DE3851316T2 - Verfahren zur Messung der Menge der Polyamine in einer biologischen Probe. - Google Patents
Verfahren zur Messung der Menge der Polyamine in einer biologischen Probe.Info
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Description
- Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Messung der Menge der Polyamine in einer biologischen Probe, insbesondere ein Verfahren zur Messung der Menge der Polyamine in einer Urinprobe, wobei die Polyamine genau gemessen werden können, ohne durch die in der biologischen Probe möglicherweise vorliegenden störenden Substanzen beeinflußt zu werden.
- Man weiß, daß das Vorliegen von Polyaminen (einschließlich Diaminen) in Körperflüssigkeiten, wie z. B. Urin, mit dem Auftreten und dem Verlauf einer Krebserkrankung im Zusammenhang steht. Elf Polyamine wurden identifiziert, einschließlich Cadaverin, Putrescin, Spermidin und Spermin. Außerdem wurden acylierte Formen der Polyamine, d. h. Acylpolyamine, gefunden. Die Messung der Gesamtpolyamine (nachstehend soll das Wort "Polyamine" auch Acylpolyamine umfassen) in Körperflüssigkeiten und der einzelnen Polyamine hat eine große klinische Bedeutung, da Hinweise dafür vorliegen, daß die Werte eine nützliche Information für die Diagnose von Krebs liefern. Aus diesem Grund benötigt man ein Verfahren, mit dem die Mengen der Polyamine sehr genau gemessen werden können.
- In den herkömmlichen Verfahren zur Messung der Menge der Polyamine werden die Polyamine in biologischen Proben durch Einsatz von Flüssigchromatographie oder Elektrophorese isoliert, sodann wird die Messung der Polyamine mittels eines Fluoreszenzverfahrens oder eines kolorimetrischen Verfahrens mit Ninhydrin durchgeführt. Bei diesen Verfahren müssen die biologischen Proben jedoch in umständlichen Schritten vorbehandelt werden, weshalb die Messung sehr zeitaufwendig ist.
- Aus diesem Grund können diese Verfahren nicht eingesetzt werden, wenn eine große Zahl von biologischen Proben auf einmal gemessen werden muß. Außerdem erfordern diese Verfahren spezielle Techniken, Ausstattungen und Anlagen. Deshalb können diese Verfahren z. B. nicht als Routineverfahren in klinischen Labors verwendet werden.
- JP-A-5 636 918 beschreibt ein relativ einfaches Verfahren zur Messung der Menge der Polyamine. In dem Verfahren werden Polyamine mit Aminoxidase umgesetzt, wodurch Wasserstoffperoxid erzeugt wird, sodann wird das Wasserstoffperoxid mit 4- Aminoantipyrin, Phenol und Peroxidase umgesetzt, wobei ein Pigment erhalten wird. Das Pigment wird mittels kolorimetrischer Analyse gemessen. In diesem Verfahren ist es nicht nötig, die Polyamine aus den biologischen Proben durch Einsatz von Flüssigchromatographie oder Elektrophorese in reiner Form zu isolieren. Bei diesem Verfahren treten jedoch aufgrund von reduzierenden Substanzen, die in der biologischen Probe vorliegen, Fehler auf, deshalb ist es nötig, zuerst die reduzierenden Substanzen aus den biologischen Proben zu entfernen. Solche reduzierenden Substanzen können z. B. aus der biologischen Probe entfernt werden, indem man die biologische Probe durch eine mit einem Kationenaustauscherharz gefüllte Säule laufen läßt. Wegen dieses Vorbehandlungsschrittes können die Polyamine in der biologischen Probe nicht in einem Einzelschritt unter Einsatz eines automatisierten Analysators gemessen werden.
- Das erfindungsgemäße Verfahren zur Messung der Menge der Polyamine in einer biologischen Probe beseitigt die vorstehend besprochenen Nachteile und Mängel und außerdem zahlreiche andere Nachteile und Mängel der bisherigen Verfahren, es umfaßt die Verwendung von Diaminoxidase und/oder Polyaminoxidase, Aminoalkylaldehyddehydrogenase und NAD&spplus; oder NADP&spplus; und ist dadurch gekennzeichnet, daß es in Gegenwart einer sauren aromatischen Verbindung durchgeführt wird, die die Störungen des Meßsystems durch die in der biologischen Probe vorliegenden reduzierenden Substanzen verhindert.
- In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren schrittweise die Zugabe eines ersten Reagens zu der biologischen Probe, wobei das erste Reagens eine saure aromatische Verbindung und Diaminoxidase und/oder Polyaminoxidase enthält, so daß die Polyamine in Aminoalkylaldehyde umgewandelt werden; die Zugabe eines zweiten Reagens zum Reaktionsgemisch, wobei das zweite Reagens Aminoalkylaldehyddehydrogenase und NAD&spplus; oder NADP&spplus; enthält, so daß das NAD&spplus; oder NADP&spplus; zu NADH bzw. NADPH reduziert wird; und die Messung entweder der Menge von NADH oder NADPH oder der Menge der aus NADH oder NADPH abgeleiteten Produkte.
- In einer bevorzugten Ausführungsform werden die ersten und zweiten Reagentien gleichzeitig zur biologischen Probe zugegeben.
- In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das Verfahren schrittweise die Zugabe eines ersten Reagens zur biologischen Probe, wobei das erste Reagens eine saure aromatische Verbindung, Acylpolyaminamidohydrolase, falls nötig, Aminoalkylaldehyddehydrogenase und NAD&spplus; oder NADP&spplus; enthält, so daß Acylpolyamine zu freien Polyaminen umgewandelt und vorher vorliegende Aminoalkylaldehyde unter Bildung von NADH bzw. NADPH zur Blindwertermittlung oxidiert werden; die Zugabe eines zweiten Reagens, wobei das Reagens Diaminoxidase und/oder Polyaminoxidase enthält, so daß die Polyamine in Aminoalkylaldehyde umgewandelt werden und NAD&spplus; oder NADP&spplus; zu NADH bzw. NADPH reduziert wird; und die Messung entweder der Menge von NADH bzw. NADPH oder der Menge der von NADH bzw. NADPH abgeleiteten Produkte.
- Die vorliegende Erfindung umfaßt außerdem ein Reagens zur Messung der Menge der Polyamine in einer biologischen Probe, das Diaminoxidase und/oder Polyaminoxidase, Aminoalkylaldehyddehydrogenase und NAD&spplus; oder NADP&spplus; umfaßt und das dadurch gekennzeichnet ist, daß außerdem eine saure aromatische Verbindung vorliegt.
- Die hier beschriebene Erfindung macht somit die folgenden Aufgaben möglich: (1) die Bereitstellung eines Verfahrens zur genauen und einfachen Messung der Polyamine in einer biologischen Probe, insbesondere der Polyamine in Urinproben; (2) die Bereitstellung eines Verfahrens zur genauen, schnellen und einfachen Messung der Polyamine in Urinproben, ohne daß ein umständliches Verfahren zur Trennung der Polyamine von anderen Substanzen, die auch in den biologischen Proben vorliegen, nötig ist oder ohne daß spezielle Techniken, Anlagen oder Apparate erforderlich sind; (3) die Bereitstellung eines Verfahrens zur Messung der Polyamine, das in klinischen Routinetests eingesetzt werden kann, da die Möglichkeit besteht, dieses Verfahren auf einem automatisierten Analysator durchzuführen; und (4) die Bereitstellung eines Verfahrens zur Messung der Polyamine, wobei das Verfahren bei klinischen Tests zum Nachweis von Krebs zu verschiedenen Aspekten der Diagnose und Behandlung einen wichtigen Beitrag leistet.
- Die beiliegenden Zeichnungen dienen dem besseren Verständnis dieser Erfindung, der Fachmann kann mit Hilfe der beiliegenden Zeichnungen die Vorteile der Erfindung erkennen.
- Fig. 1 ist eine Zeichnung, die das Verhältnis zwischen Reaktionszeit und optischer Dichte bei 570 nm des Reaktionsgemisches zeigt, wenn eine Urinprobe zur Messung der Polyamine mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens oder eines herkömmlichen Verfahrens unter Verwendung eines automatisierten Analysators getestet wird.
- Fig. 2 ist eine Zeichnung, die die Korrelation von Werten zeigt, die durch das erfindungsgemäße Verfahren und durch ein herkömmliches Verfahren unter Einsatz einer Säule erhalten wurden.
- Hinsichtlich der Auswahl von biologischen Proben, die durch das erfindungsgemäße Verfahren auf Polyamine getestet werden können, gibt es keine besondere Einschränkung. Biologische Proben, die eingesetzt werden können, umfassen Urin, Blut, Gewebe und dergleichen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders für die Messung von Polyaminen in Urinproben geeignet.
- Diaminoxidasen (DAO), die in dieser Erfindung eingesetzt werden, sind Enzyme, die mit Putrescin, Cadaverin, Spermidin usw. reagieren können. Besonders geeignet ist ein Enzym, das mit Putrescin als Substrat wirksam ist und Putrescinoxidase genannt wird. Diese DAO können irgendeinen Ursprung haben, z. B. kann DAO pflanzlichen Ursprungs, die aus Sojasprossen, Gerste oder Weisen usw. erhalten wird, DAO tierischen Ursprungs, die aus Schweinenieren oder dergleichen erhalten wird, oder DAO mikrobiologischen Ursprungs, die aus Micrococcus-Arten, Nocardia-Arten, Aspergillus-Arten oder dergleichen erhalten wird, verwendet werden. Polyaminoxidasen (PAO), die in dieser Erfindung eingesetzt werden, sind Enzyme, die mit Spermin und Spermidin reagieren können. Diese PAO können irgendeinen Ursprung haben, z. B. kann PAO tierischen Urspungs, das aus Rinderplasma und dergleichen erhalten wird, PAO pflanzlichen Ursprungs, das aus Gerste usw. erhalten wird, und PAO mikrobiellen Ursprungs, das aus Penicillium-Arten, Aspergillus-Arten, Streptomyces-Arten und dergleichen erhalten wird, verwendet werden (Biochemica et Biophysica Acta 743 (1983), 431-436; Biochemica et Biophysica Acta 705 (1982), 133-138; Agricultural and Biological Chemistry 45 (1981), 3943-3945).
- Hinsichtlich der Art der Aminoalkylaldehyddehydrogenase gibt es keinerlei Einschränkung, jedoch ist die Aminobutylaldehyddehydrogenase (abgekürzt ABAL-DH; EC 1.2.1.19) besonders geeignet. So kann z. B. ABAL-DH mikrobiellen Ursprungs, z. B. aus Pseudomonas spp. usw. (J. Biol. Chem. 234 (1959), 2145-2150; Agri. Biol. Chem. 50 (1986), 2009-2016) eingesetzt werden.
- Saure aromatische Verbindungen, die in dieser Erfindung verwendet werden können, sind z. B. Benzoesäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure, Benzolsulfonat, Benzolsulfat oder Halogenderivate oder Hydroxyderivate dieser Verbindungen usw . . Durch Zusatz dieser sauren aromatischen Verbindungen zum Reaktionssystem für die Messung der Polyamine wird verhindert, daß reduzierende Substanzen (z. B. diejenigen, die im Urin vorliegen) das Meßsystem stören.
- Die Messung der Polyamine in biologischen Proben, wie z. B. Urin oder dergleichen, durch diese Erfindung kann z. B. folgendermaßen durchgeführt werden. Wenn auch die in einer biologischen Probe enthaltenen Acylpolyamine gemessen werden sollen, wird zuerst eine Lösung, die die biologische Probe enthält, mit Acylpolyaminamidohydrolase (APAH) behandelt, um die Acylpolyamine durch Desacylierung in freie Polyamine umzuwandeln. Bezüglich des Ursprungs der APAH gibt es keine besondere Einschränkung. Sodann wird diese Probenlösung mit einem Reagens versetzt, das DAO und/oder PAO enthält, wodurch die Polyamine in Aminoalkylaldehyde umgewandelt werden. Zum Reaktionsgemisch wird ein Reagens zugegeben, das Aminoalkylaldehyddehydrogenase, NAD&spplus; oder NADP&spplus; (nachstehend mit NAD(P)&spplus; bezeichnet) und saure aromatische Verbindungen enthält, wodurch die Aminoalkylaldehyde in der Probenlösung in Aminoalkylcarbonsäuren umgewandelt werden. Gleichzeitig wird das NAD&spplus; oder NADP&spplus; in NADH oder NADPH (nachstehend als NAD(P)H bezeichnet) überführt.
- Bezüglich der Konzentration der verschiedenen Enzyme, die in dieser Art von Reaktionssystem eingesetzt werden, gibt es keine besonderen Einschränkungen. Die Konzentrationen werden so gewählt, daß sie für die zu verwendenden Reaktionsbedingungen und die Testapparatur geeignet sind. Die Konzentration der sauren aromatischen Verbindungen in diesem Reaktionsgemisch hängt von der Art der zu untersuchenden biologischen Proben ab, im allgemeinen beträgt diese Konzentration jedoch 10 bis 500 mM, vorzugsweise 50 bis 200 mM. Wenn die Konzentration zu niedrig ist, tritt bei der Messung der Polyamine aufgrund der in der biologischen Probe vorliegenden reduzierenden Substanzen ein Fehler auf. Wenn beispielsweise ein System verwendet wird, bei dem eine Farbe des nachstehend beschriebenen Formazan-Farbstoffs entsteht, erhält man eine ganz schwarze Farbe, die eine genaue Messung der Polyamine unmöglich macht. Bei einer viel zu hohen Konzentration werden die Enzymreaktionen gehemmt. Der pH-Wert des Reaktionssystems liegt im allgemeinen bei etwa 4 bis 10, für NAD(P)&spplus; wird eine Konzentration gewählt, die eine maximale Umsetzung durch die Aminoalkylaldehyddehydrogenase (z. B. ABAL-DH) ergibt, die außerdem nicht die anderen Enzyme im Reaktionssystem hemmt und die vorzugsweise 0,1 bis 20 mM beträgt. Im allgemeinen wird die Umsetzung in einem geeigneten Puffer durchgeführt. Die Temperatur der Umsetzung wird unter Berücksichtigung der optimalen Temperatur der verwendeten Enzyme und dergleichen ausgewählt. Im allgemeinen kann die Reaktionstemperatur auf 20 bis 40ºC eingestellt werden.
- Das in der vorstehenden Reaktion erzeugte NAD(P)H wird z. B. durch das direkte kolorimetrische Verfahren mittels der optischen Dichte bei 340 nm gemessen, die Menge der Polyamine in der biologischen Probe kann sodann aus den erhaltenen Werten errechnet werden. Alternativ wird NAD(P)H mit anderen Substanzen umgesetzt und das NAD(P)H indirekt durch Messung der Produkte dieser Umsetzung bestimmt, wobei aus den Ergebnissen die Menge der Polyamine errechnet werden kann.
- In einem Verfahren zur Messung von NAD(P)H wird der Formazan-Farbstoff bestimmt, der durch Umsetzung von Formazan- Reagens (d. h. Tetrazoliumsalzen) und NAD(P)H in Gegenwart eines Elektronenträgers erzeugt wird. Als Elektronenträger kann beispielsweise Phenazinmethosulfat, 1-Methoxyphenazinmethosulfat, Diaphorase usw. eingesetzt werden. Bezüglich der Konzentration des zu verwendenden Elektronenträgers gibt es keine bestimmten Grenzen, vorzugsweise beträgt die Konzentration im Reaktionssystem jedoch 0,1 mM oder mehr. Wenn Diaphorase eingesetzt werden soll, ist 0,1 E/ml oder mehr geeignet.
- Als Formazan-Reagens kann z. B. Nitrotetrazolium-Blau (NTB), 3-(p-Iodphenyl)-2-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium (INT) und 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) usw. eingesetzt werden. Bezüglich der Konzentration dieser zu verwendenden Verbindungen gibt es keine besonderen Beschränkungen, vorzugsweise jedoch beträgt die Konzentration im Reaktionssystem 0,05 bis 5 mM. In dem Testsystem, bei dem ein Formazan-Reagens einsetzt wird, werden für das Formazan-Reagens Elektronen aus NAD(P)H mittels eines Elektronenträgers bereitgestellt, wodurch das Formazan-Reagens unter Erzeugung eines Formazan-Farbstoffs reduziert wird. Der Formazan-Farbstoff weist einen höheren molekularen Absorptionskoeffizienten auf als NAD(P)H. Somit kann die spektrophotometrische Messung mit hoher Empfindlichkeit durchgeführt werden.
- In einem anderen Verfahren wird Resazurin mit NAD(P)H in Gegenwart eines Elektronenträgers umgesetzt, sodann kann das erzeugte Resorufin durch seine Fluoreszenz gemessen werden. In einem weiteren Verfahren wird Flavinreductase (FR) mit NAD(P)H in Gegenwart von Flavinmononucleotid (FMN) umgesetzt und das erzeugte reduzierte FMN mit Luciferase aus lumineszierenden Bakterien versetzt, worauf die erzeugte Lumineszenz gemessen werden kann. Als FR und LCF können Enzyme aus lumineszierenden Bakterien eingesetzt werden.
- Im erfindungsgemäßen Meßverfahren ist es auch möglich, anstatt die vorstehend beschriebenen Schritte der Umsetzung von Polyaminen zum Erhalt von Aminoalkylaldehyden und der Verwendung von Aminoalkylaldehyddehydrogenase in Gegenwart von NAD(P)&spplus; zum Erhalt von NAD(P)H getrennt durchzuführen, die Enzyme und Reagentien (einschließlich der sauren aromatischen Verbindungen) gleichzeitig zu der Probenlösung zuzugeben, so daß die Umsetzungen in einem einzigen Schritt abläuft. Auch bei Messung von NAD(P)H durch eine Farbreaktion, Fluoreszenzreaktion oder Lumineszenzreaktion können die für diese Reaktion benötigten Enzyme und Reagentien nach der Erzeugung von NAD(P)H zum Reaktionssystem zugegeben werden oder sie können beim Start der Reaktion zur Probenlösung mit DAO usw. zugefügt werden.
- Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Messung der Polyamine ist es aufgrund des Vorliegens einer sauren aromatischen Verbindung im Reaktionssystem möglich, die Polyamine mit hoher Genauigkeit ohne Beeinflussung durch reduzierende Substanzen in der biologischen Probe zu messen. Aus diesem Grund ist der Schritt zur Entfernung von reduzierenden Substanzen, z. B. unter Verwendung einer Kationenaustauschersäule, nicht mehr nötig. Auf diese Weise kann die Umsetzung in einem einzigen Schritt durchgeführt werden, somit ist es möglich, dieses Verfahren für den Test der Polyamine in einem automatisierten Analysator durchzuführen. Das Verfahren dieser Erfindung kann für einen Test der Polyamine in Urinproben verwendet werden, welche besonders große Mengen reduzierender Substanzen enthalten.
- Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele erläutert.
- Polyamine im Urin wurden mit einem automatisierten Analysator unter Einsatz des Formazan-Anfärbeverfahrens gemessen.
- Zur Messung wurde der automatisierte Analysator von Hitachi, Modell 705 (Hitachi iitd.), verwendet; Änderungen der optischen Dichte wurden während des Tests kontinuierlich durch den Computer überwacht. Die im Test eingesetzten Reagentien hatten die folgende Zusammensetzung.
- (Endkonzentration) Geeigneter Puffer, pH 7,0 0,2 M
- Triton X-100 1,0%
- Ascorbatoxidase 3,3 E/ml
- APAH 5 E/ml
- MTT 20 ug/ml
- Diaphorase 3 E/ml
- Putrescinoxidase 15 E/ml
- Benzolsulfonsäure 0,1 M
- (Endkonzentration)
- Geeigneter Puffer, pH 7,0 0,2 M
- Triton X-100 1,0%
- ABAL-DH 0,5 E/ml
- NAD&spplus; 1 mM
- Diese Reagentien wurden für den automatisierten Analysator bereitgestellt. Für jede Messung wurde im automatisierten Analysator das folgende Reagens- und Probenvolumen eingesetzt: Reagens 1, 350 ul, Reagens 2, 50 ul, und Urinprobe 20 ul. Das eingesetzte Volumen der Urinproben von 20 ul war das Volumen, das mit diesem automatisierten Analysator die größte Empfindlichkeit (relative Empfindlichkeit) ergibt. Die weiteren Testbedingungen waren folgendermaßen: Reaktionstemperatur von 37ºC, Reaktionszeit von 10 Minuten und Messung bei der Wellenlänge 570 nm.
- Die Ergebnisse der Tests von zwei verschiedenen Urinproben, A und B, werden in Fig. 1 gezeigt. In einem unabhängigen Experiment wurde Reagens 1 hergestellt, das keine Benzolsulfonsäure (d. h. die saure aromatische Verbindung) enthielt, und dieses Reagens im Test der Urinprobe B eingesetzt. Die Ergebnisse werden in Fig. 1 als Kurve C gezeigt. Fig. 1 zeigt, daß in dem Fall, wenn Reagens 1 Benzolsulfonsäure als saure aromatische Verbindung enthielt, die optische Dichte der Blindprobe nicht erhöht war. Der Grund hierfür ist, daß die Erhöhung der optischen Dichte, die durch die reduzierenden Substanzen zustande kommen könnte, unterdrückt wird. Das heißt, daß genaue Messungen der Polyamine im Urin ohne jeglichen Einfluß von reduzierenden Substanzen durchgeführt wurden.
- Sieben verschiedene Urinproben mit unterschiedlichen Polyaminkonzentrationen wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 unter Verwendung des automatisierten Analysators (Hitachi, Modell 705; Hitachi Ltd.) auf die Polyaminkonzentration getestet. Der automatisierte Analysator arbeitete nach dem N-N- Verfahren, die automatische Korrektur wurde mit einer Blindprobe durchgeführt. In einem weiteren Experiment wurde "Polyamine-Test-Enzyme", ein handelsübliches Polyamin-Testkit (Tokuyama Soda Co. Ltd.), als herkömmliches Verfahren eingesetzt und sieben Urinproben getestet. Jeweils zwei Portionen von jeder der vorstehend erwähnten Proben wurden jeweils einer Meßserie nach dem erfindungsgemäßem Verfahren bzw. nach dem herkömmlichen Verfahren unterworfen. Für jede Probe wurden bei beiden Verfahren die Mittelwerte aus zwei Messungen erhalten. Die Ergebnisse, die bei Messung der Probenlösungen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurden, wurden auf die y- Achse aufgetragen und die Ergebnisse, die bei Messung der gleichen Probenlösungen unter Verwendung des handelsüblichen Verfahrens erhalten wurden, wurden auf die x-Achse aufgetragen. Die erhaltene Zeichnung wird in Fig. 2 gezeigt. Die Korrelation der Werte, die unter Anwendung dieser Erfindung gemessen wurden, mit den Werten, die in herkömmlicher Art und Weise gemessen wurden, betrug r = 0,997, und die Korrelationsgleichung war y = 1,059x - 1,47, dies zeigt eine gute lineare Korrelation.
- Die folgenden Probenlösungen D, E und F wurden zur Verwendung als Urinproben hergestellt:
- D Urin:Wasser, 9 : 1 (Vol./Vol.)
- E Urin:wäßrige Lösung von Harnsäure (50 mg/dl) = 9 : 1 (Vol./Vol.)
- F Urin:wäßrige Lösung von Ascorbinsäure (200 mg/dl) = 9 : 1 (Vol./Vol.)
- Diese Probenlösungen D, E und F wurden gemäß dem Verfahren von Beispiel 1 getestet, mit der Ausnahme, daß die in Tabelle 1 aufgelisteten sauren aromatischen Verbindungen anstelle der in Reagens 1 enthaltenen Benzolsulfonsäure eingesetzt wurden. Der automatisierte Analysator arbeitete nach dem N-N-Verfahren, die automatische Korrektur wurde mit einer Blindprobe durchgeführt.
- Die Absorption nach zehnminütiger Reaktion wird in Tabelle 2 gezeigt.
- Reagens Saure aromatische Verbindung
- I Benzoesäure
- II Naphthalinsulfonsäure
- III Benzolsulfonsäure
- IV p-Chlorbenzoesäure
- V 2-Chlornaphthalinsulfonsäure
- VI 4-Hydroxynaphthalinsulfonsäure
- VII Keine Tabelle 2 Reagens optische Dichte Blindprobe Probe Lösung D* E* F*
- * (für die Probenlösung gemessener Wert) - (Blindwert)
- Tabelle 2 zeigt, daß keine Erhöhung der Absorption durch die reduzierenden Substanzen auftrat, wenn ein Reaktionssystem mit einem Reagens, das die vorstehenden sauren aromatischen Verbindungen enthält, für den Test der Probenlösungen E und F, die reduzierende Substanzen enthalten, verwendet wurde.
Claims (7)
1. Verfahren zur Messung der Menge an Polyaminen in einer
biologischen Probe, das die Verwendung von
Diaminoxidase und/oder Polyaminoxidase,
Aminoalkylaldehyddehydrogenase und NAD&spplus; oder NADP&spplus; umfaßt, dadurch
gekennzeichnet, daß es in Gegenwart einer sauren
aromatischen Verbindung durchgeführt wird, die eine
Störung des Meßsystems durch in der biologischen Probe
vorliegende reduzierende Stoffe verhindert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die saure aromatische
Verbindung Benzoesäure, Benzolsulfonsäure,
Naphthalinsulfonsäure, Benzolsulfonat, Benzolsulfat oder ein
Halogenderivat oder Hydroxyderivat dieser Verbindungen
ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die Zugabe
eines ersten Reagens zu der biologischen Probe, wobei
das erste Reagens die saure aromatische Verbindung und
Diaminoxidase und/oder Polyaminoxidase enthält, so daß
die Polyamine in Aminoalkylaldehyde umgewandelt werden;
die Zugabe eines zweiten Reagens zum Reaktionsgemisch,
wobei das zweite Reagens Aminoalkylaldehyddehydrogenase
und NAD&spplus; oder NADP&spplus; enthält, so daß das NAD&spplus; oder NADP&spplus;
zu NADH bzw. NADPH reduziert wird; und die Messung
entweder der Menge an NADH oder NADPH oder der Menge
der aus NADH bzw. NADPH abgeleiteten Produkte.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das erste und zweite
Reagens gleichzeitig zu der biologischen Probe
zugegeben werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, umfassend die Zugabe
eines ersten Reagens zu der biologischen Probe, wobei
das erste Reagens die saure aromatische Verbindung,
Acylpolyaminamidohydrolase, falls nötig,
Aminoalkylaldehyddehydrogenase und NAD&spplus; oder NADP&spplus;
enthält, so daß Acylpolyamine zu freien Polyaminen
umgewandelt werden und vorher vorliegende
Aminoalkylaldehyde unter Bildung von NADH bzw. NADPH
oxidiert werden; die Zugabe eines zweiten Reagens,
wobei das Reagens Diaminoxidase und/oder
Polyaminoxidase enthält, so daß die Polyamine in
Aminoalkylaldehyde umgewandelt werden und NAD&spplus; oder NADP&spplus; zu NADH
bzw. NADPH reduziert wird; und die Messung entweder der
Menge an NADH oder NADPH oder der Menge der aus NADH
bzw. NADPH abgeleiteten Produkte.
6. Reagens zur Messung der Menge an Polyaminen in einer
biologischen Probe, das Diaminoxidase und/oder
Polyaminoxidase, Aminoalkylaldehyddehydrogenase und
NAD&spplus; oder NADP&spplus; umfaßt, dadurch gekennzeichnet, daß
außerdem eine saure aromatische Verbindung vorliegt,
die eine Störung des Meßsystems durch in der
biologischen Probe vorliegende reduzierende Stoffe
verhindert.
7. Reagens nach Anspruch 6, wobei die saure aromatische
Verbindung Benzoesäure, Benzolsulfonsäure,
Naphthalinsulfonsäure, Benzolsulfonat, Benzolsulfat oder ein
Halogenderivat oder Hydroxyderivat dieser Verbindungen
ist.
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