DE3781083T2 - Verfahren zur selektiven abmessung von aminosaeuren. - Google Patents

Verfahren zur selektiven abmessung von aminosaeuren.

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Description

    1. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die selektive Bestimmung spezieller Aminosäuren, insbesondere Verfahren zur selektiven Bestimmung aromatischer Aminosäuren oder verzweigtkettiger Aminosäuren, welche dadurch gekennzeichnet sind, daß man eine Reihe von Enzymen mit denjenigen, die für aromatische Aminosäuren bzw. verzweigtkettige Aminosäuren spezifisch sind, zur Bildung von Wasserstoffperoxid an eine Probe koppelt und dann das Wasserstoffperoxid bestimmt.
    • 2. Stand der Technik
  • In jüngster Zeit gelangte man zu der Erkenntnis, daß bei Patienten mit Lebererkrankungen, beispielsweise einer Hypofunktion der Leber, die einzelnen Aminosäuren in abnormaler Weise entstehen und verwertet werden, wobei sich aromatische Aminosäuren in hohem Maße im Blut ansammeln. Folglich ändert sich das Verhältnis aromatische Aminosäuren/verzweigtkettige Aminosäuren im Blut (das Verhältnis wird als "Fischer'sches Verhältnis" bezeichnet) bei solchen Patienten im Vergleich zum Normalzustand in hohem Maße. Weiterhin wird darüber berichtet, daß durch Bestimmung des Fischer'schen Verhältnisses der Grad an Leberschädigung beurteilt werden kann (vgl. J.E.Fischer und Mitarbeiter in "Surgery", 80, 77 (1976)). Durch Abnormalität der Aminosäuren induziertes Leberkoma wurde in jüngster Zeit durch Aminosäureinfusionen therapiert.
  • Bei der Beurteilung des Grades an Leberschädigung und bei der Aminosäureüberwachung im Rahmen der Therapie durch Aminosäureinfusion ist es unabdingbar, das Fischer'sche Verhältnis zu bestimmen. Seine Signifikanz hat zunehmend an Bedeutung gewonnen.
  • Bis heute ist als praktisches Verfahren zur Bestimmung von Aminosäuren lediglich der mit einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie arbeitende Aminosäureanalysator verfügbar. Nach diesem Verfahren können zwar einzelne Aminosäuren bestimmt werden, das Gerät ist jedoch teuer. Nachteilig ist ferner, daß die Bestimmung lange dauert. Folglich bedient man sich dieses Verfahrens in Krankenhäusern, in denen täglich Sichtungstests durchgeführt werden, kaum, dieses Verfahren wird vielmehr ausschließlich in Forschungsinstituten benutzt.
  • Es gibt zahlreiche Verfahren zur Bestimmung von Aminosäuren aufgrund enzymatischer Reaktionen. Bekannt sind beispielsweise
  • 1. ein Bestimmungsverfahren durch Koppeln von Leucindehydrogenase an eine verzweigtkettige Aminosäure in Gegenwart von Nicotinamidadenindinucleotid (im folgenden mit "NAD" abgekürzt) und anschließende Bestimmung des gebildeten reduzierten NAD bei 340 nm,
  • 2. ein Bestimmungsverfahren durch Koppeln von Decarboxylase an eine einzelne Aminosäure und anschließende Bestimmung entweder des gebildeten gasförmigen Kohlendioxids auf manometrischem Wege oder des gebildeten Monoamins über einen Farbumschlag und
  • 3. ein Bestimmungsverfahren durch Koppeln von Aminosäureoxidase mit Aminosäure und anschließende Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids (diese Verfahren sind in "Methods of Enzymatic Analysis", 2.Ausgabe, 4, 1662 und 1669 (1974) und aaO, 3.Ausgabe, 8, 318 (1985), Verlag Academic Press, beschrieben) und ferner
  • 4. ein Bestimmungsverfahren durch Koppeln von Phenylalaninammonialiase mit Phenylalanin und Tyrosin zur Umwandlung in Cinnamat bzw. Coumarat und anschließende Bestimmung derselben bei 290 - 315 nm (vgl. "Science" 197, 665 (1977)).
  • Diese Bestimmungsverfahren sind jedoch mit Nachteilen behaftet. Die Verfahren 1) und 4) werden in hohem Maße durch UV- Absorption von Proteinen in der Probe beeinträchtigt, weswegen sie sehr ungenau sind. Weiterhin reicht die Nachweisempfindlichkeit für einen praktischen Gebrauch nicht aus. Das Verfahren 2), d.h. die manometrische Bestimmung, ist zwar empfindlich genug, sie erfordert jedoch ein Spezialinstrument zur Bestimmung sowie ein zeitraubendes Arbeiten. Das bei dem Bestimmungsverfahren 3) verwendete Enzym besitzt keine Spezifität gegenüber verschiedenen Aminosäuren, so daß es unmöglich ist, aromatische Aminosäuren und verzweigtkettige Aminosäuren selektiv zu bestimmen.
  • Wie bereits erwähnt, wurden bereits verschiedene auf einer enzymatischen Reaktion basierende Bestimmungsverfahren vorgeschlagen, vor ihrem Einsatz in der Praxis müssen jedoch noch viele Probleme gelöst werden.
    • 3. Mittel zur Problemlösung
  • Von den vorliegenden Erfindern wurden Forschungen und Entwicklungsprozesse durchgeführt, um ein Verfahren zur selektiven und raschen Bestimmung von Phenylalanin und/oder Tyrosin sowie verzweigtkettiger Aminosäuren mit für einen praktischen Gebrauch ausreichender Genauigkeit und innerhalb eines für den praktischen Gebrauch geeigneten Bereichs bereitzustellen. Als Ergebnis energetischer Untersuchungen hat es sich gezeigt, daß sich das angestrebte Ziel durch Koppeln von Enzymen mit spezifischer Reaktion mit (d.h. Enzymen mit hoher Spezifität für) Phenylalanin und/oder Tyrosin oder verzweigtkettige(n) Aminosäuren und anschließendes Einführen in das System zum Nachweis von Wasserstoffperoxid erreichen läßt. Darauf beruht nun diese Erfindung.
  • Weitere Untersuchungen haben gezeigt, daß das Verhältnis Phenylalanin/verzweigtkettige Aminosäuren bzw. das Verhältnis Tyrosin/verzweigtkettige Aminosäuren im Blut mit dem Fischer'schen Verhältnis voll übereinstimmt. Demzufolge kann es zur Bewertung des Grades an Leberschädigung und zur Aminosäureüberwachung bei der Therapie mittels Aminosäureinfusion anstelle des Fischer'schen Verhältnisses benutzt werden.
  • Das erfindungsgemäße Meß- oder Bestimmungsverfahren wurde niemals versucht und wurde durch unsere Versuche das erste Mal (als gangbar) bestätigt.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist folglich die Schaffung neuer Verfahren zur selektiven Bestimmung der oben genannten Aminosäuren.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • In den Zeichnungen zeigen:
  • Figur 1 eine Eichkurve für die erfindungsgemäß bestimmten Aminosäuren Phenylalanin und/oder Tyrosin;
  • Figur 2 eine Eichkurve erfindungsgemäß bestimmter verzweigtkettiger Aminosäuren und
  • Figur 3 eine graphische Darstellung der Beziehung zwischen dem Verhältnis Tyrosin/verzweigtkettige Aminosäuren, ermittelt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren und aus dem Fischer'schen Verhältnis.
    • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG 1. Gegenstand der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur selektiven Bestimmung von Phenylalanin und/oder Tyrosin oder verzweigtkettiger Aminosäuren, die durch Koppeln von Phenylalanin-4-monooxygenase und Tyrosindecarboxylase, und/oder für Phenylalanin und/oder Tyrosin spezifischer Phenylalanindecarboxylase und/oder Tyrosindecarboxylase und anschließendes Koppeln von Tyraminoxidase zur Bildung von Wasserstoffperoxid oder Koppeln von für verzweigtkettige Aminosäuren spezifischer Leucindehydrogenase und anschließendes Koppeln von Milchsäuredehydrogenase und Milchsäureoxydase zur Bildung von Wasserstoffperoxid und anschließende Bestimmung des jeweiligen Wasserstoffperoxids gekennzeichnet sind.
  • Erfindungsgemäße Beispiele verzweigtkettiger Aminosäuren sind Valin, Leucin und Isoleucin. Für die Durchführung der Erfindung eignen sich sämtliche Testproben mit den genannten Aminosäuren. Geeignet sind beispielsweise Körperflüssigkeits-, wie Serum-, Plasma- und Urinproben, sowie Aminosäureinfusionslösungen. Erfindungsgemäß ist es nicht erforderlich, Proteine aus einer Probe zu entfernen. Allerdings können als Testproben auch solche Proben eingesetzt werden, aus denen ein Protein unter Verwendung von Sulfosalicylsäure, Trichloressigsäure, Picrinsäure, Perchlorsäure oder Wolframsäure entfernt und deren pH-Wert anschließend erneut neutralisiert wurde,
  • Allgemein ausgedrückt, betrifft die vorliegende Erfindung
  • 1. (a) Verfahren zur Bestimmung von Phenylalanin und Tyrosin in einer Probe, die durch Koppeln des für Tyrosin und Phenylalanin spezifischen Enzyms oder durch aufeinanderfolgendes Koppeln des für die genannten einzelnen aromatischen Aminosäuren spezifischen Enzyms und anschließendes Einführen des Produkts in ein System zum Entweichenlassen von Wasserstoffperoxid für die Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids gekennzeichnet sind, oder
  • (b) Verfahren zur Bestimmung von Phenylalanin oder Tyrosin in einer Probe, die durch Koppeln des für Phenylalanin oder Tyrosin alleine spezifischen Enzyms und anschließendes Einführen des Produkts in ein System zum Entweichenlassen von Wasserstoffperoxid für die Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids gekennzeichnet sind; oder
  • 2. Verfahren zur Bestimmung sämtlicher verzweigtkettiger Aminosäuren in einer Probe, die durch Koppeln des für sämtliche verzweigtkettige Aminosäuren, d.h. Valin, Leucin und Isoleucin, spezifischen Enzyms oder durch aufeinanderfolgendes Koppeln des für einzelne verzweigtkettige Aminosäuren spezifischen Enzyms und anschließendes Einführen des Produkts in ein System zum Entweichenlassen von Wasserstoffperoxid für die Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids gekennzeichnet sind.
  • Die folgenden typischen enzymatischen Reaktionen veranschaulichenohne Beschränkung die vorliegende Erfindung in ihren Einzelheiten.
  • Die Bestimmungsverfahren für Phenylalanin und/oder Tyrosin sind in folgendem Schema dargestellt: Schema der Bestimmung von Phenylalanin und/oder Tyrosin Phenylalanin MTHP und Phenylalanin-4-monooxygenase Tyrosin Phenylalanindecarboxylase oder Tyrosindecarboxylase Tryosindecarboxylase β-Phenylethylamin Tyramin Tyraminoxidase β-Tyrosinase Brenztraubensäure TPP,FAD und Brenztraubensäureoxydase NADH, Milchsäuredehydrogenase und Milchsäureoxydase Entweichen von H&sub2;O&sub2; NADH: Nicotinamidadenindinucleotid, reduziert MTHP: 6-Methyl-5,6,7,8-tetrahydropteridin TPP : Thiaminpyrophosphat FAD : Flavinadenindinucleotid
  • Beispiele für Enzyme mit Spezifität für Phenylalanin sind Phenylalanindecarboxylase und Phenylalanin-4-monooxygenase. Enzyme mit Spezifität für Tyrosin sind Tyrosindecarboxylase und β-Tyrosinase. Weiterhin ist bekannt, daß Tyrosindecarboxylase in hoher Konzentration mit Phenylalanin kuppelt.
  • Erfindungsgemäß können aus beliebigen Organismen stammende Enzyme eingesetzt werden. So kann beispielsweise Phenylalanindecarboxylase aus Streptococcus faecalis gewonnen werden. Phenylalanin-4-monooxygenase läßt sich aus Rattenleber (cf. "J. Biol. Chem." 245, 4745 (1970)) und Pseudomonas (cf. "J. Biol. Chem." 250, 6672 (1975)) extrahieren und reinigen.
  • Diese 4-Monooxygenase katalysiert die quantitative Umwandlung von Phenylalanin zu Tyrosin in Gegenwart von 6-Methyl-5,6,7,8- tetrahydropteridin. Als Tyrosindecarboxylase kann ein Apoenzym von Tyrosindecarboxylase, das durch Zerkleinern von und Extrahieren aus acetongetrocknetem Streptococcus faecalis-Bakterium und anschließende Reinigung über ein Molekularsieb gewonnen wird, verwendet werden. Das Enzym katalysiert die Umwandlung von Tyrosin zu Tyramin in Gegenwart von Pyridoxal-5-phosphat. Wenn ein Holoenzym von Tyrosindecarboxylase verwendet wird, benötigt man kein Pyridoxal-5-phosphat. β-Tyrosinase kann aus Escherichia intermedia (vgl. "J. Biol. Chem." 245, 1767 und 1773 (1970)) gereinigt werden.
  • Durch Umsetzen dieser Enzyme in beliebiger Kombination können Phenylalanin und Tyrosin in einer Probe in β-Phenylethylamin, Tyramin und/oder Brenztraubensäure umgewandelt werden. Andererseits können durch Umsetzen dieser Enzyme alleine Phenylalanin und Tyrosin in einer Probe in β-Phenylethylamin, Tyramin oder Brenztraubensäure umgewandelt werden. Vorzugsweise können
  • 1. Phenylalanin und Tyrosin durch Koppeln von 0,1 - 5 U/ml (dies bedeutet hier und im folgenden die Endkonzentration) Phenylalanindecarboxylase und 0,1 - 2 U/ml Tyrosindecarboxylase (bzw. 0,1 - 2 U/ml seines Apoenzyms und 1 uM - 1 mM Pyridoxal-5-phosphat) in β-Phenylethylamin bzw. Tyramin umgewandelt werden;
  • 2. beide, nämlich Phenylalanin und Tyrosin, durch Koppeln von 0,1 - 5 U/ml Phenylalanin-4-monooxygenase (in Gegenwart von 10 uM - 1 mM 6-Methyl-5,6,7,8-tetrahydropteridin) und 0,1 - 2 U/ml Tyrosindecarboxylase (oder seines Apoenzyms und Pyridoxal-5-phosphat, vgl. oben) in Tyramin umgewandelt werden;
  • 3. beide, nämlich Phenylalanin und Tyrosin, durch Koppeln von 0,1 - 5 U/ml Phenylalanin-4-monooxygenase (in Gegenwart von 10 uM - 1 mM 6-Methyl-5,6,7,8-tetrahydropteridin) und 0,1 - 5 U/ml β-Tyrosinase in Brenztraubensäure umgewandelt werden;
  • 4. Phenylalanin sowie Tyrosin durch Koppeln der 10- bis 50fachen Menge Tyrosindecarboxylase (oder des 10- bis 50fachen ihres Apoenzyms) wie im Falle 1 - bevorzugte Endkonzentration 1 - 20 U/ml - gleichzeitig in β-Phenylethylamin und Tyramin umgewandelt werden;
  • 5. Phenylalanin durch Koppeln von 0,1 - 5 U/ml Phenylalanindecarboxylase in β-Phenylethylamin umgewandelt werden oder
  • 6. Tyrosin durch Koppeln von 0,1 - 2 U/ml Tyrosindecarboxylase (oder ihres Apoenzyms und Pyridoxal-5-phosphat, vgl. oben) bzw. durch Koppeln von 0,1 - 5 U/ml β-Tyrosinase in Tyramin bzw. Brenztraubensäure umgewandelt werden.
  • Die Verfahren 1) bis 4) dienen einer gleichzeitigen Bestimmung von sowohl Phenylalanin als auch Tyrosin in einer Probe, das Verfahren 5) dient zur Bestimmung von Phenylalanin alleine, das Verfahren 6) dient zur Bestimmung von Tyrosin alleine. Aus wirtschaftlichen Gesichtspunkten und wegen ihrer einfachen Durchführbarkeit werden die Verfahren 4) und 6) bevorzugt.
  • Die Einführung der Metaboliten aromatischer Aminosäuren in ein System zum Entweichen von Wasserstoffperoxid kann beispielsweise durch Koppeln von Tyraminoxidase an β-Phenylethylamin und/oder Tyramin (Tyraminoxidase kann mit β-Phenylethylamin sowie Tyramin unter Bildung von Wasserstoffperoxid reagieren), durch Koppeln von Brenztraubensäureoxidase an Brenztraubensäure in Gegenwart von Thiaminpyrophosphat und Flavinadenindinucleotid und durch Koppeln von Milchsäuredehydrogenase und Milchsäureoxydase an Brenztraubensäure in Gegenwart von NADH (d.h. Nicotinamidadenindinucleotid, reduziert) und dergleichen geschehen. Sämtliche für diese Reaktionen benutzte Enzyme und Reagentien sind im Handel erhältlich.
  • In der Praxis können vorzugsweise 0,1 - 5 U/ml Tyraminoxidase oder 1 - 20 U/ml Brenztraubensäureoxidase, 0,1 - 1 mM Thiaminpyrophosphat und 1 um - 0,1 mM Flavinadenindinucleotid oder 1 - 20 U/ml Milchsäuredehydrogenase, 0,1 - 5 U/ml Milchsäureoxidase und 0,1 - 1 mM NADH verwendet werden.
  • Bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin sind:
  • (1) Verfahren durch gleichzeitiges Koppeln von Phenylalanindecarboxylase und Tyrosindecarboxylase an die Aminosäuren und anschließend durch Koppeln von Tyraminoxidase;
  • (2) Verfahren durch gleichzeitiges Koppeln von Phenylalanin- 4-monooxygenase in Gegenwart von 6-Methyl-5,6,7, 8-tetrahydropteridin und Tyrosindecarboxylase an die Aminosäuren und anpteridin und Tyrosindecarboxylase an die Aminosäuren und anschließend durch Koppeln von Tyraminoxidase;
  • (3) Verfahren durch gleichzeitiges Koppeln von Phenylalanin- 4-monooxygenase in Gegenwart von 6-Methyl-5,6,7,8-tetrahydropteridin und β-Tyrosinase an die Aminosäuren und anschließend durch Koppeln von Brenztraubensäureoxidase in Gegenwart von Thiaminpyrophosphat und Flavinadenindinucleotid;
  • (4) Verfahren durch gleichzeitiges Koppeln von Phenylalanin- 4-monooxygenase in Gegenwart von 6-Methyl-5,6,7,8-tetrahydropteridin und β-Tyrosinase an die Aminosäuren und anschließend durch gleichzeitiges Koppeln von Milchsäuredehydrogenase und Milchsäureoxidase in Gegenwart von reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid;
  • (5) Verfahren durch Koppeln von Tyrosindecarboxylase in der Endkonzentration von 1 - 20 U/ml an die Aminosäuren und anschließend durch Koppeln von Tyraminoxidase;
  • (6) Verfahren durch Koppeln von Phenylalanindecarboxylase an Phenylalanin und anschließend durch Koppeln von Tyraminoxidase;
  • (7) Verfahren durch Koppeln von Tyrosindecarboxylase an Tyrosin und anschließend durch Koppeln von Tyraminoxidase;
  • (8) Verfahren durch Koppeln von β-Tyrosinase an Tyrosin und anschließend durch Koppeln von Brenztraubensäureoxidase in Gegenwart von Thiaminpyrophosphat und Flavinadenindinucleotid und
  • (9) Verfahren durch Koppeln von β-Tyrosinase an Tyrosin und anschließend durch gleichzeitiges Koppeln von Milchsäuredehydrogenase und Milchsäureoxidase in Gegenwart von reduziertem Nicotinamidadenindinucleotid.
  • Vorzugsweise läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren derart ausführen, daß man Tyrosindecarboxylase in der Endkonzentration von 1 - 20 U/ml an die Aminosäuren koppelt und danach durch Koppeln von Tyraminoxidase an das gebildete Tyramin und β-Phenylethylamin oder durch Koppeln von Tyrosindecarboxylase an Tyrosin und anschließend durch Koppeln von Tyraminoxidase an das gebildete Tyramin Wasserstoffperoxid entweichen läßt.
  • Wasserstoffperoxid bestimmt werden. So kann beispielsweise die Messung in Gegenwart von Peroxidase unter Verwendung einer Verbindung, die durch oxidative Kondensation von 4-Aminoantipyrin oder 3-Methyl-2-benzothiazolinhydrazon Hydrochlorid mit einem Derivat von Anilin, Anisidin oder Toluidin [beispielsweise N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin (im folgenden mit "TOOS" (abgekürzt)] hergestellt wurde, als farbgebendem Mittel durchgeführt werden. Die enzymatischen Reaktionen können in üblicher bekannter Weise ablaufen gelassen werden.
  • In der Praxis kann die erfindungsmäße Bestimmung durch Zusatz einer Testprobe mit Phenylalanin und/oder Tyrosin und einem geeigneten Volumen Wasser zu einer Enzymlösung, die Enzyme mit Spezifität für Phenylalanin und/oder Tyrosin, Enzyme zum Einführen von durch die Wirkung ersterer Enzyme gebildeten Metaboliten in ein System zum Entweichenlassen von Wasserstoffperoxid und Enzyme zum Nachweis des Wasserstoffperoxids enthält und deren pH-Wert mit Hilfe von Pufferlösungen auf 4 - 8, vorzugsweise 5,5 - 6, eingestellt ist, bis zum Erreichen eines festgelegten Lösungsgemischvolumens, anschließendes 5- bis 10-minütiges Reagierenlassen des Gemischs bei 37ºC und abschließende spektralphotometrische Bestimmung durchgeführt werden.
  • Erforderlichenfalls können die Enzymlösungen zur aufeinanderfolgenden Zugabe in einige Gruppen unterteilt werden.
  • Als bei der geschilderten Umsetzung verwendbare Pufferlösung eignet sich jede auf einen pH-Wert von 4 - 8 einstellbare Pufferlösung, beispielsweise eine Essigsäurepufferlösung, eine Zitronensäurepufferlösung, eine S rensen-Pufferlösung, eine McIlvaine-Pufferlösung, eine Good-Pufferlösung und dergleichen, vorzugsweise eine McIlvaine-Pufferlösung. Die Pufferlösung kann im bereich von 10 - 200 mM eingesetzt werden.
  • In folgendem Schema sind die Verfahren zur Bestimmung verzweigkettiger Aminosäuren dargestellt: Schema der Bestimmung verzweigtkettiger Aminosäuren Valin Leucin Isoleucin Valindecarboxylase Monoamin Monoaminoxidase Entweichen von H&sub2;O&sub2; NAD und Leucindehydrogenase HADH Brentraubensäure, Milchsäuredehydrogenase und Milchsäureoxidase Elektronenübertragung und Superoxiddismutase NAD: Nicotinamidadenindinucleotid
  • Beispiele für Enzyme mit Spezifität für eine verzweigtkettige Aminosäure sind Valindecarboxylase (alias Leucindecarboxylase) und Leucindehydrogenase. Beide sind für sämtliche verzweigtkettigen Aminosäuren, d.h. Valin, Leucin und Isoleucin spezifisch.
  • Erfindungsgemäß können von beliebigen Organismen herrührende Enzyme eingesetzt werden. So läßt sich beispielsweise Valindecarboxylase aus Proteus vulgaris (cf. "J. Ger. Microbiol." 17, 602 (1957)) und Leucindehydrogenase aus Bacillus sphaericus (cf. "J. Biol. Chem." 253 5719 (1978)) reinigen. Valindecarboxylase (oder ihr Apoenzym in Gegenwart von Pyridoxal-5-phosphat) katalysiert die quantitative Umwandlung verzweigtkettiger Aminosäuren in Monoamin. Leucindehydrogenase sie quantitativ gekuppeltes NAD in NADH umwandelt.
  • In der Praxis gelangen 0,1 - 5 U/ml Valindecarboxylase (oder ihr Apoenzym in Gegenwart von 1 uM - 1 mM Pyridoxal-5- phosphat) oder 1 - 20 U/ml Leucindehydrogenase und 1 - 20 mM NAD zum Einsatz.
  • Die Einführung des gebildeten Monoamins oder NADH in ein System zur Freisetzung von Wasserstoffperoxid kann durch Koppeln von Monoaminoxidase an Monoamin, durch Koppeln von Milchsäuredehydrogenase und Milchsäureoxidase an NADH in Gegenwart von Brenztraubensäure oder durch Koppeln von Superoxiddismutase an NADH in Gegenwart eines Elektronenträgers (z .B. Phenazinmethosulfat, 1- Methoxyphenazinmethosulfat oder 9-Dimethylaminobenzo-α- phenazoxoniumchlorid und dergleichen) (vgl. "Jap. J. Clin. Chem.", 15, 20 (1986)) erfolgen. Jegliche für diese Reaktionen benutzten Enzyme und Reagentien sind im Handel erhältlich. Die enzymatischen Reaktionen sind an sich bekannt und können nach üblichen bekannten Verfahren durchgeführt werden.
  • In der Praxis können 0,5 - 10 U/ml Monoaminoxidase oder 1 - 20 U/ml Milchsäuredehydrogenase, 0,1 - 5 U/ml Milchsäureoxidase und 0,1 - 5 mM Brenztraubensäure oder 10 - 100 U/ml Superoxiddismutase und 1 - 100 uM Phenazinmethosulfat verwendet werden.
  • Bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung verzweigtkettiger Aminosäuren sind folgende:
  • 1. Verfahren durch Koppeln von Valindecarboxylase an sämtliche verzweigtkettigen Aminosäuren und anschließend durch Koppeln von Monoaminoxidase;
  • 2. Verfahren durch Koppeln von Leucindehydrogenase in Gegenwart von Nicotinamidadenindinucleotid an sämtliche verzweigt kettigen Aminosäuren und anschließend durch gleichzeitiges Koppeln von Milchsäuredehydrogenase und Milchsäureoxidase in Gegenwart von Brenztraubensäure und
  • 3. Verfahren durch Koppeln von Leucindehydrogenase in Gegenwart von Nicotinamidadenindinucleotid an sämtliche verzweigtkettigen Aminosäuren und anschließend durch Koppeln von Superoxiddismutase in Gegenwart eines Elektronenträgers.
  • Vorzugsweise läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren durchführen, indem man Leucindehydrogenase in Gegenwart von NAD an verzweigtkettige Aminosäuren koppelt und danach zur Freisetzung von Wasserstoffperoxid an das gebildete NADH in Gegenwart von Brenztraubensäure Milchsäuredehydrogenase und Milchsäureoxidase koppelt.
  • Das gebildete Wasserstoffperoxid läßt sich in der zuvor beschriebenen Weise unter Verwendung des für den Nachweis von Wasserstoffperoxid bekannten Systems bestimmen.
  • In der Praxis erfolgt die erfindungsgemäße Bestimmung durch Zusatz einer Testprobe mit verzweigtkettigen Aminosäuren und einem angemessenen Volumen Wasser zu einer Enzymlösung, die Enzyme mit Spezifität für verzweigtkettige Aminosäuren, Enzyme zur Einführung von durch die Wirkung der betreffenden Enzyme gebildeten Metaboliten in ein System zur Freisetzung von Wasserstoffperoxid sowie Enzyme zum Nachweis des Wasserstoffperoxids enthält und deren pH-Wert mittels einer Pufferlösung auf 6 - 11, vorzugsweise 6 - 8 bei Verwendung von Valindecarboxylase und 7,5 - 9,5 bei Verwendung von Leucindehydrogenase, beträgt, bis zu einem festgelegten Volumen des Lösungsgemischs, 5- bis 10-minütiges Reagierenlassen des Gemischs bei 37ºC und anschließende spektralphotometrische Bestimmung. Erforderlichenfalls können die Enzymlösungen in Gruppen aufgeteilt und nach und nach zugegeben werden.
  • Als bei der genannten- Reaktion verwendbare Pufferlösung eignet sich jede Pufferlösung, die auf einen pH-Wert von 6 - 11 einstellbar ist, beispielsweise eine S rensen-Pufferlösung, eine McIlvaine-Pufferlösung, eine Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris)-Pufferlösung, eine Good-Pufferlösung, eine Kohlensäurepufferlösung, vorzugsweise Tris-Pufferlösung. Die Pufferlösung kann in einem Bereich von 10 - 200 mM verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäße selektive Bestimmung von Phenylalanin und/oder Tyrosin oder von verzweigtkettigen Aminosäuren läßt sich manuell unter Verwendung eines Spektralphotometers oder automatisch unter Verwendung eines Autoanalysators für biochemische Analysen durchführen. Vorzugsweise wird sie unter Verwendung eines Autoanalysators für biochemische Analysen durchgeführt. Dieser ermöglicht eine Bestimmung der optischen Dichte an zwei Punkten zur Ermittlung aromatischer Aminosäuren bzw. verzweigtkettiger Aminosäuren. Bei beiden Verfahren besteht das System zum Nachweis von Wasserstoffperoxid bei der Bestimmung von Phenylalanin und/oder Tyrosin, vorzugsweise aus demselben, wie es auch bei der Bestimmung verzweigtkettiger Aminosäuren benutzt wird.
  • Bei Verwendung eines Autoanalysators für biochemische Analysen kann man sich vorzugsweise eines Vorbehandlungssystems zur Entfernung störender Substanzen bedienen. So sollte beispielsweise zur Entfernung einer Wasserstoffperoxid liefernden störenden Substanz eine Testprobe in ein Peroxidase und TOOS enthaltendes Vorbehandlungssystem eingeführt werden. Zur Entfernung einer NADH in Gegenwart von NAD liefernden störenden Substanz sollte eine Testprobe in ein NAD und einen Elektronenträger, beispielsweise 1-Methoxyphenazinmethosulfat, enthaltendes Vorbehandlungssystem eingeführt werden. Zur Entfernung von Milchsäure als störender Substanz sollte eine Testprobe in ein Milchsäureoxidase, TOOS und Peroxidase enthaltendes Vorbehandlungssystem eingeführt werden.
  • Aus den Meßergebnissen für Phenylalanin und/oder Tyrosin und den verzweigtkettigen Aminosäuren läßt sich das Fischer'sche Verhältnis oder das Verhältnis Phenylalanin oder Tyrosin zu sämtlichen verzweigtkettigen Aminosäuren berechnen und zur Beurteilung des Grades an Leberschädigung und zur Überwachung der Aminosäuren bei der Therapie durch Aminosäureinfusion benutzen.
  • Unter Benutzung der erfindungsgemäßen Maßnahmen kann dem Kliniker auch ein vereinfachtes Verfahren zur halbquantitativen Analyse an die Hand gegeben werden, indem man die gewünschten Enzyme und Reagentien an eine feste Phase, wie Papier u.dgl., absorbiert und fixiert und danach darauf zur enzymatischen Reaktion eine Lösung der Testprobe appliziert.
    • 2. Beispiele
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen im Detail, beschränken jedoch nicht die vorliegende Erfindung.
    • Beispiel 1 Bestimmung aromatischer Aminosäuren, nämlich von Phenylalanin und/oder Tyrosin
  • Zu einer Enzymlösung mit 50 U/ml Apoenzym von Tyrosindecarboxylase (120 ul), 100 uM Pyridoxal-5-phosphat (50 ul), 10 U/ml Tyraminoxidase (100 ul), 20 U/ml Peroxidase (100 ul), 50 mM TOOS (60 ul) und 3 mM 4-Aminoantipyrin (100 ul) wurden nach Einstellung ihres pH-Werts durch Zugabe von 0,1 M McIlvaine- Pufferlösung (pH-Wert 6,0, 300 ul), auf 6 50 ul einer Testprobe mit Mischungen aus Phenylalanin und/oder Tyrosin in wechselnden Mengenanteilen (vgl. die folgende Tabelle) sowie weiterhin eine geeignete Menge Wasser zugegeben, um insgesamt 1 ml Lösungsgemisch zu erhalten. Das erhaltene Gemisch wurde 5 min lang bei 37ºC reagieren gelassen, worauf mittels eines Spektralphotometers die Farbintensität bei 546 nm gemessen wurde. Das Ergebnis ist in Fig. 1 dargestellt. Die Schnittstelle der y-Achse zeigt die Farbintensität von Wasser als Vergleichswert.
  • Aus der Figur geht hervor, daß für die Testproben mit Mischungen verschiedener Mengenanteile Phenylalanin und/oder Tyrosin eine nahezu gestreckte Eichkurve aufgestellt werden konnte. Daraus ergibt sich, daß für Testproben mit Mischungen beliebiger Mengenanteile an Phenylalanin und Tyrosin eine Gesamtmenge der einzelnen aromatischen Aminosäuren quantitativ bestimmt werden kann. Mengenanteile an aromatischen Aminosäuren in den Testproben Tyrosin (uM) Phenylalanin (uM) Insgesamt (uM)
    • Beispiel 2 Bestimmung verzweigtkettiger Aminosäuren
  • Zu einer Enzymlösung mit 80 U/ml Leucindehydrogenase (100 ul), 40 mM NAD (100 ul), 100 U/ml Milchsäuredehydrogenase (50 ul), 50 U/ml Milchsäureoxidase (50 ul), 10 mM Brenztraubensäure (100 ul), 20 U/ml Peroxidase (100 ul), 50 mM TOOS (100 ul) und 1 mM 4-Aminoantipyrin (100 ul) wurden nach Einstellen ihres pH-Werts durch Zugabe von 0,2 M Tris- (hydroxymethyl)-aminomethanpufferlösung (pH-Wert 7,5, 150 ul) auf 7,5 20 ul Testprobe mit Mischungen verschiedener Mengenanteile an verzweigtkettigen Aminosäuren (vgl. die folgende Tabelle) und weiterhin eine geeignete Menge Wasser zugegeben, um insgesamt 1 ml Lösungsgemisch zu erhalten. Das erhaltene Gemisch wurde 5 min lang bei 37ºC reagieren gelassen, worauf mit Hilfe eines Spektralphotometers die Farbintensität bei 546 nm gemessen wurde. Das Ergebnis ist in Fig. 2 dargestellt. Die Schnittstelle mit der y-Achse zeigt die Farbintensität von Wasser als Vergleichswert.
  • Aus der Figur geht hervor, daß für Testproben mit Mischungen verschiedener Mengenanteile an verzweigtkettigen Aminosäuren eine nahezu gestreckte Eichkurve aufgestellt werden konnte. Folglich läßt sich eine Gesamtmenge an verzweigtkettigen Aminosäuren bei Testproben mit einer Mischung verschiedener Anteile an verzweigtkettigen Aminosäuren quantitativ bestimmen. Mengenanteile an verzweigtkettigen Aminosäuren in Testproben Valin (uM) Leucin (uM) Isoleucin (uM) Insgesamt (uM)
    • Beispiel 3 Bestimmung von Phenylalanin und/oder Tyrosin im Serum
  • Unter Verwendung von Serum (50 ul) mit oder ohne Mischungen verschiedener Mengenanteile an Phenylalanin und/oder Tyrosin anstelle der in Beispiel 1 verwendeten Testproben wurden Phenylalanin und/oder Tyrosin nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Maßnahmen bestimmt. Danach wurde das Wiederauffindungsverhältnis ermittelt. Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle zusammengestellt. Zugabemenge Tyrosin (uM) Phenylalanin (uM) Insgesamt (uM) Meßwert (uM) Wiederauffindungsverhältnis (%)
  • Es wurden gute Ergebnisse, d.h. 102 - 105% beim Wiederauffindungsverhältnis, erzielt. Daraus ergibt sich, daß man selbst bei Verwendung von Serum als Probe sehr genau messen kann, ohne daß ein Einfluß anderer Komponenten feststellbar ist.
    • Beispiel 4 Bestimmung von Tyrosin und verzweigtkettigen Aminosäuren im Plasma (1) Bestimmung von Tyrosin
  • 0,1M McIlvaine-Pufferlösung (pH-Wert 6,0, 100 ml) mit 250 U Peroxidase und 0,375 mMol TOOS wurden als "erstes Reagens" zubereitet. Weiterhin wurde als "zweites Reagens" 0,1 M McIlvaine-Pufferlösung (pH-Wert 6,0, 25 ml) mit 56,3 U Apoenzym von Tyrosindecarboxylase, 1,25 uMol Pyridoxal-5-phosphat, 125 U Tyraminoxidase und 0,038 mMol 4-Aminoantipyrin zubereitet.
  • Die Bestimmung erfolgte mit einem Autoanalysator für biochemische Analysen (Hitachi, Modell 705) unter Verwendung von 10 ul Plasma als Probe, 400 ul des ersten Reagenses und 100 ul des zweiten Reagenses. Das erste Reagens wurde zu der Probe zugegeben, worauf das Gemisch 5 min lang bei 37ºC reagieren gelassen wurde. Danach erfolgte die Zugabe des zweiten Reagenses. Das nunmehr erhaltene Gemisch wurde weitere 5 min lang bei 37ºC reagieren gelassen. Schließlich wurde die Farbintensität nach der Endpunktmethode bei 546 nm gemessen.
    • (2) Bestimmung verzweigtkettiger Aminosäuren
  • 50 mM Tris-Pufferlösung (pH-Wert 7,5, 100 ml) mit 313 U Milchsäureoxidase, 0,125 mM TOOS und 250 U Peroxidase wurden als "erstes Reagens" zubereitet. Als "zweites Reagens" wurden 50 mM Tris-Pufferlösung (pH-Wert 7,5, 25 ml) mit 938 U Leucindehydrogenase, 0,5 mMol NAD, 0,13 mMol Brenztraubensäure, 625 U Milchsäuredehydrogenase und 0,038 mMol 4-Aminoantipyrin zubereitet.
  • Die Messung erfolgte in entsprechender Weise wie für Tyrosin beschrieben durchgeführt, wobei jedoch 5 ul Plasma als Probe verwendet wurden.
    • (3) Beziehung zwischen dem Verhältnis Tyrosin/verzweigtkettige Aminosäuren, ermittelt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, und dem Fischer'schen Verhältnis, bestimmt mittels eines Aminosäureanalysators (Vergleichswert)
  • Nach den geschilderten Verfahren wurden unter Verwendung von 67 Testproben (Humanplasma) Tyrosin und verzweigtkettige Aminosäuren bestimmt. Danach wurde das Verhältnis (verzweigtkettige Aminosäuren/Tyrosin) ermittelt. Hierauf wurde unter Verwendung derselben 67 Testproben einzelne Aminosäuren mit Hilfe eines Aminosäureanalysators (Hitachi, Modell 835; zu Plasma wurde dasselbe Volumen 10%iger Sulfosalicylsäure zugegeben, worauf das Gemisch 30 min lang stehengelassen wurde. Nach dem Zentrifugieren des Gemischs wurde die gebildete überstehende Flüssigkeit als Testprobe verwendet. Der Nachweis erfolgte durch Markieren mit o-Phthalaldehyd und Bestimmen bei 348 nm bezüglich einer Anregung und 450 nm bezüglich einer Emission mittels eines Fluoreszenzdetektors) bestimmt. Danach wurde das Fischer'sche Verhältnis (verzweigtkettige Aminosäuren/Tyrosin + Phenylalanin) bestimmt. Die Beziehung zwischen dem Verhältnis Tyrosin/verzweigtkettige Aminosäuren (erfindungsgemäß bestimmt) und dem Fischer'schen Verhältnis ergibt sich aus Fig. 3.
  • Y = 2.123X - 0.222
  • Korrelationskoeffizient: Y = 0,936
  • Dieser Wert zeigt, daß die Korrelation zwischen den beiden Verhältnissen ausgezeichnet ist. Daraus ergibt sich, daß das Verhältnis Tyrosin/verzweigtkettige Aminosäuren anstelle des Fischer'schen Verhältnisses zum Zwecke der Erfindung benutzt werden kann.
    • 3. Effekt
  • Die vorliegende Erfindung betrifft hervorragende Verfahren zur Bestimmung von Aminosäuren, die eine selektive und rasche Bestimmung der aromatischen Aminosäuren Phenylalanin und/oder Tyrosin sowie verzweigtkettiger Aminosäuren mit hoher Genauigkeit und in einem für den praktischen Gebrauch geeigneten Bereich gestatten. Bei Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, das Verhältnis sämtlicher oder einzelner der genannten aromatischen Aminosäuren zu verzweigtkettigen Aminosäuren in einer Probe zu bestimmen. Dieses kann dazu herangezogen werden, den Grad an Leberschädigung abzuschätzen und eine Aminosäureüberwachung bei der Therapie mittels Aminosäureinfusion durchzuführen.

Claims (8)

1. Verfahren zur selektiven Bestimmung von Phenylalanin und/oder Tyrosin oder einer verzweigtkettigen Aminosäure durch Kuppeln von Phenylalanin-4-monooxygenase und Tyrosindecarboxylase und/oder für Phenylalanin und/oder Tyrosin spezifische Phenylalanindecarboxylase und/oder Tyrosindecarboxylase und anschließendes Kuppeln von Tyraminoxidase zur Bildung von Wasserstoffperoxid oder durch Kuppeln von für verzweigtkettige Aminosäuren spezifischer Leucindehydrogenase und anschließendes Kuppeln von Milchsäuredehydrogenase und Milchsäureoxidase zur Bildung von Wasserstoffperoxid und anschließendes Ausmessen des jeweiligen Wasserstoffperoxids.
2. Verfahren zur selektiven Bestimmung nach Anspruch 1 zur Ermittlung von Phenylalanin und Tyrosin in einer Probe durch Kuppeln von für Phenylalanin und Tyrosin spezifischer Tyrosindecarboxylase oder durch sukzessives Kuppeln von Phenylalanin-4-monooxygenase und Tyrosindecarboxylase oder von für Phenylalanin oder Tyrosin spezifischer Phenylalanindecarboxylase und Tyrosindecarboxylase und anschließendes Kuppeln von Tyraminoxidase zur Bildung von Wasserstoffperoxid zur Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids.
3. Verfahren zur selektiven Bestimmung nach Anspruch 1 zur Ermittlung von Phenylalanin oder Tyrosin in einer Probe durch Kuppeln von für Phenylalanin oder Tyrosin alleine spezifischer Phenylalanindecarboxylase oder Tyrosindecarboxylase und anschließendes Kuppeln von Tyraminoxidase zur Bildung von Wasserstoffperoxid zur Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids.
4. Verfahren zur selektiven Bestimmung nach Anspruch 2 zur Ermittlung von Phenylalanin und Tyrosin in einer Probe durch gleichzeitiges Kuppeln von Phenylalanindecarboxylase und Tyrosindecarboxylase an Phenylalanin und Tyrosin und sukzessives Kuppeln von Tyraminoxidase und anschließende Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids.
5. Verfahren zur selektiven Bestimmung nach Anspruch 2 zur Ermittlung von Phenylalanin und Tyrosin in einer Probe durch gleichzeitiges Kuppeln von Phenylalanin-4-monooxygenase in Gegenwart von 6-Methyl-5,6,7,8-tetrahydropteridin und Tyrosindecarboxylase an Phenylalanin und Tyrosin und sukzessives Kuppeln von Tyraminoxidase und anschließende Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids.
6. Verfahren zur selektiven Bestimmung nach Anspruch 2 zur Ermittlung von Phenylalanin und Tyrosin in einer Probe durch sukzessives Kuppeln von Tyrosindecarboxylase in einer Endkonzentration von 1 - 20 U/ml und Tyraminoxydase an Phenylalanin und Tyrosin und anschließende Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids.
7. Verfahren zur selektiven Bestimmung nach Anspruch 3 zur Ermittlung von Phenylalanin in einer Probe durch sukzessives Kuppeln von Phenylalanindecarboxylase und Tyraminoxidase an Phenylalanin und anschließende Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids.
8. Verfahren zur selektiven Bestimmung nach Anspruch 3 zur Ermittlung von Tyrosin in einer Probe durch sukzessives Kuppeln von Tyrosindecarboxylase und Tyraminoxidase an Tyrosin und anschließende Bestimmung des gebildeten Wasserstoffperoxids.
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