JPH0353896A - 乾式クレアチニン分析要素およびその使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は臨床化学に関し、具体的には、生物学的流体の
ような水性液状物中のクレアチニンを測定するための分
析要素およびその方法に関する。

〔従来の技術〕

タンパク質代謝中間体およびその最終産物の測定は、臨
床化学、特に腎機能の診断において重要である。この代
謝産物にはクレアチニンおよびク（３〉 レアチンが包含される。

クレアチニンに対ずる酵素アッセイは、それそれクレア
チニンおよびクレアチンに特異的な酵素を使用し、そし
て次の一連の反応を使用して開発されてきた。

（１）　クレアチニン＋水ｔクレアチン（２〉　クレア
チン＋水→尿素十サルコシンこの第１の反応はクレアチ
ニンアミドヒドロラーゼによって触媒されるが、第２の
反応はクレアチンアミジノヒドロラーゼによって触媒さ
れる。

〔発明が解決しようとする課題〕

米国特許第４，１８２，３９９号明細書は、クレアチニ
ンもしくはクレアチンまたはその両者を測定するための
分析要素を公表する。この要素はりドカイン療法を受け
た患者由来のクレアチニンアッセイ試料において臨床上
許容できない大きな偏りを示す。リドカインの代謝産物
、Ｎ−エチルグリシン（ＮＥＧ）がこの偏りの原因にな
るものと信じられている。

（４） この偏りの課題は、ヨーロッパ特許出願第８８３０４３
４３．２号明細書に記載される分析要素ではいくぶん改
善されている。この要素は、酵素クレアチニンアミドヒ
ドロラーゼ２００〜１　，２００Ｉ．Ｕ．　／　ｍ２、
酵素クレアチンアミジノヒドロラーゼ３５，０００〜６
５，０００Ｉ．Ｕ．　／　ｍ２およびバシルス（Ｂａｃ
　ｉ　ｌ　ｌｕｓ）種のサルコシンオキシダーゼ２，０
００〜３，５００１．Ｕ．／　ｍ２ならびに過酸化水素
および過酸化物用の物質の存在下で検出可能な色素を提
供することができるロイコ染料を含んでなる。

そのクレアチンアミジノヒドロラーゼは、ロイコ染料に
対して実質的に不活性な状態で存在する。

そのクレアチニンアミドヒドロラーゼは、割合が限定さ
れた量で存在する。３種の酵素すべてはｐｌ＋６．５〜
６．９で存在する。

後者の要素は、リドカインで処置されている患者由来の
クレアチニンアッセイ試料において、いまだ偏りを示す
課題を有する。

（５） 〔課題を解決するための手段〕 本発明は、ａ〉　サルコシンオキシダーゼ、割合を限定
した量のクレアチニンアミドヒドロラーゼを含み、そし
て過酸化物用の物質ならびに前記過酸化物用の物質およ
び過酸化水素の存在下で検出可能な色素を提供すること
ができるイミダゾールロイコ染料を含んでなる第１試薬
層、 ｂ〉　クレアチンアミジノヒドロラーゼを含有する第２
試薬層、ならびに Ｃ）多孔質展開層、を前記順序で担持する支持体を含ん
でなる複数層分析要素であって、Ｎ−エチルグリシンに
関して少なくとも３００　１　．υ．／　ｍ　２、好ま
しくは６００Ｔ．Ｕ．／ｍ２の活性を有する高ＮＥＧオ
キシダーゼ活性サルコシンオキシダーゼが、ｉ〉前記多
孔質展開層、ｉｉ）前記展開層と前記クレアチンアミジ
ノヒドロラーゼを含有する層との間の分離層またはｉｉ
ｉ　）前記クレアチンアミジノヒドロラーゼを含有する
層に存在するが、あるいはｉｖ）層ｉ）〜ｉｉｉ　）の
すべてに存在することを特徴とする分析要素を提供する
。

（６） 本発明はまた、Ａ．本発明の複数分析要素をクレアチニ
ンまたはクレアチンいずれかの含有が予期される液状試
料と接触させる工程、ならびにＢ．　クレアチニンまた
はクレアチンいずれかの存在の結果として生成される検
出可能な色素を測定する工程、を含んでなるクレアチニ
ンまたはクレアチンいずれかの測定方法を提供する。

以下に本発明を具体的に説明する。

本発明の改良された分析要素は、米国特許出願第４９，
８７８号明細書に公表されるものと全く相違するような
、ＮＥＧに起因するアッセイの偏りを極小化または除去
するための手法を使用する。本発明の要素に必須の特徴
は、高ＮＥＧ活性を有するサルコシンオキシダーゼの使
用である。後者のサルコシンオキシダーゼの使用は、各
種の起源のサルコシンオキシダーゼがＮＥＧに関して相
違するＮＥＧオキシダーゼ活性を有するとの発見によっ
て可能になった。

定義によると、サルコシンオキシダーゼは基質としてサ
ルコシンを利用する酵素である。しかし（７） 起源に由来するサルコシンオキシダーゼは、Ｎエチルグ
リシン（ＮＥＧ）がサルコシンの良好な基質でないとし
ても、基質としてＮＥＧをも利用することができる。酵
素活性は、一般に１分当たりに転化される基質のマイク
ロモル数で特定される。

サルコシンオキシダーゼの活性は、基質としてサルコシ
ンを使用することによって測定される。活性について同
じ試験が基質としてＮＥＧを使用して行われる場合には
、その得られる活性はｒＮＥＧオキシダーゼ」活性と称
することができる。この語が本発明の明細書で使用され
るであろう。しかしながら、ｒ　ＮＥＧオキシダーゼ」
は不純物として存在する別の酵素に属するものと対立す
るようなサルコシンオキシダーゼの基本的な性質である
と解されねばならない。

本発明は、水性液状物中のクレアチニンの測定（定量ま
たは定性）に関する。特に、本発明は動物およびヒトの
生物学的流体をアツセイする目的で使用することができ
る。限定されるものでないが、（８） このような流体としては全血、血漿、血清、リンパ液、
胆汁、尿、髄液、痰および汗など、ならびに便通物が挙
げられる。また、骨格筋、心臓、肝臓、肺臓、脳、骨髄
および皮膚などのヒトまたは動物組織の液状調製物をア
ツセイすることもできる。

本発明の複数層要素は、同一層または重ねられた層のい
ずれかに、好ましくは、少なくとも１つは多孔質展開区
分である３箇所の離散区分を有する。その他の区分は、
当該技術分野で知られているような試薬区分もしくは記
録区分、追加の展開区分、輻射線遮断区分もしくはフィ
ルター区分、下塗り区分または障壁区分などでありうる
。これらの区分は、一般に流体によって相互に接触され
る。このことは一般に流体、試薬および反応生戒物（例
、発色色素〉が隣接区分の重ねられた領域間を通過また
は輸送されうることを意味する。好ましくはこれらの区
分は重ねられた層に別々に塗布される。

多孔質展開区分は自立性（すなわち、その保全くっ〉 性を維持するのに十分な硬質材料から構成される）であ
ることができるが、別の非孔質支持体上に置かれている
ものが好ましい。このような支持体は、適当な寸法安定
性で、そして好ましくは２００と９００ｎｍとの間の波
長を有する電磁線を透過する非孔質で透明（すなわち、
輻射線透過性）な材料であることができる。特定の要素
のための支持体の選択は、意図するモードの検出（透過
分光分析または反射率分光分析〉に一致させねばならな
い。有用な支持体は、ボリスチレン、ポリエステル類〔
例、ボリ（エチレンテレフタレート〉〕、ポリカーボネ
ート類およびセルロースエステル類（例、酢酸セルロー
ス）から作製することができる。

多孔質展開区分は、米国特許第４，２９２，２７２号、
同３，９９２，１５８号、同４，２５８，００１号およ
び同４，４３０，４３６号明細書ならびに特開昭５７−
１０１７６０号に記載されるような、いずれか適する繊
維材料もしくは不織布またはいずれかの混合物あるいは
両者の混合物で作製することができる。その展開区分は
等方性の多孔質、すなわち粒子間、繊維間およびポリマ
（１０） 一鎖間で連続するスペースまたは細孔によって多孔度が
その区分の各方向で同一であるものか望ましい。

本発明のアッセイは、以下の一連の反応（１）〜（４）
に従って行われる。

（１）　クレアチニン＋水２クレアチン（２）クレアチ
ン＋水→尿素＋ザルコシン（３）サノレコシン＋酸素十
水→グリシン＋ホノレムアルデヒド＋過酸化水素 （４）過酸化水素十ロイコ染料→検出可能な色素。

これらの反応は、それぞれクレアチニンアミドヒドロラ
ーゼ、クレアチンアミジノヒドロラーセ、サルコシンオ
キシダーゼおよび過酸化物用の物質によって触媒される
。

クレアチニンおよびクレアチンアッセイにおけるリドカ
イン代謝産物の妨害を極小化する従前の試みは、次の反
応（５） （５〉　Ｎ一エチノレグリシン＋０２→■２０２の進行
を防ぐことに向けられてきた。この反応で（１１） ？成されるＩＩ２０２は、前記反応（３）で生成される
Ｈ２０■と合わさって検出可能な色素を生成するため、
正確なクレアチニンおよびクレアチンアッセイを妨げる
。

本発明では、クレアチニンをアッセイするための分析要
素で従来使用されたサルコシンオキシダーゼよりもＮ−
エチルグリシンに対してより高いＮＥＧオキシダーゼ活
性を有するサルコシンオキシダーゼの使用によって反応
（５）の終了を促進することで前記障害が実質的に除去
される。

本発明の複数層要素では、展開層、その展開層とクレア
チンアミジノヒドロラーゼを含んでなる層との間の分Ｍ
．層あるいはクレアチンアミジノヒドロラーゼを含んで
なる層でＮＥＧから１１２０■への転化が終了するまで
実施される。この反応は、最初の読み取り時点までに終
了する。その最初の読み取り時点は約４分である。反応
（５）で生成されるＩ＋　２０２は、それが最初の読み
取り時点の前に実質的に終了するので、少ないかまたは
全くアッセイに妨害をもたらさない。

（１２） 本発明は、同一の分析要素によってクレアチニンもしく
はクレアチンまたはそれらの両者のいずれかを迅速かつ
経済的に測定するための相当簡単で自動化された手段を
提供する。従って、前記のそれぞれの被検体について個
別の分析組成物または分析要素は必要でない。本発明の
アッセイは迅速であり、例えば約５分以内にいずれかの
被検体の測定が可能である。本発明によって時間のかか
る空試験を避けることも可能である。従って、特開昭５
８　−　９６９９号公報に記載された溶液アッセイで使
用される複雑な装置は本発明によって避けられる。

本発明は本明細書に記載される分析要素で達戊されるク
レアチニンについての動力学的なアッセイであるので、
前記の利点が本発明によって可能になる。この要素は、
前記２種の酵素反応（１）および（２〉を促進するクレ
アチニンアミドヒドロラーゼとクレアチンアミジノヒド
ロラーゼを含む。

しかしながら、クレアチニンアミドヒドロラーセは内因
性クレアチンが完全に反応した後、色素生（１３） 成の割合がクレアチニンの存在にすべて起因するように
クレアチニンアミドヒドロラーゼが割合を限定した量で
存在する。試薬が相互に妨害しないような状態でそれら
を要素中に置くことによってバックグランドが極小化さ
れる。特に、クレアチンアミジノヒドロラーゼはロイコ
染料に対して実質的に不活性となるような状態で存在す
る。

クレアチニンアミドヒドロラーゼとクレアチンアミジノ
ヒドロラーゼは多くの供給先がら商業的に購入すること
ができる。各種の微生物源がら単離された数種の各酵素
が、米国特許第３，８０１，４１６号、同４，０３９，
３８４号明細書に記載されている。これらの種のすべて
が本発明の実施に際して使用することができる。両者と
もフラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）の１菌株から得られ、米国特許第４，０３９，３８４
号明細書に記載されているクレアチニンアミドヒドロラ
ーゼおよびクレアチンアミジノヒドロラーゼが有用であ
る。

サルコシンオキシダーゼもまた数多くの供給先から市販
されている。クレアチニンアミドヒドロ（１４） ラーゼを含有する層では、バシラス（Ｂａｃ　ｉ　Ｉ　
Ｉ　ｕｓ）種由来のサルコシンオキシダーゼか利用でき
る。このサルコシンオキシダーゼのＮＥＧオキシダーゼ
は、ＮＥＧに関して３００Ｉ　．Ｕ．　／　ｍ２未満で
ある。

いずれかの起源に由来するＮＥＧに関して少なくとも３
００Ｉ．Ｕ．／ｍ２の活性を有する高ＮＥＧオキシダー
ゼ活性のサルコシンオキシダーゼも有用であろう。好ま
しい高ＮＥＧオキシタ′−ゼ活性のサルコシンオキシダ
ーゼはアルスロバクター（八ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）
種で゛ある。

本発明で有用な過酸化物用物質はベルオキシダーゼを包
含する。ベルオキシダーゼは、過酸化水素が他の物質を
酸化する反応を触媒しうる酵素である。ベルオキシダー
ゼは、一般に鉄ボリフリン含有タンパク質と結合される
。ベルオキシダーゼは西洋ワサビ、ジャガイモ、イチジ
クの樹液およびカブ、ならびに乳および白血球細胞に存
在する。

また、微生物にも存在し、発酵によって生産することも
できる。ある種の合成ベルオキシダーゼもまた知られて
いる。ベルオキシダーゼが好ましい（１５） 過酸化物用の物質であるが、酵素でない他の物質も利用
可能である。これらの多くは市販されている。

本発明で有用なロイコ染料は、ロイコ状態で一般に無色
であるが、過酸化水素と過酸化物用の物質の存在下で検
出可能な発色色素まで酸化されうる。利用可能なロイコ
染料には、米国特許第４，０８９，７４７号、ヨーロッ
パ特許出願第１２２，６４１号および特開昭５８−４５
，５５７号公報に記載されるもののようなジアリールイ
ミダゾール類およびトリアリールイミダゾール類が包含
される。特に有用なイミダゾールロイコ染料は米国特許
第４，０８９，７４７号明細書に記載されるトリアリー
ルイミダゾール類であり、例えば、２−（３．５−ジメ
トキシー４ヒドロキシフェニル）−４．５−ビス（４−
ジメチルーアミノフエニル）イミダゾール、２−（４ヒ
ドロキシ−３−メトキシフエニル）−４．５ビス（ｐ−
ジメチルアミノフエニル）−１Ｈ−イミダゾール、２−
（３−エトキシ−４−ヒドロキシフェニル）−４．，５
−ビス（ｐ−ジメチルアミノフ（１６） ェニル〉−１Ｈ−イミダゾール、２−（４−ヒドロキシ
−３．５−ジメトキシフエニル）　−４−　Ｃ４（ジメ
チルアミノ）一フエニル）−５−（２−フリル）イミダ
ゾール、２−（４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシフ
ェニル）−４　．　５−ジ（２−フリル）イミダゾール
、２−（３．５−ジメトキシー４ヒドロキシフェニル）
−４−１：４−（ジメチルアミノ）フェニル〕−５−フ
ェネチルーイミダゾールおよび２−（３．５−ジメトキ
シ−４−ヒドロキシフエニル）−４−［４−（ジメチル
アミノ〉フェニル〕−５−ペンジルイミダゾールが挙げ
られる。

本発明の要素は、また、各種の製造や作業に有利な要素
に通常含まれる他の添加剤１種以」二をも含むことがで
きる。このような添加剤としては、界面活性剤、イオン
キレート剤、緩衝剤、硬化剤、抗酸化剤およびカプラー
溶媒などが挙げられる。

本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼは、要素中に
割合を限定した量で存在する。このことは、この酵素の
量がクレアチンアミジノヒドロラ（１７〉 ーゼの量に関連して前記反応（１）が前進方向に制御さ
れる割合となるようなことを意味する。クレアチニンア
ミドヒドロラーゼの特定の量は、熟練した臨床化学者に
よって容易に決定されうるだろう。一般的にその量は、
２００〜１，２００１．Ｕ．／ｍ２が好ましい。クレア
チンアミジノヒドロラーゼは、それが割合を限定した量
でない限り、どのような量ででも存在することができる
。換言すれば、前記反応（２）は本発明のアッセイで制
限すべきでない。

この酵素の特定の量は熟練した臨床化学者によって容易
に決定することができる。

この明細書の文脈内において使用されるＩ．Ｕ．は、１
　１．Ｕ．が酵素についての標準的なｐＨおよび温度条
件下で、１分当たりに基質の１マイクロモルの転化を触
媒するのに要する酵素活性量であるものとして定義され
る酵素活性に対する国際単位を表す。

本発明で使用される好ましい酵素標品では、これらの標
準条件はクレアチニンアミドヒドロラーゼについて３０
℃でｐＨ　８．０であり、クレアチンアミジノヒドロラ
ーゼについて３７℃でｐＨ　７．４であり、サ（１８） ルコシンオキシダーゼについて３７℃でｐＨ　７．４で
あり、そしてベルオキシダーゼについて２５℃でｐＨ７
．０である。

このアッセイで有用な他の試薬類は、熟練した臨床化学
者によって容易に決定される適当な量で存在する。代表
的な量は、以下の例で具体的に説明される。

本発明の実施に際し、クレアチンアミシノヒドロラーゼ
とロイコ染料は、その酵素がその染料に対して実質的に
不活性である，Ｌうな状態で存在することが限定的であ
る。このことは、前記酵素がロイコ染料に悪影響を及ぼ
さないような状態で２種の試薬が要素中に組み入れられ
ることを意味する。これは、いろいろな方法で達戒する
ことができる。例えば、酵素を、ロイコ染料が何等かの
不純物によって影響を受けないように非常に純粋な状態
で使用してもよい。しかしながら、より実際的には前記
酵素を非常に純粋な状態で得ることはできない。このよ
うな場合では、アッセイが行われるまで酵素および染料
のいずれかまたは両者を（１９） 封入するが、さもなければ要素中で相互に単離しておい
てもよい。好ましくは、その酵素とロイコ染料をアッセ
イの時まで混合しないように要素の異なる区分または異
なる層にそれらが配置される。

本発明に従えば、アッセイ方法に応じて多種多様な要素
を作製することができる。要素は、いずれか望ましい幅
を有する伸長されたテープ、シート、スライドまたはチ
ップを初めとする多様な形状に構成することができる。

本発明のアッセイは手動または自動化することができる
。一般的に、乾式要素を使用するには、供給用巻取、チ
ップパケットまたは他の供給源から要素を取り出し、次
いで試料と要素内の試薬類が混合し始めるように試験す
べき液状試料（例えば、１〜２００μ１）とそれを物理
的に接触させることによってクレアチニンまたはクレア
チン測定を行う。このような接触は、いずれか適当な手
段、例えば、試料中への要素の浸漬または浸没が、ある
いは好ましくは、適当なディスペンサーで試料の１滴を
手動または機械によって要素にスポット（２０） することによって行うことができる。

試料を適用後、得られる試験結果を速めるか促進するの
に望ましいかも知れないインキュベーションまたは加熱
などの何等かのコンディショニングにその要素がさらさ
れる。

次に、適当な反射率もしくは透過分光光度計を用いて処
理することによって色素生成率が測定される。一般にク
レアヂンの測定については、クレアチニンの実質的な転
化前、すなわち試料と要素の接触後即座に、例えば試料
と要素の接触後１分以内に色素測定が行われる。この時
点では要素内の割合を限定した量のクレアチニンアミド
ヒドロラーゼは実質的にクレアチニンをクレアヂンに全
く転化しないので、前記測定は内因性クレアチンを測定
する。

クレアチニン測定については、ほぼすべての内因性クレ
アチンとＮＥＧが酵素的に反応生戒物へ転化された後、
少なくとも２度の色素測定が行われる。一般に、その最
初の測定は試料と要素の接触後約４分して行われる。そ
の後、色素生戒率、（２１〉 すなわちクレアチニン量を決定するための別の測定が行
われる。この一連の測定は、クレアチニンおよびクレア
チンのいずれかまたは両方を測定するについて本発明の
要素の使用を可能にする。

前述のように、前記米国特許および米国特許出願をクレ
アチニンのアッセイに使用する場合にはりドカインの代
謝産物、Ｎ−エチルグリシン（ＮＥＧ）がしばしば臨床
的な偏りを生じさせる。Ｎエチルグリシンが妨害物であ
るとの確信は、既知量のＮ−エチルグリシンを含有する
患者試料で観察された偏りとの類似点によって裏付けさ
れる。

この確信はまた、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
　　Ｖｏｌ．３４，Ｎ［１１２（１９８８），　２５５
９〜２５７２ページおよび陽１０，　２１４４〜２１４
８ページに公表される独立した研究によっても裏付けら
れている。

本発明の典型的な要素は、次の形式および構成を有する
ことができる。

（２２） 展開層 二酸化チタン 酢酸セルロース ＢＲＩＪ　７８界面活性剤 ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−４０５界面活性剤 ＥＳＴＡＮＥ樹脂 ２０　−８０　ｇ／ｍ’ ２−１０　ｇ７ｍ２ ０．３−１．５　ｇ／ｍ２ ０．５　−５　ｇ／ｍ２ １．−５　Ｈ／ｍ２ ゲル層 ゼラチン（硬化済み） １−２０　ｇ／ｍ２ （２３） ゼラチン ｌ ２０　ｇ／ｍ２ Ｎ トリス （ヒドロキシメ 試薬層 （エチレンジニトリロ）四酢酸 ０．１ １　ｇ／ｍ２ クレアチンアミジノヒドロラーゼ ５，０００−５０，０００　Ｉ．Ｕ．／ｍ２ＴＲＩＴＯ
Ｎ　Ｘ−１００界面活性剤 ０．１ ２．５　ｇ／ｍ２ （２４） ゼラチン（硬化済み） サルコシンオキシダーゼ ペルオキシダーゼ ５．５−ジメチル−１．３ シクローヘキサンジオン ２．４−ジ−ｎ−ペンチルフ １−２０　ｇ／ｍ２ ５００−１０，０００　Ｉ．Ｕ．／ｍ２５００−８０，
０００　Ｉ．Ｕ．／ｍ２０．０１−１　ｇ／ｍ２ （エチレンジニトリロ）四酢酸 ＴＲＩＴＯＮκ−１００界面活性済ｑ ΔＬＫ八ＮＯＬ　ＸＣ界面活性済り ２，４−ジーｎ−ペンチルフ ェノ−ノレ ０．１−１　　ｇ／ｍ２ ０．１　−２．５　ｇ／ｔ０２ ０．１−２．５　ｇ／ｍ２ １−５　ｇ／ｍ２ アミノ フェニル）イミダゾール ０．１ １ ｇ／ｍ２ （２５） この要素を使用して以下のようにクレアチニンを測定し
た。まず最初に、本発明の別々の要素に適当に検量した
流体試料１０μｌを適用し、インキユベーションし、次
いで６７０ｔ＋ｍで得られた色素を測定することによっ
てクレアチニンに対する検量線を作戒した。反射率濃度
（ＤＲ）の読みは、各試料添加後の２３１秒および３０
０秒で行った。クレアチニンに対する検量線は、３００
秒で行ったそれぞれの読み値から２３１秒の読み値を引
き算し、次いで各検量試料について１．２１７で割り算
して得られた。この曲線はクレアチニンに対する反応の
動力学的速度を決定するための１つとなりうる。

？実施例〕 未知量のクレアチニンを含有する試料を同様に測定した
。

匠■Ｌ アッセイは、ＮＥＧを加えた血清試料とＮＥＧを加えて
ない血清試料について前記検量方法に従って行った。加
えた濃度はＮ　Ｅ　Ｇ　１８ｍｇ／　ｌであっ（２６） た。

この例は、先に具体的に示したような展開層または分離
層のいずれかに高ＮＥＧオキシダーゼ活性サルコシンオ
キシダーゼが存在する場合、ヨーロッパ特許出願第８８
３０４３４３　．　２号の分析要素に比べてＮＥＧによ
り生ずる妨害が顕著に減少することを示す。

この試験結果を第１図にグラフで示す。このグラフは、
高ＮＥＧオキシダーゼ活性サルコシンオキシダーゼ３０
０Ｉ　．Ｕ．　／　ｍ２所用量で、ヨーロッパ特許出願
第８８３０４３４３　．　２号に比し、ＮＥＧ妨害を約
５０％減少することを示す。

鮭−２ 第２図は、ＮＥＧに関する高ＮＥＧオキシダーゼ活性サ
ルコシンオキシダーゼが展開層と試薬層の間に配置され
、タレアチンアミジノヒドロラーゼを含むゼラチン層に
含まれている本発明の分析要素に対する試験をまとめて
いる。

この試験では、リドカインが投与されていない患者由来
の血清試料を集め、各種濃度でＮＥＧを（２７） 加えた。次に、これらのＮＥＧを加えた血清試料を、ヨ
ーロッパ特許出願第８８３０４３４３．２号の分析要素
と前記態様の本発明の要素との両方を使用してエクタッ
チェム（Ｋｋｔａｃｈｅｍ）アナライザーで試験した。

この試験は、検量線の作戒に関して前述したように行っ
た。得られた偏りを第２図に示す。

この結果は、ヨーロッパ特許出願第８８３０４３４３．
２号の要素に比し、本発明の要素を使用するアッセイ結
果ではＮＥＧに由来ずる妨害または偏りの大きさが激的
（約８５％）な減少を示す。

〔発明の効果〕

本発明は、クレアチニンアッセイのための改良された要
素を提供する。リドカイン代謝産物ＮＥＧによって生ず
るこのようなアッセイにおける偏りは、米国特許第４，
１８２，３９９号およびヨーロッパ特許出願第８８３０
４３４３　．　２号の要素に比べ有意に減少する。

（２８） 〔本発明のより具体的な態様〕 高ＮＥＧオキシダーゼサルコシンオキシダーゼが展開層
とクレアチンアミジノヒドロラーゼ含有層との間の層に
存在する請求項１記載の要素。

高ＮＥＧオキシダーゼサルコシンオキシダーゼが展開層
に存在する請求項１記載の要素。

高ＮＥＧオキシダーゼザルコシンオキシダーゼがクレア
チンアミジノヒドロラーゼ含有層に存在ずる請求項１記
載の要素。

高ＮＥＧオキシダーゼ活性サルコシンオキシダーゼが少
なくとも６００１．Ｕ．／ｍ２の活性を有する前記各項
に記載の要素。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヨーロッパ特許出願第８８３０４３４３　．
　２号の要素と本発明の要素に対するＮＥＧ偏り効果を
比較するグラフであり、 第２図は、ヨーロッパ特許出願第８８３０４３４３．２
号の要素と比較する本発明の要素に対するＮＥＧ偏り効
果のもう一つのグラフである。 （２９〉 匡 （／：

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ）サルコシンオキシダーゼ、割合を限定した量の
   クレアチニンアミドヒドロラーゼを含み、そして過酸化
   物用の物質ならびに前記過酸化物用の物質および過酸化
   水素の存在下で検出可能な色素を提供することができる
   イミダゾールロイコ染料を含んでなる第１試薬層、 ｂ）クレアチンアミジノヒドロラーゼを含有する第２試
   薬層、ならびに ｃ）多孔質展開層、を前記順序で担持する支持体を含ん
   でなる複数層分析要素であって、Ｎ−エチルグリシンに
   関して少なくとも３００Ｉ．Ｕ．／ｍ＾２の活性を有す
   る高ＮＥＧオキシダーゼ活性サルコシンオキシダーゼが
   、ｉ）前記多孔質展開層、ｉｉ）前記展開層と前記クレ
   アチンアミジノヒドロラーゼを含有する層との間の分離
   層またはｉｉｉ）前記クレアチンアミジノヒドロラーゼ
   を含有する層に存在するか、あるいはｉｖ）層ｉ）〜ｉ
   ｉｉ）のすべてに存在することを特徴とする分析要素。 ２、 Ａ）ｉ）サルコシンオキシダーゼ、割合を限定した量の
   クレアチニンアミドヒドロラーゼを含み、そして過酸化
   物用の物質ならびに前記過酸化物用の物質および過酸化
   水素の存在下で検出可能な色素を提供することができる
   イミダゾールロイコ染料を含んでなる第１試薬層、 ｉｉ）クレアチニンアミドヒドロラーゼを含有する第２
   試薬層またはｉｉｉ）クレアチンアミジノヒドロラーゼ
   を含有する層、あるいはｉｖ）これらのすべての層を前
   記順序で担持する支持体を含んでなるクレアチニンまた
   はクレアチンのいずれかを測定するための複数層分析要
   素であって、かつ、Ｎ−エチルグリシンに関して少なく
   とも３００Ｉ．Ｕ．／ｍ＾２の活性を有する高ＮＥＧオ
   キシダーゼ活性サルコシンオキシダーゼが、ｉ）前記多
   孔質展開層、ｉｉ）前記展開層と前記クレアチンアミジ
   ノヒドロラーゼを含有する層との間の分離層またはｉｉ
   ｉ）前記クレアチンアミジノヒドロラーゼを含有する層
   に存在するか、あるいはｉｖ）層ｉ）〜ｉｉｉ）のすべ
   てに存在することを特徴とする分析要素を、クレアチニ
   ンまたはクレアチンの存在が予期される液状ヒト血清試
   料と接触させる工程、ならびに Ｂ）クレアチニンまたはクレアチンいずれかの存在の結
   果として生成される検出可能な色素を測定する工程、を
   含んでなるクレアチニンの測定方法。