルCoAトランスフェラーゼにより生成されたエステルの量を測定する。
　メディエータとしては、DCIPおよびWST-1などが挙げられる。これらのメディエータは、酸化状態または還元状態で色が異なるので、発色反応により、プロピオニルCoAトランスフェラーゼにより生じたエステルの量を測定し、結果として、潤滑油およびバイオディーゼルなどの油の劣化により生じた短鎖有機酸としてのプロピオン酸の量を測定できる。SCAOxと組み合わせるメディエータとしては、フェナジンメトサルフェート、メトキシフェナジンメトサルフェートが好ましい。
　発色反応は、分光光度計を用いて、分光学的に計測することができる。酸化状態または還元状態で色が異なるメディエータを使用する場合には、目視によっても反応を確認できる。
　また、本発明においては、プロピオニルCoAトランスフェラーゼを使用して、以下の反応によってもプロピオン酸の量を計測することができる。アセチルCoAの存在下で、プロピオニルCoAトランスフェラーゼを作用させるまでは、先の反応と同一であるが、短鎖アシルCoAオキシダーゼによって、プロピオニルCoAを酸化して、過酸化水素を生じさせ、生成した過酸化水素を、４－アミノアンチピリンおよびN,N-ビス（４－スルホブチル）－３－メチルアニリンとともにペルオキシダーゼ(POD)により、キノンイミン色素とすることができ、結果として、プロピオン酸濃度としてのキノンイミン色素の吸光度を５４６ｎｍの波長で測定することができる。
　本発明において使用される場合、ペルオキシダーゼ（POD）のユニット数は、０．１U以上、より好ましくは０．１５U以上であり、最も好ましくは０．１５～０．２Uである。
　また、ギ酸を測定する場合と同様にして、プロピオニルCoAトランスフェラーゼ(PCT)と油を含む試料または油から抽出された有機酸を含む試料との酵素反応生成物の量を、短鎖アシルCoAオキシダーゼ(SCAOx)によって還元されるメディエータを電気化学的に測定することによってもプロピオン酸の量を測定することができる。使用されるメディエータとしては、フェリシアン化カリウム、テトラチアフルバレン、フェリシアニド、フェナジンメトサルフェート、メトキシフェナジンメトサルフェート、フェロセニルボロン酸誘導体、ｐ－アミノフェニルリン酸エステル、Ru(II)、Ru(III)、Ru(IV)などのルテニウム錯体、およびプルシアンブルー／ホワイトが挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　本発明においては、プロピオニルCoAトランスフェラーゼと油を含む試料または油から抽出された有機酸を含む試料との酵素反応生成物の量を電気化学的に測定することによってもプロピオン酸の量を測定することができる。
　例えば、アセチルCoAの存在下で、プロピオニルCoAトランスフェラーゼを作用させるまでは、先の反応と同一であるが、短鎖アシルCoAオキシダーゼによって、プロピニルCoAを酸素と反応させて、生じた過酸化水素を、過酸化水素電極で電気化学的に検出することもできる。
　本発明の短鎖有機酸を測定する方法は、上記のようなギ酸、酢酸またはプロピオン酸を基質とする酵素および酵素反応生成物を定量するための酵素およびメディエータを、キットの構成要素として用いることができる。ブルクホルデリア・セパシアの脱水素酵素を用いたセンサ及びアッセイキットは、例えば、国際公開ＷＯ２００６／１３７２８３号公報に記載されている。本発明の各種酵素も、同様にして使用することができる。
　本発明のギ酸、酢酸、またはプロピオン酸を基質とする酵素を少なくとも１つ用いるバイオセンサは、具体的には、電気絶縁性の基板上に、スクリーン印刷等の方法によって作用極（測定極）と対極とを有する電極系を形成し、その上に、上記酵素およびメディエータなどを含む試薬層を形成することにより作製できる。このようなバイオセンサの製造方法は、例えば、特開平１－２９１１５３号公報、国際公開ＷＯ２００５／０４３１４６号公報に記載されている。
　本発明の油を含む試料または油から抽出された有機酸を含む試料は、好ましくは、潤滑油またはバイオディーゼルを含む試料であり、より好ましくは、これらの油から抽出された有機酸の抽出物である。劣化油からの有機酸抽出は、水または水系溶媒によって行うことができる。
　本発明において、劣化油を含む試料を水で抽出したものを、ギ酸を基質とする酵素、酢酸を基質とする酵素、および／またはプロピオン酸を基質とする酵素と反応させ、それぞれ、ギ酸、酢酸、またはプロピオン酸の濃度を測定する。
　なお、以下の実施例で示される通り、有機酸抽出時に塩化ナトリウムを使用すると、ギ酸脱水素酵素およびジアフォラーゼの活性が低下することから、塩化ナトリウムの使用に注意することが好ましい。
　次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
〔実施例１〕ギ酸濃度測定時のｐHの影響
　ユニチカ社製のギ酸脱水素酵素(Mv-FDH)を用いて、反応の液量を 160 mLとし、ギ酸ナトリウム濃度を0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.8; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 8; 10; 12; 14; 16; 18; 20; 30; 40; 60; 80; 100; 150; 200; 300; 400; 600; 900 mMとして分光学的にギ酸を計測した。
　FDH (NADH; 340nmの吸光度の上昇を計測する方法)
　反応液の組成は、500 mM リン酸カリウム緩衝液 (pH 7.0)、500 mM Tris-HCl (pH 8.0)、または 500 mM Tris-HCl (pH 9.0)を、16 mL (終濃度 50 mM); 40 mM b-NAD+, 16 mL (終濃度4 mM); 10 U/mL Mv-FDH, 10 mL (終濃度0.1 U); Mili-Q, 102 mL; ギ酸ナトリウム 16 mL（濃度は上記0.1～900mM）とした。
　FDH-Diaphorase (1:10) (WST-1を用い438 nmの吸光度の増加を計測する方法) 
　反応液の組成は、500 mM リン酸カリウム緩衝液 (pH 7.0)、500 mM Tris-HCl (pH 8.0)、または 500 mM Tris-HCl (pH 9.0)を、16 mL (終濃度50 mM); 40 mM b-NAD+, 16 mL (終濃度4 mM); 10 U/mL Mv-FDH, 10 mL (終濃度0.1 U); 50 U/mL Diaphorase I, 20 mL (終濃度1 U); 超純水 66 mL; 14 mM WST-1, 16 mL (終濃度1.4 mM); ギ酸ナトリウム 16 mL（濃度は上記0.1～900mM）とした。
　Mv-FDH単独（すなわちNADHの生成を340nmの吸光度の増加速度で計測する方法）ではpH 7.0 で最大の活性を示し（図１Ａ）、40 mMおよび90 mM ギ酸ナトリウムに対してpH8.0,　9.0で測定するとpH7.0の80 % の活性だった(図１Cの左半分)。 一方、 Mv-FDH-Diaphorase の系での感度はpH 8.0 と 9.0 とで最大を示した（図１Ａ，Ｂ）。8 mM および 20 mM ギ酸ナトリウムではMv-FDH-Diaphorase 系での感度はpH7.0 時の180 %であった。この違いは、最適pHがMv-FDHとDiaphoraseとで異なることによると考えられる。
　ユニチカ社のプロトコルではMv-FDH の至適pH は6.0 - 8.0、Diaphorase の至適pHは 8.0であると記載されているため、pH8.0 - 9.0で計測すると感度が高くなる可能性が示唆された。
　ギ酸ナトリウム2 mMまでの低濃度域のS～Vプロットを拡大すると良好な直線性がみられた (R2 > 0.9)（図１B）。以上より、劣化油から抽出した有機酸はpH 8～9で計測するのが最も良いため、劣化油から抽出する際もpH 8～9が良いと考えられる。
〔実施例２〕ｐH9.0におけるNaCl濃度の影響
　反応液は全量で160 mLとし、ギ酸ナトリウム濃度を 0; 250; 500; 1000; 1500; 2000; 2500; 3000; 4000 mMとした。
　FDH (NADH; 340nmの吸光度の上昇を計測する方法)
　反応液の組成は、500 mM Tris-HCl pH 9.0を16 mL (終濃度50 mM); 40 mM b-NAD+, 16 mL (終濃度4 mM); 10 U/mL Mv-FDH, 10 mL (終濃度0.1 U); 超純水70 mL; NaCl, 32 mL; ギ酸ナトリウム 16 mL（濃度は上記０～４０００ｍM）とした。反応液を室温で 20 minインキュベートした後にギ酸ナトリウムを添加して反応を開始した。
　FDH-Diaphorase (1:10) (WST-1を用い438 nmの吸光度の増加を計測する方法)
　反応液の組成は、500 mM Tris-HCl pH 9.0, 16 mL (終濃度50 mM); 40 mM b-NAD+, 16 mL (終濃度4 mM); 10 U/mL Mv-FDH, 10 mL (終濃度0.1 U); 50 U/mL Diaphorase I, 20 mL (終濃度1 U); 超純水34 mL; NaCl, 16 mL; 14 mM WST-1, 16 mL (終濃度1.4 mM); ギ酸ナトリウム16 mL（濃度は上記０～４０００ｍM）とした。反応液を室温で 20 minインキュベートした後にWST-1を添加し、その後、ギ酸ナトリウムを添加して反応を開始した。
　Mv-FDH単独およびMv-FDH-Diaphorase いずれの場合もNaClとインキュベ－トすると活性は低下した（図１D）。100 mM NaClではMv-FDH-Diaphorase は活性が50%まで低下した。Mv-FDH 単独ではMv-FDH-Diaphorase 系よりも活性を保っていた。ユニチカ社プロトコルにはMv-FDHの塩耐性に関するデータは記載されていないが、Diaphoraseに関しては300 mM NaCl, KCl, MgCl2 において活性が80 %まで低下すること、80 mM CaCl2 では60 %まで低下することが示された。以上より、劣化油からの有機酸抽出時のNaCl等塩の添加には注意が必要である。
〔実施例３〕メディエータの種類の影響
　酸化還元色素としてDCIPとWST-1とを比較した（表１）。項目4と7、5と8を比べるとVmaxはDCIPを使用した方が高く、Km値も大きかった。DCIPもこの計測系に使用できること、感度はWST-1より高いことがわかった。しかしながら、DCIPは反応の進行により吸光度が減少していく化合物であるため、バックグラウンドが高くダイナミックレンジが狭いと考えられ、WST-1の方が望ましいことが示唆された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
〔実施例４〕WST-1濃度の影響
　反応液は全量で160 mLとし、ギ酸ナトリウム濃度を0.1; 0.2; 0.3; 0.4; 0.5; 0.6; 0.8; 1; 2; 3 mMとした。
　FDH-Diaphorase (1:10) (WST-1を用い438 nmの吸光度の増加を計測する方法)
　反応液の組成は、500 mM Tris-HCl pH 8.0を16 mL (終濃度50 mM); 40 mM b-NAD+, 16 mL (終濃度4 mM); 10 U/mL Mv-FDH, 10 mL (終濃度0.1 U); 50 U/mL Diaphorase I, 20 mL (終濃度1 U); 超純水, 80.4 mL or 78 mL or 74 mL or 66 mL; 100 mM WST-1, 1.6 mL or 4 mL or 8 mL or 16 mL  (終濃度1 mM, 2.5 mM, 5 mMまたは10 mM); ギ酸ナトリウム 16 mL（上記濃度）とした。
　WST-1濃度を 1 mM, 2.5 mM, 5 mM, 10 mMと上げていっても、吸光度の増加速度は上昇しなかった（図２）。しかし、ギ酸濃度が低い範囲(2 mM = 93.3 ppm以下)では、直線性が向上していた。なお、pH 8.0で計測したみかけの Km 値は、Mv-FDHの文献値（A.Galkin, L.Kulakova, V.Tishkov, N. Esaki, K. Soda. Cloning of formate dehydrogenase gene from a methanol-utilizing Mycobacterium vaccae N10. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 479-483 (1995)）と近かった。以上より、低濃度のギ酸を計測する際には、WST-1 濃度は 2.5 ～ 5 mMが望ましいことが示された。
〔実施例５〕Mv-FDHとジアホラーゼの混合比率
　表１の項目4,5,6はMv-FDH : Diaphorase＝1:1, 1:5, 1:10（ユニット比）と変えた場合の見かけのKm, Vmaxを示す。これらを比較するとWST-1濃度が一定ならばDiaphorase比が高い方がVmaxが大きく（すなわち感度が高く）、Km値が高い（すなわち直線範囲が広い）ことがわかる。項目7，8でDCIPを用いた場合にも同様であった。このことから、以下の実施例６では、WST-1を2.5または5mM、Ps-FDH:Diaphorase＝1:30とした。
〔実施例６〕End-point 法での計測 (pH 8.0) 
　上記実施例４の試料と同一の試料を用いた。96穴マイクロプレートに試料を入れ、デジタルカメラでマイクロプレートを撮影した（図３A,B）。このとき、並行して10 mLの試料を 990 mLの緩衝液に添加 (1/100 希釈)し、438nmでの吸光度を計測した。
　上記実施例４の試料をそのまま長時間インキュベートし、長くした場合の反応液の色調を観察した。アルミホイルで遮光し2時間（図３A）または24時間（図３B）インキュベートした後の色調を写真で示す。2mM以下の濃度では目視でギ酸濃度に応じた明確な色変化がみられた。試料を100倍希釈し438 nm での吸光度をギ酸濃度に対してプロットすると、WST-1濃度2.5 mMの場合、良好な直線性を示した（図３C）。以上より、本方法により低濃度のギ酸が簡便に正確に計測できることが示された。
〔実施例７〕バクテリア由来のギ酸脱水素酵素遺伝子のクローニング
１．FDH遺伝子の候補選定
　Ps-FDH (Pseudomonas sp.101) のコドンを、以下の3種類の異なるプログラムを用いて大腸菌発現用に最適化した：OPTIMIZER (genomes.urv.cat/OPTIMZER) (Nucl. Acids Res. 35(Suppl 2): W126-W131 (2007)); Gene Design 3.0 (www.genedesign.org) (Nucl. Acids. Res. 38(8) 2603-2606 (2010));およびGenScript社の OptimumGeneTM サービス (www.genscript.com/codon_opt.html)。
　OPTIMIZER と Gene Design 3.0 はコドン頻度のみを考慮するもので、Mv-FDH 遺伝子とは96 %類似の配列であった。一方、GeneOptimumTM はGC含量とmRNA二次構造なども考慮するプログラムで、Mv-FDH のDNA配列と80%の類似性であった。Ps-FDH はアミノ酸配列が公開されているが(Dokl. Akad. Nauk. SSSR 317: 745-748 (1991))、DNA配列はデータバンクには登録されておらず、OPTIMIZER とGene Design 3.0で予測した配列の合成を依頼した。
　Mv-FDH 配列のアミノ酸配列をPSI-BLASTで検索した。これはBLASTよりも、より遠い配列を検索できるものである。検索の結果、主としてバクテリア (identity, 99-22%), 真菌(identity, 78-37%) 、植物 (identity, 51-26%) 由来の配列が得られた。
　以下のとおり、NAD+ との結合、ギ酸との結合に関与するアミノ酸はほとんどすべての配列で保存されていた。なお、配列アライメントにはCLUSTALを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　Ｍｖ－ＦＤＨ配列における１２６位のアスパラギン酸、１４８位のセリン、１９８位のバリン、２０２位のアルギニン、２０３位のイソロイシン、２２２位のアスパラギン酸、２２３位のアルギニン、２５９位のヒスチジン、３８１位のセリン、および３８２位のチロシンはＮＡＤ結合部位を示す。
　Ｍｖ－ＦＤＨ配列における１４７位のアスパラギン、１５１位のバリン、２８３位のトレオニン、２８５位のアルギニン、３０９位のアスパラギン酸、３３３位のヒスチジン、３３５位のセリン、および３３６位のグリシンはギ酸結合部位を示す。
　従って、バクテリアの FDHは、高い触媒活性 kcat, 至適反応温度が高いこと, Km値（Biochemistry (Moscow) 69: 1252-1267 (2004)）などから計測に適していると考えられた。
　ここで、Paracoccus denitrificans と Burkholderia cepaciaは、Mv-FDHの アミノ酸配列との同一性がそれぞれ80 % と 69 %で適度な相同性があったため、目的配列をPCR法でクローニングすることにした。なお、近縁である Burkholderia stabilis FDHは、NADP+に対する特異性が高いことが知られている（Enzyme Microbiol. Technol. 46: 557-561 (2010)）。
２．FDH遺伝子の合成
　PCR での FDH 遺伝子の増幅は次のような方法で行った。組成： GoTaq, 25 mL; 10 mM forward または reverse プライマー 2 mL, 滅菌超純水 21 mL; 鋳型DNA , 細胞のペレット (total volume, 50 mL). 鋳型DNAは次のように調製した：
　10 mL のParacoccus denitrificansグリセロールストックまたは Burkholderia cepacia IFO 5507を1 mL LB 培地で37 oCで一夜培養した。培地100  mL を10,000 r.p,m, 3 min., 4 oCで遠心分離したペレットをそのままPCRのテンプレートとして用いた。
　プライマーの配列: P. denitrificans forward (NdeI), 5'-TTA CAT ATG GCC AAG GTT GTT TGC GTG CTC-3'（配列番号７）; reverse (HindIII), 5'-TTA AAG CTT TCA GCC GAC CTT CTC GAA CTT CGC-3' （配列番号８）; B. cepacia forward (NdeI), 5'-TTA CAT ATG GCC ACC GTC CTG TGC GTG CTC-3' （配列番号９）; reverse (HindIII), 5'-TTA AAG CTT TCA CGT CAG CCG GTA CGA CTG CGC-3' （配列番号１０）。
　PCR条件: 95 oC, 2 min.; [(95 oC, 30 sec.); (55 oC or 60 oC, 30 sec); (72 oC, 2 min.30 sec)] x 40; 72 oC, 10 min.
　PCR産物10 mL を1 %アガロースゲルで電気泳動したところ、FDH遺伝子に相当する大きさのバンドが検出できた。
　Paracoccus denitrificans (PD-FDH) および Burkholderia cepacia NBRC 5507 (BC-FDH) FDH遺伝子PCR産物をGeneCleanIIを用いて精製し、NdeI and HindIIIで切断した。電気泳動後にゲルを切り出し、GeneCleanIIで精製後、Takara ligation kitを用いて同制限酵素で切断したpET28a-SCAoxとライゲーションし、E. coli BL21 に形質転換後、50 mg/mL Kanamycinを含むLB培地でセレクションした。
　コロニーPCR にてFDH 遺伝子を確認したところ、E. coli BL21 pET28a PD-FDHと E. coli BL21 pET28a BC-FDH のコロニーPCRにおいて、FDHに相当する大きさのバンドが検出でき、クローニングできたことが確認された。
３．Paracoccus denitrificans FDH (PD-FDH) および Burkholderia cepacia FDH (BC-FDH) の精製
　Overnight expression法で培養したところPD-FDH は大部分が不溶性画分に発現し、Ni-NTAカラムでの溶出画分に活性はなかった（図４B）。一方、BC-FDHも大部分が不溶性画分に発現したが、Ni-NTAカラムでの溶出画分に活性があり（図５B）、SDS-PAGEでもBC-FDH　41.4kDaに相当するシングルバンドが確認できた（図５C）。なお、図５BにおけるB1-4～B1-8およびB2-3～B2-8は、それぞれ図５Cのレーン４～８およびレーン３～８に対応する。実施例８において、B1-5をWST-1アッセイに、B1-6およびB2-5をNADアッセイに用いた。
〔実施例８〕BC-FDHを用いたギ酸の計測（発色反応）
　ギ酸計測は、NADHの吸光度を計測する方法と、ジアフォラーゼと組み合わせてWST-1の吸光度を計測する方法とで、End point法で基質特異性および熱安定性について測定した。
　NAD (4 mM)またはWST-1 (1 mM)およびBC-FDH を用いてギ酸濃度と酵素活性を計測したところ、Michaelis-Menten型の飽和曲線を描いた（図６A）。ここで、上記B1-5は黒丸に、B1-6は灰色丸に、B2-5は白丸に対応する。また、ギ酸濃度 0-2 mM 範囲では良好な直線性を有していた（図６B、C）。
　反応2時間後の反応液の吸光度（WST-1のみ）も同様の結果であり（図７B）、0-2 mM 範囲では良好な直線性を有していた（図７C）。また、目視でもギ酸濃度に応じた色調の変化が観察された（図７A）。BC-FDH を用いた測定系の基質特異性および熱安定性は、Mv-FDHと同様で良好であり（図８）、BC-FDH は、ユニチカ社製のMv-FDHと同等に使用可能であると判断された。
〔実施例９〕Ps-FDH遺伝子のクローニングおよび調製
　Ps-FDHは、以下のアライメントの通り、Mv-FDHと遺伝子の類似が96%あり、適度な相同性を有するのでクローニングをすることとした（Tishkov V.I., Galkin A.G., Egorov A.M. Dokl. Akad. Nauk SSSR 317:745-748(1991)およびPopov V.O., Shumilin I.A., Ustinnikova T.B., Lamzin V.S., Egorov T.A. Bioorg. Khim. 16:324-335(1990)）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（Ps-FDH遺伝子の調製方法）
　Ps-FDHは、既報のアミノ酸配列をもとに、大腸菌での生産のためコドンを最適化した遺伝子をGenScript, US社に依頼し化学合成した。Ps-FDH遺伝子はpET28(a)ベクターに挿入し、pET28aPs-FDHベクターを調製し、これを大腸菌BL21(DE3)株に形質転換した。
（Ps-FDHの調製：培養）
　BL21(DE3)/pET28Ps-FDHを500mLフラスコ中、50μg/mL Kanamycinを含む100mLのLB培地に植菌し、37℃で一夜前培養した。次に3Lのファーメンタに50μg/mL Kanamycinを含む2Lのovernight expression用培地を入れ、25℃で600rpmで撹拌し、1v/v minで通気して30時間培養し、4℃7000xg、20分で遠心分離して集菌し、16.8gの湿菌体を得た。
　湿菌体を10mM imidazole, 300mM NaClを含む50mM リン酸カリウム緩衝液(pH7)に懸濁させフレンチプレスで破砕し、cell-free extractを調製した。20,000 x g, 30分、4℃で遠心分離し、可溶性画分を105 mL調製し,そのうち2本を精製した。
（Ps-FDHの調製：精製）
　精製はNi-agaroseカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィで行った。Ni-agaroseレジンを詰めたカラムを10mM imidazole, 300mM NaClを含む50mM リン酸カリウム緩衝液(pH7)で平衡化し、可溶性画分35mLを添加したのち、同緩衝液を流して洗い、次にimidazole濃度を10mMから50,100,150,200,250mMとした緩衝液を順番に添加して流れ出る液体を採取し、1-1，1-2，1-3，1-4，1-5，1-6とした。それぞれのフラクションを50mM リン酸カリウム緩衝液(pH7)で透析した。
（精製度の確認）
　1-1，1-2，1-3，1-4，1-5，1-6の各フラクションの蛋白濃度を測定し、SDS-PAGEで精製度を確認した。Ps-FDH活性は、以下の方法で計測した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
（精製の結果）
　各フラクションの比活性を図９Aに示す。各フラクション溶出時のイミダゾール濃度は以下の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　SDSPAGEによる精製度の確認を図９Bに示す。Ps-FDHは比活性が高く、生産量も良好であり、FDH試料として好ましい性質を有していた。
〔実施例１０〕Ps-FDHを用いたギ酸の計測（発色反応）
　Ps-FDHの評価として、“NAD(4ｍM)とWST-1(1.4ｍM)とPs-FDH”または“NAD(4ｍM) とPs-FDH”を用いてギ酸濃度を計測し、S-Vプロット(検量線)の直線性を確認した。それらの測定方法と結果を以下に示す（表４、図１０A、B）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　図１０A、Bに示される通り、ギ酸濃度0－1ｍMの範囲で良好な直線性を示していた。更に、Ps-FDHの基質特異性と熱安定性も確認した。それらの測定方法と結果を以下に示す（表５、図１０C、D）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　基質特異性および熱安定性は共に、Mv-FDHと同様に良好であった。
　以上のデータより、Ps-FDHはユニチカ社製のMv-FDHと同等に使用可能であることがわかった。また、Ps-FDHはBC-FDHよりも生産性も高いため、Ps-FDHの方が有用性が高いことが理解される。
〔実施例１１〕Ps-FDHとジアホラーゼの混合比率
　下の表に示すような比率で試薬を調製し、各濃度のギ酸におけるPs-FDHの活性を測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　結果を図１１に示す。図１１はPs-FDH：diaphorase＝1:1,1:5,1:10,1:20:1:40,1:80（ユニット比）と変えた場合の活性を示す。各群の活性を比較すると、diaphorase比が高い方が傾きが大きく（感度が高く）見かけのKmが高い（直線範囲が広い）ことがわかる。計測したいギ酸濃度は0.6mM(30ppm)以下の範囲であるため、以上よりギ酸を計測する際には、Ps-FDH:Dia比が1：40から１：80の範囲が望ましいことが示された。
〔実施例１２〕Mv-FDHを用いたギ酸の計測（電気化学的）
　β-NAD 4mM, Mv-FDH 0.1U, フェリシアン化カリウム40mM, Diaphorase 0.5U, NaCl を含む50mMリン酸緩衝液(pH7) 9.5μLに対して、ギ酸を0～4mMまでの様々な濃度になるように添加し、1分または5分おいてから400mV vs（Ag/AgCl）の電位を印加し、20秒後の電流値を計測しギ酸濃度に対してプロットした。結果を図１２Aに示す。
　反応時間1分でもギ酸濃度が計測できた。反応時間を5分とするとさらに感度が上昇した。以上のように、電気化学法での計測について検討を行ったところ、5分で十分な感度で計測ができることがわかった。
基質単体に対する特異性の確認
　β-NAD 4mM, Mv-FDH 0.1U, フェリシアン化カリウム40mM, Diaphorase 0.5U, NaCl を含む50mMリン酸緩衝液(pH7) 9.5μLに対して、ギ酸・酢酸・プロピオン酸・酪酸それぞれを終濃度4mMの濃度になるように添加し、5分おいてから400mV vs（Ag/AgCl）の電位を印加し、120秒間の応答電流値の推移と、20秒後の電流値を計測した。
　結果を図１２Bに示す。ギ酸を基質とした場合にのみ高い応答電流が得られた。電位を印加後20秒後の電流値は、ギ酸に対する応答電流値を100％とすると、他の基質に対する応答電流値は2%以下と、ほとんど見られなかった。
混合基質に対する反応性確認
　β-NAD 4mM, Mv-FDH 0.1U, フェリシアン化カリウム40mM, Diaphorase 0.5U, NaCl を含む50mMリン酸緩衝液(pH7) 9.5μLに対して、それぞれ終濃度でギ酸1.5mM+酢酸4mM / ギ酸1.5mM+プロピオン酸 4mM / ギ酸1.5mM+酪酸 4mMの濃度になるように混合基質を添加し、5分おいてから400mV vs（Ag/AgCl）の電位を印加し、120秒間の応答電流値の推移を計測した。
　どの混合基質に対してもギ酸1.5ｍMに対する応答電流値と同等の電流値しか計測されなかった。
　以上のように、基質単体の場合も、複合基質の場合も、ギ酸のみに高い反応性がみられた。
塩濃度の影響検討
　検討方法は、上の測定条件と同じとした。ただし反応時間を5分とし、NaCl終濃度を0,400,800mMとした。結果を図１２Cに示す。NaCl濃度は低い方が望ましいことが理解された。
メディエータとして、塩化ヘキサアンミンルテニウム(III)またはヘキサシアノ鉄(III)酸カリウムを用いる場合
　β-NAD 4mM, Ps-FDH 0.03U, フェリシアン化カリウムまたはヘキサアンミンルテニウム錯体40mM, Diaphorase 0.5Uを含む50mMリン酸緩衝液(pH7) 9.5μLに対して、ギ酸を0～4mMまでの様々な濃度になるように添加し、5分おいてから400mV vs（Ag/AgCl）の電位を印加し、20秒後の電流値を計測しギ酸濃度に対してプロットした。結果を図１２D、Eに示す。いずれのメディエータを用いた場合でも同程度の直線性が得られた。すなわち、いずれを用いてもギ酸計測が可能である。
〔実施例１３〕酢酸の計測
　下記のpyruvate kinase-pyruvate oxidase-peroxidase system で E. coli 由来の酢酸キナーゼ(Sigma)を加えて酢酸計測を行った。
(1) ATP + Acetate -(Acetate kinase)-> ADP + Acetylphosphate.
(2) ADP + PEP -(Pyruvate kinase)-> Pyruvate + ATP. 
(3) Pyruvate + O2 -(Pyruvate oxidase)-> Acetyl phosphate + H2O2. 
(4) H2O2+ TODB +4AA -(peroxidase)-> quinonedye
　反応液は 160 mLであり、組成は以下のとおりであった：
25mM HEPES (pH 7.4)または25 mM PPB (pH 7.4)
100 mM ATP, 20 mL (f.c. 12.5 mM); 
1,000 U/ml Acetate kinase from E. coli (Sigma), 2 mL (f.c. 2 U);
200 mM MgCl2, 20 mL (f.c. 25 mM); 5 mM PEP, 19 mL (f.c. 0.6 mM);
1,000 U/mL Pyruvate kinase, 16 mL (16 U); 
Pyruvate oxidase, 3.2U;
TODB, 1.5mM;
4AA, 1.5mM;
Peroxidase, 0.32U;
3,000 mM acetate, 16 mL (300 mM)。
　E. coli由来AcK (Sigma)を反応させたところ、酢酸の有無で違いがみられ、AcK活性があることが示された（図１３）。「－」は300 mM酢酸なし、「+」は300 mM酢酸あり、を示す。
〔実施例１４〕酢酸の計測
　Bacillus stearothermophilus 由来の酢酸キナーゼを用いて測定を行い、検量線データを求めた。
発色反応
　0,16U 酢酸キナーゼ,1mM ATP, 0.25mM phosphoenolpyruvate, 3.2U ピルビン酸オキシダーゼ, 1.5mM 4-アミノアンチピリン, 1.5mM TODB 0.32U peroxidase溶液に0-0.8mMとなるように酢酸を混合して96穴マイクロフ゜レートに試料を入れ、90分後にデジタルカメラでマイクロプレートを撮影した。この時並行して各試料を一定の倍率で希釈して546nmの吸光度を計測した。デジタルカメラで撮影した結果を図１４Aに示す。A行は0.0-0.09mMの酢酸、B行は0.1-1.0ｍMの酢酸、C行は2-8mMの酢酸の結果である。1mM以下の酢酸濃度範囲では目視でも濃度の違いが認められた。また検量線を図１４Bに示す。1mM以下の濃度範囲で酢酸の定量が可能であることがわかった。
電気化学的測定方法
　3.2U 酢酸キナーゼ,1mM ATP, 0.25mM phosphoenolpyruvate, 1.6U ピルビン酸オキシダーゼ, 10mM MgCl2 , 3.5U pyruvate kinase, 0.2mM TPP, 0.01mM FAD, 40mMフェリシアン化カリウムを含む20mMリン酸緩衝液(pH7.0)  溶液に酢酸を混合して5分おいてから400mV vs（Ag/AgCl）の電位を印加し、20秒後の電流値を計測し酢酸濃度に対してプロットした。結果を図１４Cに示す。１ｍMの酢酸（AA）を測定するために反応時間を5分で出来、ギ酸測定と同程度の時間で測定が可能である。感度も十分であった。
　以上のように、１ｍMの酢酸（AA）を5分で計測出来、ギ酸測定と同程度の時間で測定が可能であった。
〔実施例１５〕プロピオン酸の計測
　PCT、SCAOｘのプラスミド上の配列が正しいことを配列決定により確認したのち、auto induction systemで培養、HisTag精製して酵素反応に用いた。
　プロピオン酸の計測に関して計測する波長を500nm (フェノールと４AAを用いた時の波長)を546nm（４AAとTODBを用いた時の波長）とで比較した(Rajashekara et al., 2006)。
　反応は、緩衝液100 mM SPB pH 7で行った。反応液は、全量で160 mLとし、組成は以下のとおりである：
0.1 mM Acetyl Coenzyme A (Wako), 0.05 mM FAD (Wako), 0.28 U Peroxidase (Amano), 1.5 mM 4-aminoantipyrine (Wako), 1.5 mM TODB (Dojindo), 16 mg SCAOx enzyme, 8 mg PCT enzyme, および種々の濃度のプロピオン酸(Kanto)。
　比活性(U/mg)は、キノンイミン(6.4 mM-1 cm-1)の500 nmにおける吸光係数に基づいて計算した。
　546 nm で計測した場合には0.1-1mMまで感度が増大した（図１５A）。低い濃度域でも感度が増大した（図１５B）。500 nmでのKm値は210 mMであり、360 mM (Rajashekara et al., 2006)と比較可能であった。また、546 nmでのKm値は460 mMであり、1,200 mM (Aoyagi, 非公開データ, 2003)と比較可能であった。古い潤滑油中のプロピオン酸の濃度範囲(5 ppm＝67 mM)は、この系で計測可能であることが理解される。
〔実施例１６〕バイオディーゼルからのギ酸の計測
　98％蟻酸溶液を100％BDFを用いて段階的に希釈し0.01%の蟻酸を含む100％BDF（SA希釈系）を調製し、試料とした。同様にして、98％蟻酸溶液をミリＱ水を用いて段階的に希釈した希釈系も作成し、これをスタンダード（STD）試料とした。
　ギ酸の活性測定の手順は以下の通りであった。
　ＳＡ希釈系1.5mLとミリＱ 1.5mLを混合（1：1  by vol.）し、1時間静置した。その後、ＢＤＦ部分（上部）をピペッターで取り除き、残りの水層部(下部)下方より1mLを測定用抽出試料として採取した。これを直ちにPs-FDH-diaphorase系で、分光学的方法で活性を測定した。 結果を図１６に示す。
　標準サンプルでは100ppmまでのギ酸濃度で酵素反応速度の濃度依存性がみられた。特に0から25ppmまでの直線性がみられた。抽出サンプルでも100ppmまでのギ酸濃度で酵素反応速度の濃度依存性がみられ、0から25ppmまでの直線性がみられたとともに0ppmでも活性が見られた（図１６A）。
　これはもともとのＢＤＦに含まれていたギ酸と思われ、標準試料と比較するために両系列とも0ｐｐｍでの活性値を差し引いて比較すると良好に一致した（図１６B）。このことから本発明の方法を用いて、ギ酸濃度が分光学的に計測できることが示された。
〔実施例１７〕ギ酸脱水素酵素を用いた比色式バイオセンサの作製
　比活性が優れていたBurkholderia cepacia由来ギ酸脱水素酵素を用いてバイオセンサを作製した。
　図１７に示す基本構成を有するバイオセンサを作製した。すなわち、前記バイオセンサは、透明基板２に対してスペーサー３を介して透明カバー４（材質ＰＥＴ）を積層した形態を有し、各要素２～４によってキャピラリ５が規定されている。キャピラリ５の寸法は、１．３ｍｍ×９ｍｍ×５０μｍである（図１７）。透明基板２および透明カバー４は、厚みが２５０μｍであるＰＥＴにより形成し、スペーサー３は黒色の両面テープにより構成した。
　バイオセンサは、図１８に示す第１試薬部～第３試薬部を有し、それぞれ成分及び塗布量を表２に示す。表中、ＳＷＮはＬｉｔｈｉｕｍ　Ｍａｇｎｅｓｉｕｍ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｓｉｌｉｃａｔｅを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　上記バイオセンサのキャピラリに測定試料を供給し、その時点から５秒後のエンドポイントの吸光度をプロットした。各回の吸光度の測定においては、第３試薬部に対して、キャピラリの高さ方向に沿って光を照射し、そのときにバイオセンサを透過した光を受光した。光の照射は、発光ダイオードを用いて６３０ｎｍの光を照射することにより行なった。透過光は、フォトダイオードにおいて受光した。
〔実施例１８〕ギ酸脱水素酵素を用いた電極式バイオセンサの作製
　比活性が優れていたギ酸酵素を用いて電極式バイオセンサを作製した。
（作製手順）
　電極式バイオセンサの作製方法を、図１９を参照して以下に示す。絶縁基板１として、ＰＥＴ製基板（長さ２８ｍｍ、幅７ｍｍ、厚み２５０μｍ）を準備し、その一方の表面に、カーボンインクのスクリーン印刷により、リード部２および３をそれぞれ有する作用極４および対極５からなるカーボン電極系を形成した。つぎに、絶縁性ペーストを調製し、これを前記電極上にスクリーン印刷して絶縁層６とし、前記絶縁層を形成しない部分を検出部およびリード部とした。次に、合成スメクタイトである商品名「ルーセンタイトＳＷＮ」（コープケミカル社製）０．６ｇを精製水１００ｍＬに懸濁し、約８～２４時間攪拌した。この合成スメクタイト懸濁液１０ｍＬに、１０％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ（同仁化学研究所製）水溶液０．１ｍＬ、１．０Ｍ　　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）５．０ｍＬおよび精製水４．０ｍＬをこの順序で添加し、さらにメディエータとしてＮＡＤ+１．０ｇを混合した。この混合液１．０μＬを、検出部に分注した。そして、これを、３０℃、相対湿度１０％の条件下で１０分間乾燥させて、試薬層７を形成した。さらに、前記試薬層７上に酵素試薬層８を形成した。これは、本願発明の種々の酵素水溶液１．０μＬを、検出部の試薬層の上に分注して、３０℃、相対湿度１０％の条件下で１０分間乾燥させて形成した。最後に、スリット１５を有するスペーサー１１を絶縁層上に配置し、さらに、前記スペーサー上に空気孔１４となる貫通孔を有するカバー１２を配置してバイオセンサを作製した。
　本発明の方法は、潤滑油等の油の酸化劣化によって産生される各種有機酸の計測に好適に使用できる。

Claims (19)

  1. （ｉ）ギ酸を基質とする酵素、酢酸を基質とする酵素、およびプロピオン酸を基質とする酵素の少なくとも１種と、油を含む試料または油から抽出された有機酸を含む試料とを反応させる工程、並びに（ｉｉ）酵素反応生成物の量を測定して、ギ酸、酢酸、およびプロピオン酸の少なくとも１種の濃度を測定する工程を含む、油の劣化を判定する方法。
  2. 前記工程（ｉｉ）は、酵素反応生成物を発色反応に供し、発色反応を分光学的に測定して、ギ酸、酢酸、およびプロピオン酸の少なくとも１種の濃度を測定する工程である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記工程（ｉｉ）において、酵素反応生成物の量を、ジアフォラーゼを用いて間接的に測定することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
  4. 前記ギ酸を基質とする酵素がギ酸脱水素酵素であり、ギ酸脱水素酵素とジアフォラーゼのユニット数の比が、１：４０～１：８０であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
  5. 前記酵素反応の反応物の量を分光学的に測定する工程において、ＷＳＴ－１をメディエータとして使用し、その濃度が１ｍＭ～１０ｍＭである、請求項２～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 前記工程（ｉｉ）は、酵素反応生成物の量を電気化学的に測定して、ギ酸、酢酸、およびプロピオン酸の少なくとも１種の濃度を測定する工程である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記酵素反応の反応物の量を電気化学的に測定する工程において、ＤＣＩＰ、ＷＳＴ－１、フェリシアン化カリウム、テトラチアフルバレン、フェリシアニド、キノン誘導体、フェロセニルボロン酸誘導体、ｐ－アミノフェニルリン酸エステル、ルテニウム錯体、またはプルシアンブルー／ホワイトがメディエータとして使用される、請求項６に記載の方法。
  8. 前記ギ酸を基質とする酵素として、ギ酸脱水素酵素を用いることを特徴とする、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記ギ酸脱水素酵素が、BC-FDH、Ps-FDH、Mv-FDHまたはPD-FDHである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記酢酸を基質とする酵素として、酢酸キナーゼを用いることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記酢酸キナーゼが、E. coliまたはBacillus stearothermophilus由来である、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記工程（ｉｉ）において、酵素反応生成物の量を、ピルビン酸キナーゼおよびピルビン酸オキシダーゼを用いて間接的に測定して、酢酸の濃度を測定することを特徴とする、請求項１０または１１に記載の方法。
  13. 前記プロピオン酸を基質とする酵素として、プロピオニルCoAトランスフェラーゼを用いることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記工程（ｉｉ）において、酵素反応生成物の量を、短鎖アシルCoAオキシダーゼを用いて間接的に測定して、プロピオン酸の濃度を測定することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記プロピオニルCoAトランスフェラーゼと短鎖アシルCoAオキシダーゼのユニット数の比が、１：１～１：３であることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記試料は潤滑油またはバイオディーゼルを含む、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法に用いられる、ギ酸脱水素酵素、ジアフォラーゼ、ＷＳＴ－１、酢酸キナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、プロピオニルCoAトランスフェラーゼ、および短鎖アシルCoAオキシダーゼからなる群より選択される１つ以上を含む、油劣化を測定するためのキット。
  18. 電極系と反応層を有する基板上に試薬層を含み、電極系は測定極と対極とを備え、試薬層はギ酸を基質とする酵素、酢酸を基質とする酵素、およびプロピオン酸を基質とする酵素の少なくとも１種を含み、油を含む試料または油から抽出された有機酸を含む試料中の基質と当該酵素との酵素反応生成物の量を測定して、ギ酸、酢酸、およびプロピオン酸の少なくとも１種の濃度を測定して、油劣化を測定するためのバイオセンサ。
  19. （ｉ）ギ酸脱水素酵素とギ酸を含む試料とを反応させる工程、並びに（ｉｉ）ジアフォラーゼを用いて酵素反応生成物の量を間接的に測定して、ギ酸の濃度を測定する工程を含み、前記ギ酸脱水素酵素とジアフォラーゼのユニット数の比が、１：４０～１：８０である、ギ酸の測定方法。
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