JPS63226299A - アミノ酸の選択的定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はアミノ酸の選択的定量法に関する。

さらに詳しく述べると、試料に芳香族アミノ酸又は分枝
鎖アミノ酸に特異性のある酵素を含む複数の酵素を共役
させて過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を測定する
ことを特徴とする芳＠族アミノ酸又は分枝鎖アミノ酸の
選択的定量法に関する。

［発明の背景］ 肝機能低下管の肝疾患においては、各種アミノ酸の生成
能、利用能に異常をきたし、芳香族アミノ酸が血中に異
常蓄積され芳香族アミノ酸と分枝鎖アミノ酸の血中での
比率［以下、フィッシャー　（ＦｉＳＣｈｅｒ　）比と
いう。］が健常時に比べ大きく変化することが近年わか
ってきた。さらにフィッシャー比を測定することにより
、肝疾患の重症度が判定できることが報告されている「
フイランｖ　−（ｒｉｓｃｈｅｒ　Ｊ、Ｅ、　）等、サ
ージエリ−（ＳｕｒｇｅｒＶ　）、、８０巻、７７ペー
ジ（１９７６年）］。

またアミノ酸異常に基づく肝性昏睡においては、アミノ
酸輸液療法が行なわれるようになってきた。

上記の肝疾患の重症度の判定やアミノ酸輸液療法のモニ
ターでは、フィッシャー比を測定することは必須の項目
であり、その重要性はますます高まりつつある。

［従来の技術］ 従来、実用化されているアミノ酸定量方法としては高速
液体クロマトグラフィーを利用したアミノ酸分析機があ
るだけである。これによると個々のアミノ酸の定量は行
なえるが、機器が高価であるうえ、測定に要する時間が
長い等の欠点があるため日常検査を行なっている臨床病
院ではほとんど利用されておらず、もっばら研究的施設
で使用されているのが現状である。

アミノ酸の酵素的定量法も種々の方法が知られている。

例えば、０分枝鎖アミノ酸にニコヂンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（以下、ＮＡＤと略記する。）存在下、ロ
イシンデヒドログナーセを作用させ、生成した還元型Ｎ
ＡＤを紫外部３４００…で測定する方法、■各種アミノ
酸にデカルボキシラーゼを作用させ生成した炭酸ガスを
マノメトリックに測定するか、あるいは生成したモノア
ミンを呈色させて測定する方法、■アミノ酸にアミノ酸
オキシダーゼを作用させ生成する過酸化水素を測定する
方法［以上の方法はメソッズ・オブ・エンザイマテイッ
ク・アナリシス（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆＥｎｚｙｍａｔ
ｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　）　、第２版、第４巻、　１
６６２ページ及び１６６９ページ（１９７４年）及び同
、第３版。

第８巻、３１８ページ（１９８５年）、アカデミツク・
プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）発行に記載さ
れている。］及び■フェニルアラニン及びチロシンにフ
ェニルアラニンアンモニアリアーゼを作用させ、それぞ
れシンナメイト及びクマレイトに変換して紫外部２９０
〜３１５ｎｍで測定する方法［サイエンス（Ｓｃｉｅｎ
ｃｅ　）　、　１９７巻、６６５ページ（１９７７年）
に記載されている。］が知られている。

しかしながら、これらの方法はいずれも欠点を有する。

すなわち、前記■法及び■法は生体試料中のタン白質の
紫外吸収の影響を大きく受り精度が劣るうえ、検出感度
が実用に供するには不充分である。■法のマノメトリッ
クな測定は感度は十分ではあるが、特殊な機器を必要と
し、しかも操作が煩雑である。また■法は用いる酵素に
アミノ酸による特異性がなく、芳香族アミノ酸と分枝鎖
アミノ酸を選択的に定量することは不可能である。

このように酵素的定量法として種々の方法が提案されて
いるが、いずれも問題点がありまだ実用に供せられてい
ないのが現状である。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、実用可能な＠度及び範囲で迅速に芳香族
アミノ酸又は分枝鎖アミノ酸を選択的に定量する方法に
ついて鋭意検討を重ねた結果、芳香族アミノ酸又は分枝
鎖アミノ酸に特異的に反応する（特異性の高い）酵素を
用いて反応させた後、過酸化水素検出系へ導くことによ
り目的が達成されることを見い出し、本発明を完成した
。

さらに研究を重ねた結果、フェニルアラニンと分枝鎖ア
ミノ酸との比率又はチロシンと分枝鎖アミノ酸との比率
は、フィッシャー比とよく相関しており、従って、フィ
ッシャー比の代わりとして肝疾患の重症度の判定やアミ
ノ酸輸液療法のモニターに用いられることが明らかにな
った。

本発明の定量法は今までまったく試みられておらず、今
回実験によって初めて確認されたものである。

［発明の構成］ すなわち、本発明は試料に、芳香族アミノ酸又は分枝鎖
アミノ酸に特異性のある酵素を含む複数の酵素を共役さ
せて過酸化水素を生成させ、該過酸化水素を測定するこ
とを特徴とする芳香族アミノ酸又は分枝鎖アミノ酸の選
択的定量法である。

本発明において、芳香族アミノ酸としてはチロシン及び
フェニルアラニンが含まれ、分枝鎖アミノ酸としてはバ
リン、ロイシン及びイソロイシンが挙げられる。測定試
料としては、上記アミノ酸を含有するものであれば何で
もよいが、好ましくは血清、血漿、尿等の生体試料ある
いはアミノ酸輸液などである。本発明では試料中の除蛋
白操作は不要であるが、スルフオサリチル酸、三塩化酢
酸、ピクリン酸、過塩素酸、タングステン酸等で除蛋白
したのち、ｌ）Ｈを中性にもどしたものも試料として供
することができる。

本発明は、（１）（ａ）すべての芳香族アミノ酸、すな
わちチロシン及びフェニルアラニンに特異性のある酵素
を反応させるか、又は各々の芳香族アミノ酸に特異性の
ある酵素を連続的に反応させ、しかる後に生成物を過酸
化水素系へ導き、生成した過酸化水素を定量して試料中
の全芳香族アミノ酸量を測定するか、又は（ｂ）フェニ
ルアラニン又はチロシンに特異性のある酵素を単独で反
応させ、しかる後に生成物を過酸化水素発生系へ導き、
生成した過酸化水素を定量して試料中のフェニルアラニ
ン量又はチロシン量を測定するか、あるいは（２）すべ
ての分枝鎖アミノ酸、すなわちバリン、ロイシン及びイ
ンロイシンに特異性のある酵素を反応させるか又は各々
の分枝鎖アミノ酸に特異性のある酵素を連続的に反応さ
せ、しかる後に生成物を過酸化水素発生系へ導き、生成
した過酸化水素を定量して試料中の仝分枝鎖アミノ酸量
を測定する方法に関するものである。

以下に、代表的酵素反応を示し本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらに限定されるものではない。

まず芳香族アミノ酸の測定法を以下の模式図に示す。

一　　１３　− 各々の芳香族アミノ酸に特異性のある酵素としては、フ
ェニルアラニンに特異性のおるフェニルアラニンデカル
ボキシラーゼ及びフェニルアラニン４−モノオキシゲナ
ーゼ、及びチロシンに特異性のあるチロシンデカルボキ
シラーゼ及びβ−チロシナーゼが挙げられる。さらにチ
ロシンデカルボキシラーゼは高濃度ではフェニルアラニ
ンにも作用することが知られている。

各酵素はいかなる生物に由来するものでもよいが、例え
ばフェニルアラニンデカルボキシラーゼはストレプトコ
ッカス　ファエ力リス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　
ｆａｅｃａｌｉｓ）より調製され、フェニルアラニン　
４−モノオキシゲナーゼはラットの肝１ｉｊｉ　（Ｊ、
Ｂｉｏｌ、　ｃｈｅｍ、、−η１５．４７４５　（１９
７０）参照のこと）やシュードモナス（ＰＳｅｕｄＯｍ
ＯｎａＳ　、　Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、２５０．６６７２　（１９７
０）参照のこと）より抽出精製される。この４−モノオ
キシゲナーゼは６−メチル−５，６，７，８−テトラヒ
ドロプテリジン存在下、定量的にフェニルアラニンをチ
ロシンに変換する。またチロシンデ力ルポキシラ−ゼと
してはストレプトコッカス　ファＴカリスのアセトン乾
燥菌体より破砕抽出、分子篩等で精製したチロシンデカ
ルボキシラーゼのアポ酵素が用いられ、これをピリドキ
サール５−リン酸存在下に作用させてチラミンに変換す
る。もちろん、同酵素のホロ酵素を用いる場合にはピリ
ドキサール−５−リン酸は不要である。ざらにβ−チロ
シナーゼはニジエリシア　インターメディア（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ、　Ｊ、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、。

２４５、１７６７及び１７７３　　（１９７０）参照の
こと）より精製される。

これらの酵素を任意に組合わせて作用させ、試料中のす
べての芳香族アミノ酸をβ−フェニルエチルアミン、チ
ラミン及び／又はピルビン酸に導くか、又はこれらの酵
素を単独で作用させ、試料中のフェニルアラニン又はチ
ロシンをβ−フェニルエチルアミン、チラミン又はピル
ビン酸に導く。

好ましくは、■フェニルアラニンデカルボキシラーゼ０
．１〜５υ／ｍｌ（最終濃度を意味する。以下同じ）と
チロシンデカルボキシラーゼ０．１〜２　Ｕ／ｄ（アポ
酵素を用いる場合はアポ酵素０．１〜２１／戒とピリド
′キサール−５−リンＭ１μＭ〜１［丁１Ｍ）を組合わ
せて作用させ、フェニルアラニン及びチロシンをそれぞ
れβ−フェニルエチルアミン及びチラミンに変換するか
、又は■フェニルアラニンー４−モノオキシゲナーゼ０
．１〜５１／７２（６−メチル−５，６，７，８−テト
ラヒドロプテリジン１０μＭ〜１ｍＭ存在下）とチロシ
ンデカルボキシラーゼ０．１〜２Ｕ／ｍｌ（アポ酵素を
用いる場合は前記に同じ。）を組合わせて作用させ、フ
ェニルアラニン及びチロシンをともにチラミンに変換す
るか、又は■フェニルアラニンー４−モノオキシゲナー
ゼ０．１〜５０／ｄ（６−メチル−５＋　６　＋　７　
＋８−テトラヒドロプテリジン１０μＭ〜１ｍＭ存在下
）とβ−チロシナーゼ０．１〜５　（＋／ｍ！！を組合
わせて作用させ、フェニルアラニン及びチロシンをとも
にピルビン酸に変換するか、又は■チロシンデカルボキ
シラーゼを■で用いる場合の１０〜５０倍（アポ酵素を
用いる場合も１０〜５０倍）、好ましくは最終濃度で１
〜２０１／威作用させ、チロジンとともにフェニルアラ
ニンを同時にそれぞれチラミンとβ−フェニルエチルア
ミンに変換するか、又は■フェニルアラニンデカルボキ
シラーゼ０．１〜５　Ｕ／ｄを作用させ、フェニルアラ
ニンをβ−フェニルエチルアミンに変換するか、又は■
チロシンデカルボキシラーゼ０．１〜２Ｕ／ｍｌ（アポ
酵素を用いる場合は前記に同じ。）を作用させるか又は
β−チロシナーゼ０．１〜５　Ｕ／威を作用させ、チロ
シンをチラミン又はピルビン酸に変換する方法が挙げら
れる。上記■〜■の方法は試料中の全芳香族アミノ酸を
測定するためのもので必り、■の方法はフェニルアラニ
ンのみを測定するためのものであり、■の方法はチロシ
ンのみを測定するためのものである。より好ましいのは
経済性及び簡素化の点で■又は■の方法である。

次に、芳香族アミノ酸の代謝物を過酸化水素発生系へ導
く方法としては、β−フェニルエチルアミン及び／又は
チラミンにチラミンオキシダーゼを作用させる方法（チ
ラミンオキシダーゼはチラミンだけでなくβ−フェニル
エチルアミンにも作用し過酸化水素を発生させる。）、
ピルビン酸にチアミンピロフォスフェート及びフラビン
アデニンジヌクレオチド存在下、ピルビン酸オキシダー
ゼを作用させる方法、及びピルビン酸にＮＡＤＩ−１（
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）存在下
、乳酸デヒドロゲナーゼと乳酸オキシダーゼを作用させ
る方法等がある。これらの反応に用いる酵素及び試薬は
いずれも市販されている。

用いる酵素量は、チラミンオキシダーゼを用いる場合に
は、同酵素０．１〜５　Ｕ／ｍｉｌ、ピルビン酸オキシ
ダーゼを用いる場合には、同酵素１〜２０υ／威、チア
ミンピロフォスフェート０．１〜１ｍＭ及びフラビンア
デニンジヌクレオチド１μＭ〜０．１ｍ１ｖ’ｌ、ざら
に乳酸デヒドロゲナーゼと乳酸オキシダーゼを用いる場
合には、乳酸デヒドロゲナーゼ１〜２０ｕ／ｍ１、乳酸
オキシダーゼＯ５１〜５Ｕ／威及びＮＡＤＨ０，１〜１
ｍＭが適当である。

本発明の芳香族アミノ酸定量方法のうち、好ましい方法
としては、 （１）すべての芳香族アミノ酸にフェニルアラニンデカ
ルポキシラーゼとチロシンデカルボキシラーゼを組合わ
せて作用させ、しかる後にチラミンオキシダーゼを作用
させる方法、 （２）すべての芳香族アミノ酸に６−メチル−５，６，
７，８−テトラヒドロプテリジン存在下、フェニルアラ
ニン−４−モノオキシゲナーゼとチロシンデカルボキシ
ラーゼを組合わせて作用させ、しかる後にチラミンオキ
シダーゼを作用させる方法、 （３）すべての芳香族アミノ酸に６−メチル−５，６，
７，８−テトラヒドロプテリジン存在下、。

フェニルアラニン−４−モノオキシゲナーゼとβ−チロ
シナーゼを組合わせて作用させ、しかる後にチアミンピ
ロフォスフェート及びフラビンアデニンジヌクレオチド
存在下、ピルビン酸オキシダーゼを作用させる方法、 （４〉すべでの芳香族アミノ酸に６−メチル＝５．６，
７．８−テトラヒドロプテリジン存在下、フェニルアラ
ニン−４−モノオキシゲナーゼとβ−チロシナーゼを組
合わせて作用させ、しかる後に還元型口」チンアミドア
ゾ゛ニンジヌクレオチド存在下、乳酸デヒドロゲナーゼ
と乳酸オキシダーゼを組合わせて作用させる方法、 （５）すべての芳香族アミノ酸に最終濃度１〜２０Ｕ／
ｄのチロシンデカルボキシラーゼを作用させ、しかる後
にチラミンオキシダーゼを作用させる方法、 （６）フェニルアラニンにフェニルアラニンデカルボキ
シラーゼを作用させ、しかる後にチラミンオキシダーゼ
を作用させる方法、 （７）チロシンにチロシンデカルボキシラーセを作用さ
せ、しかる後にヂラミンオキシダーレを作用させる方法
、 （８）チロシンにβ−チロシナーゼを作用させ、しかる
後にチアミンピロフォスフェート及びフラビンアデニン
ジクレオチド存在下、ピルビン酸オキシダーゼを作用さ
せる方法、及び （９）チロシンにβ−チロシナーゼを作用させ、しかる
後に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド存在
下、乳酸デヒドロゲナーゼと乳酸オキシダーゼを組合せ
て作用させる方法が挙げられる。

より好ましい方法は、すべての芳香族アミノ酸に最終濃
度１〜２０Ｕ／７！のチロシンデカルボキシラーゼを作
用させ、生成したチラミン及びβ−フェニルエチルアミ
ンにチラミンオキシダーゼを作用させ過酸化水素を発生
させる系、及びチロシンにチロシンデカルボキシラーゼ
を作用させ、生成したチラミンにチラミンオキシダーゼ
を作用させ過酸化水素を発生させる系である。

生成した過酸化水素は公知の過酸化水素検出系を用いて
測定される。代表的な系としては、パーオキシダーゼの
存在下に、色原体として４−アミノアンチピリン又は３
−メチル−２−ベンゾチアゾリノン−ヒドラゾン・塩酸
塩とアニリン、アニシジン又はトルイジンの誘導体［例
えば、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−ｍ−トルイジン（以下、ＴＯＯ８と略記す
る。）］との酸化縮合体を用いた系がある。酸素反応は
公知の方法により行なわれる。

実際的には本発明は芳香族アミノ酸に特異性のおる酵素
類、該酵素による生成物を過酸化水素発生系へ導く酵素
類及び生成した過酸化水素を検出するための酵素類を含
み、緩衝液にてｐＨ４〜Ｂ、好ましくはｐｌ（５，５〜
６に調整された酵素液に芳香族アミノ酸を含む試料と適
量の水を加えて一定量の混合液を得、これを３７°Ｃで
５〜１０分間反応させた後、分光光度計にて測定するこ
とにより行なわれる。必要により、酵素液類はいくつか
の群に分けて順次加えてもよい。

上記反応に用いる緩衝液としては、ｐＨ４〜８に調整で
きるものなら何でもよいが、例えば酢酸緩衝液、クエン
酸緩衝液、ゼレンゼン（Ｓφｒｅｎｓｅｎ　）緩衝液、
マツタイルパイン（Ｈｃｒｌｖａｉｎｅ　）緩衝液、グ
ツド（Ｇｏｏｄ　）緩衝液等が挙げられ、好ましくはマ
ツタイルパイン緩衝液である。緩衝液は１０〜２００ｍ
Ｍの範囲の）農度で用いられる。

次に分枝鎖アミノ酸の定硲法を以下の模式図に示す。

−９つ 分枝鎖アミノ酸に特異性のある酵素としては、すべての
分枝鎖アミノ酸、すなわちバリン、ロイシン及びイソロ
イシンに特異性のあるバリンデカルボキシラーゼ（別名
ロイシンデ゛カルボキシラーゼ）及びロイシンデヒドロ
ゲナーゼが挙げられる。

各酵素はいかなる生物に由来するものでもよいが、例え
ばバリンデカルボキシラーゼはプロチラノ　ブルガリス
（ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ、　Ｊ　、Ｇｅｒ
。

Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１７．　６０２（１９５７）
参照のこと）より精製され、またロイシンデヒドロゲナ
ーゼは／’＜−）／Ｌ／２　　スファエリカス（ＢａＣ
ｉｌｌＬＩＳ　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓ　。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５３．５７１９　（
１９７８）参照のこと）より精製される。バリンデカル
ボキシラーゼは（同酵素がアポ酵素の場合にはピリドキ
サール−５−リン酸存在下に）分枝鎖アミノ酸を定量的
にモノアミンに変換する。ロイシンデヒドロゲーゼは分
枝鎖アミノ酸に作用し、共役させたＮＡＤを定路的にＮ
ＡＤＨに変換させる。

用いる酵素量としては、バリンデカルボキシラーゼを用
いる場合には、同酵素０．１〜５０／ｍｌ（同酵素がア
ポ酵素の場合にはピリドキサール−５−リン酸１μＭ〜
１ｍＭ存在下）、またロイシンデヒドロゲナーゼを用い
る場合には、同酵素１〜２０　Ｕ／ｍＩ！及びＮＡＤ１
〜２０ｍＭが適当である。

次に、生成したモノアミン又はＮＡＤＨを過酸化水素発
生系へ導く方法としては、モノアミンにモノアミンオキ
シダーゼを作用させる方法、ＮＡＤＨにピルビン酸存在
下、乳酸デヒドロゲナーゼ及び乳酸オキシダーゼを作用
させる方法、及びＮＡＤＨに電子伝達体（例えば、フェ
ナジンメトサルフェート、１−メトキシフェナジンメト
サルフェート、９−ジメチルアミノベンゾ−α−フエナ
ゾキンニウムクロリド等）存在下、スーパーオキシドジ
スムターゼを作用させる方法等がある（臨床化学、旦、
　２０　（１９８６）参照のこと）。これらの反応に用
いる酵素及び試薬はいずれも市販されており、反応自体
もよく知られているので、通常の方法に従って行なうこ
とができる。

用いる酵素量は、モノアミンオキシダーゼを用いる場合
には、同酵素０．５〜１０Ｕ／ｍｌ、乳酸デヒトロゲナ
ーゼと乳酸オキシダーゼを用いる場合には、乳酸デヒド
ロゲナーゼ１〜２０Ｕ／ｄ、乳酸オキシダーゼ０．１〜
５　Ｕｌｄｌ及びピルビン酸０．１〜５ｍＭ１またスー
パーオキシドジスムターゼを用いる場合には、同酵素１
０〜１００１／威及びフェナジンメトサルフェート１〜
１００μＭか適当である。

本発明の分枝鎖アミノ酸定量方法のうち、好ましい方法
としては、 （１）すべての分枝鎖アミノ酸にバリンデカルボキシラ
ーゼを作用させ、しかる後にモノアミンオキシダーゼを
作用させる方法、 （２）すべての分枝鎖アミノ酸に二ロヂンアミドアデ゛
ニンジヌクレオヂド存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼ
を作用させ、しかる後にピルビン酸存在下、乳酸デヒド
ロゲナーし及び乳酸オキシダーゼを組合わせて作用させ
る方法、及び（３）すべての分枝鎖アミノ酸にニコチン
アミドアデニンジヌクレオチド存在下、ロイシンデヒド
ロゲナーゼを作用させ、しかる後に電子伝達体存在下、
スーパーオキシドジスムターゼを作用させる方法が挙げ
られる。

より好ましい方法は分枝鎖アミノ酸にＮＡＤ存在下、ロ
イシンデヒドロゲナーゼを作用させ、生成したＮＡＤＨ
にピルビン酸存在下、乳酸デヒドロゲナーゼと乳酸オキ
シダーゼを作用させ過酸化水素を発生させる系である。

生成した過酸化水素は前記した公知の過酸化水素検出系
を用いて測定される。

実際的には本発明は分枝鎖アミノ酸に特異性のある酵素
類、該酵素による生成物を過酸化水素発生系へ導く酵素
類及び生成した過酸化水素を検出するための酵素類を含
み、緩衝液にてｐＨ６〜１１、好ましくはバリンデカル
ボキシラーゼを用いる場合はＤＨ６〜８、ロイシンデヒ
ドロゲナーゼを用いる場合はＩ）Ｈ７，５〜９，５に調
整し、ここへ分枝鎖アミノ酸を含む試料と適量の水を加
えて一定量の反応混液を得、これを３５℃で５〜１０分
間反応させた後、分光光度計にて判定することにより行
なわれる。必要により、酵素液類はいく　２７　一 つかの群に分けて順次加えてもよい。

上記反応に用いる緩衝液としては、ｐＨ６〜１１に調整
できるものなら何でもよいか、例えばゼレンゼン緩衝液
、マツクイルパイン緩衝液、グツド緩衝液、炭酸緩衝液
等が挙げられ、好ましくはトリス緩衝液である。緩衝液
は１０〜２００ｍＭの範囲の濃度で用いられる。

本発明の芳香族アミノ酸及び分枝鎖アミノ酸の選択的定
量法による測定は、分光光度計を用いた用手法でも、あ
るいは通常の生化学検査用自動分析機でも行なわれるが
、より好ましくは反応を芳香族系と分枝鎖系の２段階に
分けてそれぞれの時点で反応液の吸光度測定が可能な生
化学検査用自動分析機を用いて行なわれる。いずれの場
合も、芳香族アミノ酸の定量と分枝鎖アミノ酸の定量で
同じ過酸化水素検出系を用いることか好ましい。

さらに、生化学検査用自動分析機を用いる場合には、干
渉物質を除去するために前処理系を組込むことが好まし
い。例えば、過酸化水素を発生する干渉物質を除去する
には、試料をパーオキシダ一ゼとＴＯＯ３からなる前処
理系へ導き、ＮＡＤ存在下、ＮＡＤＨを生成する干渉物
質を除去するには、試料をＮＡＤと電子伝達体（例えば
、１−メトキシフェナジンメトサルフェート）からなる
前処理系へ導き、また干渉物質としての乳酸を除去する
には、試料を乳酸オキシダーゼ、ＴＯＯ８及びパーオキ
シダーゼからなる前処理系へ導くことにより行なわれる
。

こうして定量された芳香族アミノ酸量と分枝鎖アミノ酸
量からフィッシャー比又は個々の芳香族アミノ酸と全分
枝鎖アミノ酸との比率を求めることができ、これにより
肝疾患の重症度の判定やアミノ酸輸液療法のモニターに
利用することができる。

また、本発明方法を用いて、ペーパー等の同相面に必要
な酵素類及び試薬類を吸着、固定させ、試料を塗布し反
応させる簡易テスト法も半定量法として臨床分野に応用
可能である。

［実施例］ 以下に実施例を示し本発明をさらに詳細に説明するが、
本発明はこれらの実施例によって限定されるものではな
い。

実施例１ 芳香族アミノ酸の定量 ５０１／ｍｆｆチロシンデカルボキシラーゼのアポ酵素
１２０μル、１００μＭピリドキサール５−リン１５０
μ力、１０１Ｕ／ｍｌチラミンオキシダーゼ１００μカ
、２０　ｔＪ／ｄパーオキシダーゼ１００μ、６．５０
ｍＭ　　ＴＯＯ８６０μ、＆、３ｍＭ４−アミノアンチ
ピリン１０’Ｏμルを含み、０．１Ｍマツタイルパイン
緩衝液（ｐＨ６，０）３００μカにてｐＨ６に調整され
た酵素液に、下記の表に示す組成を有する芳香族アミノ
酸試料５０μルを加え、さらに水を加えて全量をｌｄと
した。得られた混合液３７°Ｃで５分間反応させた後、
分光光度計にて波長５４６ｎｍで発色強度を測定した。

結果を第１図に示す。ｙ輪切片は水を対照としたときの
発色強度である。

図かられかるように、種々の組成の芳香族アミノ酸試料
に対してほぼ直線的な検量線が得られた。

このことからいかなる組成の芳香族アミノ酸を含む試料
についても、その全量を定量的に測定できることがわか
る。

試料中の芳香族アミノ酸の組成 実施例２ 分枝鎖アミノ酸の定量 ８０　Ｕ／ｄロイシンデヒドロゲナーゼ１００μカ、４
０ｍＭ　　ＮＡＤ１００μ、＆、１０００／ｍ１乳酸デ
ヒドロゲナーゼ５０μ力、５００／威乳酸オキシダーゼ
５０μカ、１０ｍＭピルビン酸１００μ必、２０１／威
パーオキシダーゼ１００μ必、５０ｍＭ　　丁００８１
００ｕＪｂ、１ｍＭ４−アミノアンチピリン１００μル
を含み、０．２Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７，５＞　１５０
μカにてｐｉ−（７，５に調整された酵素液に、下記の
表に示す組成を有する分枝鎖アミノ酸試料２０μカを加
え、さらに水を加えて全量を１ｄとした。１■られた混
合液を３７℃で５分間反応させた後、分光光度ｈ］にて
波長５４６ｎｍで発色強度を測定した。結果を第２図に
示す。ｙ輪切片は水を対照としたときの発色強度である
。

図かられかるように、種々の組成の分枝鎖アミノ酸試料
に対してほぼ直線的な検量線が得られた。

このことからいかなる組成の分枝鎖アミノ酸を含む試料
についてもその全量を定量的に測定できることがわかる
。

−ワ０− 試料中の分枝鎖アミノ酸の組成 実施例３ 血清中の芳香族アミノ酸の定量 実施例１で用いた芳香族アミノ酸試料の代わりに血清あ
るいは種々の組成の芳香族アミノ酸試−、ｊＺ　　　− 料を添加した血清５０μ必を用いて実施例１と同様にし
て測定し、添加回収率を求めた。結果を下表に示す。

添加回収率１０２〜１０５％と良好な結果が１ｑられ、
血清を試料とした場合でも血清中の他の成分の影響を受
けずに十分測定可能であることがわかる。

実施例４ 血漿中のチロシン及び分枝鎖アミノ酸の定量（１）チロ
シンの定量 第１試薬として、２５０Ｕのパーオキシダーゼ及び０．
３７５ｍｍ０　ｌ　ｅのＴＯＯ３を含む０．１Ｍマツク
イルパイン緩衝液（ｐＩ−（６，０＞　１００ｙｄを調
製した。また第２試薬として、５６．３Ｕのチロシンデ
カルボキシラーゼのアポ酵素、１．２５μｍｏｌｅのピ
リドキサール５−リン酸、１２５Ｕのチラミンオキシダ
ーセ及び０．０３８ｍｍ０　ｌ　ｅの４−アミノアンチ
ピリンを含む０．１Ｍマツタイルパイン緩衝液（ＤＨ６
，０＞　２５ｍ１を調製した。

測定は生化学検査用自動分析機（日立製作所製！、７０
５型）を用いて行ない、サンプルとしての血漿を１０μ
ル、第１試薬を４００μ必及び第２試薬を１００μカに
設定し、まずサンプルに第１試薬を加えて３７°Ｃで５
分間反応させ、続いて第２試薬を加えてさらに３７°Ｃ
で５分間反応させた後エンドポイント法により５４６ｍ
ｍで発色強度を測定した。

（２〉分枝鎖アミノ酸の定量 第１試薬として９．３１３Ｕの乳酸オキシダーゼ、０．
１２５ｍ　Ｍの工００Ｓ及び２５０ＬＩのパーオキシダ
ーゼを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７，５＞　１０
０ｄを調製した。また第２試薬として、９３８Ｕのロイ
シンデヒドロゲナーゼ、０．５ｍｍ０１ｅのＮＡＤ、　
　０．１３ｍｍｏｌｅのピルビン酸、６２５Ｕの乳酸デ
ヒドロゲナーゼ及び０．０３８ｍｍｏ　ｌ　ｅの４−ア
ミノアンチピリンを含む５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７
，５＞２５ｄを調製した。

測定は、前記したチロシンの定量と同様にして（ただし
、血漿量は５μカに設定した。）行なった。

（３）上記方法で求めたチロシンと分枝鎖アミノ酸の比
率とアミノ酸分析機で求めたフィッシャー比との相関 ６７種の検体（ヒトの血漿）について上記方法によりチ
ロシン量と分枝鎖アミノ酸量を求めて、その比率（分枝
鎖アミノ酸／チロシン）を算出した。次に同じ検体につ
いてアミノ酸分析機（日立製作所製造、８３５型；サン
プルは血漿に等量の″″　　　　Φ　つ　　　− １０％スルホサリチル酸を加えて、３０分放置後遠心分
離し、得られた上清を用いた。検出は、０−フタルアル
デヒドで標識し蛍光検出計により励起波長３４８ｎｍ、
蛍光波長４５０ｎｍで測定して行なった。）を用いて各
種アミノ酸量を求め、フィッシャー比（分枝鎖アミノ酸
／チロシン＋）工二ルアラニン）を算出した。本発明方
法で求めたチロシンと分枝鎖アミノ酸の比率とフィッシ
ャー比との相関を第３図に示す。

その結果、 Ｙ−２，１３４Ｘ−０，２２２ 相関係数：γ−０，９３６ であって、両者は非常によく相関していることがわかる
。

従って、フィッシャー比の代わりにチロシンと分枝鎖ア
ミノ酸の比率を本発明の目的に用いることができる。

「効果１ 本発明方法は実用可能な精度及び範囲で迅速に芳香族ア
ミノ酸と分枝鎖アミノ酸を選択的に定量できるすぐれた
アミノ酸定量法である。本方法を用いることによって試
料中の全芳香族アミノ酸又は個々の芳香族アミノ酸と分
枝鎖アミノ酸の比を求めることができ、肝疾患の重症度
の判定やアミノ酸輸液療法におけるモニターリングに利
用することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明方法による芳香族アミノ酸検畢線を示し
、 第２図は本発明による分枝鎖アミノ酸検吊線を示し、 第３図は本発明方法により求めたチロシンと分枝鎖アミ
ノ酸の比率とアミノ酸分析機により求めたフィッシャー
比との相関関係を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）試料に、芳香族アミノ酸又は分枝鎖アミノ酸に特異
   性のある酵素を含む複数の酵素を共役させて過酸化水素
   を生成させ、該過酸化水素を測定することを特徴とする
   芳香族アミノ酸又は分枝鎖アミノ酸の選択的定量法。 ２）（ａ）すべての芳香族アミノ酸に特異性のある酵素
   を反応させるか、又は各々の芳香族アミノ酸に特異性の
   ある酵素を連続的に反応させ、しかる後に生成物を過酸
   化水素発生系へ導き、生成した過酸化水素を定量して試
   料中の全芳香族アミノ酸量を測定するか、又は（ｂ）フ
   ェニルアラニン又はチロシンに特異性のある酵素を単独
   で反応させ、しかる後に生成物を過酸化水素発生系へ導
   き、生成した過酸化水素を定量して試料中のフェニルア
   ラニン量又はチロシン量を測定することを特徴とする特
   許請求の範囲第１項記載の選択的定量法。 ３）すべての分枝鎖アミノ酸に特異性のある酵素を反応
   させるか、又は各々の分枝鎖アミノ酸に特異性のある酵
   素を連続的に反応させ、しかる後に生成物を過酸化水素
   発生系へ導き、生成した過酸化水素を定量して試料中の
   分枝鎖アミノ酸量を測定することを特徴とする特許請求
   の範囲第１項記載の選択的定量法。 ４）すべての芳香族アミノ酸にフェニルアラニンデカル
   ボキシラーゼとチロシンデカルボキシラーゼを組合わせ
   て作用させ、しかる後にチラミンオキシダーゼを作用さ
   せ、生成した過酸化水素を定量して試料中の全芳香族ア
   ミノ酸を測定することを特徴とする特許請求の範囲第２
   項記載の選択的定量法。 ５）すべての芳香族アミノ酸に６−メチル−５，６，７
   ，８−テトラヒドロプテリジン存在下、フェニルアラニ
   ン−４−モノオキシゲナーゼとチロシンデカルボキシラ
   ーゼを組合わせて作用させ、しかる後にチラミンオキシ
   ダーゼを作用させ、生成した過酸化水素を定量して試料
   中の全芳香族アミノ酸を測定することを特徴とする特許
   請求の範囲第２項記載の選択的定量法。 ６）すべての芳香族アミノ酸に６−メチル−５，６，７
   ，８−テトラヒドロプテリジン存在下、フェニルアラニ
   ン−４−モノオキシゲナーゼとβ−チロシナーゼを組合
   わせて作用させ、しかる後にチアミンピロフォスフェー
   ト及びフラビンアデニジンヌクレオチド存在下、ピルビ
   ン酸オキシダーゼを作用させ、生成した過酸化水素を定
   量して試料中の全芳香族アミノ酸を測定することを特徴
   とする特許請求の範囲第２項記載の選択的定量法。 ７）すべての芳香族アミノ酸に６−メチル−５，６，７
   ，８−テトラヒドロプテリジン存在下、フェニルアラニ
   ン−４−モノオキシゲナーゼとβ−チロシナーゼを組合
   わせて作用させ、しかる後に還元型ニコチンアミドアデ
   ニンジヌクレオチド存在下、乳酸デヒドロゲナーゼと乳
   酸オキシダーゼを組合わせて作用させ、生成した過酸化
   水素を定量して試料中の全芳香族アミノ酸を測定するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の選択的定量
   法。 ８）すべての芳香族アミノ酸に最終濃度１〜２０Ｕ／ｍ
   ｌのチロシンデカルボキシラーゼを作用させ、しかる後
   にチラミンオキシダーゼを作用させ、生成した過酸化水
   素を定量して試料中の全芳香族アミノ酸を測定すること
   を特徴とする特許請求の範囲第２項記載の選択的定量法
   。 ９）フェニルアラニンにフェニルアラニンデカルボキシ
   ラーゼを作用させ、しかる後にチラミンオキシダーゼを
   作用させ、生成した過酸化水素を定量して試料中のフェ
   ニルアラニンを測定することを特徴とする特許請求の範
   囲第２項記載の選択的定量法。 １０）チロシンにチロシンデカルボキシラーゼを作用さ
   せ、しかる後にチラミンオキシダーゼを作用させ、生成
   した過酸化水素を定量して試料中のチロシンを測定する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第２項記載の選択的定
   量法。 １１）チロシンにβ−チロシナーゼを作用させ、しかる
   後にチアミンピロフォスフェート及びフラビンアデニジ
   ンヌクレオチド存在下、ピルビン酸オキシダーゼを作用
   させ、生成した過酸化水素を定量して試料中のチロシン
   を測定することを特徴とする特許請求の範囲第２項記載
   の選択的定量法。 １２）チロシンにβ−チロシナーゼを作用させ、しかる
   後に還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド存在
   下、乳酸デヒドロゲナーゼと乳酸オキシダーゼを組合わ
   せて作用させ、生成した過酸化水素を定量して試料中の
   チロシンを測定することを特徴とする特許請求の範囲第
   ２項記載の選択的定量法。 １３）すべての分枝鎖アミノ酸にバリンデカルボキシラ
   ーゼを作用させ、しかる後にモノアミンオキシダーゼを
   作用させ、生成した過酸化水素を定量して試料中の全分
   枝鎖アミノ酸を測定することを特徴とする特許請求の範
   囲第３項記載の選択的定量法。 １４）すべての分枝鎖アミノ酸にニコチンアミドアデニ
   ンジヌクレオチド存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを
   作用させ、しかる後にピルビン酸存在下、乳酸デヒドロ
   ゲナーゼ及び乳酸オキシダーゼを組合わせて作用させ、
   生成した過酸化水素を定量して試料中の全分枝鎖アミノ
   酸を測定することを特徴とする特許請求の範囲第３項記
   載の選択的定量法。 １５）すべての分枝鎖アミノ酸にニコチンアミドアデニ
   ンジヌクレオチド存在下、ロイシンデヒドロゲナーゼを
   作用させ、しかる後に電子伝達体存在下、スーパーオキ
   シドジスムターゼを作用させ、生成した過酸化水素を定
   量して試料中の全分枝鎖アミノ酸を測定することを特徴
   とする特許請求の範囲第３項記載の選択的定量法。