WO2000004378A1 - Methode de dosage de l-phenylalanine et detecteur de l-phenylalanine - Google Patents

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phenylalanine
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reagent
sensor
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Kenji Nakamura
Toru Yokoyama
Naoki Shinozuka
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Sapporo Immuno Diagnostic Laboratory
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/32—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving dehydrogenase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a biosensor capable of rapidly and easily quantifying the concentration of L-phenylalanine contained in various samples without requiring a complicated pretreatment.
  • the electrochemical measurement method using L-phenylalanine dehydrogenase, etc. is used to determine L-phenylalanine contained in biological samples such as blood, urine, saliva, sweat, and food samples.
  • It relates to a biosensor useful for quantification.
  • PKU phenylketonuria
  • L-phenylalanine is one of the essential amino acids and is an important amino acid found in various biological samples or in foodstuffs and beverages as a source of intake.
  • a disease known as PKU is one of the typical hereditary amino acid metabolism disorders, in which tyrosine is not produced due to the lack of L-phenylalanine hydroxylase, and L-phenylalanine is found in the blood. If left untreated, serious intellectual impairment, language impairment, and melanin deficiency symptoms may occur.
  • L-phenylalanine is essential for the human body. Because it is one of the amino acids, its intake must be strictly maintained within the range of the maximum amount that does not cause brain damage and the minimum amount necessary for physical development. Thus, monitoring of daily intake of food intake as well as blood phenylalanine is essential for the treatment of PKU.
  • the content is a 1.2 mm X l. 5 mm X 30 mm tube made of a carbon paste mixed with two enzymes, salicylic acid hydroxylase and tyrosinase, in addition to L-phenylalanine dehydrogenase. And a copper wire is connected as a lead wire, and the electrode surface is polished to form a working electrode.
  • a three-electrode system consisting of a reference electrode made of silver / silver chloride and a counter electrode made of platinum is used as a detection device and connected to a reaction vessel to form a measurement device.
  • a buffer solution, salicylic acid solution, and oxidized nicotinamide adenine dinucleotide (NAD +) are mixed in a reaction vessel, a sample is added, and the concentration is calculated using a computer from the response current value after the reaction. Is going.
  • the biosensor technology described above is making it possible to measure L-phenylalanine using L-phenylalanine dehydrogenase, but requires the preparation of materials, reagents, equipment, and complicated operations and operations. As a result, rapid and simple quantification has not yet been achieved. It is desirable for PKU patients to monitor blood levels-simple measurements at home for testing food and beverage preparations, but in reality this is difficult.
  • Another object of the present invention is to provide a biosensor capable of quantifying L-phenylalanine and a method for measuring the same.
  • the present invention provides an insulating support having an electrode system comprising at least a working electrode and a counter electrode, and using at least L-phenylalanine dehydrogenase as a reaction reagent and NAD + or oxidizing as a coenzyme. Nicotinamide adenine nucleotide phosphate (NADP +), and electronic media It is possible to perform electrochemical quantification simply by adding a sample without the need for complicated pretreatment to the L-phenylalanine sensor that integrates the contained reagent reaction layer with the electrode system and the sensor.
  • the present invention provides a method for measuring L-phenylalanine.
  • the L-phenylalanine sensor of the present invention includes at least L-phenylalanine dehydrogenase, NAD + or NADP +, and an electronic media between electrodes of an electrode system configured with at least a working electrode and a counter electrode facing each other.
  • the absorbent carrier containing the dye is arranged as a reagent reaction layer, and the structure is integrated with the electrode system, so that both the enzyme reaction and the electrode reaction between the electron media and the electrode surface can be performed. And miniaturization can be realized.
  • the use of an absorptive carrier makes it possible to smoothly add a sample and to add a fixed amount of the sample.
  • the biosensor of the present invention configured as described above measures L-phenylalanine contained in a sample. High-precision quantification can be easily performed without requiring expensive special equipment and without adding reagents such as enzymes to the sample. Description of the invention
  • L-phenylalanine in the sample is added to the L-phenylalanine dehydrogenase and the NAD + by adding the sample to the L-phenylalanine sensor in which the electrode system and the reagent reaction layer are integrated.
  • it is introduced into an enzyme reaction by NADP +.
  • NADP + an enzyme reaction by NADP +.
  • phenylbirubic acid is produced, and NAD (P) + is reduced to NAD (P) H, and accordingly, electron transfer from NAD (P) H reduces the electron mediator.
  • an oxidizing current is obtained by oxidizing the reduced electron mediator by applying a potential by applying a potential, and the electrochemical current that enables the quantification of L-phenylalanine using the response current value corresponding to the substrate concentration as an index Provide a simple measurement method.
  • the present invention provides an L-phenylalanine sensor in which an electrode system comprising at least a working electrode and a counter electrode formed on an insulating support and a reagent reaction layer containing a reaction reagent are integrated with the electrode system.
  • the reagent reaction layer is composed of an absorbent carrier containing at least L-phenylalanine dehydrogenase, NAD + or NADP +, and an electron medium, and the electrode reaction occurring between the electrodes of the electrode system. It is a structure that is arranged in a part and integrated.
  • the storage stability and response of the reagents can be improved by a simple manufacturing procedure without affecting the electrode system, such as processing and deterioration of functionality. It is possible to provide a method for holding a reaction reagent having excellent stability. In addition, a fixed amount of the sample can be quickly introduced into the reagent reaction layer, so that the quantification of L-phenylalanine can be performed with high accuracy, in a short time, and easily.
  • FIG. 1 is an exploded view of components of an L-phenylalanine sensor according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a graph showing the result of the response to the electronic mediator in Example 2;
  • FIG. 3 is a graph showing the results of the response to L-phenylalanine (standard solution) in Example 3;
  • FIG. 4 is a schematic diagram of the reaction in the measurement of L-phenylalanine of the present invention
  • FIG. 5 is a graph showing the result of the response to L-phenylalanine (blood) in Example 4;
  • FIG. 6 is a configuration diagram of a portable L-phenylalanine sensor according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the results of the correlation between the portable L-phenylalanine sensor and the L-phenylalanine concentration by high performance liquid chromatography (HPLC) in Example 6;
  • FIG. 8 is a graph showing the results of the correlation between the L-phenylalanine concentration in the portable L-phenylalanine sensor and the clinical chemistry amino acid determination kit by the enzymatic method in Example 7. The symbols in the above figures are explained as follows:
  • the electrode system used in the present invention is not particularly limited as long as it is a conductive substance, and the materials are iridium, osmium, carbon, gold, silver, silver / silver chloride, iron, copper, nickel, platinum, and platinum. Black, palladium, ruthenium, rhodium, etc. and their alloys can be used. As a result of examining various materials among them, they found that carbon materials were inexpensive and chemically stable, and were preferable as working electrodes of the electrode system of the L-phenylalanine sensor of the present invention.
  • the carbon material means all materials including carbon.
  • the carbon material that can be used is not particularly limited, and may be any material used in a conventional so-called carbon fiber electrode.
  • carbon fiber, carbon black, carbon paste, glass powder, Daraite can be used.
  • Such a carbon material is formed as an electrode portion on an insulating support by a conventional method.
  • it can be formed by screen-printing a base material of a carbon material with a resin binder or the like and heating and drying it.
  • a lead wire for connecting the electrode part to the measuring device for example, a silver lead part by screen printing so as to be in contact with the carbon electrode part.
  • the insulating support examples include glass, glass epoxy, ceramics, and plastics. There is no particular limitation as long as it is a substance that is not affected during the printing of the electrode portion or the addition of the sample.
  • plastic films such as polyester, polyethylene, polyethylene terephthalate, polystyrene, and polypropylene are inexpensive. Here, it has been found that a polyester film is preferable from the viewpoint of good workability.
  • the printing method is not particularly limited to screen printing, and gravure printing, offset printing, inkjet printing, and the like can be applied.
  • the L-phenylalanine dehydrogenase used in the present invention is not particularly limited as long as it is an enzyme having NAD + or NADP + as a coenzyme, and various enzymes derived from the enzyme and their recombinant enzymes are used. it can. Examples include enzymes produced by bacteria belonging to the genus Actinomyces, microorganisms belonging to the genus Sporosarcina, bacteria belonging to the genus Bacillus, bacteria belonging to the genus Brevibacterium, and bacteria belonging to the genus Rhodococcus.
  • L-phenylalanine dehydrogenase derived from Thermoactinomyces intermedins is heat-resistant, so it has little effect on the drying process when forming a reagent reaction layer, and has excellent substrate specificity and high reactivity. It has been found that the enzyme is preferable as an enzyme constituting the L-phenylalanine sensor in the present invention.
  • the electron mediator is not particularly limited as long as it is a substance electrochemically reduced by NADH or NADPH generated as a result of an enzyme reaction and oxidized at an electrode.
  • quinones, cytochromes, porogens, phenazines, phenoxazines, phenothiazines, ferricyanides, ferredoxins, pheoctene and derivatives thereof can be used.
  • phenazines show stable response in this case.
  • 1-methoxy-15-methylphenazinium methylsulfate (1-methoxy PMS) shows the storage stability in the reagent reaction layer and the electrode stability. Since the stability of the response of the reaction was high, it was found that it was preferable as an electron mediator in the present invention.
  • the reagent reaction layer refers to a layer in which the reagent for reaction is held in contact with the electrode system and the reagent reacts with L-phenylalanine in the sample. Contains dilaranine dehydrogenase, NAD + or NADP +, and an electron mediator. Furthermore, as a result of the enzymatic reaction and the electrode reaction between the electron mediator and the electrode surface, electrochemical Means a layer capable of measuring response current. For the preparation of the reagent reaction layer, various methods conventionally used can be applied.
  • a reagent solution is dropped on an electrode and then dried, or a reagent is absorbed into a porous nonwoven fabric or the like and then dried and mounted on the electrode.
  • various methods were examined.As a result, the polymer was obtained by using a polymer material or the like as an absorptive carrier and drying each of the reagents alone or in combination after dropping, or immersing in a reagent solution and then drying. It has been found that it is preferable in the measurement of the present invention to form a reagent reaction layer with a structure in which the reagent reaction layer is arranged at least in an electrode reaction portion generated between the working electrode and the counter electrode in the electrode system.
  • the absorbent carrier is not particularly limited as long as it is a material capable of absorbing a solution and is hydrophilic.
  • fibers such as glass fiber, silica fiber, and cellulose fiber, and carboxymethyl cellulose, getyl aminoethyl cellulose, cellulose acetate, cellulose mixed ester, nylon non-woven fabric, nitrocellulose, polyether sulfone, polyester non-woven fabric, and polytetra Fluoroethylene (PTFE), polypropylene, etc.
  • cellulose fiber contains enzyme, NAD + or NADP +, and electron mediator, the function of each substance is stable without deteriorating, and the effect of disturbing the detection of response can be seen.
  • the present inventors have found that it is preferable as an absorptive carrier for L-phenylalanine sensor in the present invention, since high-precision quantification became possible.
  • FIG. 1 shows an embodiment of the L-phenylalanine sensor, and is an exploded view of components.
  • the conductive electrode 2 is formed by using a conductive graphite eye ink (manufactured by Nippon Acheson Co., Ltd.) for the insulating support 1 of a polyester film (manufactured by Diafoil Text Co., Ltd.), and the conductive electrode Z is formed by conductive silver Z silver chloride ink (Nippon Acheson Co., Ltd.).
  • the counter electrode 3 was screen-printed using the above method and dried by heating (60: 1 hour).
  • an insulating layer 4 was formed on a part of both electrodes using an insulating paint (manufactured by Acheson Japan Co., Ltd.), followed by heating and drying (60 ° C., 1 hour) to form an electrode system by printing.
  • Absorbent carrier 5 made of cellulose fiber was added to L-phenylalanine dehydrogenase (Phe DH: EC 1.4.2.10) (manufactured by Unitika Ltd.) NAD + (manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.) as an enzyme and 1-Methoxy PMS (manufactured by Dojindo Laboratories, Inc.) as an electronic media were dissolved in a borate buffer solution (pH 8.0, 20 mM). Then, a mixed solution of the anti-application reagent was prepared, and the solution was adsorbed and dried (40 ° C., 15 minutes) to obtain an absorbent carrier 5 containing the reaction reagent.
  • Phe DH L-phenylalanine dehydrogenase
  • NAD + manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd.
  • 1-Methoxy PMS manufactured by Dojindo Laboratories, Inc.
  • An L-phenylalanine sensor was formed by disposing an absorbent carrier 5 containing a reaction reagent as a reaction layer on an electrode reaction portion of an electrode system comprising a working electrode 2 and a counter electrode 3 opposed to each other.
  • Example 2 Measurement of electrode reaction
  • Figure 2 shows the results of confirming the oxidation-reduction response of 1-methoxy PMS, which is an electronic media, as a measurement of the electrode reaction.
  • a buffer solution pH10.5, 0.2 M glycine-KC1-1KOH
  • a buffer solution pH10.5, 0.2 M glycine-KC1-1KOH
  • 51 was added to the end face of the absorbent carrier 5 of the sensor.
  • the enzyme reaction did not occur because the substrate, L-phenylalanine, was not present in the sample, and the result was a cyclic voltammogram of 1-methoxy PMS (sweep speed: 20 mVZ seconds) (Hokuto Denko HZ-300 manufactured by Co., Ltd.).
  • FIG. 3 shows the results of measurement using the L-phenylalanine sensor prepared in Example 1 using a standard solution containing L-phenylalanine as a sample.
  • the sample was added 51, and after 60 seconds, a potential of 122 mV was applied with reference to the counter electrode (HZ-3000, manufactured by Hokuto Denko Co., Ltd.), and the response current value was measured.
  • HZ_300 manufactured by Toudou Corporation.
  • the final concentration of the reaction reagent per measurement was 1 U for L-phenylalanine dehydrogenase, 5 mM for NAD +, and 0.5 mM for 1-methoxy PMS.
  • FIG. 4 shows a schematic reaction diagram for the measurement of L-phenylalanine of the present invention.
  • Example 3 the result of measurement using the L-phenylalanine sensor prepared in Example 1 using blood containing L-phenylalanine as a sample is shown in FIG.
  • the sample was added to the absorbent carrier 5 of the sensor at 7.5 // 1 and the counter electrode was added after 120 seconds. In this case, a response current value was measured by applying a potential of ⁇ 180 mV.
  • the final concentration of the reaction reagent per measurement was 2 U for L-phenylalanine dehydrogenase, 5 mM for NAD ", and 0.5 mM for 1-methoxy PMS.
  • Fig. 6 shows the L-Fenilalanine sensor 12 and the portable meter 13 for simple measurement in consideration of the monitoring of L-fenylalanine in daily life. The measurement procedure is described below.
  • the measurement of L-phenylalanine is started by the switch 14.
  • the enzymatic reaction is allowed to proceed for a certain period of time by the evening timer 15, and then a predetermined potential is applied to the sensor by the potential applying device 16.
  • the response current value generated by the sensor is subjected to current-voltage conversion, analog-to-digital conversion, and the like by the detection device 17 by various methods, and then the response current value is calculated by the arithmetic device 18 to obtain the L-phenylalanine.
  • the density is converted and the result is output to the display device 19.
  • FIG. 7 shows the results of examining the correlation of the sample containing L-phenylalanine with the portable L-phenylalanine sensor prepared in Example 5 and HPLC.
  • the concentration of L-phenylalanine in the same sample was determined by HPLC (Hitachi, Ltd.). After removing the protein from the sample, Hayashi et al. (Journal of Chromatography, Vol. 274, p. 318 (1983)) The measurement was performed according to the procedure of), and the measurement was performed on an untreated blood sample with the portable L-phenylalanine sensor. These results indicate that the L-phenylalanine concentration is correlated in the range of 0 to 1.5 mM. A very good correlation with the coefficient 0.971 was obtained.
  • Example 7 Correlation between L-phenylalanine concentration using a portable L-phenylalanine sensor and a clinical clinical amino acid determination kit using an enzymatic method As in Example 6, the same blood sample containing L-phenylalanine was used.
  • FIG. 8 shows the results of an examination of the correlation between the portable L-phenylalanine sensor prepared in Example 5 and the amino acid quantification kit.
  • the kit for clinical chemical amino acid quantification (enzyme plate PKU-R) manufactured by Tomakomai Clinical Inspection Senyaku Co., Ltd. by the enzyme method was used to measure the fluorescence intensity (Dynatetsu) against the L-phenylalanine concentration according to the measurement procedure of this kit. Fluorolight 100,000 manufactured by Laboratories was determined.

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Description

明 細 書
L一フエ二ルァラニンの測定方法および
L—フエ二ルァラニンセンサ 発明の分野
本発明は、 種々の試料に含まれる L一フエ二ルァラニンの濃度を、 煩雑 な前処理を必要とせずに迅速かつ簡便に定量が可能なバイオセンサに関す る。 具体的には、 L一フエ二ルァラニン脱水素酵素等を用いた電気化学的 な測定方法によって、 血液、 尿、 唾液、 汗等の生体試料や食品試料等に含 まれる L一フエ二ルァラニンの定量に有用なバイオセンサに関する。 特に アミノ酸代謝異常症であるフエ二ルケトン尿症 （P K U ) において、 早期 発見のための新生児マススクリ一ニング、 あるいは当該患者の日常生活に おけるモニタリング等について有意義な方法である。 発明の背景
L一フエ二ルァラニンは、 必須アミノ酸の一つで種々の生体試料中ある いは摂取源としての食料品および飲料品中に多く含まれる重要なアミノ酸 である。 一方、 P K Uとして知られる疾患は、 代表的な遺伝性アミノ酸代 謝異常症の一つであり L一フエ二ルァラニン水酸化酵素の欠損によりチロ シンが生成されず、 L—フエ二ルァラニンが血液中に異常に貯留するもの であり、 放置すれば重大な知能障害、 言語障害、 およびメラニン色素欠乏 症状等が引き起こされる。
本疾患を防止するために新生児マススクリ一二ングが日本をはじめ諸外 国で広く行われており、 血液中の L一フエ二ルァラニン濃度を測定するそ の代表的な方法として、 ろ紙血液を用いた Guthrie 法が利用され早期発見 に大きく寄与している。
そこで発見された患者は、 L 一フエ二ルァラニン量を制限した食事療法 を必要とし、 L一フエ二ルァラニンのみを特別に除去するか減少させた調 理を行い、 少なくとも成年期まで、 好ましくは生涯にわたり、 治療を継続 しなければならない。 また、 L一フエ二ルァラニンは人体にとって必須ァ ミノ酸の一つであることから、 摂取量は、 脳障害等を引き起こさないだけ の最大量および身体発育に必要な最小量の濃度範囲で厳密に維持しなけれ ばならない。 このように P K Uの治療に際しては血液中フエ二ルァラニン はもとより、 食事における摂取量についても日常生活におけるモニタリン グを決して欠かすことができない。
このような背景における L 一フエ二ルァラニンの測定方法の特徵として、 血液を試料とした一例を挙げると、 液体クロマ トグラフィ による測定 (Journal of Chromatography, Vol.274, p.318 (1983)) や Guthrie法として広 く知られるろ紙血液によるバイオアツセィ法 （ Pediatrics, Vol.32, p.338 (1963)) 等があり、 前者は試料の特別な前処理や高額な測定機器を必要と し、 後者は簡便ではあるが反応に長時間を要することや目視で判定しなけ ればならないことなど、 いずれも定量における簡便性あるいは迅速性とい う点を考慮すると問題がある。
また、 酵素を利用した測定方法も報告されている。 たとえば、 L 一フエ 二ルァラニンアンモニアリアーゼを用いた方法 （Methods of
Enzymatic Analysis, Vol.8,p.405(1985)) 、 L —フエ二ルァラニンォキシダ一 ゼを用いた方法 （Clinica Chimica Acta, Vol.136, p.131 (1984)) や L —フエ 二ルァラニン脱水素酵素を用いた方法 （特開昭 6 3 — 1 2 9 9 9 6号） が 挙げられ、 そこでは定量方法としての有用性について示されている。 特に L—フエ二ルァラニン脱水素酵素を用いた血液中フエ二ルァラニンの測定 方法は Hummelら（Analytical Biochemistry, Vol.170, p.397 (1988))や Wendel ら （Analytical Biochemistry, Vol.180, p.91 (1989), Clinica Chimica Acta, Vol.192, p.165 (1990)) によって詳細な内容が報告されている。 しかし、 こ れらいずれの方法も試料である血液を様々な前処理を行ったのちに酵素反 応を行い、 さらに分光光度計などの高額で比較的大がかりな測定機器を用 いることで、 その定量がはじめて可能となっている。
近年、 バイオセンサ、 特に酵素を利用したセンサの開発が進み、 その中 でも血液中グルコースの測定は E P 3 5 1 8 9 1や W〇 8 6 / 0 7 6 3 2に開示されているように高精度で簡便な定量が可能となってきている しかし、 L — フエ二ルァラニンについては近年ようやく Huanp ら (Analytical Chemistry, Vol. 70, p. 991 (1998)) によって測定が試みられて いるが、 実用段階に至るには多くの課題が残されている。
その内容は、 L—フエ二ルァラニン脱水素酵素以外にさらにサリチル酸 ハイ ドロキシラーゼ、 チロシナ一ゼの 2種類の酵素を混合したカーボン ぺ一ストを 1 . 2 m m X l . 5 m m X 3 0 m mのチューブに充填し、 リ一 ド線として銅線をつなぎ電極表面を研磨して作用極としている。 これを銀 /塩化銀からなる参照極、 白金からなる対極の 3電極系を検出装置として、 反応容器と接続し測定装置を構成している。 測定手順は反応容器に緩衝溶 液、 サリチル酸溶液、 酸化型ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド （N A D + ) を混合した後、 試料を添加し反応後の応答電流値からコンピュー 夕を用いて濃度の算出を行っている。 これによつて 2 0〜 1 5 Ο Μの濃 度範囲のフエ二ルァラニンの定量が可能となり、 5 の検出感度を示し ている。 しかし、 応答の安定性や作製した酵素電極の保存安定性の問題な ど解決しなければならない課題も示されている。
上記のバイオセンサ技術によって L—フエ二ルァラニンを L一フエニル ァラニン脱水素酵素を用いて測定することが可能になりつつあるが、材料、 試薬、 機器の準備および複雑な作業、 操作を必要とすることから迅速で簡 便な定量が行える状況には至っていない。 P K Uの患者にとっては、 血中 濃度のモニタリングゃ食料品、 飲料品の調理における検査のために在宅で の簡易測定が望まれているが、 現実には困難な状況にある。
そこで本発明が解決しょうとする課題は、 多種類の試薬、 大がかりな測 定機器、 器具を用いることなく、 また、 複雑な操作、 特別な技術を必要と せずに、 高精度で迅速かつ簡便に L一フエ二ルァラニンの定量が行えるバ ィォセンサとその測定方法を提供することにある。 発明の要旨
本発明は上記の課題を解決するために、 絶縁性支持体に少なくとも作用 極と対極からなる電極系を設け、 反応用試薬として少なくとも L 一フエ二 ルァラニン脱水素酵素、 補酵素に N A D +もしくは酸化型ニコチンアミ ド アデニンヌクレオチドリン酸 （N A D P + ) 、 および電子メデイエ一夕が 含有された試薬反応層を該電極系と一体化させた L一フエ二ルァラニンセ ンサならびに、 該センサに煩雑な前処理を必要とせずに試料を添加するだ けで電気化学的な定量が可能となる L一フエ二ルァラニンの測定方法を提 供する。
本発明の L一フエ二ルァラニンセンサは、 少なくとも作用極と対極を対 向させて構成される電極系の電極間に、 少なくとも L一フエ二ルァラニン 脱水素酵素、 N A D +もしくは N A D P +、 および電子メデイエ一夕が含 有された吸収性担体を試薬反応層として配置し、 該電極系と一体化する構 造とすることで、 酵素反応および電子メディェ一夕と電極表面との電極反 応の双方の反応が行え、 さらに小型化も実現される。 また、 吸収性担体を 利用することで、 試料の添加をスムーズにし、 かつ一定量の添加も可能に 以上のような構成による本発明のバイォセンサは、 試料に含まれる L 一 フエ二ルァラニンを測定する上で高額な特殊機器を必要とせずに、 また酵 素などの試薬類を試料に添加することなく簡便に高精度な定量が可能とな る。 発明の説明
本発明によれば、 試料を電極系と試薬反応層が一体化された L一フエ二 ルァラニンセンサに添加することで、 試料中の L―フエ二ルァラニンは L 一フエ二ルァラニン脱水素酵素と N A D +もしくは N A D P +による酵素 反応に導入される。その結果、フエ二ルビルビン酸が生成され、 N A D ( P ) +は N A D ( P ) Hに還元され、 それに伴い N A D ( P ) Hからの電子移 動により電子メディエー夕が還元される。 続いて電極反応として電位印加 によって還元型の電子メディエータを酸化することで酸化電流が得られ、 基質濃度に対応した応答電流値を指標に、 L一フエ二ルァラニンの定量が 可能となる電気化学的な測定方法を提供する。
さらに本発明は、 絶縁性支持体に形成された少なくとも作用極と対極か らなる電極系と、 反応用試薬が含有された試薬反応層を該電極系と一体化 した L一フエ二ルァラニンセンサを提供する。 前記し一フエ二ルァラニン センサにおいて試薬反応層は、 少なくとも L一フエ二ルァラニン脱水素酵 素、 N A D +もしくは N A D P +、 および電子メデイエ一夕が含有された 吸収性担体から構成され、 該電極系の電極間に生じる電極反応部分に配置 され一体化される構造となる。
ここで試薬反応層に吸収性担体を利用することで、 電極系に加工等の操 作および機能性の低下等の影響を与えることなく、 簡易な製造手順で試薬 類の保存安定性および応答の安定性の優れた反応用試薬の保持方法を提供 できる。 また、 試料の添加も一定量をすみやかに試薬反応層に導入するこ とが可能となり、 L一フエ二ルァラニンの定量が高精度にかつ短時間で簡 便に実施できる。 図面の簡単な説明
図 1は本発明の一実施例における L一フエ二ルァラニンセンサの構成部 分の分解図であり ；
図 2は実施例 2における電子メディエー夕に対する応答の結果を示すグ ラフであり ；
図 3は実施例 3における L一フエ二ルァラニン （標準溶液） に対する応 答の結果を示すグラフであり ；
図 4は本発明の L一フエ二ルァラニン測定における反応模式図であり ； 図 5は実施例 4における L—フエ二ルァラニン （血液） に対する応答の 結果を示すグラフであり ；
図 6は本発明の一実施例におけるポータブル型 L一フエ二ルァラニンセ ンサの構成図であり ；
図 7は実施例 6におけるポータブル型 L—フエ二ルァラニンセンサと高 速液体クロマトグラフィ （H P L C ) による L—フエ二ルァラニン濃度の 相関関係の結果を示すグラフであり ；
図 8は実施例 7におけるポータブル型 L—フエ二ルァラニンセンサと酵 素法による臨床化学的アミノ酸定量キッ トによる L一フエ二ルァラニン濃 度の相関関係の結果を示すグラフである。 上記図中の符号は次のように説明される ：
1は絶縁性支持体； 2は作用極； 3は対極； 4は絶縁層； 5は吸収性担体； 1 1は試料 ； 1 2は L —フエ二ルァラニンセンサ； 1 3は L 一フエニルァ ラニンセンサ用ポータブル ' メータ ； 1 4はスィッチ ； 1 5は夕イマ ； 1 6は電位印加装置 ； 1 7は検出装置 ； 1 8は演算装置 ； 1 9は表示装置で ある。 好適実施態様の説明
本発明に用いられる電極系としては、 導電性物質であれば特に制限はな く、 材料についてはイリジウム、 オスミウム、 カーボン、 金、 銀、 銀/塩 化銀、 鉄、 銅、 ニッケル、 白金、 白金黒、 パラジウム、 ルテニウム、 ロジ ゥム等およびそれらの合金を使用できる。 その中でも種々の材料を検討し た結果、 カーボン材料が安価で化学的に安定しており本発明の L 一フエ二 ルァラニンセンサの電極系の作用極として好ましいことを見出した。
ここでのカーボン材料とは、 力一ボンを含む材料全般を意味する。 利用 できるカーボン材料は特に限定されるものではなく、 従来のいわゆる力一 ボン電極において使用されているものであれば良く、 例えば力一ポンファ ィバ、 カーボンブラック、 カーボンペースト、 グラッシ一力一ポン、 ダラ フアイ ト等を使用できる。
このようなカーボン材料は常套の方法によって絶縁性の支持体上に電極 部分として形成される。通常、カーボン材料を樹脂バインダ一等によりベー スト状にしたものをスクリーン印刷し、 それを加熱乾燥することにより形 成できる。 更に電極部分を測定装置に接続するためのリード線を、 例えば スクリーン印刷により銀のリ一ド部分を、 カーボン電極部分と接触するよ うに配置することも可能である。
絶縁性支持体としては、 ガラス、 ガラスエポキシ、 セラミックス、 ブラ スチック等が挙げられるが、 電極部分の印刷形成の際や、 試料の添加の際 に侵されない物質であれば特に制限はない。 例えばポリエステル、 ポリエ チレン、 ポリエチレンテレフタレ一卜、 ポリスチレン、 ポリプロピレン等 のプラスチックフィルムが安価であり、 さらに導電性インクとの密着性や 加工性の良さから、 ここではポリエステルフィルムが好ましいことを見出 した。
印刷方法としては、 スクリーン印刷に限定されることは特になく、 その 他、 グラビア印刷、 オフセッ ト印刷、 インクジェッ ト印刷等が応用できる。 本発明に用いられる L一フエ二ルァラニン脱水素酵素としては、 N A D +もしくは N A D P +を補酵素とする酵素であれば特に制限はなく、 種々 の由来の該酵素およびそれらの遺伝子組換え酵素を使用できる。 例えばァ クチノミセス （Actinomyces) 属細菌、 スポロサルシナ （ Sporosarcina) 属 微生物、バチルス （Bacillus)属細菌 、 ブレビパクテリゥム（Brevibacterium) 属細菌、 ロ ドコッカス （Rhodococcus) 属細菌などにより生産された酵素 が挙げられる。 その中でも Thermoactinomyces intermedins由来の L一フエ 二ルァラニン脱水素酵素は耐熱性を有することから試薬反応層を形成する 際に乾燥過程での影響も少なく、 また基質特異性に優れ反応性に富むこと から、 本発明における L _フエ二ルァラニンセンサを構成する酵素として 好ましいことを見出した。
本発明において電子メディエー夕とは、 酵素反応の結果生成された N A D Hもしくは N A D P Hにより電気化学的に還元され、 電極において酸化 される物質であれば特に制限はない。 例えば、 キノン類、 シトクロム類、 ピオロゲン類、 フエナジン類、 フエノキサジン類、 フエノチアジン類、 フエ リシアン化物、 フェレドキシン類、 フエ口センおよびその誘導体等を使用 できる。 その中でもフエナジン類がここでは応答の安定性が見られ、 特に 1ーメトキシ一 5 —メチルフエナジニゥムメチルサルフエ一卜 （ 1ーメ ト キシ P M S ) が試薬反応層での保存安定性、 電極反応の応答の安定性が 高かったことから本発明における電子メディェ一夕として好ましいことを 見出した。
本発明において試薬反応層とは、電極系に接触して反応用試薬を保持し、 かつその試薬が試料中の L 一フエ二ルァラニンと反応する層を意味してお り、 少なく とも L 一フエ二ルァラニン脱水素酵素、 N A D +もしくは N A D P +、 および電子メディエータを含有するものである。 さらに酵素反応 および電子メディエー夕と電極表面との電極反応の結果として、 電気化学 的に応答電流を測定できる層を意味する。 この試薬反応層の作製にあたつ ては、 従来用いられる種々の方法が応用できる。
例えば、 試薬溶液を電極上に滴下後乾燥させたり、 多孔体であるナイ口 ン不織布等に吸収後乾燥させ電極上に装着する方法がある。 その中でも 種々の方法を検討した結果、 吸収性担体として高分子材料等を使用し、 各 試薬を単独あるいは混合して滴下後乾燥させるか、 あるいは試薬溶液中に 浸漬後乾燥させることによって得られたものを、 前記電極系の少なく とも 作用極と対極の電極間に生じる電極反応部分に配置する構造で試薬反応層 を形成することが、 本発明における測定で好ましいことを見出した。
すなわちこの吸収性担体による試薬反応層を用いることで、 試料の添加 が吸収性担体の持つ吸収性の性質から、 特別な器具を用いることなく一定 量の試料をすみやかに添加することが可能となる。 また、 L 一フエニルァ ラニンセンサ製造の際も電極反応部分に直接、 加工等の操作を加えること なく簡易な作製が可能である。
前記の吸収性担体としては、 溶液を吸収できる材質であり親水性であれ ば特に制限はない。 例えば、 ガラス繊維、 シリカ繊維、 セルロース繊維等 の繊維類、 およびカルボキシメチルセルロース、 ジェチルアミノエチルセ ルロース、 セルロースアセテート、 セルロース混合エステル、 ナイロン不 織布、 ニトロセルロース、 ポリエーテルスルホン、 ポリエステル不織布、 ポリテトラフルォロエチレン （P T F E ) 、 ポリプロピレン等が使用でき る。 その中でもセルロース繊維が、 酵素、 N A D +もしくは N A D P +、 および電子メディエー夕を含有させた際に、 各物質の機能性が低下するこ となく安定であり、 応答検出時に妨害される影響も見られなく、 高精度な 定量が可能になったことから、 本発明における L 一フエ二ルァラニンセン ザの吸収性担体として好ましいことを見出した。 実施例
以下に、 本発明を実施例について具体的に説明するが、 本発明はこれら に限定されるものではない。
実施例 1 電極および吸収性担体の作製 図 1は、 L—フエ二ルァラニンセンサの一実施例について示したもので、 構成部分の分解図である。
ポリエステルフィルム （ダイァホイルへキス ト （株） 製） の絶縁性支持 体 1に導電性グラフアイ トインク （日本アチソン （株） 製） を用いて作用 極 2を、 導電性銀 Z塩化銀インク （日本アチソン （株） 製） を用いて対極 3をスクリーン印刷し、 加熱乾燥 （ 6 0 ：、 1時間） した。 次に、 両極の 一部分に絶縁性塗料 （日本アチソン （株） 製） を用いて絶縁層 4を形成し 加熱乾燥 （ 6 0°C、 1時間） することにより電極系を印刷形成した。
セルロース繊維 （アドバンテック東洋 （株） 製） からなる吸収性担体 5 に、 L—フエ二ルァラニン脱水素酵素 （P h e DH : E C 1. 4. 1. 2 0 ) (ュニチカ （株） 製） 、 補酵素として NAD+ (オリエンタル酵母 (株） 製） 、 電子メデイエ一夕として 1 ーメ トキシ PMS ( (株） 同仁 化学研究所製） をホウ酸緩衝溶液 （pH 8. 0 , 2 0 mM) に溶解して反 応用試薬混合溶液を調製し、 それを吸着させて乾燥後 （4 0 °C、 1 5分間） 、 反応用試薬が含有された吸収性担体 5を得た。
対向させた作用極 2と対極 3からなる電極系の電極反応部分に、 反応層 として反応用試薬が含有された吸収性担体 5を配置して L一フエ二ルァラ ニンセンサとした。 実施例 2 電極反応の測定
電極反応の測定として、 電子メデイエ一夕である 1 ーメ トキシ PMS の酸化還元応答を確認した結果を図 2に示す。
ここでは実施例 1で作製した L一フエ二ルァラニンセンサを用いて、 試 料として L一フエ二ルァラニンを含まない緩衝溶液 （ p H 1 0. 5， 0. 2 M グリシン一 KC 1 一 KOH) を該センサの吸収性担体 5の端面に 5 1添加した。 すなわち試料中には基質である L一フエ二ルァラニンが存 在しないため酵素反応は生じることなく、 本結果は 1 ーメ トキシ PMS のサイクリ ックボルタモグラム （掃引速度： 2 0 mVZ秒） （北斗電工（株） 製 H Z— 3 0 0 0 ) を示す。
なお、 一測定あたりにおける反応用試薬の終濃度をここでは、 P h e D Hは 1 U、 NAD +は 5 mM、 1 ーメ トキシ PMSは 0. 5 mMとした。 ピーク電位は、 酸化側では約一 2 2 0 mV、 還元側では約一 3 0 0 mV に現れ、 吸収性担体および含有された反応用試薬の妨害等の影響が見られ ない、 良好な酸化還元応答が得られた。 実施例 3 L—フエ二ルァラニンの定量 （標準溶液）
L一フエ二ルァラニンを含む標準溶液を試料として実施例 1で作製した L一フエ二ルァラニンセンサを用いて測定した結果を図 3に示す。
試料を 5 1添加し、 6 0秒後に対極を基準に一 2 2 0 mVの電位を印 加 （北斗電工 （株） 製 H Z— 3 0 0 0 ) して、 応答電流値を測定した （北 斗電工 （株） 製 H Z _ 3 0 0 0) 。
なお、 一測定あたりにおける反応用試薬の終濃度をここでは、 L一フエ 二ルァラニン脱水素酵素は 1 U、 NAD +は 5 mM、 1 ーメ トキシ P M Sは 0. 5 mMとした。
試料が試薬反応層である吸収性担体 5に添加されると、 試料中の L一 フエ二ルァラニンは L一フエ二ルァラニン脱水素酵素と NAD+の酵素反 応によってフエニルピルビン酸が生成され、 NAD+は NADHに還元さ れてそれに伴い電子移動により 1ーメトキシ PMSが還元される。 続い て電極反応として、 前記の電位印加により還元型の 1—メ トキシ PM S の酸化電流が得られ、 この電流値が基質である L一フエ二ルァラニン濃度 に依存する。 以上、 本発明の L一フエ二ルァラニンの測定における反応模 式図を図 4に示す。
本結果から、 L—フエ二ルァラニン濃度が 0〜 2 mMの範囲で直線的な きわめて良好な応答が得られた。 実施例 4 L一フエ二ルァラニンの定量 （血液）
実施例 3を参考に、 L一フエ二ルァラニンを含む血液を試料として実施 例 1で作製した L一フエ二ルァラニンセンサを用いて測定した結果を図 5 に示す。
試料を該センサの吸収性担体 5に 7. 5 // 1添加し、 1 2 0秒後に対極 を基準にここでは— 1 8 0 mVの電位を印加して、応答電流値を測定した。 なお、 一測定あたりにおける反応用試薬の終濃度をここでは、 L一フエ 二ルァラニン脱水素酵素は 2 U、 NAD" ¾ 5 mM、 1ーメ トキシ PM Sは 0. 5 mMとした。
本結果から、 L一フエ二ルァラニン濃度が 0〜 2 mMの範囲で直線的な きわめて良好な応答が得られた。 実施例 5 ポータブル型 L一フエ二ルァラニンセンサの作製
L—フエ二ルァラニンの日常生活におけるモニタリングを考慮した L一 フエ二ルァラニンセンサ 1 2および簡易測定用のポータブル · メータ 1 3 を図 6に示し、 測定手順を以下に説明する。
L—フエ二ルァラニンセンサ 1 2を、 L一フエ二ルァラニンセンサ用 ポータブル · メ一夕 1 3に装着し試料 1 1を添加したのち、 スィッチ 1 4 により L一フエ二ルァラニンの測定を開始する。 夕イマ 1 5により酵素反 応をある一定時間進行させて、 その後電位印加装置 1 6によって該センサ に所定の電位を印加する。 その際に該センサで生じた応答電流値を電流一 電圧変換およびアナログ一デジタル変換等を種々の方法により検出装置 1 7で行い、 続いて演算装置 1 8により応答電流値を L一フエ二ルァラニン 濃度に換算処理してその結果を表示装置 1 9に出力する。 実施例 6 ポータブル型 L—フエ二ルァラニンセンサと HP L Cによる L 一フエ二ルァラニン濃度の相関関係
L一フエ二ルァラニンを含む試料に対して、 前記実施例 5で作製した ポータブル型 L—フエ二ルァラニンセンサと HP L Cを用いて相関性を検 討した結果を図 7に示す。
同一試料での L—フエ二ルァラニン濃度を、 H P L C ( (株） 日立製作 所製） では試料の蛋 白質除去処理 を施 し前記林 ら （ Journal of Chromatography, Vol.274, p.318 (1983)) の手順に従い測定を行い、 ポ一夕 ブル型 L一フエ二ルァラニンセンサでは未処理の血液試料で測定を行った。 本結果から、 L一フエ二ルァラニン濃度が 0〜 1. 5 mMの範囲で相関 係数 0 . 9 7 1 ときわめて良好な相関関係が得られた。 実施例 7 ポータブル型 L —フエ二ルァラニンセンサと酵素法による臨床 化学的アミノ酸定量キッ トによる L 一フエ二ルァラニン濃度の相関関係 前記実施例 6と同様に L 一フエ二ルァラニンを含む同一の血液試料に対 して、 前記実施例 5で作製したポータブル型 L 一フエ二ルァラニンセンサ とアミノ酸定量キッ トを用いて相関性を検討した結果を図 8に示す。
測定にあたり、 酵素法による臨床化学的アミノ酸定量キッ ト （ （株） 苫 小牧臨床検査セン夕一製 ェンザプレート P K U— R ) は本キッ トの測 定手順に従い L 一フエ二ルァラニン濃度に対する蛍光強度 （ダイナテツ ク · ラボラトリーズ製 フルォロライ ト 1 0 0 0 ) を求めた。
本結果から、 L _フエ二ルァラニン濃度が 0〜 1 . 5 m Mの範囲で相関 係数 0 . 9 5 9ときわめて良好な相関関係が得られた。 なお、 前記実施例では作用極と対極のみの 2電極系であつたが、 参照極 を加えた 3電極系を用いれば、 より正確な測定が可能となる。 このように本発明により、 酵素等の反応用試薬類と電極系を一体化した L 一フエ二ルァラニンセンサを印刷手法を用いて簡易に作製でき、 特別な 測定機器、 器具、 技術、 および煩雑な前処理を必要とせずに微量の試料を 添加するだけで、 試料中の L 一フエ二ルァラニンを高精度にかつ短時間で 簡便に電気化学的に定量することが可能となった。
また、 L 一フエ二ルァラニンセンサおよび該センサ用ポータブル · メ一 夕を使用することにより、 種々の測定条件が緩和され、 時間および場所が 制限されることなく簡便な定量が可能となった。

Claims

請求の範囲
1 .絶縁性支持体に形成された少なくとも作用極と対極からなる電極系と、 反応用試薬として少なく とも L一フエ二ルァラニン脱水素酵素、 補酵素に N A D +もしくは N A D P +、 および電子メディェ一夕が含有された試薬 反応層を該電極系と一体化した L一フエ二ルァラニンセンサに、 試料を添 加したのち電気化学的に定量することを特徴とする L一フエ二ルァラニン の測定方法。
2 . 前記電極系は、 導電性材料を用いて印刷手法によって形成されること を特徴とし、 該作用極には主にカーボンからなる材料を用いることを特徴 とする請求項 1記載の L一フヱニルァラニンの測定方法。
3 . 前記電子メディエー夕がフエナジン類からなることを特徴とする請求 項 1または 2記載の L一フエ二ルァラニンの測定方法。
4 . 絶縁性支持体に形成された少なくとも作用極と対極からなる前記電極 系と、 反応用試薬として少なくとも L一フエ二ルァラニン脱水素酵素、 補 酵素に N A D +もしくは N A D P +、 および電子メディエー夕が含有され た試薬反応層を該電極系と一体化した構造を特徴とする L一フエ二ルァラ
5 . 前記電極系は、 導電性材料を用いて印刷手法によって形成されること を特徴とし、 該作用極には主に力一ボンからなる材料を用いることを特徴 とする請求項 4記載の L _フエ二ルァラニンセンサ。
6 . 前記電子メディェ一夕がフエナジン類からなることを特徴とする請求 項 4または 5記載の L一フエ二ルァラニンセンサ。
7 . 前記試薬反応層が吸収性担体からなり、 絶縁性支持体に形成された少 なくとも作用極と対極を対向させて構成される電極系において、 該電極間 に生じる電極反応部分に該吸収性担体が配置される構造を特徴とする請求 項 4ないし 6のいずれかに記載の L—フエ二ルァラニンセンサ。
8 . 少なくとも作用極と対極からなる前記電極系において、 該電極間に配 置される反応用試薬が含有された吸収性担体は、 試料と反応用試薬との酵 素反応および電子メディエー夕と電極表面との電極反応の双方の反応層と なることを特徴とする請求項 7記載の L一フエ二ルァラニンセンサ。
9 . 反応用試薬が含有され酵素反応および電極反応の反応層となる前記吸 収性担体は、 親水性であることを特徴とする請求項 7または 8記載の L一 フエ二ルァラニンセンサ。
1 0 . 反応用試薬が含有され酵素反応および電極反応の反応層となる前記 吸収性担体は、 少なく とも作用極と対極を対向させて構成される前記電極 系によって外界からの接触に対する部分的な保護がされており、 該電極系 が前記吸収性担体の少なくとも保護層となる構造を特徴とする請求項 7な いし 9のいずれかに記載の L一フエ二ルァラニンセンサ。
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